KR20150008852A

KR20150008852A - 계면활성제 펩타이드의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150008852A
Application number: KR1020147028100A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 모짜렐리; 사만타 라보니; 바바라 피오셀리
Original assignee: 키에시 파르마슈티시 엣스. 피. 에이.
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2015-01-23
Also published as: RU2628088C2; CN104245727A; AR090706A1; HK1200466A1; RU2014141505A; CA2870478A1; US20130303726A1; WO2013156464A1; EP2838916A1

Abstract

SP-C 펩타이드와 말토스 결합 단백질의 융합 단백질의 이형 발현에 기초한 계면활성제-단백질 C 펩타이드 (surfactant-protein C peptides, SP-C peptides)의 제조방법; 상기 방법에 사용하기 위한 유전자 구조체, 벡터 및 숙주세포.

Description

계면활성제 펩타이드의 제조 방법{METHOD FOR THE PREPARATION OF SURFACTANT PEPTIDES}

본 발명은 계면활성제-단백질 C 펩타이드(SP-C peptides)의 제조를 위한 재조합-DNA 기술에 기초한 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 방법에서 사용하기 위한 유전자 구조체(genetic constructs), 벡터 및 숙주세포를 또한 제공한다.

폐 계면활성제는 폐포 라이닝(alvelolar lining)의 공기-액체 계면에서 표면 장력을 감소시켜, 날숨(expiration)의 마지막에 폐가 허탈(collapse)되는 것을 막아준다.

계면활성제 결핍은 미숙아에서 질환이고, 호흡 곤란 증후군 (RDS)을 야기시키며, 이것은 동물의 폐로부터 추출된 천연 계면활성제로 효과적으로 치료할 수 있다 (Fujiwara, T. and Robertson B. (1992) In: Robertson, B., van Golde, L.M.G. and Batenburg, B. (eds) Pulmonary Surfactant: From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, pp. 561-592 참조).

이들 계면활성제 제조의 주요한 구성성분은, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 포스파티딜글리세롤 (PG) 그리고 소수성 계면활성제 단백질 B 및 C(SP-B 및 SP-C)와 같은 인지질이다.

단백질 SP-B 및 SP-C는 계면활성제 질량의 오직 약 1-2%로 구성되나, 순수한 지질 제조물에 비교하여 표면 활성에 매우 놀라운 개선을 나타낼 수 있다 (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262; 참조).

SP-C는 9-34 잔기들 사이에 알파-헬릭스의 도메인을 가지는 35개의 아미노산 잔기들로 구성된 리포단백질(lipoprotein)이다 (Johansson, J. et al. (1994) Biochemistry 33, 6015-6023 참조).

헬릭스는 대부분 발릴-잔기들로 구성되고, 지질이중층에 박혀있고, 지질 아실(acyl) 사슬과 평행하게 배향된다 (Vandenbussche, et al (1992) Eur. J. Biochem. 203, 201-209 참조).

두 개의 팔미토일기들은 펩타이드의 N-말단 부분의 5 및 6 위치에서 시스테인 잔기들과 공유결합으로 연결된다. (Curstedt, T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2985-2989 참조).

11 및 12 위치에서, 두개의 보존된 양 전하를 띤(positively charged) 잔기들, 아르기닌 및 라이신은 지질막의 음 전하를 띠는(negatively charged) 선두 그룹들과 상호작용하여, 경직도(rigidity)를 증가시킨다.

지질-펩타이드 상호작용의 경직도는, C-말단 쪽으로 감소될 수 있는데, 그 이유는 그것이 작거나 또는 소수성 잔기들을 오직 포함하고 있어, 이 부분을 잠재적으로는 인지질 이중층에서 좀 더 이동성있게 만들기 때문이다.

동물 조직으로부터 얻은 계면활성제 제조물은 몇가지 결점 - 예컨대, 한정된 양의 이용가능성, 그리고 전염성 물질을 포함하고 있어 면역 반응을 일으킬 가능성을 가지고 있는 점- 을 가질 수 있기 때문에, 합성 지질과 SP-C 및/또는 SP-B 단백질의 합성 유사체로 보통 구성되는 인공 계면활성제를 만들기 위한 시도들이 있어왔다.

그러나, 합성 SP-C 단백질에 관한 한, 이전 작업들은 그것이 천연 펩타이드처럼 최적의 표면 활성에 필요한 알파-헬릭스의 구조로 접히지 않는다는 것을 입증하였고 (Johansson, J. et al. (1995) Biochem. J. 307, 535-541 참조), 그러므로 계면활성제 지질들과 적절하게 상호반응할 수 없을 것이다.

이러한 문제점을 피하기 위해, 서열을 변경하는 몇몇 시도들이 있어왔는데, 예컨대, 천연 SP-C 내에 모든 헬릭스의 발린(Val) 잔기들을 류신(Leu)으로 교환하여 알파-헬릭스의 구조를 강하게 선호하게 하였다. 상응하는 막통과 유사체, SP-C(Leu)는 적절한 인지질 혼합물들과 조합될 때 공기-액체 계면에서 양호한 확산(spreading)을 나타내었다.

WO 2008/044109는 SP-C 단백질의 펩타이드 유사체를 SP-C33(Leu)로 표시하여 개시하고, 다음의 단일 코드 아미노산 서열을 가진다:

IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL (서열번호: 1).

이 펩타이드는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상의 합성 방법은 예를 들어, Schroeder et al., 'The peptides', vol. 1 , Academic Press, 1965; Bodanszky et al., 'Peptide synthesis', Interscience Publisher, 1996; Baramy & Merrifield, 'The peptides; Analysis, Synthesis, Biology', vol. 2, chapter 1 , Academic Press, 1980 에서 설명된다.

상기 기술들은 고체상에서, 용액상에서, 유기 화학 합성 방법에서, 또는 이들의 조합에서 펩타이드 합성을 포함한다.

펩타이드 SP-C33(Leu)과 같은 합성 펩타이드들의 통상의 기술에 의한 생산은 그것들의 수용성을 제한하는 높은 소수성 특징에 의해 영향 받는다.

이러한 결점은 본 발명의 방법에 의해 해결된다.

정의

용어 "SP-C 펩타이드"에 관하여, 이것은 천연 계면활성제 단백질 SP-C의 구조적 유사체 펩타이드를 의미하고, 펩타이드가 지질 담체(carrier)와의 혼합물에서 유사한 폐 계면활성제 활성을 보여주는 한, 천연 단백질과 비교하여, 하나 이상의 아미노산이 치환 및/또는 결실된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 SP-C 펩타이드의 생합성을 위한 재조합 방법으로, 종래 기술과 연관있는 결점을 극복하고, 만족할만한 수율을 가지는 고순도 생성물을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 본 발명의 방법은 프로테아제 절단 부위를 보유한(carrying) 링커의 간치(interposition)에 의해 SP-C 펩타이드가 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)과 융합된 융합단백질의 발현에 기초한다.

일 구현예로, 본 발명은 SP-C 펩타이드, MBP 단백질 및 그 사이에 위치하고 프로테아제 절단 부위를 보유한 링커 펩타이드를 코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공하고, 상기 코딩 폴리뉴클레오티드 서열(encoding polynucleotide sequence)은 원핵 세포에서 발현에 적절한 프로모터와 작동적으로(operatively) 연결되어 있다.

일 구현예로, 상기 SP-C 펩타이드는 SP-C33(Leu) (서열번호: 1)이고, 코딩 서열은 서열번호:3이다. 다른 구현예로, MBP는 서열번호: 2로 표현되고, 이를 코딩하는 서열은 서열번호:4이다. wt MBP - 즉, 대장균에 의해 천연 생산되는 것-과 비교하여, 말토스 결합 단백질 서열번호:2는 개선된 아밀로스 친화도와 SPC 펩타이드의 더 좋은 접힘을 가져다주는 변이가 존재한다. 개선된 아밀로스-친화도는 아래에서 논의되는 바와 같이, 박테리아 세포에 의해 생산되는 융합 단백질의 정제를 위해 중요하다.

MBP- 및 SP-C-코딩 서열은 바람직하게는 각각 발현 카세트의 N- 및 C-말단에 위치된다. 이것이 융합된 SP-C 펩타이드의 올바른 접힘을 가능하게 함을 발견하였다.

또 다른 구현예에서, 링커 펩타이드는 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 40 아미노산 길이이고, 엔테로키나아제에 의해 인식되는 단백질가수분해(proteolysis) 부위를 포함한다. 후자(latter)는 특정 절단 부위에서 라이신 다음을 절단하는 특정 세린 프로테아제이다. 추가로, 링커를 코딩하는 서열은 유전자 구조체의 적절한 클로닝과 프로세싱(processing)을 위한 하나 이상의 엔도뉴클레아제-제한(endonuclease-restriction) 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 펩타이드와 이를 코딩하는 서열은 서열번호:5 및 6으로 각각 표현된다.

원핵 세포에서 이형 단백질의 발현을 조절하는데 적절한 임의의 프로모터가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직하게, 유도성(inducible) 프로모터가 사용되고, 특히, 이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 활성화되는 tac 프로모터이다.

발현 카세트는 전사 (transcription) 증강인자(enhancers), 종결인자 (terminators), 개시인자(initiators) 및 다른 유전적 조절 인자들 또는 재조합 단백질의 항원성(antigenecity) 또는 결합 친화도를 주는 인자들과 같은 재조합 단백질의 발현을 조절하는 구성요소들을 더 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기에서 언급된 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게 벡터는 플라스미드이고, 더 바람직하게는 pBR32-기반 플라스미드이고, 이것은 추가적으로 항생제 저항 코딩 서열, 재조합 단백질을 분비 경로로 가도록하는 분비(secretion) 신호, 이형 서열을 삽입하게 해주는 적절한 제한 부위와 같은 선택 마커를 추가적으로 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 SP-C 펩타이드의 제조방법을 제공한다:

i) 상기 정의된 바와 같은, SP-C 펩타이드, MBP 및 그 사이에 위치하고 프로테아제 절단 부위를 보유하는 링커 펩타이드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 보유하는 벡터를 제공하는 단계;

ii) 상기 벡터를 원핵 세포에 도입하고, 상기 세포를 융합 단백질의 발현이 허용되는 조건 하에 세포를 유지하는 단계;

iii) 상기 융합 단백질을 정제하는 단계;

iv) 적절한 프로테아제로 상기 융합 단백질을 절단하고, SPC 단백질을 단리하는 단계.

박테리아 세포 및 특히 대장균(E. coli) 세포들은 SPC 펩타이드의 발현에 편리하게 사용될 수 있다. 독성 단백질에 내성(tolerance)을 주기 위해 표현형적으로 (phenotypically) 선택된 유전적 변이를 포함하는 대장균 균주(strain)가 특히 바람직하다.

융합 단백질의 발현 후에, 세포들은 파괴되고, 융합 단백질을 포함하는 세포 분획들을 분리하도록 세포 용해물(cell lysate)은 원심분리되었다.

융합 단백질의 정제는 바람직하게는 MBP 리간드-결합된 레진을 이용하여 친화(affinity) 크로마토그래피에 의해 수행된다. 바람직하게는, 조 세포 추출물(crude cell extract)은 아밀로스로 유도체가 만들어지는(derivatize) 아가로스 레진을 포함하는 컬럼에 로딩하고, 레진으로부터 융합 단백질을 제거하기 위해 적절한 양의 말토스를 포함하는 완충 용액으로 용출하였다.

융합 단백질의 최종 절단은, 이어 종래 기술을 이용하여 단리되는 SP-C 펩타이드를 유리시킨다(liberate). 엔테로키나아제 프로테아제는 바람직하게는 적절한 프로테아제 절단 부위가 존재하는 링커 영역에서 융합 단백질을 절단하는데 사용된다.

유사한 재조합 시스템에서 시험된 다른 단백질 태그와는 다르게, MBP는 특히 발현 및 거기에 융합되는 SP-C 펩타이드의 이후의 정제에 효과적임을 입증하였다.

도 1. MALDI 스펙트럼 분석은 SP-C33(Leu)이 분해(digestion) 이후에 용액 내 존재하는지를 나타낸다. 계산된 단동위(monoisotopic) 질량은 3594.52 Da로, 이것은 아미노산 서열로부터 계산된 이론적인 단동위 질량에 대하여 22 ppm 이내이다.
도 2는 MBP-링커(MW_ave ~43206 Da)의 존재는 저해상도 MALDI-MS 접근법(approach)에 의해 결정되었다. 감지가능한 양의 MBP-링커-SP-C33(Leu)는 관찰되지 않았고, 이는 적용된 단백질 가수분해 반응 조건들이 정량적인 과정임을 암시한다.
도 3. 불순물의 예비적 평가는 독립적으로 얻어진, 1 및 2로 라벨링된 두 배치 사이에서 MALDI-MS 및 HPLC-ESIMS에 의해 또한 수행되었다. 그들은 비슷한 수준의 불순물을 나타내었다. LC-MS에 의한 생성물 SP-C33(Leu)의 정량화는, SP-C33(Leu) 참조 표준에 대하여 수행되었다. 독립적으로 얻어진 두 개의 배치가 측정되었고, 단백질 내 수율은 결정되었다(표).
[표]

실험 부분

MBP 융합 단백질을 위한 클로닝 전략

SP-C33(Leu)은 말토스 결합 단백질(MBP)과의 융합 단백질 형태로 박테리아에서 발현된다. 발현 벡터 pMALc5e (New England Biolabs)는 MBP를 코딩하고, SpC33Leu를 코딩하기 위한 DNA 단편의 인-프레임(in-frame) 클로닝을 위한 (5')AvaI와 (3')BamHI 절단 부위를 제공한다. 발현 벡터는 암피실린 저항성 유전자를 포함하고, pBR322의 유도체(derivative)이다. MBP 및 SpC33Leu는, 특정 절단 사이트(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓)에서 라이신 다음에 절단하는 특정 세린 프로테아제인, 엔테로키나아제에 의해 인식되는 단백질가수분해 부위를 포함하는 펩타이드 링커를 통해, 함께 연결된다. 상업적인 MBP-링커 서열은, 최종 4개의 아미노산들이 C-말단 글리신에 더해 pMAL-c5e의 폴리링커로 코드되는 21개의 잔기들로 교체되고, 메티오닌에 의해 앞서는 대장균으로부터의 말토스 결합 단백질로 구성된다.

원천적인 상업적 폴리링커는 몇몇 새로운 엔도뉴클레아제 제한 부위(서열번호:5 및 6)를 포함하도록 변경되어왔다.

SP-C33(Leu) 뉴클레오티드 서열은 합성되고, GeneArt® Gene Synthesis service에 의한 적절한 셔틀 벡터에 클론된다. 뉴클레오티드 서열은 대장균에서의 코돈 사용 빈도에 따라 GeneArt® Gene Synthesis service에 의해 최적화된다. 코돈-최적화는 단지 핵산 서열을 변화시키는 것이지, 코드되는 아미노산 서열의 변화를 주는 것은 아니다. 유전자 설계와 최적화 전략은 소유하는 GeneOptimizer® 소프트웨어 (WO-A-04/059556 및 WO-A-06/013103)를 사용한다 [Raab D., Graf M., Notka F., Schodl T. and Wagner R. "The GeneOptimizer Algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multi-parameter DNA sequence optimization" Syst Synth Biol. 2010; 4: 215-225; Maertens B., Spriestersbach A., von Groll U., Roth U., Kubicek J., Gerrits M., Graf M., Liss M., Daubert D., Wagner R., and Schafer F. "Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli" Protein Science 2010; 19: 1312-1326]. 최적화 파라미터는 코돈 사용(codon usage), 리보좀 진입 부위와 같은 DNA 모티프, GC 양, 및 (역전) 반복(repeat)의 회피를 포함한다. 서열은 i) AvaI-특정 5', ii) 이후의 서브클로닝을 위한 BamHI-특정 3'말단, iii) SpC33Leu 서열에 선행하는 엔테로키나아제 절단 사이트를 코드하고, 리보좀 번역을 종결하는 TAA 정지 코돈을 제공한다. AvaI 및 BamHI는 제한 엔도뉴클레아제이다. AvaI는 이중 가닥의 뉴클레오티드 서열 CYCGRG (여기서 Y=T/C, 및 R=A/G)를 인식하고, C-1이후를 절단한다. BamHI는 CGATCC 서열을 인식하고, G-1의 다음을 절단한다. 효소들은 모두 부착 말단(cohesive end)을 생산한다. 최적화된 유전자들은 이어서, 합성 올리고뉴클레오티드 (de novo 유전자 합성)에 의해 결합되고, SfiI 및 SfiI 클로닝 부위를 사용하여 pMA-T로 클론된다. 최종 구조체는 입증된 서열이다.

전기천공적격(electrocompetent) 대장균 세포에서 SpC33Leu 발현, DNA 증폭, 플라스미드 단리, 정제 및 형질전환을 위한 플라스미드 제조는 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press 2001에서 일반적으로 논의되는 재조합 DNA 기술의 통상적인 프로토콜을 사용하여 수행되었다.

서브클로닝을 위해, SpC33Leu 서열은 AvaI 및 BamHI로 잘라, 돌출된 (protruding) 단일 가닥을 생산한다. 벡터에 혼합(incorporation)은 벡터의 AvaI/BamHI 분해(digestion), 탈인산화(dephosphorylation), 아가로스 젤 전기영동에 의한 필요한 벡터 DNA 단편의 정제, 접착 말단(cohesive end)을 통한 SpC33Leu 단편과 벡터 단편의 혼성화 후에 일어난다. 다음으로, 두개의 단편들은 T4 DNA 리가아제 (New England Biolab)을 이용한 라이게이션에 의해 공유 결합되고, 이후에 박테리아 숙주세포에 형질전환된다. 플라스미드-보유한(harboring) 세포들의 선별은 암피실린을 가지고 LB 아가 플레이트상에 플레이팅에 의해 수행되었다. 플라스미드 DNA는 얻어지는 Amp-저항성 군집으로부터 단리되고, 적절한 제한 효소에 의해 분석된다. 기대되는 DNA 제한 단편 패턴을 가진 클론들이 선택된다. 플라스미드 서열의 BMR Genomics (University of Padua)에 의한 완전 시퀀싱은 SpC33Leu 서열의 올바른 삽입을 확인해준다.

생산 균주 (Producer strain)

생산 균주인 대장균(E. coli) C41(DE3) 및 C43(DE3)은 SP-C33(leu)의 발현을 위해 사용되는데, 이것은 대장균 BL21(DE3)으로부터 유래되고, Lucigen으로부터 구입할 수 있다. 이러한 균주들은 적어도 하나의 비특징적인 변이를 가지고 있어, 많은 재조합 독성 단백질의 발현과 관련있는 세포 사멸을 막기 때문에, 바이러스, 진정세균, 고세균, 식물, 효모, 초파리 또는 포유류 기원의 독성있는 막 단백질의 과 발현에 효과적인 것으로 보고된다.

단백질 발현

재조합 플라스미드는 tac 프로모터의 조절 하에 융합 단백질 MBP-SpC33Leu이 발현되도록 한다. 재조합 융합 단백질은 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도된 후에 숙주세포에서 용해성 형태로 생산된다.

1 ml 전배양 또는 종균 배양(starter culture) (Luria-Bertani 배지 : 10mM의 글루코스 존재하에, 10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출물, 및 10 g/l NaCl)을 LB 플레이트 상에 씨드된(seeded) 글리세롤 배양에 접종되고, 밤새 37℃에서 강한 암피실린 선택 압력 하에 진탕배양한다. 배양물은 배양물의 5ml 접종을 위해 사용된다. 박테리아의 생장은 600nm에서 약 0.6의 광학 밀도에 이를 때까지 계속된다. 배양은 이어서 IPTG를 첨가함으로써 유도된다. 유도 후에, 생장은 세포들이 4℃에서 원심분리에 의해 회수될 때까지 4-5시간 동안 계속된다. 습기있는 바이오매스(moist biomass)를 20mM NH₄HCO₃ 버퍼, pH 7.5에서 재현탁한다. 세포 현탁액은 얼음에서 초음파로 부순다. 박테리아의 용해 후, 발현 혼합물은, 총 단백질 양을 측정하기 위해, 12% Laemmli reducing SDS-PAGE 젤 상에서 확인되었다. 융합 단백질로써 새로운 밴드의 확인은 래빗 항-MBP 항혈청(NEB)을 이용하여 면역블롯팅에 의해 확인되었다. 니트로셀룰로오스 막 상에 블롯팅은 40분동안 10V에서 반건조 기구에서 수행되었다. 트리스 완충 식염수(Tris Buffered Saline), pH 8.0 와 3% 탈지 우유가 블로킹 버퍼로써 이용된다. 1차 항체는 블로킹 버퍼에서 1:10,000으로 희석되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 항-래빗 IgG-퍼옥시다제 콘쥬게이트는 검출을 위해 홀스래디시(horseradish) 퍼옥시다제 기질, 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)과 접합하는 2차 항체로써 사용되었다 (모든 면역블롯팅 시약은 Sigma Aldrich로부터 구입되었다). 유도 후에, MBP와 SpC33 Leu 단편의 조합에 상응하는 융합 단백질의 올바른 분자량의 새로운 우세한 밴드가 SDS-PAGE 와 면역블롯팅 모두에서 검출된다.

융합 단백질의 정제

발현 혼합물로부터의 융합 단백질의 단리는 MBP 친화 크로마토그래피에 의해 가능하게 된다. 조 세포 추출물은 아밀로스로 유도체화(derivatize)된 아가로스 레진을 포함하는 컬럼에 로딩한다 (pMAL 단백질 융합 및 정제 시스템, New England Biolabs). 융합 단백질은 아밀로스에 대한 MBP의 친화도로 인해 컬럼에 결합하고, 10mM 말토스를 포함하는 20mM NH₄HCO₃ 버퍼, pH 7.5로 용출된다. 관심있는 융합 단백질을 포함하는 용출액(eluate)은 12% Laemmli reducing SDS-PAGE 젤상에서 분석되고, 항-MBP 혈청을 사용하여 면역블롯에 의해 확인된다.

MBP-SpC33Leu 융합 단백질의 수율은 배양물 1리터로부터 50-80mg 이다.

MBP와 SP-C33(Leu)를 분리하기 위해 엔테로키나아제에 의한 이후의 절단은 MBP-SpC33Leu 내 Lys-393 및 Ile-394 사이에서 일어난다. Ile-394는 SP-C33(Leu) 펩타이드의 첫번째 아미노산에 상응한다.

융합 단백질의 절단

Lys-393 연결 아미노산에서 융합 단백질 절단하기 위해, 융합 단백질 mg 당 0.02 유닛(unit)의 엔테로키나아제를 용액에 첨가한다. 절단된 분해(cleaved digestion) 소수성 생성물 SpC33Leu의 용해도를 유지하기 위해 1% (v/w) 트리톤 X-100을 절단 용액에 첨가하였다. 용액은 실온에서 적당한 교반과 함께 16시간 동안 그대로 두었다.

단백질 생성물 SpC33Leu의 질량 분석 특징

MBP-SpC33Leu 융합 단백질의 분해 생성물 특성을 확인하기 위해 두개의 다른 방법이 적용되었다. MALDI-MS 고해상도 접근법은 생성물의 단동위(monoisotopic) 분자량을 결정하고, 올바른 서열의 발현과 엔테로키나아제에 의한 융합 단백질의 올바른 절단을 평가하는데 목적이 있다. 참조 표준(reference standard)에 대하여 재조합 생성물의 불순물 프로파일링을 예비적으로 평가하고, 배치(batch)의 재현가능성을 평가하기 위한 선택 방법으로써 HPLC-ESMS가 선택되었다.

SEQUENCE LISTING <110> 1482PCT <120> method for the preparation of surfactant peptides <130> 1482PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> synthetic SP-C peptide <400> 1 Ile Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Leu Gly 20 25 30 Leu <210> 2 <211> 368 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> mutated form of MBP produced by E. coli <400> 2 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SP-C encoding sequence <400> 3 attccgagca gtccggttca tctgaaacgt ctgaaactgt tattactgct gttactgctg 60 attctgctgt taattctggg tgcactgctg ctgggtctg 99 <210> 4 <211> 1106 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> mutated MBP-encoding sequence <400> 4 ttatgaaaat cgaagaaggt aaactggtaa tctggattaa cggcgataaa ggctataacg 60 gtctcgctga agtcggtaag aaattcgaga aagataccgg aattaaagtc accgttgagc 120 atccggataa actggaagag aaattcccac aggttgcggc aactggcgat ggccctgaca 180 ttatcttctg ggcacacgac cgctttggtg gctacgctca atctggcctg ttggctgaaa 240 tcaccccgga caaagcgttc caggacaagc tgtatccgtt tacctgggat gccgtacgtt 300 acaacggcaa gctgattgct tacccgatcg ctgttgaagc gttatcgctg atttataaca 360 aagatctgct gccgaacccg ccaaaaacct gggaagagat cccggcgctg gataaagaac 420 tgaaagcgaa aggtaagagc gcgctgatgt tcaacctgca agaaccgtac ttcacctggc 480 cgctgattgc tgctgacggg ggttatgcgt tcaagtatga aaacggcaag tacgacatta 540 aagacgtggg cgtggataac gctggcgcga aagcgggtct gaccttcctg gttgacctga 600 ttaaaaacaa acacatgaat gcagacaccg attactccat cgcagaagct gcctttaata 660 aaggcgaaac agcgatgacc atcaacggcc cgtgggcatg gtccaacatc gacaccagca 720 aagtgaatta tggtgtaacg gtactgccga ccttcaaggg tcaaccatcc aaaccgttcg 780 ttggcgtgct gagcgcaggt attaacgccg ccagtccgaa caaagagctg gcaaaagagt 840 tcctcgaaaa ctatctgctg actgatgaag gtctggaagc ggttaataaa gacaaaccgc 900 tgggtgccgt agcgctgaag tcttacgagg aagagttggt gaaagatccg cgtattgccg 960 ccactatgga aaacgcccag aaaggtgaaa tcatgccgaa catcccgcag atgtccgctt 1020 tctggtatgc cgtgcgtact gcggtgatca acgccgccag cggtcgtcag actgtcgatg 1080 aagccctgaa agacgcgcag actaat 1106 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> synthetic linker peptide <400> 5 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Pro 1 5 10 15 Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 <210> 6 <211> 75 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> linker-peptide encoding sequence <400> 6 tcgagctcga acaacaacaa caataacaat aacaacaacc tcgggccaga tctgggtacc 60 gatgatgatg ataaa 75

Claims

SP-C 펩타이드, MBP 단백질 및 그 사이에 위치하고 프로테아제 절단 사이트를 보유하는 링커 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 원핵 세포에서 발현하기에 적절한 프로모터 서열과 작동적으로 연결되어 있는 발현 카세트.
제1항에 있어서,
상기 SP-C 펩타이드는 서열번호 1로 나타내어지는 SP-C33(Leu)인 발현 카세트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 MBP 단백질은 서열번호 2로 나타내어지는 발현 카세트.
제1항 또는 제2항에 있어서,
SPC 펩타이드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3인 발현 카세트.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 MBP-코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 4인 발현 카세트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
프로테아제 절단 사이트를 수반하는 상기 링커 펩타이드 및 그것을 코딩하는 서열은 각각 서열번호 5 및 6으로 나타내어지는 발현 카세트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 MBP- 및 SPC- 코딩 서열은 N- 및 C- 말단에 각각 위치되는 발현 카세트.
제1항에 있어서,
상기 프로모터는 유도성 tac 프로모터인 발현 카세트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
제9항에 있어서,
플라스미드인 발현 벡터.
제10항에 있어서,
pBR32-기반 플라스미드인 발현 벡터.
다음의 단계를 포함하는 SPC 펩타이드의 제조 방법:
i) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 융합 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 보유하는 벡터를 제공하는 단계;
ii) 원핵 세포에 상기 벡터를 도입하고, 상기 융합 단백질의 발현이 허용되는 조건하에 상기 세포를 유지하는 단계;
iii) 상기 융합 단백질을 정제하는 단계;
iv) 적절한 프로테아제로 융합 단백질을 절단하고, SP-C 펩타이드를 단리하는 단계.
제12항에 있어서,
상기 원핵 세포는 대장균 박테리아 세포인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 융합 단백질의 정제는 MBP 리간드-결합 레진을 이용하여 친화 크로마토그래피에 의해 수행되는 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
엔테로키나아제 프로테아제가 융합 단백질의 절단을 위해 사용되는 방법.