JP4546089B2 - 融合タンパク質 - Google Patents
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Description
(i)融合ポリペプチドをTolA結合ポリペプチド(例えば、コリシンN又は他のコリシンのTolA認識部位、バクテリオファージg3p‐D1タンパク質のTolA結合領域、或いはTolB又は他のTolタンパク質のTolA結合領域)に結合させるステップ;
(ii)エンドペプチダ−ゼを使用して、TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から非TolAポリペプチドを切断するステップ;及び
(iii)TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から切断された非TolAポリペプチドを分離するステップ;
を含む上記使用が提供される。
(i)融合ポリペプチドのアフィニティータグを結合部分に結合させるステップ;
(ii)エンドペプチダーゼを用いて、TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から非TolAポリペプチドを切断するステップ;
(iii)切断された非TolAポリペプチドを、TolAIIIドメイン或いはその機能性相同体、フラグメント又は誘導体から分離するステップ;
を含む上記方法において、アフィニティータグを含む融合ポリペプチドが使用される。
我々の研究室において、我々は先ず周辺タンパク質TolAのドメインIII(TolAIII)とコリシンNのTドメインの間の融合タンパク質を調製した。TolAIIIがN末端に、TドメインがC末端にある場合、非常に大量の融合タンパク質が単離された。一方、コリシンNのドメインがN末端にあるパートナーである場合には、融合タンパク質の発現は得られなかった。
実施例1
pTolべクターのクローニング
クローニングにおいて使用したオリジナルのベクターは、pET8cと称するpET3cの誘導体(Novagen)であった。pET8cベクターは、pET3cベクターにメチオニンをコードしているヌクレオチドを加え,続いて6個のヒスチジン及び2個のセリン残基をクローニング部位の下流に加えることによって構築した(Politou, A.S. et al., 1994, Biochemistry 33(15): 4730-4737)。pET8cベクターをTolAタンパク質のドメインIII(アミノ酸329−421;配列番号:13)とコリシンNのTドメインの間の融合物の発現に使用した。これは、アンピシリン選択性を提供する、bla遺伝子を有するT7に基づく発現ベクターである。融合タンパク質は、メチオニンに続いて6のヒスチジン及び2のセリンをN末端部分に含む。このリンカーはNiキレートアフィニティークロマトグラフィーを使用する容易な精製を可能とする。融合パートナーはBamHI部位を介して一緒に連結された。融合物のC末端をMluI部位を介してクローニングした。Tドメイン遺伝子を、BamHI及びMluIによって制限することによってベクターから除去した。アダプター配列をその後ベベクター中にライゲーションした。それがフレキシブルリンカー内のBamHI部位を除去したが、新たなBamHI部位をエンドペプチダーゼの切断配列のすぐ後に導入するように構成した(図2)。この方法によって、2(Gly-Ser;配列番号:25)又は4(Gly-Ser-Gly-Thr;配列番号:26)のアミノ酸のタグをそれぞれN末端に残して、融合されたパートナーをpTolベクター内にBamHI又はKpnI部位を介してクローニングすることができる(図2を参照のこと)。
エンテロキナーゼのための、
E(+) (5'−GATCTGATGATGACGATAAAGGATCCGGTACCTGATGAA−3';配列番号:27)及び
E(−) (5'-CGCGTTCATCAGGTACCGGATCCTTTATCGTCATCATCA-3’;配列番号:28)
第Xa因子のための、
X(+) (5’-GATCTATTGAAGGTCGCGGATCCGGTACCTGATGAA-3’;配列番号:29)
及び
X(−) (5’-CGCGTTCATCAGGTACCGGATCCGCGACCTTCAATA-3’;配列番号:30)
トロンビン切断部位のための、
T(+) (5’-GATCTCTGGTTCCGCGCGGATCCGGTACCTGATGAA-3’;配列番号:31)及び
T(−) (5’-CGCGTTCATCAGGTACCGGATCCGCGCGGAACCAGA-3’;配列番号:32)
を有するオリゴヌクレオチド(すべてのオリゴヌクレオチドはMWG Biotchから入手した)をアダプターとして使用した。
すべてのタンパク質を(Novagenからの)大腸菌BL21(DE3)pLysE菌株中で発現させた。株をプラスミドで形質転換し、適切な選択(アンピシリン、クロラムフェニコール)を伴うLBプレート上で増殖させた。1のコロニーを5mlのLBSC培地(100μg/mlのアンピシリン、34μg/mlのクロラムフェニコール、どちらもSIGMAから )に接種するために使用した。細菌を回転するホイール上で37℃において増殖させた。60分後に組換えタンパク質の発現を(最終)1mMのIPTGを加えることによって誘導し、細菌をさらに4時間増殖させた。(1mlに再懸濁した時にA600が0.5である細菌の容量にあたる)少ないサンプルをSDS-PAGE上で分析した。ゲルをクマシーで染色し、商業的なスキャナーを用いて600dpiでスキャンした。発現されたタンパク質を、プログラムTina2.0を用いてゲルから見積もった。大規模な発現のためには、静止期の培養細菌の5mlを、250mlのLBAC培地に接種するために使用し、180rpmのオービタルシェイカー上で37℃で一夜増殖させた。翌朝20〜25mlの一夜培養物を500mlのM9 LBAC培地の接種に使用した。全部で3〜5Lの培養細菌を1のタンパク質について増殖させた。細菌を同じ条件でA600が約0.8に達するまで培養した。そして、最終濃度1mMまでIPTGを加えることによって、組換えタンパク質の産生を誘導した。細菌をさらに4〜5時間増殖させ、4℃において5000rpmで5分遠心分離し、−20℃で保存した。
沈殿させた細菌を、以下の酵素及びプロテアーゼ阻害剤(最終濃度)を含む50mMnのNa2H2PO4、pH8.0、300mMNaCl、10mMイミダゾール、20mMβメルカプトエタノール(緩衝液A)に再懸濁した(緩衝液2ml/g細胞):DNase(10μg/ml)、RNase(20μg/ml)、リゾチーム(1mg/ml緩衝液)、PMSF(0.5mM)、ベンザミド(1mM)。それらを氷上で1時間インキュベートし、ときどき激しく振った。再懸濁された細菌を3分間、Branson ソニケーターでソニケーションし、その後、Beckman 超遠心機中で40000rpm、4℃、45tiのローター中で遠心分離した。上清を除去し、4℃においた。ペレットを酵素及び阻害剤をふくまない、同じ緩衝液(1ml/g重量)で再懸濁し、氷上で15分保った。同じ条件におけ遠心分離は、1分の追加のソニケーションの後に行った。両方の遠心分離物の上清を併合し、約1ml/分で1〜3mlの緩衝液Aで平衡化したNi-NTA樹脂(Quiagen)に適用した。典型的には、結合したタンパク質を有するカラムを2画分の3mlの300mMの緩衝液A、2画分の20mMイミダゾールを含む緩衝液A、そして6〜10画分の300mMイミダゾールを含む緩衝液Aで洗浄した。各画分をSDS-PAGE上で分析した。着目の分画をプールし、水に対して3回透析した(5l)。純度をSDS-PAGEによってチェックした。タンパク質を3mMNaN3中4℃で保存した。タンパク質濃度を、配列から計算した励起係数を使って決定した。
不溶性の発現タンパク質の量を知るために、すべての細菌タンパク質を分別した。100mlのブロスから沈殿した細菌を40mlの20%ショ糖、1mM EDTA、30mMTris-HCl、pH8.0中に再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。それらを9000g、4℃で10分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを8mlの氷冷5mMMgSO4中に穏やかに再懸濁した。細菌を穏やかに振とうし、氷上で10分間インキュベートした。細菌プロトプラストを同じ条件で再び遠心分離した。上清をペリプラスム画分同様に除去した。ペレットを10mlの1mgのリゾチーム、及びベンズアミジンを含む20mM NaH2PO4、pH8.0で再懸濁した。それを激しく振とうし、氷上30分間インキュベーションし、5×30秒でソニケーションした。35000g、4℃で30秒間ソニケーションすることによって細胞質たんぱく質を不溶性物質から除去した。上清を除去し、細胞質画分及びペレットを不溶性画分(膜たんぱく質及び推定の封入物)として、2mlの8M尿素、10mM Tris-HCl、pH 7.4、0.5%Triton X-100に4℃で再懸濁した。
コリシンNの純粋なR-ドメインを、pTol発現系を用いて作製した。45mgのTolAIII-R-ドメインを35mlの切断混合物中で20℃で20時間インキュベートした。切断混合物は、作製者によって特定された緩衝液及び0.1U/mg融合タンパク質のトロンビン(制限グレード、Novagen)を含む。切断された産物を4℃で、5lの40mM Tris-HCl、pH8.4、に対して各回少なくとも4時間で、3回透析した。切断されたRドメインをTolAIII及び非切断融合タンパク質から、FPLCシステム(Pharmacia)上のイオン交換クロマトグラフィーによって分離した。タンパク質をMono S カラム(Pharmacia)に、1ml/分で、40mM Tris-HCl、pH8.4中で適用した。未結合の物質をカラムから洗い流した後、NaClの同じ緩衝液中の0〜500mMのグラジエントを30分間で適用することによってR−ドメインを溶出した。NaCl約70%(約350mM)において大きなピークを集め、純度のSDS-PAGEによるチェックを行った。
pTolベクターのクローニング
BCL-XLをコードしているDNAフラグメントをプラスミドpETBCLXLからオリゴヌクレオチドSenseBCL-STU(5’-TTT TTTAGG CCT TCT CAG AGC AAC CGG GAG-3’ 配列番号:60 )及びMlu-BCL-Rev(5’-TTT TAC GCG TTC ATT TCC GAC TGA AGAG-3’ 配列番号:61)を用いてPCRによって増幅した。Stu I及びMlu I制限部位を用いてBCL-XLをpTOLTプラスミド中に導入した。最終的なプラスミドをpTOLT-BCLXLを名づけ(図7)、このプラスミドのDNA配列決定は、DNAフラグメントをコードしているBCL-XLが正確に挿入されたことを示した。
BCL-XLタンパク質を大腸菌BL21 DE3(pLsE)菌株中で発現させた。この株はプラスミドで形質転換し、アンピシリン(200μg/ml)及びクロラムフェニコール(35μg/ml)選択培地のLBプレート上で増殖させた。抗生物質を含む5mlのLB培地を単一のコロニーで接種し、37℃で一夜培養した。5mlの一夜培養物を、2リッターフラスコ中の500mlのアンピシリン及びクロラムフェニコール含有LB培地中に導入した。細菌をOD600が0.8になるまで培養し、最終濃度1mMのIPTGを加えることによって誘導し、続いて3時間培養した。細胞を採取し、RNAse、DNAse、PMSF(1mM)及びベンザミジン(1mM)を含む20mMリン酸緩衝液、300mM NaCl、pH:8.0中で再懸濁した。細胞をフレンチプレスで破砕し、40000rpmの超遠心を1時間行って上清を得た。N末端6Xヒスチジン‐タグ(配列番号:8)はNi-NTAアフィニティーカラムによるTol-BCL融合物の精製を容易にした。融合タンパク質を20mMリン酸緩衝液、300mM NaCl、pH:8.0を用いてカラム上で洗浄し、さらに50mMイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄し、300mMイミダゾール、pH7.0中で溶出した。融合タンパク質の発現をSDS−PAGEによって分析し(図8)、タンパク質濃度を280nmのUV吸収によって決定した。
20mgのTolA-BCL融合物を20mMの切断緩衝液中で4℃で4時間インキュベートした。切断緩衝液は、50mM Tris-HCl 、150mM NaCl、2.5mM CaCl2、5mM DTT及びトロンビン(トロンビン1ユニット(Sigma)/mgの融合タンパク質)開裂緩衝液を含む。一夜透析した切断混合物をNi-NTAカラムに適用することによって、放出されたタンパク質を回収した。未結合のタンパク質をカラムから洗い流した後、残ったBCL-XLタンパク質を2M NaClで洗浄した。すべての流出液及び洗浄液を集め、SDS-PAGEで分析した(図9)。トロンビン切断後のタンパク質の収率を280nmにおけるUV吸収を用いて計算した。
大腸菌におけるTolAIIIタンパク質の発現
実施例1において、タグを有するTolAIIIの第3のドメインを3の異なる発現ベクター、pTolE、pTolF及びpTolXから発現させた(図3)。各場合においてTolAIIIの発現は非常に多く、すべての細菌タンパク質の40%に達した(図3Aを参照のこと)。特別には、pTolTから発現されたTolAIIIは26.96%±1.67(n=5)であった。発現されたTolAIII量は、どのベクターを使用したかにかかわらずおよそ同じであった。細菌中で発現されたTolAは正常の細菌の代謝を妨害しなかった。増殖曲線は、誘導された、又は誘導されない細菌についてのものに非常に類似していた(図3B)。すべてのTolAIIIタンパク質は可溶性の形態で発現した。浸透圧による溶菌、リゾチーム処理、ソニケーション、及び遠心分離後に残った細菌のペレットの視覚的観察によれば、封入体は見られなかった。さらには、TolAIIIは、細菌からのタンパク質の分別後の不溶性画分中には見出されなかった。不溶性画分は膜タンパク質及び封入体中の組み換えタンパク質も含むことを表す(図3C)。TolAIIIを含む細菌は正常の細菌に比べてわずかに壊れやすい。周辺タンパク質のみを放出させるおだやかな低浸透圧処理後に、TolAIIIはすでに細胞から放出された。
他のタンパク質の発現及び調製のためのpTol発現系の好適性を調べるために10のタンパク質を試験した(実施例1、表1、及び実施例2を参照のこと)。これらは、原核細胞を代表する、コリシンNの異なる部分及びドメイン(TolA結合ボックス(アミノ酸40-76のペプチド)、Tドメイン(△10)及びRドメインの欠失突然変異体)であった。ヒトホスホリパーゼA2、イソギンチャクエキナトキシンIIからの孔形成タンパク質、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、ヒトミトコンドリアピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ2(PDK2)及びBCL-XLは真核生物タンパク質の代表である。膜貫通タンパク質は、BcrC、B.リシェニホルミスからのバシトラシン耐性系の構成要素、及びヒトCFTRの膜貫通ドメイン1(TM1)により代表される。選ばれたタンパク質は大きさ(コリシン40−76kDaの約4.4対PDK2の44kDa)、遺伝コード(原核生物のタンパク質対真核生物のタンパク質)、タンパク配置(可溶性のタンパク質対膜タンパク質)及びジスルフィド含量(PLA2、7ジスルフィド対エキナトキシン、なし)において変動を示す。pTol 系を使用すると、融合タンパク質を大腸菌中で高い割合で発現させた(図4)。また、発現はいくつかの場合に40%もの高率であったが、平均は20−25%であった(図4B及びCの下のパネルを参照のこと)。例外は膜タンパク質BcrC及びTM1の2のみであった。この場合、それらの大きさに対応するバンドはゲル中になかった(図4C)。TolAIIIのみの発現とは反対に、融合タンパク質の発現は細菌の増殖を妨害しなかった。PLA2及び膜タンパク質であるTM1及びBcrCの場合、増殖の最後における細菌量はいくつかの場合において半分であった。興味深いことに、細菌中のPDK2の融合物の発現は正の効果を有し、増殖の最後では常に細菌がわずかに多かった(示さない)。細菌により発現される融合物のいくつかをさらに分別した。PDK2及びPLA2は不溶性の封入体として発現された。EqtII及びRドメインは主に不溶性画分中に見出されたが、いくらかの割合は細胞質画分中にも見出された(発現されたタンパク質の10〜25%)(示さない)。
実施例1において、発現された融合物を緩衝溶液中への単純な抽出によって細胞質から単離し、それをNi-NTAカラムに加えた。この1のステップによって、タンパク質の純度はすでに95%よりも高い(図5)。単離された融合物の収率は平均して50mg/lの細菌ブロスであるが、最高90mg/lに達した(図2)。主に封入体として発現されるタンパク質でさえ、この手順によって顕著な量で単離され、それはすなわち11mg/mlのEqtII融合物が単離されたということであった。融合タンパク質の1であるTolE-Tドメイン40-76を、NMRによる構造決定に好適なペプチドサンプルの調製に使用した。それは、15NH4Cl含有M9最小限培地中で発現される。最小限培地中でさえ、顕著な量で融合物を発現及び産生することができ、細菌培養1リッターあたりおよそ70mgの純粋な融合物が得られた。
アミノ酸数 : 348
分子量 : 38048.5
pI理論値 : 5.83
アミノ酸組成:
陽性に荷電した総残基数(アルギニン+リジン) :33
吸光係数 :
条件:6.0M 塩酸グアニジン、0.02M リン酸緩衝液、pH 6.5
吸光係数はM-1cm-1の単位で表す。
最初の表はすべてのシステイン残基がシスチンの半分であると仮定した場合のコンピューターによる値を列挙し、第2の表はそのようなシステインがないとした場合の値である。
アミノ酸数 : 236
分子量 : 26329.2
pI理論値 : 4.94
アミノ酸組成:
陽性に荷電した総残基数(アルギニン+リジン) :21
吸光係数 :
条件:6.0M 塩酸グアニジン、0.02M リン酸緩衝液、pH 6.5
吸光係数はN-1cm-1の単位で表す。
最初の表はすべてのシステイン残基がシスチンの半分であると仮定した場合のコンピューターによる値を列挙し、第2の表はそのようなシステインがないとした場合の値である。
細菌細胞質中で、TolAIIIが大量に可溶性の形態で発現された。タンパク質の大腸菌中での高い発現の理由には、最もよく言われる適切なコドンの使用、mRNA転写物の安定性、大きさ、ジスルフィド結合の含量、及び細胞への無毒性がある。TolAIIIは1のジスルフィド結合のみを有する小さなタンパク質である。それは非常に安定であり、30mg/mlという高濃度においても溶液中でモノマーである(分析的超遠心及びゲル濾過のからのデータ、しめさない)。細菌の細胞質中における異種性の物質に対する耐性において、サイズの小さいことと凝集しない傾向は確かに重要である。TolAIII遺伝子のさらなる利点は、それが細菌のタンパク質であり、それ自体めったに大腸菌ゲノムで転写されない5のコドンのみを有するということである(プロテアーゼ切断部位を除く106のアミノ酸の4.7%)。それらは、配列にそって散在する。その発現の増大は、そのmRNA転写物の立体配置の処理によって達成されることができた。転写されたRNAについては、RNAの立体配置は時にはリボソーム結合部位及び開始コドンが露出され、塩基対に含まれないようなものであることが示された。TolAIIImRNAの場合、そのどちらもが短い基部の構築に含まれ、常に完全に露出しているわけでない(http://bioinfo.math.rpiedu/〜zukerm/)のMfold による60〜120ヌクレオチド(10ntのステップ)の転写されたRNAの分析)。T7に基づくベクター中でのTolAIIIタンパク質の高い発現及び純粋な生成物の高い収率は、大腸菌における融合タンパク質の現存の系に匹敵するか、より高い。
Claims (38)
- 宿主細胞中での発現のための融合ポリペプチドであって、
(a)発現が所望される、Hisタグ以外の非TolAポリペプチド;及び
(b)前記宿主細胞中での該融合ポリペプチドの発現が増加するようにもたらすためのTolAIIIドメイン
を含み、ここで、上記TolAIIIドメインが上記融合ポリペプチドのN末端側に配置され、且つ上記非TolAポリペプチドが上記融合ポリペプチドのC末端側に配置される、前記ポリペプチド。 - さらにシグナルペプチドを含む、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 上記シグナルペプチドが上記融合ポリペプチドのN末端に配置される、請求項2に記載の融合ポリペプチド。
- 上記TolAIIIドメインが、上記宿主細胞中での発現のためにコドン最適化された、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記TolAIIIドメインと上記非TolAポリペプチドとの間のリンカーをさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記リンカーがエンドペプチダーゼのための切断部位を少なくとも1つ含む、請求項5に記載の融合ポリペプチド。
- 上記切断部位がアミノ酸配列DDDDK[配列番号:3]及び/又はLVPR[配列番号:4]及び/又はIEGR[配列番号:5]を含む、請求項6に記載の融合ポリペプチド。
- さらにアフィニティー精製タグを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記アフィニティー精製タグが上記融合ポリペプチドのN末端に配置される、請求項8に記載の融合ポリペプチド。
- 上記アフィニティー精製タグが、nが4,5,6,7,8,9又は10[それぞれ、配列番号:6〜12]であるN末端Hisnタグである、請求項9に記載の融合ポリペプチド。
- 上記Hisnタグが、1又は2個のSer残基で上記融合ポリペプチドに連結される、請求項10に記載の融合ポリペプチド。
- 上記TolAIIIドメインが大腸菌TolA配列[SwissProt 引き受け番号P19934]のアミノ酸残基329〜421[配列番号:13]から成る、請求項1〜11のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記宿主細胞が細菌細胞である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記宿主細胞が大腸菌である、請求項13に記載の融合ポリペプチド。
- 上記非TolAポリペプチドがBCL−XLである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドをコードしている、DNA分子。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの発現のための、請求項16に記載のDNA分子を含む、発現ベクター。
- 上記融合ポリペプチドの発現を推進する誘導プロモーターを有する、請求項17に記載の発現ベクター。
- 抗生物質耐性マーカーを有する、請求項17又は18に記載の発現ベクター。
- 上記TolAIIIドメインをコードしているDNAを、上記非TolAポリペプチドをコードしているDNAのクローニング部位にフレーム内挿入を可能とするクローニング部位の上流又は下流に含む、請求項17〜19のいずれか1項に記載の発現ベクターを産生するためのクローニングベクター。
- エンドペプチダーゼのための少なくとも1つの切断部位をコードしているDNAをさらに含む、請求項20に記載のクローニングベクターであって、上記切断部位が上記TolAIIIドメインをコードしているDNAと上記クローニング部位との間に配置される、前記クローニングベクター。
- 上記切断部位が、アミノ酸配列DDDDK[配列番号:3]及び/又はLVPR[配列番号:4]及び/又はIEGR[配列番号:5]を有する、請求項21に記載のクローニングベクター。
- 上記クローニング部位が少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ標的配列を含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 請求項8または9に定義されたアフィニティー精製タグをコードしているDNAをさらに含む、請求項20〜23のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 誘導プロモーターをさらに含む、請求項20〜24のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 抗生物質耐性マーカーをコードしているDNAをさらに含む、請求項20〜25のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 図2に記載したpTolE、pTolT又はpTolXの構造を有する、請求項20〜26のいずれか1項に記載のクローニングベクター。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの産生のための、上記TolAIIIドメインの使用。
- 請求項16に記載のDNA分子の産生のための、上記TolAIIIドメインの使用。
- 請求項17〜19のいずれか1項に記載の発現ベクターの産生のための、上記TolAIIIドメインの使用。
- 請求項20〜27のいずれか1項に記載のクローニングベクターの産生のための、上記TolAIIIドメインの使用。
- 請求項16に記載のDNA及び/又は請求項17〜19のいずれか1項に記載の発現ベクター及び/又は請求項20〜27のいずれか1項に記載のクローニングベクターを含む宿主細胞。
- 上記非TolAポリペプチドを固定化するための、請求項5〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ:
上記融合ポリペプチドをTolA結合ポリペプチドに結合させるステップ;
を含む、前記使用。 - 上記TolA結合ポリペプチドが、コリシンN又は他のコリシンのTolA認識部位、バクテリオファージg3p−D1タンパク質のTolA結合領域、或いはTolB又は他のTolタンパク質のTolA結合領域である、請求項33に記載の使用。
- 上記非TolAポリペプチドの固定化のための、請求項8〜11のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ:
上記融合ポリペプチドの上記アフィニティー精製タグを該アフィニティー精製タグに結合する結合部分に結合させるステップ;
を含む、前記使用。 - 上記非TolAポリペプチドの精製及び単離のための、請求項6〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ:
(i)上記融合ポリペプチドをTolA結合ポリペプチドに結合させるステップ;
(ii)上記TolAIIIドメインから上記非TolAポリペプチドをエンドペプチダーゼを使用して切断するステップ;及び
(iii)上記切断された非TolAポリペプチドを上記TolAIIIドメインから分離するステップ;
を含む、前記使用。 - 上記非TolAポリペプチドの精製及び単離のための、請求項8〜11のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドの使用であって、以下のステップ:
(i)上記融合ポリペプチドの上記アフィニティー精製タグを該アフィニティー精製タグに結合する結合部分に結合させるステップ;
(ii)上記TolAIIIドメインから上記非TolAポリペプチドをエンドペプチダーゼを用いて切断するステップ;及び
(iii)上記切断された非TolAポリペプチドを上記TolAIIIドメインら分離するステップ;
を含む、前記使用。 - 宿主細胞中における融合ポリペプチドとしてのポリペプチドの高い発現のための方法であって、請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドとして上記ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるステップを含む、前記方法。
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