ES2392424T3

ES2392424T3 - Proteínas de fusión

Info

Publication number: ES2392424T3
Application number: ES03700857T
Authority: ES
Inventors: Isa Gazios Gokce; Gregor Anderluh; Jeremy Hugh Lakey
Original assignee: Newcastle University Ventures Ltd
Current assignee: Newcastle University Ventures Ltd
Priority date: 2002-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2012-12-10
Anticipated expiration: 2023-01-10
Also published as: EP1465999B1; AU2003202005B2; NZ533892A; US7348408B2; EP1465999A2; WO2003057708A3; JP4546089B2; US20050130269A1; JP2005514028A; WO2003057708A2; AU2003202005A1; CA2472328A1; GB0200689D0

Abstract

Un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora, en el que dicho polipéptido de fusión tiene,en la secuencia, una estructura básica que comprende un extremo N terminal, un dominio TolAIII para obtener unaexpresión aumentada del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera no TolA cuyaexpresión se desea y un extremo C terminal y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificaciónpor afinidad.

Description

Proteínas de fusión

La presente invención se refiere a proteínas de fusión (polipéptidos de fusión), particularmente para su uso en sistemas de expresión y/o purificación.

Las proteínas purificadas son necesarias para diversas aplicaciones. Sin embargo, algunas veces, el aislamiento de proteínas puras en cantidades suficientes es problemático. Para estudios de función de proteínas, a menudo se necesitan grandes cantidades de una proteína de interés (por ejemplo una proteína mutada). Para la producción de proteínas heterólogas se han usado diversos sistemas de expresión. Escherichia coli (E. coli) continúa siendo el hospedador más común a pesar de los enormes avances realizados en otros hospedadores en el área de la expresión de proteínas en los diez últimos años. E. coli es muy conocida porque la expresión de proteínas en la bacteria es relativamente sencilla y existe una inmensa cantidad de conocimiento sobre la propia bacteria y por (lo que algunas veces es más importante) el bajo coste asociado con la producción.

Las proteínas que pueden expresarse en E. coli directamente o como fusiones (de un “compañero de fusión” y una proteína o polipéptido), también se conocen como proteínas de fusión. La finalidad de los compañeros de fusión es proporcionar etiquetas de afinidad (por ejemplo una etiqueta Hisn, etiquetas de glutatión-S-transferasa, de dominio de unión a celulosa, de inteína) para hacer proteínas más solubles (por ejemplo glutatión-S-transferasa), para permitir la formación de enlaces disulfuro (por ejemplo tiorredoxina) o para exportar proteínas fusionadas al periplasmo donde las condiciones para la formación de enlaces disulfuro son más favorables (por ejemplo, DsbA y DsbC). Las proteínas usadas como compañeros de fusión son normalmente pequeñas (menores de 30 kDa).

La proteína TolA es una proteína periplasmática implicada en (1) mantener la integridad de la membrana interna y

(2) la captación de colicinas y bacteriófagos. La primera función se pone de manifiesto por el aumento de la inestabilidad de la membrana externa (por ejemplo sensibilidad a SDS) de mutantes TolA-. Diversos autores han demostrado esta función y puede depender de la interacción con la proteína TolB (Levengood-Freyermuth et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 222-228; Wan & Baneyx, 1998, Protein Expression & Purification 14: 13-22). Wan y Banex (1998, citado anteriormente) han demostrado que la co-expresión del dominio TolAIII C-terminal de TolA (véase más adelante) facilita la recuperación de proteínas recombinantes periplasmáticas en el medio de cultivo de E. coli, lo que confirma que la sobreproducción del dominio TolAIII rompe la membrana externa y hace que las proteínas periplasmáticas se filtren al medio de cultivo.

La segunda función de TolA se basa en el uso de TolA como un receptor por proteínas de fagos (Lubkowski, J. et al., 1999, Structure With Folding & Design 7: 711-722) y colicinas (Gokce, I. et al., 2000, J. Mol. Biol. 304: 621-632). Esto se ha puesto de manifiesto por la resistencia a fagos/colicina de mutantes de TolA y por demostración directa de las interacciones de TolA-proteína mediante métodos físicos. La proteína TolA se compone de tres dominios. Un domino corto N terminal está compuesto de una sola hélice transmembrana, que ancla a TolA a la membrana interna. El segundo dominio, más largo, es polar y principalmente a-helicoidal. Un dominio III C terminal (TolAIII) es pequeño y se compone de 92 aminoácidos. Su estructura 3D se explicó recientemente en un complejo con el dominio N1 de la proteína del gen 3 de recubrimiento menor de bacteriófagos filamentosos Ff (Holliger, P. et al., 1999, J. Mol. Biol. 288: 649-657). Está estrechamente plegada dentro de una proteína ligeramente alargada con la ayuda de un enlace disulfuro (Figura 1).

Lubkowski et al. (1999; citado anteriormente) describen una proteína de fusión que comprende 1-86 restos (el dominio N1) de la proteína del gen 3, g3p, de recubrimiento menor de bacteriófagos Ff hacia el extremo N y los restos 295-425 (incluyendo el dominio TolAIII) de TolA, un correceptor de g3p, hacía el extremo C y una cola de Ala3His6 C-terminal (SEC ID Nº: 1). Lubkowski et al. utilizaron la proteína de fusión para aclarar la estructura cristalina de un complejo formado entre los dominios TolAIII y N1 de g3p.

Se conocen diversos homólogos de la proteína TolA, por ejemplo de E. coli (Nº de acceso en SwissProt P19934), de especies de Salmonella (por ejemplo Nos de acceso en Genbank gi16764117 y gi1675986, especies de Pectobacterium (por ejemplo Nº de acceso en Genbank gi16116636) y especies de Haemophilus (por ejemplo Nº de acceso en Genbank gi2126342).

Los autores de la presente invención han descubierto que el domino TolAIII tiene propiedades destacables que son de particular uso como una proteína compañera de fusión para conseguir altos niveles de expresión en una célula hospedadora.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora, en el que el polipéptido de fusión tiene una estructura básica, en secuencia, un extremo N, un dominio TolAIII para conseguir potenciar la expresión del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera que no es TolAI cuya expresión se desea y un extremo C, y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificación por afinidad.

Como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido” y “proteína” son sinónimos y se refieren a una secuencia de dos o más restos aminoacídicos unidos.

Los autores de la presente invención han demostrado que, cuando el dominio TolAIII se localiza hacía el extremo N de un polipéptido de fusión, facilita niveles más altos de los esperados de la expresión del polipéptido de fusión TolAIII en una célula hospedadora. Las fusiones al dominio TolAIII serán útiles, por ejemplo, para obtener proteínas y polipéptidos compañeros purificados y/o para estudiar las propiedades de estos compañeros.

El polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un péptido de señal. Esto permitirá que el polipéptido de fusión se dirija a una localización intra-o extra-celular específica. El péptido de señal puede localizarse en el extremo N o cerca del extremo N del polipéptido de fusión. El péptido de señal puede escindirse del polipéptido de fusión durante el proceso de direccionamiento.

Teniendo el polipéptido de fusión la estructura básica: extremo N-TolAlll -proteína compañera -extremo C, puede esperarse que se expresará en altos rendimientos en el citoplasma. Los péptidos de señal que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención se ajustan a una serie de normas generales que se describen en Von Heijne, G. 1985, J. Mol. Biol. 184 (1): 99-105.

El dominio TolAIII puede optimizarse con codones para la expresión en la célula hospedadora.

El polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un conector entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAIII. El conector puede proporcionar una separación física entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAIII o puede ser funcional. El conector puede comprender al menos un sitio de escisión para una endopeptidasa. Por ejemplo, el sitio de escisión puede comprender la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEC ID Nº: 3; para enteroquinasa) y/o LVPR (SEC ID Nº: 4; para trombina) y/o IEGR (SEC ID Nº: 5; para el factor Xa).

En una realización, el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente una etiqueta de purificación por afinidad. La etiqueta de purificación por afinidad puede localizarse en o cerca del extremo N del polipéptido de fusión. Por ejemplo, la etiqueta de purificación por afinidad es una etiqueta Hisn Nterminal, siendo n=4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (SEC ID Nos: 6-12, respectivamente; preferentemente n=6 [SEC ID Nº: 8]), opcionalmente con la etiqueta Hisn unida al polipéptido de fusión mediante uno o más restos de Ser (preferentemente dos). La etiqueta de purificación por afinidad proporcionará un medio para inmovilizar el polipéptido de fusión, tal como, por ejemplo, una etapa en la purificación.

En una realización, el polipéptido de fusión comprende un péptido de señal en el extremo N y una etiqueta de purificación por afinidad cerca del extremo N. Si el péptido de señal se escinde del polipéptido de fusión durante el direccionamiento, entonces la etiqueta de purificación por afinidad puede localizarse en o más cerca del nuevo extremo N de la proteína de fusión.

Preferentemente, el dominio TolAIII consta de 329-421 restos aminoacídicos (SEC ID Nº: 13) de la proteína TolA de Escherichia coli (Nº de acceso en SwissProt P19934).

La célula hospedadora puede ser bacteriana (por ejemplo, Escherichia coli).

La proteína compañera no TolA del polipéptido de fusión puede ser la proteína BCL-XL humana (Nº de acceso en SWISSPROT B47537). El polipéptido de fusión con la BCL-XL humana puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14 o SEC ID Nº: 15. Como se muestra en el Ejemplo 2, más adelante, pueden generarse grandes cantidades de BCL-XL (una proteína importante en la investigación de la apoptosis y el cáncer) mediante expresión como un polipéptido de fusión TolAIII.

Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una molécula de ADN que codifica el polipéptido de fusión como se ha definido anteriormente. Cuando la molécula de ADN se transcribe, las propiedades del ARNm pueden optimizarse para la expresión en la célula hospedadora.

También se proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ADN, como se define anteriormente, para la expresión del polipéptido de fusión de la invención. El vector de expresión puede tener un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible por IPTG) que dirige la expresión del polipéptido de fusión. El vector de expresión también puede tener un marcador de resistencia a antibióticos (por ejemplo, el gen bla, que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol).

En otro aspecto de la invención se proporciona un vector de clonación para producir el vector de expresión como se define anteriormente, que comprende ADN que codifica el dominio TolAIII cadena arriba o cadena abajo a partir de un sitio de clonación que permite la inserción en fase de lectura del ADN que codifica una proteína compañera no TolA. El vector de clonación puede comprender adicionalmente ADN que codifique al menos un sitio de escisión (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos DDDDK [SEC ID Nº: 3] y/o LVPR [SEC ID Nº: 4] y/o IEGR [SEC ID Nº: 5]) para una endopeptidasa, el sitio de escisión localizado entre el ADN que codifica el dominio TolAIII y el sitio de clonación. El sitio de clonación puede comprender al menos una secuencia diana para endonucleasas de restricción (por ejemplo, BamHI y/o KpnI). El vector de clonación puede comprender adicionalmente ADN que codifique una etiqueta de purificación por afinidad como se define anteriormente. El vector de clonación puede comprender adicionalmente un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible por IPTG) y/o ADN que codifique un marcador de resistencia a antibióticos (por ejemplo, el gen bla, que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol).

Por ejemplo, el vector de clonación puede tener la estructura de pTolE, pTolT o pToIX (como se muestra en la Figura 2 con referencia a la descripción).

También se proporciona el uso del dominio TolAIII para producción de un polipéptido de fusión como se define anteriormente.

Adicionalmente se proporciona el uso del dominio TolAIII para la producción de la molécula de ADN como se define anteriormente.

Adicionalmente incluso se proporciona el uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de expresión como se define anteriormente.

También se proporciona el uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de clonación como se define anteriormente.

En un aspecto se proporciona una célula hospedadora que contiene el ADN como se define anteriormente y/o el vector de expresión como se define anteriormente y/o el vector de clonación como se define anteriormente.

En otro aspecto se proporciona el uso del polipéptido de fusión como se define anteriormente para la inmovilización de la proteína compañera no-TolA, que comprende la etapa de:

unir el polipéptido de fusión a un polipéptido de unión a TolA (por ejemplo, el sitio de reconocimiento de la colicina N a TolA [Gokce et al., 2000, citado anteriormente] u otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína g3p-D1 de bacteriófagos [Riechmann & Holliger, 1997, Cell 90: 351 -360], o la región de unión a TolA de TolB u otras proteínas Tol).

Se sabe que TolAIII interacciona específicamente con diversas proteínas de origen natural tales como colicinas, proteínas de fagos y otras proteínas Tol. Esta variedad de compañeros de unión existentes hace que la sobreexpresión de las proteínas de fusión TolAIII sea de particular utilidad ya que esas proteínas pueden usarse en tecnologías de purificación o inmovilización. Por lo tanto el dominio TolAIII no solo conduce alta expresión del polipéptido de fusión sino que también proporciona una etiqueta de afinidad para purificación, inmovilización o análisis del polipéptido de fusión. Las proteínas de unión a TolAIII (o de unión a sus dominios polipeptídicos) podrían usarse para proporcionar sitios de unión para las fusiones TolAIII (como en la Figura 6). Podrían prepararse microplacas de proteínas usando estas proteínas de unión a TolAIII que después uniesen las proteínas de fusión TolAIII. Esto proporcionaría una manera de inmovilizar una amplia diversidad de proteínas sobre la superficie usando la fusión de TolAIII como la interacción normal.

Como alternativa, el polipéptido de fusión que comprende una etiqueta de afinidad como se define anteriormente puede usarse para la inmovilización de la proteína compañera no TolAI, que comprende la etapa de:

unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión.

También se proporciona el uso del polipéptido de fusión como se define anteriormente para la purificación y aislamiento de la proteína compañera no TolAI que comprende las etapas de:

(i): unir el polipéptido de fusión a un polipéptido de unión TolA (por ejemplo el sitio de reconocimiento a TolA de la colicina N u otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína gp3-D1 de bacteriófagos, o la región de unión a TolA de TolB u otras proteínas Tol);

(ii): escindir la proteína compañera no TolA del dominio TolAIII usando una endopeptidasa; y

(iii) separar la proteína compañera no TolA escindida del dominio TolAIII.

En una realización alternativa, el polipéptido de fusión que comprende una etiqueta de afinidad puede usarse para la purificación y aislamiento de la proteína compañera no-TolA que comprende las etapas de:

(i): unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión;

(iii) separar la proteína compañera no TolA escindida del dominio TolAIII.

El polipéptido de fusión que se describe en el presente documento puede usarse para estudiar las propiedades de interacción de la proteína compañera no TolA o del polipéptido de fusión, por ejemplo auto-interacción, interacción con otra molécula o interacción con un estímulo físico.

También se proporciona un método para la alta expresión de un polipéptido como un polipéptido de fusión en una célula hospedadora, que comprende la etapa de expresar el polipéptido como un polipéptido de fusión como se define anteriormente en una célula hospedadora. Los niveles de expresión de un polipéptido como una proteína de fusión definida en el presente documento serán relativamente altos con respecto a niveles de expresión de un polipéptido no unido al dominio TolAIII.

La invención se describirá adicionalmente con referencia a las figuras acompañantes. En las que:

La Figura 1: (técnica anterior) muestra la estructura y secuencia del tercer dominio de TolA. El modelo es de la estructura cristalina del complejo entre el dominio TolAIII y N1 de la proteína del gen 3 de recubrimiento menor de bacteriófagos filamentosos (Holliger et al., 1999, citado anteriormente). El enlace disulfuro se marca en negrita. Los restos 333-421 se determinaron en el modelo;

La Figura 2: muestra vectores de expresión pTol. Los vectores pTol son vectores de expresión basados en T7 derivados de pET8c. La región TolAIII marcada, representada genéricamente en secuencia de panel central (SEC ID Nº: 16), se inserta en los sitios entre Xhol y Mlul. El conector His6-Ser2 (SEC ID Nº: 17) precede al gen de TolA para el dominio III, que codifica los aminoácidos 329-421 de TolA (SEC ID Nº: 13). Después le sigue una parte flexible corta (Gly-Gly-Gly-Ser; SEC ID Nº: 18) y el sitio de escisión para endopeptidasas compuesto de cuatro o cinco aminoácidos (indicados por X en el panel central y subrayados en el panel inferior). El panel inferior muestra las secuencias de ADN (SEC ID Nos: 19-21, respectivamente) y codifican los restos aminoacídicos (SEC ID Nos: 22-24, respectivamente) del sitio de escisión/clonación de la región TolAIII marcada de pTolE, pTolT y pTolX. El sitio de escisión se indica con una flecha. Los codones de parada se muestran como asteriscos;

La Figura 3: muestra una caracterización de la expresión de TolAIII. A: SDS-PAGE de TolAIII expresada a partir del uso de tres vectores diferentes. Carril 1, pTolT no inducido; carril 2, pTolX; carril 3, pTolE; carril 4, pTolT. B: Curva de crecimiento de bacterias con pTolT. Muestra no inducida (cuadrados en negrita), muestra inducida (cuadrados en blanco). Se añadió IPTG 1 mM para inducir la muestra en el momento indicado por una flecha. C: SDS-PAGE de fraccionamiento de bacterias después de la expresión de TolAIII a partir de pTolT. Carril 1, muestra no inducida; carril 2, bacterias inducidas; carril 3, fracción periplasmática; carril 4, fracción citoplasmática; carril 5, fracción insoluble (membrana + cuerpos de inclusión). M, marcador de peso molecular;

La Figura 4: muestra la expresión de diferentes proteínas en E. coli usando el sistema pTol. A: Expresión de la fusión de TolAIII con proteínas procariotas. Carril 1, colicina N 40-76; carril 2, dominio "10 T de colicina N; carril 3, dominio R de colicina N. El panel inferior representa un cálculo de proporción de proteína expresada en células bacterianas determinado a partir de geles explorados con el paquete informático Tina. Los valores indicados representan el promedio del cálculo de 5-11 colonias ± DT. B: Expresión de la fusión de TolAIII con proteínas eucariotas. Carril 1, PDK2; carril 2, dominio NBD1; carril 3, Eqtll; carril 4, PLA2. Los valores en la parte inferior son el promedio del cálculo de 4-8 colonias ± DT. C: Expresión de la fusión de TolAIII con proteínas de membrana. Carril 1, pTolT no inducido; carril 2, BcrC inducida; carril 3, TM1 inducida. La posición en la que se expresan BcrC y TM1 que debería aparecer sobre el gel se indica mediante un asterisco y un círculo, respectivamente. M, marcador de peso molecular; C, control de células bacterianas de la muestra de pToIT no inducida;

La Figura 5: muestra la purificación del dominio R de la colicina N. Carril 1, células no inducidas que contienen el vector pTolT-dominio R; carril 2, células inducidas; carril 3, fracción citoplasmática bacteriana; carril 4, paso de flujo de cromatografía Ni-NTA; carril 5, proteínas de fusión ToIT-dominio R purificadas; carril 6, dominio R purificado después de escisión y cromatografía de intercambio iónico;

La Figura 6: representa diagramáticamente diversos usos de una proteína de fusión marcada con His. (I) Un compañero de fusión de TollllA (“Tol”) (representado como un óvalo) con una etiqueta de afinidad de His6 (H6) (representada como un rectángulo) está unido a un polipéptido no TolAIII (representado como un círculo). (II) Para obtener el polipéptido no TolAIII purificado, este debe eliminarse de la proteína de fusión mediante escisión con endopeptidasas (representado mediante un rayo luminoso) y purificarse. Para estudios de interacción y para la creación de micromatrices de proteína, la proteína de fusión puede inmovilizarse de diversas maneras, por ejemplo, en un sustrato de Quelato de Níquel mediante la etiqueta His6 o (III) (como se muestra) usando una etiqueta inmovilizada constituida a partir de toda o parte de una proteína de unión a TolAIII reconocida de bacterias o fagos, que permite que el polipéptido no TolAIII (o la fusión completa) esté disponible para estudios de interacción. La interacción entre el polipéptido no TolAIII y una molécula que este reconoce (proteína, ADN, hidrato de carbono, lípido, etc.) se muestra en (IV). El compañero se muestra como un semicírculo. La Figura 7: muestra un mapa plasmídico circular de una construcción usada para producir un polipéptido de fusión Tol-A-III y BCL-XL; La Figura 8: muestra una SDS-PAGE de la proteína de fusión TolAIII-BCLXL expresada. Carril 1, sedimento celular completo, Carril 2, sobrenadante después de ultracentrifugación, Carril 3, lavado de columna con tampón de resuspensión, carril 4, lavado con imidazol 50 mM, carril 5, marcador de peso molecular, carril 6, elución con imidazol 300 mM; y

La Figura 9: muestra una SDS-PAGE de la proteína de fusión TolAIII-BCLXL escindida con trombina. Carril 1, proteína de fusión completa, Carril 2 y 4 proteína de fusión después de escisión con trombina, carril 3, marcador de peso molecular, carril 5, paso de flujo de la columna, carril 6, lavado, carril 7, lavado con NaCl 2 M, carril 8, elución con imidazol 300 mM.

EXPERIMENTAL

En el laboratorio de los autores de la presente invención primero se prepararon proteínas de fusión entre el dominio III de la proteína TolA periplasmática (TolAIII) y el dominio T de la colicina N. Cuando TolAIII estaba en el extremo N y el dominio T en el extremo C se aislaron enormes cantidades de proteínas de fusión. Por otro lado, cuando el dominio N de la colicina era el compañero en la parte N-terminal no se obtuvo expresión de la proteína de fusión.

En el presente documento se describe la clonación de vectores pTol que usan TolAIII como un compañero de fusión en la parte N terminal de la proteína de fusión expresada. Se muestra que los niveles de expresión de las diversas proteínas de fusión son alrededor del 20% de las proteínas bacterianas totales y pudieron purificarse 50-90 mg de fusiones por 1 de caldo bacteriano. Usando este sistema se prepararon diferentes componentes de colicina N.

En el Ejemplo 1, usando el sistema, se expresaron diversas proteínas. Estas fueron diferentes partes y dominios de colicina N (caja de unión a TolA (péptido de 40-76 aminoácidos), mutante por deleción del dominio T ("10) y domino R), que representaban proteínas procariotas. La fosfolipasa A2 humana, la proteína formadora de poros, equinatoxina II, procedente de anémona marina, el dominio 1 de unión a nucleótidos (NBD1) del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) humana y la piruvato deshidrogenasa quinasa 2 (PDK2) mitocondrial humana eran ejemplos de proteínas eucariotas. Las proteínas transmembrana se representaron por BcrC, un componente del sistema de resistencia a bacitracina de Bacillus licheniformis y el dominio transmembrana 1 (TM1) del CFTR humano. En el Ejemplo 2 se muestra la expresión de BCL-XL, una proteína importante en la investigación de la apoptosis y el cáncer, como un polipéptido de fusión a TolAIII.

Para el Ejemplo 1, en todos los casos, excepto para dos proteínas de membrana, las producciones de la proteína de fusión fueron mayores que las de las proteínas individuales. La expresión de péptidos pequeños y proteínas soluble fue sistemáticamente buena. También se seleccionaron dianas más difíciles. Las proteínas de membrana no se expresaron del todo. La PLA humana, la PDK2 y la equinatoxina se expresaron bien pero como en el caso de las proteínas individuales la mayoría terminaron como fracción insoluble. La PLA tiene muchos enlaces SS y la PDK tiene sistemáticamente expresión soluble resistente en otros sistemas. La TolAIII no pudo superar el comportamiento insoluble de estos compañeros de fusión pero aun fue posible su recuperación de los cuerpos de inclusión. En el Ejemplo 2, se expresaron grandes cantidades de BCL-XL.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ejemplo 1:

Clonación de vectores pTol:

En la clonación se usó el vector original derivado de pET3c (Novagen) denominado pET8c. El vector pET8c se construyó añadiendo al vector pET3c nucleótidos que codifican metionina seguido de seis restos de histidina y dos de serina cadena abajo del sitio de clonación (Politou, A.S. et al., 1994, Biochemistry 33(15): 4730-4737). El vector pET8c se usó para una expresión de fusión entre el dominio III de la proteína TolA (aminoácidos 329-421; SEC ID Nº: 13) y el dominio T de la colicina N. Este es un vector de expresión basado en T7 con el gen bla, que proporciona selección a ampicilina. La proteína de fusión contiene una metionina seguida de seis histidinas y dos serinas en la parte N terminal. Este conector permite facilitar la purificación usando cromatografía de afinidad con Ni-quelato. Los compañeros de fusión se unieron entre sí mediante el sitio BamHI. El extremo C terminal de la fusión se clonó mediante el sitio Mlul. El gen de dominio T se eliminó del vector restringiéndole con BamHI y Mlul. Después en el vector se ligó una secuencia adaptadora. Esta estaba compuesta de tal manera que elimina el sitio BamHI con el conector flexible, pero introduce un nuevo sitio BamHI justo después de la secuencia de escisión para endopeptidasas (Figura 2). De esta manera pueden clonarse compañeros fusionados en el vector pToI mediante el sitio BamHI o KpnI, dejando una etiqueta de dos (Gly-Ser; SEC ID Nº: 25) o cuatro (Gly-Ser-Gly-Thr; SEC ID Nº: 26) aminoácidos, respectivamente en el extremo N (véase Figura 2).

El conector entre TolAIII y el compañero fusionado está, por lo tanto, compuesto de una parte flexible (Gly-Gly-Gly-Ser; SEC ID Nº: 18) y una secuencia de escisión para endopeptidasas (enteroquinasa, factor Xa o trombina) (Figura 2). Como adaptadores se usaron los oligonucleótidos con las siguientes secuencias (todos los oligonucleótidos de MWG Biotech):

E(+) (5’-GATCTGATGATGACGATAAAGGATCCGGTACCTGATGAA-3’; SEC ID Nº: 27) y E(-) (5’-CGCGTTCATCAGGTACCGGATCCTTTATCGTCATCATCA-3’; SEC ID Nº: 28) para enteroquinasa; X(+) (5’-GATCTATTGAAGGTCGCGGATCCGGTACCTGATGAA-3’; SEC ID Nº: 29) y X(-) (5’-CGCGTTCATCAGGTACCGGATCCGCGACCTTCAATA-3’; SEC ID Nº: 30) para el factor Xa;

5 T(+) (5’-GATCTCTGGTTCCGCGCGGATCCGGTACCTGATGAA-3’; SEC ID Nº: 31) y T(-) (5’-CGCGTTCATCAG-GTACCGGATCCGCGCGGAACCAGA-3’; SEC ID Nº: 32) para sitios de escisión de trombina.

Los vectores nuevamente clonados se denominaron polE, pToIX, pTolT y estos comprendían secuencias de escisión

10 para enteroquinasa, factor Xa y trombina, respectivamente. Los compañeros de fusión usados para ensayar el sistema se clonaron en los vectores pToI mediante los sitios BamHI y Mlul. Si la secuencia de ácido nucleico que codificaba una proteína particular contenía el sitio BamHI interno, en su lugar se usó el sitio KpnI. Se usaron nueve proteínas diferentes para ensayar el sistema (Tabla 1). Las secuencias codificantes se amplificaron por PCR. La mezcla de reacción contenía (en 100 !l de volumen total): 10 !l de tampón de reacción 10X complementado por el

15 productor, 2 !l de MgSO4 100 mM, 4 !l de mezcla de dNTP (concentración final 200 !M), 100 pmol de cada oligonucleótido, aproximadamente 20 ng de ADN diana y 1 Unidad de ADN polimerasa Vent (New England BioLabs). El ADN diana se obtuvo a partir de ADN clonado en plásmidos (por ejemplo las secuencias de colicina procedían del plásmido pCHAP4 [Pugsley, A. P., 1984, Mol. Microbiol. 1: 317-325], las secuencias de equinatoxina procedían de un plásmido que contenía equinatoxina descrito en Anderluh G. et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun.

20 220: 437-42, y las secuencias de BcrC procedían de un plásmido que contenía BcrC descrito en Podlesek, Z. et al., 1995, Mol. Microbiol. 16: 969-976) o mediante PCR directa o RT-PCR del organismo hospedador. El ADN resultante se secuenció después de la clonación en pTol para garantizar que correspondía exactamente a la sección de la secuencia publicada mostrada en la tabla. Típicamente se usaron los siguientes ciclos: 10 min a 97 ºC, 30 ciclos, cada uno compuesto de 2 minutos de desnaturalización a 97 ºC, 1 minuto de hibridación a 58 ºC, 1 minuto de

25 extensión a 72 ºC; 7 minutos a 72 ºC y absorción a 10 ºC. Los fragmentos PCR se purificaron usando kits comerciales (Qiagen) y se restringieron mediante endonucleasas de restricción apropiadas. Los fragmentos restringidos se clonaron en el vector pTol previamente escindido. La secuencia de nucleótidos correcta de la proteína de fusión se verificó por secuenciación.

30 Tabla 1: Proteínas usadas para ensayar el sistema de expresión de fusión de pTol:

Proteína: Aminoácidos / Nº de Acceso SwissProt Pma Plásmido Sitio de clonaciónb Oligos para la PCRd

Colicina N 40-76 (SEC ID Nº: 33): 40-76/P08083 16038 pTolE.T, X BamHI 1,2

Dominio T -"10 de la colicina N (SEC ID Nº: 34): 11-90/P08083 18567 pTolT BamHI 3,4

Dominio R de la colicina N (SEC ID Nº: 35): 67-183/P08083 24667 pTolT BamHI 5,6

PLA2 humana (SEC ID Nº: 36): 21-144/ P14555 & NP_ 000291.1c 25810 pTolT KpnI 7,8

Equinatoxina II (SEC ID Nº: 37): 36-214/P17723 31575 pTolE BamHI 9,10

Dominio NBD1 del CFTR humano (SEC ID Nº: 38): 460-650/P13569 33134 pTolT BamHI 11,12

PDK2 humana (SEC ID Nº: 39): 18-407/Q15119 56193 pTolT KpnI 13,14

BcrC (SEC ID Nº: 40): 2-203 / P42334 34775 pTolT BamHI 15,16

Dominio TM1 del CFTR humano (SEC ID Nº: 41): 2-355/ P13569 52590 pTolT BamHI 17,18

a Pm de la proteína de fusión calculado a partir de la secuencia. b Sitio de restricción usado para la clonación en la parte N terminal de la proteína de fusión. En todos los casos el sitio C terminal usado fue MluI. c Número de acceso RefSec. d Los oligonucleótidos para amplificar las proteínas deseadas tenían las siguientes secuencias (todas en dirección 5’-3’; véase la Tabla 1):

1.: TTTTTGGATCCAATTCCAATGGATGGTCATGGAG (SEC ID Nº: 42)

2.: AAGGATCCAAGCTTCAAGGTTTAGGCTTTGAATTATTGTCC (SEC ID Nº: 43)

3.: TTTTTGGATCCAATGCTTTTGGTGGAGGGAAAAATC (SEC ID Nº: 44)

4.: CTCAGCGGTGGCAGCAGCC (SEC ID Nº: 45)

5.: CGCGGATCCCATGGGGACAATAATTCAAAGC (SEC ID Nº: 46)

6.: GGCGAATTCACGCGTTAAAATAATAATTTCTGGCTCAC (SEC ID Nº: 47)

7.: CCGGGGTACCAATTTGGTGAATTTCCACAGAATGATC (SEC ID Nº: 48)

8.: GGCGAATTCACGCGTTAGCAACGAGGGGTGCTCCC (SEC ID Nº: 49)

9.: CGCGGATCCGCAGACGTGGCTGGCGCC (SEC ID Nº: 50)

10.: GGCGAATTCACGCGTTAAGCTTTGCTCACGTGAGTTTC (SEC ID Nº: 51)

11.: CGCGGATCCTCTAATGGTGATGACAGCCTC (SEC ID Nº: 52)

12.: GGCGAATTCACGCGTTAGAAAGAATCACATCCCATGAG (SEC ID Nº: 53)

13.: CCGGGGTACCAAGTACATAGAGCACTTCAGCAAGTTC (SEC ID Nº: 54)

14.: GGCGAATTCACGCGTTACGTGACGCGGTACGTGGTCG (SEC ID Nº: 55)

15.: CGCGGATCCTTTTCAGAATTAAATATTGATG (SEC ID Nº: 56)

16.: GGCGAATTCACGCGTTAAAAGTTCTTCGATTTATCG (SEC ID Nº: 57)

17.: CGCGGATCCCAGAGGTCGCCTCTGG (SEC ID Nº: 58)

18.: GGCGAATTCACGCGTTAGGGAAATTGCCGAGTGAC (SEC ID Nº: 59)

Expresión de proteínas en E. coli

Todas las proteínas se expresaron en una cepa de E. coli BL21 (DE3)pLysE (de Novagen). La cepa se transformó con plásmidos y se cultivó en placas LB con selección apropiada (Ampicilina, Cloramfenicol). Se usó una colonia para inocular 5 ml de medio LBAC (Ampicilina a 100 !g/ml, Cloramfenicol a 34 !g/ml, ambos de SIGMA). Las bacterias se cultivaron en un torno giratorio a 37 ºC. Después de 60 minutos la expresión de las proteínas recombinantes se indujo mediante una adición de IPTG 1 mM (final) y las bacterias se cultivaron durante 4 horas más. Se analizaron muestras pequeñas (correspondiente a un volumen de bacterias que cuando se resuspendieron en 1 ml produjo un valor A600=0,5) en SDS-PAGE. Los geles se tiñeron con Coomassie y se exploraron a 600 dpi usando un escáner comercial. La cantidad de proteínas expresadas se calculó de los geles usando el programa Tina

2.0. Para la expresión a gran escala, se usaron 5 ml de cultivo bacteriano en fase estacionaria para inocular 250 ml de medio LBAC y crecieron a 37 ºC en un agitador orbital a 180 rpm durante una noche. La siguiente mañana 20-25 ml del cultivo de una noche se usaron para inocular 500 ml de medio LBAC M9. En total, para una sola proteína se cultivaron 3-5 l de cultivo bacteriano. Las bacterias se cultivaron en las mismas condiciones hasta alcanzar aproximadamente un valor A600 de 0,8. Después, la producción de proteínas recombinantes se indujo añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM. Las bacterias se cultivaron durante 4-5 horas más, se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 rpm a 4 ºC y se conservaron a -20 ºC.

Aislamiento de proteínas de bacterias

Las bacterias sedimentadas se resuspendieron (2 ml de tampón/g de células) en NaH2PO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, 1-mercaptoetanol 20 mM (tampón A), con las siguientes enzimas e inhibidores de proteasas (concentraciones finales): DNasa (10 !g/ml), RNasa (20 !g/ml), lisozima (1 mg/ml de tampón), PMSF (0,5 mM), benzamidina (1 mM). Se incubaron en hielo durante una hora y de vez en cuando se agitaron enérgicamente. Las bacterias resuspendidas se sometieron a ultrasonido durante 3 minutos con un ultrasonido Branson y después se centrifugaron en una ultracentrifugadora Beckman a 40000 rpm, a una temperatura, 4 ºC en un rotor 45ti. El sobrenadante se eliminó y se puso a 4 ºC. El sedimento se resuspendió en el mismo tampón sin enzimas ni inhibidores (1 ml/g de peso) y se conservó en hielo durante 15 minutos. Después de 1 minuto más de ultrasonido se centrifugó en las mismas condiciones. Los sobrenadantes de ambas centrifugaciones se combinaron y se aplicaron a aproximadamente 1 ml/min a 1-3 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) equilibrada con tampón A. Típicamente, la columna con proteína no unida se lavó con dos fracciones de 3 ml de tampón A, dos fracciones de tampón A con imidazol 20 mM y 6-10 fracciones de tampón A con imidazol 300 mM. Las fracciones se analizaron sobre SDS-PAGE. Las fracciones de interés se agruparon y se dializaron tres veces frente a agua (5 l) a 4 ºC. Se comprobó la pureza por SDS-PAGE. Las proteínas se conservaron a 4 ºC en NaN3 3 mM. La concentración de proteína se determinó usando coeficientes de extinción calculados a partir de la secuencia.

Fraccionamiento de proteínas bacterianas

Todas las proteínas bacterianas se fraccionaron para observar la cantidad de proteínas insolubles expresadas. Las bacterias sedimentadas de 100 ml de caldo se resuspendieron en 40 ml de sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, Tris-HCl 30 mM, pH 8,0 y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugaron a 9000 g durante 10 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió suavemente en 8 ml de MgSO4 5 mM enfriado con hielo. Las bacterias se agitaron suavemente y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Los protoplastos bacterianos se centrifugaron de nuevo en las mismas condiciones. El sobrenadante se eliminó como una fracción periplasmática. El sedimento se resuspendió en 10 ml de NaH2PO4 20 mM, pH 8,0, con 1 mg de lisozima y benzamidina. Se agitó enérgicamente y se incubó en hielo durante 30 minutos y finalmente, se sometió a ultrasonido 5 x 30 s. Las proteínas citoplasmáticas se eliminaron del material insoluble por centrifugación a 35 000 g a 4 º C durante 30 minutos. El sobrenadante se eliminó como una fracción citoplasmática y el sedimento se resuspendió en 2 ml de urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, Tritón X-100 al 0,5% como una fracción insoluble (proteínas de membrana y presuntos cuerpos de inclusión).

Escisión y purificación de la fusión del dominio R de TolAIII con colicina N

El dominio puro R de la colicina N se produjo usando el sistema de expresión de pTol, en 35 ml de mezcla de escisión se incubaron 45 mg del dominio R de TolAIII a 20 ºC durante 20 horas. La mezcla de escisión contenía tampón, según especifica el productor, y trombina (calidad de Restricción, Novagen) a 0,1 U/mg de proteína fusionada. Los productos de escisión se dializaron tres veces, cada vez al menos durante 4 horas, contra 5 l de Tris-HCl 40 mM, pH 8,4 a 4 ºC. El dominio R escindido se separó de TolAIII y la proteína de fusión no escindida por cromatografía de intercambio iónico sobre el sistema FPLC (Pharmacia). Las proteínas se aplicaron a una columna Mono S (Pharmacia) a 1 ml/min en Tris-HCl 40 mM, pH 8,4. Después, el material no unido se lavó de la columna, el dominio R se eluyó aplicando gradiente de NaCl de 0 a 500 mM en el mismo tampón durante 30 minutos. A aproximadamente un 70% de NaCl (aproximadamente 350 mM) se recogió una gran cantidad y se comprobó con respecto a la pureza por SDS-PAGE.

Ejemplo 2:

Clonación del vector pTol

Un fragmento de ADN que codificaba la proteína BCL-XL se amplificó por PCR a partir del plásmido pETBCLXL usando los oligonucleótidos en sentido BCL-STU (5’-TTT TTT AGG CCT TCT CAG AGC AAC CGG GAG -3’; SEC ID Nº: 60) y Mlu-BCL-Inverso (5’ -TTT TAC GCG TTC ATT TCC GAC TGA AGA G -3’; SEC ID Nº: 61). La proteína BCL-XL se introdujo en el plásmido pTOLT usando enzimas de restricción Stu I y Mlu I. El plásmido final se denominó pTOLT-BCLXL (Figura 7) y la secuenciación del ADN de este plásmido mostró que el fragmento de ADN que codificaba la proteína BCL-XL estaba correctamente insertado.

Purificación de proteínas

La proteína BCL-XL se expresó en una cepa BL21 DE3 (pLysE) de E. coli. La cepa se transformó con el plásmido y se cultivó en placas LB con selección de ampicilina (200 !g/ml) y cloranfenicol (35 !g/ml). Se inocularon 5 ml de medio LB con antibiótico con colonias sencillas y se cultivaron durante una noche a 37 ºC. En matraces de 2 litros que contenían ampicilina y cloranfenicol se introdujeron 5 ml del cultivo de una noche en 500 ml de medio LB. Las bacterias se cultivaron hasta una DO 600: 0,8 y se indujeron por adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y después se cultivaron durante 3 horas más. Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón fosfato 20 mM, NaCl 300 mM, pH: 8,0 que contenía RNAsa, DNasa, PMSF (1 mM) y Benzamidina (1 mM). Las células se lisaron mediante una prensa francesa y el sobrenadante se obtuvo por ultracentrifugación a 40 000 rpm durante 1 hora. La etiqueta de Histidina 6X en el extremo N (SEC ID Nº: 8) facilitó la purificación de la fusión de Tol-BCL mediante una columna de afinidad de Ni-NTA. La proteína de fusión se lavó sobre la columna con tampón fosfato 20 mM, NaCl 300 mM, pH: 8,0, tampón, adicionalmente se lavó con el mismo tampón que contenía imidazol 50 mM y se eluyó en imidazol 300 mM, pH 7,0. La expresión de la proteína de fusión se analizó por SDS-PAGE (Figura 8) y la concentración de la proteína se determinó mediante absorción UV a 280 nm.

Escisión de la proteína BCL-XL con trombina

En 20 ml de tampón de escisión se incubaron 20 mg de la fusión TolA-BCL a 4 ºC durante 4 horas. El tampón de escisión contenía Tris-HCI 50 mM, NaCI 150 mM, CaCI2 2,5 mM, DTT 5 mM y Trombina (1 Unidad de trombina (Sigma)/mg de proteína fusionada). La proteína liberada se recuperó aplicando a una columna de Ni-NTA una mezcla de escisión dializada durante una noche. Después de lavar de la columna la proteína no unida, el resto de la proteína BCL-XL se lavó con NaCl 2 M. Todo el paso de flujo y los lavados se recogieron y analizaron por SDS-PAGE (Figura 9). Usando absorbancia UV a 280 nm, Se calcularon los rendimientos de la proteína después de la escisión con trombina.

RESULTADOS

Expresión de la proteína Tol4lll en E. coli

En el Ejemplo 1, el tercer dominio de TolAIII con etiquetas (Figura 2) se expresó a partir de tres vectores de expresión diferentes (Figura 3), pTolE, pTolT y pTolX. En cada caso, la expresión de TolAIII fue enorme, algunas veces alcanzando hasta el 40% de todas las proteínas bacterianas (véase la Figura 3A). Específicamente, la cantidad de TolAIII expresada de pTolT fue el 26,96% ± 1,67 (n=5). La cantidad de TolAIII expresada fue aproximadamente la misma independientemente del vector que usado. La proteína TolAIII expresada en bacterias no interfirió con el metabolismo bacteriano normal. La curva de crecimiento fue muy similar para las bacterias inducidas y no inducidas (Figura 3B). Toda la proteína TolAIII se expresó en forma soluble. Después de lisis osmótica, tratamiento con lisozimas, ultrasonido y centrifugación, no se manifestaron cuerpos de inclusión mediante inspección visual de restos de bacterias sedimentados. Adicionalmente, después del fraccionamiento de proteínas de bacterias no se encontró ninguna TolAIII en la fracción celular insoluble. La fracción insoluble representa proteínas de membrana y debe contener también proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión (Figura 3C). Las bacterias que contenían TolAIII eran un poco más frágiles de lo normal. TolAIII se liberó de las células casi después de un tratamiento leve hipo-osmótico, que solo debe liberar proteínas periplasmáticas.

Expresión de otras proteínas en E. coli como fusiones con TolAIII

Para comprobar la idoneidad del sistema de expresión de pTol para la expresión y preparación de otras proteínas

5 (véanse el Ejemplo 1, la Tabla 2 y el Ejemplo 2) se sometieron a ensayo diez proteínas. Estas fueron diferentes partes y dominios de colicina N (caja de unión a TolA (péptido de 40-76 aminoácidos), mutante por deleción del dominio T ("10) y domino R), que representaban proteínas procariotas. La fosfolipasa A2 humana, la proteína formadora de poros, equinatoxina II, procedente de anémona marina, el dominio 1 de unión a nucleótidos (NBD1) del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) humana y la piruvato deshidrogenasa

10 quinasa 2 (PDK2) mitocondrial humana eran ejemplos de proteínas eucariotas. Las proteínas transmembrana se representaron por BcrC, un componente del sistema de resistencia a bacitracina de Bacillus licheniformis y el dominio transmembrana 1 (TM1) del CFTR humano. Las proteínas seleccionadas representan variaciones en cuanto al tamaño (aproximadamente 4,4 de colicina de 40-76 kDa frente a 44 kDa de PDK2), código genético (proteínas eucariotas frente a eucariotas), localización de proteína (soluble frente a membrana) y contenido en disulfuro (PLA2,

15 7 disulfuros frente a ninguno en la equinatoxina). Las proteínas de fusión se expresaron a alta proporción en E. coli usando el sistema pTol (Figura 4). De nuevo, la expresión fue tan alta como el 40% en algunos casos, pero el promedio fue de aproximadamente 20-25% (véase la Figura 4B y C en paneles inferiores). Las únicas dos excepciones fueron las proteínas de membrana, BcrC y TM1. En este caso, en el gel no había ninguna banda correspondiente con su tamaño (Figura 4C). A diferencia de la expresión de TolAIII en solitario, la expresión de las

20 proteínas de fusión interfería con el crecimiento de las bacterias. En el caso de PLA2 y las proteínas de membrana, TM1 y BcrC, la cantidad de bacterias al final del crecimiento se redujo a la mitad en algunos casos. Resulta interesante que, la expresión de la fusión de PDK2 en células bacterianas tuvo efecto positivo y siempre hubo ligeramente más bacterias al final del crecimiento (no mostrado). Algunas de las bacterias que expresaban fusiones también se fraccionaron. Las proteínas PDK2 y PLA2 se expresaron en cuerpos de inclusión insolubles. La EqtlI y el

25 dominio R se encontraron principalmente en la fracción insoluble, pero también se encontró alguna proporción en la fracción citoplasmática (10-25% de las proteínas expresadas) (no mostrado).

Aislamiento y escisión de proteínas de fusión

30 En el Ejemplo 1, las fusiones expresadas se aislaron del citoplasma mediante extracción simple en solución tamponada, que se aplicó sobre una columna de Ni-NTA. Mediante esta etapa sencilla las proteínas ya tenían una pureza de más del 95% (Figura 5). Los rendimientos de las fusiones aisladas estaban sobre un promedio de aproximadamente 50 mg/l de caldo bacteriano, pero alcanzaron hasta 90 mg/l (Tabla 2). Mediante este procedimiento, incluso proteínas que principalmente se expresaron como cuerpos de inclusión, se aislaron en

35 cantidades significativas, es decir, se aislaron 11 mg/ml de fusiones de Eqtll. Una de las proteínas de fusión, el domino TolE-T 40-76 se usó para la preparación de una muestra peptídica adecuada para la determinación estructural por RMN. Esta se expresó en medio mínimo M9 que contenía 15NH4CI. Incluso en medio mínimo fue posible expresarse y producir fusión a cantidades significativas, se obtuvieron casi 70 mg de fusión pura por litro de cultivo bacteriano.

Tabla 2: Rendimientos de proteínas de fusión asiladas usando el sistema de pTol

Proteínaa: Rendimiento (mg/l de caldo bacteriano)

TolE-Dominio T 40-76: 46,7

15N TolE-Dominio T 40-76: 67,1

TolT-Dominio T 40-76: 83,8

TolX-Dominio T 40-76: 89,6

TolT-Dominio "10: 37,4

TolT-Dominio R: 51

TolE-Eqtll: 11

TolT-PDK: 1,4

a Las proteínas se nombran después del plásmido usado para la expresión de las proteínas de fusión.

El dominio R puro se preparó a partir de la fusión TolT -dominio R por escisión con trombina y separación de los

45 productos de escisión por cromatografía de intercambio iónico. Los resultados de tal esquema de purificación se presentan en la Figura 5. Mediante el procedimiento indicado se prepararon 13 mg de dominio R funcional puro a partir de 1 l de cultivo bacteriano de partida. Un rendimiento ligeramente menor de lo esperado de la cantidad de fusión soluble es una consecuencia de la precipitación del dominio R durante la preparación. Sin embargo, el rendimiento presentado en el presente documento es aún más de dos veces más alto que el sistema que

50 proporciona directamente el dominio R expresado.

En el Ejemplo 2 se muestra que la BCL-XL, una proteína importante en la investigación de la apoptosis y el cáncer, puede expresarse en grandes cantidades como una fusión con TolAIII (véase Figura 8). Un análisis por SDS-PAGE de la proteína de fusión TolA-BCL reveló una banda con un peso molecular aparente de aproximadamente 35 kD, que concuerda con los siguientes cálculos teóricos:

5 ProtoParámetros de la proteína de fusión TolA-BCL (SEC ID Nº: 4): Número de aminoácidos: 348 Peso molecular: 38048,5 pl teórico: 5,83

10 Composición de aminoácidos: Ala (A) 38 10,9% Arg (R) 17 4,9% Asn (N) 17 4,9% Asp (D) 16 4,6% Cys (C) 3 0,9% Gln (Q) 13 3,7% Glu (E) 24 6,9% Gly (G) 29 8,3% His (H) 10 2,9% Ile (I) 12 3,4% Leu (L) 28 8,0% Lys (K) 16 4,6% Met (M) 7 2,0% Phe (F) 16 4,6% Pro (P) 17 4,9% Ser (S) 34 9,8% Thr (T) 13 3,7% Trp (W) 7 2,0% Tyr (Y) 10 2,9% Val (V) 21 6,0% Asx (B) 0 0,0% Glx (Z) 0 0,0% Xaa (X) 0 0,0%

Número total de restos cargados negativamente (Asp + Glu): 40

Número total de restos cargados positivamente (Arg + Lys): 33

15 Coeficientes de extinción:

Condiciones: clorhidrato de guanidio 6,0 M, tampón fosfato 0,02 M, pH 6,5

Los coeficientes de extinción estás en unidades de M-1 cm-1.

20 La primera tabla enumera valores calculados suponiendo que TODOS los restos de Cys aparecen como semicistinas, mientras que la segunda tabla supone que NO.

276 278 279 280 282

nm nm nm nmNm

Coeficiente de 52445 53327 53190 52750 51320

extinción

Abs 0,1% (=1 1,378 1,402 1,398 1,386 1,349

g/l)

276 278 279 280 282

nm nm nm nmNm

Coeficiente de 52300 53200 53070 52630 51200

extinción

Abs 0,1% (=1 1,375 1,398 1,395 1,383 1,346

g/l)

El dominio TolAIII se escindió de la fusión TolA-BCL usando trombina y la proteína compañera BCL se purificó en

25 una columna de Ni-NTA (Figura 9). Se encontró que 1 litro de cultivo celular de la cepa BL21 (DE3) pLys de E. coli proporcionaba 20 mg de proteína BLC-XL escindida con trombina, muy pura. El peso molecular aparente por SDS-PAGE después de la escisión con trombina (véase la Figura 9) coincidía con los siguientes cálculos teóricos:

ProtoParámetros del componente BCLXL escindido de la fusión TolA-BCL después de tratamiento con trombina (SEC ID Nº: 15): Número de aminoácidos: 236 Peso molecular: 26329,2

5 pl teórico: 4,94 Composición de aminoácidos:

Ala (A) 22 9,3% Arg (R) 15 6,4% Asn (N) 12 5,1% Asp (D) 10 4,2% Cys (C) 1 0,4% Gln (Q) 10 4,2% Glu (E) 21 8,9% Gly (G) 18 7,6% His (H) 4 1,7% Ile (I) 6 2,5% Leu (L) 19 8,1% Lys (K) 6 2,5% Met (M) 5 2,1% Phe (F) 13 5,5% Pro (P) 8 3,4% Ser (S) 24 10,2% Thr (T) 11 4,7% Trp (W) 7 3,0% Tyr (Y) 6 2,5% Val (V) 18 7,6% Asx (B) 0 0,0% Glx (Z) 0 0,0% Xaa (X) 0 0,0%

Número total de restos cargados negativamente (Asp + Glu): 31 10 Número total de restos cargados positivamente (Arg + Lys): 21

Coeficientes de extinción:

Condiciones: clorhidrato de guanidio 6,0 M, tampón fosfato 0,02 M, pH 6,5 15 Los coeficientes de extinción están en unidades de M-1 cm-1.

La primera tabla enumera valores calculados suponiendo que TODOS los restos de Cys aparecen como semicistinas, mientras que la segunda tabla supone que NO.

276 278 279 280 282

nm nm nm nmnm

Coeficiente de 46500 47600 47690 47510 46400

extinción

Abs 0,1% (=1 1,766 1,808 1,811 1,804 1,762

g/l)

276 278 279 280 282

nm nm nm nmnm

Coeficiente de 46500 47600 47690 47510 46400

extinción

Abs 0,1% (=1 1,766 1,808 1,811 1,804 1,762

g/l)

DISCUSIÓN

ToIAIII se expresó en enormes cantidades en forma soluble en el citoplasma bacteriano. Entre las razones para una alta expresión de proteínas en E. coli se citan más comúnmente el uso de codones apropiados, la estabilidad del 25 transcrito de ARNm, el tamaño, el contenido de enlaces disulfuro y la no toxicidad para la célula. TolAIII es una proteína pequeña con un solo enlace disulfuro. Es muy estable y monomérica en solución incluso a concentraciones tan altas como 30 mg/ml (datos procedentes de ultracentrifugación analítica y filtración en gel, no mostrados). El pequeño tamaño y la tendencia a no formar agregados son ciertamente importantes en cuanto a la tolerancia del material heterólogo en el citoplasma de las bacterias. Una ventaja adicional del gen TolAIII es, que es una proteína 30 bacteriana y como tal solo posee 5 codones (4,7% de 106 aminoácidos excluyendo el sitio de escisión de proteasas) raramente transcritos en el genoma de E. coli. Estos están dispersos a lo largo de la secuencia. Una mejora de su

expresión podría conseguirse modificando por ingeniería genética la conformación de su transcrito de ARNm. Se ha demostrado que, para una alta producción de ARN transcrito, a veces la conformación del ARN debe ser tal que el sitio de unión al ribosoma y el codón de inicio deben exponerse y no estar implicados en el emparejamiento de bases. En el caso del ARNm de ToIAIII ambos están implicados en la construcción de tallos cortos y no siempre

5 completamente expuestos (análisis de ARN transcritos de 60-120 nucleótidos (etapa de 10 nt) por M veces en http://bioinfo.math.rpi.edu/-zukerm/). La alta expresión de la proteína TolAIII en el vector basado en T7 y las altas producciones de producto puro son comparables o incluso mejores que las de los sistemas publicados y existentes para la producción de proteínas de fusión en E. coli.

Como un compañero de fusión en la sobreexpresión de diversas proteínas de origen bacteriano y eucariota, los autores de la invención emplearon un dominio de una proteína bacteriana periplasmática. Algunos péptidos o dominios pequeños podrían unirse a TolAIII sin cambiar significativamente su tamaño. Por tanto podría esperarse la misma cantidad de proteína expresada. De hecho, la producción de la fusión que contenía colicina N, péptido de 4076 aminoácidos, fue la misma que para el propio dominio TolAIII. El sistema también es adecuado para la 15 preparación de proteínas eucariotas. En particular, el nivel de expresión de EqtII está mucho más mejorado sobre el publicado. Aproximadamente el 20% de la expresión total de la fusión se contrastó con aproximadamente 5% en el caso de expresión directa. La mayoría de la Eqtll expresada a partir del sistema pTol es en la fracción soluble, pero el aislamiento de la fracción citoplasmática soluble aún dio como resultado una gran mejora en la producción sobre el método publicado. El sistema pTol también podría aplicarse a proteínas expresadas como cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la cantidad de PLA2 expresada es similar a la de los otros sistemas de expresión, sin embargo la proteína de fusión puede aislarse fácilmente por cromatografía Ni-NTA y después replegarse y escindirse sobre la matriz de la columna. Una observación interesante fue que las dos proteínas de membrana estudiadas no se expresaron como proteínas de fusión con el sistema pTolA, aunque hasta ahora, la razón de esto no se ha aclarado.

25 Los autores de la invención construyeron tres vectores de expresión que proporcionaban tres sitios de escisión diferentes para endopeptidasas muy utilizadas en biología molecular, por ejemplo enteroquinasa, factor Xa y trombina. Los sitios de reconocimiento para las endopeptidasas diferían en la secuencia de aminoácidos y en el tamaño. Estas diferencias cambian drásticamente las propiedades del pequeño compañero ToIAIII en las proteínas de fusión (Tabla 3). TolAT y TolAX son básicos, con valores de pl calculados de más de 8,5. TolAE es ácido por naturaleza, pl de 6,6. Este es el resultado de cuatro aspartatos en la secuencia de reconocimiento para enteroquinasas (DDDDK; SEC ID Nº: 3). Los vectores construidos permiten así una mayor flexibilidad, es decir, basándose en las propiedades del compañero fusionado puede seleccionarse fácilmente el vector apropiado. En este caso, el dominio R de la colicina N se expresó en el vector pTol dado que el dominio R es incluso más básico (pl 9,7) que TolAIII escindido. Por otro lado, la colicina N, péptido de 40-76 aminoácidos, tiene casi el mismo pl que

35 TolAT o TolAX. Esto hace que la purificación posterior sea mucho más difícil, representando los picos el péptido y solapándose después TolAIII en una cromatografía de intercambio iónico. Por lo tanto, el péptido se expresó en pTolE. TolAIII escindido no se unió a la columna a las condiciones seleccionadas y la diferencia en pl de la fusión no escindida (pl 7,2) y el péptido fue lo suficientemente grande como para obtener picos claramente definidos (no mostrados).

Tabla 3: Propiedades físicas de las proteínas TolAIII después de escisión con endoproteinasas

Proteínaa: Aminoácidos Pmb plb

TolAE: 111 11716,1 6,57

TolAT: 110 11593,2 8,93

TolAX: 110 11583,1 8,57

a Las proteínas se nombran de acuerdo con el vector en el que se producen. b Calculado a partir de la secuencia.

Usando el sistema de expresión de pTol los autores de la invención pudieron producir partes funcionales de la toxina

45 colicina N. Estos produjeron un dominio R funcional y un péptido de 39 restos compuestos de 40-76 restos de colicina. El domino R marcado con His se expresó mal y de forma irreproducible y la fusión TolA se expresó sistemáticamente bien y mejoró el rendimiento en más del doble. El péptido se produjo como una muestra marcada con 15N para la determinación estructural por RMN. La preparación de grandes cantidades de muestras peptídicas marcadas para análisis estructural por RMN puede ser problemática y una carga financiera significativa para los grupos de investigación. Los altos rendimientos y la versatilidad del sistema pTol podrían hacer que la preparación de péptidos y proteínas pequeños fuese mucho más asequible y una alternativa a la síntesis química y a otros sistemas de expresión. El sistema puede ser particularmente útil para la expresión reproducible a alto nivel de proteínas pequeñas solubles (<20 kDa) y péptidos no estructurados. Por ejemplo, el sistema demostraría utilidad en la preparación de péptidos pequeños marcados con 15N o 13C para estudios estructurales por RMN.

55 La expresión de BCL-XL, una proteína importante en la investigación de la apoptosis y el cáncer, es difícil de expresar a un alto rendimiento ya que tiene una región C terminal hidrófoba que produce inestabilidad y toxicidad. Por tanto la mayor parte del trabajo estructural se ha realizado sobre versiones truncadas que carecían de esta región. Los autores de la invención no pudieron expresar esta proteína con rendimientos satisfactorios para estudios estructurales y por tanto usaron el sistema de proteínas de fusión de TolAIII para mejorar sus rendimientos. Ahora pueden expresarse grandes cantidades de esta proteína como un compañero de fusión de TolAIII (Figura 8). Se plegó de acuerdo con espectroscopia CD (no mostrada). También pueden producirse grandes cantidades en medio mínimo incluyendo 15NH4CI como única fuente de nitrógeno.

5 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> University of Newcastle Upon Tyne

<120> Proteínas de Fusión

<130> 43952/JMD/MAR

<150> GB 0200689.8 15 <151>

<160> 61

<170> Patentln version 3.1

<210>1 <211>9

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial 25

<220>

<223> cola de Ala3-His6

<400> 1

<210>2

<211> 25

<212>PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sitio de escisión para enteroquinasas

<400> 3

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sitio de escisión para trombina

<400> 4

<210>5 <211>4

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sitio de escisión para el factor Xa

<400> 5

<210>6 <211>4

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 4xHistidina

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 5xHistidina

<400> 7

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 6xHistidina

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 7xHistidina

<400> 9 <210> 10

<211> 8

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 8xHistidina

<400> 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 9xHistidina

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta de 10xHistidina

<400> 12

<210> 13

<211> 93

<212>PRT

<213> Escherichia coli

<400>13 <210> 14

<211> 348

<212>: PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> proteína de fusión TolA-BCL

<210> 15

<211> 236

<212>: PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> proteína de fusión TolA-BCL después de escisión con trombina

<210> 16

<211> 115

<212>: PRT 5 <213> Secuencia Artificial

10 <400>14

10 <400>15 <220>

<223> Región TolAIII etiquetada de vectores pTol

10 <220>

<221>MISC-FEATURE <222>(107)..(111)

<223> los restos Xaa representan sitios de escisión DDDDK (SEC ID Nº: 3), LVPR (SEC ID Nº: 4; sin Xaa en la

posición 111) o IEGR (SEC ID Nº: 5; sin Xaa en la posición 111)

<400> 16

5 <210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> conector de 6His6-2SeR

<400> 17

15 <210> 18

<211> 4

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> polipéptido flexible corto

<400> 18

25 <210> 19

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> sitio de escisión/clonación del vector pTolE

<400> 19

<210>20

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> sitio de escisión/clonación del vector pTolT

<400> 20

<210> 21

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> sitio de escisión/clonación del vector pToIX

<400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> sitio de escisión/clonación del vector pTolE

<220>

<221>MISC_FEATURE <222>(14)..(15)

<223> Xaa representa sitios de codón de parada

<400> 22

<210>23 <211>16

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> sitio de escisión/clonación del vector pTolT

<220>

55 <221>MISC_FEATURE <222>(13)..(14)

<223> Xaa representa sitios de codón de parada

<400> 23 <210>24 <211>16

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> sitio de escisión/clonación del vector pToIX

<220>

<221>MISC_FEATURE <222>(13)..(14)

<223> Xaa representa sitio de codón de parada

<400> 24

<210>25 <211>2

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta Gly-Ser

<400> 25

<210> 26

<211> 4

<212>PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> etiqueta Gly-Ser-Gly-Thr

<400> 26

<210>27

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 28

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 28

<210> 29 5 <211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Oligonucleótido sintético

15 <211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Oligonucleótido sintético

<210> 31 25 <211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 30 <223> Oligonucleótido sintético

<400> 31

<210> 32 35 <211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 40 <223> Oligonucleótido sintético

<400> 32

45 <211> 37

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<210> 34

<211> 80

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 34

<210> 35 <211>117

<212> PRT 10 <213> Escherichia coli

<400> 35

<210> 36

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 179

<212> PRT

<213> Actinia equina

<400> 37

<210>38 <211>191

<212>PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 390

<212>PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 202

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<400> 40

<210> 41

<211> 354

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210>43

<211> 41

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210>44

<211> 36

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210>45 <211>19

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210>46

<211> 31

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210>47

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 47

<210> 48

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 49

<211> 35

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 50

<211> 27

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 51

<211> 38

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 51

<210> 52

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 53

<211> 38

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 53

<210> 54

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 55

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 56

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 57

<211> 36

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 58

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 59

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 60

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<210> 61

<211> 28

<212>ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Oligonucleótido sintético

<400> 61

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora, en el que dicho polipéptido de fusión tiene, en la secuencia, una estructura básica que comprende un extremo N terminal, un dominio TolAIII para obtener una expresión aumentada del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera no TolA cuya expresión se desea y un extremo C terminal y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificación por afinidad.
2.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un péptido de señal.
3.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el péptido de señal se sitúa a nivel o cerca del extremo N terminal del polipéptido de fusión.
4.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que para la expresión en la célula hospedadora, el domino TolAIII se ha optimizado por codones.
5.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un conector entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAI.
6.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el conector comprende al menos un sitio de escisión para una endopeptidasa.
7.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEC ID Nº: 3) y/o LVPR (SEC ID Nº: 4) y/o IEGR (SEC ID Nº: 5).
8.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende una etiqueta de purificación por afinidad.
9.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la etiqueta de purificación por afinidad se sitúa a nivel o cerca del extremo N terminal del polipéptido de fusión.
10.

El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la etiqueta de purificación por afinidad es una etiqueta Hisn N terminal con n=4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (SEC ID Nos: 6-12, respectivamente; preferentemente n=6 [SEC ID Nº: 8]), estando la etiqueta Hisn opcionalmente unida al polipéptido de fusión mediante uno o más restos de Ser (preferentemente 2).
11.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio TolAIII consiste en los restos aminoacídicos 329-421 (SEC ID Nº: 13) de la secuencia de TolA de Escherichia coli (Nº de Acceso en SwissProt P19934).
12.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula hospedadora es bacteriana (por ejemplo Escherichia coli).
13.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido no TolA es la proteína BCL-XL.
14.

Una molécula de ADN que codifica el polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15.

Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 14, en la que cuando la molécula de ADN se transcribe, las propiedades del ARNm se optimizan para una expresión en la célula hospedadora.
16.

Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 14 o con la reivindicación 15, para la expresión del polipéptido de fusión definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
17.

El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 16, que tiene un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible mediante IPTG) que conduce la expresión del polipéptido de fusión.
18.

El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 16 o con la reivindicación 17, que tiene un marcador de resistencia a un antibiótico (por ejemplo el gen bla que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol).
19.

El vector de clonación para producir el vector de expresión definido en cualquiera de las reivindicaciones 16-18, que comprende ADN que codifica el dominio TolAIII cadena arriba o cadena abajo de un sitio de clonación que permite la inserción en la fase de lectura de un ADN que codifica un polipéptido no TolA.
20.

El vector de clonación de acuerdo con la reivindicación 19, que adicionalmente comprende un ADN que codifica al menos un sitio de escisión (por ejemplo la secuencia de aminoácidos DDDDK [SEC ID Nº: 3] y/o LVPR [SEC ID Nº: 4] y/o 1 BGR [SEC ID Nº: 5]) de una endopeptidasa, estando situado el sitio de escisión entre el ADN que codifica el domino TolAIII y el sitio de clonación.
21.

El vector de clonación acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20, en el que el sitio de clonación comprende al menos una secuencia diana de una endonucleasa de restricción (por ejemplo BamHI y/o Kpnl).
22.

El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, que adicionalmente comprende un ADN que codifica una etiqueta de purificación por afinidad como se define en la reivindicación 8 o en la reivindicación 9.
23.

El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, que adicionalmente comprende un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible mediante IPTG).
24.

El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, que adicionalmente comprende un ADN que codifica un marcador de resistencia a un antibiótico (por ejemplo el gen bla que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol).
25.

El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-24, que tiene la estructura de pTolE, pTolT o pToIX (como se muestra en la Figura 2 con referencia a la descripción).
26.

El uso del dominio TolAIII para la producción de un polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
27.

El uso del dominio TolAIII para la producción de la molécula de ADN como se define en la reivindicación 14 o en la reivindicación 15.
28.

El uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16-18.
29.

El uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de clonación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19-25.
30.

Una célula hospedadora que contiene el ADN como se define en la reivindicación 13 y/o el vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16-18 y/o el vector de clonación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19-25.
31.

El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-13 para la inmovilización del polipéptido no TolA que comprende la etapa de:

unir el polipéptido de fusión a un polipéptido que se une a TolA (por ejemplo el sitio de reconocimiento de TolA

de la colicina N o de otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína gp3-D1 de bacteriófagos o la región

de unión a TolA de TolB o de otras proteínas Tol);
32.

El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-13 para la inmovilización del polipéptido no TolA que comprende la etapa de:

unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión.
33.

El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-13 para la purificación y aislamiento del polipéptido no TolA que comprende las etapas de:

(i)

unir el polipéptido de fusión a un polipéptido que se une a TolA (por ejemplo el sitio de reconocimiento de TolA de la colicina N o de otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína g3p-D1 de bacteriófagos o la región de unión a TolA de TolB o de otras proteínas Tol);

(ii)

escindir el polipéptido no TolA del dominio TolAIII usando una endopeptidasa; y

(iii) separar el polipéptido no TolA escindido del dominio TolAIII.
34.

El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8-13 para la purificación y aislamiento del polipéptido no TolA que comprende las etapas de:

(i)

unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión;

(ii)

escindir el polipéptido no TolA del dominio TolAIII usando una endopeptidasa; y

(iii) separar el polipéptido no TolA escindido del dominio TolAIII del mismo.
35.

El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para el estudio de las propiedades de interacción del polipéptido no TolAI o del polipéptido de fusión, por ejemplo auto-interacción, interacción con otra molécula o interacción con un estímulo físico.
36.

Un método de alta expresión de un polipéptido como un polipéptido de fusión en una célula hospedadora, que comprende la etapa de expresar, en una célula hospedadora, el polipéptido como un polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.