JP5469786B2 - タンパク質の発現増強および精製の方法および組成 - Google Patents
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Description
ユビキチン(Ubiquitin:Ub)およびユビキチン様タンパク質(ubiquitin like proteins:Ubls)が文献に記載されている(Jentsch and Pyrowolakis(2000)Trends Cell Biol.,10:335〜42;Yeh et al.(2000)Gene,248:1〜14;Larsen and Wang(2002)J.Proteome Res.,1:411〜9)。SUMO系もまた述べられている(Muller et al.(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,2:202〜10)。SUMO(small ubiquitin related modifier(低分子ユビキチン様修飾因子))は、公開文献ではSentrin,SMT3,PIC1,GMP1,およびUBL1としてもまた知られているUblである。SUMO経路は真核生物界の全般に存在し、SUMOタンパク質は酵母からヒトまでに渡って非常に良く保存されている(Kim et al.(2002)J.Cell.Physiol.,191:257〜68)。ユビキチンとSUMOとの間の全体の配列相同性は18%に過ぎないにもかかわらず、核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance:NMR)による構造決定によって、これら2つのタンパク質は、密度の高い球状折り畳みと、1つのアルファ−ヘリックスで囲まれたベータ−シートによって特徴付けられる、共通の3次元構造を有することが明らかになった(Bayer et al.(1998)J.Mol.Biol.,280:275〜86;Kim et al.(2000)J.Biol.Chem.,275:14102〜6)。SUMOのシャペロン特性の解析によって、不安定なタンパク質のN末端へのSUMOの連結が、折りたたみの核として働いてタンパク質を凝集から保護することが可能であることが明らかになった。
全てのSUMO遺伝子は、保存されたC末端のGly−Glyモチーフを超えて伸長した短いC末端配列を有する前駆体タンパク質をコードしている(Muller et al.(2001) Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,2:202〜10)。前記伸長配列は長さに変化があり、典型的には2〜12アミノ酸である。細胞内でのSUMO化の前に、SUMOプロテアーゼ(加水分解酵素としてもまた知られる)がC末端の伸長部を除去する(Coloma et al.(1992)J.Immunol.Methods,152:89〜104)。標的タンパク質のリシン残基のイプシロン−アミノ基へのSUMOのC末端の結合はSUMO化として知られる。細胞タンパク質のSUMO化は、核移行、シグナル伝達、ストレス応答、および細胞周期の進行を制御すると提唱されている(Kretz−Remy and Tanguay(1999)Biochem.Cell.Biol.,77:299〜309)。SUMOが様々な細胞内コンパートメント間のタンパク質移行のシグナルを送るという可能性は非常に高いが、SUMOのこの機能の正確な機構の詳細は判明していない。SUMO経路とユビキチン経路との間の類似性は、これら2つのタンパク質修飾による異なる効果を考えれば、注目に値することである(Goettsch and Bayer(2002)Front.Biosci.,7:a148〜62)。
NusAは、おそらくその大きなサイズによって、パートナーとなるタンパク質の可溶性を促進する、もう1つの融合タグである(Davis et al.(1999)Biotecnol.Bioeng.,65:382〜8)。グルタチオンS−トランスフェラーゼ(glutathione S−transferase:GST)(Smith and Johnson(1988)Gene,67:31〜40)、およびマルトース結合タンパク質(maltose binding protein:MBP)(diGuan et al.(1988)Gene,67:21〜30)の融合タグもまた、融合パートナーの発現および生産を増強することが提唱されている。しかし、GSTが2
量体を形成するように用いられ、タンパク質の可溶性を阻害する可能性がある場合には、発現量増強は必ずしも観察されない。このような全ての融合システムにおけるもう1つの問題は、所望のタンパク質を融合から除去する必要があるかもしれないことである。この問題を回避するために、Xa因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、またはTevプロテアーゼ部位などのプロテアーゼ部位を融合タグの下流に作製することが多い。しかし、それらプロテアーゼは融合/標的タンパク質中に存在する短い特異的なアミノ酸配列を認識するため、不適切な切断がしばしば観察される(Jonasson et al.(2002)Biotechnol.Appl.Biochem.,35:91〜105)。本発明は、これら問題点を回避する。さらに、SUMOプロテアーゼとは異なり、Tevプロテアーゼは、融合タンパク質の切断後に目的のタンパク質のN末端へ望ましくない配列を残す配列特異的プロテアーゼである。それとは対照的にSUMOプロテアーゼは、SUMOのC末端からあらゆる配列を切断し、融合タンパク質の望みのN末端(プロリンを除く)を生成する。__
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献1】 国際公開第2006/073976号
【非特許文献】
【非特許文献1】 KONO,K.et at.The Mobility of Bach2 Nuclear Foci is Regulated by SUMO−1 Modification.Experimental Cell Research.2008,Vol 314,pages 903−913.
【非特許文献2】 KIM KEUN IL ET AL:"Versatile protein tag,SUMO:its enzymology and biological function"JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY,WILEY LISS,NEW YORK,NY,US LNKD−DOI:10.1002/JCP.10100,vol.191,no.3,1 June 2002(2002−06−01),pages 257−268
【非特許文献3】 MARBLESTONE Jeffrey G ET AL:"Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems:Enhanced expression and solubility with SUMO"PROTEIN SCIENCE,CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS,CAMBRIDGE,GB LNKD−DOI:10.1110/PS.051812706,vol.15,no.1,1 January 2006(2006−01−01),pages 182−189
【非特許文献4】 MALAKHOV MICHAEL P ET AL:"SUMO fusions and SUMO−specific protease for efficient expression and purification of proteins"JOURNAL OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL GENOMICS,vol.5,no.1−2,2004,pages 75−86
【非特許文献5】 PEROUTKA RAYMOND J ET AL:"Enhanced protein expression in mammalian cells using engineered SUMO fusions:Secreted phospholipase A(2)"PROTEIN SCIENCE,vol.17,no.9,September 2008(2008−09),pages 1586−1595
【非特許文献6】 LIU LI ET AL:"Enhanced protein expression in the baculovirus/insect cell system using engineered SUMO fusions."PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION NOV 2008 LNKD− PUBMED:18713650,vol.62,no.1,November 2008(2008−11),pages 21−28
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
以下の定義は、本発明の理解を助けるために提供するものである。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−600/2重鎖中の#bp
上記の公式の実例としては、[Na+]=[0.368]および50%ホルムアミド、GC含有量42%、および平均プローブサイズが200塩基で、Tmは57℃である。DNA2重鎖のTmは相同性が1%減少するごとに1〜1.5℃低下する。従って、約75%以上の配列同一性を有する標的では、ハイブリダイゼーション温度42℃を用いて観察することになる。例えば、Sambrook et al.の方法に従って、5×SSC、5×デンハート試薬、1.0%SDS、100μg/ml変性サーモン精子DNA断片、0.05%ピロリン酸ナトリウム、および50%までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーションは37〜42℃で少なくとも6時間かけて実施する。ハイブリダイゼーションに続いて、以下の要領でフィルターを洗浄する:(1)2×SSCおよび1%SDS中室温で5分間;(2)2×SSCおよび0.1%SDS中室温で15分間;(3)1×SSCおよび1%SDS中37℃で30分〜1時間;(4)1×SSCおよび1%SDS中で42〜65℃で2時間、30分ごとに溶液を交換する。
本発明は、SUMOプロテアーゼ(例えば、Ulp1)によって切断不可能なSUMOタンパク質を包含する。SUMOは、あらゆる真核生物種からのもの、またはあらゆるSUMO分子の変異型であることが可能である。特定の実施形態では、SUMOは酵母またはヒトのものである。酵母とは異なり、脊椎動物では現在までに4種類のSUMOが記述されている:SUMO−1、および近縁のホモログであるSUMO−2、SUMO−3、およびSUMO−4である。それら脊椎動物の全てのSUMOタンパク質は、本発明に包含される。SUMOタンパク質の例は、図11A〜11Cに提供する。ヒトSUMOタンパク質をコードする核酸配列の例は、GenBankアクセス番号NM_003352.4(SUMO1)、NM_001005781.1(SUMO1)、NM_001005782.1(SUMO1)、NM_006937.3(SUMO2)、NM_001005849.1(SUMO2)、NM_006936.2(SUMO3)、およびNM_001002255.1(SUMO4)にもまた提供されている。
X1FX2X3X4GX5X6(配列ID番号:2)
を含むように改変したSUMOタンパク質(例えば、酵母SUMO(Smt3)またはヒトSUMO1)であり、ここで、X1およびX6はアルギニン以外のあらゆるアミノ酸であり、X2、X3、X4、およびX5はあらゆるアミノ酸および野生型(すなわち変異なし)とすることができる。特定の実施形態では、X1およびX6は非塩基性アミノ酸である。好ましい実施形態では、X2はLまたはR;X3はF,W,またはY、X4はDまたはE;およびX5はI,Q、またはRである。特定の実施形態では、X1はグルタミン、スレオニン、およびフェニルアラニンから成る群から選択したもの、および/またはX6は位置71におけるロイシンおよびグルタミン酸から成る群から選択したものである。
X1FX2F(配列ID番号:65)
を含むように改変したSUMOタンパク質(例えば、ヒトSUMO2、SUMO3、およびSUMO4)であり、ここで、X1およびX2はアルギニン以外のあらゆるアミノ酸である。特定の実施形態では、X1およびX2は非塩基性のあらゆるアミノ酸である。特定の実施形態では、X1は非荷電側鎖を有するアミノ酸、特にスレオニンであり、X2は酸性アミノ酸、特にグルタミン酸である。
本発明は、野生型SUMOプロテアーゼでは切断できない改変SUMOを切断可能な改変SUMOプロテアーゼもまた包含する。SUMOプロテアーゼは、あらゆる真核生物種由来とすることが可能である。特定の実施形態では、切断しようとする改変SUMOと同じ生物種由来のものとする。SUMOプロテアーゼの例は、ULP1およびSENP1〜5を含み、特定のアミノ酸配列を図12A〜12Bに提供する。
WLNX1X2X3X4X5(配列ID番号:6)
を含むよう改変したSUMOプロテアーゼであり、ここで、X1およびX5は非酸性のあらゆるアミノ酸であり、X2、X3、およびX4はあらゆるアミノ酸であって、野生型(すなわち変異なし)とすることもできる。特定の実施形態では、X1は非荷電極性側鎖アミノ酸、非極性側鎖アミノ酸、または小さなアミノ酸である。X5は非荷電極性側鎖アミノ酸、非極性側鎖アミノ酸、または小さなアミノ酸とすることができる。他の一実施形態では、X3はIまたはV、X4はIまたはTである。特定の実施形態では、X1はセリンであり、X2はグリシンおよびスレオニンから成る群から選択されるものであり、および/またはX5はセリン、アラニン、およびメチオニンから成る群から選択されるものである。
本発明の融合タンパク質技術は、タンパク質およびペプチドの生産および精製においていくつもの適用を有している。限定するわけではないが、この技術を用いる方法の例は:
(1)タンパク質およびペプチド(目的タンパク質)、特に発現の少ないものを、改変SUMOタンパク質のC−末端への融合によって発現増強する。前記SUMO−融合タンパク質の構造は、原核生物(例えば、E.coli;図2参照)または真核生物(酵母および昆虫細胞;図3参照)中のいずれにおける発現中にも、改変SUMOプロテアーゼもまた細胞中へ導入しない限り、切断されることはない。目的タンパク質の例は、限定するわけではないが、多量体タンパク質、サイトカイン、ワクチン、酵素、成長因子、受容体、インターフェロン、増血剤、アルブミン、インスリン、およびホルモンを含む。
(8)ペプチドライブラリーを構築するために、改変SUMOを含む融合タンパク質を原核および/または真核細胞中で発現可能である。
(9)ペプチドライブラリーを構築するために、目的タンパク質、および選択的にアフィニティー・タグへ結合した改変SUMOを含む融合タンパク質を、原核および/または真核細胞中で発現することができる。発現させたタンパク質ライブラリーを次に、改変SUMOまたはアフィニティー・タグを介して精製可能である。選択的に、切断したタグからのライブラリーの単離によって、純粋なタンパク質またはペプチドのライブラリーを構築するために、改変SUMOプロテアーゼによって、改変SUMO、およびもし存在するならばアフィニティー・タグを融合タンパク質から切断することができる。
本発明は、目的タンパク質の発現増強、分泌、精製、局在化、およびアミノ末端の改変の効率化に用いるキットもまた包含する。そのようなキットは、所望の宿主細胞中での発現に適したプロモーターへ作用するように結合した改変SUMOをコードする核酸配列、および改変SUMOをコードする核酸配列に対してインフレームで目的タンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのに適した複数のクローニング部位を含む、少なくとも1つの組換えベクターを含む。前記プロモーターは好ましくは強いプロモーターであり、恒常的または調節性とすることができる。そのようなプロモーターは当該技術分野で周知のものであり、限定するわけではないが、CMV,RSV,SV40,ADH1,T7,およびCUP1プロモーターを含む。
SMT3−GTPおよびULP1プロテアーゼを同一のE.coli細胞中で共発現させるために、プライマー23(5’−GGCGCTCGAGTCCCGCGAAATTAATACGACTCA−3’;配列ID番号:7)およびプライマー46(5’−CGCAAAGCTTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA−3’:配列ID番号:8)を用いて、pET24d−Smt3−GFPベクター(Malakhov et al.(2004)J.Struct.Funct.Genomics,5:75〜86)からT7−SMT3−GFPカセットを増幅し、XhoIおよびHindIIIで消化して、XhoIおよびHindIIIで切断したpACYC177ベクター(GenBankアクセス番号X06402)へ挿入した。この操作でpACYC177中のKan耐性遺伝子をSMT3−GFP発現カセットで置換した結果がpACYC−SMT3−GFPベクターである。pACYC−SMT3−GFPで、BL21(DE3)コンピテント細胞を形質転換した。pACYC−SMT3−GFPを保有する細胞を、アンピシリン含有培地上で増殖し、標準的なCaCl2法を用いてコンピテントにした。それらコンピテント細胞を、以前に記述された(Malakhov et al.(2004)J.Struct.Funct.Genomics,5:75〜86)誘導性T7プロモーター下にULP1プロテアーゼを保有するもう1つの他のベクターpET24−ULP1で形質転換した。形質転換細胞は、アンピシリンおよびカナマイシンを含むLB培地上で選択した。細胞中でULP1プロテアーゼと共発現したSMT3−GFP融合タンパク質は、IPTGで誘導した場合にSMT3(20kD)およびGFP(28kD)へとプロセシングされる。ULP1を共発現していない細胞は、サイズ48kDの全長のSMT3−GFP融合タンパク質を生産した。
SUMOタンパク質は、融合パートナーとして目的タンパク質へ結合した場合、バクテリアおよび真核細胞中での組換えタンパク質の量および質を非常に良く増強した(図2および図3Aを参照;Malakhov et al.(2004)J.Struct.Funct.Genom.,5:75〜86)。SUMOファミリーのタンパク質は、細胞制御の一部として自然状態で真核生物タンパク質に付加または除去される。SUMOの構造およびSUMOタンパク質の付加および除去の過程は真核細胞中で非常に良く保存されている。SUMOタンパク質構造の高度な保存の結果、SUMO融合タグと他種の宿主の内在性SUMO修飾酵素とは種を超えた反応性を示す。従って、真核生物はSUMOタグを切断可能であり、この切断により、組換えタンパク質からタグが分離される結果となる。従って、「切断されていない」またはプロセシングされていない野生型SUMO融合タンパク質を真核細胞から発現および精製することは容易ではない。
融合タグを最適なものとするためには、続く精製工程で除去して目的タンパク質のみを残すようにする能力を有する必要がある。SUMO*タグを切断するプロテアーゼを作製するために、E.coli中で融合パートナーから変異SUMOsを切断可能な加水分解酵素をスクリーニングした(図7)。スクリーニングは、アンピシリン耐性タンパク質であるベータ−ラクタマーゼが細胞中で発現している場合に、抗生物質アンピシリンを含有する培地上でE.coliが成長する能力に基づいたものである。非融合ベータ−ラクタマーゼのみがアンピシリン耐性を与えることが示されている。従って、SUMOタグをベータ−ラクタマーゼに融合させた場合は、アンピシリン耐性が与えられない。ベータ−ラクタマーゼをSUMO*のC−末端へ融合して、様々な加水分解酵素と共に発現させた。タグが切断された場合にのみ、ベータ−ラクタマーゼが活性型で解放されてアンピシリン耐性を与えることで細胞の生存を可能にする。タンパク質がプロリンで開始する場合には、SUMO−タンパク質融合体はUlp1で切断されないことが知られている。従って、Smt3タグの直後のアミノ酸がプロリンであるSmt3−pro−BLA融合タンパク質をスクリーニングのコンセプトの実証として作製した(図8)
Ulp1の構造解析によって、SUMOのアミノ酸R64およびR71と相互作用するアミノ酸残基は残基450と456との間の領域に存在することを決定した。R64およびR71と相互作用する可能性のあるアミノ酸は、それぞれ位置451および455のアスパラギン酸およびグルタミン酸、その他に位置452のスレオニンである(図4および9)。Ulp1中のそれら3残基は、PCR飽和変異技術を用いてランダムに変異させた。変異後に、インビボのベータ−ラクタマーゼ・アッセイを用いてアンピシリン含有プレート上で変異体を選択した。スクリーニングで同定したUlp1変異体は、さまざまな度合いの切断効率を示した。最も効率的な変異体2.2を選別して「SUMO*プロテアーゼ1」と命名した(図10)。変異体の例を以下の表2中に提供する。
融合タグ・ベクターの作製
全てのベクター・コンストラクトに対して、pcDNA3.1/V5−His(Invitrogen)を基盤として用いた。Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity(Invitrogen)を全てのPCR反応に用い、全ての制限酵素およびT4 DNAリガーゼはFermentas(カナダ、オンタリオ州Burlington)の物である。クローニングは標準的技術に従って実施した。全てのクローンはシーケンシングによって点検した。まず、2つの間で相同性のある領域を有するオーバーラップしたプライマー(それぞれ、プライマー1+2および3+4;プライマー配列については表3を参照)によって、kappa S.S.および6×Hisタグを生成した。kappa S.S.および6×Hisタグは、プライマー1+4を用いた2番目のPCR反応で結合した。kappa−6×His融合体をHindIIIおよびBamHI制限部位によってpcDNA3.1へ挿入して、pcDNA3.1−kappa−6×Hisを生成した。プライマー3および4は、Hisタグの後へ2つのグリシンが続き、反対鎖のBamHI部位の上流にEsp3I/BsmBI制限部位ができるように設計した。Esp3Iによる消化で、ジ−グリシンのggaggtコード配列の部分の非コード鎖上にtccaから成る4塩基の突出末端を生成した。CTHS,SUMO,SUMOmut,およびhSUMO3は、それぞれプライマー5+6、7+6、7+6、および8+9によって増幅した。全てのリバースプライマーは様々なSUMO末端のジ−グリシン・コドン下流へEsp3I認識部位を再生成したが、しかし下流の2番目のEsp3I認識部位を利用した。SUMOタグはEco31IおよびBamHI制限部位を用いてpcDNA3.1−kappa−6×His中へ挿入して、以下のベクターを生成した:pcDNA3.1−kappa−6×His−CTHS,pcDNA3.1−kappa−6×His−SUMO,pcDNA3.1−kappa−6×His−SUMOmut,pcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO3。
活性型sPLA2−Xは、プライマー10+11を用いてPCR増幅した。不活性型sPLA2−Xは、プライマー12+11を用いて同じクローンからPCR増幅した。活性型および不活性型の両方のsPLA2−Xコンストラクトは、PCR産物およびベクターの両方のEsp3Iでの消化によって作製した。
ヒトSUMO−1は、プライマー13+14を用いてcDNAからPCR増幅して、Esp3IおよびXbaI制限部位を用いてpcDNA3.1−kappa−6×His中へクローニングし、pcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO1を作製した。変異型ヒトSUMO−1および3は、N−末端およびC−末端側の半分ずつを個別の反応で生成するPCR部位特異的変異を用いて作製して、ゲルで分離し、続くPCR反応で結合した。ヒトSUMO−1の1番目のPCRでは、NおよびC−末端側に対してそれぞれプライマー13+15および16+14を用いた。ヒトSUMO−3の1番目のPCRでは、NおよびC−末端側に対してそれぞれプライマー8+17および18+9を用いた。2番目のPCRでは、精製した1番目の産物をそれぞれのヒトSUMOと混合して、hSUMO1mutに対してはプライマー13+14を、hSUMO3mutに対してはプライマー8+9を用いた。産物をpcDNA3.1−kappa−6×His中へ挿入してpcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO1mutおよびpcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO3mutを作製した。
マウスsPLA2−IIC,IIE、IIIおよびVのcDNAはOpen Biosystems(アラバマ州Huntsville)から購入した。PLA2プライマーは、精製およびタグ除去の後の成熟タンパク質の生成を目的として設計した。従ってプライマー設計では、文献レビューおよびシグナルP解析に基づいて、分泌シグナルおよびプロペプチドは省略した。マウスsPLA2−IICは、プライマー19+20を用いて、GenBankエントリーBC029347に対応するcDNAからクローニングした。マウスsPLA2−IIEは、プライマー21+22を用いて、GenBankエントリーBC027524に対応するcDNAからクローニングした。全長のマウスsPLA2−IIIは、プライマー23+24を用いて、GenBankエントリーBC079556に対応するcDNAからクローニングした。マウスsPLA2−Vは、プライマー25+26を用いて、GenBankエントリーBC030899に対応するcDNAからクローニングした。マウスsPLA2−IIIの活性ドメイン(Murakami et al.(2005)J.Biol.Chem.,280:24987〜24998)は、プライマー27+28を用いて、GenBankエントリーBC079556に対応するcDNAからクローニングした。活性型および不活性型sPLA2−Xを含む全てのsPLA2遺伝子は、pcDNA3.1−kappa−6×His、pcDNA3.1−kappa−6×His−SUMO、pcDNA3.1−kappa−6×His−SUMOmut、pcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO1、pcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO1mut、pcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO3、およびpcDNA3.1−kappa−6×His−hSUMO3mut中へサブクローニングした。
HEK−293細胞は、DMEM含有10%ウシ胎仔血清培地中でウェル当たり500,000細胞の密度となるように6穴プレート(Becton Dickinson;メリーランド州Sparks)中へ播種して、95%空気/CO2で37℃にてオーバーナイトでインキュベートした。製造者(Invitrogen)による記述に従って、Lipofectamine−LTXを用いて、pcDNA3.1ベクター(2.5μg/ウェル)中の様々なPLA2のcDNAコンストラクトを細胞へ一過性に導入した。導入後、PLA2発現の解析前に37℃でさらに48時間、細胞をインキュベートした。
トランスフェクションに続く48時間のインキュベーション後、培地および細胞を解析のために採取した。各ウェルからカルチャー培地(〜1.5ml)を取り除き、残留物を遠心分離で分離する。SDS−PAGE/ウエスタンブロッティングのためには、100μlの培地を6×SDSローディング緩衝液と混合して、5分間煮沸した。残りの培地は後のアッセイのために−80℃で保存した。プレートの各ウェルからの細胞は洗浄して、遠心分離し、180μlの冷却RIPA緩衝液中で再懸濁し、軽く超音波処理して、6×SDSローディング緩衝液と混合して5分間煮沸した。全てのサンプルは4%アクリルアミドのスタッキングレイヤーを伴う変性15%アクリルアミドゲル状で分離した。Trans−Blot(登録商標)semi−dry transfer cell(BioRad;カリフォルニア州Hercules)を用いて、ゲルをImmoblin(商標)ニトロセルロース(Millipore;マサチューセッツ州Billerica)へ転写した。膜への転写後、PBS pH7.5 + 0.05%Tween−20(PBST)中の5%脱脂乳によって1時間、ブロット膜をブロックした。ブロッキングに続いて、PBST + 脱脂乳中の1:1000モノクローナル抗−His抗体(Sigma)中でブロット膜を1時間インキュベートした。ブロット膜をPBSTで3回洗浄して、PBST + 脱脂乳中の1:2500抗−マウスHRP合成抗体(Sigma;ミズーリ州St.Louis)を加えて1時間インキュベートした。ブロット膜は再度PBSTで3回洗浄した。HRP結合はSuperSignal(登録商標) West Pico chemoluminescent substrate(Pierce;イリノイ州Rockford)によって検出した。ブロット膜はLAS−3000(Fujifilm Life Science;コネチカット州Stamford)を用いて映像化した。
哺乳類の分泌経路中での改変SUMO−融合タンパク質の可能性のある有用性を評価するために、マウスsPLA2−Xをモデルタンパク質として用いた。まず、以下の4つのN−末端融合タンパク質を試験した:Smt3(SUMO)、AA45−99(CTHS)を含むSmt3のC−末端側の半分、SUMOプロテアーゼによって切断されない2重変異体であるSmt3 R64TR71E(SUMOmut(SUMO*))、およびヒトSUMO−3(hSUMO3)。全てのタグはヘキサヒスチジン(hexahistidine:6×His)のN−末端で作製し、マウスのIgGカッパ分泌シグナルを用いて分泌させるようにした。コントロールを目的として、シグナル配列および6×Hisタグのみを有するベクターを作製して、SUMOをベースとするタグの部分のみ異なる全部で5種のベクターを作製した。Smt3との融合はE.coli中で異種タンパク質発現を増強することが示されており、ヒトSUMO−3との融合はE.coliおよびP.pastoris中で発現が増強する結果となった。特定の発現データは表4に提供した。
Claims (33)
- 改変低分子ユビキチン様修飾因子(small ubiquitin−like modifier:SUMO)をコードする単離核酸分子であって、前記改変SUMOはSUMOプロテアーゼ相互作用ドメイン中の少なくとも1つのアルギニン残基を非塩基性アミノ酸へ変更したSUMOタンパク質であり、
前記改変SUMOは、
a)ヒトSUMO1であって、位置63のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および/又は位置70のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO1、
b)ヒトSUMO2であって、位置59のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および/又は位置61のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO2、
c)ヒトSUMO3であって、位置58のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および/又は位置60のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO3、
d)酵母Smt3であって、位置64のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および/又は位置71のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記酵母Smt3
からなる群から選択されるものである、単離核酸分子。 - 請求項1記載の核酸分子において、前記改変SUMOは、
a)ヒトSUMO1であって、位置63のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置70のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO1、
b)ヒトSUMO2であって、位置59のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置61のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO2、
c)ヒトSUMO3であって、位置58のアルギニンがスレオニンに変更され、および位置60のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記ヒトSUMO3、
d)酵母Smt3であって、位置64のアルギニンがグルタミン、ロイシン、スレオニン、またはフェニルアラニンに変更され、および/又は位置71のアルギニンがグルタミン酸に変更されたものである、前記酵母Smt3
からなる群から選択されるものである、核酸分子。 - 請求項1記載の核酸分子において、前記改変SUMOは配列ID番号:1である、核酸分子。
- 請求項1記載の核酸分子によってコードされる単離改変SUMOタンパク質。
- 請求項1記載の核酸分子において、前記核酸分子は複数のクローニング部位に作用するように結合しており、前記複数のクローニング部位は目的タンパク質をコードする核酸配列を、前記改変SUMOのGly−Gly切断部位をコードする核酸配列の3’側に隣接してインフレームでクローニングすることを可能とするものである、核酸分子。
- 請求項1記載の核酸分子において、この核酸分子は、さらに、
アフィニティー・タグをコードする核酸配列を有するものであり、前記アフィニティー・タグをコードする核酸配列は前記改変SUMOをコードする核酸配列の5’側にインフレームで作用するように結合したものである、核酸分子。 - 請求項1記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 改変低分子ユビキチン様修飾因子(small ubiquitin−like modifier:SUMO)プロテアーゼをコードする単離核酸分子であって、前記改変SUMOプロテアーゼは酵母Ulp1であり、位置451のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置455のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、単離核酸分子。
- 請求項8記載の単離核酸分子において、位置455のグルタミン酸はセリンに変更されたものである、単離核酸分子。
- 請求項8記載の単離核酸分子において、前記改変SUMOプロテアーゼは、配列ID番号:3、配列ID番号:4、および配列ID番号:5から成る群から選択されるものである、単離核酸分子。
- 請求項8記載の核酸分子によってコードされる単離改変SUMOプロテアーゼ。
- 宿主細胞中で目的タンパク質の発現量を増強する方法であって、
i)融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成するために、請求項1記載の核酸を前記目的タンパク質をコードする核酸配列に作用するように結合する工程と、
ii)前記宿主細胞中へ前記核酸を導入する工程と
を有し、
それによって前記融合タンパク質中でのSUMOの存在が、前記宿主細胞中での前記目的タンパク質の発現量を増加させるものである、
宿主細胞中で目的タンパク質の発現量を増強する方法。 - 請求項12記載の方法において、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、E.coli、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択されるものである、方法。
- 請求項12記載の方法において、この方法は、さらに、
前記融合タンパク質の単離の工程を有するものである、方法。 - 請求項14記載の方法において、この方法は、さらに、
前記目的タンパク質を放出するための前記融合タンパク質の切断の工程を有するものである、方法。 - 宿主細胞中の目的タンパク質に改変アミノ末端を生成する方法であって、
a)前記目的タンパク質をコードする核酸配列を提供する工程と、
b)前記核酸中のN−末端アミノ酸コード配列を改変する工程と、
c)請求項1記載の核酸を、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列へ作用するように結合する工程と、
d)宿主細胞中で前記核酸を発現する工程と、
e)前記宿主細胞中で改変SUMOを切断可能な改変SUMOプロテアーゼを発現する工程であって、前記改変SUMOプロテアーゼは酵母Ulp1であり、位置451のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置455のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、前記発現する工程と
を有し、
それによって、改変SUMOプロテアーゼが改変SUMOの切断を引き起こして、それにより改変アミノ末端を有する目的タンパク質を生産するものである
前記宿主細胞中の目的タンパク質に改変アミノ末端を生成する方法。 - 請求項16記載の方法において、この方法は、さらに、
改変アミノ末端を有する目的タンパク質の単離の工程を有するものである、方法。 - 宿主細胞からの目的タンパク質の分泌量を増強する方法であって、
i)請求項1記載の核酸分子を、前記目的タンパク質をコードする核酸配列に作用するように結合する工程であって、それにより融合タンパク質をコードするコンストラクトを生成するものである、前記結合する工程と、
ii)前記宿主細胞中へ前記核酸を導入する工程と
を有し、
それによって、前記融合タンパク質中の改変SUMOの存在が、前記宿主細胞からの前記目的タンパク質の分泌を増加させるものである
前記宿主細胞からの目的タンパク質の分泌量を増強する方法。 - プロモーターおよび複数のクローニング部位に作用するように結合した、請求項1記載の核酸分子を含む組換えベクターを含むキットであって、
前記複数のクローニング部位は、改変SUMOのGly−Gly切断部位をコードする核酸配列の3’側へ隣接したインフレームでの、目的タンパク質をコードする核酸のクローニングを可能にするものである、キット。 - 請求項19記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
宿主細胞を有するものである、キット。 - 請求項20記載のキットにおいて、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、E.coli、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択するものである、キット。
- 請求項19記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
天然の目的タンパク質とは異なるアミノ末端を生成するために前記目的タンパク質をコードする核酸を改変するための、オリゴヌクレオチドベースの部位特異的変異の試薬を有するものである、キット。 - 宿主細胞からのタンパク質精製キットであって、
i)組換えベクターであって、
a)請求項1記載の核酸分子と、
b)プロモーターと、
c)複数のクローニング部位と、選択的に、
d)アフィニティー・タグをコードする核酸配列と
を有し、
前記プロモーターは請求項1記載の前記核酸に作用するように結合しており、もし存在するならば、前記アフィニティー・タグをコードする核酸配列は請求項1記載の核酸分子に対してインフレームで作用するように結合しており、前記複数のクローニング部位は改変SUMOのGly−Gly切断部位をコードする核酸配列の3’側へ隣接したインフレームでの目的タンパク質をコードする核酸配列のクローニングを可能にするものである
前記組換えベクターと、
ii)改変SUMOをGly−Gly切断部位の後で特異的に切断するプロテアーゼを含む組成物と
を有する前記宿主細胞からのタンパク質精製キット。 - 請求項23記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
宿主細胞を有するものである、キット。 - 請求項23記載のキットにおいて、前記宿主細胞は、原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、E.coli、昆虫細胞、および真核細胞から成る群から選択するものである、キット。
- 請求項23記載のキットにおいて、前記キットは、さらに、
i)アフィニティー・タグ結合のための固体支持体、
ii)溶解緩衝液、
iii)洗浄緩衝液、
iv)溶出緩衝液、
v)切断緩衝液、および
vi)説明資料
から成る群から選択される少なくとも1つを有するものである、キット。 - 請求項19記載のキットにおいて、このキットは、さらに、
改変SUMOを切断する改変SUMOプロテアーゼをコードする発現ベクターを有するものであり、前記改変SUMOプロテアーゼは酵母Ulp1であり、位置451のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置455のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、キット。 - 請求項23記載のキットにおいて、このキットは、さらに、
改変SUMOを切断する改変SUMOプロテアーゼをコードする発現ベクターを有するものであり、前記改変SUMOプロテアーゼは酵母Ulp1であり、位置451のアスパラギン酸がセリンに変更され、および位置455のグルタミン酸がセリン、アラニン、またはメチオニンに変更されたものである、キット。 - 請求項8記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項7記載の発現ベクターを含む単離細胞。
- 請求項29記載の発現ベクターを含む単離細胞。
- 目的タンパク質に結合した、請求項4記載の改変SUMOを含む融合タンパク質を含むマイクロアレイ。
- 請求項12記載の方法において、前記目的タンパク質は毒性タンパク質である、方法。
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