KR20070035499A - 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 벡터와 샤페론 유전자를 도입한 벡터를 발현시켜서, 저온 조건하에서 목적 단백질을 제조하는 방법

Description

폴리펩티드의 제조방법 {Process for producing polypeptide}

본 발명은 목적으로 하는 단백질을 코드하는 유전자를 혼입한 벡터와 샤페론 유전자를 혼입한 벡터를 발현시켜서, 저온 조건하에서 목적으로 하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 각종 생물 게놈 해석이 종료되면서, 금후는 유전자의 발현산물인 단백질의 망라적인 기능 해석으로 진행할 것으로 여겨진다. 개개의 단백질의 성질을 명백히 함과 동시에, 단백질끼리의 상호작용을 망라적으로 해석함으로써, 생명 현상 해명의 일조가 되는 연구가 급속히 증가되고 있다. 한편, 각종 생리활성물질과 특이적으로 결합하여, 그 작용을 전달하는 세포내 수용체 단백질도 이의 수용체 단백질과 결합하는 활성물질이 신규 의약품의 후보 물질이 될 수 있기 때문에, 이의 3차원 구조 결정에 중대한 관심이 가져지게 되어, 신규 의약품의 스크리닝에 있어서 주목되고 있다. 이와 같은 단백질의 성질을 결정하고자 하는 경우, 해당하는 유전자를 벡터 유전자 상에 혼입하여, 박테리아, 효모, 곤충 세포 등의 숙주에 트랜스포메이션하여, 발현시켜서 얻어지는 재조합 단백질의 성질을 조사하는 방법이 일반적이다.

단백질의 정확한 성질을 평가할 때, 그 단백질이 정확한 입체구조로 폴딩되 어 있는지의 여부가 매우 중요하다. 그러나, 이종 생물 유래의 단백질을 상술한 숙주 발현계를 이용한 단백질 발현법으로 제작하고자 하는 경우, 종종 단백질의 폴딩 이상에 의해 입체구조가 상이한 이상형 단백질만 얻어지는 케이스에 직면한다. 이러한 단백질은 숙주 내에서 봉입체로 불리우는 애그리게이트 (aggregate)를 형성한다. 봉입체의 형성은 발현 단백질을 숙주 균체 내의 단백질 분해효소에 의한 분해로부터 보호하고, 또한 원심분리에 의해 균체로부터 용이하게 분리하는 것을 가능하게 한다는 이점을 갖지만, 목적으로 하는 생물학적 활성을 갖는 단백질을 얻기 위해서는 봉입체를 변성 가용화한 후, 재생 (리폴딩)할 필요가 있다. 가용화/재생 조작은 각 단백질마다 시행착오를 반복하여 경험적으로 행해지지만, 만족스런 수율이 얻어지지 않는 경우가 많거나 반드시 재생할 수 있는 것은 아니다. 또한, 대장균에서 프로테아제에 의해 분해되어, 고 발현량에 이르지 못하는 이종 단백질도 적지 않다. 이러한 발현산물의 불용화나 분해에 대한 해결수단은 아직 충분히 확립되었다고는 말하기 곤란하고, 상술한 숙주 발현계로 생물학적 활성을 갖는 단백질을 대량으로 생산하는 것이 반드시 성공적이지 않는 것이 현상이다. 이 문제를 해결하기 위해, 샤페론 등을 공발현시키는 것이 시도되어, 몇개 보고되어 있다 (예를 들면, 특허문헌 1 내지 3 참조).

DnaK, DnaJ 및 GrpE는 단백질의 폴딩에 협조하여 작용하는 샤페론이다. 우선, DnaJ가 기질인 폴딩되지 않은 단백질에 결합하면, DnaK 상의 ATP가 가수분해되어, 폴딩되지 않은 단백질/DnaJ/DnaK (ADP 결합형) 복합체를 형성한다. 다음에, GrpE에 의해, ADP/ATP 교환이 일어나서, 기질 단백질이 복합체로부터 유리하는 것 으로 여겨진다 (예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 트리거 팩터 (Trigger Factor)는 단백질의 폴딩에 관여하는 분자 샤페론의 하나이며, 세포 내의 폴딩 시의 타겟 단백질 중의 아미노산 중, 프롤린 잔기의 N 말단측 펩티드 결합의 시스-트란스 이성화 반응 (PPIase 활성)을 촉매하는 활성을 갖는 것이다.

대장균 내에서 불용화하는 외래 단백질을 가용화하기 위해, 외래 단백질을 GroEL 및 GroES와 공발현시킴으로써, 가용화하는 것에 성공한 예가 많이 알려져 있다. 예를 들면, 티로신 키나아제 (예를 들면, 비특허문헌 2, 3 참조), 글루탐산 라세마아제 (예를 들면, 비특허문헌 4 참조), 디히드로폴산 환원효소 (예를 들면, 비특허문헌 5 참조) 등을 들 수 있다. 또한, DnaK의 공발현으로 사람 성장 호르몬의 용해성이 향상한 예 (예를 들면, 비특허문헌 6 참조)나 DnaJ의 공발현으로 트란스글루타미나아제가 가용한 예 (예를 들면, 특허문헌 4 참조), DnaK, DnaJ 및 GrpE의 공발현에 의해 티로신 키나아제가 가용한 예 (예를 들면, 비특허문헌 2 참조)가 알려져 있다.

또한, 대장균에서 불용화하는 단백질을 샤페론 등과의 융합 단백질로서 발현시킴으로써 가용화시키는 시도도 이루어져 있다. 예를 들면, 마우스 유래 안티-치킨 리소자임 Fab 항체 단편을 고세균 유래의 샤페론인 TcFKBP18과의 융합 단백질로서 발현시킴으로써 가용화시키는 것에 성공한 예가 알려져 있다 (특허문헌 7 참조).

그러나, 모든 단백질의 발현이나 폴딩 문제가 상기 방법에 의해 해결될 수 있는 것은 아니다. 그 때문에, 단백질을 효과적으로 생산하는 방법의 확립이 강하 게 요망되어 왔다.

한편, 대수증식기의 대장균의 배양온도를 37℃에서 10∼20℃로 저하시키면, 대장균의 증식은 일시적으로 저지되고, 그 사이에 콜드 쇼크 단백질로 불리우는 일군의 단백질의 발현이 유도된다. 이 단백질은 이의 유도 레벨에 따라 제 I 군 (10배 이상)과 제 II 군 (10배 미만)으로 분할되며, 제 I 군의 단백질로는 CspA, CspB, CspG, CsdA 등을 들 수 있다 (예를 들면, 비특허문헌 7, 8 참조). 그 중에서도, CspA (예를 들면, 특허문헌 5 참조)는 37℃에서 10℃로의 온도 시프트의 1.5시간 후에 이의 발현량은 전균체 단백질의 13%에 달하기 때문에 (예를 들면, 비특허문헌 9 참조), 저온에서의 재조합 단백질의 생산에 cspA 유전자의 프로모터를 이용하는 것이 시도되어 왔다.

cspA 유전자를 이용한 저온 조건하에서의 재조합 단백질 발현계는 상술한 바와 같이 이 유전자의 프로모터가 저온에서 고효율로 전사를 개시시키는 것 이외에, 이하와 같은 유효성을 나타낸다.

(1) cspA 유전자로부터 전사된 번역가능한 mRNA가 기능을 갖는 CspA 단백질을 코드하지 않는 경우, 보다 구체적으로는 CspA 단백질의 N 말단 서열의 일부만을 코드하는 경우에는 이러한 mRNA는 콜드 쇼크 단백질도 포함한 다른 대장균 단백질의 발현을 장기간 저해하고, 그 사이에는 이 mRNA의 번역이 우선적으로 행해진다 (예를 들면, 비특허문헌 7, 특허문헌 6 참조). 이 현상은 LACE (절단형 cspA 발현의 저온 의존성 항생물질 효과 (low temperature-dependent antibiotic effect of truncated cspA expression)) 효과로 불리운다.

(2) cspA 유전자의 개시 코돈으로부터 12 염기 하류의 위치에는 15 염기로 이루어지는 다운스트림 박스 (downstream box)로 불리우는 서열이 있고, 저온 조건하에서의 번역 효율을 높이는 것으로 되어 있다.

(3) cspA 유전자 mRNA의 전사 개시점으로부터 개시 코돈까지에 있는 159 염기로 이루어지는 5'비번역 영역은 CspA의 발현에 대하여, 37℃에서는 마이너스 영향, 저온 조건하에는 플러스 영향을 부여한다.

특히, 상기 (1)의 현상은 cspA 유전자를 이용하여 목적으로 하는 단백질만을 특이적으로 발현시키는 가능성을 시사하는 것으로, 고순도의 재조합 단백질 생산, 구조 해석을 위한 동위체 표식된 단백질의 조제로의 응용이 기대된다.

그러나, 상기 저온 조건하에서의 재조합 단백질 발현계도 모든 재조합 단백질에 적용가능한 것은 아니다. 단백질은 각각 고유 분자량, 등전점, 아미노산 조성을 갖고, 또한 이의 기능을 발휘하기 위해서는 특유의 고차원 구조를 형성할 필요가 있다. 단백질 중에는 상기 발현계를 사용해도 충분한 발현량이 달성될 수 없는 것, 활성을 갖는 단백질을 취득할 수 없는 것이 존재한다.

특허문헌 1: 일본 특개평 11-9274호 공보

특허문헌 2: 일본 특개 2000-255702호 공보

특허문헌 3: 일본 특개 2000-189163호 공보

특허문헌 4: 일본 특개 8-308564호 공보

특허문헌 5: 국제공개 제90/09447호 팜플렛

특허문헌 6: 국제공개 제98/27220호 팜플렛

특허문헌 7: 국제공개 제2004/001041호 팜플렛

비특허문헌 1: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10345-10349 (1994)

비특허문헌 2: Cell Mol. Biol., 40:635-644 (1994)

비특허문헌 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1048-1052 (1995)

비특허문헌 4: J. Biochem., 117:495-498 (1995)

비특허문헌 5: Protein. Eng., 7:925-931 (1994)

비특허문헌 6: Biotechnol., 10:301-304 (1992)

비특허문헌 7: J. Bacteriol., 178:4919-4925 (1996)

비특허문헌 8: J. Bacteriol., 178:2994-2997 (1996)

비특허문헌 9: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:283-287 (1990)

본 발명은 상기 종래기술을 감안하여 이루어진 것으로, 본 발명의 목적은 목적으로 하는 폴리펩티드를 효율적이면서 활성을 보유한 상태로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 예의검토를 거듭한 결과, 목적으로 하는 폴리펨티드, 단백질을 코드하는 유전자를 저온 조건하에서의 재조합 단백질 발현계에 의해 발현시킬 때에, 사용하는 숙주 중에서의 샤페론 유전자의 발현을 증강시킴으로써, 종래의 방법에서는 가용성 단백질을 발현시키는 것이 곤란한 것을 활성이 있는 가용성 단백질로서 발현시킬 수 있는 것을 알아냈다.

또한, 상기 방법에 있어서, 목적으로 하는 폴리펩티드, 단백질을 샤페론과의 융합 단백질로서 발현시키는 경우, 목적 단백질의 가용화에 특히 유효하다는 것을 알아냈다. 이 방법에 의한 목적 단백질의 가용화의 효과는 종래로부터 알려져 있던 단백질과 샤페론을 융합 단백질로서 발현시키는 방법이나, 저온 조건하에서의 재조합 단백질 발현계를 이용하여 목적 단백질을 발현시키는 방법에 의한 각각의 효과에서는 전혀 예상할 수 없는 놀라운 것이었다.

본 발명은 예를 들면, 목적 유전자를 혼입한 벡터와 샤페론 유전자를 혼입한 벡터를 동일 숙주 내에 도입하고, 양 유전자의 발현을 유도하여 효율적으로 목적 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 제 1 발명은 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 도입된 숙주를 저온 조건에 둠으로써 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서, 상기 숙주에서 추가로 샤페론을 코드하는 유전자의 발현을 증강하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

제 1 발명에 있어서, 샤페론 유전자를 코드하는 유전자의 발현을 증강하는 수단으로는 숙주 샤페론 유전자의 발현의 유도, 숙주 염색체 상의 샤페론 유전체의 개변, 숙주로의 샤페론 유전자의 도입, 샤페론 유전자의 발현이 증강된 숙주의 사용이 예시된다.

제 1 발명에는 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 샤페론을 코드하는 유전자가 바람직하게 사용된다.

제 1 발명에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자는 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA의 하류에 접속되어 숙주에 도입될 수 있으며, 상기 콜드 쇼크 단백질 유전자로는 대장균 cspA 유전자가 예시된다.

제 1 발명에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 샤페론을 코드하는 유전자는 벡터에 의해 숙주에 도입될 수 있다. 또한, 상기 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA와 샤페론을 코드하는 유전자는 원하는 폴리펩티드와 샤페론과의 융합 단백질을 코드하도록 접속되어도 된다. 상기 원하는 폴리펩티드로는 라우스 관련 (Rous associated) 바이러스 2 (RAV-2) 유래 역전사 효소 α 서브유닛, RAV-2 유래 β 서브유닛, DNase, 사람 유래 Dicer PAZ 도메인 폴리펩티드가 예시된다.

제 1 발명에 사용되는 숙주로는 대장균이 예시된다.

본 발명의 제 2 발명은 원하는 폴리펩티드의 제조에 사용되는 플라스미드 벡터의 세트로서,

(1) 프로모터의 하류에

(a) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA 및

(b) 상기 (a)의 DNA의 하류에 위치하는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 갖는 제 1 벡터; 및

(2) 샤페론을 코드하는 유전자를 갖는 제 2 벡터를 함유하고,

상기 (1), (2)의 벡터의 복제 기점이 불화합성을 나타내지 않도록 선택되는 것을 특징으로 한다.

제 2 발명에 있어서, 제 1 벡터로는 대장균 cspA 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 것, 또한 제 2 벡터로는 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 샤페론을 코드하는 유전자를 함유하는 것이 각각 예시된다. 상기 벡터로는 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드를 사용할 수 있다.

본 발명의 제 3 발명은 발현 벡터에 관한 것으로, 프로모터의 하류에,

(a) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA,

(b) 상기 (a)의 DNA의 하류에 위치하는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 갖는 DNA, 및

(c) 샤페론을 코드하는 유전자를 갖는 것을 특징으로 한다.

제 3 발명의 발현 벡터로는 대장균 cspA 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 것, DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 샤페론을 코드하는 유전자를 함유하는 것이 예시된다.

제 3 발명에 있어서는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열이 원하는 폴리펩티드가 샤페론과의 융합 단백질로서 발현되도록 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입할 수 있는 부위에 위치해도 된다.

상기 발현 벡터는 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드이어도 된다.

본 발명의 방법에 의해, 종래는 발현이 곤란했던 폴리펩티드를 상당량으로 활성을 갖는 상태로 취득하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 공발현에 의한 hDi-ASI의 발현시험결과를 나타내는 도면이다. "A" 및 "B"는 각각 CBB 염색 및 항체 염색의 결과를 나타낸다. 도면 중, "T"는 세포 추출액 분획, "S"는 가용성 분획을 나타낸다.

도 2 는 RTaseα 및 RTaseβ와 트리거 팩터와의 융합 단백질의 발현시험결과를 나타내는 도면이다. "A" 및 "B"는 각각 단독발현 및 공발현의 결과를 나타내고, "C" 및 "D"는 각각 T7 프로모터 발현계에 의한 융합 발현 및 콜드 쇼크 발현계에 의한 융합 발현의 결과를 나타낸다. 도면 중, "α"는 RAV-2 RTaseα, "β"는 RAV-2 RTaseβ, "T"는 세포 추출액 분획, "S"는 가용성 분획, "P"는 불용성 분획을 나타낸다.

도 3은 DNase와 트리거 팩터와의 융합 단백질의 발현시험결과를 나타내는 도면이다. "A", "B" 및 "C"는 각각 단독발현계, 공발현계 및 융합발현계의 결과를 나타낸다. 도면 중, "S"는 가용성 분획, "P"는 불용성 분획을 나타낸다.

도 4는 DNase의 활성측정결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, "M"은 기질만, "1"은 대조의 초음파 파쇄 가용성 분획을 사용하여 DNase 활성측정을 행한 결과, "2"는 융합발현계의 초음파 파쇄 가용성 분획을 사용하여 DNase 활성측정을 행한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 관해서 설명한다.

(1) 콜드 쇼크 벡터

본 발명에 사용되는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하는 벡터 는 숙주의 배양온도를 통상의 생육온도보다도 낮게 시프트시키는 처리, 즉 콜드 쇼크에 의해, 상기 폴리펩티드의 발현이 유도되는 것으로, 본 발명에 있어서는 발현 벡터로서 사용된다. 본 명세서에 있어서, "저온"이란 용어는 숙주의 통상의 생육온도보다도 낮은 온도를 말한다. 이하, 상기 벡터를 콜드 쇼크 벡터로 기재하는 일이 있다. 또한, 이 벡터를 이용한 원하는 폴리펩티드의 발현계를 콜드 쇼크 발현계로 기재하는 경우가 있다. 이 벡터로는 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA를 보유하여, 이의 하류에 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 접속되는 것을 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서, "하류"란 용어는 전사 방향에 관하여 하류의 위치를 말한다.

특히, 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 바람직한 형태에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 함유하는 벡터는 하기 각 요소를 함유하는 것을 특징으로 한다:

(A) 사용하는 숙주 중에서 이의 작용을 나타내는 프로모터;

(B) (A)의 프로모터의 작용을 조절하기 위한 조절 영역; 및

(C) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역, 또는 이 비번역 영역에 적어도 1 이상의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가가 실시된 영역을 코드하는 영역.

이하에 이의 상세를 설명한다.

상기 (A)의 프로모터는 특별히 한정되지 않고, 사용하는 숙주 중의 RNA의 전사를 개시하는 활성을 갖는 것이면 된다. 상세하게는, 임의의 프로모터를 상기 (C)의 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 영역과 조합하여 사용함으로써, 저온 응답성 프로모터로서 이용할 수 있는 프로모터이다.

또한, 상기 (B)의 조절 영역으로는 (A)의 프로모터의 하류에 위치하는 유전자의 발현을 제어가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 프로모터로부터 전사된 mRNA에 상보적인 RNA (안티센스 RNA)를 전사하는 영역을 벡터에 도입함으로써, 프로모터 하류의 유전자로부터의 목적 단백질의 번역을 저해할 수 있다. 안티센스 RNA의 전사를 (A)의 프로모터와는 다른 적당한 프로모터의 제어하에 둠으로써, 목적 폴리펨티드의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 각종 유전자의 발현 조절 영역에 존재하는 오퍼레이터를 이용해도 된다. 예를 들면, 대장균 락토오스 오페론 유래의 lac 오퍼레이터를 본 발명에서는 사용할 수 있다. lac 오퍼레이터는 적당한 유도물질, 예를 들면 락토오스나 이의 구조유사체, 특히 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)의 사용에 의해 이의 기능을 해제하여, 프로모터를 작용시키는 것이 가능하다. 이러한 오퍼레이터 서열은 통상 프로모터 하류의 전사 개시점 부근에 배치된다.

상기 (C)의 콜드 쇼크 단백질 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 영역이란, mRNA의 개시 코돈보다도 5'측의 부분을 코드하는 영역이다. 대장균의 콜드 쇼크 단백질 유전자 (cspA, cspB, cspG 및 csdA)에는 이의 영역이 특징적으로 밝혀져 있고 [J. Bacteriol., 178: 4919-4925 (1996); J. Bacteriol., 178: 2994-2997 (1996))], 이들 유전자로부터 전사된 mRNA 중 5' 말단으로부터 100 염기 이상의 부분이 단백질로 번역되어 있지 않다. 이 영역은 유전자 발현의 저온 응답성에 중요 하며, 임의의 단백질의 mRNA의 5' 말단에 5' 비번역 영역을 부가함으로써, 이 mRNA로부터 단백질로의 번역이 저온 조건하에서 일어나게 된다. 이 콜드 쇼크 단백질 mRNA 유래의 5' 비번역 영역은 이 기능을 보유하는 범위에 있어서 이의 염기 서열에 1 이상의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가가 실시된 것이어도 된다.

본 명세서에 있어서, "영역"이란 핵산 (DNA 또는 RNA) 상의 어떤 범위를 가리킨다. 또한, 본 명세서에 기재된 "mRNA의 5' 비번역 영역"이란, DNA로부터의 전사에 의해 합성되는 mRNA 중, 이의 5'측에 존재하고, 또한 단백질을 코드하지 않는 영역을 말한다. 이후의 본 명세서에 있어서는 이 영역을 "5'-UTR (5' 비번역 영역)"로 기재한다. 또한, 특별히 언급하지 않는 한, 5'-UTR은 대장균 cpsA 유전자의 mRNA, 또는 이것이 개변된 것의 5' 비번역 영역을 가리킨다.

본 벡터로는 상기에 열거된 콜드 쇼크 단백질 유전자 유래의 5'-UTR를 코드하는 영역을 사용할 수 있지만, 특히 대장균 cpsA 유전자 유래의 것이 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 저온 특이적인 폴리펩티드의 발현에 기여할 수 있는 범위에서 이 염기 서열을 일부 개변한 것이어도 되고, 예를 들면 상기 (B)에 나타낸 오퍼레이터의 도입 등에 의해 이 영역의 염기 서열이 개변된 것이어도 된다. 또한, 이 콜드 쇼크 단백질 유전자의 5'-UTR를 코드하는 영역은 (A)의 프로모터와 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 개시 코돈과의 사이에 배치되고, 또한 이 영역 상에 오퍼레이터가 도입되어도 된다.

또한, 상기 구성요소에다가, 사용하는 숙주의 리보소말 RNA의 안티다운스트림 박스 서열과 상보성을 갖는 염기 서열을 5' 비번역 영역의 하류에 함유시킴으로 써 발현 효율을 상승시킬 수 있다. 예를 들면, 대장균의 경우, 16S 리보소말 RNA의 1467 내지 1481의 위치에 안티다운스트림 박스 서열이 존재하고, 이 배열과 높은 상보성을 나타내는 염기 서열을 함유하는 콜드 쇼크 단백질의 N 말단 펩티드를 코드하는 영역을 사용할 수 있다. 또한, 목적 단백질 유전자의 하류에 전사 종결 서열 (터미네이터)이 배치된 벡터는 벡터의 안정성이 향상되어, 목적 단백질의 고발현에 유리하다.

본 벡터는 벡터로서의 목적을 달성할 수 있는 것이면, 일반적으로 사용되는 벡터, 예를 들면 플라스미드, 파아지, 바이러스 등의 어느 것이어도 된다. 또한, 본 발명의 벡터에 함유되는 상기 구성요소 이외의 영역으로는 예를 들면, 복제 기점, 선택 마커로서 사용되는 약제 내성 유전자, 오퍼레이터 기능에 필요한 조절 유전자, 예를 들면 lac 오퍼레이터에 대해서는 lacI^q 유전자 등을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 숙주에 도입된 후에는 이의 게놈 DNA 상에 혼입되어도 상관없다.

이하에, 구체적인 플라스미드 벡터의 구축을 들 수 있다. 또한 본 명세서에서 특별히 한정되지 않는 한, 대장균 CspA 단백질을 "CspA", 이 단백질의 발현에 관여하는 유전자 상의 영역을 "cspA 유전자", 이 유전자의 프로모터 영역을 "cspA 프로모터"로 기재한다. 또한, 유전자 은행 유전자 데이터베이스에 수탁 번호 M30139로서 등록, 공개되어 있는 천연 cspA 유전자의 염기 서열 (서열표의 서열번호 1에 이 서열을 나타낸다)에 있어서, 염기번호 426이 주요한 (major) 전사 개시점 (+1), 염기번호 609∼611이 SD 서열 (리보솜 결합 서열), 염기번호 621∼623 및 823∼834가 각각 CspA의 개시 코돈 및 종지 코돈이다. 따라서, 이 서열 중에서 5'-UTR을 코드하는 것은 염기번호 462∼620의 부분이다. 또한, 상기 일부 개변된 5'-UTR로는 국제공개 제99/27117호 팜플렛에 기재된 것이 예시된다. 본원 실시예에서 사용된 pCold08NC2 벡터가 가지고 있는 5'-UTR 영역은 그 일례이며, 이의 염기 서열을 서열표의 서열번호 2에 나타낸다.

또한, 목적 유전자의 발현 효율을 향상시키기 위해, 16S 리보소말 RNA 중에 존재하는 안티다운스트림 박스 서열에 높은 상보성을 갖는 염기 서열 (다운스트림 박스 서열)을 본 벡터에 도입할 수 있다. 대장균 CspA의 N 말단 부분을 코드하는 영역에 존재하는 다운스트림 박스 서열은 상기 안티다운스트림 박스 서열에 대하여 67%의 상보성만 갖고 있다. 이것을 보다 높은 상보성, 바람직하게는 80% 이상의 상보성을 갖는 염기 서열, 특히 바람직하게는 100%의 상보성을 갖는 염기 서열 (퍼펙트 (Perfect) DB 서열)로 함으로써, 이의 하류에 접속된 유전자를 보다 높은 효율로 발현시키는 것이 가능해진다.

또한, 본 벡터는 발현된 목적 유전자 산물의 정제를 용이하게 하기 위한 펩티드인 태그 서열을 코드하는 염기서열이나, 태그 서열과 같은 목적 유전자 산물 중의 여분의 펩티드의 제거에 이용되는 프로테아제 인식 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 도입할 수 있다.

정제용 태그 서열로는 수개의 히스티딘 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그 (His Tag)나 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트란스페라제 등을 사용할 수 있다. 히스티딘 태그를 부가시킨 폴리펩티드는 킬레이팅 컬럼을 사용하여 용이하게 정제할 수 있고, 다른 태그 서열에 관해서도 이들에 특이적인 친화성을 갖는 리간드를 사용함으로써, 간편하게 정제할 수 있다. 또한, 여분의 펩티드의 제거에 이용되는 프로테아제로는 팩터 Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 등을 사용할 수 있으며, 본 벡터에 이들의 프로테아제에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 도입하면 된다.

(2) 샤페론의 발현의 증강

본 발명의 폴리펩티드의 제조방법은 목적으로 하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현시에, 샤페론을 코드하는 유전자의 발현을 증강시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 샤페론으로는 단백질의 폴딩에 관여하는 단백질이면 어느 단백질이어도 무관하다. 예를 들면, 대장균 유래 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, 트리거 팩터 등을 들 수 있다.

특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 콜드 쇼크 벡터를 이용한 폴리펩티드의 발현에 있어서는 폴리펩티드 내의 프롤린의 이성화에 관여하는 단백질, 예를 들면 트리거 팩터 [펩티딜-프로필 시스-트란스 이소메라제 (PPIase)로도 불리운다]의 사용이 바람직하다. 상기 샤페론은 대장균 유래의 것에 한정되지 않고, 예를 들면, 고세균, 효모, 미생물, 호냉균 유래 등의 샤페론을 이용할 수 있다.

상기 샤페론 유전자의 발현의 증강은 염색체 상의 샤페론을 코드하는 유전자의 발현 유도 이외에, 염색체 상의 샤페론 유전자의 개변 (카피수의 증가나 프로모터의 삽입), 샤페론 유전자의 숙주로의 도입, 숙주로의 변이 도입에 의한 샤페론 유전자 고발현주의 취득 등의 공지의 수법에 의해 달성될 수 있다.

염색체 상의 샤페론 유전자의 발현 유도는 예를 들면 숙주에 있어서 상기 샤페론의 발현이 유도되는 조건이 공지되어 있는 것이면, 이 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 염색체 상의 샤페론 유전자의 개변은 숙주 염색체에 관해서 상동 재조합을 이용한 유전자의 삽입이나 부위 특이적 변이 도입의 수법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 숙주 염색체 상에 유도되는 샤페론을 코드하는 유전자의 상류에 유도가능한 프로모터를 삽입하여, 이 프로모터를 통해 발현을 유도할 수 있다.

또한, 다른 형태로는 폴리펩티드의 발현에 사용되는 숙주에 관해서 샤페론 유전자의 발현이 증강되어 있는 변이주를 취득하여, 이것을 숙주로서 사용하는 것을 들 수 있다. 변이주의 취득은 공지의 방법, 예를 들면 숙주 미생물을 약제나 자외선과 같은 변이원으로 처리한 후에 샤페론 유전자의 발현이 증강되어 있는 주를 선택함으로써 실시될 수 있다.

여기에서, 샤페론을 코드하는 유전자의 발현의 증강이란, 숙주 중의 샤페론 단백질의 양이 이의 통상적인 양에 비교하여 증가되어 있는 것을 의미한다. 상기 조작에 의해 샤페론 유전자의 발현이 증강되어 있는지의 여부는 예를 들면, 이 샤페론을 인식하는 항체를 이용하여 샤페론 단백질을 측정하거나, 또는 이 샤페론을 코드하는 유전자로부터 전사되는 mRNA 양을 공지의 방법, 예를 들면 RT-PCR법이나 노던 하이브리다이제이션, DNA 어레이를 사용하는 하이브리다이제이션 등에 의해 측정하여 확인할 수 있다.

목적 단백질의 발현 레벨을 저하하지 않고, 상기 샤페론의 발현량이나 발현 시기를 최적화하기 위해, 샤페론의 발현과 목적 단백질의 발현은 독립하여 제어할 수 있는 것이 유리하다. 이를 위해, 샤페론 유전자를 제어가능한 프로모터의 하류에 두는 것이 바람직하다. 또한, 샤페론의 발현에 사용되는 제어가능한 프로모터로는 목적 단백질의 발현에 사용되는 프로모터와는 다른 것이 바람직하다.

상기 샤페론 유전자의 발현의 증강은 이 샤페론 유전자를 벡터에 삽입하여 숙주에 도입하여 실시할 수도 있다. 벡터로는 벡터로서의 목적을 달성할 수 있는 것이면, 일반적으로 사용되는 벡터, 예를 들면 플라스미드, 파아지, 바이러스 등의 어느 것이어도 된다.

통상, 근연인 2종의 플라스미드는 동일 숙주에 안정하게 공존할 수 없다. 이 현상을 불화합성이라 한다. 본 발명에 있어서, 샤페론 유전자를 함유하는 벡터로서 플라스미드 (이하, 샤페론 플라스미드로 기재하는 경우가 있다)를 사용하는 경우는 목적 단백질의 발현 벡터와 불화합성을 나타내지 않는 레플리콘을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 목적 단백질의 발현 벡터로서 국제공개 제99/27117호 팜플렛에 기재된 pCold07 등 ColE1 레플리콘을 갖는 것을 사용하는 경우, 샤페론 플라스미드에는 pACYC 벡터에 존재하는 p15A 레플리콘 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 샤페론 유전자를 함유하는 벡터에 의한 형질전환시에 선택이 용이하게 행해지도록, 필요에 따라 선택 마커 유전자를 추가로 포함해도 된다. 이러한 선택 마커 유전자로는 암피실린 내성 (Amp^r) 유전자, 카나마이신 내성 (Km^r) 유전자, 클로람페니콜 내성 (Cm^r) 유전자 등을 들 수 있지만, 외래 단백질 발현 벡터에 포함되는 선택 마커 유전자와는 상이한 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 샤페론 플라스미드의 구체예로는 DnaK/DnaJ/GrpE 및 GroEL/GroES를 발현하는 플라스미드 pG-KJE8, GroEL/GroES를 발현하는 플라스미드 pGro7, DnaK/DnaJ/GrpE를 발현하는 플라스미드 pKJE7, GroEL/GroES 및 트리거 팩터를 발현하는 플라스미드 pG-Tf2, 및 트리거 팩터를 발현하는 플라스미드 pTf16 (모두 Takara Bio 제)를 들 수 있다.

샤페론을 코드하는 유전자는 상기와 같이 벡터를 사용하여 숙주에 도입되는 것 이외에, 숙주 염색체에 혼입되어 사용될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 발현되는 외래 단백질로는 숙주 내에서 불안정화 및/또는 불용화하는 외래 단백질이면, 어느 단백질이어도 무관하다. 이러한 외래 단백질로는 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 인터루킨 수용체 길항물질, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자, 마크로파아지 콜로니 자극 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 백혈병 억제 인자, 간세포 성장 인자, 종양 괴사 인자, 성장 호르몬, 프로인슐린, 인슐린 양 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 트랜스포밍 성장 인자, 간세포 성장 인자, 골형성 인자, 신경 성장 인자, 모양체 신경 영양 인자, 뇌유래 신경 영양 인자, 글리아 세포 유래 신경 영양 인자, 뉴로트로핀, 프로우로키나제, 조직 플라스미노겐 액티베이터, 혈액 응고 인자, 프로테인 C, 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 슈퍼옥사이드디스무타제, 레닌, 리소자임, P450, 프로키모 신, 트립신 인히비터, 엘라스타제 인히비터, 리포코르틴, 렙틴, 면역글로불린, 1본쇄 항체, 보체 성분, 혈액 알부민, 삼나무 화분 항원, 저산소유도성 스트레스 단백질, 프로테인 키나제, 원종양유전자 산물, 전사 조절 인자 및 바이러스 구성 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 숙주에 도입되어 목적 단백질의 발현을 행한다. 상기 숙주로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 세균 등의 원핵생물, 효모, 진균, 식물, 곤충세포, 포유류 세포 등을 들 수 있지만, 사용되는 숙주와 발현 벡터의 특성은 적합해야 한다. 예를 들면, 포유류 세포계에서 단백질을 발현하는 경우, 발현 벡터는 포유류 세포의 게놈으로부터 단리된, 예를 들면 마우스 메탈로티오네인 프로모터 등의 프로모터나, 이들 세포에서 증식하는 바이러스로부터 단리된, 예를 들면 배큘로바이러스 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터 등의 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 숙주로는 그 중에서도 대장균 등의 원핵생물이 바람직하게 사용된다. 그람 음성 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 단백질의 발현은 세포질이어도 페리플라즘 영역으로의 발현이어도 된다.

본 발명의 샤페론 벡터 및 발현 벡터를 숙주에 도입하는 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 공지의 각종 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 트랜스펙션으로서 인산칼슘 침전법, 전기천공, 리포솜 융합, 핵주입, 바이러스 또는 파아지 감염 등을 들 수 있다. 본 발명의 발현 벡터를 내포하는 숙주도 또한 본 발명의 하나이다. 숙주에 도입하는 순서로는 샤프론 벡터와 발현 벡터를 동시에 도입하는 1단계 방식이어도, 샤페론 벡터를 도입한 후에 발현 벡터를 도입하고, 또는 발현 벡터를 도입한 후에 샤페론 벡터를 도입하는 2단계 방식이어도 된다. 공형질전환균의 스크리닝법으로는 선택 마커 유전자에 따른 약제에 의해 행할 수 있다. 외래 단백질의 발현은 예를 들면, 웨스턴 블로팅 등에 의해 확인될 수 있다.

본 발명의 하나의 형태로서, 상기 콜드 쇼크 벡터, 샤페론 유전자를 함유하는 벡터를 조합시킨 폴리펩티드 발현용 벡터 세트를 들 수 있다. 이 형태에 있어서, 콜드 쇼크 벡터로는 목적에 따라서 발현시키는 것이 요구되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입가능한 것이 바람직하고, 예를 들면 (a) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA 및 (b) 상기 (a)의 DNA의 하류에 위치하는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 갖는 것이 예시된다.

또한, 본 발명의 다른 형태로서, 상기 콜드 쇼크 벡터에 샤페론을 코드하는 유전자를 삽입한 벡터를 들 수 있다. 이 경우, 단일 벡터로 숙주를 형질전환함으로써, 목적 폴리펩티드를 발현에 사용할 수 있는 형질전환체를 제작할 수 있다.

이 형태에 있어서는, 샤페론을 코드하는 유전자와 목적 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 인프레임으로 결합되어, 샤페론과 목적 폴리펩티드와의 융합 단백질이 발현되는 위치에 목적 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 배치해도 된다. 샤페론과 목적 폴리펩티드의 융합 단백질은 샤페론이 목적 폴리펩티드의 N 말단측에 연결되어도 C 말단측에 연결되어도 그 양쪽에 연결되어도 된다. 또한, 상기 융합 단백질은 샤페론과 목적 폴리펩티드 사이에 링커 가 되는 아미노산 또는 펩티드를 가져도 된다. 이러한 링커의 쇄 길이는 1∼50 아미노산인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3∼40 아미노산이며, 가장 바람직하게는 5∼30 아미노산이다. 또한, 링커의 아미노산 서열은 프로테아제 인식 서열이어도 되고, 다수의 프로테아제 인식 서열이 병렬로 삽입된 것이어도 된다. 이러한 프로테아제 인식 서열로는 팩터 Xa, 트롬빈, 엔테로키나제 (모두 Takara Bio 제) 및 프리시전 (PreScission) 프로테아제 (Amersham Biosciences 제)라는 각종 프로테아제의 인식 서열이 예시된다. 상기 프로테아제의 인식 서열은 바람직하게는 4∼8 아미노산으로 이루어진 서열이 예시된다.

상기 벡터에 목적 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입하여 적당한 숙주에 도입함으로써, 목적 폴리펩티드와 샤페론과의 융합 폴리펩티드를 취득할 수 있다. 이 융합 폴리펩티드가 프로테아제의 인식 서열을 포함하는 링커를 갖는 경우에는, 프로테아제 소화에 의해 샤페론과 분리된 목적 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

(3) 폴리펩티드의 제조방법

본 발명에서의 폴리펩티드의 제조는 예를 들면 이하와 같은 공정으로 실시된다.

목적으로 하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 콜드 쇼크 벡터의 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA의 하류에 삽입한다. 이렇게 하여 제작된 재조합 발현 벡터를 적절한 숙주에 도입하여 형질전환체를 제작한다.

상기 샤페론을 코드하는 유전자를 함유하는 벡터를 병용하는 경우에는, 추가 로 이 벡터를 상기 형질전환체에 도입한다. 또한, 콜드 쇼크 벡터가 샤페론을 코드하는 유전자를 보유하는 경우에는 이 벡터만으로 숙주를 형질전환하면 된다.

상기 형질전환체를 통상의 조건에서 배양한다. 예를 들면, 대장균의 경우에는 37℃ 전후에서 배양하면 된다. 샤페론에 대해서는 배양의 모든 공정에서 숙주 중에 발현시켜도 되고, 또한 목적 폴리펩티드의 발현과 동시기에 발현을 유도해도 된다. 샤페론 유전자의 발현의 유도는 숙주 중의 샤페론 유전자의 존재 상태에 따라서 행하면 되고, 예를 들면 숙주가 본래 가지고 있는 샤페론 유전자의 발현을 유도하고자 하는 경우에는, 그것에 적합한 조건에 숙주를 배치하면 된다. 샤페론을 코드하는 유전자가 이종의 프로모터의 제어하에 있는 경우, 예를 들면 샤페론 유전자가 벡터에 삽입되어 숙주에 도입되어 있는 경우에는 이의 전사를 제어하고 있는 프로모터에 적합한 수단으로 발현 유도가 실시된다. 또한, 정상적으로 샤페론 유전자의 발현이 증강되어 있는 숙주를 사용하는 경우, 상기와 같은 유도 조작은 필요하지 않다.

목적 폴리펩티드의 발현 유도는 통상 상기와 같이 일반적인 배양온도에서 세포수를 증가시킨 후에 실시된다. 이 상태로부터 배양온도를 저하시킴으로써 숙주에 콜드 쇼크 응답이 유도되고, 이 결과로서 목적 폴리펩티드의 발현이 우선적으로 행해지도록 된다. 배양온도는 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 일반적인 배양온도로부터 5℃ 이상, 바람직하게는 10℃ 이상 저하시켜서 콜드 쇼크 응답이 유도된다. 이 때, 프로모터의 하류에 오퍼레이터를 보유하는 콜드 쇼크 벡터가 사용되는 경우에는 적절한 수단으로 이 오퍼레이터의 기능을 해제하여, 프로모터를 유도해도 된다.

상기 콜드 쇼크 후, 추가로 저온에서 형질전환체의 배양을 계속하여, 폴리펩티드를 발현시킨다. 이렇게 하여 얻어지는 배양물로부터 목적 폴리펩티드를 회수함으로써, 이 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 배양물로부터의 폴리펩티드의 정제는 상기 배양물로부터 회수된 형질전환체 세포, 배양물 상청액, 또는 이들 양쪽으로부터 실시할 수 있다. 폴리펩티드의 정제는 황산암모늄 분획, 한외여과, 각종 크로마토그래피 등의 단백질 정제수법을 조합하여 실시하면 된다.

또한, 발현된 폴리펩티드를 적당한 리간드를 통해 담체에 결합하는 형태로 설계함으로써, 이의 정제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드의 N 말단측에 히스티딘 6 잔기 정도의 태그를 부가하도록 설계하면, 얻어진 융합 폴리펩티드는 니켈 등의 금속을 킬레이트한 담체에 히스티딘 잔기를 통해 결합할 수 있다. 이 담체를 사용하면, 숙주 유래의 단백질과 발현된 폴리펩티드를 간편하게 분리할 수 있다. 담체에 결합한 발현된 폴리펩티드는 프로테아제로 링커를 절단함으로써, 목적 폴리펩티드만을 간편하게 담체로부터 유리시킬 수 있다. 물론, 절단하지 않고, 발현된 폴리펩티드 그대로 담체로부터 유리시키는 것도 이미다졸로 용출하면 가능하다. 상기 히스티딘 태그 이외에도, 글루타티온-S-트란스페라제 또는 이의 부분을 태그로 하여, 글루타티온 수지에 의한 어피너티 (affinity)에 의해 정제하는 방법이나, 밀토오스 결합 단백질 또는 이의 부분을 태그로 하여, 말토오스 수지에 의해 정제하는 방법 등을 적용해도 상관없다.

그 외에, 항체와의 어피너티를 이용해도 상관없다. 상기 정제 태그는 발현 단백질의 N 말단측에 설계해도 C 말단측에 설계해도 어느 것이어도 상관없다. 이들 유전자 조작이나 어피너티 정제방법은 당업자에게는 일반적으로 이해되는 것이다.

상기와 같이 콜드 쇼크 벡터를 사용한 폴리펩티드의 발현계에서는 목적 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드의 발현은 억제되므로, 본원 발명의 방법은 고순도의 폴리펩티드의 제조에 있어서 유리하다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 명세서에 기재된 조작 중, 플라스미드의 조제, 제한효소 소화 등의 기본적인 조작에 관해서는 문헌 [참조: J. Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)]에 기재된 방법에 따랐다.

실시예 1: 샤페론 공발현에 의한 hDi-ASI의 발현 검토

(1) 발현 벡터의 구축

사람 유래 Dicer의 PAZ + RNase III 도메인으로 이루어지는 폴리펩티드 (사람 유래 Dicer의 아미노산 서열의 N 말단측으로부터 679∼1924번째)를 발현시키기 위해, 이하와 같이 하여 발현 벡터를 구축했다.

우선, 유전자 은행 수탁번호 (Genbank Acc No.) AB028449로 공개되어 있는 염기서열로부터, 서열표의 서열번호 4 및 5에 기재된 염기서열을 갖는 합성 프라이머 5 및 6을 DNA 합성기로 합성하여, 통상법에 의해 정제하였다. 상기 합성 프라 이머 5는 제한효소 KpnI의 인식 서열을 염기번호 9∼14에, 또한 사람 유래 Dicer의 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 679∼685에 상당하는 염기서열을 염기번호 16∼36에 갖는 합성 DNA이다. 또한, 합성 프라이머 6은 제한효소 HindIII의 인식 서열을 9∼14에, 또한 사람 유래 Dicer의 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 1919∼1924에 상당하는 염기서열을 염기번호 18∼35에 갖는다.

상기 합성 프라이머를 사용하여, PCR을 행하였다. PCR의 반응조건을 이하에 나타낸다.

즉, 주형 DNA (사람 cDNA 라이브러리, Human Pancreas, Takara Bio 제) 2 ㎕, 5 ㎕의 10 × LA PCR 버퍼 (Takara Bio 제), 5 ㎕의 dNTP 혼합액 (Takara Bio 제), 10 pmol의 합성 프라이머 5, 10 pmol의 합성 프라이머 6, 0.5 U의 다카라 (Takara) LA Taq (Takara Bio 제)를 가하고, 멸균수를 가해 전체량을 50 ㎕로 하였다. 상기 반응액을 다카라 PCR 더멀 사이클러 (Thermal Cycler) SP (Takara Bio 제)에 세트하여, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃에서 3분을 1 사이클로 하는 30 사이클 반응을 행하였다.

반응종료 후, 이 반응액 5 ㎕를 1.0% 아가로스 겔 전기영동시켰다. 확인된 목적의 2.7 kbp의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, 에탄올 침전을 행하였다. 에탄올 침전 후의 회수 DNA를 5 ㎕의 멸균수에 현탁하여, 제한효소 KpnI (Takara Bio 제) 및 제한효소 HindIII (Takara Bio 제)로 이중 소화하고, 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 이의 KpnI-HindIII 소화물을 추출정제하여, KpnI-HindIII 소화 DNA 단편을 얻었다.

다음에, 국제공개 제99/27117호 팜플렛의 기재에 의거하여, 대장균 JM109/pMM047 (FERM BP-6523) (1997년 10월 31일 (원기탁일)에 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566), 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 기탁)에 보유된 플라스미드 pMM047을 출발재료로 하여 pCold08NC2를 구축하였다. 플라스미드 pCold08NC2는 상류측으로부터 순번으로 cspA 프로모터, lac 오퍼레이터, 개변된 대장균 cspA 유전자 유래 5'-UTR 및 멀티플 클로닝 사이트를 갖는 플라스미드이다. 또한, 이 플라스미드는 lacI 유전자, 대장균 16S 리보소말 RNA 중에 존재하는 안티다운스트림 서열에 완전히 상보적인 다운스트림 박스 서열, 6개의 히스티딘 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그 및 팩터 Xa가 인식하는 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 각각 갖고 있다. pCold08NC2 벡터가 갖고 있는 5'-UTR 영역의 염기서열을 서열표의 서열번호 2에 나타낸다.

이 pCold08NC2 벡터를 상기 KpnI-HindIII 소화 DNA 단편을 조제할 때에 사용한 것과 동일한 제한효소로 절단하고, 말단을 탈인산처리를 행한 것을 조제하여, 상기 KpnI-HindIII 소화 DNA 단편과 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 20 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 50 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다.

목적 DNA 단편이 삽입된 플라스미드는 시퀀싱함으로써 확인하여, 이 재조합 플라스미드를 pCold08 hDi-ASI로 하였다. 이 플라스미드는 플라스미드 pCold08 hDi-ASI로 명명, 표시되어, 2003년 9월 26일 (원기탁일)로부터 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터 (일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566))에 FERM BP-10076으로서 기탁되어 있다. 이 pCold08 hDi-ASI는 사람 유래 Dicer 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 679∼1924의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열 (서열표의 서열번호 6 기재의 염기서열, 서열번호 7 기재의 아미노산 서열)을 포함하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드로부터 발현된 단백질은 퍼펙트 DB 서열, His 태그 서열 및 팩터 Xa 서열을 갖고 있다. 이 단백질의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 8에, 염기서열을 서열표의 서열번호 9에 나타낸다.

(2) 공형질전환체의 조제

GroEL 및 GroES를 발현하는 pGro7, DnaK, DnaJ 및 GrpE를 발현하는 pKJE7, GroEL, GroES 및 트리거 팩터를 발현하는 pG-Tf2, 트리거 팩터를 발현하는 pTF16 (모두 Takara Bio 제) 각각의 샤페론 플라스미드 각 1 ng과, 상기 플라스미드 pCold08/hDi-ASI 각 1 ng을 사용하여, 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법으로 행하였다.

pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTF16의 각각과 pCold08/hDi-ASI를 보유하는 공형질전환체는 클로람페니콜 및 암피실린을 각각 20 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻어졌다. 얻어진 각 샤페론과 hDi-ASI를 공발현하는 클론을 각각 T1, T2, T3, T4로 명명하였다.

또한, 대조로서, pCold08/hDi-ASI만을 사용하여 대장균 BL21 (Novagen 제)을 형질전환하고, 암피실린 100 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻어진 형질전환체를 제작하였다. 이 샤페론을 도입하지 않은 종래의 발현계의 클론을 C1으로 명명하였다.

(3) hDi-ASI의 발현

(1)에서 얻어진 각 형질전환체를 사용하여, hDi-ASI의 발현을 조사하였다. 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (조성: 1% 백토 (Bacto) 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 20 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 ㎍/ml 암피실린)를 사용하였다. 단, 대조인 C1의 배양에는 클로람페니콜을 포함하지 않는 배지를 사용하였다.

각 형질전환체는 37℃에서 배양하였다. 배양 개시할 때에, T1, T2, T4의 배지에는 L-아라비노스 (최종 농도 0.5 mg/ml)를 첨가하고, 또한 T3의 배지에는 테트라사이클린 (최종 농도 5 ng/ml)을 첨가하여, 샤페론을 발현유도하였다. 탁도가 OD600 = 0.4 정도에 도달한 시점에서, 15℃에서 15분간 배양 후, 배양액에 최종 농도 0.5 mM의 IPTG를 가하고, 또한 15℃에서 24시간 배양을 행함으로써 hDi-ASI의 발현을 유도하였다.

hDi-ASI의 발현유도를 24시간 행한 후, 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄하여, 세포 추출액 분획을 조제하고, 이어서 15000 × g의 원심분리에 의해 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 각각의 분획에 대해서, 약 3.75 × 10⁶개의 균수 분을 SDS-PAGE하였다. CBB 염색 (A), 또는 항 His 태그 항체 (QIAGEN 제)를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 해석한 결과 (B)를 도에 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이 종래의 발현계인 대조의 C1에서는 세포 추출액 분 획에 분자량 144000의 목적 단백질이 확인되었지만, 가용성 분획에는 거의 검출되지 않았다. 한편으론, T4에 보여지는 바와 같이 hDi-ASI와 트리거 팩터를 공발현한 경우에는 대조와 비교하여 hDi-ASI의 세포 추출액 분획이 증가되는 것이 관찰되었다. 또한, 이의 대부분이 가용성 분획에 검출되었다. hDi-ASI와 다른 샤페론의 공발현을 행한 T1, T2, T3에서는 가용성 분획에는 거의 검출되지 않았다.

이상과 같이, 샤페론을 도입하지 않은 종래의 발현계, 또는 GroEL 및 GroES; Dnak, DnaJ 및 GrpE; GroEL, GroES 및 트리거 팩터를 발현하는 샤페론 공발현에 비해, 트리거 팩터와의 공발현에 의해 hDi-ASI의 발현량, 가용성도의 증대 효과가 얻어지는 것을 나타냈다.

(4) 발현, 정제

상기 (2)에서 조제한 pCold08 hDi-ASI와 pTf16을 사용하여, 대장균 BL21을 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 50 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 생육한 클로니를 500 ml의 TB 액체 배지 (백토 트립톤 6 g, 백토 효모 추출물 12 g, 글리세롤 2 ml, 17 mM KH₂PO₄, 72 mM K₂HPO₄, 암피실린 25 mg) 2개에 식균하였다. 식균 후에 아라비노스를 최종 농도 0.5 mg/ml가 되도록 첨가하여, 37℃, 130 rpm의 조건에서 대수증식기까지 배양하고, 그 후 15℃로 냉각하였다. 냉각 후에 IPTG를 최종 농도 1.0 mM이 되도록 첨가하여, 130 rpm, 15℃의 조건에서 24시간 배양하여 발현유도하였다. 그 후, 균체를 원심분리에 의해 수집하여, 3.3 g의 습균체를 얻었다. 습균체 3.3. g을 13.16 ml의 바인딩 버퍼 [50 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 100 mM 염화나트 륨, 1 mM 염화마그네슘, 프로테아제 인히비터 (컴플리트 (Complete), EDTA 프리, Boehringer Mannheim 제)]에 재현탁하였다. 초음파 파쇄에 의해 균체를 파쇄하여, 원심분리 (12,000 rpm, 20분)에 의해 상청 추출액과 침전으로 분리하였다.

상기 상청 추출액 약 13 ml를 사용하여 추가로 니켈 컬럼에 의한 정제를 이하와 같이 행하였다.

즉, 수지 용적으로 하여 10 ml 분의 Ni-NTA 아가로스 (Qiagen 제)를

50 mm의 컬럼에 충전하여 증류수 30 ml로 세정하였다. 그 후, 바인딩 버퍼 100 ml로 세정하여, 수지를 회수하였다. 상기 균체 파쇄액으로부터 조제한 약 13 ml의 상청액을 첨가하여, 4℃에서 약 1시간 로터리 셰이커로 서서히 혼합하였다. 그 후, 이 목적 단백질이 흡착한 수지를

50 mm의 컬럼에 충전하여, 50 ml의 바이딩 버퍼로 2회 세정하였다. 다음에, 50 ml의 버퍼 A [20 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 10 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸]로 수지를 세정한 후, 50 ml의 버퍼 B [20 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 800 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸], 이어서 50 ml의 버퍼 A로 세정을 행하여 목적 이외의 불필요한 단백질의 제거를 행하였다.

세정 후, 30 ml의 버퍼 C [20 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 100 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 10% 글리세롤, 100 mM 이미다졸]로 용출조작을 행하였다. 용출 샘플에 관해서 센트리콘 (Centricon) YM-10 (Amicon 제)을 사용하여 농축을 행하고, 10 ml의 버퍼 D [50 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 250 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 0.1 mM DTT, 0.1% 트리톤 (Triton) X-100, 10% 글리세 롤]를 가해 농축을 행하였다. 이 조작을 2회 반복하였다. 다음에, 500 ml의 버퍼 E [50 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 250 mM 염화나트륨, 1 mM 염화마그네슘, 0.1 mM DTT, 0.1% 트리톤 X-100, 50% 글리세롤]에 대하여 투석을 행하여, 약 220 ㎕의 단백질 샘플을 얻었다. 이의 일부에 대하여 10% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동을 행한 바, 분자량 약 144,000의 위치에 목적 단백질의 밴드가 확인되어, 이것을 이하의 활성 확인에 사용하였다.

(5) dsRNA 분해 활성의 측정

(4)에서 조제한 단백질 샘플에 대하여, dsRNA 분해 활성을 측정하였다. 활성 측정은 이하와 같이 하여 행하였다.

우선, 활성 측정에 사용한 기질이 되는 dsRNA를 터보스크립트 (TurboScript) T7 트랜스크립션 (Transcription) 키트 (GTS 제)을 이용하여, 이의 첨부 프로토콜에 따라 합성하였다.

즉, 플라스미드 pQBI1125 (Wako Pure Chemical Industries 제)에 삽입되어 있는 레드-시프트 그린 플루어레슨트 단백질 (red-shift green fluorescent protein; 이하, GFP로 약칭한다)을 코드하는 유전자 (서열표의 서열번호 10에 이의 염기서열을 나타낸다)를 플라스미드 pDON-AI (Takara Bio 제)에 삽입한 pDON-rsGFP를 주형으로 하고, 서열표의 서열번호 11에 기재된 T7 프로모터 서열을 가진 합성 프라이머 3과 서열표의 서열번호 12에 기재된 합성 프라이머 4를 이용하여 PCR을 행하여, 증폭산물을 얻었다. 다음에, 얻어진 2본쇄 DNA를 주형으로 하여, T7 RNA 폴리메라아제에 의한 RNA 합성반응에 의해 약 700 bp의 길이의 dsRNA를 조제하였 다. 상기 방법으로 조제한 dsRNA 1 ㎍, 상기 (3)에서 조제한 단백질 샘플 1 ㎕, 5 × 반응 완충액 (100 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 750 mM 염화나트륨, 12.5 mM 염화마그네슘) 2 ㎕, 이것에 뉴클레아제를 함유하지 않는 물을 가해, 전체량을 10 ㎕로 한 것을 반응액으로 하였다. 37℃에서 18 시간 반응 후, 반응액의 10 ㎕를 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜서, 영동 후의 겔을 에티듐브로마이드로 염색하여 절단산물의 확인을 행하였다. 그 결과, 약 21 염기쌍의 분해산물이 확인되고, dsRNA 분해활성이 확인되었다.

이상과 같이, 본 발명의 방법에 의해 dsRNA 분해활성을 보유한 단백질이 발현되는 것이 나타났다.

실시예 2: RTaseα 및 RTaseβ의 발현 검토

하기 조작에 의해, 목적 단백질 단독에서의 발현, 목적 단백질과 트리거 팩터의 공발현, 목적 단백과 트리거 팩터의 융합 단백질의 발현의 비교를 행하였다. 또한, 융합 단백질의 발현에 관해서는 발현계로서, 콜드 쇼크 벡터를 사용하는 계 (콜드 쇼크 발현계), T7 프로모터와 T7 RNA 폴리메라아제를 조합시킨 발현계 (T7 프로모터 발현계)의 두가지를 사용하였다.

(1) 플라스미드 벡터의 구축

대장균 유래의 트리거 팩터 유전자 서열 (유전자 은행 수탁번호 NC_000913, 454357번째∼455655번째)로부터, 서열표의 서열번호 13 및 14에 기재된 염기서열을 갖는 합성 프라이머 TFN 및 TFCP를 DNA 합성기로 합성하여 통상법으로 정제하였다.

상기 합성 프라이머 TFN은 대장균 유래 트리거 팩터의 아미노산 서열의 N 말 단으로부터 1∼9번째의 아미노산을 코드하는 염기서열을 갖고, 또한 염기번호 4∼9에 제한효소 NdeI의 인식서열을 갖는 합성 DNA이다. 또한, 합성 프라이머 TFCP는 대장균 유래 트리거 팩터의 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1∼9번째의 아미노산을 코드하는 염기서열에 상보적인 염기서열, 프로테아제 팩터 Xa의 인식서열을 코드하는 염기서열에 상보적인 염기서열, 제한효소 EcoRI의 인식서열, 제한효소 BamHI의 인식서열, 및 제한효소 HindIII의 인식서열을 갖는 합성 DNA이다. 다음에, 대장균 HB101 (Takara Bio 제)으로부터, PCR의 주형이 되는 게놈 DNA를 추출하였다.

그 후, 상기 합성 프라이머 및 게놈 DNA를 사용하여, PCR을 행하였다. PCR 반응조건을 이하에 나타낸다. 즉, 상기에서 조제한 주형 DNA 1 ㎕, 10 ㎕의 10 × 파이로베스트 (Pyrobest) 버퍼 II (Takara Bio 제), 8 ㎕의 dNTP 혼합액 (Takara Bio 제), 100 pmol의 합성 프라이머 TFN, 100 pmol의 합성 프라이머 TFCP, 2.5 U의 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio 제)를 가하고, 멸균수를 가해 전체량을 100 ㎕로 하였다. 상기 반응액을 PCR 더멀 사이클러 SP (Takara Bio 제)에 세트하여, 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하는 30 사이클의 반응을 행하였다.

반응종료 후, 이 반응액 100 ㎕를 1% 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 확인된 목적의 약 1.5 kbp의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, 에탄올 침전을 행하였다. 에탄올 침전 후의 회수 DNA를 15 ㎕의 멸균수에 현탁시키고, 제한효소 NdeI (Takara Bio 제) 및 제한효소 HindIII (Takara Bio 제)로 이중 소화하 고, 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 이의 NdeI-HindIII 소화물을 추출정제하여, NdeI-HindIII 소화 DNA 단편을 얻었다.

다음에, 플라스미드 벡터 pColdII (Takara Bio 제)를 제한효소 NdeI, HindIII로 이중 소화하고, 또한 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, 상기 NdeI-HindIII 소화 DNA 단편과 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 목적 DNA 단편이 삽입된 플라스미드는 시퀀싱에 의해 확인되었다. 계속해서, 얻어진 플라스미드의 트리거 팩터 유전자 서열 중의 제한효소 EcoRI 인식서열 (유전자 은행 수탁번호 NC_000913, 455107번째∼455112번째)을 소실시키기 위해, 이 부위에 사일런트 변이를 도입하였다. 이렇게 하여 얻어진 콜드 쇼크 발현계를 가지며, 대장균 유래 트리거 팩터 유전자 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 pColdTF로 명명하였다.

또한, T7 프로모터 발현계에 의해 목적 단백질과 대장균 유래 트리거 팩터와의 융합 단백질을 발현시키기 위한 플라스미드 벡터에 관해서도 이하와 같이 제작하였다.

우선, pColdTF를 제한효소 EcoRI (Takara Bio 제) 및 제한효소 EcoO109I (Takara Bio 제)로 이중 소화하고, 또한 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, EcoRI-EcoO109I 소화 DNA 단편을 얻었다. 다음에, pCold08NC2를 제한효소 EcoRI 및 제한효소 EcoO109I로 이중 소화하여, 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 이의 EcoRI-EcoO109I 소화물을 추출정제하고, 상기 EcoRI-EcoO109I 소화 DNA 단편과 혼합하여, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 이용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 pColdTF의 멀티플 클로닝 사이트를 개변한 재조합 플라스미드를 pColdTF-II로 명명하였다.

또한, pColdTF-II를 제한효소 XbaI (Takara Bio 제)로 소화하여, T4 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio 제)에 의해 평활 말단화한 후, 제한효소 NdeI로 소화하여, 대장균 유래 트리거 팩터 유전자를 포함하는 NdeI-평활 말단 단편을 얻었다.

다음에, 플라스미드 벡터 pET16b (Novagen 제)를 제한효소 BamHI (Takara Bio 제)로 소화하여, T4 DNA 폴리메라아제로 평활 말단화하였다. 또한, 제한효소 NdeI로 소화 후, 말단을 탈인산처리한 것을 조제하고, 상기 대장균 유래 트리거 팩터 유전자를 포함하는 NdeI-평활 말단 DNA 단편과 혼합하여, DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 T7 프로모터 발현계를 갖고, 대장균 유래 트리거 팩터 유전자 서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 pETTF로 명명하였다.

(2) RTaseα 및 RTaseβ 발현 벡터의 구축

라우스 관련 바이러스 2 (RAV-2) 유래의 역전사 효소 α 서브유닛 (이하, RAV-2 RTaseα)의 아미노산 서열 (유전자 은행 수탁번호 BAA22090 중, N 말단으로부터 1∼572번째의 아미노산)을 동시에, 코드되는 아미노산 서열을 변화시키고 않고 대장균의 코돈 사용 빈도에 따라 염기서열을 변경하고, 또한 제한효소 EcoRI의 인식서열 및 제한효소 XbaI의 인식서열을 각각 상기 서열의 양단에 갖도록 설계한 서열 (서열표의 서열번호 15)을 가진 2본쇄 DNA를 합성하였다.

또한, 라우스 관련 바이러스 2 (RAV-2) 유래의 역전사 효소 β 서브유닛 (이하, RAV-2 RTaseβ)의 아미노산 서열 (유전자 은행 수탁번호 BAA22090)을 동시에, 코드되는 아미노산 서열을 변화시키고 않고 대장균의 코돈 사용 빈도에 따라 염기서열을 변경하고, 또한 제한효소 EcoRI의 인식서열 및 제한효소 XbaI의 인식서열을 각각 상기 서열의 양단에 갖도록 설계한 서열 (서열표의 서열번호 16)을 가진 2본쇄 DNA를 합성하였다.

다음에, 제한효소 EcoRI (Takara Bio 제) 및 XbaI (Takara Bio 제)를 사용하여, 상기 2종류의 합성 2본쇄 DNA를 각각 이중 소화하고, 1% 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 확인된 목적의 사이즈의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, RAV-2 RTaseα를 코드하는 유전자를 포함하는 EcoRI-XbaI 소화 DNA 단편, 및 RAV-2 RTaseβ를 코드하는 유전자를 포함하는 EcoRI-XbaI 소화 DNA 단편을 얻었다.

계속해서, (1)에서 조제한 pColdTF를 제한효소 EcoRI, XbaI로 이중 소화하고, 또한 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, 상기 2종류의 EcoRI-XbaI 소화 DNA 단편과 각각 혼합한 후, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 이들 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseα의 융합 단백질, 및 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseβ의 융합 단백질을 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 플라스미드를 각각 pColdTF-α, pColdTF-β로 명명하였다.

또한, RAV-2 RTaseα를 단독으로 발현하는 플라스미드 및 RAV-2 RTaseβ를 단독으로 발현하는 플라스미드에 대하여, pColdTF 대신에 실시예 1에서 구축한 pCold08Nc2를 사용하는 점 이외에는 각각 pColdTF-α, pColdTF-β와 동일한 방법으로 조제하였다. 조제한 플라스미드는 각각 pCold08-α, pCold08-β로 명명하였다.

한편, 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseα의 융합 단백질, 및 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseβ의 융합 단백질을 T7 프로모터 발현계에서 발현하는 플라스미드에 관해서는 이하와 같이 제작하였다.

상기 pColdTF-α 및 pCold08-β를 제한효소 XbaI (Takara Bio 제)로 소화하여, T4 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio 제)로 평활 말단화하였다. 또한, 제한효소 EcoRI로 소화하여, 1% 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 확인된 목적의 사이즈의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, RAV-2 RTaseα를 코드하는 유전자를 포함하는 EcoRI-평활 말단 DNA 단편, 및 RAV-2 RTaseβ를 코드하는 유전자를 포함하는 EcoRI-평활 말단 DNA 단편을 얻었다.

다음에, (1)에서 조제한 pETTF를 제한효소 SalI로 소화하여, T4 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio 제)로 평활 말단화하였다. 또한, 제한효소 EcoRI로 소화한 후, 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, 상기 2종류의 EcoRI-평활 말단 DNA 단편 과 혼합하고, DNA 라이게이션 키트를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 이들 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseα의 융합 단백질, 및 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseβ의 융합 단백질을 T7 프로모터 발현계에서 발현하는 플라스미드를 각각 pETTF-α, pETTF-β로 명명하였다.

(3) 형질전환체의 조제

트리거 팩터와 RAV-2 RTaseα의 융합 단백질을 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 pColdTF-α를 사용하여, 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법에 의해 행하였다. 형질전환체는 암피실린을 100 ㎍/ml의 농도를 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

또한, 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseβ의 융합 단백질을 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 pColdTF-β로 대장균 BL21을 형질전환한 형질전환체도 동일한 방법으로 조제하였다.

상기 융합 발현계의 비교예로서, RAV-2 RTaseα, RAV-2 RTaseβ를 단독 발현계에서 발현하는 형질전환체, RAV-2 RTaseα와 트리거 팩터의 공발현계에서 발현하는 형질전환체, RAV-2 RTaseβ와 트리거 팩터의 공발현계에서 발현하는 형질전환체, 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseα의 융합 단백질을 T7 모로모터 발현계에서 발현하는 형질전환체, 및 트리거 팩터와 RAV-2 RTaseβ의 융합 단백질을 T7 모로모터 발현계에서 발현하는 형질전환체에 관해서도 조제하였다.

단독 발현계에서 발현하는 형질전환체는 플라스미드 pCold08-α 및 pCold08-β를 사용하여 BL21을 형질전환하는 점 이외에는 상기 융합 단백질을 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 형질전환체의 제조방법과 동일한 방법으로 얻었다.

공발현계에서 발현하는 형질전환체의 조제는 이하의 방법에 의해 행하였다. 우선, 플라스미드 pCold08-α 및 pCold08-β의 각각과 플라스미드 pTf16를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법에 의해 행하였다. 다음에, pCold08-α 및 pCold08-β의 각각과 플라스미드 pTf16를 보유하는 공형질전환체는 클로람페니콜 및 암피실린을 각각 100 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

융합 단백질을 T7 프로모터 발현계에서 발현하는 형질전환체는 플라스미드 pETTF-α 및 pETTF-β를 이용하는 점, 및 BL21 (DE3; Novagen 제)을 형질전환하는 점 이외에는 상기 융합 단백질을 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 형질전환체의 조제방법과 동일한 방법으로 얻었다.

(4) RTaseα 및 RTaseβ의 발현

(3)에서 얻어진 각 형질전환체를 사용하여, RTaseα 및 RTaseβ의 발현을 조사하였다. 콜드 쇼크 발현계에서 발현하는 융합 단백질을 발현하는 형질전환체, 및 단독 발현계의 형질전환체의 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린을 포함한다)를 이용하였다. 또한, 공발현계의 형질전환체의 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린, 20 ㎍/ml 클로람페니콜, 0.5 mg/ml 아라비노스를 포함한다)를 사용하였다. 각각의 형질전환체는 37℃에서 배양하여, 탁도가 OD600 = 0.4 정도에 도달한 시점에서 15℃, 15분간 배양 후, 배양액에 최종 농도 1 mM의 IPTG를 가하고, 또한 15℃에서 24시간 배양을 행함으로써 발현을 유도하였다. 발현유도를 24시간 행한 후, 균체를 회수하였다.

또한, T7 프로모터 발현계에서 융합 단백질을 발현하는 형질전환체의 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린을 포함한다)를 사용하고, 형질전환체는 37℃에서 배양한 후, 탁도가 D600 = 0.4 정도에 도달한 시점에서 배양액에 최종 농도 1 mM의 IPTG를 가하고, 또한 37℃에서 3시간 배양을 행함으로써 발현을 유도하였다. 발현유도를 3시간 행한 후, 균체를 회수하였다.

상기에 의해 얻어진 각 균체를 PBS에 현탁, 초음파 파쇄하여, 세포 추출액 분획을 조제하고, 이어서 15,000 × g의 원심분리에 의해 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 각각의 분획에 대해서는 약 3.75 × 10⁶개의 균체분을 SDS-PAGE를 행하였다. CBB 염색에 의해 해석한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, pCold08-α 및 pCold08-β로 목적 단백질을 단독 발현시킨 경우 (A), 및 pCold08-α와 pTFf16 또는 pCold08-β와 pTFf16을 사용하여 목적 단백질과 트리거 팩터를 공발현시킨 경우 (B)에는, 세포 추출액 분획에 RAV-2 RTaseα, RAV-2 RTaseβ 각각의 분자량 63000 Da, 98000 Da에 대응하는 발현산물이 확인되었지만, 가용성 분획에는 거의 검출되지 않았다. 또한, pETTF-α 및 pETTF-β를 이용하여 목적 단백질과 트리거 팩터의 융합 단백질을 T7 프로모터 발현계에서 발현한 경우 (C)에는, 세포 추출액 분획에 검출된 목적 단백질의 대부분이 불용성 분획에 검출되었다. 한편, pColdTF-α 또는 pColdTF-β를 이용하여 목적 단백 질과 트리거 팩터를 융합발현한 경우 (D)에는, 세포 추출액 분획에 검출된 목적 단백질의 대부분이 가용성 분획에 검출될 수 있었다.

실시예 3: DNase의 발현

(1) DNase 발현 벡터의 구축

DNase를 단독으로 발현하는 플라스미드로서, pCold-End1 (FERM BP-10313) (2005년 2월 16일 (원기탁일)에 일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566), 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 기탁)을 사용하였다. 이 플라스미드는 254 아미노산 잔기로 이루어지는 DNase를 코드하는 염기서열을 포함하고, 이 DNase에는 His-Tag, 팩터 Xa 인식서열, 및 링커 서열이 부가된 271 아미노산 잔기의 융합 단백질이 발현되도록 구축되어 있다.

다음에, 트리거 팩터와 DNase의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축을 이하와 같이 행하였다.

우선, 상기 pCold08-End1의 염기서열로부터, 서열표의 서열번호 17 및 18에 기재된 염기서열을 갖는 합성 프라이머 NUCN 및 NUCC를 DNA 합성기로 합성하여, 통상법에 의해 정제하였다. 합성 프라이머 NUCN은 DNase의 N 말단으로부터 1∼7번째의 아미노산을 코드하는 염기서열을 갖고, 또한 염기번호 4∼9에 제한효소 EcoRI의 인식서열을 갖는 합성 DNA이다. 또한, 합성 프라이머 NUCC는 DNase의 N 말단으로부터 247∼254번째의 아미노산을 코드하는 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖고, 또한 염기번호 4∼9에 제한효소 BamHI의 인식서열을 갖는 합성 DNA이다.

다음에, 상기 합성 프라이머를 이용하여, PCR을 행하였다. PCR 반응조건을 이하에 나타낸다. 즉, 주형 DNA (pCold08-End1) 1 ㎕, 10 ㎕의 10 × 파이로베스트 버퍼 II (Takara Bio 제), 8 ㎕의 dNTP 혼합액 (Takara Bio 제), 100 pmol의 합성 프라이머 NUCN, 100 pmol의 합성 프라이머 NUCC, 2.5 U의 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio 제)를 가하고, 멸균수를 가해 전체량을 100 ㎕로 하였다. 상기 반응액을 PCR 더멀 사이클러 SP (Takara Bio 제)에 세트하여, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하는 30 사이클 반응을 행하였다.

반응종료 후, 이 반응액 100 ㎕를 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 확인된 목적의 약 0.8 kbp의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, 에탄올 침전을 행하였다. 에탄올 침전 후의 회수 DNA를 15 ㎕의 멸균수에 현탁하여, 제한효소 EcoRI (Takara Bio 제) 및 제한효소 BamHI (Takara Bio 제)로 이중 소화하고, 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 이의 EcoRI-BamHI 소화물을 추출정제하여, EcoRI-BamHI 소화 DNA 단편을 얻었다.

다음에, 실시예 2(2)에서 조제한 pColdTF를 제한효소 EcoRI, BamHI로 이중 소화하고, 또한 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, 상기 2종류의 EcoRI-BamHI 소화 DNA 단편과 각각 혼합한 후, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 100 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다. 목적 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 조제하였다. 트리거 팩터와 DNase의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 pColdTF-End1로 명명하였다.

(2) 형질전환체의 조제

트리거 팩터와 DNase의 융합 단백질을 발현하는 pColdTF-End1을 사용하여, 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법에 의해 행하였다. 형질전환체는 암피실린을 100 ㎍/ml의 농도를 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

상기 융합 발현계의 비교예로서, DNase를 단독 발현계에서 발현하는 형질전환체, DNase와 트리거 팩터의 공발현계에서 발현하는 형질전환체에 관해서도 조제하였다.

단독 발현계에서 발현하는 형질전환체는 플라스미드 pCold08-Endl을 사용하여 BL21을 형질전환하는 점 이외에는 상기 형질전환체의 제조방법과 동일한 방법으로 얻었다.

공발현계에서 발현하는 형질전환체의 조제는 이하의 방법에 의해 행하였다. 우선, 플라스미드 pCold08-End1과 플라스미드 pTf16를 사용하여 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법에 의해 행하였다. 다음에, pCold08-End1과 플라스미드 pTf16를 보유하는 공형질전환체는 클로람페니콜 및 암피실린을 각각 100 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

(3) DNase의 발현

(2)에서 얻어진 각 형질전환체를 사용하여, DNase의 발현을 조사하였다. 융 합 발현계 및 단독 발현계의 형질전환체의 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린을 포함한다)를 이용하였다. 또한, 공발현계의 형질전환체의 배양에는 5 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린, 20 ㎍/ml 클로람페니콜, 0.5 mg/ml 아라비노스를 포함한다)를 사용하였다. 각각의 형질전환체는 37℃에서 배양하여, 탁도가 OD600 = 0.8 정도에 도달한 시점에서 15℃, 15분간 배양 후, 배양액에 최종 농도 1 mM의 IPTG를 가하고, 또한 15℃에서 24시간 배양을 행함으로써 발현을 유도하였다. 발현유도를 24시간 행한 후, 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 PBS에 현탁, 초음파 파쇄하여, 세포 추출액 분획을 조제, 이어서 15,000 × g의 원심분리에 의해 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 각각의 분획의 0.05 OD분 (OD 600)에 대해서는 SDS-PAGE (5-20% 겔)를 행하였다. CBB 염색에 의해 해석한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, pCold08-End1을 사용하여 목적 단백질을 단독 발현시킨 경우 (A), 및 pCold08-End1과 pTFf16을 사용하여 목적 단백질과 트리거 팩터를 공발현시킨 경우 (B)에는 가용성 분획 및 불용성 분획에 발현산물인 분자량 31000 Da의 DNase에 대응하는 명확한 밴드는 CBB 염색 레벨에서는 검출되지 않았다. 한편, pColdTF-End1을 이용하여 DNase와 트리거 팩터를 융합발현한 경우 (C)에는 목적 단백질에 유래하는 밴드를 가용성 분획에서 검출할 수 있었다.

(4) DNase 활성의 측정

(3)에서 조제한 융합 발현계의 초음파 파쇄 가용성 분획에 관해서, DNase 활성을 측정하였다. 대조로서, 인서트를 도입하지 않은 pColdTF 벡터만을 사용하여 형질전환한 대장균의 초음파 파쇄 가용성 분획에 관해서도 취득하고, 동시에 활성 측정을 행하였다. 대조의 초음파 파쇄 가용성 분획은 pColdTF를 이용하는 점 이외에는 상기 (2), (3)과 동일한 방법으로 얻었다.

활성 측정에는 λ-HindIII 다이제스트 (Takara Bio 제)를 기질로서 사용하였다. λ-HindIII 다이제스트 1 ㎍, 초음파 파쇄 가용성 분획 0.025 OD분 (OD 600), 10 × 반응 완충액 (400 mM 트리스염산 완충액 (pH 7.5), 100 mM 염화나트륨, 60 mM 염화마그네슘, 10 mM 염화칼슘) 5 ㎕, 이것에 뉴클레아제를 함유하지 않는 물을 가해, 전체량을 50 ㎕로 한 것을 반응액으로 하였다. 20℃에서 2시간 반응 후, 반응액의 10 ㎕를 1% 아가로스 겔 전기영동을 행하여, 절단산물의 해석을 행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4로부터, 대조의 초음파 파쇄 가용성 분획을 이용한 경우 (레인 1)는 기질의 분해가 거의 확인될 수 없는데 대하여, DNase와 트리거 팩터의 융합 발현계의 초음파 파쇄 가용성 분획을 이용한 경우 (레인 2)는 기질이 분해되어, DNase의 활성이 확인되었다.

실시예 4: hDi-PAZ의 발현 검토

(1) 발현 벡터의 구축

사람 유래 Dicer의 PAZ 도메인 (사람 유래 Dicer의 아미노산 서열의 N 말단측으로부터 895∼1064번째)을 포함하는 폴리펩티드 (사람 유래 Dicer의 아미노산 서열의 N 말단측으로부터 892∼1064번째, 이하 PAZ로 칭하는 경우가 있다)를 발현시키기 위해, 이하와 같이 하여 발현 벡터를 구축했다.

우선, 유전자 은행 수탁번호 AB028449로 공개되어 있는 염기서열로부터, 서열표의 서열번호 19 및 20에 기재된 염기서열을 갖는 합성 프라이머 1 및 2를 DNA 합성기로 합성하여, 통상법에 의해 정제하였다. 상기 합성 프라이머 1은 제한효소 KpnI의 인식 서열을 염기번호 9∼14에, 또한 사람 유래 Dicer의 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 892∼898에 상당하는 염기서열을 염기번호 16∼36에 갖는 합성 DNA이다. 또한, 합성 프라이머 2는 제한효소 HindIII의 인식 서열을 염기번호 9∼14에, 또한 사람 유래 Dicer의 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 1058∼1064에 상당하는 염기서열을 염기번호 15∼36에 갖는다.

상기 합성 프라이머를 사용하여, PCR을 행하였다. 주형 DNA로는 실시예 1-(2)에서 조제한 pCold08/hDi-ASI를 사용하였다. PCR의 반응조건을 이하에 나타낸다.

즉, 주형 DNA 1 ng, 10 ㎕의 10 × LA PCR 버퍼 (Takara Bio 제), 8 ㎕의 dNTP 혼합액 (Takara Bio 제), 10 pmol의 합성 프라이머 5, 10 pmol의 합성 프라이머 6, 0.5 U의 다카라 Ex Taq (Takara Bio 제)를 가하고, 멸균수를 가해 전체량을 100 ㎕로 하였다. 상기 반응액을 다카라 PCR 더멀 사이클러 MP (Takara Bio 제)에 세트하여, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하는 30 사이클 반응을 행하였다.

반응종료 후, 이 반응액 95 ㎕를 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 확인된 목적의 530 bp의 DNA 단편을 전기영동 겔로부터 회수/정제하여, 에탄올 침전을 행하였다. 에탄올 침전 후의 회수 DNA를 5 ㎕의 멸균수에 현탁하여, 제한효 소 KpnI (Takara Bio 제) 및 제한효소 HindIII (Takara Bio 제)로 이중 소화하고, 1.0% 아가로스 겔 전기영동에 의해 이의 KpnI-HindIII 소화물을 추출정제하여, KpnI-HindIII 소화 DNA 단편을 얻었다.

pCold08NC2 벡터를 상기 KpnI-HindIII 소화 DNA 단편을 조제할 때에 사용한 것과 동일한 제한효소로 절단하고, 또한 말단을 탈인산처리한 것을 조제하여, 상기 KpnI-HindIII 소화 DNA 단편과 혼합하고, DNA 라이게이션 키트 (Takara Bio 제)를 사용하여 연결하였다. 그 후, 라이게이션 반응액 6 ㎕를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하여, 이의 형질전환체를 1.5% (w/v) 농도의 한천을 포함하는 LB 배지 (암피실린 50 ㎍/ml를 포함한다) 상에서 생육시켰다.

목적 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 pCold08/hDi-PAZ로 하였다. 이 pCold08/hDi-PAZ는 사람 유래 Dicer의 아미노산 서열 (서열번호 3)의 아미노산 번호 892∼1064의 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 포함하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드로부터 발현된 단백질은 퍼펙트 DB 서열, His 태그 서열 및 팩터 Xa 서열을 갖고 있다.

또한, 트리거 팩터와 PAZ의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를, 벡터로서 실시예 2-(1)에서 조제한 pColdTF-II를 사용하는 점 이외에는 상기 pCold08/hDi-PAZ의 조제방법과 동일한 방법으로 제조하여, 이 플라스미드를 pColdTF/hDi-PAZ로 명명하였다.

(2) 형질전환체의 조제

트리거 팩터와 hDi-PAZ의 융합 단백질을 발현하는 pCold/hDi-PAZ를 이용하 여, 대장균 BL21을 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법으로 행하였다. 형질전환체는 암피실린을 100 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

상기 융합발현계의 비교예로서, hDi-PAZ를 단독발현계에서 발현하는 형질전환체, hDi-PAZ와 트리거 팩터의 공발현계에서 발현하는 형질전환체에 관해서도 조제하였다.

단독 발현계에서 발현하는 형질전환체는 플라스미드 pCold08/hDi-PAZ를 사용하여 BL21을 형질전환하는 점 이외에는 상기 융합 발현계에서 발현하는 형질전환체의 제조방법과 동일한 방법으로 얻었다. 공발현계에서 발현하는 형질전환체의 조제는 이하의 방법에 의해 행하였다. 우선, 플라스미드 pCold08/hDi-PAZ와 플라스미드 pTf16를 사용하여 대장균 A19를 형질전환하였다. 또한, 형질전환은 염화칼슘법에 의해 행하였다. 다음에, pCold08/hDi-PAZ와 플라스미드 pTf16를 보유하는 공형질전환체는 클로람페니콜 및 암피실린을 각각 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 포함하는 플레이트를 사용하여 스크리닝함으로써 얻었다.

(3) hDi-ASI의 발현

(2)에서 얻어진 각 형질전환체를 사용하여, hDi-PAZ의 발현을 조사하였다. 융합 발현계 및 단독 발현계의 형질전환체의 배양에는 3 ml의 LB 액체 배지 (조성: 50 ㎍/ml 암피실린을 포함한다)를 사용하였다. 또한, 공발현계의 형질전환체의 배양에는 3 ml의 LB 액체 배지 (50 ㎍/ml 암피실린, 20 ㎍/ml 클로람페니콜, 0.5 mg/ml 아라비노스를 포함한다)를 사용하였다. 각각의 형질전환체는 37℃에서 배양 하여, 탁도가 OD600 = 0.4 정도에 도달한 시점에서 15℃, 15분간 배양 후, 배양액에 최종 농도 0.5 mM의 IPTG를 가하고, 또한 15℃에서 24시간 배양을 행함으로써 발현을 유도하였다. 발현유도를 24시간 행한 후, 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 균체 파쇄액 (50 mM 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 프로테아제 인히비터 (컴플리트 EDTA 비함유))에 현탁, 초음파 파쇄하여, 세포 추출액 분획을 조제, 이어서 15,000 × g의 원심분리에 의해 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 각각의 분획에 대해서, 약 2.5 × 10⁶개의 균체분을 SDS-PAGE를 행하였다. CBB 염색에 의해 해석하였다.

그 결과, pCold08/hDi-PAZ로 목적 단백질을 단독 발현시킨 경우, 및 pCold08/hDi-PAZ와 pTf16을 사용하여 목적 단백질과 트리거 팩터를 공발현시킨 경우에는, 세포 추출액 분획에 목적 단백질의 분자량 24000 Da에 대응하는 발현산물이 확인되었지만, 가용성 분획에는 거의 검출되지 않았다. 한편, pCold08/hDi-PAZ를 사용하여 목적 단백질과 트리거 팩터를 융합발현한 경우에는 대조와 비교하여 세포 추출액 분획의 목적 단백질량이 증가하였다. 또한, 이의 대부분을 가용성 분획에 검출할 수 있었다.

본 발명의 방법에 의해, 목적 폴리펩티드를 상당량으로 활성을 갖는 상태로, 또한 고순도로 제조할 수 있다.

서열표 전문

서열번호 2; 대장균 cpsA 유전자의 변이된 5'-UTR을 코드하는 유전자

서열번호 4; 사람 유래 dicer 변이체를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 5

서열번호 5; 사람 유래 dicer 변이체를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 6

서열번호 6; 사람 유래 dicer 변이체를 코드하는 유전자

서열번호 7; 사람 유래 dicer 변이체의 아미노산 서열

서열번호 8; 사람 유래 dicer 변이체의 아미노산 서열

서열번호 9; 사람 유래 dicer 변이체를 코드하는 유전자

서열번호 10; 레드-시프트 그린 플루어레슨트 단백질을 코드하는 유전자

서열번호 11; 레드-시프트 그린 플루어레슨트 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 3

서열번호 12; 레드-시프트 그린 플루어레슨트 단백질을 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 4

서열번호 13; 트리거 팩터를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 TFN

서열번호 14; 트리거 팩터를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 TFCP

서열번호 15; RAV-2 유래 역전사 효소 α 서브유닛을 코드하는 유전자

서열번호 16; RAV-2 유래 역전사 효소 β 서브유닛을 코드하는 유전자

서열번호 17; DNase를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 NUCN

서열번호 18; DNase를 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 NUCC

서열번호 19; 사람 유래 dicer PAZ 도메인을 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 1

서열번호 20; 사람 유래 dicer PAZ 도메인을 코드하는 유전자를 증폭하는 합성 프라이머 2

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for producing polypeptide <130> 665240 <150> JP 2004-152598 <151> 2004-05-21 <150> JP 2005-067984 <151> 2005-03-14 <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa 60 agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca 120 gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg 180 gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa 240 ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat 300 tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc 360 tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata 420 attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc 480 attaaagcag tgtagtaagg caagtccctt caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg 540 cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta 600 attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg 660 ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact 720 tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca 780 ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg taatctctgc 840 ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag 900 gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg 960 gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct 1020 tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc 1080 aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact 1140 attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttgattt cacgagtatg 1200 tactgcacc 1209 <210> 2 <211> 143 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A gene encoding mutated 5'-UTR of Escherichia coli cspA gene <400> 2 aauugugagc ggauaacaau uugaugugcu agcgcauauc caguguagua aggcaagucc 60 cuucaagagc cuuuaacgcu ucaaaaucug uaaagcacgc cauaucgccg aaaggcacac 120 uuaauuauua aagguaauac acu 143 <210> 3 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taaccaatct caaccagcca ctgctggatg tggaccacac atcttcaaga 960 cttaatcttt tgacacctcg acatttgaat cagaagggga aagcgcttcc tttaagcagt 1020 gctgagaaga ggaaagccaa atgggaaagt ctgcagaata aacagatact ggttccagaa 1080 ctctgtgcta tacatccaat tccagcatca ctgtggagaa aagctgtttg tctccccagc 1140 atactttatc gccttcactg ccttttgact gcagaggagc taagagccca gactgccagc 1200 gatgctggcg tgggagtcag atcacttcct gcggatttta gataccctaa cttagacttc 1260 gggtggaaaa aatctattga cagcaaatct ttcatctcaa tttctaactc ctcttcagct 1320 gaaaatgata attactgtaa gcacagcaca attgtccctg aaaatgctgc acatcaaggt 1380 gctaatagaa cctcctctct agaaaatcat gaccaaatgt ctgtgaactg cagaacgttg 1440 ctcagcgagt cccctggtaa gctccacgtt gaagtttcag cagatcttac agcaattaat 1500 ggtctttctt acaatcaaaa tctcgccaat ggcagttatg atttagctaa cagagacttt 1560 tgccaaggaa atcagctaaa ttactacaag caggaaatac ccgtgcaacc aactacctca 1620 tattccattc agaatttata cagttacgag aaccagcccc agcccagcga tgaatgtact 1680 ctcctgagta ataaatacct tgatggaaat gctaacaaat ctacctcaga tggaagtcct 1740 gtgatggccg taatgcctgg tacgacagac actattcaag tgctcaaggg caggatggat 1800 tctgagcaga gcccttctat tgggtactcc tcaaggactc ttggccccaa tcctggactt 1860 attcttcagg ctttgactct gtcaaacgct agtgatggat ttaacctgga gcggcttgaa 1920 atgcttggcg actccttttt aaagcatgcc atcaccacat atctattttg cacttaccct 1980 gatgcgcatg agggccgcct ttcatatatg agaagcaaaa aggtcagcaa ctgtaatctg 2040 tatcgccttg gaaaaaagaa gggactaccc agccgcatgg tggtgtcaat atttgatccc 2100 cctgtgaatt ggcttcctcc tggttatgta gtaaatcaag acaaaagcaa cacagataaa 2160 tgggaaaaag atgaaatgac aaaagactgc atgctggcga atggcaaact ggatgaggat 2220 tacgaggagg aggatgagga ggaggagagc ctgatgtgga gggctccgaa ggaagaggct 2280 gactatgaag atgatttcct ggagtatgat caggaacata tcagatttat agataatatg 2340 ttaatggggt caggagcttt tgtaaagaaa atctctcttt ctcctttttc aaccactgat 2400 tctgcatatg aatggaaaat gcccaaaaaa tcctccttag gtagtatgcc attttcatca 2460 gattttgagg attttgacta cagctcttgg gatgcaatgt gctatctgga tcctagcaaa 2520 gctgttgaag aagatgactt tgtggtgggg ttctggaatc catcagaaga aaactgtggt 2580 gttgacacgg gaaagcagtc catttcttac gacttgcaca ctgagcagtg tattgctgac 2640 aaaagcatag cggactgtgt ggaagccctg ctgggctgct atttaaccag ctgtggggag 2700 agggctgctc agcttttcct ctgttcactg gggctgaagg tgctcccggt aattaaaagg 2760 actgatcggg aaaaggccct gtgccctact cgggagaatt tcaacagcca acaaaagaac 2820 ctttcagtga gctgtgctgc tgcttctgtg gccagttcac gctcttctgt attgaaagac 2880 tcggaatatg gttgtttgaa gattccacca agatgtatgt ttgatcatcc agatgcagat 2940 aaaacactga atcaccttat atcggggttt gaaaattttg aaaagaaaat caactacaga 3000 ttcaagaata aggcttacct tctccaggct tttacacatg cctcctacca ctacaatact 3060 atcactgatt gttaccagcg cttagaattc ctgggagatg cgattttgga ctacctcata 3120 accaagcacc tttatgaaga cccgcggcag cactccccgg gggtcctgac agacctgcgg 3180 tctgccctgg tcaacaacac catctttgca tcgctggctg taaagtacga ctaccacaag 3240 tacttcaaag ctgtctctcc tgagctcttc catgtcattg atgactttgt gcagtttcag 3300 cttgagaaga atgaaatgca aggaatggat tctgagctta ggagatctga ggaggatgaa 3360 gagaaagaag aggatattga agttccaaag gccatggggg atatttttga gtcgcttgct 3420 ggtgccattt acatggatag tgggatgtca ctggagacag tctggcaggt gtactatccc 3480 atgatgcggc cactaataga aaagttttct gcaaatgtac cccgttcccc tgtgcgagaa 3540 ttgcttgaaa tggaaccaga aactgccaaa tttagcccgg ctgagagaac ttacgacggg 3600 aaggtcagag tcactgtgga agtagtagga aaggggaaat ttaaaggtgt tggtcgaagt 3660 tacaggattg ccaaatctgc agcagcaaga agagccctcc gaagcctcaa agctaatcaa 3720 cctcaggttc ccaatagcta a 3741 <210> 7 <211> 1246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of human dicer mutant <400> 7 Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys Val Arg Leu Ala Glu Arg 1 5 10 15 Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu His Lys Ile Gly Glu Leu 20 25 30 Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu Thr Val Lys Tyr Glu Glu 35 40 45 Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser Val Pro Gly Arg Pro 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Glu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln Pro Cys Tyr Leu Tyr Val 85 90 95 Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro Asp Glu Leu Asn Phe Arg 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acctaaccaa tctcaaccag ccactgctgg atgtggacca cacatcttca 1020 agacttaatc ttttgacacc tcgacatttg aatcagaagg ggaaagcgct tcctttaagc 1080 agtgctgaga agaggaaagc caaatgggaa agtctgcaga ataaacagat actggttcca 1140 gaactctgtg ctatacatcc aattccagca tcactgtgga gaaaagctgt ttgtctcccc 1200 agcatacttt atcgccttca ctgccttttg actgcagagg agctaagagc ccagactgcc 1260 agcgatgctg gcgtgggagt cagatcactt cctgcggatt ttagataccc taacttagac 1320 ttcgggtgga aaaaatctat tgacagcaaa tctttcatct caatttctaa ctcctcttca 1380 gctgaaaatg ataattactg taagcacagc acaattgtcc ctgaaaatgc tgcacatcaa 1440 ggtgctaata gaacctcctc tctagaaaat catgaccaaa tgtctgtgaa ctgcagaacg 1500 ttgctcagcg agtcccctgg taagctccac gttgaagttt cagcagatct tacagcaatt 1560 aatggtcttt cttacaatca aaatctcgcc aatggcagtt atgatttagc taacagagac 1620 ttttgccaag gaaatcagct aaattactac aagcaggaaa tacccgtgca accaactacc 1680 tcatattcca ttcagaattt atacagttac gagaaccagc cccagcccag cgatgaatgt 1740 actctcctga gtaataaata ccttgatgga aatgctaaca aatctacctc agatggaagt 1800 cctgtgatgg 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cgggaaagca gtccatttct tacgacttgc acactgagca gtgtattgct 2700 gacaaaagca tagcggactg tgtggaagcc ctgctgggct gctatttaac cagctgtggg 2760 gagagggctg ctcagctttt cctctgttca ctggggctga aggtgctccc ggtaattaaa 2820 aggactgatc gggaaaaggc cctgtgccct actcgggaga atttcaacag ccaacaaaag 2880 aacctttcag tgagctgtgc tgctgcttct gtggccagtt cacgctcttc tgtattgaaa 2940 gactcggaat atggttgttt gaagattcca ccaagatgta tgtttgatca tccagatgca 3000 gataaaacac tgaatcacct tatatcgggg tttgaaaatt ttgaaaagaa aatcaactac 3060 agattcaaga ataaggctta ccttctccag gcttttacac atgcctccta ccactacaat 3120 actatcactg attgttacca gcgcttagaa ttcctgggag atgcgatttt ggactacctc 3180 ataaccaagc acctttatga agacccgcgg cagcactccc cgggggtcct gacagacctg 3240 cggtctgccc tggtcaacaa caccatcttt gcatcgctgg ctgtaaagta cgactaccac 3300 aagtacttca aagctgtctc tcctgagctc ttccatgtca ttgatgactt tgtgcagttt 3360 cagcttgaga agaatgaaat gcaaggaatg gattctgagc ttaggagatc tgaggaggat 3420 gaagagaaag aagaggatat tgaagttcca aaggccatgg gggatatttt tgagtcgctt 3480 gctggtgcca 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aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer 3 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein <400> 11 gggtaatacg actcactata gggagaatgg ctagcaaagg ag 42 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer 4 to amplify a gene encoding red-shift green fluorescent protein <400> 12 gggtaatacg actcactata gggagatcag ttgtacagtt ca 42 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer TFN to amplify a gene encoding Trigger Factor <400> 13 ggccatatgc aagtttcagt tgaaaccact c 31 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer TFCP to amplify a gene encoding Trigger Factor <400> 14 gcaagcttgg atccgaattc tccctacctt cgatcgcctg ctggttcatc agctcgttga 60 <210> 15 <211> 1732 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A gene encoding RAV-2 reverse transcriptase alpha subunit <400> 15 gaattcgacc gttgctctgc acctggctat cccgctgaaa tggaaaccgg accacacccc 60 ggtttggatc gaccagtggc cgctgccgga aggtaaactg gttgctgtta cccagctggt 120 tgaaaaagaa ctgcagctgg gtcacatcga accgtctctg tcttgctgga acaccccggt 180 gttcgttatc cgtaaagctt ctggttctta ccgtctgctg cacgacctgc gtgctgttaa 240 cgctaaactg gttccgttcg gtgctgttca gcagggtgct ccggttctgt ctgctctgcc 300 gcgtggttgg ccgctgatgg ttctggacct gaaagactgc ttcttctcta tcccgctggc 360 tgaacaggac cgtgaagctt tcgctttcac cctgccgtct gttaacaacc aggctccggc 420 tcgtcgtttc cagtggaaag ttctgccgca gggtatgacc tgctctccga ccatctgcca 480 gctggttgtt ggtcaggttc tggaaccgct gcgtctgaaa cacccggctc tgcgtatgct 540 gcactacatg gacgacctgc tgctggctgc ttcttctcac gacggtctgg aagctgctgg 600 taaagaagtt atcggtaccc tggaacgtgc tggtttcacc atctctccgg acaaaatcca 660 gcgtgaaccg ggtgttcagt acctgggtta caaactgggt tctacctacg ttgctccggt 720 tggtctggtt gctgaaccgc gtatcgctac cctgtgggac gttcagaaac tggttggttc 780 tctgcagtgg ctgcgtccgg ctctgggtat cccgccgcgt ctgatgggtc cgttctacga 840 acagctgcgt ggttctgacc cgaacgaagc tcgtgaatgg aacctggaca tgaaaatggc 900 ttggcgtgaa atcgttcagc tgtctaccac cgctgctctg gaacgttggg acccggctca 960 gccgctggaa ggtgctgttg ctcgttgcga acagggtgct atcggtgttc tgggtcaggg 1020 tctgtctacc cacccgcgtc cgtgcctgtg gctgttctct acccagccga ccaaggcttt 1080 caccgcttgg ctggaagttc tgaccctgct gatcaccaaa ctgcgtgctt ctgctgttcg 1140 taccttcggt aaagaagttg acatcctgct gctgccggct tgcttccgtg aagacctgcc 1200 gctgccggaa ggtatcctgc tggctctgcg tggtttcgct ggtaaaatcc gttcttctga 1260 caccccgtct atcttcgaca tcgctcgtcc gctgcacgtt tctctgaaag ttcgtgttac 1320 cgaccacccg gttccgggtc cgaccgtttt caccgacgct tcttcttcta cccacaaagg 1380 tgttgttgtt tggcgtgaag gtccgcgttg ggaaatcaaa gaaatcgttg acctgggtgc 1440 ttctgttcag cagctagaag ctcgtgctgt tgctatggct ctgctgctgt ggccgaccac 1500 cccgaccaac gttgttaccg actctgcttt cgttgctaaa atgctgctga aaatgggtca 1560 ggaaggtgtt ccgtctaccg ctgctgcttt catcctggaa gacgctctgt ctcagcgttc 1620 tgctatggct gctgttctgc acgttcgttc tcactctgaa gttccgggtt tcttcaccga 1680 aggtaacgac gttgctgact ctcaggctac cttccaggct tactaatcta ga 1732 <210> 16 <211> 2709 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> A gene encoding RAV-2 reverse transcriptase beta subunit <400> 16 gaattcgacc gttgctctgc acctggctat cccgctgaaa tggaaaccgg accacacccc 60 ggtttggatc gaccagtggc cgctgccgga aggtaaactg gttgctgtta cccagctggt 120 tgaaaaagaa ctgcagctgg gtcacatcga accgtctctg tcttgctgga acaccccggt 180 gttcgttatc cgtaaagctt ctggttctta ccgtctgctg cacgacctgc gtgctgttaa 240 cgctaaactg gttccgttcg gtgctgttca gcagggtgct ccggttctgt ctgctctgcc 300 gcgtggttgg ccgctgatgg ttctggacct gaaagactgc ttcttctcta tcccgctggc 360 tgaacaggac cgtgaagctt tcgctttcac cctgccgtct gttaacaacc aggctccggc 420 tcgtcgtttc cagtggaaag ttctgccgca gggtatgacc tgctctccga ccatctgcca 480 gctggttgtt ggtcaggttc tggaaccgct gcgtctgaaa cacccggctc tgcgtatgct 540 gcactacatg gacgacctgc tgctggctgc ttcttctcac gacggtctgg aagctgctgg 600 taaagaagtt atcggtaccc tggaacgtgc tggtttcacc atctctccgg acaaaatcca 660 gcgtgaaccg ggtgttcagt acctgggtta caaactgggt tctacctacg ttgctccggt 720 tggtctggtt gctgaaccgc gtatcgctac cctgtgggac gttcagaaac tggttggttc 780 tctgcagtgg ctgcgtccgg ctctgggtat cccgccgcgt ctgatgggtc cgttctacga 840 acagctgcgt ggttctgacc cgaacgaagc tcgtgaatgg aacctggaca tgaaaatggc 900 ttggcgtgaa atcgttcagc tgtctaccac cgctgctctg gaacgttggg acccggctca 960 gccgctggaa ggtgctgttg ctcgttgcga acagggtgct atcggtgttc tgggtcaggg 1020 tctgtctacc cacccgcgtc cgtgcctgtg gctgttctct acccagccga ccaaggcttt 1080 caccgcttgg ctggaagttc tgaccctgct gatcaccaaa ctgcgtgctt ctgctgttcg 1140 taccttcggt aaagaagttg acatcctgct gctgccggct tgcttccgtg aagacctgcc 1200 gctgccggaa ggtatcctgc tggctctgcg tggtttcgct ggtaaaatcc gttcttctga 1260 caccccgtct atcttcgaca tcgctcgtcc gctgcacgtt tctctgaaag ttcgtgttac 1320 cgaccacccg gttccgggtc cgaccgtttt caccgacgct tcttcttcta cccacaaagg 1380 tgttgttgtt tggcgtgaag gtccgcgttg ggaaatcaaa gaaatcgttg acctgggtgc 1440 ttctgttcag cagctagaag ctcgtgctgt tgctatggct ctgctgctgt ggccgaccac 1500 cccgaccaac gttgttaccg actctgcttt cgttgctaaa atgctgctga aaatgggtca 1560 ggaaggtgtt ccgtctaccg ctgctgcttt catcctggaa gacgctctgt ctcagcgttc 1620 tgctatggct gctgttctgc acgttcgttc tcactctgaa gttccgggtt tcttcaccga 1680 aggtaacgac gttgctgact ctcaggctac cttccaggct tacccgctgc gtgaagctaa 1740 agacctgcac accgctctgc acatcggtcc gcgtgctctg tctaaagctt gcaacatctc 1800 tatgcagcag gctcgtgaag ttgttcagac ctgcccgcac tgcaactctg ctccggctct 1860 ggaagctggt gttaacccgc gtggtctggg tccgctgcag atctggcaga ccgacttcac 1920 cctggaaccg cgtatggctc cgcgttcttg gctggctgtt accgttgaca ccgcttcttc 1980 tgctatcgtt gttacccagc acggtcgtgt tacctctgtt gctgctcagc accactgggc 2040 taccgctatc gctgttctgg gtcgtccgaa agctatcaaa accgacaacg gttcttgctt 2100 cacctctaaa tctacccgtg aatggctggc tcgttggggt atcgctcaca ccaccggtat 2160 cccgggtaac tctcagggtc aggctatggt tgaacgtgct aaccgtctgc tgaaagacaa 2220 aatccgtgtt ctggctgaag gtgacggttt catgaaacgt atcccggctt ctaaacaggg 2280 tgaactgctg gctaaagcta tgtacgctct gaaccacttc gaacgtggtg aaaacaccaa 2340 aaccccggtt cagaaacact ggcgtccgac cgttctgacc gaaggtccgc cggttaaaat 2400 ccgtatcgaa accggtgaat gggaaaaagg ttggaacgtt ctggtttggg gtcgtggtta 2460 cgctgctgtt aaaaaccgtg acaccgacaa agttatctgg gttccgtctc gtaaagttaa 2520 accggacatc acccagaaag acgaagttac caaaaaagac gaagcttctc cgctgttcgc 2580 tggttcttct gactggatcc cgtggggtga cgaacaggaa ggtctgcagg aagaagctgc 2640 ttctaacaaa caggaaggtc cgggtgaaga caccctggct gctaacgaat cttgaattag 2700 ctttctaga 2709 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer NUCN to amplify a gene encoding DNase <400> 17 ggcgaattcg atgtttttgt taattttagg g 31 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer NUCC to amplify a gene encoding DNase <400> 18 gcgggatcct taacgaacta agccgttatt ttggc 35 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer 1 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain <400> 19 tcgagctcgg tacccattga ctttaaattc atggaa 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer 2 to amplify a gene encoding human dicer PAZ domain <400> 20 tatctagaaa gcttaaaggc agtgaaggcg ataaag 36

Claims (18)

1. 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 도입된 숙주를 저온 조건에 둠으로써 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서, 상기 숙주에서 추가로 샤페론을 코드하는 유전자의 발현을 증강하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 샤페론을 코드하는 유전자의 발현의 증강이 숙주 샤페론 유전자의 발현의 유도, 숙주 염색체 상의 샤페론 유전체의 개변, 숙주로의 샤페론 유전자의 도입, 및 샤페론 유전자의 발현이 증강된 숙주의 사용 중에서 선택되는 폴리펩티드의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 샤페론이 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 폴리펩티드의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA의 하류에 접속되어 숙주에 도입되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
5. 제 4 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 대장균 cspA 유 전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA의 하류에 접속되어 숙주에 도입되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
6. 제 1 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와 샤페론을 코드하는 유전자가 벡터에 의해 숙주에 도입되는 폴리펩티드의 제조방법.
7. 제 6 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와 샤페론을 코드하는 유전자가 원하는 폴리펩티드와 샤페론의 융합 단백질을 코드하도록 접속되는 폴리펩티드의 제조방법.
8. 제 7 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드가 RAV-2 유래 역전사 효소 α 서브유닛, RAV-2 유래 역전사 효소 β 서브유닛, DNase, 및 사람 유래 Dicer PAZ 도메인 폴리펩티드 중에서 선택되는 폴리펩티드의 제조방법.
9. 제 1 항에 있어서, 숙주가 대장균인 폴리펩티드의 제조방법.
10. 원하는 폴리펩티드의 제조에 사용되는 플라스미드 벡터의 세트로서,

    (1) 프로모터의 하류에

    (a) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA 및

    (b) 상기 (a)의 DNA의 하류에 위치하는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 갖는 제 1 벡터; 및

    (2) 샤페론을 코드하는 유전자를 갖는 제 2 벡터를 함유하고,

    상기 (1), (2)의 벡터의 복제 기점이 불화합성을 나타내지 않도록 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터의 세트.
11. 제 10 항에 있어서, 제 1 벡터가 대장균 cspA 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 벡터의 세트.
12. 제 10 항에 있어서, 제 2 벡터가 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 샤페론을 코드하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터의 세트.
13. 제 10 항에 있어서, 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드로 이루어지는 벡터의 세트.
14. 프로모터의 하류에,

    (a) 콜드 쇼크 단백질 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA,

    (b) 상기 (a)의 DNA의 하류에 위치하는 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열을 갖는 DNA, 및

    (c) 샤페론을 코드하는 유전자를 갖는 발현 벡터.
15. 제 14 항에 있어서, 대장균 cspA 유전자 mRNA 유래의 5' 비번역 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 발현 벡터.
16. 제 14 항에 있어서, DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 및 트리거 팩터 중에서 선택되는 샤페론을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
17. 제 14 항에 있어서, 원하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 삽입에 사용가능한 제한효소 인식서열이 원하는 폴리펩티드가 샤페론과의 융합 단백질로서 발현되도록 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 삽입할 수 있는 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
18. 제 14 항에 있어서, 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드인 발현 벡터.

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