JPH06500006A - ユビキチン特異的プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ユビキチン（Ｕｂ）は最初に子ウシ胸腺から単離された約８５００ダルトンの短 鎖ポリペプチドである。ユビキチンに関する初期の研究で、この７６個の残基か ら成るタンパク質はすべての真核細胞中に存在すること、およびそのアミノ酸配 列は公知のタンパク質では匹敵するものがないほど高度に保存されていることが 明らかになった［詳細については、フィンレイとバルシャフスキー（Ｆｉｎｌｅ ｙ　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓ ｃｊ、　１０：３４３　（１９８５）参照］。これらの知見は、ユビキチンが基 本的な細胞機能に関与していることを明らかに示唆しているが、この機能の実態 については比較的最近までよくわかっていなかった。

１９７７年、ユビキチンはそのカルボキシル末端グリシンがイソペプチド結合に よってヒストンＨ２Ａ中の内部リジン１１９のε−アミノ基に結合している珍し い分枝タンパク質の一部を成すことがわかり、最初の手掛かりが得られた［ハン ジュゲートは分枝ユビキチンコンジュゲートと呼ばれるようになった。

その後の生化学的および遺伝学的研究で、ユビキチンの機能の一つがタンパク質 分解のシグナルとして作用することであることがわかった。すなわち、選択的タ ンパク質分解は、ュビキチンがあらかじめ標的タンパク質分解基質にＡＴＰ依存 的に結合する段階を必要とすることがわかった。ユビキチンと他のタンパク質の 結合は、ユビキチンのカルボキシル末端グリシンと受容体タンパク質（ａｃｃｅ ｐｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）中のりジン残基のε−アミノ基の間にイソペプチド 結合を形成する一部のユビキチン結合酵素によって触媒される（図１参照）。

ユビキチンが多数連なる鎖中では、ユビキチン自体が受容体として作用し、いく つかのユビキチン部分が最初の受容体タンパク質に連鎖的に付着してユビキチン 同士のコンジュゲートの分枝鎖を作る。ユビキチン連鎖が標的タンパク質上に形 成されることは、それに続いてこのタンパク質が分解するために不可欠であるこ とがわかっている［チャウ（Ｃｈａｕ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４　二１５７６ −１５８３　（１９８９）　］　。

第二の非分技型ユビキチンータンパク質コンジュゲートは、カルボキシル末端グ リシン残基がペプチド結合によって受容体タンパク質のアミノ末端のα−アミノ 基と結合しているユビキチンを含有している。生じたコンジュゲートはユビキチ ンと「下流の」タンパク質が結合した直鎖状融合体である。翻訳後にこのような 直鎖状ユビキチンータンパク質融合体を生成しつる酵素は見つかっていないが、 これらのユビキチン融合体は、分枝ユビキチンコンジュゲートと異なり、適当に 構築されたＤＮＡ分子にコードされて、ｍＲＮＡ翻訳の直接生成物としてリポソ ーム上で合成することができる。

上記ＤＮＡ構築物が作成され、それらによってコードされ土で合成されている［ ５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（ｉ９８６）コ。特にエビキチン− β−ガラクトシダーゼ（Ｕｂ−βｇａ　１）融合れた。この融合体のユビキチン 部分はイン・ビボでユビキチンーβｇａｌ結合部で効果的かつ正確に切断されて 遊離ユビキチンおよびそのアミノ末端に（天然）メチオニン残基を有するβｇａ ｌタンパク質ができることが観察された。彼らは部位特異的突然変異誘発法を利 用して、Ｕｂ−βｇａｌ結合部にあるβｇａｌのメチオニンコドンを、他の１９ 個のアミノ酸のそれぞれを決定するコドンと置換した。対応するＵｂ−Ｘ−βｇ ａｌタンパク質（Ｘはβｇａｌの結合部アミノ酸残基を示す）が酵母中で発現さ れ、生成物の構造と代謝状況が調べられた。その結果、いずれの場合も、Ｕｂ− βｇａｌ結合部の残基Ｘの性質に無関係にユビキチン部分がユビキチン特異的（ Ｕｂ−特異的）プロテアーゼによってイン・ビボでＵｂ−Ｘ−βｇａｌ融合体タ ンパク質から切断されることがわかった（Ｘがプロリンの場合、脱ユビキチン化 は起きているものの他の１９個の結合部残基の場合より約１ｏ分の１の低速であ った）［バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３虹１７９− １８６　（１９８６）　；バクマイアとバルシャフスキ−（Ｂａｃｈｍａｉｒ　 ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）　、Ｃｅ１ｌ　５６：１０１９−１０３２　 （１９８９）　；ボンダ（Ｇｏｎｄａ　）　ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］この様にして確立された 技術、すなわちユビキチン融合法は、いわゆる「メチオニン問題」の決定的な解 決をもたらした。この根本的な問題は、遺伝子コードがもたらす制限ゆえにすべ ての生物におけるすべての新たに合成されるタンパク質がメチオニンで始まると いう事実に起因するものである。

新規に作成されたタンパク質のアミノ末端領域のその後の成り行きを支配する規 則（例えばメチオニンが保持されるのか、アセチル化されるのか、その他の形で 変性されたり除去されるのか、あるいはアミノ末端でより広範な変化が起きるの か）についてはほとんどわかっていないので、目的の（あらかじめ決めておいた ）アミノ末端残基を有する特定のタンパク質やポリペプチドをイン・ビボで製造 する目的に使うことはできない。このことは、例えば医学的に重要な真核生物タ ンパク質を組換えＤＮＡ技術によって酵母や細菌などの異種宿主中で製造する場 合など多くのバイオテクノロジー分野の応用において困難な問題となる。このよ うなタンパク質の多させた場合に有するものとは異なる成熟アミノ末端残基を有 す、る。正しい（天然の）アミノ末端残基を持つということは、医薬品用に製造 される組換えＤＮＡの場合に特に重要である。例えば、正しくない（または過剰 の）アミノ末端残基が静脈内投与タンパク質中に含まれていると、抗原性の問題 （タンパク質に対する免疫応答の誘導）を引き起こしたり、血流からのタンパク 質のクリアランスが速くなり過ぎるといった現象につながるおそれがある。これ らの群に属する重要な臨床用および獣医柱層タンパク製剤としては、成長ホルモ ン、様々なインターフェロン、繊維芽球成長因子、インターロイキンなどが挙げ られる。

ユビキチン融合法によって、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド（当該分野で はこれら３つの用語は互換的に使われることが多く、「ペプチド」という用語は 必ずしもそうではないものの、通常は残基数が５０個以下の比較的短いポリペプ チドを示すことが多い）のいずれかのアミノ末端に目的の（あらかじめ決めてお いた）アミノ末端残基を作るという問題に対して決定的かつ一般的応用可能な解 決がもたらされた特定のタンパク質のアミノ末端に目的の残基を生成することが できれば、上記問題の解決に極めて重要であるばかりでなく、タンパク質やペプ チドの機能研究のだ、めに異なるアミノ末端を作成することがらアミノ末端残基 を変えることによってタンパク質の代謝安定性（イン・ビボ半減期）を操作する ことまで、様々な他の用途に育用である［バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）　ら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（１９８６）］。

特定のタンパク質中に目的のアミノ末端残基を正確にイン・ビボで生成させるこ とはユビキチン融合法によって初めて実現されたものであるが、レニンやＸａ因 子などの様々な特異的プロテアーゼを用いてイン・ビトロ（無細胞系において） でタンパク質のアミノ末端を操作する類似の方法は以前か］。残念ながら、これ らのイン・ビトロで使用するプロテアーゼはいずれも、目的のアミノ末端を特定 のタンパク質やペプチド中に生成するための試薬として使用するには大きな欠点 がある。これらは、レニンの如く、十分な特異性を有さず、不適当な場所でも同 様に標的タンパク質を切断することが多いことや、Ｘａ因子の如く、比較的効率 が低いため反応時間が長く目的物の収量が低いことがその理由である。

これらの理由から、１９８６年のユビキチン融合法の発明完成の時点以後は、該 法のイン・ビボ変異（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｖｅｒｓｉｏｎ）の基礎となる高効率で 極めてＵｂ−特異性の高いプロテアーゼの遺伝子を単離し、以前からタンパク質 のアミノ末端のイン・ビトロ操作に使われている欠点のあるタンパク質分解試薬 の替わりにこのプロテアーゼをイン・ビトロで用いることが望まれてきている。

酵母のＵｂ−特異的プロテアーゼＹＵＨ１をコードする遺伝子の単離およびその 大腸菌中の（異種）発現がミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らによって報告されている［ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１：６９８−７０４　（１９８９）　］。しか し、彼らによって単離されたプロテアーゼをより詳細に分析したところ、十分に 短いユビキチン融合体タンパク質のみを切断すること、および約（〜）６０残基 以上の長さの非ユビキチン部分を有する融合体は切断しないことがわかった。特 に、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）らが上記報告で述べているように、ＹＵＨ１プロテ アーゼはバクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら［Ｓ＋ｊｅｎｃｅ　２３４：１７９ −１８６　（１９８６）］によってユビキチン融合法のイン・ビポ変異（ｉｎ　 ｖｉｖｏ　ｖｅｒｓｉｏｎ）の確立に使ゎれたユビキチン融合体であるＵｂ−Ｘ −βｇａｌタンパク質を脱ユビキチン化することができない。（Ｕｂ−Ｘ−βｇ ａ１のＸ−βｇａ１部分の長さは約（〜）１０００残基である。） プロテアーゼをコードする単離された核酸に関する。ＵＢＰ１プロテアーゼは、 ユビキチンとユビキチン以外のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を 脱ユビキチン化するもので、融合体の非ユビキチン部分のサイズは制限を受けな い。したがって、ＵＢＰ　１は以前に単離されたＹＵＨ１プロテアーゼの基質特 異性とは定性的に異なる基質特異性を有する。本発明はさらに、ＵＢＰＩプロテ アーゼを発現する組換えベクター、該ベクターによって形質転換された細胞、お よびＵＢＰＩプロテアーゼを用いるユビキチンータンパク質融合体の非ユビキチ ン部分の単離と操作を容易にする特定のユビ、キチンータンパク質融合体の態様 に関する。

本発明の組成物および方法によれば、ＵＢＰＩプロテアーゼの大規模製造が容易 である。この新規タイプのユビキチン特異的プロテアーゼが利用できるようにな ったことで、ユビキチン融合法のイン・ビトロでの応用が可能となった。ＵＢＰ １プロテアーゼは、様々な組換えタンパク質やペプチドをより高い効率で単離、 精製する方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、ユビキチン系の経路を示す。

図２は、酵母ＵＢＰＩ遺伝子の単離に用いる姉妹選択法（Ｓｉｂ　５ｅｌｅｃｔ ｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ）の概要を示す。

図３は、ＵＢＰ　１プロテアーゼをコードするプラスミドｐＪＴ６０のマツプを 示す。

図４は、ＵＢＰＩ遺伝子のヌクレオチド配列およびＵＢＰ１プロテアーゼのアミ ノ酸配列を示す。

図５は、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＢＰＩで処理したユビキチン−Ｍｅｔ −βｇ　ａ　１　ｓユビキチン−Ｍｅｔ−ＤＨＦＲ，およびその他のユビキチン 融合体の電気泳動分析の結果を示す。

図６は、サンドイッチ融合体タンパク質ＤＨＦＲ−ユビキチン−Ｍｅｔ−βｇａ ｌをコードする発現ベクターｐＪＴＵＰのマツプ（Ａ）、およびユビキチン特異 的プロテアーゼＵＢＰＩで処理したＤＨＦＲ−ユビキチン−Ｍｅｔ−βｇａｌの 電気泳動分析の結果を示す。

本発明のＵｂ−特異的プロテアーゼＵＢＰＩは、ユビキチンが連結したあらゆる 非ユビキチンタンパク質またはペプチドからユビキチンを特異的に切断する。Ｕ ＢＰＩはユビキチン融合体の非ユビキチン部分のサイズに関して上限および下限 のいずれも制限を受けずに、あらゆるユビキチン融合体（ボリュビキチンを除く ）を切断するという点が重要である。

ＵＢＰＩはユビキチンと非ユビキチンタンパク質またはペプチドとが結合してい る部位で切断する。すなわち、ユビキチン部分のカルボキシル末端残基と、それ に連結する非ユビキチンタンパク質またはペプチドのα−アミノ基の間で、ユビ キチン融合体タンパク質中のペプチド結合を切断するのである。

また、ＵＢＰ　１は、１番目と２番目の非ユビキチン部分の間にユビキチン部分 がある「サンドイッチ状Ｊユビキチン融合体を認識し、切断する。本明細書中で 用いる場合、１番目の非ユビキチン部分とは、上記サンドイッチ状ユビキチン融 合体中のユビキチン部分の上流に位置する非ユビキチンタンパク質またはペプチ ドをいう。２番目の非ユビキチン部分とは、上記サンドイッチ状ユビキチン融合 体中のユビキチン部分の下流に位置する非ユビキチンタンパク質またはペプチド をいう。ＵＢＰＩはユビキチン部分のカルボキシル末端残基と２番目の非ユビキ チン部分のαアミノ基の間でサンドイッチ状融合体タンパク質を切断する。

サンドイッチ状ユビキチン融合体中の１番目の非ユビキチン部分はどのようなペ プチドまたはタンパク質であってもよい。このサンドイッチ状ユビキチン融合体 タンパク質は、例えば１番目と２番目の非ユビキチン部分をコードするＤＮＡ断 片をユビキチンをコードするＤＮＡ配列のそれぞれ５゛末端および３°末端に連 結させることによって得ることができる。これらのコード配列は、サンドイッチ 状融合体をコードするｍＲＮＡの翻訳を不完全な状態で終わらせる終止コドンか できない様な発現に適した条件下でフレーム内で連結させねばならない。下記実 施例で述べるように、１番目と２番目の非ユビキチン部分の間にユビキチン部分 があるサンドイッチ状ユビキチン融合体タンパク質（ＤＨＰＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ −βｇａ　１）が構築、発現され、そしてＵＢＰＩによって効率的かつ特異的に 切断されることがわかった。

上記サンドイッチ状構築物は、１番目の非ユビキチン部分がサンドイッチ状ユビ キチン融合体に対して何らかの好ましい性質をもたらす場合に特に有用である。

例えば、１番目の非ユビキチン部分はユビキチン融合体タンパク質のアフィニテ ィー精製を容易にすることがある。この場合、融合体タンパク質は、Ｕｂ−特異 的プロテアーゼを欠く菌体（例えば大腸菌）内で発現させることができ、溶菌物 を１番目の非ユビキチン部分に対して特異的なアフィニティーカラムに通すこと ができる。アフィニティー精製に有用なタンパク質の１例としてはストレプトア ビジン［サラセンフェルト（５ａｓｓｅｎｆｅ１、ｄ、　Ｋ、Ｍ、）　、Ｔｒｅ ｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　８：８８−９３　（１９９０）］が挙げられる。融 合体タンパク質をアフィニティー精製した後、本発明のユビキチン特異的プロテ アーゼと接触させる。これにより、２番目の非ユビキチン部分がサンドイッチ状 ユビキチン融合体構築物から遊離される。

以前に単離されたＹＵＨｌ酵素はＵＢＰＩと対照的に、融合体の非ユビキチン部 分が比較的短い（約６ｏ残基以下のもの、上記参照）場合に限ってユビキチンを ユビキチン融合体から切断する。例えば、薬理学的に重要なタンパク質の多くは ６０残基よりはるかに長いので、これらのタンパク質とユビキチンの融合体を脱 ユビキチン化する目的でＹＵＨｌプロテアーゼを使用することはできない。一方 、ＵＢＰＩプロテアーゼはこの目的に使用することができるので、大小いずれの タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（上記したとおり、当該分野ではこ れらの用語は互換的に用いられることが多い）のアミノ末端にも目的の残基を生 成することができる。

原則として、様々な組換えＤＮＡ手法を用いてＵＢＰＩ遺伝子を単離することが できる。上記単離手順は、ＵＢＰＩを産生ずることが知られている生物に由来す るｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーの構築が行なわれているのが一般的 である。ユビキチンは試験したすべての真核生物中で産生されることが知られて いるので、どのような真核生物でも組換えライブラリーの構築のための核酸供給 源として適切に使用することができる。さらに、ユビキチンはこれまでに同定さ れている真核タンパク質のなかで最も高度に保存されているものである。ｃＤＮ ＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーの製造とスクリーニングのプロトコ ールは当該技術に熟練せる者に公知である。

本願で表示された発明者によって実際に行なわれたスクリーニング手法は姉妹選 択法（ｓｉｂ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）と呼ばれる遺伝子を基準とするクローン化 法の変法である。この方法は、大腸菌などの細菌は真核生物と異なり真核生物ユ ビキチン系、特にＵｂ−特異的プロテアーゼを持っていないという事実を利用す るものである。細菌がユビキチン特異的プロテアーゼを欠損しているという事実 が、目的のＵｂ−特異的プロチ了−ゼをコードする酵母〔ニス・セレビシェ（Ｓ 、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕遺伝子を単離するのに利用されているのである。

姉妹選択法（ｓｉｂ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）は、ＤＮＡクローンの連続分画法の 一つで、選択可能な表現型すなわち配列情報がない場合に特に有用である。この 方法については以下の実施例の項で詳細に説明する。

好ましい態様においては、本発明の単離ＤＮＡ配列は図４に示したアミノ酸配列 、またはコードされる物質の活性と基質特異性を本質的に損なうことなくアミノ 酸が欠損、挿入、または置換されて該配列が変化したものをコードする。図４に おいて、ＵＢＰＩのオーブンリーディングフレームはヌクレオチド配列の１９４ 位で始まり、２６２３位の終止コドンによって２６２２位で終わる。このリーデ ィングフレームは８０９個の残基から成るタンパク質をコードし、１文字表記で 示される。このＤＮＡは上記で概要を示した方法によって本発明の単離ＤＮＡは ＵＢＰＩを大量に発現させるのに利用できる。この目的のためには、該ＤＮＡを 適当な調節シグナルとともに原核生物または真核生物の発現ベクターに組み込ま れ、細胞の形質転換に用いられる。この目的のために様々な適当なベクターと調 節シグナルがすでに開発されており、当該技術に熟練せる者に公知となっている 。ＵＢＰＩは真核細胞または原核細胞内で発現させることができる。過去の研究 で、原核生物はユビキチンおよびＵｂ−特異的酵素の両者を欠いていることが示 されている「例えばフィンレイとノく公知の適当な発現ベクターを用いて該プロ テアーゼを細菌または酵母培養物から大量に製造、単離することができる。

該Ｕｂ−特異特異的プローアーゼン・ビトロでユビキチン融合体からユビキチン を切り離すのに用いることができる。

タンパク質分解切断に適した条件下でＵＢＰ　ｌプロテアーゼをユビキチン融合 体と接触させ、切断された付加物を回収する。この手順において、ＵＢＰ　１は 遊離形で使用することができるが、ビーズなどの固相上に固定してもよい。上記 した通り、ＵＢＰＩは小型のもののみならず大型の付加物からもユビキチンを切 断するので、イン・ビボで適当な系内でタンパク質やペプチドをユビキチン融合 体として製造することができ、ユビキチン部分はＵｂ−特異的プロテアーゼを用 いてイン・ビトロで除去することができる。

また、該プロテアーゼをコードする発現ベクターを保持する原核細胞は、任意の ユビキチン融合体タンパク質またはペプチドをコードする発現ベクターで形質転 換することができる。その結果、これらの細胞は、あらかじめ決めておいたアミ ノ末端アミノ酸残基を育する脱ユビキチン化物を産生する。大腸菌なとの原核生 物中で組換えタンノ（り質を製造することは多くの長所があることが知られてい る。

ユビキチンと非ユビキチンタンパク質またはペプチドの融合体のなかには、ユビ キチン部分が存在すると非ユビキチンタンパク質またはペプチドの機能活性を阻 害または修正するものがある。この場合、ユビキチンは、対応するユビキチン融 合体をＵｂ−特異的プロテアーゼと接触させてユビキチン部分を切断することに よってイン・ビトロまたはイン・ビボでいつでも希望するときに元の機能活性を 回復することができる状慇で非ユビキチンタンパク質またはペプチドの機能活性 を一時的に阻害する薬剤（または修正する薬剤）として使用することができる。

以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

実施例 実施例１ ｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ）を行なった。ライブラリーＲＢ２３７は、酵母ゲノム ＤＮＡを５ａｕＩＩＩＡで部分消化し、得られた断片を酵母／大腸菌シャトルベ クターｙｃｐｓｏのＴｅ　ｔ’遺伝子のＢａｍＨ１部位に連結することによって 作成した。最初の分析時には、このライブラリーは平均的（〜）１９Ｋｂのサイ ズの挿入配列を含んでいた。

上記ライブラリーで形質転換した大腸菌をルリア・ブロス（Ｌ　Ｂ）とアンピシ リン（ａｍｐ）（１００μｇ／ｍｌ）を含有する寒天平板上に１枚あたり約４０ 個の生存菌体密度で接種した。平板を３６°Ｃで１６時間インキュベートした。

次いで、コロニーをＬ　Ｂ　／　ａ　ｍ　ｐ平板上にレプリカした。元の平板を ４°Ｃで保存し、そのレプリカを３６°Ｃで２４時間培養した。すべてのコロニ ーが液体に落ち込むまで平板表面上で繰り返し洗うことによって１ｍｌのＬＢ／ ａｍｐ（５０μｇ／ｍ１）で各レプリカを溶出した。次いで溶出物全体を４ｍｌ のＬ　Ｂ　／　ａ　ｍ　ｐに加え、回転ドラム上で３６℃で１夜インキユベート した。

次いで、これら１夜（定常期）培養物中の大腸菌菌体を溶菌した。各培養物１． ７ｍｌを氷上のマイクロ遠心分離チューブに入れ、次いで４°Ｃ，１２０００ｘ ｇで１分間遠心分離した。菌体ベレットを高速でポルテックス攪拌することによ って５０μｍの２５％ショ糖（ｗ／ｖ）　、２５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８ ，０）に再懸濁した。次いで、新たに調製した。リゾチーム溶液（０，２５Ｍト リス−塩酸にｔｏｍｇ／ｍ１ニワトリ卵白リゾチーム（シグマ社）を溶かしたも の、ｐＨ８，０）１０μｍを加え、軽いポルテックス攪拌を行なって混合した。

得られた懸濁液を氷上で５分間インキュベートした。１５０μｌの７５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、０．３３Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８，０）を加え、軽くポルテックス攪 拌を行なって混合し、時々攪拌しながら試験管を氷上で５分間インキュベートし た。次いで、１μｌの１０％トリトンＸ−１゜Ｏ（ピャース社）を各試験管に加 え、ピペットで混合した。

溶菌物を４°Ｃ，１２０００ｘｇで１５分間遠心分離した。得られた上滑を氷上 に保持し、ベレットは廃棄した。

Ｕｂ特異的プロテアーゼ活性の測定に際し、０．５ｍｌマイクロ遠心管中で上記 上清９μｍを１μｌの３５３標識ユビキチン一ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｕｂ−Ｍ ｅ　ｔ−ＤＨＦＲ）融合体と合わせ、３６°Ｃで３時間インキュベートした。次 いで、５μｍの３倍濃縮電気泳動試料用緩衝液（３０％のグリセリン、３％のＳ ＤＳ　（ｗ／ｖ）、１５ｍＭのＥＤＴＡ、０゜２Ｍの２−メルカプトエタノール 、０．３μｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー、３７５ｍＭのトリス−塩酸、ｐ Ｈ６゜８）を加え、各遠心管を沸騰水浴に３分間入れた。試料を１２％ポリアク リルアミド−３ＤＳゲルにのせ、ブロモフェノール染料がゲルの底に到達するま で５０ｖで電気泳動した。

ゲル中の放射標識タンパク質の位置をフルオログラフィーで可視化した。ゲルを １０％酢酸と２５％メタノールで１５分間洗い、水中で１５分間すすぎ、オート フルオール（ナショナルダイアグノスチック社）とともに１時間インキュベート した。次いで、ゲルを真空下８０℃で乾燥させ、コダックＸＡＲ−５フィルムに 当てた状態で遮光カセットに入れ、−８５°Ｃで１夜保存した。

２ＳＳ探識Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＰＲは下記のようにして調製した。５０μｇ　 ／　ｍ　１のアンピシリンを添加したルリア・ブロス（５０ｍ１）に、ｌａｃプ ロモーターのＩＰＴＧ誘導性高活性誘導体由来の、Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲ融 合体タンパク質を発現する、プラスミドを含有する大腸菌ＪＭＩＯＩ菌株の飽和 １夜培養物１ｍｌを接種した。該菌体をＡ、。。値が約（〜）０．９になるまで 振盪しなから３７°Ｃで培養した。

培養物を氷上で１５分間冷却した後、３０００ｘｇで５分間遠心分離し、０°Ｃ でＭｅ塩で２回洗った。菌体を最後に洗った後、０．２％のグルコース、１．８ μｇ／ｍｌのチアミン、４０℃１ｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧ、 ０゜０６２５％（Ｗ／Ｖ）のメチオニン測定溶媒（ディフコ社）を添加した２５ ｍ１のＭｅ塩に再懸濁した。次いで、懸濁液を３７℃で１時間振盪し、１ｍＣ１ の！５３−）ランスラベル（ＩＣＮ社）を加えた後、振盪しながら５分間インキ ュベートすることによって菌体を標識した。次いで、未標識のし−メチオニンを 最終濃度が０．００３２％（Ｗ／Ｖ）になるように加え、菌体をさらに１０分間 振盪した。次いで、菌体を採取しく３０００ｘｇ、５分間）、冷却したＭｅ塩で １回洗った。二〇Ｍ９洗浄後、菌体ベレットを０．５ｍｌの２５％ショ糖、５０ ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）に再懸濁し、氷上で５分間インキュベートした 。この間、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにニワトリ卵白リゾチーム（シグマ 社）を２５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）に新たに溶解した。

リゾチーム溶液ｌＯμｌを菌体懸濁液に加え、混合し、０℃で５分間インキュベ ートした。次いで、５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，Ｏ）を加え、間欠的 に混合しながら懸濁液を０°Ｃで５分間放置した。次いで、０．９７５ｍ１の６ ５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８，０） 、およびプロテアーゼ阻害剤のアンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、ア プロチニン、ペプスタチンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ濃度で含有する遠心管に菌 体懸濁液を加えた。次いで、１０μｌのｌＯ％トリトンＸ−１ｏ。

（ピアース社）を加え、ピペットで分散させた。得られた溶菌物を３９０００ｘ ｇで３０分間遠心分離した。上溝を保持し、液体窒素で迅速に凍結させ、−８５ ℃で保存した。

２Ｓ３１ｊｌ識Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲをアフィニティー精製するために、メ トトレキセー）　（ＭＴＸ）−アガロースアフィニティーマトリックスをカウフ マン（Ｋａｕｆｍａｎ　）の方法に従って調製した［Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｂ、Ｔ 、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４：２７２−２８１（１９７４）　］ 　、ベッド容量０．５ｍｌのカラムにＭＴＸ−アガロースを充填し、１０ｍ１の ＭＴＸカラム緩衝液（２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７，５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ ００ｍＭのＮａＣｌ、０．２Ｍのジチオスレイトール）で洗った。先の段階（上 記参照）で得られた２１３標識上清を融解させ、ＭＴＸ−アガロースカラムにか けた。カラムをＭＴＸカラム緩衝液５０ｍ１と２Ｍの尿素を含有するＭＴＸカラ ム緩衝液５０ｍ１で洗い、５０ｍ１のＭＴＸカラム緩衝液で再び洗った。

標識Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲを葉酸溶出緩衝液（０，２Ｍのホウ酸カリウム（ ｐＨ９，０）、ＩＭのＫＣＩ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｌ　ＯｍＭ の葉酸）でカラムから溶出した。溶出緩衝液１ｍｌをカラムにかけ、１ｍｌの画 分を集めた。画分のｓｓ３放射能を測定し、高い放射性ピークを含存する画分を プールした。プールした画分は、４０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ｍＭ のＭｇＣＩｔ　、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５０％のグリセリンを含有する保存緩 衝液（２一度交換）に対して約（〜）２０時間透析した。精製した３５３標識Ｕ ｂ−Ｍｅｔ−ＤＨＦＲを５ＤＳ−ＰＡＧＥ、さらにフルオログラフィーで分析し たところ、純度が９５％以上であることがわかった。

ゲル分析でユビキチンーＤＨＰＲ結合部においてタンパク質分解活性を示す溶菌 物が見つかるまで、異なる大腸菌形質転換体プールから得た溶菌物を用いて上記 脱ユビキチン化分析を繰り返した（図２）。その結果、元のＬ　Ｂ　／　ａ　ｍ 　ｐ平板（プール溶菌物を得た平板）上の約（〜）４０個の大腸菌コロニーのう ち少なくとも１個はＵｂ−特異的タンパク質分解活性をもたらす酵母ＤＮＡ挿入 配列を有するｙｃｐ　５０ベースのプラスミドを含有することが判明した。

このＵＢＰＩ遺伝子クローニングのための姉妹選択アプローチ（ｓｉｂ　５ｅｌ ｅｃｔｉｏｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ）の次の段階は、同様のＵｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨ ＦＲ切断分析を行なうことによって「陽性」プール中の約（〜）４０個のコロニ ーのうちのどれが目的のプラスミドを含んでいるかを決定することであった。そ のために、該当する平板の上の各コロニーの試料をＬ　Ｂ　／　ａ　ｍ　ｐに接 種し、１夜培養した。次いで、各溶菌物試料が約（〜）４０個の上記形質転換体 の混合物ではなく単一のクローン化大腸菌形質転換体を表す以外は上記と全（同 じ手順でＵｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＰＲ切断分析を繰り返した。この分析の結果、Ｕ ｂ−ＤＨＰＲ結合部で特異的に切断する能力をもたらすプラスミドを含有する単 一のコロニーが見つかり、Ｕｂ−特異的プロテアーゼをコードするニス・セレビ シェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ虹）遺伝子のクローン化の目的が達せられた。

最初に単離したプラスミド（ｐＪＴ５５）を分析したところ、ＹＣｐ５０ベクタ ー中に約（〜）１５ｋｂの酵母ゲノムＤＮＡ挿入配列が見つかった。このプラス ミドをｓｐｈ　Ｉで消化したところ、約（〜）１４ｋｂの断片ができたが、これ をＩ）ＵＣ１９ベクター中にサブクローニングしたところ、同じタンパク質分解 活性をもたらした。このプラスミドをｐＪＴ５７と名付けた。この約（〜）１４ ｋｂ断片をｓｐｈ　ＩとＸｈｏＩで切断し、挿入ＤＮＡ配列の約（〜）５．５ｋ ｂ断片を単離し、それをｓｐｈ　Ｉと５ａｉｌであらかじめ切断しておいたｐＵ ｃ１９ベクター中にサブクローン化することによってさらにサブクローニングし た。その結果、元のプラスミドと同じＵｂ−特異的タンパク質分解活性をもたら す約（〜）５．５ｋｂ酵母ＤＮＡ挿入配列を含有する約（〜）８゜１ｋｂのプラ スミドｐ、ｒ’ｒａｏが得られた。

プラスミドｐＪＴ６０中の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示すマツプを図３ に示す。マツプ中、塩基対の位置は切断部位の後ろのかっこ内の数字で示す。ｐ ＪＴ６０中の酵母ＤＮＡ挿入配列（塩基４２３〜５８３０）は、それが２つのよ り短い断片Ａおよび断片Ｂに分かれる中心の付近にＫｐｎ■部位を含んでいた。

この断片中、白抜き矢印はＵＢＰＩをコードするオーブンリーディングフレーム （ＯＲＦ）示す。

ＯＲＦ全体およびそれをかっこで囲む細い線は図４に示した配列決定済みＤＮＡ の範囲を示す。両方の断片をｐＵｃｌＱ中にサブクローン化し、ｐＪＴ６０Ａお よびｐＪＴ６０Ｂを得た。断片ＡをＫｐｎＩとＳｐｈ　Ｉで切断した後、ｐＪＴ ５７から単離した。この断片を、同じ制限エンドヌクレアーゼであらかじめ切断 しておいたｐＵＣ１９中にサブクローン化しめ切断しておいたｐＵｃ１９中にサ ブクローン化した。ｐＪＴ６０ＡとｐＪＴ６０ＢはいずれもＵｂ特異的タンパク 質分解活性をもたらす能力はなかった。この結果は、対象遺伝子がｐＪ’ｒａｏ の約（〜）５．５ｋｂ挿入挿入上Ｋｐｎ１部位をまたがっていることを示唆する ものである。

クローン化した遺伝子の配列を決定するために、ｐＪＴ６０ＡとｐＪＴ６０Ｂの 挿入配列をＭ１３ｍｐ１９ファージベクター中にサブクローン化した。ｐＪＴ６ ０の内部ＫｐｎＩ部位から両方向のヌクレオチド配列を決定した（チェインター ミネータ−法を利用）。該ＫｐｎＩ部位は、そこから両方向に延びているオーブ ンリーディングフレーム内に保持されていることがわかった。次いで、ゾール（ Ｄａｌｅ）らの方法［Ｐｌａｓｍｉｄ　１３：３１−４０　（１９８９）コによ って配列鋳型中に単一方向欠損をつくり、このオーブンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）全体を決定した（図４）。このＯＲＦの５゛末端は断片Ｂ中にあり、終 止コドンは断片Ａ中にあった。ＯＲＦは２４２７個のヌクレオチドの長さがあり 、８０９個の残基から成るタンパク質をコード化しており、分子量は９３ｋＤで あったンカーを連結することによって、配列決定済みＯＲＦを２゜８ｋｂ断片上 で単離した。この構築物を５ａｉｌとＢａｍＨＩで消化し、得られた２、８ｋｂ 断片を電気泳動精製し、あらかじめＢａｍＨＩと５ａｉｌで消化しておいたｐＵ Ｃ１９に連結した。得られたプラスミドをｐＪＴ７０と名付けた。

このプラスミドを大腸菌に形質転換したところ、ｙｃｐｓ。

中の元の約（〜）１５ｋｂ挿入配列またはｐＪＴ７０の約（〜）２．８ｋｂ断片 を含むｐＪＴ６０プラスミドの約（〜）５．５ｋｂ挿入挿入上同程度にＵｂ−特 異的タンパク質分解活性をもたらす能力があった。プラスミドＩ）ＪＴ６０はア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビルエムディー）　（Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃ ｋｖｉｌｉｅ、　ＭＤ　）　）に寄託され、ＡＴＣＣ登録番号６８２１１を付与 されている。この２．８ｋｂ断片は有意な長さを育する他のＯＲＦを含んでいな かったことから、図４に示した配列決定済みＯＲＦはＵｂ−特異的プロテアーゼ をコード化していることがわかる。

この新規遺伝子はユビキチンー特異的プロテアーゼにちなんでＵＢＰＩと名付け られている。この名称は、ユビキチン経路に関与する遺伝子の命名に関する既存 の慣行に適合している［フィンレー、パーチル、およびバルシャフスキー（Ｆｉ ９８９）コ　。

ＵＢＰＩ遺伝子生成物の基質特異性を調べた。結果を図５に示す。図５Ａは、Ｕ ｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲを基質として脱ユビキチン化タンパク質分解活性の検出 に用いた１２％ポリアクリルアミド−８ＤＳゲルのフルオログラフ、および大腸 菌に対してＵｂ−特異的タンパク質分解活性をもたらす酵母ＤＮＡ断片のサブク ローン群を示す。各レーンは、大腸菌抽出物で処理しゲル電気泳動によって分画 した精製［”ＳＩ　Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲの試料に対応する。レーンｌおよ び４は、Ｕｂ特異的タンパク質分解活性が無いことを示し、レーン２．３、およ び５〜７は該活性が存在することを示す。レーンｌでは、基質は形質転換してい ない（対照）大腸菌ＪＭ１０１の抽出物で処理した。レーン２では、処理は最初 のプラスミドｐＪＴ５５を含有するＪＭＩＯＩの抽出物で行なった。レーン４〜 ７は、ｐＪＴ５５中に存在する最初のニス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ　）ゲノムＤＮＡ挿入配列の様々なサブクローン（ベクターｐＵＣ１９中 ）を保持するプラスミドを含有するＪＭＩＯＩの抽出物に対応する。Ｕｂ特異的 タンパク質分解活性をもたらした一つのプラスミド（レーン６）をｐＪＴ５７と 命名し、ｐＪＴ６０の構築に使用した（上記と同じ手順で）。矢印の頭は［”Ｓ ＩＵｂ−Ｍｅ　ｔ　−ＤＨＰＲ調製物中に存在する少量の不純物を示す。

図５Ｂは６％ポリアクリルアミド−３ＤＳゲルのフルオログラフを示し、ＵＢＰ Ｉプロテアーゼがユビキチンーβ−ガラクトシダーゼ融合体を脱ユビキチン化す る能力があることがわかる。レーンｌは、緩衝液のみによる模擬反応で処理した ［”ＳＩ　Ｕｂ−Ｍｅ　を−βｇａｌを含有する。レーン２は、プラスミドを含 まない大腸菌ＪＭＩＯＩを抽出源として使用する以外は同じ反応を行なって得ら れた生成物を含有する（脱ユビキチン化はみられない）。レーン３は、プラスミ ドｐＪＴ６０を含有する大腸菌ＪＭＩＯＩを抽出源として使用する以外は同じ反 応を行なって得られた生成物を含有する（約（〜）１１５ｋＤのＵｂ−Ｍ−βｇ ａｌからユビキチン部分が切断されたことに対応して分子量が約（〜）８ｋＤ減 っていることに注意されたい）。

図５０は、天然ユビキチンと酵母リボゾームタンパク質（ＵＢＩ２およびＵＢ　 Ｉ　３）の融合体が酵母ＵＢＰＩプロテアーゼによってイン・ビトロで脱ユビキ チン化されることを示す。レーン１は、ニス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ　）由来の天然ユビキチンーリボゾームタンパク賀融合体であるＵＢ■ ２を発現しているプラスミドを含有する大腸菌ＪＭＩＯＩの抽出物を１２％ポリ アクリルアミド−８ＤＳゲル中で電気泳動に付し、ポリビニリデンジフルオライ ド膜にブロッティングし、ウサギ抗ユビキチン抗体を使用して検出し、アルカリ ホスホターゼに連結した二次ヤギ抗ウサギ抗体およびアルカリホスホダーゼ発色 性基質を加えた結果を示す。レーン２およびレーンｌは、ＵＢＩ２含有抽出物を ＵＢＰＩ−発現プラスミドｐＪＴ６０を含有する大腸菌ＪＭＩＯＩの抽出物で処 理する以外は同じ試料を示す。レーン３およびレーンｌは、ＵＢＩ２含有抽出物 を酵母全菌体抽出物で処理する以外は同じ試料を示す。レーン４およびレーンｌ は、大腸菌ＪＭＩＯ１抽出物がもう一つの天然ユビキチン融合体（異なる酵母リ ボゾームタンパク質との融合体）であるＵＢＴ３を発現するプラスミドを含有す る以外は同じ試料を示す。レーン５およびレーン２は、酵母ＵＢＩ３タンパク質 をＵＢＰＩプロテアーゼの基質として用いる以外は同じ試料を示す。レーン６お よびレーン３は、ＵＢＴ３タンパク質を基質として用いる以外は同じ試料を示す 。ｒｕｂｉ３Ｊ、ｒｕｂｉ２Ｊ、および「Ｕｂ」は、ＵＢＩ３、ＵＢＩ２、およ び遊離ユビキチンタンパク質の位置を示す。レーン４中のＵＢ　Ｉ　３バンドよ り速く移動したバンドは、大腸菌抽出物中の酵母ＵＢＩ３タンパク質の部分的非 特異的分解産物である。このタンパク質分解切断はＵＢＩ３の非ユビキチン部分 に限局されている。なぜなら、レーン４の試料全体をＵＢＰＩプロテアーゼで処 理すると、未分解ユビキチン（レーン５）が生成するからである。

チタイブのユビキチン融合体タンパク質がＵＢＰＩの基質であるかどうかを決め るために、アミノ末端ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）部分および３個の グリシン残基とセリンより成るフレキシブルリンカ一部分があってその後ろにユ ビキチン部分とＭｅｔ−βｇａ１部分が続く３重融合体タンパク質をコードする プラスミドを構築した（図６Ａ）。ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　Ｉ　ｒ　Ｉ断片上の マウスＤＨＦＲ遺伝子をＵｂ−Ｍｅ　ｔ−ＤＨＦＲをコードするプラスミドから 単離した［バクマイアとバルシャフスキー（Ｂａｃｈｍａｉｒ　ａｎｄ　Ｖａｒ ｓｈａｖｓｋの２番目のコドンを変化させた修正Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ。この 手順でＤＨＦＲ、ユビキチン（最初のＭｅｔコドン無し）およびＭｅｔ−βｇａ ｌをコードするプラスミドが得られたが、各部分のオーブンリーディングフレー ムはまだ単一のオーブンリーディングフレームの並びになっていない。オーブン リーディングフレームを並ばせＤＨＦＲの開始コドンをベクター中のＧＡＬプロ モーターに対して正確な位置に置くために、このプラスミド中の２カ所で部位特 異的突然変異誘発を行なった。

このプラスミドをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌｌで切断し、得られたＤＨＦＲ、ユ ビキチン、および最初の少数のＭｅｔ−βｇａｌ残基をコードする約（〜）２． ７６ｋｂの断片を、あらかじめ同じ酵素で切断しておいたＭ１３ｍｐｌＱ中にク ローン化した。得られた１重ら旋Ｍ１３誘導体と標準プロトコールを用い、オリ ゴヌクレオチドを媒介として部位特異的突然変異誘発を行なった。第１のオリゴ デオキシヌクレオチドは、ＤＨＰＲの開始コドンがベクターのＧＡＬプロモータ ーに対して適切な位置に来るような２０ｂｐの欠失を生じるように作成した。第 ２のオリゴデオキシヌクレオチドは、ＤＨＦＲとユビキチンのリーディングフレ ームを一体化させ、４残基から成るスペーサー（−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　１　ｙ−Ｇ 　１　ｙ　−３ｅ　ｒ−）をＤＨＦＲ部分とユビキチン部分の間に挿入するよう に作成した。突然変異誘発後、チェインターミネーション法による直接ヌクレオ チド配列決定によりＤＮＡクローンに両方の変化が生じているかどうかを調べた 。

目的のＭ１３クローンの２重ら旋複製型（ＲＦ）を単離し、ＢａｍＨＩとＸｈｏ ｌで消化した。得られた約Ｃ〜）ｌ。

２ｋｂ断片を、同じ酵素で消化しておいたＵｂ−Ｍｅｔ−βｇａ１発現ベクター の約（〜）９．８７ｋｂ断片中にクローン化し、Ｕｂ−Ｍｅｔコード断片を部位 特異的突然変異誘発によって作成したＤＨＦＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　ｔコード断片で置 換した。この最終段階で、３重融合体ＤＨＰＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　を−βｇａｌをコ ードする発現ベクターが得られた。このベクターをｐＪＴＵＰと命名した（図６ ）。

ｐＪＴＵＰを用いて、２つの非ユビキチン部分の間にユビキチン部分があるユビ キチン融合体がＵＢＰ　１による切断の基質であるかどうかを調べた。［”Ｓｌ メチオニンで代謝標識した大腸菌において、β−ガラクトシダーゼに対するモノ クローナル抗体による免疫沈降法さらにポリアクリルアミド−８ＤＳゲル電気泳 動、およびフルオログラフィーを使って、発現されたＤＨＰＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ −βｇａｌの挙動をＵＢＰＩの存在下と非存在下で調べた（図６Ｂ）。

図６Ｂ（結果を概略的に示したもの）において、レーンｌは下記の手順で得られ た電気泳動分画試料のフルオログラムを示す。Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌを発現す るプラスミドとＵＢＰＩを発現するプラスミドを保持する大腸菌の定常期培養物 を新鮮ルリアブロスで１００倍に希釈した。培養物のＡ、。

。値が０．３になるまでを３７°Ｃで激しく振盪しながら培養した。培養物１ｍ ｌを１２０００ｘｇで１分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを０．２％グ ルコースを加えた５０μｍのＭ９培地に再懸濁した。菌体を３７°Ｃで１０分間 インキュベートした後、２０μＣｉの［”Ｓｌメチオニンを加えた。インキュベ ートをさらに２分間続け、次いで未標識Ｌ−メチオニンを最終濃度が３０ｍＭに なるように加えた。次いで、菌体を３７°Ｃで５分間インキュベートし、続いて ５０μｍの溶菌緩衝液（４％ＳＤＳ、１２５ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ６，８）） を加えて溶菌した後、直ちに１００℃で４分間加熱した。

次いで、β−ｇａｌに対するモノクローナル抗体を用いる免疫沈降を行なった。

１ｍｌの免疫沈降緩衝液（ＩＰ緩衝液）（１％のトリトンＸ−１００，０，５％ のＮａ−デオキシコーレート、０．１５ＭのＮａＣ１，５０ｍＭのトリス−塩酸 （ｐＨ７，５）　、２０ｍＭのＮ　ａ　Ｎｓ　、５　ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭフ ェニルメチルスルホニルフルオライド）を加えて溶菌物を希釈した。試料を４° Ｃ，１２０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上溝上部層０．９ｍｌを新たに用 意した試験管に集め、β−ｇａｌに対するモノクローナル抗体［バクマイア（Ｂ ａｃｈｍａｉｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（１９８６） ］を含有する６μｌの濃縮組織培養上清を加えた。試験管を氷上で１時間インキ ュベートした。次いで、セファロースビーズ（レブリゲン社）に結合させたプロ ティンＡの５０％懸濁液ｌＯμｍを加え、試験管を４℃でゆっくりと３０分間回 転させた。次いで、試験管を１２０００ｘｇで１５秒間遠心分離し、上溝を捨て た。ビーズを４°Ｃで１ｍｌのＩＰ／ＳＤＳ緩衝液（ＩＰ緩衝液に０．１％ＳＤ Ｓ　（ｗ／ｖ）を加えたもの）で３回洗い、１２０００ｘｇで１５秒遠心分離し てプロティンＡ−セファロースビーズを沈降させた。最終的に得られたペレット を１５μｍの３倍濃縮電気泳動試料用緩衝液（３０％のグリセリン、３％のＳＤ Ｓ　（ｗ／ｖ）、１５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｍの２−メルカプトエタノール、 ０．３μｇ／ｍ１ブロモフェノールブルー、３７５ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ６， ８））に再懸濁し、ポリアクリルアミド−３ＤＳゲル電気泳動で分画し、次いで フルオログラフィーを行なった。ゲルのフルオログラム（図６Ｂのレーンｌに示 す）から明らかなように、同時に発現されたＵＢＰＩによってＵｂ−Ｍｅｔ−β ｇａｌがＵｂ−βｇａｌ結合部で切断され、予想した生成物Ｍｅｔ−βｇａｌが 得られた。

レーン２に示した試料は、３重融合体ＤＨＦＲ−Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌがＵＢ ＰＩを欠く大腸菌中で発現されている点以外はレーン１に示したものと同じであ る。このレーンは全長ＤＨＰＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　ｔ−βｇａｌ以外にもより短いタ ンパク質に相当するバンドを含んでいることに注意されたい。これは、３重融合 体の上流（ＤＨＦＲ）部分内における替わりの開始部位によるか、その部分内に おける非特異的エンド型タンパク質分解的切断によるものである。これらのより 小さい生成物をそれぞれＸ−Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌとＹ−Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇ ａｌと呼ぶ。

レーン３に示した試料は３重融合体ＤＨＦＲ−Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌがＵＢＰ Ｉの存在下で発現されたという点以外はレーン２のものと同じである。ＵＢＰＩ は３つの３重融合体タンパク質（ＤＨＦＲ−Ｕｂ−Ｍｅ　を−βｇａｌ、Ｘ−Ｕ ｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ、Ｙ−Ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ）すべてをＵｂ−βｇａｌ 結合部で効果的に切断して、Ｍｅｔ−βｇａｌを生成することに注意されたい。

ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩＧ、５８ Ｆ／θ５Ｃ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１１月７日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０３１７７ ２、発明の名称 ユビキチン特異的プロテアーゼ ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ　０２１３９ケンブリツジ、マサチュ ーセッツ　アベニュー名称　マサチューセッツ　インスティチュート　オブ　テ クノロジー ４、代理人 住所　〒５４０　大阪市中央区谷町２丁目８番１号大手前Ｍ２ビル　細円国際特 許事務所 ５、補正書の提出年月日 請　求　の　範　囲 １４．タンパク質分解による切断に適した条件下で、融合体タンパク質を請求項 ！または２記載のプロテアーゼに接触させることよりなる、ユビキチンと非ユビ キチンタンパク質またはペプチドの間で、融合体タンパク質からユビキチンを切 断する方法。

１５、ａ）目的の（１ｎｔｅｒｅｓｔ）タンパク質またはペプチドにユビキチン を融合させてなる、ユビキチン融合体タンパク質を調製し、 ｂ）タンパク質分解による切断に適した条件下で、該融合体タンパク質を請求項 １または２記載のプロテアーゼに接触させ、および Ｃ）該融合体タンパク質から遊離された非ユビキチンタンパク質またはペプチド 部分を回収すること、よりなる、目的（１ｎｔｅｒｅｓｔ）タンパク質またはペ プチドの製造方法。

１６、該ユビキチン融合体タンパク質が、１番目の非ユビキチン部分と２番目の 非ユビキチン部分の間で融合されたユビキチン部分を有するサンドイッチ融合体 である請求項１５記載の方法。

１７、　１番目の非ユビキチン部分が、融合体タンパク質のアフィニティー精製 を容易にするものである請求項１６記載の方法。

１８、　１番目の非ユビキチン部分が、ストレプトアビジン（５ｔｒｅｐｔａｖ ｉｄｉｎ）である請求項１７記載の方法。

１９、その活性を阻害させるためにユビキチンの、タンパク質またはペプチドと の融合体を作製し、それに引き続いて、ユビキチン特異的プロテアーゼを用いて イン・ビトロまたはイン・ビボのいずれかで該融合体からユビキチンを切り離す ことにより、元の活性を回復することよりなる、ユビキチン部分の結合により、 分析可能な活性が阻害されるタンパク質またはペプチドの機能的活性を一時的に 阻害させる方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年ｚ月ｒａ＠

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）に連結した、任意の非ユビキチンタンパ ク質またはペプチドからユビキチンを特異的に切断し、該切断がユビキチンのカ ルボキシル末端残基と非ユビキチンタンパク質またはペプチドのα−アミノ基の 間で起こるものであるユビキチン特異的プロテアーゼ。 ２．ユビキチンのカルボキシル末端のグリシンの後を特異的に切断する、請求項 １記載のユビキチン特異的プロテアーゼ３．図４に記載のアミノ酸配列を有する か、あるいはプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に損なうことなくそ の配列中でアミノ酸が付加、挿入、削除あるいは置換されてこの配列が修飾され ている、請求項１記載のユビキチン特異的プロテアーゼ。 ４．ユビキチンに連結した、任意の非ユビキチンタンパク質またはペプチドから ユビキチンを特異的に切断し、該切断がユビキチンのカルボキシル末端残基と非 ユビキチンタンパク質またはペプチドのα−アミノ基の間で起こるものである、 ユビキチン特異的プロテアーゼをコードする単離された核酸５．コードされるユ ビキチン特異的プロテアーゼが、ユビキチンのカルボキシル末端のグリシンの後 を特異的に切断するものである、請求項４記載の単離された核酸。 ６．該核酸がデオキシリボ核酸である、請求項４記載の単離された核酸。 ７．図４に記載のヌクレオチド配列を有するか、あるいはその配列中で、これに よりコードされるプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に損なうことな くヌクレオチド残基が付加、挿入、削除あるいは置換されて、この配列が修飾さ れている、請求項６記載の単離された核酸。 ８．ユビキチンに連結した、任意の非ユビキチンタンパク質またはペプチドから ユビキチンを特異的に切断し、該切断がユビキチンのカルボキシル末端残基と非 ユビキチンタンパク質またはペプチドのα−アミノ基の間で起こるものである、 ユビキチン特異的プロテアーゼをコードするＤＮＡを含有する組換え発現ベクタ ー。 ９．該ＤＮＡが、図４に記載のヌクレオチド配列を有するか、あるいはその配列 中でこれによりコードされるプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に損 なうことなくヌクレオチド残基が付加、挿入、削除または置換されて、この配列 が修飾されている、請求項８記載の組換え発現ベクター。 １０．ユビキチン特異的プロテアーゼを発現することができる請求項８記載のベ クターにより形質転換された細胞。 １１．該細胞が微生物である、請求項１０記載の細胞。 １２．該細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１０記載の細胞。 １３．ユビキチン特異的プロテアーゼが、図４に記載のアミノ酸配列を有するか 、あるいはこの配列中でプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に損なう ことなくアミノ酸が付加、挿入、削除または置換されているこの配列の修飾配列 を有する、請求項１０記載の微生物。 １４．哺乳動物株化細胞を、請求項８記載のベクターで形質転換することにより 得られる、ユビキチン特異的プロテアーゼを発現することができる細胞培養物。 １５．ユビキチン特異的プロテアーゼが、図４に記載のアミノ酸配列を有するか 、あるいはその配列中においてプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に 損なうことなくアミノ酸が付加、挿入、削除または置換されてこの配列が修節さ れている、請求項１４記載の細胞培養物。 １６．下記の工程を有してなる、ユビキチンと任意の非ユビキチンタンパク質ま たはペプチドの間で、融合体タンパク質からユビキチンを切断する方法。 ａ）タンパク質分解による切断に適した条件下で、融合体タンパク質を請求項１ に記載のプロテアーゼに接触させる工程、および ｂ）該融合体タンパク質から遊離された非ユビキチン部分を回収する工程、 １７．該ユビキチン融合体タンパク質が、１番目の非ユビキチン部分と２番目の 非ユビキチン部分の間に融合されたユビキチン部分よりなるサンドイッチ融合体 である請求項１６記載の方法。 １８．１番目の非ユビキチン部分が、融合体タンパク質のアフィニティー精製を 容易にするものである請求項１７記載の方法。 １９．１番目の非ユビキチン部分が、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉ ｄｉｎ）である請求項１８記載の方法。 ２０．該プロテアーゼが、図４に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいはその 配列中においてプロテアーゼの活性または基質特異性を本質的に損なうことなく アミノ酸が付加、挿入、削除または置換されてこの配列が修飾されている、請求 項１６記載の方法。 ２１．その活性を阻害または修正するためにユビキチンの、タンパク質またはペ プチドとの融合体を作製し、それに引き続いて、ユビキチン特異的プロテアーゼ を用いてイン・ビトロまたはイン・ビボのいずれかで該融合体からユビキチンを 切断することにより、元の活性を回復することよりなる、ユビキチン部分の結合 により、ある活性が阻害または別のものに修正され得るタンパク質またはペプチ ドの機能的活性を、一時的に阻害または修正させる方法。 ２２．１番目と２番目の非ユビキチン部分の面でユビキチン部分が融合してなる 、請求項１６記載の融合体タンパク質。 ２３．１番目の非ユビキチン部分が、融合体タンパク質のアフィニティー精製を 容易にするものである請求項２２記載の融合体タンパク質。 ２４．１番目の非ユビキチン部分が、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉ ｄｉｎ）である、請求項２３記載の融合体タンパク質。