JPH03505527A - 精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ、それをコードするｄｎａ配列、およびポリペプチド回収の際のその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６５、ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項６４記載の宿主細胞。

６６、ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、ブロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはＤＮアーゼである請求項６５記載の宿主細胞。

６７、請求項１３記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズしないＤＮＡによってコー ドされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ。

６８、請求項１３記載の配列にハイブリダイズせず、少なくとも約１０個のヌク レオチドを含有する核酸配列を含有するユビキチン・ヒドロラーゼをコードして いる単離された核酸配列。

６９、少な（とも約２０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。

７０、少なくとも約３０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。

７１、少なくとも約４０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。

７２、ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項６８記載の核酸配列を含有する発現ベクター。

７３、　！Ｉ！１求項７求肥７２記載ベクターで形質転換された宿主細胞。

７４、原核性である請求項７３記載の宿主細胞。

７５、大腸菌である請求項７４記載の宿主細胞。

７６、ヒドロラーゼが緩衝液中に存在する請求項１記載の組成物。

７７、第１成ｔとしてユビキチン・ヒドロラーゼを、そして第２成分として固定 化した抗−ユビキチン抗体を含有するキット。

７８、第１成分として請求項７６記載の組成物を、そして第２成分として固定化 した抗−ユビキチン抗体を含有するキット。

明　　　細　　　　書 精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ、それをコードするＤＮＡ配列、およびポ リペプチド回収の際のその使用本発明は、ユビキチンータンパク質コンジュゲー トの切断において酵素活性を有するユビキチン・ヒドロラーゼの精製に関する。

また、本発明は、組換え法を用いてユビキチン・ヒドロラーゼを製造する方法、 およびそれを用いてポリペプチドとユビキチンの融合体からポリペプチドを単離 する方法にも関する。

ユビキチンとして知られるポリペプチドは保存性が高（，８，５６５の分子量を 有し、７６のアミノ酸残基を含んでいる。このポリペプチドは、他のタンパク質 と共に、または遺伝子間に全（停止コドンを含まずに繰り返される数の異なるタ ンパク質の配列を含む遺伝子によってコードされている。ユビキチンは、Ｒｅｃ ｈｓｔｅｉｎｅｒ［Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３４　：　ｌ−３０（１９８７）］、およ びＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、　Ｍ、編の”　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ″’（Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ　：　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８８）に概説されている。

ユビキチンは胸腺ペプチドの研究中に初めて精製された。このペプチドのラジオ イムノアッセイによって、これが植物、動物および酵母に広（見い出されるもの であることがわかった［Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ４−２２１８（１９７５）］ によって決定され、ＮＨ，−末端のメチオニンと７４キチンの分解された形態で あり、その生物学的機能において活性ではないことが後に示された。活性な形態 は７６アミノ酸の形態であユビキチンは細胞内タンパク質のエネルギー依存性の 分解に関与していることがわかった［Ｇａｎｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３　：　１２４１２−１２４１９（１９８８）］。

真真核物においては、ユビキチンのタンパク質への共有コンジュゲート化がタン パク質の選択的な分解に必須であるということが証明されている［Ｆｉｎｌｅｙ 　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＳｃＬ　 　１０　：　３４３−３４６（１９８５）　；およびＦｉｎｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｃｅ１ｌ　３７　：　４３（１９８４）コ。

真核生物に特有のイソペプチダーゼが同定された。これらはインビトロで、ユビ キチンのＧｌｙ−ＣＯＯＨ末端と他のポリペプチドのリジンのε−ＮＨ２基の間 で形成されるアミド結合を切断することが見い出された。例えば、イソペプチダ ーゼはユビキチンとリソチームの間の結合を切断して遊離のリソチームを生成さ せることが確認された［Ｂｅｒｓｈｋｏ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：　１６１９−１６２３（１９ ８４）］。また、未分解のヒストンの放出を伴ってエビキチン−ヒストン２Ａコ ンジユゲートを切断するイソペプチダーゼが網状赤血球抽出物において検出され た［Ａｎｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍｉｓｔｒｙ　２０ 　：１１００−１１０４（１９８１）　；　Ｋａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂ ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　８７０　：　６４|７ およびＨａａｓ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　７８　：　６８４５−６８４８（１９８１）コをも参照。

イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ならびに全ヒストンおよびヒストン Ｈ２Ａセファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって、イソペプチ ダーゼがウシ胸腺から１７５倍に精製された［Ｋａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９９　：　（４）　ＰＡ１３５（１９８４）］。この精 製されたインペプチダーゼは、構造クロマチンタンパク質Ａ２４中のε−（グリ シル）リジン結合に特異的であることがわかった。

インペプチダーゼが精製されると、これは増殖チャイニーズ・／％ムスター細胞 においては分子量２５０．０００および３４，０００を有する２つの主な形態で 存在することがわかったが、ヒト赤血球およびウシ胸腺においては分子量２５０ ．０００の形態でのみ存在することがわかった。大きい形態の分解によって小さ い方の形態が出現する結果にはならず、これら２つの形態の酵素は互いに別個の ものであることがわかった［Ｍａｔｓｕｉ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０５ 　：　（４Ｐａｒｔ　２）、１８７Ａ（１９８７）］。この著者は、大きい形態 は安定な構成酵素であり、早い回転速度を有する小さい形態は成長関連のユビキ チンータンパク質コンジュゲートの代謝経路に関与していると示唆している。ま た、銀染色の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて３０ｋＤａのインペプチダーゼ活性（カ ルボキシ末端ヒドロラーゼと呼ばれる）がヒト赤血球において同定されている［ Ｐｉｃｋａｒｔ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０ 　：　７９０３−７９１０（１９８５）］。この同じ酵素が、ユビキチンータン パク質融合体のプロセッシングに関与していると同様に、切断に関与しているこ ともある［Ｐｉｃｋａｒｔ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、　２６１　：　１０２１０−１０２１７（１９８６）］。この酵素は、小さい チオールのユビキチンエステルを加水分解することがわかっていたので、以前は ユビキチン力ルボキシ末端エステラーゼと呼ばれていた［Ｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｗ ａｒｍｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　：　４２３４−４２３７（１９ ８３）］。

１０８８１０２４０６（１９８８年４月７日公開）に、人工のユビキチンータン パク質融合体の使用を導入することに基づいて特定のアミノ末端を得るためにタ ンパク質または遺伝子レベルでタンパク質構造を設計または修飾するということ に関連して、プロセッシングプロテアーゼの活性が報告されている。

ユビキチンアルデヒドはほとんどのヒドロラーゼと強固なコンプレックスを形成 することがわかっている；例えば、２０ＱｋＤａ以上の大きいユビキチンータン パク質ヒドロラーゼ、小さい３０ｋＤａカチオン性ヒドロラーゼ、およびユビキ チンの低分子量コンジュゲートに作用する３０ｋＤａの大きいヒドロラーゼ［Ｒ ｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｆｅｄ、　Ｐｒ。

ｃ、　４６　：　（６）、２０８７（１９８７）］。ユビキチンヒドロラーゼは 、小さい求核基による捕捉からユビキチンを守るのに重要であるのに加えて、徐 々にしか分解されないタンパク質コンジュゲートからユビキチンを再生利用する ために必要であると結論された。

種々の生物由来のユビキチンをコードしている遺伝子の分子遺伝学的方法による 最近の分析によって、ユビキチンは、多数の連続したユビキチン配列を有するポ リュビキチン前駆体として、あるいはユビキチンがさらに大きなタンパク質のＮ −末端ドメインに位置しているタンパク質融合体として合成されることが示され た［ＯｚｋａｙｎＣｈｅｗ、　２６０　：　７６０９−７６１３（１９８５）コ 。ポリュビキチン遺伝子中のユビキチン配列の最後のコピーには、通常、特有の Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ末端の後ろに１つのアミノ酸延長部分が続いている［０ ｚｋａｙｎａｋ　ｅｔ　ａｌ、　：上記］。

ユビキチンータンパク質コンジュゲートの切断に関する別の発見によって、ユビ キチンーβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をコードしているキメラ遺伝子が 酵母中で発現されたときには、ユビキチンはこの融合タンパク質から切断され、 脱ユビキチン化されたβ−ガラクトシダーゼが生成することが明らかになった。

この内タンパク質加水分解は、１つの例外を除いて、ユビキチンーβ−ｇａｌ連 結点のβ−ｇａｌのアミノ酸残基の性質によらず起こることがわかった［Ｂａｃ ｂａ＋ａｉｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４　：　１７９−１８ ６（１９８６）ｌｏまた、別の残基をその他は同一のβ−ｇａ１タンパク質のア ミノ末端のところで暴露することもできることがわかった。これらの著者は、そ の時点で生化学的に特徴付けられていない同一のプロテアーゼが、ポリュビキチ ンの成熟ユビキチンへの変換、および形成期ユビキチンーβ−ｇａｌタンパク質 の脱ユビキチン化の両方の原因であると示唆している。

組合せのインビトロ転写／翻訳系を用いたときにポリュビキチンをユビキチンに 変換するタンパク質加水分解活性が異なる研究者によって検出された［Ａｇｅｌ ｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　　１０５　：　（４ｐｔ　２） 、８２ａ（１９８７）　：およびＡｇｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　３６９３−R ６９７（１９８８）］。］ポリュビキチンプロセッシング活は、ユビキチン・ヒ ドロラーゼの既知の阻害物質であるユビキチンアルデヒドによって部分的に阻害 された。このタンパク質加水分解活性の精製された調製物は不活性であることが わかり、次いで推定のプロテアーゼの尚一層の精製が進行中であることが報告さ れた。

１９８８年９月２６日のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ の会議で、ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐ、は、直接発現させることが難しいことがわか りている遺伝子を酵母ユビキチンの合成遺伝子に融合させると、内生の酵母プロ テアーゼによってインビボで切断された成熟ポリペプチドとして所望のタンパク 質が高レベルで細胞内生産されることが可能になることを開示した。１９８８　 ＡＣＳ　人ｂｓｔｒａｃｔ　Ｂｏｏｋ、＾ｂｓ、　Ｎｏ、３４．　ＰＪ、Ｂａｒ ｒ　ｅｔａｌ、、ｒ酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに おける組換えＤＮＡ誘導の医薬の製造」を参照。

切断などの不可逆的な工程を用いる物質の精製に関して、ある次元での大きさま たは電荷、次いで第２の次元での可視化のためにタンパク質フラグメントを不可 逆的に変えるのに用いる試薬によってタンパク質フラグメントを分離し得ること が報告されていた。この研究の目的はタンパク質からアミノ酸配列を得ることで あった［Ｂａｒｔｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｊ、　　８０ 　：　　３６（１９６１）コ。

さらに、「識別」ペプチドを用いて融合産物からタンパク質を回収および精製す ることが知られている［ＥＰ　１５０．１２６（１９８５年７月３１日公開）： 米国特許Ｎ　ｏ、　４．７０３．００４と同等コ。この方法では、識別ペプチド を用い、この識別ペプチドのＣ−末端に所望の機能的タンパク質を融合させてハ イブリッドのポリペプチドを合成する。この識別ペプチドの結合部分を、配列特 異的なタンパク質加水分解酵素または化学的試薬を用いて機能的タンパク質に隣 接する特異的なアミノ酸残基のところで切断する。このハイブリッドのポリペプ チドを、識別ペプチドの抗原部分に特異的な固定化配位子を用いるアフィニティ ー・クロマトグラフィーによって精製する。次いで、単離したハイブリッドのポ リペプチドから、適当なタンパク質加水分解試薬を用いてタンパク質を切断し、 成熟した機能的タンパク質を放出させる。

また、識別ペプチドリンカ−または抗体を用いる融合体からの産物の回収も開示 されている［ＥＰ　３５．３８４（１９８１年９月９日公開）、および米国特許 Ｎ　ｏ、　４．７３２．８５２（１９８８年３月２２日発行）］。さらに、荷電 したアミノ酸ポリマーとの融合産物としてのポリペプチドの組換え製造、ポリマ ーの性質に基づく不純物からの融合産物の分離、およびエキソペプチダーゼを用 いる融合産物からのポリマーの切断も報告されている［米国特許Ｎｏ、　４．５ ３２．２０７（１９８５年７月３０日発行）コ。

組換え法によって得られた融合タンパク質を切断する際に付随する主な問題は、 正確かつ一定して生成タンパク質から融合タンパク質部分を除去するための特異 的な切断試薬が存在しないことである。

臭化シアンもしくはヒドロキシアミンなどの化学的試薬、または因子Ｘａもしく はコラゲナーゼなどの特異的なプロテアーゼ（通常、これらは切断を行うために 用いられる）は、通常、限定された数のタンパク質融合切断において工業的に有 用であるにすぎない。

例えば、融合タンパク質の切断に必要とされる特異的なアミノ酸（臭化シアンの ためのメチオニンなど）が所望のタンパク質産物のアミノ酸配列の内部に存在し ているときには、この産物は融合ポリペプチドから切断されると共に内部でも切 断されるであろう。この理由およびその他の理由により、通常、切断試薬はある タンパク質産物に対してだけ特異的である。さらに、切断それ自体が生成タンパ ク質に余分のアミノ酸残基を残すこともある。また、切断試薬のほとんど全てが 、切断後に生成したさらに複雑な混合物を精製するために余分の回収工程を必要 とする。

従って、本発明の目的は、配列決定をすることができる程度に十分精製されたユ ビキチン・ヒドロラーゼを提供することである。

別の目的は、組換え法を用いてユビキチン・ヒドロラーゼを製造することにより 、供給源タンパク質を含まない工業用に有用な大量のユビキチン・ヒドロラーゼ を提供することである。

さらに別の目的は、これまで確認されていなかった酵母のユビキチン・ヒドロラ ーゼを得るための方法を提供することである。

他の目的は、成熟ポリペプチド製造し、精製するための方法であって、特異的か つ効率的に生成物部分から融合タンパク質部分を除去すること、融合体回収工程 の数および複雑さを減少させること、および余分の不要な末端アミノ酸残基を含 まない正確かつ再現性ある生成物の切断を得ることを特徴とする方法を提供する ことである。

これらおよびその他の目的は当業者には明らかであろう。

本発明の１つの態様においては、これらの目的は、組成物中の全タンパク質の重 量に基づいて少なくとも７０％均質性の純度のユビキチン・ヒドロラーゼを含有 する組成物によって達成される。

別の態様においては、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼを精製するための方 法であって、 （ａ）真核細胞発酵ペーストをホモジナイズし、このホモジネートからユビキチ ン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を回収し；（ｂ）工程（ａ）で回収したヒ ドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含有する沈澱物を塩沈 澱させ；（ｃ）この沈澱物の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン・ヒ ドロラーゼ活性の分画を回収し： （ｄ）ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティー樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し； （ｅ）ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィー樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し： そして （ｆ）ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画をイオン交換樹脂と接触させ、ヒド ロラーゼ活性の分画を回収することを特徴とする方法を提供するものである。

さらに別の態様において、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼまたはそのフラ グメントもしくは変異体をコードしている配列を含有する単離された核酸配列、 ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機能的に 結合した該核酸配列を含有する発現ベクター、および該ベクターで形質転換され た宿主細胞を提供するものである。この核酸はＤＮＡであるのが好ましいが、Ｒ ＮＡまたはＲＮＡベクター（レトロウィルス）であってもよい。

さらに具体的な態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件下で第５図 のＤＮＡ配列とハイブリダイズする配列であって、少なくとも約１０個のヌクレ オチドを含有する配列を含有する単離されたＤＮＡ配列を提供するものである。

このＤＮＡ配列は、好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、さらに好ま しくは約３０個のヌクレオチド、最も好ましくは約４０個のヌクレオチドを含有 している。

さらに別の態様においては、本発明は、ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配 列を十分に複製するアミノ酸配列を有する酵素であって、ユビキチンとポリペプ チドを結合させているアミド結合のところでユビキチンーポリペプチドコンジュ ゲートを加水分解し、それによってコンジュゲート化されていない成熟Ｎ−末端 を有する無傷のポリペプチドを与える酵素をコードしているＤＮＡ配列を含有す る単離されたＤＮＡ配列を提供するものである。また、本発明は、適当なコント ロール配列に機能的に結合したそのようなりＮＡ記列を含有する発現ベクター、 およびそのようなベクターで形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）などの宿主 をも提供するものである。

他の態様においては、本発明は、ユビキチンーポリベブチドコンジュゲートをイ ンビトロで切断するための方法であって、（ａ）組換え宿主細胞培養の不純生成 物を含有する組成物においてユビキチンーポリペブチドコンジュゲートを得（こ こで、該ポリペプチドはユビキチンのＣ−末端にコンジュゲートしており、また 、該ポリペプチドはそのＮ−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有してい る）； （ｂ）この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し、試薬からコンジュゲートを回収し： （Ｃ）回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと接触させることに よってコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水分解し、ユビキチ ン・ヒドロラーゼを固定化し：そして（ｄ）工程（Ｃ）で得られた物質をユビキ チンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させて残留コンジュゲートおよ び遊離ユビキチンの全てを試薬に吸着させ、試薬およびそれに吸着した物質を含 まないポリペプチドを回収すること を特徴とする方法に関する。

さらに異なる態様においては、本発明は、ユビキチンーポリベブチドコンジュゲ ートをインビトロで切断するための方法であって、（ａ）組換え宿主細胞培養の 不純生成物を含有する組成物においてユビキチンーポリベプチドコンジュゲート を得（ここで、該ポリペプチドはユビキチンのＣ−末端にコンジュゲートしてお り、また、該ポリペプチドはそのＮ−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含 有している）； ＜ｂ＞この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し；（ｄ）コンジュゲートが吸着した試薬をユビキチン・ヒ ドロラーゼと接触させ； （ｅ）試薬からヒドロラーゼとポリペプチドを分離し；そして（ｆ）ヒドロラー ゼからポリペプチドを分離することを特徴とする方法に関する。

別の態様においては、本発明は、ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートをイ ンビボで切断するための方法であって、（ａ）染色体中に組込まれたユビキチン ・ヒドロラーゼをコードしているＤＮＡを有し、そしてユビキチンーボリペブチ ドコンジュゲートをコードしているヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで 形質転換された原核宿主細胞を培養してコンジュゲートを発現させ（ここで、該 ポリペプチドはユビキチンのＣ−末端にコンジュゲートしており、また、該ポリ ペプチドはそのＮ−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有している）；そ して（ｂ）ユビキチン（これにポリペプチドがコンジュゲートしていた）を含ま ないポリペプチドを培養細胞から回収することを特徴とする方法を提供するもの である。

さらに別の態様においては、本発明は、染色体中に組込まれたユビキチン・ヒド ロラーゼをコードしているＤＮＡを有する原核宿主細胞を提供するものである。

これらのうちで最も好ましいのは、ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートを コードしているヌクレオチド配列を含有する発現ベクターによっても形質転換さ れている宿主細胞である（ここで、該ポリペプチドはユビキチンのＣ−末端にコ ンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのＮ−末端にプロリン以外の 任意のアミノ酸を含有している）。

また、本発明は、少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約 ２０個、より好ましくは少なくとも約３０個、最も好ましくは少なくとも約４０ 個のヌクレオチドを含有し、そして第５図のＤＮＡ配列にストリンジェントな条 件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列にハイブリダイズしないＤＮＡによってコ ードされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼに関する。同様に、本 発明は、上に規定したＤ　Ｎ　Ａ配列にハイブリダイズしない核酸配列を含有す るユビキチン・ヒドロラーゼをコードし７ている単離された核酸配列を提供する ものである。さらに、本発明は、ベクターで形質転換された宿主によって認識さ れるコントロール配列に機能的に結合したこの核酸配列を含有する発現ベクター を提供するものである。最後に、本発明はこの発現ベクターで形質転換された宿 主細胞を提供するものである。

別の態様においては、本発明は、緩衝液中に本発明のユビキチン・ヒドロラーゼ を含有している酵素組成物、ならびに第１の成分としてユビキチン・ヒドロラー ゼおよび第２の成分として固定化した抗−ユビキチン抗体を含有するキットを提 供するものである。

本発明は、組換え法によってユビキチン・ヒドロラーゼまたはその誘導体を製造 すること、ならびにそのような製造に関連した産物および方法を提供することを 可能にするものである。さらに、本発明は、別のタンパク質との融合体から成熟 タンパク質およびポリペプチドを回収するための簡単かつ効率的な方法を可能に するものである。また、本発明は、望ましくない位置での切断または分泌につい て配慮することな（変異ポリペプチドおよびタンパク質を発現させることを可能 にするものである。

本発明のインビボ切断法は、細胞中で通常は不安定であるか、または分泌される ことが望ましくない、原核生物からのポリペプチドの細胞内産生を可能にする（ 例えば、Ｎ−末端メチオニンを有さないヒト成長ホルモンおよびγ−インターフ ェロンなど）。前者の場合には、Ｎ−末端メチオニンは産生中に存在している必 要がなく、タンパク質が培地から回収された後に除去される必要もない。

第１ａ図は、ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているＸｂａＩからＨｆｎ ｄＩＩＩまで延びる合成遺伝子の配列を示すものである。ここで、ポリペプチド は、ヘキサペプチドに結合した３２アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖（Ｎ −末端アミノ酸を欠き、そのＮ−末端で結合している）である。このヘキサペプ チドは、次にそのＮ−末端のところでユビキチンのＣ−末端に結合している。こ の６アミノ酸はどのような天然配列をもコードしていない。

第１ｂ図は、ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているＤｒａＩＩＩからＨ ｉｎｄＩＩＩ部位まで延びる合成遺伝子の配列を示すものである。ここで、ポリ ペプチドは３３アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖である。

第１ｃ図は、Ｔ７ボリメラーゼ（Ｐｉ□）によって認識されるｐｈｉｌＯプロモ ーターを与える中間プラスミドであるｐＴ７−１２ＴＮＦの構築を示すものであ る。

第１ｄ図は、ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の検定に用いられるユビキチン融合 ポリペプチドを含有するいくつかのベクターのｐＴ７−１２ＴＮＦからの構築を 示すものである。ｐＴｒｐＬＪｂｓ−Ｘ系列のプラスミドは、ユビキチン融合ポ リペプチドを大量に製造する際に工業的に有用である。

第２図は、ユビキチン・ヒドロラーゼ検定を図式的に示すものである。

第３図は、酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ（本明細書中ではＹＵＨ−１と呼ぶ） のヌクレオチド配列および予想のアミノ酸配列を示すものである。タンパク質の 予想アミノ酸はＤＮＡ配列の下に示し、タンパク質配列の提案Ｎ−末端の第１残 基から数を付した。また、この図には、酵母ゲノムライブラリーをスクリーニン グして酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしているクローンを得るためのＰ ｒｏｂｅ　１を導（のに用いられるポリペプチドのアミノ酸配列も示されている 。

第４図は、酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている遺伝子を配列決定す るためのＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９中のＢａｎＨｌ−８ａｉｌフラグ メントの配向を示すものである。

第５図は、第３図に示されている酵母ユビキチン・ヒドロラーゼＹＵＨ−１のヌ クレオチド配列および予想アミノ酸配列ならびにそれと境界を接するＨｆｎｄＩ ＩＩからＢａｍＨＩまでの領域を示すものである。３つの配列決定されたペプチ ド（１４，８および１７と数を付した）の位置は星印で示した。５３−ｍａｒの プローブ配列を正しいＤＮＡ配列の下に示した。誤対合は小文字で示した。この プローブは正しいＤＮＡ配列に８７％一致している。

第６図は、大腸菌を形質転換してユビキチン・ヒドロラーゼを過産生させるため に用いるｐＴＲＰ−ＵｂｉＡ由来の発現プラスミドｐＴＲＰ−ＹＵＨの構築を示 すものである。

第７図は、大腸菌をｐＴＲＰ−ＹＵＨで形質転換し、誘導条件下（レーンａ）も しくは非誘導条件下（レーンｂ）で増殖させたときに産生されるタンパク質産物 、および均質になるまで精製した産物（レーンＣ）の５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲルを示すものである。ｒＨＪは、ユビキチン・ヒドロラーゼのバンドの位置 を示す（２６ｋＤのところ）。

第８図は、ｐＴＲＰ−ＹＵＨから調製され、そして大腸菌株のゲノム中に組込ま れるラムダｇｔｌｌ　ＴＲＰ−ＹＵＨの構築を示すものである。

第９図は、Ｔ７ボリメラーゼによって認識されるｐｈｉｌＯプロモーターおよび ５ＴＩＩシグナルを供給する中間プラスミドであるｐＴ７−１２ＳＴ２ＨＧＨの 構築を示すものである。

第１０図は、ｐｈｉｌＯプロモーターの転写支配下にある５ＴＩＩ−ｔＰＡ遺伝 子を有するｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１ベクターの組立てにおける最終工程を 示すものである。

第１１図は、ｐＡＰＳＴ２ＩＦＮ−７ΔＮｄｅ　ｌ　−Ａｖａ　Ｉの構築を示す ものである。

第１２図は、ｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１およびｐＡＰｓＴ２ＩＦＮ−７ΔＮ ｄｅ　ｒ　−Ａｖａ　Ｉからの、ｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡの構築を示すものであ る。

第１３図は、Ｉ）Ｔ７−３ＳＴ２ＴＰＡおよびｐＴＲＰ−ＵｂｉＡからの、ｐｈ ｉｌｏプロモーターによって誘導されるユビキチンーレラキシンＡ融合合成りＮ Ａフラグメントを含有するｐＴ７−３ＵｂｉＡＰの構築を示すものである。

第１４図は、ＹＵＨ−１遺伝子を発現する、ラムダｇｔｌｌＴＲＰ−ＹＵＨをゲ ノム中に組込んだ大腸菌株において、ｐＴ７−３ＵｂｉＡＰおよびｐＴ７−１２ ＵｂｉＢから発現されたユビキチンーレラキシンＡおよびユビキチンーレラキシ ンＢ融合ポリペプチドのインビボ切断によって得られたタンパク質産物の５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲルを示すものである。

第１５図は、ｐＣＧＹ３７９の構築を示すものである。

第１６図は、ｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡおよびｐＣＧＹ３７９からの、遮断された ＹＵＨ−１遺伝子を含有するｐＹＵＨ：：ＵＲＡ３の構築を示すものである。

第１７図は、未遮断および遮断されたＹＵＨ−１遺伝子それぞれについての、５ ａｌＩからＥｃｏＲＩまでの０．８４７および１．９５ｋｂフラグメントを示す ものである。

第１８図は、ＹＵＨ：：ＵＲＡ３遺伝子遮断を含有する５ａｉｌ　−ＥｃｏＲＩ フラグメントで形質転換した二倍体および一倍体酵母のサザーン・プロットを示 すものである。

Ａ、定義 本明細書で用いる「ユビキチン・ヒドロシーゼコなる用語は、ユビキチン・ヒド ロラーゼの生物学的活性を有する酵素を意味し、天然分子の配列を有しているか 、またはその誘導体もしくはアミノ酸配列変異体であるかを問わない。生物学的 活性とは、（ａ）ユビキチンーポリペブチドコンジュゲートをユビキチンとポリ ペプチドを結合させているアミド結合のところで加水分解し、それによってコン ジュゲート化さねていない成熟Ｎ−末端を有する無傷のポリペプチドを与える能 力、または（ｂ）第５図のポリペプチドに結合する抗体と交差反応する能力の一 方または両方である。少なくとも２種類の天然の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ タンパク質が存在する。第５図のアミノ酸配列を有するものに対応するこれらの うちの一方の完全長の形態は、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約２９．０００ダル トンの分子量を有する。クローンされた遺伝子由来のアミノ酸配列は分子量が２ ６．０００ダルトンであることを示した。通常、この酵素は真核生物由来である 。

誘導体およびアミノ酸配列変異体は、天然ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸 配列またはその他の特徴が共有結合によって、または非共有結合によりて修飾さ れた分子であると定義される。アミノ酸配列酵母変異体には、第５図の配列のア レルが含まれるだけでなく、予め決めたその突然変異体も含まれる。通常、アミ ノ酸配列変異体は、天然のユビキチン・ヒドロラーゼ、例えば第５図に示したも ののアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性、より普通には少なくと も約９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有している。以後、他に記すことがな ければ、「ユビキチン・ヒドロラーゼ」なる用語は、天然配列または変異形態の ものの全てを意味するものとする。

即ち、本発明の範囲内に含まれるのは、第５図に示されるアミノ酸配列を有する 酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ（ＹＵＨ−１）、他の微生物、を椎動物もしくは 非を椎真核生物種由来の類似のユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質（例えば、 昆虫、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、ネコのユビキチン・ヒ ドロラーゼなど）、低ストリンジエンシーの条件下であっても第５図に示したヌ クレオチド配列とハイブリダイズしないＤＮＡによってコー・ドされている酵母 ユビキチン・ヒドロラーゼ（本明細書ではＹＵＨ−２と呼ぶ）、ならびにこれら のユビキチン・ヒドロラーゼの生物学的に活性なアミノ酸配列変異体であり、酵 素活性を示すユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質のアレルおよびインビトロ生 成の共有結合変異体を含む。

「ポリペプチド」なる用語は、１以上のペプチド結合を有する産物を指し、ジペ プチド、トリペプチド、および任意の大きさのタンパク質、またはそれらの突然 変異体もしくはそれらのフラグメントが含まれる。

「ユビキチンーポリペブチドコンジュゲート」なる用語は、ユビキチンのＣ−末 端のところでユビキチン（７６番目のアミノ酸はグリシンである）が上記定義の ポリペプチドにコンジュゲートしたものを意味する（ここで、該ポリペプチドは そのＮ−末端残基としてプロリン以外の任意のアミノ酸を有している）。

「少な（とも７０％の均質性」なる表現は、銀染色のＳ　Ｄ　５−ＰＡＧＥゲル のバンドの相対的な強度について視覚精査を比較することによって測定した、全 タンパク質中のユビキチン・ヒドロラーゼの重量を意味する。

「緩衝液」なる用語は、通常は３〜１０近辺の、より好ましくは４〜８の適当な ｐＨ範囲で本発明の酵素を安定化させるその能力によって特徴付けられる緩衝液 を意味する。

本発明のユビキチン・ヒドロラーゼを精製する際に包含される工程を以下に列挙 する。この方法は組換えまたは弁組換え細胞由来のユビキチン・ヒドロラーゼを 精製するのに有用である。

真核細胞、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど の酵母または他の酵母株を当分野で既知の標準条件を用いて発酵させ、発酵ペー ストを得る。このペーストをホモジナイズし、このホモジネート由来のユビキチ ン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を好ましくは遠心によって回収する。その 活性を実施例に記載したようにして検定することができる。

回収したヒドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含む沈澱を 塩析させる。硫酸アンモニウム分別を用いて塩析を行うのが好ましいが、この目 的に適する任意の塩を用いることができる。

沈澱の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画 を回収する。好ましいイオン交換樹脂はＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムであ り、このカラムに分画を吸着させ、モしてカラムから回収する。

ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティー樹脂（例えば、 フェニル、オクチル１．またはセチルセファロースのクロマトグラフィーカラム ）と接触させ、この樹脂に吸着したユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を得、 これを回収する。次の工程を行う前に、この工程で回収した分画を緩衝液に対し て透析するのが好ましい。

このユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィー樹脂（例え ば、ヒドロキシアパタイトまたはシリカカラム）と接触させ、この樹脂に吸着し たユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収する。次の工程を行う前に、この 工程で回収した分画を緩衝液に対して透析するのが好ましい。最も好ましいのは 、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで吸着クロマトグラフィーを 行い、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収することである。

ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を、もう一度、ＤＥＡＥクロマトグラフィ ーカラムなどのイオン交換樹脂と接触させ、ヒドロラーゼ活性の分画をこのカラ ムに吸着させ、そしてそれから回収する。

次いで、通常はこのユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画からユビキチン・ヒド ロラーゼを少なくとも７０％の純度（全タンパク質重量の）で単離する。この単 離工程に液体クロマトグラフィーを用いることもできる。

２、ユビキチン・ヒドロラーゼの修飾 ユビキチン・ヒドロラーゼの誘導体およびアミノ酸配列変異体は、本明細書中の 他の箇所に記載したようなそれらの酵素活性の故に、ならびに抗−二ビキチン・ ヒドロラーゼ抗体に結合するそれらの能力の故に有用である。後者の性質を保持 する誘導体および変異体は、これらの誘導体および変異体が酵素活性を維持して いるか否かを問わず、抗体の精製に、あるいはラベルされたときにはユビキチン ・ヒドロラーゼの免疫検定における試薬として有用である。

ａ、共有結合による修飾 ユビキチン・ヒドロラーゼ分子の共有結合修飾が本発明の範囲内に含まれる。約 １００までの残基を有する変異ユビキチン・ヒドロラーゼフラグメントは、イン ビトロ合成によって好都合に製造することができる。このような修飾は、精製ま たは粗製のタンパク質の標的アミノ酸残基を、選択した側鎖または末端残基と反 応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによって分子中に導入す ることができる。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性に重要な残基の識別 に関する計画において有用である。

システイニル残基は、α−ハロアセテートおよび対応するアミン、例えばクロロ 酢酸またはクロロアセトアミドなどと反応させて、カルボキシメチルまたはカル ボキシアミドメチル誘導体を得るのが最も普通である。また、システイニル残基 は、プロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロ ピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２− ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−タロロメルクリ ベンゾエート、２−クロロヌルクリ−ニトロトロフェノール、またはクロロ−７ −ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化 される。

ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５，５〜７゜０で反応させ ることによって誘導体化されるが、これは、この試薬がヒスチジル側鎖に比較的 特異的であるためである。また、ｐ−ブロモフェナシルプロミドも有用である； この反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６，０で行われる 。

リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応さ せる。これら試薬による誘導体化はリジニル残基の電荷を逆にする作用を有して いる。α−アミノを含有する残基の誘導体化に適するその他の試薬には、ピコリ ンイミド酸メチルなどのイミドエステルニリン酸ビリドキサル：ビリドキサル； 水素化クロロホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；０−メチルイソ尿素：２ ．４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒の 反応が含まれる。

アルギニル残基は、１または数種の通常の試薬、特にフェニルグリオキサル、２ ，３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの 反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高 いｐＫ、の故にアルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬 はリジンの基ならびにアルギニンのε−アミノ基とも反応することができる。

チロシル残基自体の特異的な修飾は広く研究されており、特に、芳香族ジアゾニ ウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクト ルラベルを導入することに興味が持たれている。Ｎ−アセチルイミダゾールおよ びテトラニトロメタンを用いてそれぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニト ロ誘導体を得るのが最も普通である。１２＋１Ｊまたは１３１１を用いてチロシ ル残基をヨウ素してラジオイムノアッセイで用いるためのラベルされたタンパク 質を調製する（上記のクロラミンＴ法が適している）。

カルボキシ側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’ −Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば１−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル） −（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４， ４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどとの反応によって選択的に修飾され る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反 応によってアスパラギニルおよびグルタミル残基に変換される。

２官能性試薬による誘導体化は、ユビキチン融合ポリペプチドを切断して切断さ れたポリペプチドを放出させ、そして回収するための方法に用いる水不溶性の支 持マトリックスまたは表面にユビキチン・ヒドロラーゼを架橋させるのに有用で ある。通常用いられる架橋剤には、例えば１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２ −フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル（４−アジドサリチル酸とのエステルなど）、ホモ２官能性のイミドエステル ［３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシン イミジルエステルを含むコ、および２官能性のマレイミド（ビス−Ｎ−マレイミ ド−１，８−オクタン）などが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル ）ジチオコプロビオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成す ることができる光活性化しつる中間体を与える。別の方法によれば、臭化シアン 活性化した炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックスおよび米国特許Ｎｏ、 　３．９６９゜２８７　、３．６９１．０１６　；　４．１９５．１２８　；　 ４．２４７．６４２　：　４．２２９．５３７　、および４．３３０゜４４０に 記載されている反応性基質をタンパク質の固定化に用いる。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基は対応するグルタミルおよびアスパルチ ル残基に脱アミド化されることが多い。別法では、これらの残基は穏やかな酸性 条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る 。

他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはトレオニル 残基のヒドロキシ基のホスホリル化、リジン、アル：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａ ｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　１．Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ 　＆　Ｃｏ、　、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｐｐ、７９−８６（１９８３ ）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびにある場合にはＣ−末端力ルポキシ 基のアミド化が含まれる。

ｂ、ＤＮＡ中の突然変異 また、ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配列変異体はＤＮＡ中の突然変異に よって調製することができる。このような変異体には、例えば第３図に示したア ミノ酸配列中の残基の削除、挿入または置換が含まれる。また、最終の構築物が 所望の活性を保持しているなら、任意の組合せの削除、挿入および置換を行って 最終構築物を得ることができる。変異体をコードしているＤＮＡ中で行われる突 然変異がこの配列をリーディング・フレーム（読み枠）の外に置くものであって はならず、また、好ましくは２次的なｍＲＮＡ構造を与える相補領域を生じない ものであることは明らかであろう［ＥＰ　７５゜４４４Ａを参照］。

遺伝子レベルにおいて、通常、これらの変異体はユビキチン・ヒドロラーゼをコ ードしているＤＮＡ中のヌクレオチドの部位指向性の突然変異誘発によって調製 され、これによって変異体をコードしているＤＮＡを得、次いでこのＤＮＡを組 換え細胞培養において発現させる。通常、この変異体は、天然の類似体と同じ性 質の生物学的活性を示す。

アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決められるが、突然変異それ自体は予め 決める必要がない。例えば、ある部位での突然変異の実施を最適にするために、 ランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域において行い、発現されたユビキ チン・ヒドロラーゼ変異体を所望の活性の最適の組合せについてスクリーニング することができる。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決めた部位で置換突然変 異を行う方法は周知である（例えば、部位特異的な突然変異誘発など）。

本発明に従うユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の製造は、先に調製したこのタン パク質の変異または非変異形態をコードしているＤＮＡの部位特異的な突然変異 誘発によって行うのが好ましい。所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードしている 特異的なオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドを用い、 横断される削除連結点の両側に安定な２重螺旋を形成させるに十分な大きさと配 列の複雑さを有するブライマー配列を得ることによって、部位特異的な突然変異 誘発はユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の製造を可能にする。通常は、長さが約 ２０〜２５ヌクレオチドの、配列の連結点の両側の約５〜１０残基が変えられた ブライマーが好ましい。

この部位特異的な突然変異誘発の方法は一般に当分野で周知である［例えば、Ａ ｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＤＮＡ　ｇ　：　１８３（１９８３）の開示 によって例示されるコ。

通常、部位特異的な突然変異法は１本鎖および２本鎖の両形態で存在するファー ジベクターを用いることは理解されよう。部位指向性の突然変異誘発で有用な典 型的なベクターには、例えばＭｅｓｓｉｎｇるＭ１３ファージなどのベクターが 含まれる。これらのファージは市販品から容易に入手することができ、通常、そ の使用は当業者に周知である。別法では、１本鎖のファージ複製起点を含有する プラスミドベクター［Ｖｅｉｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　１５３　＋　３（１９８７）］を用いて１本鎖のＤＮＡを得ることができる。

通常、本発明に従う部位指向性の突然変異誘発は、始めに関連タンパク質をコー ドしているＤＮＡ配列をその配列内に含有する１本鎖ベクターを得ることによっ て行われる。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを、通 常は合成によって、例えばＣｒｅａ等［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ７５　：　５７６５（１９７８）コの方法によって調製する。次 いで、このブライマーを１本鎖のタンパク質配列含有のベクターとアニーリング させ、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウフラグメントなどのＤＮＡ重合化酵素にさ らし、突然変異保持の鎖の合成を完結させる。即ち、第１の鎮が元の非突然変異 配列をコードし、第２の鎖が所望の突然変異を保持しているヘテロ２本鎖が形成 される。次いで、このへテロ２本鎖ベクターを用いてＪＭＩＯＩ細胞などの適当 な細胞を形質転換し、突然変異配列を有する組換えベクターを含有するクローン を選択する。

このようなりローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り、タンパ ク質製造のための適当なベクター（通常、適当な宿主の形質転換に用いることも できる種類の発現ベクター）中に設置することができる。

（以下、余白） Ｃ０突然変異の種類 通常、アミノ酸配列の削除は約１〜３０残基の範囲内、より好ましくは１〜１０ 残基の範囲内であり、普通は連続している。

アミノ酸配列挿入体には、１個の残基から実質的に制限されない長さのポリペプ チドまでのアミノ−および／またはカルボキシ−末端融合体、ならびに１個また は複数のアミノ酸残基の配列内挿入体が含まれる。通常、配列内挿入（即ち、成 熟ユビキチン・ヒドロラーゼ配列内の挿入）は、約１〜１０残基の範囲内であり 、より好ましくは１〜５残基である。末端挿入の例には、組換え宿主からの成熟 ユビキチン・ヒドロラーゼの分泌を容易にするための、ユビキチン・ヒドロラー ゼのＮ−末端へのシグナル配列（宿主細胞に対して異種であるか、または同種で あるかを問わない）の融合が含まれる。

第３の群の変異体は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子中の少な（とも１つのアミ ノ酸残基（好ましくは１つだけ）が除去され、その位置に別の残基が挿入されて いるものである。そのような置換は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子の性質を微 妙に調節することが所望であるときに以下の第１表に従って行うのが好ましい。

元の残基　　　　　　　　　　　　　　　　置換例Ａｌａ　　　　　　　　　　 　　　　　　　ｇｌｙ　；　ｓｅｒＡｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　 １ｙｓＡｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｉｎ　；　ｈｉｓＧ　Ｉｎ 　　　　　　　　　　　　　　　　　ａｓｎＧ　ｌｕ　　　　　　　　　　　　 　　　　　ａｓｐＧｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　ａｌａ　；　ｐｒ 。

Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　ａｓｎ　；　ｇｉｎＩ　ｌｅ　　　 　　　　　　　　　　　　　　ｌｅｕ　；　ｖａｌＬｅｕ　　　　　　　　　　 　　　　　　　ｉｌｅ　；　ｖａｌＬ　ｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　 　ａｒｇ　；　ｇｉｎ　；　ｇｌｕＭｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｌｅｕ　；　ｔｙｒ　；　１ｌｅＰ　ｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｍｅｔ　；　ｌｅｕ　；　ｔｙｒＴｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｔ ｒｐ　；　ｐｈｅＶａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｉｌｅ　；　ｌｅ ｕ第１表のものより保存性が少ない置換を選択することによって、即ち、（ａ） 置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座 、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ 、を維持するその作用がもっと有意に異なりでいる残基を選択することによって 、機能または免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通常、ユビキチン・ ヒドロラーゼの性質に最大の変化をもたらすと予想される置換は、ＣＢ）グリシ ンおよび／またはプロリンが他のアミノ酸によって置換されたか、または削除も しくは挿入されているもの：（ｂ）親水性の残基（例えば、セリルまたはトレオ ニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル 、バリルまたはアラニル）に代えて（または、によって）置換されているもの； （Ｃ）システィン残基が他のいずれかの残基に代えて（または、によって）置換 されているもの；（ｄ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギ ニルまたはヒスチジル）が、電気陰性の電荷を有する残基（例えば、グルタミル またはアスパルチル）に代えて（または、によって）置換されているもの；また は（ｅ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、そのような 側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に代えて（または、によって）置換さ れているものであろう。

はとんどの削除および挿入、並びに特に置換は、ユビキチン・ヒドロラーゼ分子 の性質に激変はもたらさないであろう。しかし、置換、削除または挿入の正確な 効果をそれを行う前に予測することが困難であるときには、その効果を通常のス クリーニング検定によって評価するのは当業者の認識するところであろう。例え ば、変異体は通常、天然のユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている核酸の部 位特異的な突然変異誘発、組換え細胞培養での変異核酸の発現、および所望によ り、細胞培養物からの精製（例えば、少なくとも１つの残存免疫エピトープに変 異体を結合させることによって変異体を吸着させるためのウサギポリクローナル 抗−ユビキチン・ヒドロラーゼカラムでの免疫アフィニティー吸着による）によ って調製される。

次いで、細胞溶解液または精製されたユビキチン・ヒドロラーゼ変異体の活性を 、目的の性質に対して適切なスクリーニング検定で調べる。例えば、ある抗体に 対する親和性などのユビキチン・ヒドロラーゼの免疫学的性質の変化は競合型の 免疫検定で測定する。免疫モジュレータ−活性の変化は適切な検定で測定する。

酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質加水分解に対する感受性、ま　 　　　　゛たは担体と、もしくはマルチマーに集合する傾向などのタンパク質の 性質の修飾は、当業者に周知の方法によって検定する。

３、組換え発現 所望のユビキチン・ヒドロラーゼ分子は、組換え法を含む任意の方法によって調 製することができる。同様に、本発明において単離されたＤＮＡとは、３′およ び／または５゛と境界を接する領域を含むと含まないを問わず、化学的に合成さ れたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡを意味するものと理 解される。本発明の所望のユビキチン・ヒドロラーゼは、組換え細胞培養におけ る合成によって調製するのが好ましい。

このような合成のためには、始めにユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている 核酸を確保することが必要である。ユビキチン・ヒドロラーゼ分子をコードして いるＤＮＡは、酵母または酵母以外の供給源から、（ａ）適当な株由来のＤＮＡ ライブラリーを入手し、（ｂ）ユビキチン・ヒドロラーゼまたはそのフラグメン トをコードしているラベルしたＤＮＡ（長さが１００塩基対まで、またはそれ以 上）を用いてハイブリダイゼーション分析を行って、相同な配列を含んでいるラ イブラリー中のクローンを検出し、そして（Ｃ）制限酵素分析および核酸配列決 定によってクローンを分析して完全長のクローンを同定すること、によって得る ことができる。ストリンジェントな条件下でユビキチン・ヒドロラーゼをコード しているＤＮＡにハイブリダイズすることができるＤＮＡは、特定の所望のユビ キチン・ヒドロラーゼをコードしているＤＮＡを同定する際に有用である。

ストリンジェントな条件は後記で詳しく定義する。完全長のクローンがｃＤＮＡ ライブラリー中に存在しないときには、初めて本願で開示した核酸配列情報を用 いて種々のクローンから適当なフラグメントを回収し、クローンに共通する制限 部位のところで連結してユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている完全長のク ローンを組み立てることができる。別法では、ゲノムライブラリーから所望のＤ ＮＡを得る。最終的に決定した１つの型の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコー ドしている酵母ＤＮＡの配列を第５図に示す。

このＤＮＡが同定され、ライブラリーから単離されたら、さらにクローニングす るためまたは発現させるために複製可能なベクター中に連結する。

組換え発現系の１つの例では、ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチン・ヒド ロラーゼをコードしているＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換することに よって原核生物中で発現される。宿主細胞の周辺質または培養培地にヒドロラー ゼが得られるように、プロセッシングを行うことができる宿主細胞を形質転換す るのが好ましい。

ａ、有用な宿主細胞およびベクタ一 本明細書に開示したベクターおよび方法は、広範囲の原核および真核生物の宿主 細胞において用いるのに適している。

通常、原核生物がＤＮＡ配列の最初のクローニングおよび本発明で有用なベクタ ーの構築に好ましいのは勿論のことである。例えば、大腸菌に１２株ＭＭ２９４ （ＡＴＣＣＮｏ、３１，４４６）は特に有用である。用いることができる他の微 生物株には、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ、３１．５３７） などの大腸菌株が含まれる。勿論、これらの例示は限定のためのものではなく説 明のためのものである。

また、原核生物は発現のためにも用いることができる。上に挙げた菌株、ならび に大腸菌株Ｗ３１１０（Ｆ−１λ−１原栄養株、ＡＴＣＣＮｏ、２７，３２５） 、Ｋ５７７２（ＡＴＣＣＮｏ、５３．６３５）、および５ＲＩＯＩ、バシラス種 、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ、およびその他の腸内細菌、例え ばＳ　ａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳ　ｅｒｒａｔｉａ 　ｍａｒｃｅｓａｎｓ、および種々のシュードモナス種を用いることができる。

通常、宿主細胞に適合する種から導かれるレプリコンおよびコントロール配列を 含有するプラスミドベクターをこれら宿主と組合せて用いる。ベクターは、複製 部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を可能にするマーカー配 列を担持しているのが普通である。例えば、大腸菌は、大腸菌種から導いたプラ スミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換するのが普通である［例えば、Ｂｏ ｌｔｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｒｒｅ　２　＋　９５（１９７７）を参照コ 。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含 有しており、従って形質転換細胞を同定するための容易な手段を与える。また、 ｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドもしくはファージは、 自身のタンパク質を発現させるために微生物が利用することができるプロモータ ーを含有しているか、または含有するように修飾しなければならない。

組換えＤＮＡ構築において最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラクタ マーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３７５　：　６１５（１９７ｇ）　；　Ｉｔａｋｕ ｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　：　１０５６（１９７７）　 ；　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２８１　＋　５４４（ １９７９j］ １ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　４０５７（１９８０）　；　Ｅ　Ｐ 　Ｏ出願公開Ｎ　ｏ、　００３６．７７６］が含まれる。これらが最も普通に用 いられるものであるが、他の微生物プロモーターが発見され、利用されており、 そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されており、当業者はこれ らをプラスミドベクターに機能的に連結することができる［例えば、５ｉｅｂｅ ｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、、Ｃｅ１ｌ　２０　：　２６９（１９８０）を参照 ］。

原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物を用いることもできる。Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通常のパン酵母が真核微生物 のなかで最も普通に用いられるが、他の多数の菌株も普通に用いることができる 。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現させるためには、通常、例えばプラス ミドＹ　Ｒｐ７　［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ｅｔ　ａｌ、　、　？Ｊａｔｕｒｅ 　２ｇ２．３９（１９７９）；　Ｋｉｎｇｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎ ｅヱ：　１４１（１９７９）　；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｇｅ ｎｅ　！Ｑ　：　１５７（１９８０）］が用いられる。このプラスミドは、トリ プトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ。

４４．０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　［Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　 ８５　：　１２（１９７７）］のための選択マーカーを与える廿ｐ１遺伝子を既 に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの性質としてｔｒｐ　ｌ欠損が存 在すると、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するため の有効な環境が得られる。

酵母ベクターにおける適当な促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼの ためのプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５　：　２０７３（１９８０）］、またはその他のグル コース分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ ヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフル クトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセ レートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホ スホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーター［１１ ｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、　Ｚ　：　 １４９（１９６８）　；　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７ 　：　４９００i１ ９７８）］が含まれる。また、適当な発現プラスミドを構築する際には、これら の遺伝子と結合した終止配列を、発現ベクター中の発現させることが所望である 配列の３′に連結して、ｍＲＮＡのボリアデニル化および終止を得る。増殖条件 によってコントロールされる転写の別の利点を有しているその他のプロモーター は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸ホスフアターゼ、窒 素代謝に関与する分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ ドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプ ロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終止配列 を含有するあらゆるプラスミドベクターが適している。

微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主として用いることもできる 。原理的には、を推動物または非を推動物の培養物由来を問わず、そのような任 意の細胞培養物が使用可能である。しかし、を推動物細胞が最も重要であり、培 養におけるを推動物細胞の増殖（組織培養）は最近の数年で常法となった［Ｔｉ ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、＾Ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋｒｕｓｅ　ａ ｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ｅｄ、　（１９７３）コ。そのような有用な宿主セ ルラインの例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣 （ＣＨＯ）セルライン、ならびにＷ２Ｂ５、ＢＨＫ、ＣＯ５−７，２９３および ＭＤＣＫセルラインである。通常、このような細胞のための発現ベクターは、必 要なら、複製起点、発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモーターを、 任意の必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位 、および転写終止配列と共に含有している。

哺乳動物細胞において用いるためには、発現ベクター上のコントロール機能はウ ィルス供給源から得ることが多い。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポ リオーマ、アデノウィルス２から、そして最も多くはサルウィルス４０（ＳＶ４ ’０）から得られる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、これ らがＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有するフラグメントとしてこのウィルスか ら容易に得られるので特に有用である［Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎａｔ ｕｒｅ　２７３　：　１１３（１９７８）］。また、Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位からウ ィルス複製起点中に位置するＢｇｌＩ部位まで伸びる約２５０ｂｐの配列が含ま れているなら、もっと小さいか、またはもっと大きいＳＶ４０フラグメントを用 いることもできる。さらに、プロモーターまたはコントロール配列が宿主細胞系 に適合するなら、所望の遺伝子配列に通常は結合しているプロモーターまたはコ ントロール配列を利用することができるし、また、それが望ましいことも多い。

複製起点は、外来の起点を含むようにベクターを構築することによって、例えば ＳＶ４０もしくは他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）供給源から導くことによって得ることができるし、また、宿主細胞の 染色体複製機序によって得ることができる。ベクターが宿主細胞染色体に組込ま れるときには、後者が十分であることが多い。

十分な量のタンパク質が細胞の培養によって得られる；しかじ、第２の暗号配列 を用いる工夫が産生量をさらに増大させるのに有用である。第２の暗号配列の１ つは、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの外部からコントロールされるパラメー ターによって影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）を含有し、従 ってメトトレキセート濃度をコントロールすることによって発現をコントロール することを可能にする。

ユビキチン・ヒドロラーゼとＤＨＦＲタンパク質の両方をコードしているＤＮＡ 配列を含有する本発明のベクターによるトランスフェクション用に好ましい宿主 細胞を選択する際には、使用されるＤＨＦＲタンパク質の種類に従うて宿主を選 択するのが適切である。野生型のＤＨＦＲタンパク質が使用されるときには、Ｄ ＨＦＲ欠損であり、従ってヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠（選 択培地において成功裏のトランスフェクション用のマーカーとしてＤＨＦＲ暗号 配列を用いることを可能にする宿主細胞を選択するのが好ましい。この場合の適 当な宿主細胞は、Ｕ　ｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７７　：　４２１６（１９８０）］記載のよう に調製し、増殖させた、ＤＨＦＲ活性を欠（チャイニーズ・）１ムスター卵巣（ ＣＨＯ）セルラインである。

他方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲタン／くり質をコントロ ール配列として用いるときには、ＤＨＦＲ欠損細胞を用いることは必要ではない 。突然変異ＤＨＦＲはメトトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞それ 自体がメトトレキセート感受性であるという条件のもとで、ＭＴＸ含有培地を選 択手段として用いることができる。ＭＴＸを吸収することができる真核細胞の大 部分は、メトトレキセート感受性のようである。このような有用なセルラインの １つは、ＣＨＯライン、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＣＬ６１）である。

ｂ、使用可能な代表的な方法 所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構築には通 常の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、 加工し、そして必要なプラスミドを調製するのに望ましい形態で再連結する。

平滑末端が必要であるときには、調製物を１５℃で１５分間、ポリメシーゼエ（ フレノウ）１０単位で処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノ ール沈澱させることができる。

ルを用いて行うことができる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認する分析のために、通常は、この連結 混合物を用いて大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣ３１、４４６）またはその他の 適切な大腸菌株を形質転換し、適当なところで成功裏の形質転換体をアンピシリ ンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体由来のプラスミド を調製し、Ｍｅｓｓｉｎｇ等［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　旦：　 ３０９（１９８１）：ｌの方法またはＭａＸａｌ等［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　：　４９９（１９８０）］の方法により制限マツピ ングおよび／またはＤＮＡ配列決定を行って分析する。

哺乳動物宿主細胞中にＤＮＡを導入し、安定なトランスフェクタントについて培 地で選択を行った後、約２０，０００〜５００．　ＯＯＯｎＭの濃度のメトトレ キセート（ＤＨＦＲ活性の競合型の阻害物質）の存在下で宿主細胞培養物を増殖 させることによってＤＨＦＲ−タンパク質をコードしている配列の増幅を行う。

勿論、有効な濃度範囲はＤＨＦＲ遺伝子の性質および宿主の性質に大きく依存し ている。

一般的に定めた上限および下限を確定することができないのは明らかである。適 切な濃度のＤＨＦＲを阻害する他の葉酸類似体または他の化合物を用いることも できる。しかし、ＭＴＸそれ自体が好都合であり、容易に入手することができ、 そして効果的である。

使用可能なその他の方法は、実施例のすぐ前の部に記載する。

４、インビトロで融合ポリペプチドを切断する方法本発明のユビキチン・ヒドロ ラーゼ分子は、ユビキチンと所望の任意のポリペプチド産物の間の融合ポリペプ チドをインビトロですぐにプロセッシングするための方法において特に有用であ る。ユビキチン融合ポリペプチドは、通常、所望のポリペプチドをコードしてい る遺伝子の５′末端に連結されたユビキチン遺伝子（その３′末端で）を含有す るキメラ遺伝子構築物によって発現される。このユビキチン遺伝子は、天然供給 源から入手し、適当なベクター中にクローンするか（上記のＷＯ３８１０２４０ ６に記載のように）、または、例えばＥ　ｃｋｅｒ等［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２６２　：　３５２４−３５２７（１９８７）　；およびＪ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、　２６２　：　１４２１３−１４２２１（１９８７）］の記載の方 法を用いて化学的に合成する。次いで、所望によりこの融合体にＮ−末端シグナ ル配列を含有させて融合ポリペプチドの分泌を容易にする。

所望のポリペプチドのＮ−末端アミノ酸のコドンは、ユビキチン遺伝子の３′末 端にすぐ隣接して位置しているか、または、任意の数のヌクレオチド・トリプレ ットによって隔てられている（通常は、１．２または３個のトリブレット；これ らは、どんな特定の配列をもコードしている必要がないが、所望のポリペプチド をコードしている遺伝子を正しいリーディング・フレーム内に維持する）。

所望のポリペプチドは任意のポリペプチドであってよく、以下のポリペプチドを 含むがこれらに限定はされない：即ち、哺乳動物ポリペプチド、例えば成長ホル モン（ヒト成長ホルモン、デス−Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ 成長ホルモンを含む）：インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖；プロインスリン；因 子■：プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト組織型プラ スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケフ ァリナーゼ；血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）；ミュレリアン（ａ＋ ｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物賀；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；ブロリラキシ ン；マウス性腺刺激ホルモン関連のペプチド；微生物タンパク質（β−ラクタマ ーゼなど）；ＤＮアーゼ：組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；神経 成長因子（ＮＧＦ−βなど）；血小板由来の成長因子；線維芽細胞成長因子ニド ランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β： インスリン様成長因子−■および一■；インスリン様成長因子結合タンパクｉｔ ；ＣＤ−４；エリトロポイエチン：インターフェロン（インターフェロン−α、 −β、および−γなど）；コロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）、例えばＭ−Ｃ３Ｆ、 ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−Ｃ３Ｆ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、 Ｉ　Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４など；スーパーオキシドジムスターゼ：崩壊促 進因子；ウィルス抗原（例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部）；任意の上記ポ リペプチドのフラグメントなどである。さらに、ポリペプチド上の１またはそれ 以上の予め決めたアミノ酸残基を、融合体の発現および／またはユビキチン・ヒ ドロラーゼプロセッシングに悪影響を及ぼすことなく、置換、挿入または削除す ることもできる。

本発明において好ましいポリペプチドは、レラキシンもしくはインスリンのＡ鎖 もしくはＢ鎖、プロレラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インター ロイキン、成長ホルモン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、イン スリン様成長因子、またはＤＮアーゼである。本発明において最も好ましいポリ ペプチドは、レラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロレラキシ ン、プロインスリン、インターフェロン−γ、またはデス−Ｎ−メチオニルヒト 成長ホルモンである。また、好ましいポリペプチドは、それが発現される宿主細 胞に対して４異種であるポリペプチド、およびヒトポリペプチドである。

融合体は組換え細胞培養の不純産物を含有する組成物中に得られ、次いでこれを 切断して所望のポリペプチド産物を回収する。ポリペプチドはユビキチンのＣ− 末端にコンジュゲートしており、そのＮ−末端には任意のアミノ酸を含有してい る。融合体を含む宿主細胞培養物を宿主にとって適切な培養培地で増殖させ、融 合体が分泌されているか否かに依存する方法によって集める。通常は、細胞を溶 解し、遠心して細胞の残骸を除き、上清中の融合タンパク質を回収する。次いで 、この上清、または細胞外培地から回収もしくは細胞周辺腔から回収（例えば、 浸透圧ショックによって）した分泌された融合物質を、ユビキチンに対して特異 的な親和性を有する試薬と接触させてコンジュゲートを試薬に吸着させる。この 試薬は、ユビキチンと相互作用する細胞タンパク質または抗−ユビキチン抗体な どの任意の試薬であってよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ユビキチンに 対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニティークロマトグラフィーカラ ムで分離を行うのが最も好ましい。

次の工程において、ユビキチンに特異的な親和性を有する試薬およびその吸着し たコンジュゲートを宿主細胞培養物の残りから分離し、試薬からコンジュゲート を回収する。吸着されたコンジュゲートがアフィニティーカラム上に存在してい るときには、ｐＨ勾配４〜５を用いてカラムから溶離することによって抗体に吸 着されたコンジュゲートを回収する。

その次の工程において、回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと 接触させ、それによつてコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水 分解し、ヒドロラーゼを固定化する。

これは、ユビキチン・ヒドロラーゼを結合させたカラムに、溶離したコンジュゲ ートを通すことによって行うことができる。別の方法では、コンジュゲートをユ ビキチン・ヒドロラーゼと接触させ、次いで固定化したヒドロラーゼに対する抗 体を用いてコンジュゲートからヒドロラーゼを分離する。

次いで、回収した物質をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触 させて、すべての残留コンジュゲートおよび遊離のユビキチンを試薬に吸着させ 、試薬およびそれに吸着した物質を含まないポリペプチドを回収する。ここでも 、この試薬はユビキチンに対するモノクローナル抗体であってよく、これをアフ ィニティーカラムに結合させることもできる。

この方法を成功させるためには、宿主細胞は、この回収方法を妨害する内生のユ ビキチン・ヒドロラーゼを全く産生しないものであるのが好ましい。これは、ユ ビキチン・ヒドロラーゼを通常は全く産生しない原核宿主を用いることによって 、あるいは削除もしくはトランスボゾン突然変異誘発を行って宿主細胞（即ち、 真核宿主細胞）から内生のユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている全ての遺 伝子を除去することのどちらかによって達成することができる。

また、融合ポリペプチドが細胞内（例えば、原核宿主内）に産生されたときにそ れを分解することもある内生のプロテアーゼを欠く宿主細胞を選択するのが望ま しいこともある。

切断したポリペプチドを回収する別の方法においては、コンジュゲートを産生し ている宿主細胞培養物を上記のようにして集めた後に、この培養物をユビキチン に対して特異的な親和性を有する試薬と接触させてコンジュゲートを試薬（この 試薬は上に定義されている）に吸着させる。この試薬とその吸着コンジュゲート を培養物の残りから分離する。次いで、コンジュゲートが吸着した試薬をユビキ チン・ヒドロラーゼに接触させる。ヒドロラーゼおよびポリペプチドを試薬から 分離し、最後の工程でポリペプチドをヒドロラーゼから分離する。また、第１の 工程に対して挙げたものと同じ好ましい態様がこの方法に当てはまる。

５、ユビキチンに対する抗体 通常、ユビキチンに対する抗体は、ユビキチンとアジュバントの複数の皮下また は腹腔的注射によって動物に生成させる。２官能性または誘導体化試薬、例えば マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システィン残基を介する コンジュゲート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グ ルタルアルデヒド、無水コハク酸、５ＯＣＩ２またはＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用い、 免疫しようとする種に免疫原性であるタンパク質、例えばキーホール・リンペッ ト（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチロ グロブリン、または大豆トリプシン阻害物質にユビキチンをコンジュゲートさせ るのが有用であることもある。また、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答 を増強することもできる。

１ｍｇまたは１μｇのコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して ）を３容量倍のフロイント完全アジュバントと混合し、この溶液を皮肉の複数部 位に注射することによって、動物を免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対し て免疫する。１力月後に、複数部位の皮下注射により、フロイント完全アジュバ ント中の最初の量の１１５〜１／１０のコンジュゲートで動物をブースター処理 する。７〜１４日後に動物から採血し、その血清について抗−ユビキチン力価を 測定する。力価がプラトーに達するまで動物をブースター処理する。同じユビキ チンポリベプチドであるが、異なるタンパク質に、および／または異なる架橋剤 によってコンジュゲートしたコンジュゲートで動物をブースター処理するのが好 ましい。

免疫した動物から牌細胞を回収し、常法によって細胞を永久化することによって 、例えばミエローマ細胞との融合またはエプスタイン−バーウィルス形質転換お よび所望の抗体を発現しているクローンのスクリーニングによってモノクローナ ル抗体を調製する。ユビまた、ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチンと所望 の任意のポリペプチド産物の間の融合ポリペプチドをインビボでプロセッシング するための方法において特に有用である。このコンジュゲート用の遺伝子構築物 は上記セクション４に記載した通りである。

この遺伝子構築物を、ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている遺伝子をゲノ ム中に組込んだ（好ましくは、染色体中に単一コピーとして）任意の原核宿主細 胞に導入する。このような細胞は、ユビキチン・ヒドロラーゼ遺伝子の５°末端 に結合させたプロモーターを有するＤＮＡ構築物をλフアージ中にクローンし、 これを適当な菌株に組込むことによって調製することができる。好ましい宿主細 胞は大腸菌細胞、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ［１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ、　ＭＤ、　ＤＮＡコにＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ。

５３、８３２のもとて１９８８年１１月３０日に寄託されている大腸菌株に５８ ０８の性質を有しているものである。この菌株は、大腸菌株に５７７２のｇａｌ およびｂｉｏの間のλ付着部位に組込まれたλｇｔｌｌファージ中の廿ｐプロモ ーターによって作動するＹＵＨ−１遺転子構築物を含有している。

菌株に５７７２（ＡＴＣＣＮｏ、５３，６３５）は、染色体１ａｃＺオペロンに 挿入されたＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有しており、従って培地にイソ プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって誘導することがで きる。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼの構成レベルの発現は、このポリメラーゼ構造 遺伝子の５°に位置する非翻訳化ドメインに依存している。大腸菌に５７７２に 組込まれたＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は次の配列を含有している（相補鎖 は示していない）： １ｎＰＩ ｈａＩ ５ｔＩ ａｌｕＩ　　　　　　　　　　　　　　　ｆｓｐＩＬａｃｅ−ＧＧＧＡＡＧＣＴ ＡＧ　ＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴ　ＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡ　ＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧ　 ＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴ−ｈａｅＩ　　　　ｒｓａＩ　　　　　　　　ｍｂｏＩ　 ＩＧＣＣＡＴＣＡＴＣＴ　ＧＣＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＧＴＡ　ＣＧＡ ＴＴＴＡＣＴＡ　ＡＣＴＧＧＡＡＧＡＧ　ＧＣＡＣＴＡＡＡＴf− ポリメラーゼ開始。

このＨｐａＩ部位は大腸菌１ａｃＺの最初のＨｐａＩである。

得られた形質転換宿主細胞を、ユビキチンーボリベブチドコンジュゲートが発現 されるように培養する。培養は、ヒドロラーゼ遺伝子のプロモーターを誘導する ことによって行うのが好ましい。即ち、ｔｒｐがプロモーターとして用いられる ときには、トリプトファンを含まない最少培地で細胞を培養する。誘導によって 、２０分間でユビキチンーレラキシンＡ鎖融合体が効率的に切断される結果にな る。

コンジュゲートが発現されるとすぐに、それはゲノム中にコードされているユビ キチン・ヒドロラーゼによって切断される。

７、キット成分 本発明のユビキチン・ヒドロラーゼの組成物は、安定化のための緩衝液で製剤化 することができる。この緩衝液は無機または有機塩で構成されていてよ（、例え ば所望のｐＨに依存してクエン酸塩、リン酸塩、またはトリス緩衝液を含有して いる。

さらに、ユビキチン・ヒドロラーゼの組成物はキットの１成分であってもよく、 第２の成分としてユビキチン・ヒドロラーゼに対する固定化抗体を含有すること もできる。この抗体は、ユビキチンの修飾に関連して上に記したようにして固定 化することができる。このようなキットは、所望のタンパク質にコンジュゲート したユビキチンを含有する融合タンパク質の切断を行うのに用いることができる 。

実施例および請求の範囲を簡単にするため、一部の頻繁に出て（る方法を簡略し て表す。

「トランスフェクション」とは、宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味し 、任意の暗号配列が実際に発現されると否とを問わない。例えば、Ｃａ　Ｐ　Ｏ Ｉ法および電気穿孔法などの多数のトランスフェクション法が当業者に知られて いる。通常、このベクターの作用のいずれかの指標が宿主細胞内に現れたときに 、トランスフェクションの成功が認められる。

「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色体組込みのいずれかによっ て、複製可能なように生物中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿 主細胞に依存して、そのような細胞に適した常法を用いて形質転換を行う。原核 生物または強固な細胞壁障壁を有するその他の細胞のためには、通常、Ｃｏｈｅ ｎ、　Ｓ、　Ｎ、　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ｔｌ ｓＡ）　６９　：　２１１０（１９７２）］およびＭａｎｄｅ１等［Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ。

５３　：　１５４（１９７０）］が開示している塩化カルシウム使用のカルシウ ム処理法が用いられる。そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞のためには、 Ｇ　ｒａｈａｍ、　Ｆ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　［Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ　５２　：　４５６−４５７（１９７ｇ）］のリン酸カルシウム沈澱法が好 ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の全般についてはＡ　ｘｅｌ　［米国特 許Ｎｏ、　４．３９９．２１６　；　１９８３年８月１６日発行］が開示してい る。酵母の形質転換は、通常、ＶａｎＳ　ｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、等［Ｊ、　Ｂ ａｃｔ、　、　１３０　：　９４６（１９７７）］およびＨｓｉａｏ、　Ｃ，Ｌ 、等［扛ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７６　：　 ３８２９（１９７９）］の方法に従って行われる。

しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法、例えば核注射による方法ま たはプロトプラスト融合による方法なども用いることができる。

本明細書で用いる、本発明の範囲内に含まれるある種のＤＮＡ配列を記述するた めの「ストリンジェント（厳格）な条件下でハイブリダイズ」という表現は、洗 浄を高温および低イオン強度の条件下で、例えば５０℃の０．１５Ｍ　ＮａＣ１ １０゜０１５Ｍクエン酸ナトリウム１０．１％ＮａＤｏｄＳＯ＜の条件下で行う ハイブリダイゼーション、または別法ではホルムアミドなどの変性剤の存在下で 、例えば０゜１％ウシ血清アルブミン１０，１％フィコール１０．１％ポリビニ ルピロリドン１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５；　７５０ｍＭ　 ＮａＣ１，７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）を含む５０％（容量／容量）ホ ルムアミドの存在下、４２℃でハイブリダイゼーションを行うことを意味する。

「低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」とは、２０％ホルムアミド、 ５ｘＳＳＰＥ、４２℃の条件下でハイブリダイズさせることを意味する。

「部位指向性の突然変異誘発」はこの分野では普通の方法であり、所望の突然変 異を示す限定された誤対合を除いて突然変異誘発を行おうとする１本鎖ファージ ＤＮＡに相補性の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。簡単に説明 すると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてファージに対して相 補性である鎖を直接合成し、得られた２本鎖ＤＮＡをファージを維持する宿主細 菌中に導入する。導入した細菌の培養物をトップ寒天で培養すると、ファージを 保持している１個の細胞からプラークが形成される。理論的には、新しいプラー クの５０％が突然変異形を１本鎖として有するファージを含有し、５０％は元の 配列を有する。このプラークを、正確な対合とはハイブリダイズさせるが元の鎖 との誤対合がハイブリダイズするのを妨げるには十分な温度で、キナーゼ処理し た合成ブライマーとハイブリダイズさせる。次いで、ブロー・ブとハイブリダイ ズするプラークを選択し、培養し、ＤＮＡを回収する。

「機能的に結合」とは、構成成分の正常な機能を発揮させることができるように 並べることを指す。即ち、コントロール配列群に「機能的に結合」した暗号配列 とは、この暗号配列がこれらの配列群のコントロールのもとで発現することがで き、結合されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し てリーディング相内にある立体配置を意味する。例えば、プレ配列または分泌リ ーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として 発現されるならばポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合しており；プロモーター またはエンハンサ−は、それが配列の転写に影響を及ぼすならば暗号配列に機能 的に結合しており；また、リポソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように 設置されているならば暗号配列に機能的に結合している。結合は都合のよい制限 部位での連結によって行う。そのような部位が存在しないときには、常法に従う て合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を用いる。

「コントロール配列」とは、特定の宿主生物における機能的に結合した暗号配列 の発現に必要なりＮＡ配列を指す。原核生物に適したコントロール配列には、例 えば、プロモーター、所望によるオペレーター配列、リポソーム結合部位、そし て恐ら（は今のところはよくわかっていないその他の配列が含まれる。真核細胞 はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用することが わかっている。

「発現系」とは、所望の暗号配列および機能的に結合したコントロール配列を含 有するＤＮＡ配列を指し、これらの配列で形質転換された宿主はコードされてい るタンパク質を産生ずることができる。

形質転換を行うためには、発現系はベクター上に含まれているであろう；しかじ 、関連のＤＮＡが次いで宿主染色体中に組込まれることもある。

本明細書で用いる「細胞」、「セルライン」および「細胞培養物」は交換可能な ように用い、これら表示の全てはその子孫を含んでいる。従って、「形質転換体 」または「形質転換細胞」は、転移の数とは無関係に１次対象細胞およびそれか ら導いた培養物を含んでいる。また、意図的あるいは偶然の突然変異により、全 ての子孫がそのＤＮＡ内容において正確に一致していないこともあることは理解 されよう。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングを行ったときに同 一の機能を有する突然変異子孫は包含される。別の意味が意図されているときに は、その文脈から明らかであろう。

「プラスミド」は、小文字ｐ１その前および／またはその後の大文字および／ま たは数字で表す。本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能であるか、制 限のない状態でだれでも入手可能であるか、またはそのような入手可能なプラス ミドから公知の方法に従うて構築することができる。さらに、他の等価なプラス ミドが当分野で知られているが、これらは当業者には明らかであろう。

ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある位置にのみ作用する酵素によるＤＮＡの 触媒的切断を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、そのそれぞれが特 異的である部位は制限部位と呼ばれる。

本発明で用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能であり、それらの反応 条件、補助因子、およびその他の必要なものは、酵素供給元が確立したものを用 いた。通常、制限酵素は、それぞれの制限酵素が初めて得られた微生物を表す大 文字とそれに続く他の文字、その後の特定の酵素を表す数字からなる短縮形によ って表示される。

通常は、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μｌの緩衝液 中、約１〜２単位の酵素とともに用いる。特定の制限酵素のための適切な緩衝液 および基質量は製造元によって指定されている。通常は３７℃で約１時間のイン キュベート時間を用いたが、供給元の指示に従って変えてもよい。インキュベー トの後、フェノールおよびクロロホルムによる抽出によってタンパク質を除去し 、エタノール沈澱によって水性分画から消化した核酸を回収する。多いことでは ないが、制限酵素による消化に続いて末端５”ホスフェートの細菌性アルカリホ スファターゼ加水分解を行って、ＤＮＡフラグメントの２つの制限切断末端が「 環状化」または閉じた環を形成すること（この制限部位における別のＤＮＡフラ グメントの挿入が妨げられる）を妨げる。特に記すことがなければ、プラスミド の消化に続いて５°末端の脱ホスホリル化を行うことはない。脱ホスホリル化の ための方法および試薬は通常のものである［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｔｓｅｔ　ａ１ １１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１９８２）、　Ｉ）Ｉ）、　１３３−１ ３４］。

制限消化物からのあるＤＮＡフラグメントの「回収」または「単離」とは、ポリ アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動による消化物の分離、その移動度 と既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度の比較による目的フラグメ ントの同定、目的のフラグメントを含有しているゲル切片の取り出し、およびゲ ルからのＤＮＡの分離を意味する。この方法は広く知られている。例えば、Ｒ３ Ｌ　ａｗｎ等［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９−　：　６１０３− ６１１４（１９８１）］およびり、Ｇｏｅｄｄｅ１等［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　二４０５７（１９８０）］を参照。

「サザーン分析」とは、既知のラベルされたオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフ ラグメントへのハイブリダイゼーションによって消化物またはＤＮＡ含有組成物 中のＤＮＡ配列の存在を確認する方法である。本発明のためには、他に記載がな ければ、サザーン分析は、Ｅ　、　Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎの方法［Ｊ、　Ｍｏ１． Ｂｉｏ］、　９８　：　５０３−５１７（１９７５）］による１１％アガロ−で の消化物の分離、変性およびニトロセルロースへの移行、ならびにＴ、　Ｍａｎ ｉａｔｉｓ等［Ｃｅ１ｌ　１５　：　６８７−７０１（１９７８）コが記載して いるようなハイブリダイゼーションを意味する。

「連結（ライゲート）」とは、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でホスホジエ ステル結合を形成させる過程を指す［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）、上記、 ｐ、１４６］。特に記さなければ連結は、連結しようとするほぼ等しい量のＤＮ Ａフラグメント（０，５μｇ）に対してＴ４　ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」） （１０単位）を用い、既知の緩衝液および条件を用いて行うことができる。

形質転換体からのＤＮＡの［調製」とは、微生物培養物からのプラスミドＤＮＡ の単離を意味する。他に記載がなければ、Ｍａｎｉａｔｉｓ等［１，９ｇ２、上 記、ｐ、　９０］のアルカリ／ＳＤＳ法を用いてよい。

「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法［例えば、ＥＰ特許公開Ｎｏ、　２６ ６、０３２（１９８８年５月４日公開）に記載されている固相法を用いるホスホ トリエステル、ホスファイト、もしくはホスホルアミダイトの化学、またはＦ　 ｒｏｅｈｌｅｒ等（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、νｊ：　５３９９−５４ ０７（１９８６））が記載しているデオキシヌクレオシドビーホスホネート中間 体を用いて）によって化学的に合成された短い１本鎖または２本鎖のポリデオキ シヌクレオチドである。次いで、これらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

以下に挙げる実施例は、今わかっている本発明実施の最良の態様を説明するため のものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例Ｉ このラベル化法は、ラベルしようとするタンパク質基質の遺伝子を含有するプラ スミドおよび組込まれたバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含 有する大腸菌株中、インビボで行った。タンパク質基質遺伝子の発現は、Ｔ７　 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（その配列はプラスミドのタンパク質基質遺 伝子の石゛に位置している）の支配下に行った。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝 子の発現は、大腸菌のｌａｃプロモーターの支配下に行った。

酵母ユビキチン融合ポリペプチドをコードしているＤＮＡフラグメントを、Ｆ　 ｒｏｅｈｌｅｒ等（上記）の方法を用いるＤＮＡ合成機で化学的に合成した。３ ２アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖（レラキシンＢ鎖のＮ−末端アミノ酸 を欠いているが、ユビキチンとレラキシン鎖の連結点に６つのアミノ酸を付加し ている）に対する合成ユビキチン融合遺伝子を第１ａ図に示す（Ｘｂａｌ接着末 端からＨｉｎｄＩＩＩまで延びる）。第１ａ図から、ユビキチン遺伝子はヌクレ オチド２１１−２１６に好都合な唯一のＤｒａＩＩＩ部位を有しており、この部 位を用いて種々のタンパク質をコードしているＤＮＡを結合させ得ることがわか る（結合させようとするタンパク質をコードしているＤＮＡが、ユビキチン３゛ 末端を構築するのに必要なヌクレオチドの残りに結合され、そしてＤｒａ１１１ 部位が挿入されているときには）。

このＤｒａＩＩＩ部位を用いて、Ｎ−末端を切除したユビキチンで残りの融合ペ プチドを合成した。

即ち、３３アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖に対する、先端切除の合成ユ ビキチン融合遺伝子を第１ｂ図に示す。これは、ユビキチンの内部ＤｒａＩＩＩ 部位（接着末端）からレラキシン鎖の末端のＨｉｎｄＩＩＩ（接着末端）部位ま で延びる。同様に、３゛末端にシスティンジペプチドのための遺伝子を有するユ ビキチンの先端切除遺伝子を構築した。これは、ユビキチン接着末端ＤｒａｌＩ Ｉ部位からこのフラグメントの３゛末端の接着末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位まで延び る。また、２９アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖（３′末端の４アミノ酸 を切除）の遺伝子に融合させたユビキチンの先端切除遺伝子（その３′末端で融 合）を同じ方法で合成した。これは、ユビキチンの内部接着末端ＤｒａＩＩＩ部 位からこのフラグメントの３°末端の接着末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位までである。

最後に、２４アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＡ鎖の遺伝子に融合させたユビ キチンの先端切除遺伝子（その３゛末端で融合）を同じ方法で合成した。これは 、ユビキチンの内部接着末端ＤｒａＩＩＩ部位からこのフラグメントの３゛末端 の接着末端Ｈ１ｎｄＩＩＩ部位までである。ヒトレラキシン（Ｈ２）Ａ鎖のヌク レオチド配列は欧州特許公開Ｎｏ、　１１２．１４９（１９８４年６月２７日公 開）に見ることができる。

第１ｃ図および第１ｄ図は、種々の合成レラキシン鎖とのユビキチンタンパク質 基質をコードしているベクターの構築を示すものである。始めに、プラスミドｐ Ｔ７−２をＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎから入手した。このプラスミドＤＮＡをｐｖｕｌで切断し、再連結し た。このＤＮＡを用いてコンピテントな細菌を形質転換し、ＰｖｕＩフラグメン トの逆位についてクローンをスクリーニングした。このような逆位クローンの１ つをｐＴ７−１２と命名した。

この構築の目的はβ−ラクタマーゼ遺伝子の高レベルの発現を妨げることであっ た（他では、ｐｈｉｌＯプロモーターの支配下に転写される）。ｐＴ７−１２を ＨｉｎｃＩＩおよびＢａｍＩ（Ｉテ切断し、大きイフラクメントを単離した。

第２のプラスミドｐＴｒｐＸＡＰＴＮＦをｐＢＲ３２２から調製するが、これは 廿ｐプロモーターの支配下にある腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードしている遺伝 子を含有している。この遺伝子の構築はＥＰ公開Ｎｏ、　１６８．２１４（１９ ８６年１月１５日公開）に詳しく記載されている。このプラスミドをＨｐａｌお よびＢａｍＨＩで切断し、小さいフラグメントを単離した。次いで、この小さい フラグメントをｐＴ７−１２由来の大きいフラグメントに連結し、プラスミドｐ Ｔ７−１２７ＮＦを得た。これは、廿ｐリーダーリポソーム結合部位内にＸｂａ Ｉ部位およびＴＮＦをコードしている遺伝子を含有している。Ｉ）Ｔ７−１２Ｔ ＮＦの構築を第１Ｃ図に示す。

プラスミドｐＳ　ＲＣｅｘ　１６　［Ｊ、　Ｐ、　ＭｃＧｒａｔｈおよびＡ、　 Ｄ、　Ｌｅｖｉｎｓｏｎが開示（Ｎａｔｕｒｅ　巖：　４２３−４２５（１９８ ２））コをＸｂａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、大きいフラグメントを単離 した。第１ａ図に示す合成りＮＡ（ＵｂｓＲ１ｘｎＢ３２）をこの大きいフラグ メントに連結してプラスミドｐＴｒｐＵｂｓＲ１ｘｎＢ　３２を得た。この構築 を第１ｄ図に示す。このプラスミドをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、小さ いフラグメントを単離した。プラスミドｐＴ７−１２ＴＮＦをＸｂａＩおよびＢ ａｍＨＩ　１’切断し、大きいフラグメントを単離し、ｐＴｒｐＵｂｓＲ１ｘｎ Ｂ３２由来の小さいフラグメントに連結した。得られたプラスミドはｐＴ７−１ ２ＵｂｓＲ１ｘｎＢ　３２であり、ここで合成りＮＡフラグメントはｐＴ７プロ モーターの支配下にある。

他のプラスミドｐＴ　７−１２　Ｕｂｓ−Ｘ（ここで、Ｘは、ｃｙｓ−ｃｙｓジ ペプチド、シラキシンＢ２９鎖、レラキシンＢ３３鎖、またはシラキシンＡ２４ 鎖のためのものである）は第１ｄ図に示すように、ｐＴｒｐＵｂｓＲｌｘｎＢ　 ３２ベクターをＤｒａＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、大きいフラグメン トを単離してこれを上記の４種の合成りｒａＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン ト（Ｕ　ｂｓ−Ｘと呼ぶ）の１つに連結してｐＴｒｐＵｂｓ−Ｘプラスミド（こ こで、Ｘは上記定義に同じ）を得、これらのプラスミドをＸｂａｌおよびＢａｍ ＨＩで切断し、小さいフラグメントを単離し、そしてこれらをＸｂａｌおよびＢ ａｍＨＩ切断のｐＴ７−１２ＴＮＦプラスミドから単離した大きいフラグメント に連結することによって調製した。

別の方法では、酵母ユビキチン遺伝子［０ｚｋａｙｎａｋ　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、　６　：　１４２９−１４３９（１９８７）］を、長さが ５５〜６２ヌクレオチドの範囲の８つのオリゴヌクレオチドフラグメントから組 立てた。この配列および順序を以下に示す。

＜−−−−−−−−−−＜−−−−−−−一−−＜−−−−−−−−−−＜−− −−−−−−−−それぞれのオリゴヌクレオチド（約３０ｎｇ）をホスホリル化 し、５０ＩＩＩＭトリスーＭＣＩ（ｐＨ＝８．０）、１０ｍＭ　Ｍｇｃｉ、、０ ．５ｍＭＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位）、およびＴ４ＤＮ Ａリガーゼ（１０００単位）を含む１つの反応混合物中で一緒にして連結した。

得られたＤＮＡ２重螺旋を６％ポリアクリルアミドゲルで分画し、２４０塩基対 のフラグメントに対応するＤＮＡバンドを切り出し、電気溶離した。

溶離したＤＮＡをクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＸｂａＩおよ びＥｃｏＲＩ末端を有するようにリンカ−と連結し、そしてＸｂａＩおよびＥｃ ｏＲＩ切断したｐＵＣ−１２ベクター（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ 　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌｓ）から単離した大きいフラグメントに連結した。ユ ビキチンＤＮＡ挿入体の配列をジデオキシヌクレオチドＤＮＡ配列決定分析によ って確認した。

同様に、３８アミノ酸をコードしている人工のレラキシンＢ鎖遺伝子に対応する ＤＮＡを、長さが５７〜６２ヌクレオチドの範囲の４種の合成りＮＡフラグメン ト（その配列を以下に示す）から組立て、ＥｃｏＲＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩリン カ−に連結し、次いでＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断したｐＵＣ−１２か ら単離した大きいフラグメントに連結し、その配列を確認した。これら２つのＤ ＮＡ挿入体は、第１のベクターをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、第２のベ クターをＥｃ。

Ｒ１およびＨｉｎｄｌＩＩで切断することによってそれぞれのプラスミド・から 切り出した。次いで、これら２つの挿入体を共通のＥｃｏＲ１部位で連結してＸ ｂａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを得た。このフラグメントを、ＸｂａＩお よびＨ１ｎｄＩＩＩで切断したｐｓＲｃｅｘ１６から単離した大きいフラグメン トに連結した。用いた合成りＮＡ配列を以下ＣＧＴＧＡＡＣ−３゜ ＣＴＧＴＡＧ−３’ Ｒｌｘ　１−３　　　　５−７ ＋＋＋＋−＋＋＋＞　　＋　　　　＋＋＋＋＋＞ｐｓＲｃｅｘ１６のＤｒａＩＩ ＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩ部位の間に存在する合成りＮＡ配列を、ユビキチンをコ ードしている遺伝子がポリペプチドの遺伝子の５゛にあるように関連の合成りＮ Ａフラグメントで置換することによって、ユビキチンとレラキシンＢ鎖の融合タ ンパク質を調製した。得られたハイブリッドの遺伝子を、ＸｂａｌおよびＢａａ ＨＩで消化することによってｐｓＲｃｅｘ１６由来のプラスミドから切り出し、 単離し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ切断のｐＴ７−１２ＴＮＦから単離し た大きいフラグメントに挿入した。

大腸菌に５７７２細菌［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎに受託番号５３，６３５のもとで寄託されている；大腸菌１ａｃ 　Ｚ遺伝子中にＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを含有している］をコンピテントにし 、ｐＴ７−１２ＵｂｓＲ１ｘｎＢ３２プラスミド、またはｐＴ７−１２Ｕｂｓ− Ｘプラスミドのいずれかを用いて別々に形質転換した。カルベニシリンに対する 耐性について細胞を選択した。

それぞれの大腸菌形質転換体を、システィンおよびメチオニンを除く全てのアミ ノ酸（それぞれ５０Ｍｇ／ｍｌ）を追加したＭ９最少培地（５ｍｌ）で飽和にな るまで３７℃で一晩増殖させた（インビボでのシスティンとメチオニンの間の早 い相互変換の故に、外部添加のメチオニンの非存在下でラベルを行うとタンパク 質中のメチオニン残基がラベルされる結果になる：この相互変換の故に、外部添 加のメチオニンの存在下でラベルを行うとメチオニン残基中にほとんど検出不能 に８３５が導入される結果になる）。グルコースの存在はＴ７　ＲＮＡポリメラ ーゼの転写を支配するｌａｃプロモーターの代謝産物抑制を確実なものにした。

また、５０Ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有させてプラスミドの安定性を維持 した。

この−晩培養物を、システィンおよびメチオニンを除（アミノ酸（それぞれ１０ Ｍｇ／＋１）とカルベニシリン（５０Ｍｇ／ｍｌ）を追加したＭ９最少培地（１ ｍｌ）で５０倍に希釈した。

３７℃で３時間振盪した後、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴ Ｇ）を１＋Ｍの最終濃度が得られるまで培養物に加えてＴ７　ＲＮＡポリメラー ゼの合成を誘導した。さらに３０分後に、２０ｍｇ／ｍｌのリファンピシンを２ ００μｇ／ｍｌの最終濃度が得られるまで加えて宿主のＲＮＡポリメラーゼ活性 を阻害した。さらに３０分後に、３５Ｓシステイン（６００Ｃｉ／ｍモル）を培 養物１ｍｌあたり０．２５ｍＣ１の割合で培養物に加えてタンパク質またはｃｙ ｓ−ｃｙｓジペプチドをラベルした。

最終濃度５０μｇ／ｍｌのシスティンで培養物を失活させることによってラベル 化を停止させ、細菌ペレットを遠心して集めた。

細胞の溶解は、使用しようとする細胞溶解液の目的に応じて異なる方法で行うこ とができる。以下の方法を用いて、さらに処理することなく水性条件下で、試験 しようとしているほとんど全ての酵素法に適合しつる溶液中に全可溶性大腸菌タ ンパク質（可溶性であるときにはラベルされたタンパク質を含有している）を含 有している溶解液を調製した。種々試薬の培養物容量に対する比率は１１１のラ ベル培養物に基づいた。

集めた細菌ベレットに、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８）、２５％（Ｗ／ｖ） スクロースを含有する溶液（８０μｍ）を加えて細胞を再懸濁した。この工程な らびに以下の工程の全ては室温で行った。

この細胞懸濁液に、０．２５Ｍトリス−Ｃ１（ｐＨ８，０）に新たに溶解した５ ｍｇ／ｍｌ卵白リソチーム（２０μｍ）を加え、５分間インキュベートした。次 いで、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８０４０μｍ）をこの懸濁液に加えた。

さらに５分間インキュベートした後、５０ｍＭ）リス−Ｃ１（ｐＨ８）、５０ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、０．２％（ｖ／ｖ）Ｎ　Ｐ　４０を含有する溶解混合 物（６０μｍ）を加えることによって細胞を溶解した。完全な細胞の溶解を得る には５〜１０分間必要であった。この溶解液を遠心して透明にし、すぐに用いる か、または−２０℃で長期間保存することもできる。

全ての検定はエッペンドルフ管中、２５μｍの最終容量で行い、インキュベート は３７℃で１時間行った。反応混合物は次の成分を含有していた： ５９ｍＭ）リス−ＣＩ（ｐＨ７，５） １ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０） ｌＱｍＭ　ジチオトレイトール １μＩ　５−３５　（ｙ５ラベルしたユビキチンーレラキシンＢ鎖基質２．５μ ｍユビキチン・ヒドロラーゼ溶液。

インキュベートの後、反応混合物を等容量のＳＤＳ試料緩衝液と混合し、９０℃ に５分間加熱した。次いで、この試料を直接、１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにか け、電気泳動によってモニターして、未切断の基質から切断産物を分割した。Ｗ ｈａｔｍａｎ　Ｎｏ、　１紙片でゲルを乾燥し、これをＸ−線フィルムに一晩さ らすことによって、種々のラベルしたタンパク質種の検出を行った。この検定の 原理を示す概略図を第２図に挙げるにこで、ＲＧＧはユビキチンのカルボキシ末 端のａｒｇ−ｇｌｙ−ｇｌｙであり、Ｃはシスティンである］。

ラベルした基質はインビボでのラベル化によって得られるので、その量に制限が あり、決められない特異的な活性によって制限される。酵素量を定量する最も良 い方法は、連続希釈酵素溶液を用い、同じバッチの基質を用いて上記反応を行う ことである。希釈の倍率（酵素活性が減少する）を、特定の酵素溶液の相対活性 の指標として用いることができる。この目的に用いた希釈緩衝液は、酵素および 基質を含まない５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む反応力クチこの検定は 、別の基質であるユビキチンーｃｙｓ−ｃｙｓを用いたことを除き、原則的にタ ンパク質切断検定と同じである。切断産物、即ちユビキチンとｃｙｓ−ｃｙｓは ５ＤＳ−ＰＡＧＥの代わりに酸沈澱によって分離したが、これはｃｙｓ−ｃｙｓ が酸に可溶性であり、それより大きいユビキチンが不溶性であるためである。

全ての検定はエツベンドルフ管中、２５μｌの最終容量で行い、インキュベート は３７℃で２０分間行った。反応混合物は次の成分を含有していた： ５０ｍＭ　　　　トリス−Ｃ１（ｐＨ７，５）１ｍＭ　　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８， ０） １０ｍＭ　　　　ジチオトレイトール ５０μｇ７／ｍｌウシ血清アルブミン ｌ　ｕ　Ｉ　　　５−３５　Ｃｙｓラベルしたユビキチンー〇　ｙｓ−Ｃｙｓ基 質２．５μｍ　　ユビキチン・ヒドロラーゼ溶液。

インキュベートの後、反応混合物（２０μｍ）をＧＦ／Ｃフィルターディスク（ ２，１ｃｍ）にスポットし、直ちに氷上のビーカー中に入っている１０％（Ｗ／ Ｖ））リクロロ酢酸（ＴＣＡ）中に浸漬した。個々のフィルターディスクを、洗 浄工程の後、同定用の墨汁で予めラベルした。このビーカーを５分間の間に時々 かき混ぜた。このＴＣＡ溶液をデカントし、フィルターをさらに５％ＴＣＡ溶液 で洗浄した。

時々かき混ぜながらさらに５分間の後、ＴＣＡ溶液をもう一度デカントした。フ ィルターディスクを９５％アルコールですすいでＴＣＡを除去し、加熱ランプで 乾燥した。個々のフィルターディスクを計数バイアル中に入れ、計数液（５ｍｌ ）で満たし、シンチレーショ計数器で計数した。不溶性のユビキチンはフィルタ ーディスク上に保持されているので、フィルターディスクによって保持されてい る放射活性の減少によってヒドロラーゼ活性を測定した。

ラベルした基質はインビボでのラベル化によって得られるので、その量に制限が あり、決められない特異的な活性によって制限される。また、ヒドロラーゼの特 異的な活性は現時点では未知である。

従って、酵素量を定量する最も良い方法は、連続希釈酵素溶液を用い、同じバッ チの基質を用いて上記反応を行うことである。希釈の倍率（酵素活性が最初の放 射活性量の６０％を保持する結果を与える）を、特定の酵素溶液の相対活性の指 標として用いることができる。この目的に用いた希釈緩衝液は、酵素基質および 酵素それ自体を含まない反応カクテルである。

タンパク質融合体の切断検定およびシスティン放出検定の両者は同じ酵素を検出 するようなので、システィン放出検定において基質の約５０％加水分解を与える ように酵素溶液を希釈することによって活性を定量するのが最も簡単である。次 いで、酵素溶液の相対活性を、標準検定条件下で５０％加水分解を得るのに必要 な希釈倍率として定義した。

■、酵酵母ユビキノンヒドロラーゼの精製および検定全ての精製工程は、−晩の 透析、および貯蔵（４℃で行う）を除き、室温で行った。

Ａ０発酵 酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、１０１の発酵器 中、２．６％酵母窒素ベースおよび１％グルコース中、Ａ６１１０が３〜４にな るまで３０℃で増殖させた。次いで、Ａ６６゜が５０〜１００に達するまで、グ ルコースを用いて細胞をゆっくりと培養した。

Ｂ、細胞のホモジナイズ この酵母株の発酵ペースト（約１　ｋｇ）を緩衝液Ａ［５０ｍＭ）リス−Ｃ１（ ｐＨ，８）、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、および１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール］中にＩｇ／＋１で再懸濁した。得られた懸濁液を０ ．２５ｇ／ｍｌのガラスピーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｇ−８８９３；　１０６ミクロン およびそれより微細）と混合した。この細胞−ガラスビーズ懸濁液を、Ｗａｒｉ ｎｇ混合器中、最高速度で数回の２〜３分のパルスで合計１０分間混合した（こ の操作の間に温度が上昇しないように注意いなければならない）。細胞破壊の効 率は、懸濁液の短時間の遠心の後に上清のタンパク質濃度を測定することによっ てモニターすることができる。

ホモジナイズの後に、この懸濁液を５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ　Ｓ　Ａローター中、１ ２、００　Ｏｒｐｍで約３０分間遠心した。ベレットを集め、緩衝液Ａに再懸濁 しく最初のＩｇ／ｍｌの比で）、そしてさらに約５分間混合した（ここでも２分 のパルスで）。上記のように遠心した後、上溝を集め、最初の上清と合わせた。

合計した上清を、５ｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ｓ−３４０−ター中、１８．０００ｒｐ ｍで３０分間遠心することによってさらは２０ｍｇ／ｇ（元の生酵母ペースト） であった。

Ｃ１硫酸アンモニウム分画化 ユビキチン・ヒドロラーゼ活性を３３％〜６３％飽和の硫酸アンモニウムで回収 した。硫酸アンモニウムを粗製の透明にした上清に直接加えて最初の３３％飽和 を得、添加した固体の硫酸アンモニウム１ｇに対してＩＭトリス塩基約ｌμｌを 加えることによって懸濁液のｐＨを維持した。次いで、３３％飽和の上清を６３ ％飽和にした。

約半分のタンパク質が除去された。

Ｄ、ＤＥＡＥクロマトグラフィー ６３％硫酸アンモニウム飽和後のタンパク質沈澱を、ＧＳＡＳ−ローター中２． ０００ｒｐｍで３０分間、上記の懸濁液を遠心することによって集めた。タンパ ク質沈澱物を緩衝液Ａ（３５０ｍ＋１）中に再懸濁し、８０ｍＭＮａＣ１含有の 緩衝液Ａ（４１）に対して２４時間透析した（７２時間で１回の緩衝液交換）。

この透析したタンパク質溶液を、１時間あたり４００１１の流速で８０ｍＭ　Ｎ ａＣ１含有の緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カ ラム（５ｘ　２１ｃｍ）にかけた（流速は１時間あたり約８０ｍ１に落とした） 。このカラムを、８０ｍＭＮａＣ１，１７０ｍＭ　ＮａＣ１，２３０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１、および３００ｍＭＮａＣ１含有の緩衝液Ａで順番に洗浄した。それぞれの 洗浄の緩衝液容量は約１１であった。はとんど全ての活性が３００ｍＭＮａＣ１ 洗浄液で溶出し、この時点ではまだ変色の大きいカラムマトリックスを捨てた。

活性な分画を集め（約４５０１０１）、次のカラム分画にかけた。

Ｅ、フェニル−セファロースクロマトグラフィー固体の硫酸アンモニウムをプー ルしたＤＥＡＥ分画に、タンパク質溶液１００ｍ１あたり１０ｇの割合で加え、 １時間あたり約５０ｍ１の流速で１０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム含有の緩衝 液Ａで予め平衡化したフェニル−セファロースカラム（２，５ｘ　１７ｃｍ）に 直接かけた。

次に、このカラムを１０％（Ｗ／Ｖ）、次いで５％硫酸アンモニウムを含有する 緩衝液Ａ（それぞれ１００ｍ１）で洗浄した。次いで、５％硫酸アンモニウムを 含む緩衝液Ａと緩衝液Ａで構成される直線減少の勾配液（３５０ＩＩｌ）で酵素 を溶離した。初期の２０％の直線勾配に位置する活性分画をプールしく合計容量 は約８４ｍ１である）、Ａｍ１ｃｏｎメンプランによる限外濾過によって濃縮し た。この濃縮した酵素溶液（約４０ｍ１）を１１の緩衝液Ｂ［５０ｍＭ）リス− Ｃ１（ｐＨ８）、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、１０ＩＩＩＭ２−メルカプト エタノール］に対して一晩透析した。

Ｆ、ヒドロキシアパタイト　クロマトグラフィー透析した酵素溶液を、緩衝液Ｂ で平衡化したヒドロキシアバタイトカラム（１，Ｏｘ７ｃｍ）にかけた。このカ ラムを緩衝液Ｂ（１０ｍｌ）で洗浄し、次いで緩衝液ＢとＱ、５Ｍ硫酸アンモニ ウム含有の緩衝液Ｂの間の直線勾配液（５０ｍＭ）で溶離した。これを０．５Ｍ 硫酸アンモニウム、次いで１Ｍ硫酸アンモニウム含有の緩衝液Ｂ（それぞれ１０ ｍ１）でさらに洗浄した。酵素活性は勾配液中に存在し、次いでこれをプールし く合計容量は約８１１１１である）、そして０．１ＭＮａＣ１を加えた緩衝液Ａ に対して一晩透析した。

この時点での全体収率は、粗製の溶解液中に存在していた元の活性の約２０％で あり、全体の精製は約１５，０００倍であった。

Ｇ、ＤＥＡＥセファセルでの再クロマトグラフィー透析した酵素をＤＥＡＥセフ ァセルカラム（０，７ｘ　７ｃｍ）にかけ、このカラムを０．１ＭＮａＣ１含有 の緩衝液Ａで平衡化し、次いで同じ緩衝液（５ｍｌ）で洗浄した。酵素活性を緩 衝液Ａ中の０．１ＭＮａＣ１と１．０ＭＮａＣ１の間の直線勾配液（３０ｍｌ） で溶離した。

活性は予想の通り０．３ＭＮａＣ１のあたりに位置し、この時点での全体の収率 は、粗製の溶解液中に存在していた元の活性の少な（とも１５％であった。

Ｈ，５ＤＳ−ＰＡＧＥ 回収した活性の還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製し、銀染色した。

ゲルの目視による観察およびバンドの相対密度の比較によって、得られたユビキ チン・ヒドロラーゼが組成物中の全タンパク質の重量に基づいて約７０％の純度 であることがわかった。フェニルセファロース、ヒドロキシアパタイトおよび最 後のＤＥＡＥカラムを通じてヒドロラーゼ活性と共に移動した、分子量約３０． ０００ダルトンを有する主要なタンパク質種を、遺伝子のクローニングによって ユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質であると確認した。

１、ＨＰＬＣおよび配列決定 ＤＥＡＥカラムから回収した活性を、１０４０ダイオード配列検出器を備えたＨ ｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ１９０Ｍ中の、Ｓ　ｙｎｃ ｈｒｏｍ、　Ｉ　ｎｃ、からの４０００人広孔人力孔ム（１００ｍｍｘ２ｗｉｎ 直径）に入れた。１００％の溶液Ａから６０％の溶液Ｂまでの直線勾配液を６０ 分間で用いた。ここで、溶液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水溶液 であり、溶液Ｂは０．０７％ＴＦＡの１−ブロバノール溶液である。流速は室温 で１分間あたり２００μｍであり、ピークを２１４および２８０ｎｍでモニター した。２１４ｎｍでの吸収を有する全てのピークを、ヒドロラーゼ活性の特定の 検定に用いる緩衝液中に集めた。

還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで３０ｋＤａの分子量を有する収集ピーク由来の１つ のポジティブな検定が存在した。３０ｋＤａタンノ（り質を９０％豊富化したＤ ＥＡＥカラムからの１つの分画を、その溶離緩衝液中の分画に約５％のＬｙｃｔ ｎｅ　Ｃ（ｌｌａｋｏ）を加えることによって消化した。この消化は３７℃で２ ４時間行った。消化によって得られたペプチドを、上記と同じ条件を用いて上記 のＣ４−ＨＰＬＣカラムで分離した。この分離したペプチドを、エドマン分解を 用しするＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７　Ｑ　Ａ気相配列決定機 で配列決定した。

次のアミノ酸配列が得られた： １．５ＤＰＴＡＴＤＬＩＥＱＥＬＶＲＶＲＶＡ２、ＥＮＶＱＴＦＳＴＧＱＳＥＡ ＰＥＡＴＡＤＴＮＬＨＹＩ３、ＮＥＷＡＹＦＤＩＹ ４、ＮＲＦＤＤＶＴＴＱ　。

■、ヒドロラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現Ｆ　ｒｏｅｈｌｅｒ等（上記 ）の方法を用い、ＤＮＡ合成機で合成りＮＡプローブを合成した。このプローブ （プローブ１　；　５３ｍａｒ）は次の配列を有していた二 ５°−ＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＣＴＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡ　 ＡＴＴＧＧＴＴＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣ−３’全ゲノムＤＮＡを、Ｓｍ１ ｔｈ等［１１ｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１２　：　５３８−５４１（１９ ６７）］の方法により、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［ Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔ。

ｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡコの酵母株５１７９９Ｄ（α 廿ｐ５　ｈｉｓ４　ａｄｅ６ｇａ１２）から単離した。酵母ＤＮＡ（３７０ｕｇ ）を２１１１１ノ反応混合物中、２．５単位の５ａｕ３　Ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ、ｏｌａｂｓ）で部分消化した。その一部を１０．２０およ び３０分の時点で取り、冷却し、２０ｍＭ　ＥＤＴＡで不活性化した。集めてフ ェノール抽出したＤＮＡを、ＩＭＮａＣｌ、２０１Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８， ０）および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中の１０〜５０％スクロース勾配液中で遠心する ことによって分画した。５ａｕ３Ａ１　１０〜１５ｋｂフラグメント（アガロー スゲル電気泳動で測定）を単離し、ＢａｍＨＩ単離したアームで切断したバクテ リオファージλ　Ｃｈａｒｏｎ　３０に連結した［Ｍａｎｉａｔｉｓ等；上記コ 。

次いで、得られた連結ＤＮＡを用いてプレート上で大腸菌ＤＰ５０株（市販品か ら入手可能）を感染させた。１０，０００のプラークが非滅菌のニトロセルロー スフィルター［５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ。

ＢＡ８５．１３２ｎｍ直径コに現れた。このフィルターを、０．５Ｍ　ＮａＯＨ １１ＭＮａＣ１の溶液と接触させることによって変性した。次いで、これをトリ ス、ｐＨ７，５，３ＭＮａＣ１の溶液中で復元し、２ｘＳＳＣで洗浄した。復元 後、このフィルターを真空オーブン中、８０℃で１時間加熱した。次に、このフ ィルターを、５ｘＳＳＰＥ［２０ｘＳＳＰＥは、水（８００ｍｌ）にＮａＣ１（ １７４ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４−ＨｚＯ（２７，６ｇ）およびＥＤＴＡ（７，４ｇ ）を溶解し、ｐＨを７．４に調節し、容量を１１に調節することによって調製す る；あるいは、５ＳＰＥは０．１８Ｍ　ＮａＣ１，１０μＭ　ＮａＰＯ４，１ｍ Ｍ　ＮａＥ　ＤＴＡＳｐＨ７であるコ、５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液［１ｘ　 Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液＝０゜１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、 ０，１％ＢＳＡ］、Ｑ、ｌｉＭ　ＡＴＰ、０．２μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子 ＤＮＡ、２０％ホルムアミド、および０．１％ＳＤＳからなるプレハイブリダイ ゼーション緩衝液中、４２℃で５分間処理した。次いで、プローブ１（下記のよ うに放射活性なリンでその５°末端をラベルした）を、このプレハイブリダイゼ ーション混合物に２ｘｌＯ’ｃｐ〜／ｍｌの濃度で加えた。

０．０５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、０　、　ＯＩ　Ｍ　ＭｇＣｂ、０． ００５Ｍジチオトレイトール、０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＥＤＴＡ、 ３５μｇ／ｍ１合成プローブ１．４ｍＣ１／ｍｌ　７３２Ｐ　ＡＴＰ（約５００ ０Ｃｉ／ｍモル）およびＩＯＵポリヌクレオチドキナーゼを含有する溶液中、３ ７℃で３０分間、プローブ１を３２Ｐで５′末端ラベルした。このラベルしたＤ ＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ３抽出し、エタノール沈澱させ、水に再懸濁させた 。導入された３２Ｐは、プローブ溶液の一部をＤＥＡＥフィルターディスクにス ポットし、０．５Ｎギ酸アンモニウムで徹底的に洗浄し、次いで液体シンチレー ション計数することによって測定した。

このフィルターをプローブ１と共に４２℃で１時間インキュベートした。次いで 、フィルターをプローブ溶液から取り出し、２ｘＳＳＣ＋０，１％ＳＤＳ中で３ 回、３７℃で１５分間洗浄した。このフィルターを一７０℃で３時間、Ｘ線フィ ルムに暴露した。ポジティブなプラークを選択し、ＤＮＡ用の液体培地で増殖さ せた。

ファージＤＮＡを増殖させた後、数種の制限酵素でこのファージを切断した。得 られたフラグメントをニトロセルロースフィルター上に置き、上記のようにプレ ハイブリダイゼーション混合物およびプローブ１で処理した。このプローブはフ ァージλ７の１，２ｋｂＳＢＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントにハイブリダイズす ることがわかった。

５ａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断することによってこのフラグメントをλ７から 単離した。

Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｉｐ１９バクテリオファージ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）を５ａｌＴおよびＢａａ＋ＨＩで切断し、 太きいフラグメントを単離した。λ７由来のフラグメントを、このフラグメント がｌａｃプロモーターの支配下に入るようにＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１ ９由来の大きいフラグメントに連結した。得られた構築物をＸ−Ｇａ１プレート 上のＪＭＩＯＩに蒔いた［Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｖｉｅｒａ、　Ｇｅｎｅ　 １９　：　２６９−２７６（１９８２）］。無色のプラークを取り、Ｍ１３ｍｐ １８バクテリオフバクテリオファージ中トを含有している１本鎖のＤＮＡ鋳型に ついて、Ｓ　ａｎｇｅｒ等（上記）のジデオキシ鎖終止法によって５ａｌＩ部位 からＢａｍＨＩ部位までを、そして合成のファージ特異的なブライマーを用いて 逆に配列決定した。

それぞれの方向で約５００ｂｐを決定した後、決定した配列に基づいて新しいブ ライマーを設計し、配列をさらに５００ｂｐ延長した。

制限マツピングによってＳａｉｌ−ＢａｍＨＩフラグメントに隣接していること が示された２ｋｂの５ａｌＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１８中に クローンし、約５００ｂｐについてＤＮＡ配列を決定した。

５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素の［薄層］ゲルでの電気泳動によって試料を 分離した。ゲルをＷｈａｔｉａｎ　３ＭＭ紙上で乾燥し、時間を変えてコダック Ｘ線フィルムに暴露した。

第３図は、このフラグメントに対して決定された５ａｉｌ末端からＢａｉ＋ＨＩ 末端の約３００塩基以内までのヌクレオチド配列、ならびに２６ｋｂの酵母ユビ キチン・ヒドロラーゼＹＵＨ−１の帰属させたアミノ酸配列および種々の制限部 位の位置およびプローブ１の位置を示すものである。第４図は配列決定の方向を 示すものである。

第５図は、ＹＵＨ−１の予想アミノ酸配列を示すだけでな（、ＨｉｎｄＩＩＩか らＢａｍＨＩまでのその境界配列をも示している（λおよび酵母ＤＮＡを含有す るＳａｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと境界を接する２ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｓ ａｌ　Ｉフラグメントの部分的配列に基づ（）。３つの配列決定したペプチドの 位置を星印で示す。５３−ｍａｒのプローブ配列を正しいＤＮＡ配列の下に示す 。誤対合は小文字で示す。このプローブは正しいＤＮＡ配列と８７％一致してい る。

Ｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩのヒドロラーゼをコードしている挿入体を含有するＭ １３ｍｐ１９バクテリオファージを用いて大腸菌株５ＲＩＯＩ（市販品から入手 可能）を形質転換し、ＬＢブロスを培養培地とじて用いて増殖させた。培養培地 に１ｍＭのＩＰＴＧを加えることによってタンパク質の産生を誘導した。

５ＲＩＯＩ細胞の溶解は、Ｋ５７７２由来のユビキチン・ヒドロラーゼ用のラベ ル化タンパク質基質の調製について本明細書中のタンパク質検定の項で説明した 溶解法を用いて行った。

細胞溶解液を遠心して透明にし、次いで上記の融合ポリペプチド検定によって活 性を調べた。この検定は両検定による検出可能なユビキチン・ヒドロラーゼ活性 を示し、クローンしたＤＮＡ配列がヒドロラーゼタンパク質をコードしており、 Ｉ　ＰＴＧによって誘導されることを示した。

実施例■ 酵母ユビキチンをコードしているＤＮＡフラグメントを、メトキシホスホルアミ ダイトを用いるＤＮＡ合成機で化学的に合成した。

酵母ユビキチン遺伝子を３２アミノ酸のヒト（Ｈ２）レラキシンＢ鎖をコードし ている遺伝子に結合させて合成して第１ａ図に示す配列を得、２４アミノ酸のヒ ト（Ｈ２）レラキシンＡ鎖に、プロレラキシンに、モして３３アミノ酸のヒト（ Ｈ２）レラキシンＢ鎖に結合させて第１ｂ図に示す配列を得た。それぞれのフラ グメントは、その末端に接着末端ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩ部位を有するように 設計した。

プロレラキシンの構築は欧州特許公開Ｎｏ、　２６０．１４９（１９８８年３月 １６日公開）に記載されている。Ａ鎖しラキシンのＤＮＡ配列はＥＰ公開Ｎｏ、 　１１２．１４９（上記）に挙げられている。

この合成遺伝子を、欧州特許公開Ｎｏ、　２６０．１４９に詳細に記載されてい るプラスミドｔｒｐ　２０　？−１本ｔｅｔｘａｐのＸｂａｌおよびＢａｍＨＩ 消化の後の大きいフラグメントに別々にクローンした。ユビキチン融合ポリペプ チド遺伝子がｔｒｐ　２０７−１　＊ｔｅｔｘａｐプラスミドのｔｒｐプロモー ターの支配下にくるようにこのユビキチン融合ポリペプチド遺伝子を連結した。

得られたプラスミドで大腸菌株ＭＭ２９４（市販品から入手可能）を形質転換し 、培養培地にインドールアクリル酸を加えることによって融合タンパク質の合成 を誘導した。還元条件下で銀染色を用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって顕著な タンパク質バンドが明らかになった。ウェスタン・プロット分析を行うと、この バンドは適当なレラキシン部分に指向性である抗体と反応した。

このバンドはそれぞれの場合の正しい分子量に一致することがわかった。

次いで、それぞれの形質転換体の培養物を発酵させ、収穫し、抗−ユビキチンモ ノクローナル抗体を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに通し た。カラムに結合した物質を溶離し、上記のように精製したユビキチン・ヒドロ ラーゼを吸着させたカラムに通した。カラムからの溶出液を、抗−ユビキチンモ ノクローナル抗体を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに通し た。種々のレラキシンポリベブチドを別々に含有している第１の分画を、切断さ れたユビキチン、ユビキチン融合ポリペプチドおよび全ての細胞残骸を含まない ように得、これをプールした。

（以下、余白） 実施例■ ユビキチンーレラキシンＡ鎖の合成りＮＡがＸｂａｌおよびＢＪ１ｍＨ１消化の 廿ｐ　２０７−１　＊ｔｅｔｘａｐの大きいフラグメントに挿入された実施例■ のプラスミドをｐＴＲＰ−ＵｂｉＡと命名した。ｐＴＲＰ−ＵｂｉＡをＸｂａＩ およびＢａｍＨＩで消化し、大きいフラグメントを単離した。Ｃｈａｒｏｎ　３ ０クローン由来の１．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例 工）を単離し、唯一のＢａｎ１部位で切断した。大腸菌リポソーム結合部位配列 およびその５°末端にＸｂａＩ部位をコードしている合成りＮＡ（その配列を第 ６図に示す）をＢａｎＩ部位ζ二連結して、クローンしたユビキチン・ヒドロラ ーゼ遺伝子の５’、ＩＩＬ翻訳化末端を結合部位に置き換えた。得られたＸｂａ 　Ｉ　−ＢｒｍＨＩフラグメントをｐＴＲＰ−ＵｂｉＡの大きいフラグメント中 にクローンして、この遺伝子をこのプラスミドのｔｒｐプロモーターの支配下（ 装置（Ａた。

ｐＴＲＰ−ＹＵＨと命名したこのプラスミドの構築を第６図（こ示す。

ｐ’ｒ　ＲＰ　−Ｙ　Ｕ　Ｈを大腸菌株ＭＭ２９４に導入し、３７℃で飽和１こ なるまでＬＢ培地またはＭ９最少カザミノ酸培地（トリプトファンを欠く）で増 殖させた。試料を本明細書中に記載したようなＳＤＳ試料緩衝液中、９０℃で溶 解し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、次いでクーマツシ ー・ブリリアント・ブルーで染色した。この結果を第７図に示す。レーン（ａ） はＭ９最少カザミノ酸培地（トリプトファンを欠く）での大腸菌株の増殖であり 、レーン（ｂ）はＬＢ培地での増殖である。

Ｍ９培地においてｐＴＲＰ−ＹＵＨで形質転換した大腸菌は、第７図に示した５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の顕著なバンドから測定すると、２６ｋｄのユビキチン・ ヒドロラーゼを過生産した。ＬＢ培地での同じプラスミドは２６ｋｄのユビキチ ン・ヒドロラーゼのバンドを生じなかった。

ユビキチン・ヒドロラーゼを単離し、次のようにして精製した。

大腸菌細胞（約６０ｇ）を緩衝液Ａ（１２０ＩＩｌｌ）に再懸濁した。この細胞 懸濁液をソニケーター中で３．５分間超音波処理し、遠心して透明にした。この 透明上清を、０．１Ｍ　ＮａＣ１含有の緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファセ ルカラム（２，５ｘ　１６ｃｍ）に直接かけた。

このカラムを０，１ＭＮａＣ１含有の緩衝液Ａで洗浄し、次いで緩衝液Ａ中、０ ．１Ｍ　ＮａＣ１〜０．５Ｍ　ＮａＣ１の直線勾配液で展開し、次に９．５ＭＮ ａＣ１含有の緩衝液Ａで洗浄した。活性をシスティン放出検定で位置決めし、プ ールした（６０ｍｌ）。このプールした酵素溶液に十分量の硫酸アンモニウムを 加えて１０％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度を得た。

次に、この酵素溶液を、緩衝液Ａおよび１０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウムで平 衡化したフェニル−セファロースカラム（２，５Ｘ　１２ｃｍ）にかけた。緩衝 液Ａおよび１０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウムで洗浄した後、緩衝液Ａ中、１０ ％から０％（Ｖ／　Ｖ）硫酸アンモニウムの減少勾配液で展開した。ヒドロラー ゼ活性は主タンパク質ピークで同時溶離し、第７図のレーン３に示すように５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ分析で測定すると、この工程後は実質的に純粋であった。全ての活 性分画をプールし、保存用に５０％グリセロールおよび緩衝液Ａに対して透析し た。

この精製したタンパク質はユビキチンタンパク質融合体を切断することができ、 実施例Ｉに記載した検定を用いるシスティン放出検定において活性であった。

実施例■ 本実施例は、大腸菌中インビボでタンパク質を切断するユビキチン・ヒドロラー ゼの能力を例示するものである。

第６図に示すプラスミドｐＴＲＰ−ＹＵＨ由来の廿ｐプロモーターおよびＹＵＨ −１遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをλｇｔｌｌファージにクローンした 。λｇｔｌｌ　ＴＲＰ−ＹＵＨの構築を第８図に示す。この組換えファージを用 いてＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ含有の菌株に５７７２を溶原化した。得られた菌 株（大腸菌株に５８０８と命名；そのゲノム中にユビキチン・ヒドロラーゼをコ ードしている遺伝子を含有する）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣＮｏ、５３．８３２のもとで寄託されて いる（１９８８年１１月３０日寄託）。

ユビキチンーレラキシンＡ融合タンパク質を含有しているプラスミドｐＴ７−３ ＵｂｉＡＰを、ｐＴ７−１２およびｐｔｒｐＳＴ２ＨＧＨから始め、第９〜１３ 図に記したようにして調製した。

ｐＴ７−１２ＳＴ２ＨＧＨの構築（第９図）プラスミドｐＴ７−１２（実施例Ｉ に記載）をＨ１ｎｃＩＩおよびＢａｍＨｌで消化し、大きいベクターフラグメン トを単離した。プラスミドｐｔｒｐ　Ｓ　Ｔ　２　ＨＧ　Ｈ（ＥＰ　１７７、３ ４３）をＨｐａｌおよびＢａｍＨ１１’消化し、小さいｈＧＨ暗号フラグメント を単離した。これら２つのフラグメントを連結してｐＴ７−１２ＳＴ２ＨＧＨを 得た。

ｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１の構築（第１０図）プラスミドｐＴ７−１２ＳＴ ２ＨＧＨをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、大きいベクターフラグメントを 単離した。プラスミドｐΔＲＩ　Ｐ　Ａｏ（ＥＰ　９３．６１９　；大腸菌ｔｒ ｐブ０モーター／オヘレーターオヨヒヒトｔ−ＰＡ遺伝子を含有する）をＢｓｔ ＸＩおよびＢａｍＨＩで消化し、小さいフラグメント（ｔ−ＰＡ遺伝子）を単離 した。また、同じプラスミドをＢｓｔＸＩおよびＰｓｔＩで切断し、３８３ｂｐ のフラグメントを単離した。これら３種のフラグメントを、以下の２種類の２本 鎖合成りＮＡフラグメントＡ（ＳＴＩＩシグナルのＮ−末端をコードしている） およびＢ（ｔ−ＰＡのＮ−末端セリル残基に融合した５ＴＩＩシグナルのＣ−末 端をコードしている）と連結してｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１を得た。

ＸｂａＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍ ｌｕＩＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＡｍＣＴＴＣＴＴ ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＴＴＣＧＴＴｒＴＴＴＣＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡ`Ａ ＭｌｕＩ　　　　　　　　　　ＰｓｔＩＡ１ａＴｙｒＡｌａＳｅｒ丁ｙｒＧ１ｎ Ｖａ１１１ｅＣｙｓフラグメントＢ ■で部分的に消化した。このベクターをＤＮＡポリメラーシーのフレノウ・フラ グメントで処理して接着末端を修復し、次いで単離し、自己に連結させてｐＴｅ ｔｒａＳｅｒΔＡＮを得た。プラスミドｐＡＰＨ−１［Ｐ、　Ｇｒａｙ　ｅｔ　 ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　３９　：　２４７（１９８５）コをＥｃｏＲＩおよびＸ ｂａＩで消化し、４００塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントを単離 し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ消化のｐＴｅｔｒａｓｅｒΔＡＮに連結してプラ スミドｐＡ　Ｐ　ｔｅｔｒａ　Ｓ　ｅｒを得た。プラスミドｐＡＰｔｅｔｒａＳ ｅｒをＸｂａＩおよびＮｄｅＩで消化し、ベクターを単離した。第１１図に示す 配列の合成オリゴヌクレオチドフラグメントをキナーゼ処理し、アニーリングし 、プラスミドｐＡ　Ｐ　ｔｅｔｒａ　Ｓ　ｅｒから得たＸｂａｌ−Ｎｄｅｌベク ターに連結して、プラスミドｐＡＰＳ７２１　ＦＮ−７ΔＮｄｅ　Ｉ　−Ａｖａ 　Ｉを得た。このプラスミドは、アルカリホスファターゼ遺伝子由来のプロモー ター［Ｙ、　Ｋｉｋｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　９　：　５６７１（１９８１）コ、および大腸菌の熱シグナルエン テロトキシン■の分泌シグナル［Ｒ，Ｎ、　Ｐｉｃｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉａ＋ｍｕｎｉｔｙ　４２　：　２６９（１９８ ３）］を含有している。

ｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡの構築（第１２図）ｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１をＸ ｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、小さいフラグメントを単離した。同じプラス ミドを）（ｂａｒおよびＰｖｕＩＩで消化し、９６ｂｐのフラグメントを単離し た。

ｐＡＰＳＴ２ＩＦＮ−７ΔＮｄｅ　ｌ　−Ａｖａ　ＩをＨｉｎｄＩＩＩで切断し 、フレノウＤＮＡポリメラーゼＩで処理して接着末端を充填し、ＢａｍＨＩで切 断し、そして大きいフラグメントを単離した。

ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩの小さいフラグメント、９６ｂｐのフラグメント、および ｐＡＰＳＴ２　ＩＦＮ−７ΔＮｄｅ　Ｉ　−Ａｖａ　ｌ由来の大きいフラグメン トを連結してプラスミドｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡを得た。

Ｔ７−３ＵｂｉＡＰの構築（第１３図）ｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡをＸｂａｌおよ びＢａｍＨＩで消化し、大きいフラグメントを単離した。ｐＴＲＰ−ＵｂｉＡを ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩで消化し、小さいフラグメントを単離した。この小さ いフラグメントをｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡ由来の大きいフラグメントに連結した 。

得られたプラスミドｐＴ　７−３　ＵｂｉＡをＤｒａＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで 消化し、第１３図に示す合成りＮＡフラグメントに連結してｐＴ７−３ＵｂｉＡ Ｐを得た。

ｐＴ７−１２ＵｂｉＢの構築 ｐＴ７−１２ＳＴ２ＴＰＡ−１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化して大きいフ ラグメントを単離し、ユビキチンーレラキシンＢ−２９融合タンパク質をコード しそしてＸｂａｌおよびＢａｍＨＩ接着末端を有する合成りＮＡフラグメントに 連結してｐＴ７−１２ＵｂｉＢを得た。

形質転換および切断 菌株に５８０８をｐＴ　７−３　ＵｂｉＡ　ＰまたはｐＴ７−３ＵｂｉＢで形質 転換した。さらに、対照としてレラキシンＡ鎖だけをコードしているプラスミド （ｐＴ７プロモーターの支配下にある）で菌株に５７７２を形質転換し、細胞上 清を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。また、実施例■の大腸菌から精製したユ ビキチン・ヒドロラーゼで処理したレラキシンＡ鎖融合体の上清も分析した。

Ｋ５７７２およびに５８０８株を、メチオニン、システィンおよびトリプトファ ンを除くそれぞれ５０μｇ／ｍｌの共通のアミノ酸を含有するＭ９最少塩培地で 、および適当なプラスミドを維持するための５０μｇ／ｍｌのアンピシリン下で 培養した。インキュベートは、Ｋ５７７２誘導体については３７℃であり、Ｋ５ ８０８誘導体については３２℃であった。ＯＤが０．４になるまで培養物を増殖 させ、この時点でＩＰＴＯを１ｍＭの濃度になるまで加え、そして３０分間イン キュベートを続けた。リファンピシンを２００μｇ／ｍｌまで加え、培養物をさ らに３０分間インキュベートした。３５Ｓ−システィンを加え（１０ｕ　Ｃｉ／ ｍｌ、６００Ｃｉ／ｍモル）、培養物を表示した時間パルスラベルした。試料を 、直ちにＳＤＳ試料緩衝液［１０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノー ル、２．３％ＳＤＳ、０．０６２５トリスーＨＣＩ（ｐＨ５，８）、０．０４％ ブロムフェノール・ブルー］中、９０℃で５分間溶解し、次いで氷上に置くか、 または、ラベルした細胞を素早くエッペンドルフ管中でペレット化し、エタノー ル／ドライアイス中で凍結させた。パルス−チェース実験を行ったときにはパル ス後すぐにクロラムフェニコール（１００μｇ／ｍｌ）を加え、インキュベート を続け、１０．２０および３０分でパルス−チェース試料を採取した。即ち、Ｔ ７　ＲＮＡポリメラーゼによってインビボでラベルしたポリペプチドは続いてパ ルス−チェースを行い、そして還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を第１４図に示す。ここで、レーン（ａ）は大腸菌株に ５７７２におけるラベル化しラキシンＡ融合の細胞上清であり、（ｂ）は大腸菌 由来の精製ユビキチン・ヒドロラーゼによりインビトロで処理したラベル化しラ キシンＡ融合の上清であり、（Ｃ）〜（ｆ）はユビキチン・ヒドロラーゼ遺伝子 を含有する菌株に５８０８においてラベルしたレラキシンＡ融合体であり［（ｄ ）〜（ｆ）はそれぞれ１０，２０および３０分間チェースした］、（ｇ）〜（ｊ ）は菌株に５８０８においてラベルしたレラキシンＢ融合体である［（ｈ）〜（ ｊ）はそれぞれ１０．２０および３０分間チェースした］。ユビキチン単量体と レラキシンＡポリペプチドの位置が示されている。

ＹＵＨ−１遺伝子ならびに組込みλファージを欠く菌株に５７７２は融合タンパ ク質だけを産生じた。しかし、ＹＵＨ−１遺伝子を含有するに５８０８株は、ユ ビキチンの大きさのポリペプチドにチェースされる融合タンパク質を産生した。

カルボキシ末端延長ポリベブチドレラキシンＡ鎖は、レラキシンＢ鎖のように、 減成されることが明らかであった。

実施例Ｖ 本実施例は、ユビキチンの７６位のアミノ酸またはユビキチンに融合させたポリ ペプチドのＮ−末端のアミノ酸（７７位）を変えたときの作用を示すものである 。

ユビキチン遺伝子は、融合タンパク質をコードしているＤＮＡを結合させるのに 用いた唯一のＤｒａＩＩＩ部位の５′に好都合な唯一の５ａ１１部位を有してい る。以下に示すＤＮＡフラグメントを、エビキチン３′末端を再構成するのに必 要なヌクレオチドの残りに連結し、Ｓ　ａｃ１１部位を挿入した。この末端に、 レラキシンＡに融合したユビキチンをコードしているＤＮＡを含有するｐＴ７− １２ＵｂｉＡＰを５ａｌｌおよびＢａｍＨＴで切断し、５′末端に５ａｌｌ接着 末端および最上の配列の３゛末端にＢａｍＨＩ接着末端を有する以下の合成りＮ Ａフラグメントの１つと連結した（ポリペプチドの残りをコードしているベクタ ー提供のヌクレオチドには下線を引いた）。ｐＴ７−１２ＵｂｉＡＰは、ｐＴ７ −１２ＳＴ２ＴＰＡ−１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断して大きいフラグメ ントを単離し、ｐＴ　７−３　ＵｂｉＡ　ＰをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断 して小さいフラグメントを単離し、そしてこれら２つのフラグメントを連結する ことによって調製した。

ｐＴ　７−３　ＵｂｉＡ　ＰをＤｒａＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、大きい フラグメントを単離し、そしてこれを以下のポリペプチドの１つをコードしてい る合成りＮＡフラグメントに連結することによって別の組の構築物を調製する： （Ａｓｐ　７７）ユビキチンーＡｓｐ−レラキシンＢ鎖のアミノ酸２−２９（Ｇ ｉｎ　７７）　ユビキチンー〇ｉｎ−レラキシンＡ鎖のアミノ酸２−２４また、 （Ｇｌｕ　７７）　［ユビキチンーＧｌｕ−ペンタペブチドーレラキシンＢ鎖の アミノ酸２−３３］を上記のようにして調製した（第１ｂ図および実施例工）。

さらに、ｐＴ７プロモーターによって誘導される、融合ポリペプチドの合成りＮ Ａが７７位（融合ポリペプチドのＮ−末端）にメチオニンまたはシスティン残基 をコードするようにプラスミドを構築した。

菌株に５７７２を上記プラスミドのそれぞれで形質転換し、タンパク質基質をラ ベルし、そして融合タンパク質のインビトロ切断検定を実施例工の記載のように 行った。

Ｇ１ｕ７７、Ａｓｐ７７、Ｇ１ｎ７７、Ｃｙｓ７７、Ｇｌｙ７７、およびＭｅｔ ７７構築物で効果的な切断が達成された。しかし、プロリンがこの７７位に挿入 されると、切断は観察されず、Ｂ　ａｃｈｍａｉｒ等［５ｃｉｅｎｃｅ　２３４ 　：　１７９−１８６（１９８６）コのインビボでの結果と一致した。

さらに、ユビキチンの７６位（Ｃ末端）のバリンまたはシスティン置換によって 切断がブロックされ、７６位のグリシン残基が重要であることがわかった。

実施例■ ）’　１ｎｌｅｙ等［Ｃｅ１ｌ　４８　：　１０３５−１０４６（１９８７）］ は、酵母のペンターユビキチン遺伝子を削除するとこの細胞が環境ストレスに対 して感受性になることを見い出した。従って、ＹＵＨ−１遺伝子を除去すると同 一かまたはさらに重度の表現型を生じるはずである。これは、この細胞がユビキ チン単量体を生成する方法を有しておらず、従ってユビキチンマイナスであるた めである。

即ち、以下に記載するようにしてＹＵＨ−１遺伝子をＵｒａ３遺伝子で遮断した 。最終のプラスミドｐＹＵＨ：：ＵＲＡ３をｐｃＧＹ３７９（この構築は以下に 示す）および上記のｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡから調製した。

ｐＣＧＹ３７９は、Ｙ　Ｅ　ｐ　２４　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１１６６ｂｐのフラグメントを単離すること によって調製した。このフラグメントを第１５図に記した合成リンカ−と連結し た。ｐＵｃ１１９（市販品から入手可能）を５ａｌＩで切断し、リンカ−を有す る１１６６ｂｌ）フラグメントに連結した。得られたプラスミドがｐＣＧＹ３７ ９であり、その構築を第１５図に図示した。

ｐＹＵＨ：：ＵＲＡ３は次のように調製した。ｐＴＲＰ−ＹＵＨ（上記）を５ａ ｉｌおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＹＵＨ−１遺伝子を含有する小さいフラグメン トを単離した。ｐＴ７−３ＳＴ２ＴＰＡをＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで切断し、 大きいベクターフラグメントを単離した。これら２つのフラグメントを連結して プラスミドｐＹＵＨ１を得た。ｐＹＵＨｌをＥｃｏＲＶで切断した。ｐＣＧＹ３ ７９をＳｍａＩで切断し、酵母ＵＲＡ３遺伝子を含有する小さいフラグメント（ １，１ｋｂ）を単離した。このＳｍａＩフラグメントと切断したｐＹＵＨ１プラ スミドを連結し、連結産物をＥｃｏＲＶで切断し、ＹＵＨ−１遺伝子内にＵＲＡ ３遺伝子を含有するｐＹＵＨ：：ＵＲＡ３を得た。この構築を第１６図に示す。

ｐＹＵＨ：：ＵＲＡ３プラスミドを５ａｉｌおよびＥｃｏＲＩ　テ切断した。こ の小さいフラグメント（１，９５ｋｂフラグメント）を、ハイブリダイゼーショ ンプローブとして用いた未遮断のＹＵＨ−１遺伝子を含有する５ａｉｌ−Ｅｃｏ ＲＩ　　８４７ｂｐフラグメントと共に第１７図に示す。

倍数ｕｒａ３／ｕｒａ３酵母栄養要求変異種（ａ／αｕｒａ３−５２）を、通常 の交配法により、半数ＤＢＹ７４７（ＭＡＴ　ａ　ｕｒａ３−５２）およびＤＢ Ｙ７４６（ＭＡＴ　ａ　ｕｒａ３−５２）を交配することによッテ調製すること ができる。これらの半数体はＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔ ｅｒ［Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ］から入手することができる。得られた倍数体 を、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１　：　２０２− ２１１（１９８３）］の記載のようにして１．９５ｋｂのフラグメントで形質転 換することができる。

ＵＲＡ′″の倍数体を選択し、胞子形成させる［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　；上記］ 。この胞子を分析し、増殖およびＵ、ＲＡ表現型について試験する。ＵＲＡ“あ るいはＵＲＡ−にかかわらず全ての胞子が生存性であり、半数体酵母コロニーに 増殖した。親の倍数体株、ＵＲＡ”倍数体、ＵＲＡ＋倍数体由来のＵＲＡ”半数 体胞子およびＵＲＡ＋倍数体由来のｕｒａ−半数体胞子からＤＮＡを調製し、５ ａｉｌおよびＥｃｏＲＩで切断し、下記のようにラベルしたＹＵＨ−１遺伝子由 来の８４７ｂｐの５ａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして用いてサ ザーン・プロットを行い、ＹＵＨ−１遺伝子中へのＵＲＡ３遺伝子の挿入につい てスクリーニングした。

８４７ｂｐの５ａｌＩ−ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡフラグメントは、ランダムプライ ムしたＤＮＡ合成でラベルした。１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０ ｍＭ　ＭｇＣｌ□、１１００ｕ　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、４ｍＣ１／ ｍｌ　ａ３２Ｐ　ｄＣＴＰ、および４０　μｌ／ｍｌウシ胸腺プライマー中に８ μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む混合物を２分間、１００℃に加熱し、次いで氷上で冷 却した。フレノウ酵素（４００Ｕ／ｍｌ）を加え、インキュベートを室温で１時 間行った。混合物をフェノール／ＣＨＣｌ、抽出し、エタノール沈澱させた。導 入された放射活性を実施例■の記載のようにして測定した。ラベルしたプローブ を１００℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、次いでハイブリダイゼーション反応 液に加えた。プローブのハイブリダイゼーションは実施例工の記載のようにして 行った。

得られたサザーン・プロットを第１８図に示す。ここで、レーン（ａ）は親の菌 株（ｕｒａ−倍数体）、（ｂ）はＵＲＡ”倍数体、（ｃ）はＵＲＡ”半数体、お よび（ｄ）はｕｒａ−半数体である。

８４７ｂｐの親のＳａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　７ラグメントは、親の倍数体、Ｕ ＲＡ＋倍数体、およびｕｒａ−半数体で観察された。２ｋｂの挿入フラグメント はＵＲＡ＋半数体およびＵＲＡ＋倍数体にのみ存在した。これらの実験によって 、倍数体の親の形質転換体の１つの染色体中、ならびに半数体胞子中のＵＲＡ３ 遮断ＹＵＨ−１遺伝子の存在が確かめられた。

ＹＵＨ−１ネガテイブなＵＲＡ”倍数体および半数体クローンの抽出物について 、実施例Ｉの記載のようにして、ユビキチンータンパク質のインビトロ切断活性 を調べた。この結果は、ＹＵＨ−１ネガテイブなりローンがほぼ野生型の酵素レ ベルを有していることを示した。ＵＲＡ３遺伝子が３５番目のアミノ酸のところ でＹＵＨ−１遺伝子を遮断し、ＡＵＧ翻訳開始コドンがＹＵＨ−１遺伝子中に見 い出されないので、この分離したＹＵＨ−１遺伝子から活性なタンパク質を産生 ずることができない。従って、第２の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードし ている少なくとも第２の遺伝子ＹＵＨ−２が存在する。この遺伝子はＤＮＡ配列 レベルではＹＵＨ−１に関連していない。何故なら、低ストリンジエンシーでＹ ＵＨ−１遺伝子をプローブとして用いたときに、第２のハイブリダイゼーション バンドが第１８図のＹＵＨ−１ネガテイブなＵＲＡ＋半数体由来のＤＮＡのサザ ーン・プロットにおいて観察されないためである。従って、この遺伝子ＹＵＨ− ２は第２の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている。

実施例Ｉのセクション■に記載されている方法を用いて、初めにＵＲＡ”半数体 ［そのサザーン・プロットがレーン（Ｃ）に示されている］を発酵させ、精製し 、それに含まれているヒドロラーゼを部分的に配列決定する（プローブを設計す る目的で）ことによって、この第２の酵母ユビキチン・ヒドロラーゼタンパク質 をクローンし、発現させた。少なくとも一部の配列が得られると、これを用いて 合成プローブを調製することができ、このプローブを用いて実施例工のセクショ ン■の記載のようにして酵母ライブラリーをスクリーニングする。プローブとハ イブリダイズするＤＮＡフラグメントを関連のファージから単離し、Ｍ１３ｍｐ １９および／またはＭ１３ｍｐ１８バクテリオファージにクローンし、そして実 施例Ｉの記載のように配列決定する。次いで、ヒドロラーゼをコードしているフ ラグメントを、ｔｒｐなどの適当なプロモーターに、およびリポソーム結合部位 に連結し、大腸菌株に導入し、例えば実施例■でＹＵＨ−１について記載したよ うにして発現を誘導する。

まとめると、ユビキチンータンパク質融合体をプロセッシングする触媒活性をコ ードしている遺伝子（ＹＵＨ−１）を、酵母Ｓ　ａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからクローンした。この遺伝子は２６ｋｄの タンパク質をコードしており、はとんどの酵母遺伝子と同様、イントロンを含ん でいない。このＹＵＨ−１遺伝子を大腸菌において活性形で過発現させ、均質に なるまで精製することができ、この酵素は大腸菌の細胞内でユビキチン融合体を 切断することができる。

酵母から単離されたときに、ユビキチン・ヒドロラーゼは少なくとも２つの他の タンパク質を含有する複合体として精製される。

ＹＵＨ−１遺伝子の遺伝子遮断は半数体酵母にとって致死性ではない。実際のと ころ、システィン放出検定で測定したときのユビキチン・ヒドロラーゼのレベル は、そのような菌株においては正常に近い。この酵母細胞は第２のユビキチン・ ヒドロラーゼ遺伝子ＹＵＨ−２を含有しているようである。

酵母ユビキチン・ヒドロラーゼは、ユビキチン融合タンパク質のｇｌｙ７６の次 のペプチド結合の切断に特異的である。ユビキチン部分中の７６位の１個のアミ ノ酸を変えると切断が阻害されるようである。しかし、この酵素は、Ｃ−末端延 長の大きさ、または切断部位に続くプロリン以外の残基には比較的非感受性のよ うである。

インビトロで精製およびプロセッシングされるユビキチン融合タンパク質のイン ビボ合成は、特定のアミノ末端を有するタンパク質の合成を可能にする。この方 法は、その大きさの故に細胞内で急速に分解される小さいペプチドを調製する際 に特に有用であろう。また、ユビキチン・ヒドロラーゼはユビキチンータンパク 質コンジュゲートからユビキチンを切断するのにも活性であるので、精製された ヒドロラーゼは、活性検定および／または配列決定を行う前にインビトロで真核 性タンパク質を脱ユビキチン化するのに極めて有用である（ユビキチンの存在が これらの過程を妨げるので）。

ＨＩｎｄＩＩＩ　／ρｖｕＩＩ ８４７ｂｐ １．９５ｋｂ −一１−−ｍ１＾帥皺吟−一・　　　　ｐ−〒／Ｉｌｌ：　　ＱＯ／ｎつｌ：’ 、１国際調査報告

Claims (78)

【特許請求の範囲】
1. １．組成物中の全タンパク質重量に基づいて少なくとも７０％均質である純度の ユビキチン・ヒドロラーゼを含有する組成物。
2. ２．ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項１記載の組成物 。
3. ３．（ａ）真核細胞発酵ペーストをホモジナイズし、このホモジネートからユビ キチン・ヒドロラーゼ活性を含有する部分を回収し；（ｂ）工程（ａ）で回収し たヒドロラーゼ含有部分からユビキチン・ヒドロラーゼ活性を含有する沈澱物を 塩沈澱させ；（ｃ）この沈澱物の溶液をイオン交換樹脂と接触させ、ユビキチン ・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し： （ｄ）ユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を疎水性のアフィニティ−樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し′ （ｅ）ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を吸着クロマトグラフィ−樹脂と接 触させ、この樹脂に吸着されたユピキチン・ヒドロラーゼ活性の分画を回収し： そして （ｆ）ユビキチン・ヒドロラーゼ活性の分画をイオン交換樹脂と接触させ、ヒド ロラーゼ活性の分画を回収することを特徴とする方法。
4. ４．ヒドロラーゼ活性分画中の全タンパク質重量に基づいて少なくとも７０％の 純度でユビキチン・ヒドロラーゼ活性分画からユピキチン・ヒドロラーゼを単離 する工程をさらに含有する請求項３記載の方法。
5. ５．工程（ａ）の回収を遠心によって行い、工程（ｄ）および（ｅ）から回収し た分画を次の工程を行う前に緩衝液に対して透析し、そして真核生物が酵母であ る請求項３記載の方法。
6. ６．工程（ｂ）を硫酸アンモニウム分画化によって行う請求項３記載の方法。
7. ７．工程（ｃ）および（ｆ）をＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーによって行い 、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収する請求項３記載の方 法。
8. ８．工程（ｄ）をフェニル、オクチル、またはセチルセファロースクロマトグラ フィーによって行う請求項３記載の方法。
9. ９．工程（ｅ）をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって行い 、活性分画をこのカラムに吸着させ、そしてそれから回収する請求項３記載の方 法。
10. １０．ユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている配列を含有する単離した核酸 配列。
11. １１．ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユピキチン・ヒドロラーゼである請求項 １０記載の配列。
12. １２．ＤＮＡ配列である請求項１１記載の配列。
13. １３．ストリンジェントな条件下で第５図のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、少 なくとも約１０個のヌクレオチドを含有する配列からなる単離したＤＮＡ配列。
14. １４．少なくとも約２０個のヌクレオチドを含有する請求項１３記載のＤＮＡ配 列。
15. １５．少なくとも約３０個のヌクレオチドを含有する請求項１３記載のＤＮＡ配 列。
16. １６．少なくとも約４０個のヌクレオチドを含有する請求項１３記載のＤＮＡ配 列。
17. １７．核酸配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含有する請求項１０記 載の核酸配列。
18. １８．単細胞生物中で機能する複製起点をさらに含有する請求項１０記載の核酸 配列。
19. １９．ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項１０記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
20. ２０．請求項１９記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
21. ２１．細胞が原核性であり、ベクターがヒドロラーゼ分泌のためのシグナル配列 を含有している請求項２０記載の宿主細胞。
22. ２２．大腸菌である請求項２１記載の宿主細胞。
23. ２３．真核性である請求項２０記載の宿主細胞。
24. ２４．ユビキチン・ヒドロラーゼのアミノ酸配列を十分に複製するアミノ酸配列 を有する酵素であって、ユビキチンとポリペプチドを結合させているアミド結合 のところでユビキチン−ポリペプチドコンジュゲートを加水分解し、それによっ て非コンジュゲートの成熟Ｎ−末端を有する無傷のポリペプチドを生成させる酵 素をコードしているＤＮＡ配列を含有する単離したＤＮＡ配列。
25. ２５．ｃＤＮＡ配列である請求項２４記載の配列。
26. ２６．酵素をコードしている配列のＮ−末端にシグナル配列をコードしている領 域をさらに含有している請求項２４記載の配列。
27. ２７．シグナル配列が原核宿主細胞または酵母宿主細胞によって認。 識されるものである請求項２６記載の配列。
28. ２８．ゲノム配列である請求項２４記載の配列。
29. ２９．検出可能な部分に共有結合している請求項２４記載の配列。
30. ３０．ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項２４記載のＤＮＡ配列を含有する発現ベクター。
31. ３１．プラスミドである請求項３０記載のベクター。
32. ３２．請求項３０記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
33. ３３．請求項３０記載のベクターで形質転換された大腸菌。
34. ３４．請求項３２記載の細胞を培養して宿主細胞培養物中にヒドロラーゼを発現 させることを特徴とするユピキチン・ヒドロラーゼの製造方法。
35. ３５．請求項３３記載の大腸菌を培養して大腸菌培養物中にヒドロラーゼを発現 させることを特徴とするユビキチン・ヒドロラーゼの製造方法。
36. ３６．宿主細胞培養物からヒドロラーゼを回収する工程をさらに含有する請求項 ３４記載の方法。
37. ３７．（ａ）組換え宿主細胞培養の不純生成物を含有する組成物においてユビキ チン−ポリペプチドコンジユゲートを得（ここで、該ポリペプチドはユピキチン のＣ−末端にコンジュゲートしており、また、核ポリペプチドはそのＮ−末端に プロリン以外の任意のアミノ酸を含有している）； （ｂ）この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し、試薬からコンジュゲートを回収し； （ｃ）回収したコンジュゲートをユビキチン・ヒドロラーゼと接触させ、それに よってコンジュゲートをユビキチンと成熟ポリペプチドに加水分解し、ユビキチ ン・ヒドロラーゼを固定化し；（ｄ）工程（ｃ）で得られた物質をユビキチンに 対して特異的な親和性を有する試薬と接触させて残留コンジュゲートおよび遊離 ユビキチンの全てを試薬に吸着させ；そして （ｅ）試薬およびそれに吸着した物質を含まないポリペプチドを回収すること を特徴とする方法。
38. ３８．宿主細胞が内生のユビキチン・ヒドロラーゼを産生しないものである請求 項３７記載の方法。
39. ３９．宿主細胞培養物が原核細胞培養物である請求項３７記載の方法。
40. ４０．ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはＤＮアーゼである請求項３７記載の方法。
41. ４１．ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン−７、またはデス−Ｎ−メチオ ニルヒト成長ホルモンである請求項４０記載の方法。
42. ４２．ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項３７記載の方法 。
43. ４３．ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項４２記載の方法。
44. ４４．工程（ａ）において、コンジュゲートを組換え宿主細胞培養で発現させ、 この宿主細胞培養物を工程（ｂ）の前に収穫し、そして工程（ｃ）において、回 収したコンジュゲートを初めに固定化ユビキチン・ヒドロラーゼと接触させる請 求項３７記載の方法。
45. ４５．工程（ｂ）および（ｄ）の試薬が抗ーユビキチン抗体である請求項３７記 載の方法。
46. ４６．工程（ｂ）において、抗体に吸着させたコンジュゲートを溶離する請求項 ４５記載の方法。
47. ４７．抗体がモノクローナル抗体であり、溶離がアフィニティークロマトグラフ ィーカラムからである請求項４６記載の方法。
48. ４８．（ａ）組換え宿主細胞培養の不純生成物を含有する組成物においてユピキ チン−ポリペプチドコンジュゲートを得（ここで、該ポリペプチドはユビキチン のＣ−末端にコンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのＮ−末端に プロリン以外の任意のアミノ酸を含有している）： （ｂ）この組成物をユビキチンに対して特異的な親和性を有する試薬と接触させ てコンジュゲートを試薬に吸着させ、試薬とその吸着されたコンジュゲートを組 成物の残りから分離し；（ｄ）コンジュゲートが吸着した試薬をユビキチン・ヒ ドロラーゼと接触させ； （ｅ）試薬からヒドロラーゼとポリペプチドを分離し；そして（ｆ）ヒドロラー ゼからポリペプチドを分離することを特徴とする方法。
49. ４９．宿主細胞培養物が原核細胞培養物であり、ポリペプチドが宿主細胞に対し て異種のものである請求項４８記載の方法。
50. ５０．工程（ａ）において、コンジュゲートが組換え宿主細胞培養で発現され、 工程（ｂ）の前に宿主細胞培養物が収穫される請求項４８記載の方法。
51. ５１．ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはＤＮアーゼである請求項４８記載の方法。
52. ５２．工程（ｂ）で用いる試薬が抗ーユビキチン抗体である請求項４８記載の方 法。
53. ５３．（ａ）染色体中に組込まれたユビキチン・ヒドロラーゼをコードしている ＤＮＡを有し、そしてユビキチン−ポリペプチドコンジュゲートをコードしてい るヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで形質転換された原核宿主細胞を培 養してコンジュゲートを発現させ（ここで、該ポリペプチドはユピキチンのＣ− 末端にコンジュゲートしており、また、該ポリペプチドはそのＮ−末端にプロリ ン以外の任意のアミノ酸を含有している）；そして（ｂ）ユピキチン（これにポ リペプチドがコンジュゲートしていた）を含まないポリペプチドを培養細胞から 回収することを特徴とする方法。
54. ５４．宿主細胞が大腸菌である請求項５３記載の方法。
55. ５５．ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項５３記載の方法 。
56. ５６．ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項５５記載の方法。
57. ５７．ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはＤＮアーゼである請求項５３記載の方法。
58. ５８．ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項 ５３記載の方法。
59. ５９．染色体中に組込まれたユビキチン・ヒドロラーゼをコードしているＤＮＡ を有する原核宿主細胞。
60. ６０．大腸菌である請求項５９記載の宿主細胞。
61. ６１．ユピキチン・ヒドロラーゼが酵母ユビキチン・ヒドロラーゼである請求項 ６０記載の宿主細胞。
62. ６２．ＡＴＣＣＮｏ．５３，８３２のもとで寄託されている菌株Ｋ５８０８の性 質を有する請求項６１記載の宿主細胞。
63. ６３．ユピキチン−ポリペプチドコンジュゲートをコードしているヌクレオチド 配列を含有する発現ベクターで形質転換された請求項５９記載の宿主細胞（ここ で、該ポリペプチドはユビキチンのＣ−末端にコンジュゲートしており、また、 該ポリペプチドはそのＮ−末端にプロリン以外の任意のアミノ酸を含有している ）。
64. ６４．ポリペプチドが宿主細胞に対して異種のものである請求項６３記載の宿主 細胞。
65. ６５．ポリペプチドがヒトポリペプチドである請求項６４記載の宿主細胞。
66. ６６．ポリペプチドがレラキシンもしくはインスリンのＡ鎖もしくはＢ鎖、プロ レラキシン、プロインスリン、インターフェロン、インターロイキン、成長ホル モン、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子、 またはＤＮアーゼである請求項６５記載の宿主細胞。
67. ６７．請求項１３記載のＤＮＡ配列にハイプリダイズしないＤＮＡによってコー ドされている単離された酵母ユビキチン・ヒドロラーゼ。
68. ６８．請求項１３記載の配列にハイプリダイズせず、少なくとも約１０個のヌク レオチドを含有する核酸配列を含有するユピキチン・ヒドロラーゼをコードして いる単離された核酸配列。
69. ６９．少なくとも約２０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。
70. ７０．少なくとも約３０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。
71. ７１．少なくとも約４０個のヌクレオチドを含有する請求項６８記載の核酸配列 。
72. ７２．ベクターで形質転換された宿主によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合した請求項６８記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
73. ７３．請求項７２記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
74. ７４．原核性である請求項７３記載の宿主細胞。
75. ７５．大腸菌である請求項７４記載の宿主細胞。
76. ７６．ヒドロラーゼが緩衝液中に存在する請求項１記載の組成物。
77. ７７．第１成分としてユビキチン．ヒドロラーゼを、そして第２成分として固定 化した抗ーユビキチン抗体を含有するキット。
78. ７８．第１成分として請求項７６記載の組成物を、そして第２成分として固定化 した抗ーユビキチン抗体を含有するキット。