JP3038193B2 - タンパク質の代謝的安定性の調節方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】バクテリアおよび真核生物の細胞におい
て、半減期が細胞の世代時間に近接するかあるいはそれ
を越える、比較的長く生きるタンパク質は、半減期が細
胞の世代時間の１パーセントより短いことがあるタンパ
ク質と共存する。細胞内タンパク質の分解（ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ）の速度は、細胞の生理学的状態の関数で
あり、そして個々のタンパク質について差別的に制御さ
れるように見える。とくに、損傷したおよびそうでなけ
れば異常なタンパク質は生体内で代謝的に不安定であ
る。選択的タンパク質の分解の特定の機能はほとんどの
場合においてなお未知であるが、多くの調節タンパク質
は生体内で極端に短い寿命を有する。このようなタンパ
ク質の代謝的不安定性は、それらの合成または分解の速
度の調節された変化によって、それらの細胞内濃度の急
速な調節を可能とする。細胞内タンパク質の代謝的不安
定性がその機能について必須であることが示された、わ
ずかの場合は、バクテリオファージラムダのｃＩＩタン
パク質および酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
ＨＯエンドヌクレアーゼを包含する。

【０００２】正常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の
選択的ターンオーバーのほとんどは、ＡＴＰ依存性およ
び（真核生物において）非リソソーム的である。最近の
生化学および遺伝学の証拠は、真核生物において、生存
が短い細胞内タンパク質へのユビキチン（ｕｂｉｑｕｉ
ｔｉｎ）の共有接合がそれらの選択的分解について必須
であることを示す。所定のタンパク質が生体内で代謝的
に安定であるかあるいは不安定であるかを決定するルー
ルは、従来知られていない。

【０００３】

【発明の要約】本発明は、タンパク質のアミノ末端を操
作し、これによってタンパク質の代謝的安定性および他
の性質を制御する方法に関する。さらに、本発明は、タ
ンパク質のアミノ末端において、２０アミノ酸残基（ま
たはそれらの類似体）のいずれかをもつタンパク質を生
体内または生体外で生成する方法を提供する。本発明
は、一部分、細胞内タンパク質の生体内の半減期がアミ
ノ末端アミノ酸残基の関数であるという顕著な発見に基
づき、そして生体内または生体外で特定したアミノ末端
をもつタンパク質を発生させることを可能とする新規な
（およびより一般的に応用可能な）技術に基づく。本発
明は、また、新しく同定されたプロテアーゼ、ユビキチ
ン特異的処理プロテアーゼに関し、前記プロテアーゼ
は、生体内または生体外で、問題のタンパク質のアミノ
末端において所望のアミノ酸残基を露出することを可能
とする性質を有する。

【０００４】細胞内タンパク質のアミノ末端において露
出されたアミノ酸の性質は、タンパク質が生体内で長く
生きるか、あるいは生存が短いかを特定する、１つの極
めて重要な決定基であることを示した。個々のアミノ酸
は、タンパク質のアミノ末端において露出されたとき、
それらがタンパク質に与える半減期に関して、安定化ま
たは脱安定化のアミノ酸として分類することができる。
脱安定化アミノ酸残基は、脱安定化アミノ酸のあるもに
ついて数分までに少ない、短い半減期を与える。安定化
アミノ酸残基は、多数時間の長い半減期を与える。この
顕著な、新しく発見された、タンパク質の半減期のその
アミノ末端残基への依存性は、ここでＮ−末端ルールと
呼ぶ。

【０００５】このＮ−末端ルールに基づき、タンパク質
のアミノ末端は、こうして、タンパク質の細胞内の半減
期を変化するように、設計または変更することができ、
そして、このようにして、タンパク質の生体内の寿命お
よび／または活性を調節することができる。この能力
は、多くの異なる面において合理的なタンパク質の設計
のために利用することができる。天然または野生型のタ
ンパク質は、修飾して、それらを生体内の分解に対して
多少抵抗性とすることができる。タンパク質の設計また
は変更は、タンパク質レベルまたは遺伝子（ＤＮＡ）レ
ベルで実施することができる。例えば、タンパク質はア
ミノ末端を化学的に変更または操作して、安定化または
脱安定化クラスのアミノ酸残基のアミノ末端においてを
露出することができる。遺伝子のレベルにおいて、タン
パク質をエンコードする遺伝子は、所望のクラスのアミ
ノ酸をアミノ末端においてをエンコードするようにし
て、発現されたタンパク質が、タンパク質分解のＮ−末
端ルールの通路に関してタンパク質を代謝的に安定また
は不安定とする、前以て決定したアミノ末端構造を示す
ようにすることができる。さらに、タンパク質は操作し
たアミノ末端をマスキングする「マスキング」タンパク
質配列に発現、融合させ、こうして、アンマスキング
（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ）したとき、タンパク質がそのア
ミノ末端残基の性質に依存する所望の安定性または他の
性質を示すようにすることができる。このような構成体
において、例えば、２つのタンパク質配列の間の接合
は、例えば、エンドヌクレアーゼによって特異的に切断
するように設計することができる。融合した配列の内部
のタンパク質分解は、問題のタンパク質の特異的に操作
されたアミノ末端をアンマスキングし、そしてタンパク
質をＮ−末端ルールによって支配される分解に付す。タ
ンパク質のアミノ末端を操作する１つの特定の新しい方
法は、本発明において、ユビキチン特異的処理プロテア
ーゼの同定およびその基質特異性の決定によって提供さ
れる。このプロテアーゼを使用して、ユビキチンと他の
タンパク質との融合体は、生体内または生体外で特別に
処理して、所望のアミノ末端残基をもつタンパク質を発
生させることができる。

【０００６】生存が短いタンパク質を特別に操作する、
異なる、かつまた、新しい方法は、本発明において、効
率よく脱ユビキチンすることができる、ユビキチン−タ
ンパク質融合体、例えば、ユビキチン−Ｐｒｏ−β−ガ
ラクトシダーゼが代謝的に不安定であるという発見によ
って提供される。こうして、アミノ末端のユビキチン部
分タンパク質に、その除去を不可能とするか、あるいは
非効率的とする方法で、取り付けることによって、Ｎ−
末端ルールに直接基づかない、明確な技術によって脱安
定化することができる。

【０００７】さらに、変異型の細胞を発生させることが
でき、前記細胞は分解する生存が短いタンパク質を条件
的または非条件的に停止する、「Ｎ−末端」分解性プロ
テアーゼ中に推定上の突然変異を含有する。これらの細
胞を使用して、細胞内で通常生存が短いタンパク質を過
度に生成することができる。

【０００８】

【発明の詳細な記述】Ｎ−末端ルールを下に詳しく解説
する。簡単に述べると、タンパク質の分解を支配するこ
のルールは、そのアミノ末端に種々のアミノ酸残基を有
し、そしてユビキチンとの融合タンパク質として生成し
た、酵素β−ガラクトシダーゼの生体内の半減期を検査
することによって明らかにされた。ユビキチン−β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質をエンコードするキメラ
遺伝子を酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（以
後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現するとき、ユ
ビキチンは発生期の融合タンパク質を切断して、脱ユビ
キチンされたβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）を生成
する。１つの例外を除いて、この切断はユビキチン−β
ｇａｌ）の接合におけるβｇａｌのアミノ酸残基の性質
に無関係に起こり、これによって選択的に異なる残基を
そうでなければ同一のβｇａｌタンパク質のアミノ末端
において露出することができる。そのように設計された
βｇａｌタンパク質は、βｇａｌのアミノ末端における
アミノ酸の性質に依存して、２０時間以上から３分より
短い範囲の、顕著に異なる生体内の半減期を示した。こ
うして、アミノ酸は、そのアミノ末端に存在するとき、
βｇａｌにそれらが与える半減期に従って配列すること
ができる。例えば、アミノ酸、メチオニン、セリン、ア
ラニン、スレオニン、バリン、グリシンおよびシステイ
ンは２０時間より長い半減期を与える。フェニルアラニ
ン、ロイシン、アスパルギンおよびリジンは約３分の半
減期を与える。（アミノ酸の完全なリストおよび対応す
る半減期について下表１参照）。

【０００９】原核細胞および真核生物の両者からの長い
半減期の非画分化細胞内タンパク質において、現在知ら
れているアミノ末端残基は、事実上もっぱら、Ｎ−末端
ルールによって正確に予測されるように、アミノ酸の安
定化クラスに属する。この結果は、一般に細胞内タンパ
ク質の選択的分解におけるＮ−末端ルールを強く説明す
る。

【００１０】適当なアミノ末端アミノ酸は、非画分化細
胞内タンパク質の代謝的安定性に必須な（しかし、必ず
しも十分ではない）要件であるように思われる。こうし
て、タンパク質が細胞内で比較的安定であるためには、
安定化アミノ酸はアミノ末端に存在すべきである。タン
パク質のアミノ末端における脱安定化残基の存在は、頻
繁であるが、その生体内の代謝的脱安定化のために、常
に十分であるということはない。このような脱安定化が
比較的小さい程度に起こるとき、それ以上の分析は、ア
ミノ末端の不十分な接近可能性あるいはアミノ末端付近
における「許容性」配列の欠如、例えば、タンパク質の
アミノ末端領域におけるセグメントの移動性の欠如を示
す。少なくともある場合におけるアミノ末端における安
定化アミノ酸の存在（例えば、β−ｇａｌについて観察
されるような）は、安定性をタンパク質に与える。しか
しながら、アミノ末端における安定化アミノ酸は、長い
半減期を常に与えるというわけではない。なぜなら、他
の分解的通路はタンパク質の究極の寿命の決定における
含まれ得るからである。例えば、内部のタンパク質分解
の切断（タンパク質の末端領域の外側の切断）は、切断
の得られる生成物のアミノ末端において脱安定化アミノ
酸を露出させることができ、次いでこれはＮ−末端ルー
ルの通路を経て急速に分解する。安定化アミノ酸を使用
するための適当な環境は、実験的に確証することができ
る。

【００１１】Ｎ−末端ルールは生体内の選択的タンパク
質分解の他の面を包含する、より複雑な「半減期のルー
ル」の唯一の成分（中央のものにかかわらず）であるこ
とができるが、Ｎ−末端ルールの通路によって天然の修
飾されないタンパク質より分解に対して多少抵抗性であ
るタンパク質を生成するために、Ｎ−末端ルールはタン
パク質構造を設計または変化させるための合理的な実施
可能なアプローチを提供する。タンパク質は、タンパク
質または遺伝子のレベルで設計または修飾して、安定化
または脱安定化のクラスの所望のアミノ酸をそれらのア
ミノ末端において提供する。タンパク質の半減期を調節
する能力は、タンパク質の細胞内の活性の変調を可能と
する。

【００１２】その代謝的安定性を増加または減少するた
めにタンパク質を修飾する直接のアプローチは、タンパ
ク質のアミノ末端をタンパク質レベルで直接操作するこ
とである。所望のアミノ末端アミノ酸を提供するため
に、問題のタンパク質のアミノ末端は、例えば、安定化
または脱安定化のクラスのアミノ酸は、適当な化学を使
用して、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端に
付加することによって化学的に変更することができる。
こうして、例えば、不安定なタンパク質は、安定化アミ
ノ酸残基（例えば、メチオニン、セリン、アラニン、ス
レオニン、バリン、グリシンまたはシステイン）をタン
パク質のアミノ末端に付加することによって、より安定
性とすることができる。逆に、安定なタンパク質は脱安
定化アミノ酸をアミノ末端に付加することによって脱安
定化することができる。タンパク質のアミノ末端を修飾
する１つの明確な方法は、タンパク質のアミノ末端への
単一のアミノ酸の翻訳後の付加を触媒する、特異的酵
素、アミノ酸−タンパク質のリガーゼを使用することで
ある。同一のタイプの非遺伝子的変更のための他の方法
は、当業者によって容易に確認することができる。

【００１３】あるタンパク質において、アミノ末端の末
端はタンパク質のコンホメーション（すなわち、その第
三または第４構造）の結果として観察される。これらの
場合において、アミノ末端のより広範な変更はタンパク
質をＮ−末端ルールの通路に付すために必要なことがあ
る。例えば、接近不可能なアミノ末端のために、単一の
アミノ末端残基の簡単な付加または置換は不十分である
場合、いくつかのアミノ酸（リジン、基質のタンパク質
へのユビキチンの接合の部位、を包含する）は、初期の
アミノ末端に付加して、操作したアミノ末端の接近可能
性および／またはセグメントの移動性を増加することが
できる。

【００１４】タンパク質の修飾または設計は、また、遺
伝子レベルで達成することができる。分離したまたは合
成した遺伝子の５’末端への適当なコドンの付加または
置換のための部位特異的突然変異発生の普通の技術を使
用して、エンコードしたタンパク質に所望のアミノ末端
構造を提供することができる。例えば、発現されたタン
パク質はそのアミノ末端に所望のアミノ酸を有するの
で、安定化アミノ酸のために適当なコドンを、タンパク
質をエンコードする配列のアミノ末端に挿入するか、あ
るいは構成ことができる。

【００１５】同時に、発現されたタンパク質は翻訳後細
胞内でしばしば自然に修飾される。これはアミノ末端の
修飾を包含することができる。例えば、アミノ末端は、
それからの１つまたは数個のアミノ酸を切断するアミノ
ペプチダーゼによって、作用させることができる。アミ
ノ酸は、また、翻訳後の処理によってアミノ末端に付加
することができる。本発明は、アミノ末端のタンパク質
の処理のなお明確にされないルールを「バイパス」し
て、成熟した処理されたタンパク質種のアミノ末端にお
いて所望のアミノ末端残基を正確にかつ特異的に露出す
る方法を提供する。問題のタンパク質のアミノ末端の究
極の構造へのこのような翻訳後の事象の衝撃を最小にす
るために、アミノ末端に融合した「マスキング」タンパ
ク質配列が問題のタンパク質のアミノ末端（所望の安定
化または脱安定化の構造を有するように設計した）より
先行する、特異的融合タンパク質を設計することができ
る。問題のマスキングタンパク質のアミノ末端へ融合し
たタンパク質配列が２つの間の接合における特異的切断
に感受性であるように、融合タンパク質を設計する。こ
うして、タンパク質配列を除去すると、問題のタンパク
質のアミノ末端はアンマスキングされ、こうして、解放
された半減期は前以てアミノ末端によって支配される。
融合タンパク質は、例えば、宿主細胞のエンドヌクレア
ーゼによって生体内の特異的切断のために、あるいは生
成体（融合タンパク質を切断する能力を欠く）からの分
離後、切断できる生体外系における特異的切断のため、
設計することができる。

【００１６】ユビキチンは問題のタンパク質と融合した
タンパク質の構成のための、広く有用な融合相手であ
る：ユビキチンが融合されているタンパク質への依存性
をほとんどまたは全くもたない、細胞質真核生物プロテ
アーゼによって、人工的ユビキチン−タンパク質融合体
を正確に切断することができるという発見は、生体内ま
たは生体外の両者のタンパク質操作方法において応用す
ることができ、そして本発明の主要な面である。例え
ば、ユビキチン−タンパク質融合方法を使用して、人工
的手段によって生成されたタンパク質において、真性の
アミノ末端を人工的に発生させることができる。こうし
て、天然の真核生物または原核生物のタンパク質のアミ
ノ末端の特性は、原核生物の宿主において生成されたユ
ビキチン−タンパク質融合体の生体外切断によって発生
させることができる。

【００１７】ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質を生成するための特別の方法を、下において詳
述する。他のタンパク質をエンコードする遺伝子を、こ
の方法においてＬａｃＺ（β−ｇａｌ遺伝子）の代わり
に使用することができる。

【００１８】一般に、ユビキチン融合タンパク質はキメ
ラの遺伝子構成体によって発現され、前記遺伝子構成体
は、５’から３’への向きにおいて、問題のタンパク質
をエンコードする遺伝子に結合したユビキチン遺伝子か
らなる。問題のタンパク質のアミノ末端アミノ酸のため
のコドンは、ユビキチン遺伝子の３’末端にすぐに隣接
して位置する。融合した遺伝子生成物は、ユビキチンと
問題のタンパク質との間の接合において生体内または生
体外で内部タンパク質分解的に切断して（本発明におい
て同定した純粋なまたは部分的に精製されたユビキチン
−特異的プロテアーゼを使用して）、そのアミノ末端に
所望のアミノ酸を有する問題のタンパク質を発生させる
ことができる。タンパク質のアミノ末端を特異的に操作
する記載する能力について、ある数の用途が存在する。
１つのこのような用途は、解放されたタンパク質の細胞
内の半減期がＮ−末端ルールの原理によって支配される
という事実によって確立される。ここに記載するタンパ
ク質のアミノ末端を操作するための特定の方法の他の用
途は、問題のタンパク質の所望の機能的性質の調節か
ら、その抗原性の修飾、および再び、当業者によって容
易に確証することができる他の用途の範囲である。

【００１９】問題のタンパク質のアミノ末端において所
望のアミノ酸残基を発生させるこの方法は、２つの新規
は成分を包含する：一方、ユビキチン−タンパク質融合
体の使用、および他方、同定されたユビキチン特異的処
理プロテアーゼ。そして、この研究において、それらの
顕著な基質の要件が発見された。ユビキチン特異的プロ
テアーゼの初期の同定は生体内でなされたが、この酵素
は、また、生体外（抽出液中）で比較的安定であり、そ
して当業者に知られた技術によって等質性に容易に精製
することができる。さらに、ユビキチン特異的処理プロ
テアーゼの基質の特異性は、進化において保存され、酵
母菌および動物において同一である。この酵素は、粗製
の抽出物から、当業者に知られた方法のなかでも、ホス
ホセルロース、ＤＥＡＥセルロースおよびＳＨセファロ
ースの順次のクロマトグラフィーによって精製すること
ができる。あるいは、このプロテアーゼのための遺伝子
は当業者によってクローニングすることができる。クロ
ーニングされたプロテアーゼ遺伝子は生体内で使用する
ことができるか、あるいは遺伝子は適当な宿主中で過度
に発現することができ、過度に発現されたユビキチン特
異的プロテアーゼを精製し、そして同一または同様な目
的に生体外で使用することができる。ここににおけるこ
の酵素の発見およびその基質特異性の詳細な特性は、こ
の酵素の生体外および生体内の使用を提供する。

【００２０】問題のタンパク質のアミノ末端において所
望のアミノ酸残基の発生を可能とするユビキチン−タン
パク質融合体の使用は、生成体の細胞からのこのような
タンパク質の精製を促進するために拡張することができ
る。前述のユビキチン−タンパク質融合体に結合した、
便利なマーカータンパク質、例えば、ストレプトアビジ
ン、をエンコードする遺伝子は容易に構成することがで
きる。得られる（マーカータンパク質）−ユビキチン−
タンパク質融合体は、生成体細胞から、マーカータンパ
ク質の前以て選択した性質、例えば、ビオチンカラムの
親和クロマトグラフィーによって分離可能であるストレ
プトアビジンの既知能力を使用することによって分離す
ることができる。こうして、精製された（マーカータン
パク質）−ユビキチン−タンパク質融合体は、次いで、
本発明において記載するユビキチン特異的プロテアーゼ
によって特異的に切断して最終生成物、そのアミノ末端
に所望のアミノ酸残基を有する問題のタンパク質、を発
生することができる。

【００２１】例えば、この分野において現在標準の部位
特異的突然変異発生技術よる、所望のアミノ酸のアミノ
末端アミノ酸のコドン。問題のタンパク質をエンコード
する遺伝子が合成遺伝子である場合、適当な５’コドン
を合成方法の間に構成することができる。あるいは、特
異的コドンのためのヌクレオチドは遺伝子の５’（アミ
ノ末端のエンコーディングド）末端に適当なＤＮＡ配列
結合することによって、分離または合成された遺伝子に
付加することができる。

【００２２】ユビキチン特異的プロテアーゼによって切
断されうるユビキチン用融合相手は、また、使用するこ
とができる。さらに、問題のタンパク質のアミノ末端を
マスキングするためのユビキチン以外の融合相手を使用
することができる。適当な場合において、融合タンパク
質は、十分に狭い特異性を有する制限エンドヌクレアー
ゼのためのタンパク質分解切断部位を含有するように設
計し、こうして唯一の標的部位が融合タンパク質におい
て切断されるようにすることができる。このようなプロ
テアーゼの極めて重要な性質は、切断部位のカルボキシ
末端部位にりんせつするアミノ酸残基について十分に緩
和された要件でなくてはならない。商業的に入手可能な
プロテアーゼ、補体因子Ｘ_a、はこれらの性質を示し、
こうしてそれらのアミノ末端の究極的位置において前以
て決定したアミノ酸残基をもつタンパク質を直接発生さ
せることができる［Ｋ．ノグチおよびＨ．Ｃ．トゲーソ
ン（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、３０９：８１０（１９８４）］。エンドプロテア
ーゼのための認識部位を、マスキングタンパク質の配列
と問題のタンパク質のアミノ末端をエンコードする３’
領域との間の接合中に操作することができる。

【００２３】生存が短いタンパク質を操作する異なる明
確な方法は、本発明において、効率よく脱ユビキチンで
きないユビキチン−タンパク質融合体、例えば、ユビキ
チン−Ｐｒｏ−β−ガラクトシダーゼ融合体（表１）が
代謝的に不安定であるという発見によって提供される。
こうして、アミノ末端ユビキチン部分をタンパク質に、
その除去が不可能であるか、あるいは非効率的になされ
るような方法で、取り付けることによって、Ｎ−末端ル
ールの要件に従ってタンパク質の所望のアミノ末端を発
生される方法と定性的に区別される、明確な技術によっ
て、タンパク質を脱安定化することができる。ユビキチ
ン−タンパク質融合体の効率よく脱ユビキチンの防止
は、いくつかの方法において、例えば、表１に示すよう
なユビキチン−タンパク質の接合においてプロリン残基
を使用することによって、あるいはユビキチン部分がも
はやユビキチン特異的処理プロテアーゼによって認識さ
れないが、なお分解的通路の残部によって認識されうる
ような方法で、ユビキチンのアミノ酸配列をそのカルボ
キシル末端近くで変化させることによって、達成するこ
とができる。ユビキチン−タンパク質融合体の脱ユビキ
チン速度を減少するこれらおよび他の方法は、当業者に
よって容易に確証できる。

【００２４】本発明の方法は、なかでも、タンパク質の
半減期を細胞内で調節するために使用できる。この可能
性が使用である多くの場合が存在する。例えば、遺伝子
を細胞中にその中の発現のために導入するとき、発現さ
れた生成物は特定の要求に依存して長い半減期または短
い半減期について設計することができる。

【００２５】一般に、短い半減期をもつ脱ユビキチンし
たタンパク質は、タンパク質の細胞内レベルの調節をい
っそうよく受けることができる。タンパク質の細胞内レ
ベルおよび活性を微細に調節する能力は、治療または生
体外細胞培養物を使用する研究において有用であること
がある。例えば、遺伝子の治療において、遺伝子を細胞
中に導入して、遺伝子の欠乏または異常を補正すること
ができる。遺伝子は誘発性プロモーターの制御下に挿入
することができる。誘導は遺伝子生成物の増大した発現
および結局、細胞内のより高いレベルを生ずる。遺伝子
を不安定なタンパク質をエンコードするように設計する
場合、発現されたタンパク質の細胞内濃度は、細胞内で
持続しないので、その合成速度の後の減少に対していっ
そう急速に応答的である。このようにして、挿入された
遺伝子によってエンコードされたタンパク質の細胞内レ
ベルおよび／または活性は、いっそう微細に調節調節す
ることができる。

【００２６】本発明の方法は、また、マーカーに関する
表現型に必要な時間を短縮することによって、選択可能
なマーカーの使用を拡張するために使用できる。この目
的に対して、マーカー遺伝子によってエンコードされる
生成物は、Ｎ−末端ルールに従いそのアミノ末端を変更
することによって脱安定化することができる。このよう
にして、ネガティブ表現型についての選択は促進するこ
とができる。なぜなら、マーカーをエンコードする機能
が消滅した後、マーカーの生成物はより急速に絶滅する
であろうからである。１つの例はチミジンキナーゼ（ｔ
ｋ）遺伝子である。ｔｋ遺伝子は、アミノ末端において
適当な脱安定化アミノ酸を導入することによって、安定
性が低い酵素をエンコードするように操作することがで
きる。ｔｋ^-表現型を生ずる遺伝子の突然変異は、残留
するｔｋがより急速に分解するので、細胞によっていっ
そう急速に現れるであろう。これは、ｔｋ^-型への形質
転換前に合成されたｔｋを「希釈」するためにより多く
の時間が要求される場合、増殖の遅い細胞においてこと
に有用である。

【００２７】Ｎ−末端ルールに基づくタンパク質の修飾
の原理は、また、細胞毒素の設計において使用できる。
タンパク質の細胞毒素はＮ−末端ルールの通路によって
分解可能な不安定なタンパク質として設計することがで
きるので、それらの毒性作用が標的細胞上で発揮された
後、それらは持続しない。毒素の寿命を減少すると、非
標的細胞を殺す可能性は減少する。 分解のＮ−末端ル
ールの通路の発見は、Ｎ−末端ルールの通路の必須成分
をエンコードする遺伝子中に突然変異体を有する突然変
異体細胞の発生を可能とする。例えば、そうでなければ
生存が短いタンパク質を効率よく分解することが永久に
あるいは条件的に不可能である、細胞を生成することが
できる。これらの細胞は、通常細胞内で不安定である所
望のタンパク質を生成するために使用できる。

【００２８】本発明をＮ−末端ルールの解釈の次の詳細
な説明によってさらに例示する。

【００２９】方法 タンパク質の配列決定 ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ（第３Ａ図）をエンコードす
る、ｐＵＢ２３を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞
を、後述するように、［³⁵Ｓ］メチオニンで標識し、次
いで抽出調製し、βｇａｌを免疫沈澱し、そして電気泳
動する。湿ったポリアクリルアミドゲルをオートラジオ
グラフィーにかけ、βｇａｌの帯びを切除し、そして電
気溶離したβｇａｌをエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解によ
る６サイクルの放射線化学の配列決定にかけた。配列決
定はハーバード大学の微生物化学設備（Ｍｉｃｒｏ Ｃ
ｈｅｍ Ｆａｃｉｌｔｙ）においてＷ．レン（Ｌａｎ
ｅ）によって実施された。

【００３０】部位特異的突然変異誘発 ｐＵＢ２３（第１図）を、順次に、ＡｃｃＩ、ｐｏｌＩ
のクレノー断片、およびＢａｍＨＩで処理した。Ｘｈｏ
Ｉ部位を含有する断片を精製し、そしてＭ１３ｍｐ９フ
ァージＤＮＡの充填したＨａｅＩＩＩ部位およびＢＡＭ
ＨＩ部位の間に挿入した（Ｊ．メッシングおよびＪ．ビ
エラ、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９、２６３（１９８
２））。部位特異的突然変異誘発［Ｍ．スミス、アニュ
アル・レウビュー・イン・ジェネティックス（Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９、４２３（１９８
５）］を、クレイマー、Ｗ．ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１２、９４
４１（１９８４）によって記載されるように、βｇａｌ
のＭｅｔコドンの５’側に１０塩基および３’側に１２
塩基を含有する、合成２５残基のオリゴデオキシリボヌ
クレオチドを使用して実施した。すべての４塩基を合成
の間にもとのＭｅｔコドン位置において発生させた。一
次のファージのプラークは、コドンの変化の領域にまた
がる１２残基のオリゴヌクレオチドプローブを使用して
交雜し［ウッド、Ｎ．Ｉ．ら、ＰＮＡＳ、８２、１５８
５（１９８５）］、そしてもとの配列に交雜することに
よってスクリーニングした。期待したプラークのインサ
ートを含有する非交雜プラークは、連鎖停止方法によっ
て配列決定した。［サンガー、Ｆ．ら、ＰＮＡＳ、７
１、５４６３（１９７７）］。所望の構成体をｐＵＢ２
３バックグラウン中に移すために、突然変異ファージの
複製形態のＤＮＡをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、そしてプラスミドｐＬＧＳ５−ＡＴＧの同一消化物
に加えた［参照、第１図およびＬ．グアレンテ、メソッ
ズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．）、１０１、１８１（１９８３）］。結合した
混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＣ１０６１を形質
転換した。［Ｍ．Ｊ．カサダバンおよびＳ．Ｎ．コウヘ
ン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１３８、１７９（１９８
０）］。問題のプラスミドを含有するコロニー（ここで
βｇａｌのオープンリーディングフレームが修復されて
いる）は、Ｘ−ｇａｌ平板上でそれらの青色によって認
識された。

【００３１】パルス−チェース実験 問題のプラスミドで形質転換した［Ｆ．シャーマンら、
メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コール
ド・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ニューヨーク、１９８１］菌
株ＢＷＧ−９ａ−１（ＭＡＴ ｈｉｓ ｕｒａ３ ａｄ
ｅ６）のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、２％のガラ
クトース、アミノ酸を含まない０．６７％の酵母菌窒素
塩基（ＤＩＦＣＯ）、アデニン（１０μｇ／ｍｌ）およ
びメチオニンを含むアミノ酸の培地中で、３０℃におい
てほぼ５のＡ₆₀₀に増殖させた。典型的には、５ｍｌの
培養物をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マイクロタイ
ター濾過プレートのウェルを通して濾過することによっ
て収穫し、フィルター上でメチオニンを欠く同一培地で
数回洗浄し、そして０．３ｍｌの１％のガラクトース、
５０ミリモルのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中
に最懸濁させた。次いで、［³⁵Ｓ］メチオニン（５０〜
１００μＣｉ）を３０℃において５分間加えた；細胞を
濾過によって集め、そして０．５ｍｇ／ｍｌのシクロヘ
キシルイミドを含有する増殖培地の０．４ｍｌ上に最懸
濁させた。試料（０．１ｍｌ）を示した時間に抜き出
し、そして０．４ｍｌのガラスに加えてビーズレウペプ
チン、ペプスタチンＡ、アンチペイン、アプロチニンお
よびキモスタチンを含有する０．５ｍｌの冷緩衝液Ａ
［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］に添加した。その直後、細胞
を４℃においてほぼ３分間渦形成することによって破壊
した；抽出物を１２，０００ｇで３分間遠心し、そして
上澄み液中の酸不溶性³⁵Ｓの放射能を決定した。等量の
合計の酸不溶性³⁵Ｓを含有する上澄み液のアリコート
を、ｇａｌに対するモノクローナル抗体で免疫沈澱する
ために処理した。モル過剰量（少なくとも１０倍）の抗
体を含有する腹水を各アリコートに添加し、引き続いて
４℃において２時間インキュベーションした；次いで、
プロテインＡ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］を添加、懸濁
液を揺動しながら４℃において３０分間インキュベーシ
ョンし、そして１２，０００ｇで１分間遠心した。プロ
テインＡ−セファローズのペレットを０．１％のドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する緩衝剤Ａ（下を
参照）中で３回洗浄し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
含有電気泳動試料緩衝液中に再懸濁させ［Ｕ．Ｋ．ラエ
ルミ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７、６８０
（１９７０）］。１００℃に３分間加熱し、そして１
２，０００ｇで１分間遠心した。上澄み液の等しいアリ
コートを７％の不連続のポリアクリルアミド−ＳＤＳゲ
ル（１５×１５×０．１５ｃｍ）中で電気泳動させ、次
いでフルオログラフィーにかけた。いくつかの実験にお
いて、上のプロトコルを使用せず、抽出物はＳＤＳの存
在下に直接細胞を沸騰させることによって調製し、本質
的に同一の結果を得た。

【００３２】Ｅ．ｃｏｌｉ中で生成したｕｂ−βｇａｌ
タンパク質の分析 プラスミドｐＵＢ２３（第１図および第３図）をＤＳ４
１０、Ｅ． ｃｏｌｉ菌株を生成するミニ細胞、中に導
入した。［Ｎ．ストウカーら、転写および翻訳：実際的
アプローチ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ）、Ｂ．Ｄ．ハーンスおよびＳ．Ｊ．ヒ
ギンス編、ＩＲＬプレス、オクスフォード、１９８４
ｐ．１５３］。上のＮ．ストウカーらの文献に記載され
ているように、ミニ細胞を調製し、そして［³⁵Ｓ］メチ
オニン［６００Ｃｉ／ミリモル、アマーシャム（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）］で３６℃において６０分間標識した。

【００３３】標識したミニ細胞を遠心し、２％のＳＤ
Ｓ、１０ミリモルのＤＴＴ、１０ミリモルのＮａ−ＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、そして１００℃
で３分間加熱した。１２，０００ｇにおいて１分間遠心
した後、上澄み液を２０倍に緩衝液Ａ（１％のトリトン
Ｘ−１００、０．１モルのＮａＣｌ、５ミリモルのＮａ
−ＥＤＴＡ、５０ミリモルのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．５）で希釈し、次いでフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）およびＮ−エチルマレイミド
を、それぞれ、０．５ミリモルおよび１０ミリモルに添
加した。４℃において４時間後、試料を０．５ミリモル
のＰＭＳＦを含有する緩衝液Ａに対して４℃において一
夜透析し、そして免疫沈澱のために処理した（上の記載
ように）。酵母菌中で生成したｕｂ−βｇａｌタンパク
質の分析 問題のプラスミドを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細
胞を８００ ｍｌのウラシル欠乏培地中で増殖させ、次
いで収穫し、そしてレウペプチン、ペプスタチンＡ、ア
ンチペイン、アプロチニンおよびクミスタチン（各々３
μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液Ａ中でガラスビーズで破
壊した。抽出物を１２,０００ｇで３分間遠心した。飽
和した硫酸アンモニウムを上澄み液に５７％の最終濃度
に添加した。４℃において一夜経過した後、沈澱したタ
ンパク質を２３，０００ｇで３０分間遠心することによ
って集めた。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含有する
緩衝液Ａ中に再溶解した。１２，０００ｇで３分間遠心
後、腹水からのＩｇＧ分画（ｇａｌに対するモノクロー
ナル抗体を含有する）をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ［バイオ−ラ
ド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）］に架橋することによって調製し
た親和カラムに試料を通過させた。架橋のために使用し
たＩｇＧ分画は、プロテインＡ−セファローズの親和ク
ロマトグラフィーによって腹水から精製した。トリトン
Ｘ−１００を欠く緩衝液Ａで洗浄後、抗体結合したタン
パク質を０．２５モルのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
６）で溶離した。溶離液を直ちに１モルのＮａ−ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ８．５）でｐＨ７．５に調節し、その後ＳＤ
Ｓ中で０．１％にした。試料をセントリコン（Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ）３０［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）］中の限
外濾過によって濃縮し、そして７％の不連続のポリアク
リルアミド−ＳＤＳゲル中で電気泳動させた［Ｕ．Ｋ．
ラエルミ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）、２２７、６８０（１９７０）］。ニトロセルロー
スへのタンパク質の電気ブロッティング、およびユビキ
チンに対するペプチド仲介抗体を使用するイムノブロッ
ティング分析を、Ｐ．Ｓ．スウェルドロウ、Ｄ．フィン
レイおよびＡ．バルシャウスキー、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、１５６、１４７（１９８６）に記載されている
ように実施した。Ａ．ハース（ミルウォーキーのメディ
カル・スクールの大学）から入手したユビキチンに対す
る異なる抗体を使用して、同一の結果を得た。

【００３４】図面の詳細な説明 第１図は、ユビキチン−ｌａｃＺ遺伝子融合体の構成を
示す。ｐＵＢ２、ｐＢＲ３２２に基づくゲノムＤＮＡク
ローン［Ｅ．オズカイナク、ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３１２、６６３（１９８４）は、フランキング
領域（ジグザグの線）と一緒に酵母菌ユビキチン解読配
列の６つの反復（開いたボックス）を含有する。ｐＵＢ
２を、線図に示すように、最初のユビキチン反復から下
流にＢａｍＨＩ部位の６塩基を配置することによって修
飾した。これにより、単一のユビキチン反復と発現ベク
ターｐＬＧＳＤ５−ＡＴＧん；ゾーンゲノムとの間フレ
ーム内融合するの構成（ヌクレオチドの配列決定によっ
て確証された）が可能であった［Ｇ２と呼ばれる、Ｌ．
グアレンテ、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１０１、１８１（１９
８３）］。用語「２μｍ」は、２μｍの円と呼ぶ酵母菌
プラスミドの複製起源およびフランキング配列を含有す
るｐＬＧＳＤ−ＡＴＧの領域を意味する（上のＬ．グア
レンテの文献を参照）。第３Ｂ図は、ユビキチン−βｇ
ａｌ接合の付近における融合タンパク質のアミノ酸配列
を示す。

【００３５】第２図は、ｇａｌの生体内で半減期がその
アミノ末端残基の関数であることを示す。（レーンａ）
ｐＵＢ２３、最初のｕｂ−ｌａｃＺ融合、を有するＥ．
ｃｏｌｉ菌株から分離したミニ細胞（第１図および第３
図）を［³⁵Ｓ］メチオニンで３６℃で６０分間標識し、
次いで記載するようにβｇａｌを分析した。ｇａｌの免
疫沈澱前に、標識したミニ細胞ＳＤＳ抽出物を標識しな
い酵母菌ＳＤＳ抽出物と一緒にしたとき、同一の結果が
得られた。（レーンｂ）ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌ（第３
Ｂ図）をエンコードするｐＵＢ２３を有するＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ細胞（第１図）を、［³⁵Ｓ］メチオニン
で３０℃において５分間標識し、次いでβｇａｌを分析
した。１〜３０分の［³⁵Ｓ］メチオニン標識期間の長
さ、およびプロテアーゼ阻害剤の存在下の細胞の機械的
破壊によって、あるいはＳＤＳ含有緩衝液中細胞を直接
沸騰することによって生成された酵母菌抽出物を使用し
て、同一の結果が得られた。（レーンｃ）レーンａと同
一であるが、ｇａｌをエンコードする対照プラスミドｐ
ＬＧＳＤ５（Ｇ１と呼ぶ、Ｌ．グアレンテの上の文献）
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を使用した。（レーンｄ〜ｇ）ｕｂ−
Ｍｅｔ−βｇａｌ（第３Ａ図）をエンコードするｐＵＢ
２３を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（第１図）
を３０℃において５分間［³⁵Ｓ］メチオニンで標識し、
次いでシクロヘキシイミドの存在下に１０、３０および
６０分間チェースし（レーンえ〜ｇ）、抽出し、免疫沈
澱し、そしてβｇａｌを分析した。（レーンｈ〜ｊ）レ
ーンｄ〜ｆと同一であるが、ｕｂ−Ｉｌｅ−βｇａｌを
使用した（参照、第３Ａ図）。（レーンｋ〜ｍ）レーン
ｈ〜ｊと同一であるが、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌを使用
した。（レーンｎ〜ｑ）レーンｄ〜ｇと同一であるが、
ｕｂ−Ｌｅｕ−βｇａｌを使用した。（レーンｒ〜ｕ）
レーンｄ〜ｇと同一であるが、ｕｂ−Ａｒｇ−βｇａｌ
を使用した。表示：ｏｒｉ；分離ゲルの由来；ｕｂ、ユ
ビキチン；βｇａｌ、特定したアミノ末端残基を含有す
るβｇａｌタンパク質の電気泳動の帯び；この用語にお
いて、ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌのＭｅｔ−βｇａｌ部分
はβｇａｌと表示する。矢印はβｇａｌの代謝的に安定
な、約９０ｋＤの消化生成物を示し、これはある比率の
生存が短いβｇａｌ代謝的に部分、例えば、Ｌｅｕ−β
ｇａｌおよびＡｒｇ−βｇａｌの生体内で内部タンパク
質分解的切断の結果として明らかに形成する（レーンｎ
〜ｕ）。

【００３６】第３図は、ユビキチン−ｇａｌ接合におけ
るｇａｌの変化するアミノ酸残基を示す。（Ａ）ｕｂ−
Ｍｅｔ−βｇａｌをエンコードする、最初のプラスミ
ド、ｐＵＢ２３（第１図）を、上に記載するように、突
然変異誘発して、ｕｂ−βｇａｌ接合におけるもとのＭ
ｅｔコドンＡＴＧをＭｅｔ以外の１９アミノ酸を特定す
るコドンに転化した。（第３図中に示す突然変異誘発の
もとのラウンドは１９のうちから１５の可能な置換を生
成した。残りの４つの置換は後に生成した（参照、表
１））。矢印は、ｕｂ−Ｐｒｏ−ｇａｌを除外した融合
タンパク質のすべてを用いて起こる、発生期の融合タン
パク質における脱ユビキチン生体内で切断の部位を示す
（参照、テキスト）。示した構成体のすべては、第２ｇ
ａｌ残基としてＨｉｓをエンコードする。さらに、構成
体のあるもの（ｕｂ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−βｇａ
ｌ、ｕｂ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−βｇａｌ、および
ｕｂ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−βｇａｌ、最
後のものは挿入突然変異によって生成した、参照、表
２）において、ＨｉｓあるいはＧｌｎはｕｂ−βｇａｌ
接合においてＭｅｔより後に存在し、対応するｇａｌタ
ンパク質の代謝的安定性について区別不可能な結果を与
えた。（Ｂ）ｕｂ−Ｍｅｔ−βｇａｌのアミノ酸配列
（単一の文字の略号）、初期の融合タンパク質（第１
図）、ｕｂ−βｇａｌ接合付近。単一の文字のアミノ酸
の略号：Ａ、Ａｌａ；Ｃ、Ｃｙｓ；Ｄ、Ａｓｐ；Ｅ、Ｇ
ｌｕ；Ｆ、Ｐｈｅ；Ｇ、Ｇｌｙ；Ｈ、Ｈｉｓ；Ｉ、Ｉｌ
ｅ；Ｋ、Ｌｙｓ；Ｌ、Ｌｅｕ；Ｍ、Ｍｅｔ；Ｎ、Ａｓ
ｎ；Ｐ、Ｐｒｏ；Ｑ、Ｇｌｎ；Ｒ、Ａｒｇ；Ｓ、Ｓｅ
ｒ；Ｔ、Ｔｈｒ；Ｖ、Ｖａｌ；Ｗ、Ｔｒｐ；Ｙ、Ｔｙ
ｒ。

【００３７】第４図は、脱ユビキチンしない場合、ユビ
キチン−ｇａｌが生存が短いことを示す。（レーンａ〜
ｇ）Ｘが各レーンの上部に示す残基である、ｕｂ−Ｘ−
βｇａｌ融合タンパク質をエンコードするプラスミドを
有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、３０℃におい
て５分間標識し、抽出し、免疫沈澱させ、そしてβｇａ
ｌを分析した。これらのレーンについてのフルオログラ
フィーの露出は、第２図における同様なパターンをもつ
ものより数倍長く、生存が短いβｇａｌタンパク質の多
数のユビキチン化を明らかにした。（レーンｈ、ｉ）パ
ルス−チェース露出における多数のユビキチン化Ｌｅｕ
−βｇａｌタンパク質の「ラダー（ｌａｄｄｅｒ）」を
明らかにするために、第２図においてレーンｎ、ｏのフ
ルオログラフィーの過度の露出（それぞれ、０および１
０分のチェース）。（レーンｊ）レーンａ〜ｇと同一で
あるが、ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌを使用した。（レーン
ｋ）レーンｊと同一であるが、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌ
を使用した。（レーンｌ）レーンｊと同一である。（レ
ーンｍ〜ｐ）ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌをエンコードする
プラスミドを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を３
０℃において５分間［³⁵Ｓ］メチオニンで標識し（レー
ンｍ）、次いでシクロヘキシイミドの存在下に１０、３
０および６０分間チェースした（レーンｎ〜ｐ）。レー
ンｐの右への上の小さい矢印は、ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａ
ｌを示し、その小さい比率は１時間のチェース後なお存
在する。下の小さい矢印は、チェースの間ゆっくり蓄積
し、そして代謝的に安定である、明らかに脱ユビキチン
されたＰｒｏ−βｇａｌを示す。レーンｍの左への点
は、使用した抗体によってある実験において沈澱した、
内因性酵母菌タンパク質を示す。正方形のカッコは多数
のユビキチン化βｇａｌ種を意味する（参照、第５
図）。他の表示は第２図における通りである。

【００３８】第５図は、ユビキチンを含有する「ラダ
ー」ｇｅｌ種を示す。（レーンａ）ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇ
ａｌをエンコードするプラスミドを有するＳ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ細胞を、増殖し、そして破壊し、そしてβ
ｇａｌに対する固定化した抗体を有するカラムの親和ク
ロマトグラフィーによって、抽出物をβｇａｌタンパク
質の分離のために処理した。このようにして得られたβ
ｇａｌタンパク質をポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル中
で電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、そしてユビ
キチンに対する抗体でプロービングした。（レーンｂ）
レーンａと同一であるが、ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌを使
用した。（レーンｃ）ｂと同一であるが、より長いオー
トラジオグラフィーの露出。（レーンｃ）ｕｂ−Ｌｅｕ
−βｇａｌをエンコードするプラスミドを有するＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンで５分間
標識し、次いで抽出し、免疫沈澱し、そしてβｇａｌの
電気泳動させた（第４図、レーンｆと同一の試料）。正
方形のカッコは、ユビキチンに対する抗体で検出された
多数のユビキチン化Ｇｌｎ−βｇａｌ種を示す。矢印は
ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの帯び、レーンｂおよびｃにお
いて見られる初期の融合タンパク質を示す。矢印の頭
は、ｕｂ−Ｇｌｎ−βｇａｌ融合タンパク質から誘導さ
れた脱ユビキチンしたβｇａｌ［クーマッシー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ）の着色または代謝的に標識つけによる
が、ユビキチンに対する抗体を使用しないで検出可能で
ある］の帯の位置を示す。

【００３９】第６図は、原核細胞および真核生物の両者
の長く生きる細胞内タンパク質がそれらのアミノ末端に
おいて安定化アミノ酸残基を有するが、これに対して分
泌されたタンパク質が相補的バイアスを示すことを示
す。

【００４０】（Ａ）原核細胞（７７のタンパク質）およ
び真核生物（１３１のタンパク質）の両者からのブロッ
キングされないアミノ末端をもつ２０８の長く生きる、
直接に配列決定した、細胞内（非画分化）タンパク質
を、Ｎ−末端ルールによって定められた、それらのアミ
ノ末端残基の性質に従って、３つの群に分配した。検査
した細胞内タンパク質のすべては、広範に安定化性の残
基をそれらのアミノ末端において有する。パネルＢ〜Ｄ
において、類似の線図が２４３の分泌された真核生物の
タンパク質（Ｂ）について、３７の免疫グロブリンの軽
鎖および重鎖（Ｃ）について、および９４の分泌された
真核生物のトキシン（Ｄ）について表されている。Ｃお
よびＤにおけるエントリーはＢにおけるエントリーのサ
ブセットである。Ｂ〜Ｄにおけるタンパク質について、
集めたアミノ末端は、割り当てが可能であるときはいつ
でも、分泌する細胞内にない位置するタンパク質の最も
処理された形態に相当する。Ａ〜Ｄにおけるデータは、
１９８１年以前に入手可能であった完全なタンパク質配
列の全体組みから相互に集めた。同一の結論は、現在の
ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデン
ションのデータベースを使用して、いっそう詳細なかつ
広範な、コンピュータに助けられるタンパク質のアミノ
末端の表作成後に、最近到達された。Ａｓｎ、Ｃｙｓ、
ＨｉｓおよびＴｒｐのアミノ末端残基残基は、対応する
ｇａｌタンパク質の生体内半減期がまだ未知であるの
で、収集から排除した（しかしながら、表１の凡例を参
照）。同一のタイプの最近の収集中への残基（表１）の
包含は、もとの結論を変化させなかった。アミノ末端Ｐ
ｒｏは、また、収集から排除したが、Ｐｒｏは、長く生
きる非画分化タンパク質のアミノ末端におけるＰｒｏの
頻繁な存在と一致するβｇａｌについて安定化残基であ
るように思われる（表１）。

【００４１】結果および説明 発生期のユビキチン−βｇａｌ融合タンパク質の急速な
生体内脱ユビキチン ユビキチン部分のカルボキシル末端のグリシンがイソペ
プチド結合を経てタンパク質中の内部のリジン残基のε
−アミノ基へ結合する、枝分かれしたユビキチン接合体
は、明らかに、真核生物の細胞中の多くのユビキチン接
合体からなる。標的タンパク質のアミノ末端α−アミノ
基へユビキチンを接合して、線状のユビキチン接合体を
生成することは、また、化学的に可能である。参照、
Ａ．ヘルコら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８１：７０２１（１
９８４）。線状ユビキチン−タンパク質融合体がユビキ
チンのタンパク質のアミノ末端への翻訳後の酵素的接合
によって生体内で実際に合成されるか否かにかかわら
ず、このようなタンパク質は、また、適当なキメラ遺伝
子を構成し、そしてそれらを生体内で発現させることに
よって生成することができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのｇａｌへ結合した酵母菌ユビキチンをエン
コードする、１つのこのような遺伝子の構成は、第１図
にしめされている。

【００４２】この遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ中で発現される
とき、得られるβｇａｌ含有タンパク質は見掛けの分子
質量を有し、これは対照βｇａｌのそれより大きく、ほ
ぼ６ｋＤであり、キメラ遺伝子によってエンコードされ
るタンパク質中のユビキチンの存在と一致する値であ
る。対照的に、同一遺伝子を酵母菌中で発現するとき、
対応するβｇａｌタンパク質は対照βｇａｌと電気泳動
的に区別可能である。この結果は、［³⁵Ｓ］メチオニン
標識期間（１〜３０分）に対して独立である。さらに、
生体内標識したゲル精製βｇａｌのエドマン分解によ
る、推定のＭｅｔ−βｇａｌ（半減期、ｔ_1/2 ２０時
間）におけるアミノ末端残基の決定（第２図、レーン
ｄ）は、そのアミノ末端における期待するＭｅｔ残基の
存在（第３Ａ図および表１）を確証した。ユビキチンが
融合タンパク質を切断するという独立の証拠は、ユビキ
チンの最後のＧｌｙ残基が下に存在した直後に、起こ
る。酵母菌において、ユビキチンは発生期のユビキチン
−融合タンパク質を効率よく切断して、脱ユビキチンさ
れたβｇａｌを生成すると、われわれは結論する。
［Ｅ．ｃｏｌｉ中の脱ユビキチン反応の不存在は、原核
細胞がユビキチンおよびユビキチン特異的酵素の両者を
欠くことをしめす他の証拠と一致する］。

【００４３】キメラ遺伝子、Ｇｌｙ−Ｍｅｔによってエ
ンコードされるユビキチン−β−ｇａｌ接合（第１図お
よび第３Ｂ図）は、成熟ユビキチン中に効率よく処理さ
れる、ポリユビキチン前駆体タンパク質中の隣接する反
復の間の接合と同一である。こうして、まだ生化学的に
特性づけられないが、同一のプロテアーゼは、成熟ユビ
キチンへのポリユビキチンの転化、および発生期のユビ
キチン−βｇａｌタンパク質の脱ユビキチンのための原
因となるように思われる。そうである場合、ユビキチン
−βｇａｌの生体内脱ユビキチンを阻害する（これによ
ってβｇａｌへの安定なユビキチンの結合の代謝的結果
の分析を可能とする）１つの潜在的方法は、ユビキチン
−βｇａｌ接合におけるβｇａｌのＭｅｔ残基（第３Ｂ
図）を他のアミノ酸残基（第３Ａ図）に転化することで
ある。このようなアプローチの予期されない結果は下に
説明する。

【００４４】βｇａｌの生体内半減期はそのアミノ末端
残基の関数である。ユビキチン接合におけるｇａｌのも
とのＭｅｔ残基を特定するＡＴＧコドン（第３Ｂ図）
を、部位特異的突然変異誘発によって、１９の他のアミ
ノ酸を特定するコドンに転化した（参照、第３Ａ図およ
び表１）。これらの構成体は、もっぱらユビキチン接合
におけるβｇａｌの第１コドンにおいて異なる（第３Ａ
図）。このように設計された１６プラスミドの各々が酵
母菌中に導入された後、生体内でパルス標識された対応
するｇａｌタンパク質の分析は、次の結果に導いた(第
２図、第４図および表１)： １）１つの例外（下を参照）を除いて、発生期のユビキ
チン−βｇａｌの効率よい脱ユビキチンは、ユビキチン
−βｇａｌ接合におけるβｇａｌのアミノ酸残基の性質
に無関係に起こる。こうして、もとのユビキチン−βｇ
ａｌタンパク質をＧｌｙ−Ｍｅｔ接合において切断す
る、明らかにユビキチン特異的のプロテアーゼは、一般
に、接合におけるβｇａｌの第１残基の性質に無関係で
ある(第３Ａ図および表１)。この結果は、事実、生体内
で生成されたそうでなければ同一のβｇａｌタンパク質
のアミノ末端において、異なるアミノ酸残基を露出する
ことを可能とする。

【００４５】２）こうして設計されたβｇａｌタンパク
質の生体内の半減期は、βｇａｌのアミノ末端において
露出されたアミノ酸残基の性質に依存して、２０時間以
上から３分より小に変化する（第２図、第４図および表
１）。詳しくは、アミノ末端にＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＣｙｓまたはＧｌｙをもつ脱ユビ
キチンされたβｇａｌタンパク質は、遺伝子がユビキチ
ンのそれに融合されていない対照の半減期に類似して、
２０時間の比較的長い生体内半減期を有する（第２図、
レーンｄ〜ｇ、および表１）。顕著に対照的に、アミノ
末端にＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐまたは
Ｔｒｐをもつβｇａｌタンパク質は、Ａｒｇ−βｇａｌ
についてほぼ２分およびＬｙｓ−βｇａｌ、Ｐｈｅ−β
ｇａｌ、Ｌｅｕ−βｇａｌ、Ａｓｐ−βｇａｌ、Ａｓｎ
−βｇａｌおよびＴｒｐ−βｇａｌについてほぼ３分の
間の非常に短い半減期を有する（第２図、レーンｎ〜
ｕ、および表１）。Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＴｙｒのアミ
ノ末端残基をもつβｇａｌタンパク質の半減期はほぼ１
０分であり（第２図、レーンｋ〜ｍ、および表１）、こ
れに対してアミノ末端のＩｌｅまたはＧｌｕはβｇａｌ
にほぼ１０分の半減期を与える（第２図、レーンｈ〜
ｊ、および表１）。パルス−チェースおよび連続的標識
技術の両者を、これらの実験において使用し、そして同
様な結果を得た。

【００４６】個々のアミノ酸の組みを、それらがそのア
ミノ末端において露出されるときｇａｌに与える半減期
に関して配列することができる。得られるルール（表
１）を「Ｎ−末端ルール」と呼ぶ。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１に対する凡例 Ｎ−末端ルール。酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の
βｇａｌタンパク質の生体内半減期は、パルス−チェー
ス技術（短い半減期のｇａｌについて；下を参照）によ
って、あるいは粗製抽出物中のｇａｌの酵素活性を測定
によって決定した。βｇａｌの活性を測定するため、ガ
ラクトース含有培地中で増殖する細胞を、ガラクトース
を欠かつ１０％のグルコースを含有する、そうでなけれ
ば同一の培地に移した。３０℃において少なくとも５時
間さらに増殖させた後、グルコースへのシフトの前およ
び後の細胞当たりのβｇａｌ活性の比を、βｇａｌタン
パク質の各々について決定した。［融合遺伝子のＧＡＬ
プロモーター推進発現（第１図および第２図）はグルコ
ース培地中で再び発現させる］。生存が短い（ｔ_1/2＜
１時間）βｇａｌタンパク質について、パルス−チェー
ス技術を同様によく使用された（第２図および第４
図）。パルス−チェース実験において［³⁵Ｓ］メチオニ
ンで標識されたβｇａｌタンパク質の電気泳動の帯びを
第２図および第４図のそれらと同様にシンチラント含
浸、乾燥ゲルから切り取り、そして帯び中の³⁵Ｓを決定
した。生存が短いｇａｌの生体内の崩壊は一次の動力学
から誘導し、ここで分解の速度はチェースのより遅い
（１時間）時間の期間において測定するとき低く、より
遅い速度はシクロヘキシイミドの時間依存性の毒性作用
あるいは生体内分解過程の固有の特性を反映する。［翻
訳の抑制はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の効率よい短時
間のチェースのために必要である。なぜなら、アミノ酸
プールの平衡化の問題はこの有機体中で液胞の存在に関
係するからである］。下に列挙する半減期の値は、チェ
ースの最初の１０分の間に決定した。いくつかの証拠
（参照、第４図および第６図の説明）は、Ｐｒｏが安定
化残基であることを示唆する。列挙したアミノ酸の旋回
の半径はＭ．レビット、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１０
４：５９（１９７６）からのものである。

【００４９】アミノ酸のアミノ末端の位置はｇａｌの半
減期へのその作用について必須である 部位特異的突然変異誘発を用いて、「安定化」アミノ酸
（この実験において、Ｍｅｔ残基）を特定するコドン
を、ユビキチン−βｇａｌ接合におけるβｇａｌの最初
のコドンの前に挿入した（表２）。他の安定化残基（Ｔ
ｈｒ）あるいはユビキチン−βｇａｌ接合における種々
の脱安定化残基（Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の前に
おける安定化残基（Ｍｅｔ）の挿入は、長く生きる脱ユ
ビキチンされたβｇａｌを必ず生ずる（表２）。さら
に、生存が短いばかりでなく、かつまた脱ユビキチンに
対して抵抗性であるユビキチン−Ｐｒｏ−βｇａｌ（第
４図、レーンｊ〜ｐ、および表１）と対照的に、ユビキ
チン−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−βｇａｌは生体内で効率よく脱
ユビキチンされて長く生きるＭｅｔ−Ｐｒｏ−βｇａｌ
を生成する（表２）。これらの結果が示すように、アミ
ノ酸残基の同一性およびそのアミノ末端の位置（多分遊
離ａ−アミノ基の存在）の両者はβｇａｌの半減期への
その作用について必須である。さらに、これらの結果が
支持するように、融合タンパク質の切断はユビキチンの
最後Ｇｌｙ残基の直後に起こる（第３Ａ図）。

【００５０】

【表２】

【００５１】アミノ酸のアミノ末端の位置は、βｇａｌ
のその作用について必須である。挿入突然変異体は本質
的に突然変異体の初期の組みについて記載したように得
たが、ただしＭｅｔコドンの背後に挿入された不明瞭の
コドンの５’側に１４塩基および３２−残基をを含有す
る、３２−塩基のオリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＣＧ
ＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣ（Ｇ／Ｃ／Ｔ／）（Ｇ／Ｔ）ＣＡ
ＴＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧを使用した。カッコ内の塩
基は、配列中の位置１６および１７における不明瞭を意
味する。対応するβｇａｌタンパク質の半減期は、表１
に対する凡例中に記載ように決定した。

【００５２】ｇａｌの長く生きる切断生成物は、生存が
短いβｇａｌタンパク質の崩壊の間に形成される。

【００５３】生存が短い（長く生きるものでない）の電
気泳動のパターンは、βｇａｌの特異的な、約９０ｋＤ
の切断生成物を必ず含有し（第２図、レーンｎ〜ｕ）、
この生成物は、親のβｇａｌ種と異なり、標識後（チェ
ース）期間の間に蓄積する（第４図、レーンｍ〜ｐ）。
９０ｋＤのβｇａｌ断片は、比較的小さい比率の初期量
のパルス標識されたβｇａｌを構成する。それにもかか
わらず、その存在は、生体内の電気泳動的切断がその生
存が短い親のタンパク質の代謝的寿命からタンパク質断
片を救済する。単一のタンパク質種内の多数の半減期の
得られる可能性が天然の生存が短いタンパク質の設計に
おいて利用されるかどうかについての理解が残る。

【００５４】ユビキチン−βｇａｌは、脱ユビキチンさ
れないとき、生存が短い。

【００５５】ユビキチン−Ｐｒｏ−βｇａｌ、生体内で
脱ユビキチンされない唯一のユビキチン−βｇａｌ（第
４図、レーンｊ〜ｐ）は、代謝的に安定なβｇａｌタン
パク質の半減期（表１）の１％より短い、ほぼ７分の半
減期（表１）を有する。この結果の１つの解釈は、タン
パク質のアミノ末端への代謝的に安定なユビキチンの結
合が需要体タンパク質の分解のシグナルを与えるために
十分であるということである。この解釈は、哺乳動物の
細胞における生存が短いタンパク質のユビキチン化がそ
れらの分解に必須であるという、早期の生化学的および
遺伝学的証拠と一致する。同時に、ユビキチン−Ｐｒｏ
−βｇａｌ以外のすべてのユビキチン−βｇａｌ融合タ
ンパク質は生体内で急速に脱ユビキチンされる。（表
１）。こうして、タンパク質の翻訳後のアミノ末端ユビ
キチン化は、生体内の分解のためのタンパク質を表示す
る、初期の認識またはコミットメント（ｃｏｍｍｉｔｍ
ｅｎｔ）工程において含まれないことがある。翻訳後の
アミノ末端のユビキチン化（それが生体内で実際に起こ
る場合）が分解通路の後の段階のために必須であるかど
うかは、まだ、決定することができない。早期の生体内
の実験により、タンパク質分解の基質のアミノ末端の優
先的化学的修飾は生体内ユビキチン依存性のタンパク質
分解系におけるそれらの分解を阻止することが示され
た。これらのデータに基づき、タンパク質のアミノ末端
のユビキチン化はそれらの分解のために必須であること
が提案された。同一の結果の別の解釈は、タンパク質の
アミノ末端の化学的ブロッキングが、その初期の段階が
必ずしもユビキチン依存性でない、「Ｎ−末端ルール」
によって、それらのアミノ末端の認識を防止するという
ことである。

【００５６】生存が短いβｇａｌタンパク質は生体内で
多数的にユビキチン化される。

【００５７】パルス−チェースのフルオログラムの過剰
露出（第２図）は、脱ユビキチンされた、生存が短いβ
ｇａｌタンパク質の主要な帯びが、４〜７ｋＤの間隔で
不規則的に間隔をもって位置する帯びを含有する、大き
い分子量のβｇａｌの「ラダー」と共存することを明ら
かにする（第４図、レーンｃ〜ｇ）。長く生きるβｇａ
ｌタンパク質のフルオログラムを同様に過度に露出する
とき、このような大きい種は現れない。βｇａｌに対す
る抗体およびユビキチンに対する抗体の両者を使用する
免疫学的分析は、「ラダー」βｇａｌ種がユビキチンを
含有することを立証する（第５図）。

【００５８】選択的分解の通路のためのモデル 天然のまたは操作したユビキチン融合タンパク質（第１
図および表１）を除外して、発生期のタンパク質はユビ
キチン部分を明らかに欠く。発生期の非画分化タンパク
質の生体内アミノ末端処理は、その基質特異性が部分的
に特性づけられる、アミノ末端ペプチダーゼの作用を経
て、それらの成熟アミノ末端を発生させる。［参照、ツ
ナサワ、Ｓ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６０、
５３８２（１９８５）；ボイセル、Ｊ．Ｐ．ら、ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ、８２、８４４８（１９８５）］。こうして
発生したアミノ末端は、「Ｎ−末端の読み」によって認
識されることを、われわれは示唆する。１つの特定のモ
デルは、タンパク質分子を分解するコミットメントを、
酵素を確率的に操作することによって、そのアミノ末端
残基を認識する結果としてなされるものであり、その標
的アミノ末端における「クランピング」の確立はＮ−末
端ルールによって決定される（表１）。いったんコミッ
トメントがなされると、標的タンパク質の高度に処理さ
れやすいユビキチン化が起こり、これはβｇａｌの場合
において、ｇａｌの分子当たり１５より多いユビキチン
部分に接合する（第４図、レーンｃ〜ｇ、および第５
図）。次いで、多数でユビキチン化された「下流」の酵
素（１）によって分解され、そのために標的のユビキチ
ン部分は、認識シグナルまたは変性［アンフォルディン
グ（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）］装置として、あるいは両者
として働く。

【００５９】ユビキチン含有「ラダー」βｇａｌ種（第
４図、レーンｃ〜ｌ、および第５図）は、βｇａｌにお
いて内部リジン残基のε−アミノ基に接合した、明らか
に枝分かれのユビキチン部分から成る。驚くべきことに
は、ユビキチン−Ｐｒｏ−βｇａｌから誘導した「ラダ
ー」βｇａｌ種は、βｇａｌの類似の種から電気泳動的
に区別可能であり、その類似の種のアミノ末端ユビキチ
ンは発生期の融合タンパク質を切断する（第４図、レー
ンｊ〜ｌ、および第５図）。電気泳動的に区別可能なユ
ビキチン化したβｇａｌ種が、事実、構造的に相同性で
ある場合、これらの結果は別の２つのモデルと適合し、
ここで、第１のユビキチンがβｇａｌに枝分かれ接合し
た直後に、枝分かれユビキチン化−Ｐｒｏ−βｇａｌは
アミノ末端の脱ユビキチン化するか、あるいはアミノ末
端ユビキチン部分を欠く類似のβｇａｌ種はそれを再び
獲得する。この不明瞭されの実験的解明は、タンパク質
の翻訳後のアミノ末端のユビキチン化（それが生体内で
起こる場合）選択的タンパク質のターンオーバーにおい
てある役割を演ずるかどうかに拘らず、達成することが
できる。

【００６０】原核細胞および真核生物の両者はＮ−末端
ルールに従うように思われるが（下を参照）、バクテリ
アは明らかにユビキチン系を欠く。こうして、仮定のＮ
−末端認識タンパク質が、選択的分解通路の残部である
より、原核細胞および真核生物の間でいっそう強く保存
されることが可能である。興味あることには、その存在
が生体外のユビキチン接合酵素によるタンパク質分解基
質のユビキチン化のために要求される、哺乳動物のタン
パク質Ｅ３の性質は、Ｎ−末端認識タンパク質の１成分
であるということと一致する。

【００６１】Ｎ−末端ルールおよび細胞内タンパク質の
既知のアミノ末端 原核細胞および真核生物の両者からの代謝的に安定な、
非画分化タンパク質における、ブロッキングされないア
ミノ末端残基は、安定化クラス（Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ）、すなわち、ｇａｌに生
体内の長く生きる与えるクラス、から排除される(第６
Ａ図)。それについての成熟アミノ末端が知られてい
る、１つの生存が短い細胞内タンパク質は、ファージラ
ムダのｃＩＩタンパク質であり、これはλが溶菌的に増
殖するか、あるいは感染した細胞を溶原菌化するかどう
かを決定するトリガーの中央成分である。［Ｙ．Ｓ．Ｈ
Ｏ、Ｄ．ウルフ、Ｍ．ロウゼンバーグ、遺伝子の発現の
調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ）、Ｉ．ブースおよびＣ．ヒギンス編（ケ
ンブリッジ大学、プレス、ロンドン、１９８６)、ｐ．７
９；Ｆ．バヌエット、Ｍ．Ａ．、ホイト、Ｌ．マクファ
ーレン、Ｈ．エコールス、Ｉ．ヘルスコウィッツ、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、１８７、２１３（１９８６）；Ｈ．
エコールス、細胞（Ｃｅｌｌ）、３１、５６５（１９８
２）；Ｋ．ナスミス、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）、３２０、６７０（１９８３）］。ラムダ
感染したＥ．ｃｏｌｉにおけるｃＩＩの半減期は、３分
より短い。顕著には、ｃＩＩの成熟アミノ末端はＡｒｇ
で開始し［ホウ、Ｙ．Ｗ．ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、９１２３（１９８２）］、この残基はＮ−末端
ルールにおける最も脱安定化残基である（表１）。

【００６２】脱安定化アミノ酸は疎水性であり、帯電し
ない親水性であるか、あるいは帯電していことができる
が、それらはＭｅｔを除外する安定化アミノ酸のいずれ
よりも大きい旋回半径を有するという性質を共有する。

【００６３】画分化タンパク質におけるアミノ末端残基
は大部分脱安定化クラスである。

【００６４】第６図は、長く生きる非画分化細胞内タン
パク質（Ａ）および分泌されたタンパク質（Ｂ）の間の
アミノ末端残基の選択における顕著な差を示し、分泌さ
れたタンパク質の多くはそれらのそれぞれの細胞外画分
において長く生きる。この発見の１つの解釈は、Ｎ−末
端ルールに従って操作する、単一の細胞内分解の通路が
細胞内タンパク質の生体内半減期の多様性および細胞内
空間中に異常に導入される、画分化タンパク質の選択的
分解の両者について原因となりうるということである。
ある誤って画分化されたタンパク質は他のものよりも細
胞に有害であり得る。したがって、分泌された真核生物
トキシンは、分泌されたタンパク質の一般の集団よりも
頻繁に、それらのアミノ末端に、強く脱安定化性の残基
（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ）を含有す
るということは、興味あることである（第６図、パネル
Ｂ〜Ｄ）。

【００６５】上の考察が、また、示唆するように、細胞
の位相的外側、例えば、内質の網状構造の内腔およびゴ
ルジ、および細胞外空間がＮ−末端ルールの通路に類似
する分解通路を有する場合、それらはＮ−末端ルールの
「逆転した」型に基づくことができ、ここで細胞の内側
で脱安定化されるアミノ末端残基は、今度は、安定化残
基であるか、あるいはその逆である。こうして、本発明
の方法は、また、分泌されたものを包含する、画分化タ
ンパク質の代謝的安定性および他の性質の操作に有用で
あろう。

【００６６】長く生きるタンパク質のターンオーバーに
おけるＮ−末端ルールの通路の可能な役割。

【００６７】脱安定化（表１）終わりから２番目の残基
をもつ長く生きる細胞内タンパク質は、それらの初期の
アミノ末端メチオニン残基を一般に保持する。アミノ末
端の処理を行わない、長く生きる細胞内タンパク質にお
けるアミノ末端残基は、必ず安定化クラスに属する（表
１）。長く生きるタンパク質ターンオーバーにおけるＮ
−末端ルールの通路を包含するであろう興味ある可能性
は、長く生きるタンパク質の生体内分解における速度制
限段階が脱安定化残基を露出する、遅いアミノペプチダ
ーゼ切断および引き続くＮ−末端ルールの通路を経る急
速な分解であることができるということである。分解速
度の微細な調整は、この場合において、Ｎ−末端ルール
に従う残基の脱安定化能力の機能であるよりはむしろ、
脱安定化残基を露出するアミノペプチダーゼ切断の速度
の機能であることに注意すべきである。

【００６８】Ｎ−末端ルールおよび生存が短い損傷され
たタンパク質の選択的分解 生体内の選択的分解のためのそうでなければ長く生きる
が、損傷されたタンパク質を標的する、ポリペプチド鎖
の折り畳みパターンまたは局所的化学的特徴の認識は、
Ｎ−末端ルールの通路によって直接仲介されるように思
われる。その代わり、特異的プロテアーゼ（機能がＤＮ
Ａにおける特異的障害を認識するヌクレアーゼに類似す
る）は、標的されたタンパク質を切断して、切断の２つ
の生成物の一方のアミノ末端において脱安定化残基を露
出することを、われわれは示唆する。このモデルの１つ
の試験可能な予測は、分解通路の初期の切断生成物がそ
れらのＮ−末端に脱安定化残基をを有することでであ
る。初期のタンパク質の切断の生成物のアミノ末端にお
ける脱安定化残基の優先的露出は、含まれるプロテアー
ゼの固有の特異性のためであるか、あるいはアミノ酸の
大部分が脱安定化クラスに属する（表１）という単なる
事実のためであろう。さらに、タンパク質の初期の切断
は、そのもとのコンホメーションの面を脱安定化市、こ
うしてそれ以上の内部の切断の可能性を増加することが
期待されるであろう。タンパク質の初期の切断生成物
が、もっぱらＮ−末端ルールの通路を経て分解するか、
あるいは追加の内部の切断によってさらに処理されなけ
ればならなかどうかは、いくつかの因子、例えば、初期
の切断生成物のアミノ末端における脱安定化残基の露
出、および内部の切断の導入に依存するであろう。この
モデルにおいて、Ｎ−末端ルールの通路は、化学的に損
傷され、永久に停止され、不適切に折り畳まれ、そして
誤って画分化されたものから、天然のマルチサブユニッ
トの凝集体にアセンブリング不可能なものに、および最
後に生体内で生存が短いそうでなければ正常のものに及
ぶ、代謝的に不安定なタンパク質の大部分の分解のため
に必須であろう。こうして、タンパク質の代謝的不安定
性は、そのアミノ末端における脱安定化残基の露出によ
ってばかりでなく、かつまた切断生成物のアミノ末端に
おいて脱安定化残基を露出するタンパク質分解的切断を
生ずる、そのポリペプチド鎖のコンホメーションのおよ
び化学的特徴によって仲介されることができる。

【００６９】いずれの所定のタンパク質についても、Ｎ
−末端ルールに加えて種々の因子は一緒になってその生
体内の半減期を変調することができる。このような因子
の例は、次のとおりである：タンパク質のアミノ末端の
柔軟性および接近可能性［トルントン、Ｊ．Ｍ．および
シバンダ、Ｂ.Ｌ.、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１６７、４
４３（１９８３）］、アミノ末端基を化学的にブロッキ
ングする基、例えば、アセチル基の存在、アミノ末端付
近におけるユビキチン化可能なリジンの分布、および他
の変数、例えば、カルボキシル末端の構造。マルチサブ
ユニットのタンパク質のアミノ末端領域は普通にサブユ
ニットの界面に含まれる［トルントン、Ｊ．Ｍ．および
シバンダ、Ｂ．Ｌ．、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１６７、
４４３（１９８３）］ので、タンパク質の第４構造は、
生体内のタンパク質の半減期へのＮ−末端ルールの通路
の衝撃を変調することが期待される、なお他のパラメー
ターである。さらに、上に示唆したように、Ｎ−末端ル
ールの通路は、また、その分解のための標的として初期
の認識がそれらのアミノ末端における構造に対して独立
である、タンパク質の分解に必須である。

【００７０】タンパク質のアミノ末端へのアミノ酸の翻
訳後の付加の機能的意味 バクテリアおよび真核生物の両者において、生体外の受
容体成熟アミノ末端への特異的アミノ酸の翻訳後の接合
を触媒する、酵素の異常なクラス、アミノアシル−転移
ＤＮＡ−タンパク質トランスフェラーゼが存在すること
が、多年にわたって、知られている［Ｒ．Ｌ．ソファ
ー、トランスファー、ＲＮＡ：バイオロジカル・アスペ
クツ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ：Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ）、Ｄ．ソル、Ｊ．Ｎ．アベルソン、
Ｐ．Ｒ．シムメル編（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、
１９８０）、ｐ４９３；Ｃ．デウチ、メソッズ・イン・
エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．）、１０６、１９８（１９８４）：Ａ．カジ、Ｈ．
カジ、Ｇ．Ｄ．ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.)、２４
０、１１８５（１９６５)]。生体内のタンパク質へのア
ミノ酸の翻訳後付加は、抑圧されたまたは再生の組織、
例えば、神経細胞の軸索への物理的損傷後の組織、にお
いて劇的に促進する［Ｓ．シネ−アスワル、Ｒ．Ｖ．リ
ッシオ、Ｇ．チャクラボルティ、Ｎ．Ａ．インゴリア、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１、６０３（１９
８６）；Ｎ．Ａ．インゴリア、ジャーナル・オブ・ネウ
ロサイエンス(ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ)、３、２４６３
（１９８３)]。Ｎ−末端ルールは、この現象についての
せつめいを提供する。細胞の変化した生理学的状態によ
って要求される、そうでなければ損傷されない、長く生
きるタンパク質の代謝的安定性が、生体内で標的タンパ
ク質のアミノ末端への脱安定化アミノ酸の翻訳後の付加
によって発生することを、われわれは示唆する。顕著に
は、タンパク質へのアミノ酸の既知の翻訳後の付加
［Ｒ．Ｌ．ソファー、ＲＮＡ：バイオロジカル・アスペ
クツ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ：Ｂｉｌｏｇｉｃａｌ
Ａｓｐｅｃｔｓ）、Ｄ．ソル、Ｊ．Ｎ．アベルソン、
Ｐ．Ｒ．シムメル編（コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールド・ハーバー、ニューヨーク、
１９８０）、ｐ４９３；Ｃ．デウチ、メソッズ・イン・
エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．）、１０６、１９８（１９８４）：Ａ．カジ、Ｈ．
カジ、Ｇ．Ｄ．ノベリ、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２
４０、１１８５（１９６５）；Ｓ．シネ−アスワル、
Ｒ．Ｖ．リッシオ、Ｇ．チャクラボルティ、Ｎ．Ａ．イ
ンゴリア、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１、６
０３（１９８６）；Ｎ．Ａ．インゴリア、ジャーナル・
オブ・ネウロサイエンス（ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、
３、２４６３（１９８３）］は、Ｎ−末端ルールに従っ
て脱安定化される、ほとんどのアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、およびＴｙｒ）を包含する。タン
パク質への脱安定化アミノ酸の付加が起こることが期待
される生理学的状態は、前以て存在する、そうでなけれ
ば長く生きる細胞内タンパク質のある比率が選択的に分
解される、細胞サイクルへの出入り、化学的または物理
学的ストレスへの応答、および特定の分化の事象、例え
ば、赤血球の分化および精子形成を包含する。

【００７１】哺乳動物の赤血球からのユビキチン依存性
系におけるあるタンパク質分解的基質の生体内の分解
は、最近、ある種のアミノアシル−ｔＲＮＡの存在に依
存することが示された［フェルバー、Ｓ．およびクレチ
ャノバー、Ａ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６１、
３１２８（１９８６）］。この現象は、また、タンパク
質分解の基質のアミノ末端への特定の脱安定化アミノ酸
の翻訳後の付加のための要件を反映することを、われわ
れは示唆する。問題の初期のタンパク質分解の基質は、
ＡｓｐまたはＧｌｕのアミノ酸残基を有し、それらの両
者はＮ−末端ルールに従って脱安定化可能である（表
１）。これは、タンパク質中のある種のアミノ末端残基
がそのままで直接脱安定化されないで、他の脱安定化残
基へ接合するそれらの能力によってのみ脱安定化されう
るという、興味あるかつ試験可能な可能性を発生させ
る。

【００７２】同等の実施態様 当業者は認識するか、あるいは日常実験を用いて確証す
ることができるように、ここに記載する本発明の特定の
実施態様について、多くの同等の実施態様が可能であ
る。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲に包
含されることを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ユビキチン−ｌａｃＺ遺伝子融合体の構築を示
す図である。

【図２】操作したβ−ｇａｌタンパク質の半減期を直接
測定する実験結果を示す図である。

【図３】ユビキチン特異的処理プロテアーゼの新しく発
見された性質を使用するβ−ｇａｌ接合におけるアミノ
酸残基（Ａ）および前記接合付近におけるアミノ酸配列
（Ｂ）の変化を示す図である。

【図４】代謝的に不安定なβ−ｇａｌタンパク質におけ
る多数のユビキチン部分の存在を示す図である。

【図５】代謝的に不安定なタンパク質におけるユビキチ
ン含有β−ｇａｌ種の１系列を示す図である。

【図６】原核細胞および真核生物の両者の長く生きる細
胞内タンパク質がそれらのアミノ末端に安定化アミノ酸
残基を有し、これに対して分泌されたタンパク質が補体
のバイアスを示すことを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダニエル・フインレイ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02139 ケンブリツジ・リーストリート27 (72)発明者 アレクサンダー・バルシヤブスキー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02115 ボストン・コモンウエルスアベニユーナ ンバー30 311 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．所期のタンパク質又はポリペプチドを、宿主細胞内
   で、該タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端がユビ
   キチンに融合されている融合タンパク質として発現させ
   ることから成り、該融合タンパク質は、ユビキチンのカ
   ルボキシ末端残基と、隣接する所期のタンパク質又はポ
   リペプチドのアミノ末端残基との間が、ユビキチン特異
   性エンドプロテアーゼによって、特異的にタンパク質分
   解により切断可能であることを特徴とする、所定のアミ
   ノ末端アミノ酸残基を有する所期のタンパク質又はポリ
   ペプチドの製造方法。 ２．融合タンパク質を真核宿主細胞内で切断して、所定
   のアミノ末端アミノ酸残基を有する所期のタンパク質又
   はポリペプチドを放出させる請求項１に記載の方法。 ３．宿主細胞が融合タンパク質を切断しうるユビキチン
   特異性プロテアーゼを欠損している宿主細胞であり、そ
   して発現された融合タンパク質をin vitroでユビキチン
   特異性プロテアーゼと接触させることによって切断し、
   所定のアミノ末端残基を有するタンパク質を放出させる
   請求項１に記載の方法。