TWI774651B - 包含融合有免疫球蛋白Ｆｃ之介白素-７的用於預防或治療人類乳頭狀瘤病毒相關疾病的藥學組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於一種包含免疫球蛋白Fc區域及IL-7之融合蛋白的藥學組成物。局部投與包含免疫球蛋白Fc區域及IL-7之融合蛋白能誘發強大的活體內免疫反應，藉此預防或治療一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病。

Description

包含融合有免疫球蛋白Fc之介白素-7的用於預防或治療人類乳頭狀瘤病毒相關疾病的藥學組成物
發明領域
本發明係有關於一種包含介白素-7之融合蛋白的組成物，用於預防或治療一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病。
發明背景
介白素-7(後文中'IL-7')為一種免疫刺激細胞介素(cytokine)，其刺激B細胞及T細胞媒介的免疫反應，以及於適應性免疫系統上扮演重要的角色。IL-7主要是由骨髓及胸腺所分泌，但角質細胞、樹狀細胞、肝細胞、神經細胞及上皮細胞也會生產(Heufler C等人，1993,J.Exp.Med.178(3))：1109-14)。
特別地，介白素-7係透過刺激T細胞及B細胞之存活與分化、類淋巴細胞之存活及NK(自然殺手)細胞之活化，來活化免疫功能，以及對於T細胞及B細胞的發育特別重要的。其與HGF(肝細胞生長因子)有密切關係，以及 作用為初前B(pre-pro-B)細胞生長刺激因子或T細胞受體β(TCRβ)V(D)J重排之輔因子(Muegge K,1993,Science 261(5117)：93-5)。此外，介白素-7係透過淋巴組織誘導物(LTi)細胞來調節淋巴節的發育，以及促進初始T細胞或記憶T細胞之增生與存活。也已知IL-7會刺激IL-2及干擾素-γ(interferon-γ)的分泌，藉此提升人類的免疫反應。
同時，乳頭狀瘤病毒為一種DNA基的病毒，具有52至55nm的直徑，其感染人類或其他動物的皮膚及皮下組織。人類乳頭狀瘤病毒(HPV)通常是經由皮膚角質細胞或黏膜來傳播。迄今已經發現超過100種人類乳頭狀瘤病毒(HPV)，其等多數不會顯現出任何徵候，但是在一些情況中其等會造成人類的乳頭狀瘤。一些HPVs會造成疣的發育，以及一些會造成胰臟的病灶。特別地，高風險的病毒，譬如人類乳頭狀瘤病毒16(HPV 16)及人類乳頭狀瘤病毒18(HPV 18)會造成癌症，例如子宮頸癌及睪丸癌。
子宮頸癌是全世界婦女癌症相關死亡的最常見的原因之一。幾乎所有的案件都是由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染引起的。其中，HPV16及HPV18是大約70-75%的子宮頸癌病人的原因。感染細胞的連續增殖會導致癌前的子宮頸上皮內贅瘤(CIN)，其繼而逐漸轉變為侵襲性癌。
縱然預防性HPV疫苗能有效地預防HPV感染，但是其等對預先存在的感染及HPV誘發的病灶不具有治療功效。CIN2及CIN3最常見的治療是手術切除，其與 妊娠相關併發症及10%再發率有相關。更為嚴重的是，傳統治療後的子宮頸癌死亡率超過50%。
同時，最近已經發展透過誘發免疫增強作用來治療HPV感染的療法。業已報導，於投與包括HPV16 E7抗原的疫苗之後，局部投與類鐸受體(TLR)劑7及9、咪喹莫特(imiquimod)及CpG，會誘發E7-專一性CD8 T細胞蓄積在生殖道，以及生殖器腫瘤之退化(Soong R-S等人，2014,Clin.Cancer Res.20：5456-67)。然而，於人類，咪喹莫特使用能誘發副作用，譬如急性及嚴重的局部發炎及潰瘍，以及投與CpG因為短期的功效所以必須重複注射。細胞介素，譬如IL-2及IL-15，其作用為動物模式的疫苗佐劑，的能力被研究俾以提升治療的功效(Abraham E等人，1992,J Immunol 149：3719-26)。然而，此等細胞介素也必須重複注射且可能誘發不良作用，諸如於IL-2的情況下為微血管滲漏症候群(capillary leakage syndrome)。
因而，對於發展用於預防及治療HPV感染引起的疾病之有效及非手術療法，仍然存在需要。
發明概要
本發明的目的是要提供一種用於預防或治療一人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病之組成物。
本發明的另一個目的是要提供一種用於預 防或治療一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病之方法。
依據本發明的一個態樣，提供一種包含免疫球蛋白Fc區域及IL-7之融合蛋白的藥學組成物。並且，提供一種藉由黏膜投與該包含該融合蛋白的藥學組成物用於預防或治療一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病之方法。
在經由黏膜途徑投與一種包含依據本發明之免疫球蛋白Fc區域及IL-7之融合蛋白的情況下，抗原專一性T細胞的數目會增加以預防或治療一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病。並且，此種投與是容易進行的。因而，該包含依據本發明之免疫球蛋白Fc區域及IL-7之融合蛋白可以使用作為一種新穎的藥學組成物，其可代替傳統的HPV預防疫苗。
圖1為融合有Fc之IL-7的結構之結構圖。
圖2a及2b分別為螢光影像之條狀圖，其分別顯示Cy5.5及IL-7-Fc-Cy5.5投與至黏膜之後，各種器官於第1天及第7天之螢光強度(*，p<0.05)。
圖3闡示於陰道內投與PBS、rIL-7及IL-7-Fc至小鼠之後，IL-7-Fc經由FcRn-媒介的胞吞轉送作用而輸送至血清(*，p<0.05(rIL-7 vs IL-7-Fc))。
圖4顯示子宮頸組織的T細胞之點圖，CD4及CD8 T細胞計數，以及CD4及CD8 T細胞之CD62L低CD44高亞群的 數目(**，p<0.01)。
圖5顯示T細胞移動取決於IL-7-Fc投與途徑的結果。陰道投與7天之後，子宮頸(CV)組織的T細胞係藉由流動式細胞測量術予以測量，以及計數CD4 T細胞及CD8 T細胞的數目(圖5)(**，p<0.01)。
圖6顯示觀察取決於IL-7-Fc投與之抗癌功效的結果。
較佳實施例之詳細說明
實施本發明的最佳模式
後文中，本發明將更詳細地說明。
於實現該目的的一態樣中，本發明提供一種用於預防或治療一生殖疾病之藥學組成物，該藥學組成物包含一融合有免疫球蛋白Fc區域之介白素-7(IL-7)融合蛋白。
該生殖疾病可以為一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病。
本文中使用之術語"人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病"或"人類乳頭狀瘤病毒感染疾病"係指一種由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染引起的一疾病。人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病可分類成CIN1、CIN2、CIN3、LSIL(輕度鱗狀上皮內病灶)、HSIL(高度鱗狀上皮內病灶)或癌症等等，取決於感染程度或病灶的狀態。
本文中使用之術語"介白素-7"可以為一種具有如一動物或人類衍生的介白素-7相同的胺基酸序列之蛋 白。再者，術語"介白素-7"可以為一種具有與活體內衍生的介白素-7相似活性之多肽或蛋白。特別地，IL-7可以為一種包含IL-7蛋白或其片段之蛋白。並且，IL-7可以衍生自一種人類、大鼠、小鼠、猴子、牛或綿羊。
該IL-7包含一種多肽，其係由序列辨識編號：1至序列辨識編號：6表示的胺基酸序列所組成。此外，該IL-7與序列辨識編號：1至序列辨識編號：6的序列可以有大約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同源性。
特別地，人類IL-7可以具有由序列辨識編號：1(Genbank登錄編號P13232)表示的胺基酸序列；大鼠IL-7可以具有由序列辨識編號：2(Genbank登錄編號P56478)表示的胺基酸序列；小鼠IL-7可以具有由序列辨識編號：3(Genbank登錄編號P10168)表示的胺基酸序列；猴子IL-7可以具有由序列辨識編號：4(Genbank登錄編號NP_001279008)表示的胺基酸序列；牛IL-7可以具有由序列辨識編號：5(Genbank登錄編號P26895)表示的胺基酸序列；以及綿羊IL-7可以具有由序列辨識編號：6(Genbank登錄編號Q28540)表示的胺基酸序列。
此外，該IL-7蛋白或其片段可以包含各種各樣經修飾的蛋白或胜肽，亦即變異體。此修飾可以透過野生型IL-7之一種或多種蛋白之取代作用、缺失作用或添加作用來進行，該等作用不會改變IL-7的功能。此等種種蛋白或胜肽與野生型蛋白可以有70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
一般而言，野生型胺基酸殘基之取代作用可以藉由取代丙胺酸或守恆的胺基酸來完成，其等不會影響整個蛋白的電荷、極性或疏水性。
本說明書中使用之術語“IL-7蛋白”可以為一概念，其含括“IL-7蛋白”或其片段。除非另有指明，否則術語“蛋白”、“多肽”及“胜肽”可以交換使用。
此外，IL-7可以為一種具有下列結構之經修飾的IL-7：A-IL-7，其中該A為由1至10個胺基酸殘基所組成的一寡肽，以及該IL-7為一種具有與該介白素-7相似活性的介白素-7或多肽。
於此，該A可以直接鍵聯至該IL-7之N端或是可以透過一鍵接子而鍵聯。
該A可以增加IL-7之生產力且可以依據韓國專利申請案第10-2016-0072769號所揭示的方法來製備。
當使用於本文中，該A可以鍵聯至IL-7之N端。於上式中，該A係特徵在於包含1至10個胺基酸，該等較佳可選自於由下列所構成的群組：甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸，及其等之組合。
已知甲硫胺酸及甘胺酸不會誘發人體的免疫反應。縱然大腸桿菌產生的各種蛋白治療劑於其N端必 定含有甲硫胺酸，但是沒有不良的免疫效果被報導。同時，甘胺酸被廣泛地使用於GS鍵接子內，且已知商用產品例如杜拉鲁肽(Dulaglutide)不會誘發免疫反應。
依據一個具體例，該A可以為一種包含1至10個胺基酸的寡肽，該胺基酸係選自於由下列所構成的群組：甲硫胺酸(Met，M)、甘胺酸(Gly，G)及其等之組合。較佳地，該A可以為一種由1至5個胺基酸所組成的一種寡肽。舉例而言，該A可以由選自於由下列所構成的群組之胺基酸序列來表示：甲硫胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸，以及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸。於此，該經修飾的IL-7可以具有選自於序列辨識編號：15至20的胺基酸序列之任一者。
再者，免疫球蛋白Fc區域可包含一種動物或人類免疫球蛋白Fc區域，或其之經修飾的免疫球蛋白Fc區域。
IL-7可以鍵聯至該Fc區域之N端或C端。已知的是，即使當IL-7融合至該Fc區域之C端時，IL-7的活性也是維持的(US8338575 B2)。於此，IL-7可以透過一鍵接子而鍵聯至Fc區域。
本文中使用之術語"Fc區域"、"Fc片段"或 "Fc"係指一種蛋白質，其包含免疫球蛋白的重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，但不包含重鏈或輕鏈之變異區及輕鏈恆定區1(CL1)。其可進一步包含重鏈恆定區之鉸鏈區。雜交Fc或雜交Fc片段於此亦可稱為"hFc"或"hyFc"。並且，本文中使用之術語“經修飾的免疫球蛋白Fc區域”或“Fc區域變異體”係指一種Fc區域，其中該Fc區域內的一或多個胺基酸係經取代的，或者一種透過組合不同的Fc區域所製備的Fc區域。較佳地，其係指一種Fc區域，其與一Fc受體及/或補體之結合力業已經修飾以使得展現出與野生型Fc區域相比，弱化的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。經修飾的免疫球蛋白Fc區域可以為IgG1、IgG2、IgG3、IgD及IgG4中二者或多者之組合序列。
尤其，該經修飾的免疫球蛋白Fc區域，以N端至C端的方向，包含CH2域以及CH3域，其中該CH2域包含人類IgD及人類IgG4之CH2域的胺基酸殘基的一部分，以及該CH3域包含人類IgG4 CH3域的胺基酸殘基的一部分。
Fc區域變異體可以予以修飾以使得避免於鉸鏈區裂開。特別地，序列辨識編號：9之第144個胺基酸及/或第145個胺基酸可以予以修飾。較佳地，變異體可以為一突變體，其中序列辨識編號：9之第144個胺基酸K，係被G或S所取代，以及第145個胺基酸E，係被G或S所取代。
尤其，經修飾的免疫球蛋白之Fc區域，以N端至C端的方向，包含CH2域以及CH3域，其中該CH2域包含人類IgD及人類IgG4之CH2域之胺基酸殘基的一部分，以及該CH3域包含人類IgG4 CH3域之胺基酸殘基的一部分。
本文中使用之術語"Fc區域"、"Fc片段"或"Fc"係指一種蛋白質，其包含免疫球蛋白的重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，但不包含重鏈或輕鏈之變異區及輕鏈恆定區1(CL1)。其可進一步包含重鏈恆定區之鉸鏈區。雜交Fc或雜交Fc片段於此亦可稱為"hFc"或"hyFc"。並且，本文中使用之術語“Fc區域變異體”係指一種Fc區域，其中該Fc區域內的一或多個胺基酸係經取代的，或者其係透過組合不同的Fc區域來產生。Fc區域變異體可以予以修飾以使得避免於鉸鏈區斷裂。特別地，序列辨識編號：9之第144個胺基酸及/或第145個胺基酸可以予以修飾。較佳地，變異體可以為一突變體，其中序列辨識編號：9之第144個胺基酸K，係被G或S所取代，以及序列辨識編號：9之第145個胺基酸E，係被G或S所取代。
此外，該hFc可以由下式(I)來表示：[式(I)]N'-(Z1)p-(Y)q-Z2-Z3-Z4-C'，其中，N'為一種多肽的N端且C'為該多肽的C端，p或q為0或1的整數， Z1為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第90個位置至第98個位置處之胺基酸殘基、從第98個位置以N端方向之5至9個連續胺基酸殘基，Y為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第99個位置至第162個位置處之胺基酸殘基、從第162個位置以N端方向之5至64個連續胺基酸殘基，Z2為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第163個位置至第199個位置處之胺基酸殘基、從第163個位置以C端方向之4至37個連續胺基酸殘基，Z3為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：8的第115個位置至第220個位置處之胺基酸殘基、從第220個位置以N端方向之70至106個連續胺基酸殘基，以及Z4為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：8的第221個位置至第327個位置處之胺基酸殘基、從第221個位置以C端方向之80至107個連續胺基酸殘基。
此外，該經修飾的免疫球蛋白Fc區域或Fc區域變異體可以由下式(I)來表示：[式(I)]N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'，其中，N'為一種多肽的N端且C'為該多肽的C端，p為0或1的整數，Z1為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第90個位置至第98個位置處之胺基酸殘基、從第98個位置以N 端方向之5至9個連續胺基酸殘基，Y為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第99個位置至第162個位置處之胺基酸殘基、從第162個位置以N端方向之5至64個連續胺基酸殘基，Z2為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：7的第163個位置至第199個位置處之胺基酸殘基、從第163個位置以C端方向之4至37個連續胺基酸殘基，Z3為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：8的第115個位置至第220個位置處之胺基酸殘基、從第220個位置以N端方向之70至106個連續胺基酸殘基，以及Z4為一胺基酸序列，其具有於序列辨識編號：8的第221個位置至第327個位置處之胺基酸殘基、從第221個位置以C端方向之80至107個連續胺基酸殘基。
此外，本發明之Fc片段可為野生型糖鏈、比野生型增長的糖鏈、比野生型減短的糖鏈，或為去糖鏈的形式。增長、減短或移除免疫球蛋白Fc糖鏈可用本技藝已知的慣用方法來進行，諸如化學方法、酵素方法及使用微生物的遺傳工程方法。從Fc片段移除糖鏈會快速地降低初級補體組分C1與C1q之結合親和力並且造成ADCC(抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性)或CDC(補體依賴性細胞毒性)的減少或喪失，因此不會在活體內誘發不必要的免疫反應。在這方面，去糖基化或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fc片段可能更適合作為藥物載劑而用於本發明之目的。本文中使用之術語“去糖基化”係指從Fc片段 以酵素方式移除糖，而術語"非糖基化(aglycosylation)"意指Fc片段係由原核生物，較佳為大腸桿菌，製造成未糖基化的形式。
該經修飾的免疫球蛋白Fc區域可以包含序列辨識編號：9(hFc01)、序列辨識編號：10(hFc02)、序列辨識編號：11(hFc03)、序列辨識編號：12(hFc04)或序列辨識編號：13(hFc05)之胺基酸序列。此外，該經修飾的免疫球蛋白Fc區域可以包含序列辨識編號：14之非裂解性(non-lytic)小鼠Fc。
依據本發明，該經修飾的免疫球蛋白Fc區域可以為美國專利案第7,867,491號內所述之一者，以及該經修飾的免疫球蛋白Fc區域之生產可以參考美國專利案第7,867,491號之揭露內容來進行。
此外，該融合有免疫球蛋白Fc區域之介白素-7融合蛋白可以具有序列辨識編號：21至27任一者之胺基酸序列。
同時，依據本發明之融合有免疫球蛋白Fc區域之介白素-7融合蛋白可以進一步包含一藥學上可接受的載劑。藥學上可接受的載劑可以為適合遞送至病人且對病人無毒性的任何載劑。蒸餾水、醇類、脂肪、蠟及惰性固體亦可被含括作為載劑。藥學組成物亦可含括藥學上可接受的佐劑(一種緩衝劑或分散劑)。
於本發明的另一態樣中，提供一種用於預防或治療一生殖疾病之方法，其包含投與一融合有免疫球蛋 白Fc區域之介白素-7(IL-7)融合蛋白及一藥學上可接受的載劑至一個體。
該生殖疾病可以為一種人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病，舉例而言子宮頸癌。
於此，投與至一個體之方法可以為局部投與，較佳為黏膜投與。在本發明組成物局部提供的這種情況下，例如陰道內或氣化噴霧投與，該組成物較佳包含一部分的含水或生理相容體液懸浮液或溶液。因此，載劑或媒液可以為生理上可接受的，且因而其可添加至該組成物而遞送至病人，載劑或媒液不會不利地影響病人的電解質及/或體積平衡。因而，一種調配物的載劑一般可包括生理食鹽水。並且，其可包括一部分黏性的懸浮液或溶液，取決於病灶或生理狀況。
該使用本發明的融合蛋白或包含其之組成物的用於預防或治療一疾病之方法，可以包含投與具有預防或治療一疾病之另一種藥物或生理活性物質，組合以本發明的蛋白或組成物，而投與的途徑、時機及劑量可以根據疾病的類型、病人疾病的病況、治療或預防的目的，以及其他共投與的藥物或生理活性物質而定。
該編碼經修飾的介白素-7或包含其之融合蛋白之經單離的核酸分子，可以編碼一種多肽，其具有選自於由序列辨識編號：15至25所構成的群組之胺基酸序列。該核酸分子可以包含一種選自於由序列辨識編號：29至39所構成的群組之多核苷酸序列。該核酸分子可以進一 步包含一訊息序列或一前導序列。
發明模式
後文中，本發明將更詳細地說明。下列實施例係為了進一步說明本發明而非限制本發明的範疇。
製備實施例1：實驗動物的準備
下列實施例內使用的8-10週大雌性C57BL/6小鼠係購自於傑克遜實驗室(The Jackson Laboratory)(美國，巴哈伯)。所有的動物均於無病原條件下飼養於POSTECH之動物照護設施。動物實驗的程序係依據國立衛生研究院(NIH)的小鼠實驗指導方針來執行。計畫書係由機構動物護理和使用委員會(IACUC)核准。並且，11週大的雌性史-道二氏大鼠係購自於查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)(美國，羅利)。所有的動物均於無病原條件下飼養於MPI研究之動物照護設施。動物實驗的程序係依據美國農業部(USDA)動物福利法(9 CFR，第1-3冊)概述的規章來執行。
製備實施例2：Fc及IL-7融合蛋白之製備及治療
密碼子最佳化的人類IL-7及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)基因個別地與雜交Fc片段融合。融合有Fc之IL-7的結構圖係顯示於圖1內。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞係穩定地以一種編碼IL-7-Fc及G-CSF-Fc之質體予以轉染。然後，從細胞得到IL-7-Fc及G-CSF-Fc。用於對照組之純化的重組人類IL-7(rIL-7)係購自於百進生物科技公司(BioLegend)(美國，聖地牙哥)。
於治療前4天將3mg的醋酸甲羥助孕酮(medroxyprogesterone acetate)(得普樂(Depo-Provera)，輝瑞)皮下注射至在動情間期狀態的小鼠。小鼠係藉由腹膜內注射配於PBS之100mg/kg的克他明(ketamine)(柳韓(Yuhan))及10mg/kg的甲苯噻嗪鹽酸鹽(xylazine hydrochloride)(拜耳)予以麻醉。繼而，將10μg的rIL-7、IL-7-Fc或G-CSF-Fc與PBS混合，以及使用微量吸管來施用(投與)於陰道黏膜組織。
製備實施例3：生殖道內螢光共軛的IL-7-Fc之鑑定
IL-7-Fc係與Cy-5.5單反應性的NHS酯偶和。溶析的蛋白係予以脫鹽且藉由使用離心式過濾裝置(默克密理博(Merck Millipore))來濃縮，以及染料標記的IL-7-Fc之蛋白濃度係使用一種抗人類IL-7 ELISA組(Southern Biotech)來測量。將等價訊號強度的配於PBS之Cy-5.5-共軛的IL-7-Fc(1mg/kg)及Cy-5.5陰道內投與至麻醉的小鼠。於投與之後第1天及第7天，使小鼠安樂死且清洗其等之陰道，以及得到各個器官。繼而使用一種IVIS光譜機(卡利普生命科學(Caliper Life Science))來定量螢光訊號強度。器官內的訊號強度係藉由測量每球面度每平方公分每秒的光子(p/s/cm2/sr)來定量測量。
製備實施例4：血清IL-7之定量
於投與之前及多至投與IL-7-Fc之後7天採集血液樣本，以及血清IL-7之濃度係使用一種抗人類IL-7 ELISA組(Southern biotech)來測量。
製備實施例5：依據重複投與之毒性研究
於局部投與IL-7-Fc之後，使用一種顯微鏡進行組織病理學分析，將0.8、3及8mg/kg/劑量的IL-7-Fc陰道內投與至大鼠一個星期一次歷時4星期(5個總劑量)。切除子宮的子宮頸/陰道組織且用中和福馬林予以固定。將固定的組織放置於石蠟內，切4-6μm的厚度且用蘇木精及伊紅(H&E，西格瑪-奧瑞奇(Sigma-Aldrich))來染色。為了判定劑量依賴式陰道發炎，於各劑量投與後4小時及24小時以及每週逐個觀察大鼠。使用下列評分量表：0=無紅斑，1=非常輕微的紅斑(幾乎難以察覺)，2=定義明確的紅斑，3=中等的紅斑，4=嚴重的紅斑(發紅狀態)至焦痂形成。
製備實施例6：脾細胞及子宮頸/陰道(CV)細胞的製備
脾臟及CV組織係使用無菌技術予以手術切除。脾細胞係以機械破壞組織來獲得。為了製備CV細胞，將CV組織切碎以及用1mg/ml膠原蛋白酶D(羅氏)及0.5mg/ml DNase(西格瑪-奧瑞奇)來處理。使細胞通經一種40-μm濾器(BD)、清洗且用含10% FBS及抗生素之RPMI-1640予以再懸浮。
製備實施例7：流動式細胞測量術
為了避免免疫球蛋白與Fc受體之非專一性結合，下列實施例使用的細胞係用CD16/32(2.4G2)來處理且用下列單株抗體予以染色：CD4(RM4-5)、CD8(53-6.7)、CD44(IM7)、CD62L(MEL-14)、CD11b(M1/70)、CD11c(N418)及MHCII(M5/114.15.2)，來自 eBioscience；CD3e(145-2C1)及TCR γ δ(GL3)，來自BD；CXCR3(CXCR3-173)，來自百進生物科技公司；以及Live/Dead(生命科技公司(Life technologies))。所有的樣本均使用一種LSR Fortessa(BD)及FlowJo軟體(Tree Star)予以分析。
製備實施例8：統計分析
使用一種雙尾成對司徒頓t檢定來評估二個實驗組之間的統計差異。關於活體內腫瘤實驗，組別之間的存活率差異係藉由對數秩檢定、使用Prism 5.0軟體(GraphPad)來判定。
實施例1：IL-7-Fc融合蛋白投與方法之評估
將Cy-5.5(Cy-5.5)及Cy-5.5-共軛IL-7-Fc(Cy5.5-IL-7-Fc)陰道內投與至C57BL/6野生型小鼠(n=3/組)。結果顯示於圖2a及2b中。
如圖2a及2b中所示，子宮頸/陰道(CV)組織內Cy-5.5-IL-7-Fc的強度於投與1天後顯著地增加且觀察7天。特別地，投與後第1天及第7天之Cy5.5-IL-7-Fc-治療的小鼠CV組織的訊號強度分別比對照組(Cy5.5治療的小鼠)高6及4.5倍。於Cy5.5-IL-7-Fc-治療的小鼠之各種子宮頸/陰道鄰近的組織(子宮頸-陰道、子宮、卵巢及直腸)內也偵測到高強度的螢光訊號。特別地，以Cy5.5-IL-7-Fc治療的小鼠不只在生殖道組織而且還在肝臟、腎臟及脾臟維持高螢光水準，即使在第7天。
實施例2：陰道內投與的IL-7-Fc之體循環確認
將PBS、rIL-7及IL-7-Fc陰道內投與至小鼠(n=7/組)，以及用人類IL-7ELISA來測量血清濃度IL-7。結果顯示於圖3中。如圖3中所示，以IL-7-Fc，而非rIL-7，治療的小鼠顯示出與PBS對照相比，顯著地增加的IL-7水準。
此等結果顯露出，施用融合有Fc的蛋白於黏膜上皮賦予生殖-上皮障壁胞吞轉送作用的能力。
實施例3：局部投與IL-7-Fc後之子宮頸組織內的白血球數目變化分析
於犧牲前0、3、7、14及21天，將IL-7-Fc陰道內投與至小鼠(n=3/組)，以及使用流動式細胞測量術來計算子宮頸組織內白血球的數目(表1)。此外，以PBS、IL-7、IL-7-Fc、IFN-α2a-Fc或G-CSF-Fc治療的小鼠(n=6/組)，以及7天後，藉由流動式細胞測量術來分析CV組織內的CD4和CD8 T細胞。結果顯示於表1及2以及圖4中。下表中的數據係以平均值±SEMs來顯示(*，p<0.05)。
Figure 105139967-A0305-02-0022-4
Figure 105139967-A0305-02-0022-5
如表1及表4中所示，局部投與之IL-7-Fc使CD4和CD8 T細胞的數目增加。此生殖道T細胞之增加於IL-7-Fc投與之後7天達到高峰，以及在第14天逐漸地下降至基線水準。並且，CD4或CD8 T細胞的數目於IL-7-Fc投與之後7天，與基線水準相比，分別顯著地增加大約20倍和 10倍。特別地，CD44高CD62L低效應子CD4和CD8 T細胞的數目在第7天顯著地增加，以及總CD4和CD8 T細胞的數目隨著時間以相似的方式下降。
如表2及圖4中所示，IFN-α2a-Fc及G-CSF-Fc投與與基線水準或對照組相比，沒有顯著地改變CD4和CD8 T細胞的數目。
此等結果表示IL-7-Fc陰道內投與會誘發免疫細胞如T細胞和DCs之局部蓄積。並且，發現IL-7-Fc陰道內投與的功效比其他的免疫誘導物優秀。
實施例4：IL-7-Fc毒性之評估
將IL-7-Fc陰道內投與至SD大鼠五次，即，在第1、8、15、22和29天。於起始治療後33天顯微鏡檢查生殖道切片(表3A)。使用評分量表來記錄投與前以及投與後4小時及24小時之陰道發炎分數(表3B)。結果顯示於表3A和3B中。
Figure 105139967-A0305-02-0023-6
Figure 105139967-A0305-02-0024-7
Figure 105139967-A0305-02-0024-8
如以上的表3A和3B中所示，子宮頸組織(表3A)和陰道(表3B)發炎程度之病理評估顯示局部投與IL-7-Fc是安全的以及不會誘發生殖道內嚴重的發炎。
實施例5：IL-7-Fc之投與途徑和子宮頸/陰道組織內T細胞誘發之間關係的確認
將IL-7-Fc皮下或陰道內投與至小鼠(n=5/組)以及T細胞於子宮頸/陰道組織內的分布係用製備實施例6的方法進行觀察。
結果，如圖5中所示，陰道內投與之子宮頸/陰道組織內CD4和CD8 T細胞的蓄積程度，比皮下投與增加更多。因而，發現到為了專一地誘發的CD4和CD8 T細胞至子宮頸/陰道組織，與子宮頸/陰道組織直接有關的陰 道內投與，比全身投與例如皮下投與，更有效。
實施例6：使用TC-1/fluc模式進行IL-7-Fc局部投與的抗癌功效
治療的功效係使用一種表現HPV16 E6和HPV E7抗原之TC-1腫瘤細胞株來確認。將1x106 TC-1/fluc細胞株(將表現HPV16 E6和E7基因的TC-1細胞株操縱以表現螢光素酶基因)陰道內投與至小鼠(n=7或8/組)。於TC-1/fluc細胞株投與之前四(4)天，將3mg的醋酸甲羥助孕酮(得普樂，輝瑞)皮下投與至動情間期狀態的小鼠。TC-1/fluc細胞株投與當天，將小鼠麻醉以及將10μl的20%壬苯醇醚-9(nonoxynol-9)(USP)及40μl的3%羧甲纖維素(CMC)(西格瑪-奧瑞奇)的混合物陰道內投與至小鼠，且6小時後，將小鼠再次麻醉並用PBS清洗其等之陰道，然後將投TC-1/fluc細胞株與至小鼠。
於TC-1/fluc細胞株投與後1、8及15天，將1μg的IL-7-Fc陰道內投與至小鼠，以及在第8和15天透過活體內生物發光成像來調查癌症進展。在第20天，觀察外觀來檢查抗癌功效(圖6)。結果，確認IL-7-Fc-治療組癌細胞發病率顯著地降低。
<110> 吉耐森股份有限公司(GENEXINE,INC.)
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<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IL-7的胺基酸序列(登錄編號：P13232)
<400> 1
Figure 105139967-A0305-02-0026-9
Figure 105139967-A0305-02-0027-10
<210> 2
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IL-7的胺基酸序列(登錄編號：P56478)
<400> 2
Figure 105139967-A0305-02-0027-11
<210> 3
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IL-7的胺基酸序列(登錄編號：P10168)
<400> 3
Figure 105139967-A0305-02-0027-12
Figure 105139967-A0305-02-0028-13
<210> 4
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 猴子IL-7的胺基酸序列(登錄編號：NP_001279008)
<400> 4
Figure 105139967-A0305-02-0028-14
Figure 105139967-A0305-02-0029-15
<210> 5
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 牛IL-7的胺基酸序列(登錄編號：P26895)
<400> 5
Figure 105139967-A0305-02-0029-16
<210> 6
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 綿羊IL-7的胺基酸序列(登錄編號：Q28540)
<400> 6
Figure 105139967-A0305-02-0029-17
Figure 105139967-A0305-02-0030-18
<210> 7
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgD恆定區的胺基酸序列(Genbank登錄編號：P01880)
<400> 7
Figure 105139967-A0305-02-0030-19
Figure 105139967-A0305-02-0031-20
<210> 8
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分人類IgG4恆定區的胺基酸序列(Genbank登錄編號：AAH25985)
<400> 8
Figure 105139967-A0305-02-0032-21
<210> 9
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFc01的胺基酸序列
<400> 9
Figure 105139967-A0305-02-0033-22
<210> 10
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFc02的胺基酸序列
<400> 10
Figure 105139967-A0305-02-0034-24
<210> 11
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFc03的胺基酸序列
<400> 11
Figure 105139967-A0305-02-0035-25
<210> 12
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFc04的胺基酸序列
<400> 12
Figure 105139967-A0305-02-0035-26
Figure 105139967-A0305-02-0036-27
<210> 13
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hFc05的胺基酸序列
<400> 13
Figure 105139967-A0305-02-0036-28
Figure 105139967-A0305-02-0037-29
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IgG Fc變異體的胺基酸序列
<400> 14
Figure 105139967-A0305-02-0037-30
Figure 105139967-A0305-02-0038-31
<210> 15
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(M)的胺基酸序列
<400> 15
Figure 105139967-A0305-02-0038-32
Figure 105139967-A0305-02-0039-33
<210> 16
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MM)的胺基酸序列
<400> 16
Figure 105139967-A0305-02-0039-34
<210> 17
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MMM)的胺基酸序列
<400> 17
Figure 105139967-A0305-02-0040-35
<210> 18
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MGM)的胺基酸序列
<400> 18
Figure 105139967-A0305-02-0040-36
Figure 105139967-A0305-02-0041-37
<210> 19
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(DDD)的胺基酸序列
<400> 19
Figure 105139967-A0305-02-0041-38
<210> 20
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MMMM)的胺基酸序列
<400> 20
Figure 105139967-A0305-02-0041-39
Figure 105139967-A0305-02-0042-40
<210> 21
<211> 398
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(M)的胺基酸序列
<400> 21
Figure 105139967-A0305-02-0042-41
Figure 105139967-A0305-02-0043-42
<210> 22
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MM)的胺基酸序列
<400> 22
Figure 105139967-A0305-02-0043-43
Figure 105139967-A0305-02-0044-44
Figure 105139967-A0305-02-0045-45
<210> 23
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MMM)的胺基酸序列
<400> 23
Figure 105139967-A0305-02-0045-46
Figure 105139967-A0305-02-0046-47
<210> 24
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MGM)的胺基酸序列
<400> 24
Figure 105139967-A0305-02-0046-48
Figure 105139967-A0305-02-0047-49
<210> 25
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MMMM)的胺基酸序列
<400> 25
Figure 105139967-A0305-02-0047-50
Figure 105139967-A0305-02-0048-51
Figure 105139967-A0305-02-0049-52
<210> 26
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之人類IL-7的胺基酸序列
<400> 26
Figure 105139967-A0305-02-0049-53
Figure 105139967-A0305-02-0050-54
<210> 27
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有非裂解性小鼠Fc之人類IL-7的胺基酸序列
<400> 27
Figure 105139967-A0305-02-0050-55
Figure 105139967-A0305-02-0051-56
<210> 28
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IL-7的核苷酸序列
<400> 28
Figure 105139967-A0305-02-0052-57
<210> 29
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(M)的核苷酸序列
<400> 29
Figure 105139967-A0305-02-0052-60
<210> 30
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MM)的核苷酸序列
<400> 30
Figure 105139967-A0305-02-0052-61
Figure 105139967-A0305-02-0053-62
<210> 31
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MMM)的核苷酸序列
<400> 31
Figure 105139967-A0305-02-0053-79
<210> 32
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MGM)的核苷酸序列
<400> 32
Figure 105139967-A0305-02-0053-64
Figure 105139967-A0305-02-0054-65
<210> 33
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(DDD)的核苷酸序列
<400> 33
Figure 105139967-A0305-02-0054-66
<210> 34
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾的IL-7(MMMM)的核苷酸序列
<400> 34
Figure 105139967-A0305-02-0054-67
Figure 105139967-A0305-02-0055-68
<210> 35
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(M)的核苷酸序列
<400> 35
Figure 105139967-A0305-02-0055-69
Figure 105139967-A0305-02-0056-70
<210> 36
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MM)的核苷酸序列
<400> 36
Figure 105139967-A0305-02-0056-71
<210> 37
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MMM)的核苷酸序列
<400> 37
Figure 105139967-A0305-02-0057-72
<210> 38
<211> 1275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MGM)的核苷酸序列
<400> 38
Figure 105139967-A0305-02-0057-73
Figure 105139967-A0305-02-0058-74
<210> 39
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合有hyFc之經修飾的IL-7(MMMM)的核苷酸序列
<400> 39
Figure 105139967-A0305-02-0058-75
Figure 105139967-A0305-02-0059-76
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-7共軛的寡肽
<400> 40
Figure 105139967-A0305-02-0059-77

Claims (10)

  1. 一種一介白素-7(IL-7)融合蛋白在製備一用於預防或治療一生殖疾病之醫藥品的用途，其中該生殖疾病為一人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病或子宮頸癌，其中該IL-7融合蛋白用於局部投與，其中該IL-7融合蛋白包含一經修飾的IL-7及一經修飾的免疫球蛋白Fc區域，其中該經修飾的IL-7具有下列結構：A-IL-7，其中該A為一寡肽，其由1至10個選自於下列所構成之群組的胺基酸殘基所組成：甲硫胺酸、甘胺酸及其組合，但有條件的是該寡肽不是一單一甲硫胺酸，以及該A-IL-7中的IL-7為(i)IL-7，其包含一選自於由SEQ ID NOS：1至6所構成的群組之胺基酸序列，或(ii)一胜肽，其由與SEQ ID NO：1具有95%或更大的序列同一性之胺基酸序列所構成，其中該經修飾的免疫球蛋白Fc區域具有下列式(I)：N'-(Z1)p-(Y)q-Z2-Z3-Z4-C' 式(I)其中，N'為一種多肽的N端且C'為該多肽的C端，p或q為0或1的整數，Z1為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7第 98個位置開始以N端方向之5至9個連續胺基酸殘基，Y為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7的第162個位置開始以N端方向之5至64個連續胺基酸殘基，Z2為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7的的第163個位置開始以C端方向之4至37個連續胺基酸殘基，Z3為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：8的第220個位置開始以N端方向之70至106個連續胺基酸殘基，以及Z4為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：8的第221個位置開始以C端方向之80至107個連續胺基酸殘基。
  2. 如請求項1之用途，其中該IL-7係融合至該免疫球蛋白Fc區域之N端或C端。
  3. 如請求項1之用途，其中該IL-7係選自於由序列辨識編號：1至6所構成的群組。
  4. 如請求項3之用途，其中該A係選自於由下列所構成的群組：甘胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸，以及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸。
  5. 如請求項1之用途，其中該經修飾的免疫球蛋白Fc區域係選自於由序列辨識編號：9至14所構成的群組。
  6. 如請求項1之用途，其中該局部投與為一黏膜投與。
  7. 一種一介白素-7(IL-7)融合蛋白在製備一用於預防或治療一生殖疾病之醫藥品的用途，其中該生殖疾病為一人類乳頭狀瘤病毒衍生的疾病或子宮頸癌，其中該IL-7融合蛋白用於黏膜投與，其中該IL-7融合蛋白包含一IL-7及一經修飾的免疫球蛋白Fc區域，其中該IL-7是下列(i)至(iii)中任一者：(i)IL-7，其包含一選自於由SEQ ID NOS：1至6所構成的群組之胺基酸序列，或(ii)一胜肽，其由與SEQ ID NO：1具有95%或更大的序列同一性之胺基酸序列所構成，(iii)一具有下列結構之經修飾的IL-7：A-IL-7，其中，該A為一寡肽，其由1至10個選自於下列所構成之群組的胺基酸殘基所組成：甲硫胺酸、甘胺酸及其組合，但有條件的是該寡肽不是一單一甲硫胺酸，以及該A-IL-7中的IL-7為上述(i)的IL-7或(ii)的胜肽， 以及其中該經修飾的的免疫球蛋白Fc區域具有下列式(I)：N'-(Z1)p-(Y)q-Z2-Z3-Z4-C' 式(I)其中，N'為一種多肽的N端且C'為該多肽的C端，p或q為0或1的整數，Z1為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7第98個位置開始以N端方向之5至9個連續胺基酸殘基，Y為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7的第162個位置開始以N端方向之5至64個連續胺基酸殘基，Z2為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：7的的第163個位置開始以C端方向之4至37個連續胺基酸殘基，Z3為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：8的第220個位置開始以N端方向之70至106個連續胺基酸殘基，以及Z4為一胺基酸序列，其包含從SEQ ID NO：8的第221個位置開始以C端方向之80至107個連續胺基酸殘基。
  8. 如請求項7之用途，其中該IL-7係融合至該免疫球蛋白Fc區域之N端或C端。
  9. 如請求項7之用途，其中該A係選自於由下列所構成的群組：甘胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甲硫胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甲硫胺酸、甲硫胺 酸-甘胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甲硫胺酸-甘胺酸、甘胺酸-甘胺酸-甲硫胺酸，以及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸。
  10. 如請求項7之用途，其中該經修飾的免疫球蛋白Fc區域係選自於由序列辨識編號：9至14所構成的群組。
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