WO2023167033A1 - プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、および医薬組成物 - Google Patents

プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、および医薬組成物 Download PDF

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成 西山
研人 北田
アサドゥール ラフマン
啓徳 中神
宏樹 林
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Definitions

  • the present invention relates to prorenin receptor peptides, conjugates, and pharmaceutical compositions.
  • Abnormalities in the Wnt/ ⁇ -catenin pathway can cause various diseases. Abnormalities in the Wnt/ ⁇ -catenin pathway cause, for example, tumors (benign tumors) such as familial adenomatous polyposis and osteoporosis (Non-Patent Documents 1 to 4). Recently, attempts have been made to treat diseases resulting from abnormalities in the Wnt/ ⁇ -catenin pathway by blocking Wnt/ ⁇ -catenin.
  • the Wnt/ ⁇ -catenin pathway has various physiological activities in vivo. Therefore, when the Wnt/ ⁇ -catenin pathway is blocked, various physiological activities of the living body are also inhibited, which makes it difficult to target therapeutically.
  • the present inventors have found that the prorenin receptor contributes to the activation of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway and that the Wnt/ ⁇ -catenin pathway can be inhibited by using an antibody against the prorenin receptor (PRR). . Accordingly, the present inventors have come up with the idea of using PRR peptides to treat diseases caused by the Wnt/ ⁇ -catenin pathway.
  • PRR0 200th to 213th peptides of PRR
  • the present disclosure aims to provide PRR peptides with enhanced ability to induce antibodies against prorenin receptors.
  • the prorenin receptor peptide of the present disclosure includes the following (P1), (P2), or (P3) polypeptides: (P1) a polypeptide consisting of an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (P2) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (P3) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-3.
  • a conjugate of the present disclosure comprises an antigenic peptide and a carrier protein, the antigenic peptide is bound to the carrier protein; Said antigenic peptides comprise the prorenin receptor peptides of the present disclosure.
  • the nucleic acid of the present disclosure encodes the prorenin receptor peptide of the present disclosure.
  • the expression vector of the present disclosure contains the nucleic acid of the present disclosure.
  • a pharmaceutical composition of the present disclosure comprises a prorenin receptor peptide, conjugate, nucleic acid and/or expression vector of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the PRR peptide of the present disclosure has an enhanced ability to induce antibodies against prorenin receptors.
  • FIG. 1 is a graph showing the antibody titers of the prorenin receptor vaccine PRR0 in Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing mice 10 weeks after the first inoculation of the prorenin receptor vaccine PRR0 in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing antibody titers of prorenin receptor vaccines PRR1-4 in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the antitumor effects of prorenin receptor vaccines PRR1-4 in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the antitumor effects of prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3 in Example 1.
  • FIG. 6 is a photograph of ⁇ -catenin staining in colon tissue in Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing antibody titers against prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3 under short-term observation in Example 1.
  • FIG. 8 is a graph showing antibody titers against prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3 under long-term observation in Example 1.
  • FIG. 9 is a graph showing the antibody titers of CRM197-PRR2 in mice in Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing the antibody titer of CRM197-PRR2 in cynomolgus monkeys in Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the activity of ⁇ -catenin in HEK293 cells in Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of suppressing polyp formation in adenomatous polyposis model mice in Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the effect of suppressing polyp formation in adenomatous polyposis model mice in Example 3.
  • FIG. 14 is a photograph of staining of ATP6ap2 or activated ⁇ -catenin in the intestine in Example 3.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of side reactions in adenomatous polyposis coli model mice and normal mice in Example 3.
  • FIG. 16 is a graph showing survival rates of adenomatous polyposis coli model mice in Example 3.
  • FIG. 17 is a graph showing the antibody titer of vaccine PRR2 in Example 4.
  • FIG. 18 is a graph showing weight shift by PRR2 in Example 4.
  • protein and “polypeptide” refer to polymers of peptides composed of unmodified (naturally occurring), modified, and/or artificial amino acids. Examples of the shape of the polymer include linear, branched, and cyclic.
  • prorenin receptor refers to a single transmembrane protein identified as a component of the renin-angiotensin system and a protein that functions as a prorenin receptor. Said prorenin receptor is also called ATP6AP2. Said prorenin receptors are presumed to indirectly potentiate the activity of the Wnt/ ⁇ -catenin system.
  • conjugate means a compound in which two or more peptides with different amino acid sequences are bound by covalent bonds.
  • Said peptides with different amino acid sequences are, for example, antigenic peptides, carrier peptides or carrier proteins.
  • the antigen peptide is, for example, a peptide intended to induce an antibody by inducing an immune response and inducing activation of lymphocytes and the like.
  • Said carrier peptides and carrier proteins are, for example, peptides or proteins that confer immunogenicity to said antigenic peptide or enhance immunogenicity of said antigenic peptide.
  • Said carrier peptides and carrier proteins can also be referred to as peptide carriers and protein carriers, for example.
  • Wnt/ ⁇ -catenin pathway means a signaling pathway in which Wnt activates ⁇ -catenin via Wnt receptors (Frizzled).
  • the Wnt/ ⁇ -catenin pathway contributes to disease induction in cancers such as colon cancer through abnormal accumulation of ⁇ -catenin and inactivation of gene expression of Wnt inhibitory factors.
  • inhibition of activity means that the activity of a subject changes to a state in which it is suppressed, or the state in which it is suppressed.
  • suppression of activity is used in combination with a specific protein or a signal pathway mediated by the specific protein
  • the “suppression of activity” is the specific protein or a signal mediated by the specific protein It means that the function of the pathway is changed to a suppressed state, or that it is in a suppressed state.
  • sarcopenia or frailty means a disease caused by dysfunction of muscle tissue.
  • positive is defined as a negative control reaction using negative control cells that do not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen by an analysis method such as flow cytometry that is detected using an antigen-antibody reaction. By comparison, it means that a higher signal or the like is detected.
  • negative means that a signal or the like that is equal to or lower than that in a negative control reaction using a negative control cell that does not express the antigen or an antibody that does not react with the antigen is detected. means.
  • treatment means therapeutic treatment and/or prophylactic treatment.
  • treatment means treating, curing, preventing, arresting, ameliorating, ameliorating a disease, condition, or disorder, or halting, arresting, reducing, or delaying the progression of a disease, condition, or disorder. do.
  • prevention means reducing the likelihood of developing a disease or condition or delaying the onset of a disease or condition.
  • the “treatment” may be, for example, treatment of a subject (patient) who develops the target disease, or treatment of a model animal of the target disease.
  • subject means an animal or an animal-derived cell, tissue, or organ, and is particularly used to include humans.
  • Said animal means both human and non-human animals.
  • non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions.
  • nucleic acid means a polymer of deoxyribonucleotides (DNA), ribonucleotides (RNA), and/or modified nucleotides.
  • nucleic acid when used in combination with a particular protein, means a polymer of nucleotides that encodes the amino acid sequence of the protein. Examples of the nucleic acid include genomic DNA, cDNA, and mRNA. The nucleic acid may be, for example, single-stranded or double-stranded. The nucleic acid is interchangeable with “polynucleotide” or "nucleic acid molecule”.
  • host means a cell and/or individual into which foreign nucleic acid is introduced.
  • the host can also be called a host cell.
  • vector and “expression vector” refer to a recombinant plasmid or virus containing a nucleic acid that is delivered to a host or host cell in vitro or in vivo .
  • the "vector” and “expression vector” include viral vectors and non-viral vectors.
  • transformant means a host into which a foreign nucleic acid has been introduced.
  • isolated or “isolated” means the state of being identified and separated, and/or the state of being recovered from components in their natural state. Said “isolation” or “isolated” can be carried out, for example, by going through at least one purification step.
  • Prorenin receptor polypeptides of the present disclosure include the following (P1), (P2), or (P3) polypeptides: (P1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-3; (P2) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (P3) A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-3.
  • the present inventors have found that antibodies against prorenin receptors (PRR) exhibit antitumor effects and the like by regulating the activity of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway.
  • PRR prorenin receptors
  • administration of a peptide having a specific amino acid sequence in PRR can induce an antibody against PRR in vivo, thereby exhibiting an antitumor effect similar to that of the antibody against PRR.
  • the inventors have also found that the inhibitory effect of muscle mass reduction can be obtained, and have completed the present disclosure.
  • the PRR peptide of the present disclosure induces the production of an antibody that indirectly controls the activity of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway in a living body to which the PRR peptide is administered, resulting in an antitumor effect and an inhibitory effect on muscle mass loss.
  • the presumption does not limit the present disclosure in any way.
  • the PRR peptides of the present disclosure can be suitably used to treat, for example, tumors (eg, benign tumors such as familial adenomatous polyposis) and sarcopenia or frailty.
  • the origin of the prorenin receptor is not particularly limited, and can be set as appropriate, for example, depending on the type of subject.
  • Examples of the origin include humans and non-human animals other than humans, and examples of the non-human animals include mammals such as mice, rats, dogs, monkeys, rabbits, sheep and horses.
  • prorenin receptors derived from various animals for example, information registered in existing databases can be referred to.
  • the human-derived prorenin receptor is cDNA, for example, the 103rd to 1155th regions (including the stop codon) in the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) registered under NCBI Accession No.
  • NM_005765 and the protein , for example, the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) registered under NCBI Accession No. NP_005756.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4 is a sequence that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.
  • Prorenin receptor (SEQ ID NO: 5) MAVFVVLLALVAGVLGNEFSILKSPGSVVFRNGNWPIPGERIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATVMVMVKGVNKLALPPGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRKRLFQENSVLSSLPLNSHSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDEIGKRYGED SEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLIRKTRTILEAKQAKNPASPYNLAYKYNFEYSVVFNMVLWIMIALALAVIITYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRMDPGYDSIIYRMTNQKIRMDPGYDSIIYRMTNQKIRMDPGYDSIIYRMTNQKIRMDPGYDSIIYRMTN
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-3 is a polypeptide derived from a human prorenin receptor.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid sequence of positions 198-211 in the amino acid sequence of human prorenin receptor (SEQ ID NO: 5).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of positions 223-236 in the amino acid sequence of human prorenin receptor (SEQ ID NO: 5).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 corresponds to the amino acid sequence of positions 221-230 in the amino acid sequence of human prorenin receptor (SEQ ID NO: 5).
  • PRR1 peptide SEQ ID NO: 1
  • SRHKHLAKDHSPDL PRR2 peptide SEQ ID NO:2
  • GKRYGEDSEQFRDA PRR3 peptide SEQ ID NO:3
  • polypeptide of (P2) "one or several” is, for example, a range in which the polypeptide of (P2) can induce antibody production against PRR when conjugated with a carrier protein, for example. preferably. "One or several” is, for example, 1 to 3, 1 or 2, or 1 in the above (P1) amino acid sequence. In the present disclosure, the numerical range of the number, for example, discloses all positive integers belonging to the range (the same shall apply hereinafter).
  • substitutions are preferably conservative substitutions.
  • Said conservative substitution refers to replacement of an amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain.
  • the conservative substitutions include, for example, substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine and histidine; substitutions between amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; glycine, asparagine, Substitutions between amino acid residues with non-charged polar side chains such as glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine; amino acids with non-polar side chains such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan substitutions between residues; substitutions between amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine; substitutions between amino acid residues with aromatic side chains such as
  • the "identity” is preferably within a range that can induce antibody production against PRR when the polypeptide of (P3) forms a conjugate with a carrier protein, for example.
  • “Identity” is, for example, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more with respect to the amino acid sequence of (P1) , 99% or more.
  • Calculation of the "identity” for example, using the default parameters in the homology algorithm BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) can be calculated by (hereinafter the same).
  • the PRR peptide may contain, for example, a linker amino acid or linker peptide.
  • Said linker amino acid or linker peptide is an additional amino acid or peptide for attachment to a carrier protein or carrier peptide at the N-terminus and/or C-terminus.
  • the PRR peptide may also be modified at the N-terminus, C-terminus, amino acid backbone, and/or amino acid side chains.
  • Said linker amino acid is, for example, cysteine.
  • the PRR peptides of the present disclosure can induce antibodies against the PRR, for example, by using them in combination with carrier peptides or carrier proteins.
  • the present disclosure provides conjugates with enhanced ability to induce antibodies against the prorenin receptor.
  • the present disclosure includes an antigenic peptide and a carrier protein, said antigenic peptide bound to said carrier protein, said antigenic peptide comprising said prorenin receptor peptide.
  • the carrier protein may be any protein that can confer or enhance immunogenicity of the PRR peptide.
  • the carrier protein include diphtheria toxin (DT) or diphtheria toxin mutants, tetanus toxin (TT) or tetanus toxin fragment C, keyhole limpet hemocyanin (KLH), or functional equivalents thereof.
  • the functional equivalent is a mutant in which a mutation is introduced in the amino acid sequence to the extent that it has the function as the carrier protein.
  • Said diphtheria toxin variants include, for example, detoxified diphtheria toxin CRM 197 , CRM 197 A chain (CN103495161), CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. (1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844). ), CRM9, CRM102, CRM103, CRM107 and the like.
  • the carrier protein is preferably CRM 197 , since it can be suitably used, for example, as a vaccine composition.
  • CRM 197 proteins include proteins in which glycine at position 52 in the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 6), registered under Uniprot accession number Q5PY51, is replaced with glutamic acid, or functional equivalents thereof.
  • CRM 197 (SEQ ID NO: 6) MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVI RDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENT
  • the antigen peptide and the carrier protein are bound by a covalent bond.
  • the binding position of the carrier protein in the antigen peptide is, for example, the N-terminus, C-terminus and/or amino acid side chain of the antigen peptide, preferably the N-terminus (amino group) and/or C-terminus. (carboxyl group).
  • the binding position to the antigen peptide in the carrier protein is, for example, the N-terminus, C-terminus, and/or amino acid side chain of the carrier protein, preferably the amino acid side chain.
  • the amino acid side chain is, for example, a side chain (thiol group) of a cysteine residue, a side chain (amino group) of a lysine residue, an arginine residue, a glutamine residue, or a serine residue, a side chain of glutamic acid or aspartic acid. (carboxyl group) and the like.
  • the antigen peptide and the carrier protein are bound directly or indirectly.
  • Said direct binding means that said antigenic peptide is directly bound to an amino acid of said carrier protein.
  • the indirect binding means that the antigen peptide is bound to the carrier protein via a linker peptide (peptide linker).
  • the antigen peptide is preferably bound, for example, to a cysteine residue of the carrier protein.
  • the binding between the antigen peptide and the carrier protein can be established, for example, based on the reactive group of the antigen peptide used for binding and the reactive group of the carrier protein.
  • the antigen peptide and the carrier protein may be bound, for example, by directly reacting the reactive group of the antigen peptide with the reactive group of the carrier protein, or by using a crosslinking agent. may be conjugated by reacting with said antigenic peptide and said carrier protein.
  • the antigen peptide and the carrier protein are, for example, cross-linked with different reactive groups.
  • the binding can be achieved by cross-linking using a cross-linking agent, more specifically, a cross-linking agent having a reactive group reactive with an amino group and a reactive group reactive with a thiol group.
  • the cross-linking agent includes, for example, N- ⁇ -malemidocaproyl-oxysuccinimide ester (EMCS), N- ⁇ -maleimidocaproyl-oxysulfosuccinimide ester (Sulfo-EMCS), succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N- ⁇ -maleimidoacet-oxysuccinimide ester (AMAS), N- ⁇ -maleimidopropyl-oxysuccinimide ester (BMPS), N- ⁇ -maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS) and the like.
  • EMCS N- ⁇ -malemidocaproyl-oxysuccinimide ester
  • Sulfo-EMCS N- ⁇ -male
  • the ratio of the carrier protein and the antigen peptide is, for example, 1:1 to 1:100 or 1:1 to 1:10.
  • the conjugate has the ability to induce the formation of antibodies capable of inhibiting Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity in a Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity assay when administered to a subject.
  • the Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity assay is carried out, for example, according to Example 3(1) described below, using plasma or serum from a subject to whom the subject conjugate was administered, and reporter cells.
  • Said reporter cell is a cell in which a reporter (eg, luciferase) is detected upon activation of said ⁇ -catenin pathway.
  • the inducibility is determined, for example, by administering (inoculating) the measurement object to a subject using a measurement object conjugate (measurement object), and obtaining serum or plasma derived from the subject for the Wnt/ ⁇ -catenin pathway. It can be measured by evaluating in an activity assay.
  • the measurement object is optionally mixed with an immunostimulant and administered to the subject, for example, in the same manner as in Examples 1 and 2 described later. Said administration is preferably twice. Blood is then collected from the subject, eg, 2-4 weeks after the last administration, and serum or plasma is isolated.
  • the inducibility can be evaluated, for example, by performing an activity assay of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway using the serum or plasma, and measuring Wnt/ It can be evaluated by comparing with the activity of the ⁇ -catenin pathway.
  • the conjugate reduces the Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity by 5% based on the Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity of the control (100%) in the Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity assay. 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% It has the ability to induce the formation of antibodies capable of suppressing more than 99% or more.
  • the conjugate is used, for example, for the treatment of tumors.
  • Said tumor may be benign or malignant (cancer).
  • examples of the tumor include prorenin receptor-positive tumors.
  • examples of the tumor include colon cancer, pancreatic cancer, and brain tumor.
  • Examples of the tumor include benign tumors and familial adenomatous polyposis.
  • the conjugate can be suitably used, for example, for treatment of familial adenomatous polyposis with complications.
  • Complications of the familial adenomatous polyposis may include, for example, gastrointestinal benign multiple tumor predilection, Gardner's syndrome, Turcot syndrome, and/or desmoid predominance syndrome.
  • the conjugates of this disclosure may be used, for example, in vitro or in vivo .
  • the conjugates of the present disclosure can be used, for example, as research reagents and can be used as pharmaceuticals. In the former case, the conjugates of this disclosure can also be referred to as test reagents or test kits.
  • the administration target of the conjugate of the present disclosure is not particularly limited.
  • the subject can, for example, refer to the above exemplification.
  • the subject of administration includes, for example, cells, tissues, organs, etc., and the cells include, for example, cells collected from living organisms, cultured cells, etc.
  • the tissue or organ includes, for example, a tissue (living tissue) or organ collected from a living body.
  • the cells include immune cells such as T cells, B cells, NK cells, and dendritic cells.
  • the administration subject may be a healthy subject who has not developed a tumor, a subject who may have developed a tumor, or a subject who has developed a tumor.
  • the subject for whom treatment is desired is preferred, although it may be a patient with
  • the administration subject may be a patient not suffering from complications of the familial adenomatous polyposis
  • Subjects for whom treatment is desired are preferred, although they may be those who may be suffering from the disease, or patients suffering from complications of said familial adenomatous polyposis.
  • the administration subject may be a healthy subject not suffering from sarcopenia or frailty, a subject possibly suffering from sarcopenia or frailty, or a patient suffering from sarcopenia or frailty. , is preferred for subjects for whom treatment is desired.
  • the conditions of use (administration conditions) of the conjugate of the present disclosure are not particularly limited, and for example, depending on the type of active ingredient in the conjugate (protein, peptide, VLP, virus, nucleic acid, etc.), the type of administration subject, etc. , administration form, administration time, dosage, etc. can be set as appropriate.
  • Examples of methods for administering the conjugate of the present disclosure include intracerebral administration, intrathecal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, and intravenous administration. Intramuscular or subcutaneous administration is preferred because it can be administered in a stable manner.
  • the dose of the conjugate of the present disclosure may be an amount that, when administered to a subject, induces antibodies to the prorenin receptor compared to a subject that has not been administered, i.e., an effective dose (therapeutically effective dose).
  • an effective dose therapeutically effective dose
  • the dose can be appropriately determined according to, for example, the age, body weight, symptoms, etc. of the subject of administration.
  • the number of administrations of the conjugate of the present disclosure is one or more.
  • the plurality of times is, for example, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times or more.
  • the number of times of administration may be appropriately determined while confirming the therapeutic effect of the subject to be administered.
  • the administration interval can be determined as appropriate while confirming the therapeutic effect of the administration subject. For example, once a day, once a week, once every two weeks, once a month, once every three months once every 6 months, etc.
  • a conjugate of the present disclosure can prevent or alleviate at least one symptom caused by a tumor in a subject to which it is administered.
  • Symptoms of tumor onset include, for example, general malaise, anorexia, and weight loss.
  • Symptoms of familial adenomatous polyposis include, for example, an increase in the number of polyps with a diameter of 5 mm or more that need to be endoscopically removed.
  • a conjugate of the disclosure may prevent or alleviate at least one symptom associated with a tumor. Reduction of symptoms, for example, can be subjectively or objectively evaluated, specific examples include self-evaluation by the administration subject; doctor's evaluation; QOL (Quality of Life) evaluation; Examples include evaluation of reduction in severity of onset symptoms. The objective evaluation may be evaluation by animals or evaluation by humans.
  • the administration subject may be a healthy subject who is not suffering from sarcopenia or frailty, a subject who may be suffering from sarcopenia or frailty, or a subject with sarcopenia. Or it may be a patient suffering from frailty.
  • a conjugate of the present disclosure can prevent or alleviate at least one symptom caused by sarcopenia or frailty in an administered subject.
  • Symptoms of sarcopenia or frailty include, for example, decreased body weight, skeletal muscle mass, muscle strength (grip strength), or physical function (walking speed).
  • a conjugate of the present disclosure may prevent or alleviate at least one symptom associated with sarcopenia or frailty.
  • Reduction of the symptoms can be evaluated subjectively or objectively, and specific examples include self-evaluation by the administration subject; physician evaluation; QOL (Quality of Life) evaluation; delayed progression of sarcopenia or frailty symptoms, or Assessment of reduction in severity of symptoms of sarcopenia or frailty.
  • the objective evaluation may be evaluation by animals or evaluation by humans.
  • the conjugate of the present disclosure contains the prorenin receptor peptide, it can induce antibodies against PRR.
  • the conjugates of the present disclosure can be suitably used in the treatment of cancer and the treatment of sarcopenia or frailty.
  • nucleic acids encoding said PRR peptides.
  • Nucleic acids of the disclosure encode prorenin receptor peptides of the disclosure.
  • the nucleic acid may be composed of deoxynucleotide residues, ribonucleotide residues, or both.
  • the nucleic acid may be composed of natural nucleic acid residues, may be composed of non-natural nucleic acid residues, or may be composed of both.
  • said nucleic acid comprises, for example, DNA, RNA and/or DNA/RNA composed of natural and/or non-natural nucleic acid residues.
  • the non-natural nucleic acid residue includes, for example, a modified nucleotide residue or a modified ribonucleotide residue in which the base, sugar residue, or sugar phosphate backbone of the nucleotide residue is modified.
  • the non-natural nucleic acid residue is, for example, cEt (constrained ethyl bicyclic nucleic acid, manufactured by Ionis Pharmaceuticals), LNA (TM, Locked Nucleic Acid), ENA (registered trademark, 2'-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid), etc.
  • the nucleic acid may, for example, have a 5' cap at the 5' end.
  • the nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid molecule or a double-stranded nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid of the present disclosure can be designed by replacing the corresponding codon based on the amino acid sequence of the PRR peptide of the present disclosure.
  • the base sequences of the nucleic acids of the present disclosure may be codon-optimized, for example.
  • nucleic acids and prorenin receptor peptides can be synthesized by, for example, genetic engineering techniques or organic synthesis techniques, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA and synthetic RNA.
  • nucleic acid of the present disclosure encodes the PRR peptide, it can be suitably used for synthesizing the PRR peptide.
  • nucleic acid of the present disclosure encodes the PRR peptide, it can induce antibodies against the PRR when used as an active ingredient of a vaccine.
  • the disclosure provides expression vectors that can be used to synthesize or express prorenin receptor peptides.
  • An expression vector of the disclosure comprises a nucleic acid of the disclosure above.
  • the prorenin receptor peptide of the present disclosure can be suitably produced by genetic engineering techniques.
  • the expression vector of the present disclosure has, for example, the nucleic acid of the present disclosure inserted into the expression vector.
  • the expression vector for example, can also be said to be operably linked to the nucleic acid.
  • the expression vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting an inserted gene into a target such as a cell.
  • the expression vector may contain, for example, a polynucleotide encoding a prorenin receptor peptide so that the prorenin receptor peptide encoded by the polynucleotide of the nucleic acid of the present disclosure can be expressed, and its configuration is particularly Not restricted.
  • the expression vector can be prepared, for example, by inserting a polynucleotide encoding a prorenin receptor peptide, that is, the nucleic acid of the present disclosure, into a backbone vector (hereinafter also referred to as a "basic vector").
  • the type of the expression vector is not particularly limited, and can be determined appropriately according to the type of the host, for example. Specifically, when the expression vector is synthesized by a genetic engineering technique, the expression vector is synthesized by designing and synthesizing, for example, a nucleic acid encoding the prorenin receptor peptide.
  • the design and synthesis can be carried out by PCR using, for example, a vector containing a nucleic acid encoding the prorenin receptor peptide as a template and primers designed to synthesize the desired nucleic acid region. Then, a recombinant vector for protein expression (expression vector) is obtained by ligating the obtained nucleic acid to an appropriate vector, and the recombinant vector is introduced into a host so that the target gene can be expressed. Transformants can be obtained (Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)).
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the nucleic acid of interest.
  • non-human hosts such as microorganisms, animal cells, insect cells, or cultured cells thereof
  • examples include human cells, cultured cells thereof, mammalian cells, and the like.
  • the expression vector is administered to a subject, the host is, for example, the subject's cells.
  • the prokaryotes include bacteria of the genus Escherichia such as Escherichia coli, and bacteria of the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida.
  • the eukaryotic organism include yeast such as Saccharomyces cerevisiae.
  • the animal cells include COS cells and CHO cells
  • examples of the insect cells include Sf9 and Sf21.
  • the expression vectors include viral vectors and non-viral vectors.
  • the viral vectors include, for example, baculovirus; poxviruses such as vaccinia virus, avipoxvirus, canarypox virus, chickenpox virus, raccoon poxvirus, and swinepox virus; adenoviruses such as canine adenovirus; adeno-associated virus; Viral vectors such as viruses; retroviruses;
  • examples of the expression vector include a binary vector.
  • Examples of the expression vector include pETDuet-1, pQE-80L, pUCP26Km and the like.
  • examples of the expression vector When transforming bacteria such as Escherichia coli, examples of the expression vector include pETDuet-1 vector (Novagen), pQE-80L (QIAGEN), pBR322, pB325, pAT153, pUC8 and the like.
  • examples of the expression vector When the yeast is transformed, examples of the expression vector include pYepSec1, pMFa, pYES2 and the like.
  • examples of the expression vector include pAc, pVL and the like.
  • examples of the expression vector include pCDM8 and pMT2PC.
  • said expression vector has regulatory sequences that, for example, regulate expression of a polynucleotide encoding said prorenin receptor peptide and expression of said prorenin receptor peptide of the present disclosure encoded by said prorenin receptor peptide polynucleotide; is preferred.
  • the regulatory sequences include, for example, promoters, terminators, enhancers, polyadenylation signal sequences, replication origin sequences (ori) and the like.
  • the arrangement of the regulatory sequence in the expression vector is not particularly limited.
  • the regulatory sequence may be arranged, for example, so as to be able to functionally regulate the expression of the polynucleotide encoding the prorenin receptor peptide and the expression of the polypeptide encoded thereby. Can be placed based on method.
  • a sequence provided in advance in the expression vector may be used, the regulatory sequence may be inserted into the expression vector, or the regulatory sequence provided in the basic vector may be may be replaced by the regulatory sequences of
  • the present disclosure provides transformants capable of producing prorenin receptor peptides and methods for producing the same.
  • a transformant of the present disclosure comprises nucleic acid encoding a prorenin receptor peptide of the present disclosure.
  • the transformant of the present disclosure is characterized by containing a nucleic acid encoding the prorenin receptor peptide of the present disclosure, and other configurations and conditions are not particularly limited. According to the transformant of the present disclosure, the prorenin receptor peptide of the present disclosure can be suitably produced.
  • the method for producing a transformant of the present disclosure includes the step of introducing the nucleic acid of the present disclosure into a host.
  • the method for producing the transformant of the present disclosure is characterized by introducing the nucleic acid of the present disclosure into the host, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the transformant can be produced.
  • the description of the method for producing the prorenin receptor peptide, conjugate, nucleic acid, and expression vector of the present disclosure can be used.
  • the nucleic acid encoding the prorenin receptor peptide can refer to the description of the nucleic acid encoding the prorenin receptor peptide of the present disclosure.
  • the expression vector of the present disclosure may be used as the nucleic acid of the present disclosure.
  • the nucleic acid of the present disclosure exists as an exogenous molecule. Therefore, the transformant of the present disclosure can be produced, for example, by introducing the nucleic acid of the present disclosure into the host.
  • the method for introducing the nucleic acid is not particularly limited, and can be performed by a known method.
  • Said nucleic acid may, for example, be introduced by means of said expression vector.
  • a method for introducing the expression vector into a host is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the introduction method can be appropriately set according to, for example, the type of the host. Examples of the introduction method include an introduction method using a gene gun such as a particle gun, a calcium phosphate method, a polyethylene glycol method, a lipofection method using liposomes, an electroporation method, an ultrasonic nucleic acid introduction method, a DEAE-dextran method, a micro glass tube, and the like.
  • a direct injection method using , a hydrodynamic method, a cationic liposome method, a method using an introduction aid, a method via Agrobacterium, and the like.
  • the liposome include lipofectamine and cationic liposome
  • the introduction aid include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • the host is a microorganism, for example, among others, a method using yeast or the like is preferable.
  • the polynucleotide of the prorenin receptor peptide of the present disclosure may be introduced into the host by, for example, an expression vector of the present disclosure.
  • the present disclosure provides methods of making prorenin receptor peptides.
  • a method for producing a prorenin receptor peptide of the present disclosure includes an expression step of expressing the prorenin receptor peptide of the present disclosure.
  • the method for producing a prorenin receptor peptide of the present disclosure is characterized by including the expression step, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the method for producing the prorenin receptor peptide of the present disclosure, the prorenin receptor peptide of the present disclosure can be produced.
  • the production of the prorenin receptor peptide may be carried out, for example, by genetic engineering techniques using a host such as yeast, or by a cell-free system, using methods well known to those skilled in the art. can.
  • a host such as yeast
  • a cell-free system using methods well known to those skilled in the art. can.
  • For the production of the polypeptide see, for example, International Publication No. 2016/017037 (US Patent Application Publication No. 2016/0202251).
  • the production method of the present disclosure may prepare a transformant containing the nucleic acid or expression vector of the present disclosure prior to the expression step.
  • the expression step may include, for example, a culture step of culturing the transformant and an isolation step of isolating the prorenin receptor peptide from the culture.
  • culturing conditions can be appropriately set according to the type of host used for producing the transformant.
  • the culture may be a culture supernatant, a transformant such as cultured cells or cultured cells, or a processed or crushed product thereof.
  • the production method of the present disclosure includes an isolation step of isolating the prorenin receptor peptide, for example, by disrupting the host.
  • the production method of the present disclosure for example, uses the culture medium as it is or removes the host by centrifugation or the like.
  • the production method of the present disclosure is, for example, a general biochemical method used for protein isolation and purification, specifically, concentration by ultrafiltration membrane; salting out such as ammonium sulfate precipitation; gel filtration, ion
  • the prorenin receptor peptide can be isolated or purified by using chromatography using various columns such as exchange chromatography and affinity chromatography, either alone or in combination.
  • the prorenin receptor peptide may be obtained by in vitro translation using a cell-free synthesis system.
  • the production method of the present disclosure may be carried out by a method using RNA encoding the prorenin receptor peptide as a template, or a method using DNA encoding the prorenin receptor peptide as a template (transcription and translation).
  • a commercially available system can be used for the cell-free synthesis system, and as a specific example, the Expressway (trademark) system (Invitrogen) and the like can be used.
  • the production method of the present disclosure is, for example, a general biochemical method used for protein isolation and purification, specifically, concentration by ultrafiltration membrane; salting out such as ammonium sulfate precipitation; gel filtration , ion-exchange chromatography, affinity chromatography and the like using various columns; Said isolation or purification can be carried out, for example, in the same manner as in the case of using said transformant.
  • the prorenin receptor peptide obtained by the production method of the present disclosure may be used as it is as a crude product, may be used as a partially purified product, or may be used as a single purified product. It may be used as a purified product.
  • the obtained prorenin receptor peptide may be pulverized by, for example, freeze-drying, vacuum-drying, or spray-drying.
  • the production method of the present disclosure includes, for example, pre-preparing a prorenin receptor peptide in an acetate buffer, a phosphate buffer, a triethanolamine buffer, a Tris-HCl buffer, a GOOD buffer (e.g., PIPES, MES, MOPS, etc.). It may be dissolved in a buffer solution such as
  • the production method of the present disclosure may further bind the obtained PRR peptide to the carrier protein.
  • the binding can be determined based on the substituent (reactive group) at the binding position, depending on the binding position of the PRR peptide and the carrier protein.
  • a pharmaceutical composition of the present disclosure is a pharmaceutical composition comprising the prorenin receptor peptide, conjugate, nucleic acid, and/or expression vector of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure is characterized by containing a prorenin receptor peptide, a conjugate, a nucleic acid, and/or an expression vector (hereinafter collectively referred to as an "active ingredient") as an active ingredient, and other constituents. and conditions are not particularly limited.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure contains the prorenin receptor peptide or conjugate, or a nucleic acid encoding them, as an active ingredient, when used as an active ingredient of a vaccine, anti-tumor effects and/or anti-muscle loss are achieved. can be effective.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can refer to the description of the conjugate.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure can induce antibodies against prorenin receptor peptides or conjugates, or nucleic acids encoding them, for example, by administering to a subject.
  • the pharmaceutical compositions of the present disclosure can also be referred to as vaccines, vaccine compositions, or vaccine formulations.
  • a pharmaceutical composition of the present disclosure includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier includes a suspending agent, a solubilizer, a stabilizer, a tonicity agent, a preservative, an antiadsorption agent, a surfactant, a diluent, a vehicle, a pH adjuster, and a painless agent for administering the active ingredient.
  • agents, buffering agents, sulfur-containing reducing agents, antioxidants, etc. and can be added appropriately within a range that does not impair the effects of the present disclosure.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may, for example, further contain an immunostimulator.
  • the immunostimulant is, for example, a Toll-like receptor stimulant such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum chloride, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, CpG oligonucleotide, Poly I:C, lipopolysaccharide (LPS) , cytokines, lymphokines, and chemokines.
  • a Toll-like receptor stimulant such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum chloride, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, CpG oligonucleotide, Poly I:C, lipopolysaccharide (LPS) , cytokines, lymphokines, and chemokines.
  • Said cytokines and lymphokines are for example interferons such as interferon (IFN- ⁇ ); inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ ; IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13 granulocyte macrophage (GM) colony-stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and other growth factors; Flt3 ligand; B7-1; B7-2; .
  • interferon IFN- ⁇
  • inflammatory cytokines such as TNF- ⁇
  • GM colony-stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • Flt3 ligand B7-1; B7-2; .
  • the disclosure provides a method of treating a tumor.
  • the method of treating a tumor of the present disclosure uses the prorenin receptor peptide, conjugate, nucleic acid, expression vector, and/or pharmaceutical composition of the present disclosure (hereinafter also collectively referred to as "active ingredient") in a subject. .
  • the method of treating a tumor of the present disclosure includes, for example, administering the active ingredient to the subject.
  • the explanation of the administration conditions for the conjugate of the present disclosure can be used.
  • Said administration may be in vitro or in vivo .
  • the tumor treatment method of the present disclosure contains the prorenin receptor peptide, conjugate, or nucleic acid encoding them as an active ingredient, when the subject is treated, antibody production against the prorenin receptor is suppressed. can be induced. As such, the methods of treating tumors of the present disclosure may inhibit tumors.
  • the present disclosure provides methods of treatment for sarcopenia or frailty.
  • the treatment method of the present disclosure is a method of treating a subject, wherein the subject is provided with the prorenin receptor peptide, conjugate, nucleic acid, expression vector, and/or pharmaceutical composition of the present disclosure (hereinafter collectively referred to as "active ingredient ) is used.
  • the treatment method of the present disclosure is characterized by using prorenin receptor peptides, conjugates, nucleic acids, and expression vectors as active ingredients, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • a method of treating sarcopenia or frailty of the present disclosure comprises, for example, administering to said subject said active ingredient.
  • the explanation of the administration conditions for the conjugate of the present disclosure can be used.
  • Said administration may be in vitro or in vivo .
  • the method for treating sarcopenia or frailty of the present disclosure contains the prorenin receptor peptide, conjugate, or nucleic acid encoding these as an active ingredient, when the subject is treated, antibody production against the prorenin receptor can be induced. As such, the methods of treating sarcopenia or frailty of the present disclosure may inhibit sarcopenia or frailty.
  • the present disclosure is the prorenin receptor peptides, conjugates, nucleic acids, expression vectors and/or pharmaceutical compositions of the present disclosure, or uses thereof, for use in treating tumors.
  • the present disclosure is the prorenin receptor peptides, conjugates, nucleic acids, expression vectors and/or pharmaceutical compositions of the present disclosure or uses thereof for the manufacture of a medicament for treating tumors.
  • the present disclosure is the prorenin receptor peptides, conjugates, nucleic acids, expression vectors and/or pharmaceutical compositions of the present disclosure, or uses thereof, for use in treating sarcopenia or frailty.
  • the present disclosure is the prorenin receptor peptides, conjugates, nucleic acids, expression vectors, and/or pharmaceutical compositions of the present disclosure, or uses thereof, for the manufacture of a medicament for treating sarcopenia or frailty.
  • Prorenin Receptor Peptide Antigen As peptide fragments of the human prorenin receptor protein (SEQ ID NO: 5), the 198th to 211st PRR1 peptides (PRR1, SEQ ID NO: 1), the 223rd to 236th PRR2 peptides (PRR2, SEQ ID NO: 2), 221st to 230th PRR3 peptide (PRR3, SEQ ID NO: 3), 224th to 233rd PRR4 peptide (PRR4, SEQ ID NO: 7), and 200th to 213th PRR0 peptide (PRR0, sequence No. 8) was prepared.
  • Conch protein (keyhole limbet hemocyanin: KLH) is linked by a known method as a carrier protein (carrier protein) to the N-terminus of the amino acid of each of the polypeptides, corresponding to the polypeptides 0-4, PRR0-Cg, PRR1-Cg, PRR2-Cg, PRR3-Cg, and PRR4-Cg were obtained. Each antigen was adjusted to 1 mg/ml.
  • EMCS cross-linking agent
  • PRR4 peptide (SEQ ID NO:7) KRYGEDSEQ PRR0 peptide (SEQ ID NO: 8) HKHLAKDHSPDLYS
  • Figure 1 is a graph showing the antibody titers of the prorenin receptor vaccine PRR0.
  • the horizontal axis indicates the serum dilution ratio
  • the vertical axis indicates the absorbance.
  • no increase in antibody titer was observed in negative control mice two weeks and four weeks after the first administration.
  • mice inoculated with PRR0-Cg a tendency toward an increase in antibody titer was observed 2 weeks and 4 weeks after the first administration compared to the negative control, but no significant increase was observed.
  • FIG. 2 is a photograph showing mice 10 weeks after the first inoculation of the prorenin receptor vaccine PRR0-Cg (5 weeks after transplantation of mouse colon cancer cells CT26: Day 35).
  • the upper row in FIG. 2 shows mice of negative control, the middle row shows mice inoculated with 5 ⁇ g of PRR0-Cg, and the lower row shows mice inoculated with 20 ⁇ g of PRR0-Cg.
  • no antitumor effect was observed regardless of the dose of PRR0-Cg. From the above, it was found that although the antibody against PRR0 exhibits an antitumor effect, its epitope, PRR0, does not function as a prorenin receptor vaccine.
  • mice Two weeks after the first inoculation, the mice were again inoculated with 50 ⁇ g of PRR1-Cg, PRR2-Cg, PRR3-Cg, or PRR4-Cg together with an adjuvant (Freund's Incomplete Adjuvant).
  • an adjuvant Freund's Incomplete Adjuvant
  • 3 weeks after the first inoculation 1 ⁇ 10 5 cells of mouse colon cancer cells CT26 were implanted into the mice.
  • serum was collected from the mice. The antibody titer in the serum was measured as half maximum absorbance at 450 nm.
  • the mice were also measured for tumor size 3, 4, 5, 6, and 7 weeks after the first inoculation.
  • FIG. 3 is a graph showing antibody titers 7 weeks after the first administration (5 weeks after the second administration) of the prorenin receptor vaccines PRR1-4.
  • the horizontal axis indicates the type of immunogen
  • the vertical axis indicates the half value of absorbance at 450 nm.
  • mice inoculated with PRR1-Cg, PRR2-Cg and PRR3-Cg had elevated antibody titers.
  • mice inoculated with PRR1-Cg and PRR2-Cg had markedly increased antibody titers.
  • no increase in antibody titer was observed in mice inoculated with PRR4-Cg. From the above, it was found that the PRR1 peptide, PRR2 peptide, and PRR3 peptide of the present disclosure have an antibody-inducing function against PRR.
  • FIG. 4 is a graph showing the antitumor effects of prorenin receptor vaccines PRR1-4.
  • the horizontal axis indicates the number of days after CT26 transplantation, and the vertical axis indicates the tumor size (mm 3 ).
  • the tumor size mm 3 .
  • FIG. 4 it was found that mice inoculated with PRR1-Cg, PRR2-Cg, or PRR3-Cg had smaller tumor sizes than mice inoculated with adjuvant alone.
  • no change in tumor size was observed in mice inoculated with PRR4-Cg compared to mice inoculated with adjuvant alone.
  • the PRR1 peptide, PRR2 peptide, and PRR3 peptide of the present disclosure function as a prorenin receptor vaccine against colorectal cancer.
  • the PRR1 peptide, PRR2 peptide, and PRR3 peptide can induce antibodies against PRR, the PRR1 peptide, PRR2 peptide, and PRR3 peptide exhibit antitumor effects through antibodies induced by these antigens. was estimated.
  • FIG. 5 is a graph showing the antitumor effects of prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3.
  • the horizontal axis indicates the number of days after CT26 transplantation, and the vertical axis indicates the tumor size (mm 3 ).
  • smaller tumor sizes were reproduced in mice inoculated with PRR2-Cg or PRR3-Cg compared to mice inoculated with adjuvant alone. From the above, it was found that the PRR2 peptide and PRR3 peptide of the present disclosure function as a prorenin receptor vaccine against colorectal cancer.
  • the large intestine tissue was fixed using 4% paraformaldehyde. After the fixation, the large intestine tissue was embedded in paraffin to prepare a 2 ⁇ m-thick paraffin-embedded section. Immunohistochemistry for ⁇ -catenin was performed on the paraffin-embedded sections obtained. Anti- ⁇ -catenin antibody (300-fold dilution, Cat.No: 05-665, Merck Millipore) was used as the primary antibody for ⁇ -catenin staining, and rabbit serum was used as the negative control. These results are shown in FIG.
  • Fig. 6 is a photograph of activated ⁇ -catenin staining in colon tissue.
  • the upper photograph shows the stained image of the colon tissue of the negative control
  • the lower left photograph shows the stained image of the colon tissue of the PRR2-Cg-inoculated mouse
  • the lower right photograph shows the PRR3-Cg-inoculated mouse. Stained images of mouse colon tissue are shown.
  • little expression of activated ⁇ -catenin was observed in the colon tissue of mice administered with PRR2-Cg or PRR3-Cg. From the above, it was found that administration of the PRR2 peptide or PRR3 peptide of the present disclosure induces antibodies against PRR, thereby suppressing activation of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway.
  • Sera were collected from the mice 2, 4, and 8 weeks after the first inoculation.
  • the antibody titer in the serum was measured as half maximum absorbance at 450 nm.
  • a negative control was performed in the same manner, except that mice were inoculated with only the adjuvant.
  • FIG. 7 is a graph showing the antibody titers of the prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3 under short-term observation.
  • the upper row shows the results for male mice, and the lower row shows the results for female mice.
  • the horizontal axis indicates the type of immunogen and the number of weeks after the first inoculation, and the vertical axis indicates the half value of absorbance at 450 nm.
  • the PRR2 and PRR3 peptides can induce antibodies against PRR regardless of gender and function as prorenin receptor vaccines.
  • Sera were collected from the mice 2, 4, 8, and 89 weeks after the first inoculation (corresponding to 9, 11, 15, and 96 weeks of age).
  • the antibody titer in the serum was measured as half maximum absorbance at 450 nm.
  • a negative control was performed in the same manner, except that mice were inoculated with only the adjuvant.
  • FIG. 8 is a graph showing the antibody titers of the prorenin receptor vaccines PRR2 and PRR3 under long-term observation.
  • the upper row shows the results of female mice, and the lower row shows the results of male mice.
  • the horizontal axis indicates the type of immunogen and the age of the mouse in weeks, and the vertical axis indicates the half-value of absorbance at 450 nm.
  • the PRR2-Cg-inoculated mice maintained antibody titers 89 weeks after the first inoculation (96 weeks of age) regardless of gender.
  • Example 2 It was confirmed that the PRR peptide of the present disclosure has an ability to induce antibodies against PRR and an anti-tumor effect even when CRM 197 is used as a carrier protein.
  • KLH was used as a carrier protein for the PRR2-Cg and PRR3-Cg conjugates. Therefore, in this example, instead of KLH, a nontoxic mutant diphtheria toxin CRM 197 that can be used clinically in humans was used as the carrier protein.
  • CRM197 was ligated as a carrier protein to the N-terminus of the amino acid of the PRR2 polypeptide by a known method to obtain CRM197-PRR2. The ligation was performed similarly except CRM 197 was used in place of the KLH.
  • CRM197-PRR2 functions as a prorenin receptor vaccine in the same way as KLH-conjugated PRR2.
  • mice Two weeks after the first inoculation, the mice were again inoculated with 30 ⁇ l of the CRM197-PRR2 together with an adjuvant (Freund's Incomplete Adjuvant). Sera from the mice were collected before the first inoculation and two and four weeks after the first inoculation. The antibody titer in the serum was measured as half maximum absorbance at 450 nm. A negative control was performed in the same manner, except that mice were inoculated with only the adjuvant. These results are shown in FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing antibody titers of CRM197-PRR2 in mice.
  • the horizontal axis indicates the number of weeks after the first administration, and the vertical axis indicates the half value of absorbance at 450 nm.
  • the antibody titer did not rise in mice inoculated with adjuvant alone.
  • mice treated with CRM197-PRR2 showed a slight increase in antibody titer two weeks after the first administration.
  • the antibody titer was elevated in CRM197-PRR2-administered mice 4 weeks after the first administration. From the above, it was found that CRM197-conjugated PRR2 increased the antibody titer in mice in the same manner as KLH-conjugated PRR2.
  • CRM197-PRR2 was found to be effective in increasing antibody titers in mice. Therefore, it was examined whether CRM197-PRR2 induces antibodies against PRR in monkeys as well. Specifically, CRM197-PRR2 was inoculated into cynomolgus monkeys, and antibody titers were measured. The CRM197-PRR2 was prepared at a concentration of 7 mg/ml. After the preparation, an adjuvant (2% aluminum hydroxide) was added in an amount equal to that of CRM197-PRR2 to adjust the concentration to 3.5 mg/ml to obtain a preparation. Then, on days 1 and 29, the preparation was subcutaneously administered to the back (lumbar back) of the cynomolgus monkey.
  • an adjuvant 2% aluminum hydroxide
  • the administration was 140 ⁇ l for the low dose group and 420 ⁇ l for the high dose group.
  • the cynomolgus monkey sera were collected pre-dose, 29 and 57 days.
  • the antibody titer in the serum was measured as half maximum absorbance at 450 nm.
  • FIG. 10 is a graph showing the antibody titers of CRM197-PRR2 in cynomolgus monkeys.
  • the horizontal axis indicates the inoculated group and the number of days after the first administration, and the vertical axis indicates the half value of absorbance at 450 nm.
  • the antibody titers in the low-dose group and the high-dose group increased with the lapse of days.
  • the antibody titer increased in a CRM197-PRR2 dose-dependent manner. From the above, it was found that CRM197-conjugated PRR2 increased the antibody titer in cynomolgus monkeys.
  • Example 3 The PRR peptide of the present disclosure was confirmed for ⁇ -catenin inhibitory effect, antitumor effect, and side reactions.
  • ATP6ap monoclonal antibody (Clone67_3, see International Publication No. 2018/084236) or PRR2 purified antibody was added to the HEK293 cells at the same time as Wnt3a, and cultured at 37°C for 24 hours.
  • FIG. 11 is a graph showing the activity of ⁇ -catenin in HEK293 cells.
  • the horizontal axis indicates the addition group, and the vertical axis indicates the luciferase activity.
  • ATP6ap monoclonal antibody and PRR2 purified antibody were found to suppress the activity of ⁇ -catenin. From the above, it was found that PRR2 of the present disclosure can induce antibodies capable of suppressing the Wnt/ ⁇ -catenin pathway. It was also suggested that PRR2 of the present disclosure suppresses cancer by inducing antibodies capable of suppressing the Wnt/ ⁇ -catenin pathway.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of suppressing polyp formation in adenomatous polyposis model mice.
  • (A) shows a graph of total polyp number
  • (B) shows a graph of total polyp area (mm 2 )
  • (C) shows adjuvant alone, PRR2-Cg, or PRR3-Cg. shows a photograph of inoculation.
  • the horizontal axis indicates the inoculated group
  • the vertical axis indicates the number of polyps.
  • the horizontal axis indicates the inoculation group
  • the vertical axis indicates the area (mm 2 ).
  • FIG. 12(A) shows a graph of total polyp number
  • (B) shows a graph of total polyp area (mm 2 )
  • FIG. 12(B) shows the horizontal axis indicates the inoculation group
  • the vertical axis indicates the area (mm 2 ).
  • FIG. 13 is a graph showing the effect of suppressing polyp formation in adenomatous polyposis model mice.
  • the horizontal axis indicates the polyp size (mm 2 ), and the vertical axis indicates the number of polyps.
  • inoculation of PRR2-Cg or PRR3-Cg resulted in medium size (1.1-2.0 mm 2 ) and large (greater than 2.1 mm 2 ) polyps were found to decrease in number. From the above, it was suggested that the PRR2 peptide and PRR3 peptide of the present disclosure inhibit polyp proliferation by inhibiting ATP6ap2.
  • Fig. 14 is a photograph of staining of ATP6ap2 or active ⁇ -catenin in the intestine.
  • (A) shows a stained image of ATP6ap2
  • (B) shows a stained image of active ⁇ -catenin.
  • strong ATP6ap2 staining was observed in intestinal polyps of saline-inoculated mice.
  • ATP6ap2 staining was attenuated in intestinal polyps of mice inoculated with PRR2-Cg or PRR3-Cg.
  • PRR2-Cg PRR2-Cg
  • PRR3-Cg PRR3-Cg
  • AST liver
  • BUN kidney
  • bone strength were measured as indicators of side reactions in the adenomatous polyposis coli model mouse.
  • AST liver
  • BUN kidney
  • bone strength were measured.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of side reactions in adenomatous polyposis model mice and normal mice.
  • the upper row shows the results of female mice, and the lower row shows the results of male mice.
  • FIG. 15 shows AST (liver) in adenomatous polyposis coli model mice
  • B shows BUN (kidneys) in adenomatous polyposis coli model mice
  • C shows adenomatous polyposis coli model mice.
  • D shows AST (liver) in normal mice
  • E shows creatinine clearance (kidney) in normal mice
  • (F) shows bone strength in normal mice.
  • the horizontal axis indicates the inoculated group, and the vertical axis indicates the AST enzyme concentration.
  • the horizontal axis indicates the inoculation group, and the vertical axis indicates the BUN blood concentration.
  • the horizontal axis indicates the inoculation group and sex, and the vertical axis indicates bone strength.
  • the horizontal axis indicates the inoculation group and sex, and the vertical axis indicates the AST enzyme concentration.
  • the horizontal axis indicates the inoculation group and sex, and the vertical axis indicates the creatinine clearance value.
  • the horizontal axis indicates inoculation group and sex, and the vertical axis indicates bone strength.
  • the same AST enzyme as in the adenomatous polyposis model mouse (Control) inoculated with saline concentration.
  • the adenomatous polyposis coli model mice inoculated with PRR2-Cg or PRR3-Cg there was a decrease in BUN blood level and an increase or an increase in bone strength compared to the adenomatous polyposis model mice inoculated with physiological saline.
  • Fig. 16 is a graph showing the survival rate of adenomatous polyposis model mice.
  • the horizontal axis indicates the number of weeks after the first inoculation, and the vertical axis indicates the survival rate.
  • the survival rate of female mice inoculated with PRR2-Cg or PRR3-Cg was found to be increased compared to the survival rate of saline-inoculated mice (Control). From the above, it was found that the PRR2 peptide and PRR3 peptide of the present disclosure are effective in improving prognosis.
  • physiological saline was used instead of the PRR2 vaccine.
  • Serum was also collected from the mice 6 weeks after the first inoculation. Antibody titers in the sera were measured by absorbance at 450 nm.
  • FIG. 17 is a graph showing the antibody titer of the PRR2 vaccine.
  • the horizontal axis indicates the experimental group, and the vertical axis indicates the half value of absorbance at 450 nm.
  • the PRR2-Cg-inoculated mice had elevated antibody titers regardless of the high salt load.
  • no increase in antibody titer was observed in the adjuvant-inoculated control group of mice, regardless of the high salt load.
  • FIG. 18 is a graph showing weight shift by PRR2-Cg.
  • (A) shows the weight deviation of control groups (i) and (ii) administered with adjuvant only
  • (B) shows the weight deviation of groups (iii) and (iv) inoculated with PRR2 vaccine. indicates a shift.
  • the horizontal axis indicates the number of days after the initiation of high salt loading
  • the vertical axis indicates the body weight of the mouse.
  • the high-salt diet group was found to lose weight more than the normal diet group.
  • the PRR2-vaccinated mice the high-salt diet group weighed similar to the normal diet group. From the above, it was found that the PRR2 peptide of the present disclosure has the effect of suppressing muscle mass loss.
  • ⁇ PRR peptide> (Appendix 1) A prorenin receptor peptide comprising the following (P1), (P2), or (P3) polypeptide: (P1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-3; (P2) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3; (P3) A polynucleotide consisting of an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-3.
  • Appendix 11 7.
  • ⁇ Nucleic acid> (Appendix 12) A nucleic acid encoding the peptide of Supplementary Note 1.
  • ⁇ Expression vector> (Appendix 13) An expression vector comprising the nucleic acid of Appendix 12.
  • ⁇ Pharmaceutical composition> (Appendix 15) The prorenin receptor peptide of appendix 1, the conjugate of any one of appendices 2 to 11, the nucleic acid of appendix 12, and/or the expression vector of appendix 13 or 14, and a pharmaceutically acceptable and a carrier. (Appendix 16) 16. The pharmaceutical composition according to appendix 15, further comprising an immunostimulant. (Appendix 17) 17. The pharmaceutical composition of paragraph 15 or 16, which induces the formation of antibodies capable of inhibiting the activity of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway in a Wnt/ ⁇ -catenin pathway activity assay when administered to a subject. ⁇ Use for tumor treatment> (Appendix 18) 18.
  • Appendix 19 19.
  • Appendix 20 20.
  • Appendix 21 21.
  • ⁇ Transformant> (Appendix 23) A transformant comprising the prorenin receptor peptide of appendix 1, the nucleic acid of appendix 12, or the expression vector of appendix 13 or 14.
  • ⁇ Manufacturing method> (Appendix 24) A method for producing a prorenin receptor peptide, comprising an expression step of expressing the nucleic acid according to Appendix 12 and/or the expression vector according to Appendix 13 or 14.
  • the expression step includes a culturing step of culturing the transformant according to Supplementary Note 23; an isolation step of isolating the prorenin receptor peptide; 25.
  • a method of treating a tumor comprising administering a pharmaceutical composition according to any one of 21.
  • ⁇ How to treat sarcopenia or frailty> (Appendix 27) to a subject a prorenin receptor peptide according to appendix 1, a conjugate according to any one of appendices 2 to 6 and 11, a nucleic acid according to appendix 12, an expression vector according to appendix 13 or 14, and/or 23.
  • a method of treating sarcopenia or frailty comprising administering a pharmaceutical composition according to any of 15-17 and 22.
  • ⁇ Use> (Appendix 28) a prorenin receptor peptide according to appendix 1, a conjugate according to any one of appendices 2 to 10, a nucleic acid according to appendix 12, an expression vector according to appendix 13 or 14, and/or for use in the treatment of tumors Alternatively, the pharmaceutical composition according to any one of Appendices 15 to 21.
  • Appendix 29 A prorenin receptor peptide according to appendix 1, a conjugate according to any one of appendices 2 to 6 and 11, a nucleic acid according to appendix 12, an expression according to appendix 13 or 14, for use in the treatment of sarcopenia or frailty A vector and/or a pharmaceutical composition according to any of clauses 15-17 and 22.
  • the present disclosure antibodies against prorenin receptors can be induced. Also, according to the present disclosure, the activity of the Wnt/ ⁇ -catenin pathway can be indirectly inhibited. Thus, the prorenin receptor peptides of the present disclosure can treat, for example, diseases resulting from abnormalities in the Wnt/ ⁇ -catenin pathway. Therefore, the present disclosure is extremely useful in, for example, the medical field.

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Abstract

プロレニン受容体に対する抗体誘導能が増強されたプロレニン受容体ペプチドを提供する。　本開示のプロレニン受容体ペプチドは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、または（Ｐ３）のポリペプチドを含む： （Ｐ１）配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド； （Ｐ２）配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド； （Ｐ３）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリヌクレオチド。

Description

プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、および医薬組成物
　本発明は、プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、および医薬組成物に関する。
　Ｗｎｔ／β－カテニン経路の異常は、様々な疾患の原因となりうる。前記Ｗｎｔ／β－カテニン経路に異常が生じると、例えば、家族性大腸腺腫症等の腫瘍（良性腫瘍）および骨粗鬆症等が生じる（非特許文献１～４）。近年、Ｗｎｔ／β－カテニンの遮断により、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の異常から生じる疾患を治療することが試みられている。
Caldwell, G. M., et al. "Wnt signalling in adenomas of familial adenomatous polyposis patients." British journal of cancer 103.6 (2010): 910-917. Obrador‐Hevia, Antonia, et al. "Oncogenic KRAS is not necessary for Wnt signalling activation in APC‐associated FAP adenomas." The Journal of pathology 221.1 (2010): 57-67. Zhong, Zhendong A et al. "Regulation of Wnt receptor activity: Implications for therapeutic development in colon cancer." The Journal of biological chemistry vol. 296 (2021): 100782. doi:10.1016/j.jbc.2021.100782 Phull, Manjinder Singh et al. "A perspective on medicinal chemistry approaches towards adenomatous polyposis coli and Wnt signal based colorectal cancer inhibitors." European journal of medicinal chemistry vol. 212 (2021): 113149. doi:10.1016/j.ejmech.2020.113149
　しかしながら、Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、生体において様々な生理活性を有する。このため、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を遮断すると、前記生体の様々な生理活性も阻害するため、治療標的とすることが困難という問題がある。
　本発明者らは、プロレニン受容体が、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性化に寄与すること、プロレニン受容体（ＰＲＲ）に対する抗体を用いることにより、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制できることを見出した。そこで、本発明者らは、ＰＲＲペプチドを用いることにより、Ｗｎｔ／β－カテニン経路に起因する疾患を治療できないかとの着想を得た。また、前記ＰＲＲの２００～２１３番目のペプチド（ＰＲＲ０）を用いて、担癌モデルマウスにおいて、抗腫瘍効果を得られないかを検討した。しかしながら、前記ＰＲＲ０を投与したマウスにおいては、十分な抗腫瘍効果が得られなかった。これは、前記ＰＲＲに対する抗体の誘導能が不十分であるためと、推定された。
　そこで、本開示は、プロレニン受容体に対する抗体誘導能が増強されたＰＲＲペプチドの提供を目的とする。
　前記目的を達成するため、本開示のプロレニン受容体ペプチドは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、または（Ｐ３）のポリペプチドを含む：
（Ｐ１）配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ２）配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ３）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリヌクレオチド。
　本開示のコンジュゲートは、抗原ペプチドと、担体タンパク質とを含み、
前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質と結合し、
前記抗原ペプチドは、本開示のプロレニン受容体ペプチドを含む。
　本開示の核酸は、本開示のプロレニン受容体ペプチドをコードする。
　本開示の発現ベクターは、本開示の核酸を含む。
　本開示の医薬組成物は、本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、および／または、発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む。
　本開示のＰＲＲペプチドは、プロレニン受容体に対する抗体誘導能が増強されている。
図１は、実施例１における、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ０の抗体価を示すグラフである。 図２は、実施例１における、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ０の１回目の接種から１０週間後のマウスを示す写真である。 図３は、実施例１における、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ１～４の抗体価を示すグラフである。 図４は、実施例１における、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ１～４の抗腫瘍効果を示すグラフである。 図５は、実施例１における、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗腫瘍効果を示すグラフである。 図６は、実施例１における、大腸組織におけるβ－カテニンの染色の写真である。 図７は、実施例１における、短期観察下におけるプロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価を示すグラフである。 図８は、実施例１における、長期観察下におけるプロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価を示すグラフである。 図９は、実施例２における、マウスにおけるＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２の抗体価を示すグラフである。 図１０は、実施例２における、カニクイザルにおけるＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２の抗体価を示すグラフである。 図１１は、実施例３における、ＨＥＫ２９３細胞におけるβ－カテニンの活性を示すグラフである。 図１２は、実施例３における、大腸腺腫症モデルマウスにおけるポリープ形成の抑制効果を示すグラフである。 図１３は、実施例３における、大腸腺腫症モデルマウスにおけるポリープ形成の抑制効果を示すグラフである。 図１４は、実施例３における、腸におけるＡＴＰ６ａｐ２または活性型β－カテニンの染色の写真である。 図１５は、実施例３における、大腸腺腫症モデルマウスおよび正常マウスにおける副反応の結果を示すグラフである。 図１６は、実施例３における、大腸腺腫症モデルマウスの生存率を示したグラフである。 図１７は、実施例４における、ワクチンＰＲＲ２の抗体価を示すグラフである。 図１８は、実施例４における、ＰＲＲ２による体重偏移を示したグラフである。
　以下、本発明について、例をあげて説明する。以下の説明において、各発明の説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。
＜定義＞
　本明細書において、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸）、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるペプチドのポリマーを意味する。前記ポリマーの形状は、例えば、直鎖、分岐、および環状等があげられる。
　本明細書において、「プロレニン受容体」は、レニン・アンジオテンシン系を構成する因子として同定された一回膜貫通型タンパク質であり、プロレニンの受容体として機能するタンパク質を意味する。前記プロレニン受容体は、ＡＴＰ６ＡＰ２とも呼ばれる。前記プロレニン受容体は、Ｗｎｔ／β－カテニン系の活性を間接的に増強すると推定される。
　本明細書において、「コンジュゲート」は、２つ以上のアミノ酸配列の異なるペプチドが共有結合により結合した化合物を意味する。前記アミノ酸配列の異なるペプチドは、例えば、抗原ペプチド、担体ペプチドまたは担体タンパク質である。前記抗原ペプチドは、例えば、免疫応答を惹起し、リンパ球等の活性化を誘導することにより、抗体の誘導を目的とするペプチドである。前記担体ペプチドおよび担体タンパク質は、例えば、前記抗原ペプチドに免疫原性を付与するペプチドもしくはタンパク質、または前記抗原ペプチドの免疫原性を増強するペプチドまたはタンパク質である。前記担体ペプチドおよび担体タンパク質は、例えば、ペプチド担体およびタンパク質担体ということもできる。
　本明細書において、「Ｗｎｔ／β－カテニン経路」は、ＷｎｔがＷｎｔ受容体（Frizzled）を介してβ－カテニンを活性化するシグナル伝達経路を意味する。前記Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、例えば、大腸がん等のがんにおいて、β－カテニンの異常な蓄積、およびＷｎｔ阻害因子の遺伝子発現の不活化等を介して、疾患の誘導に寄与している。
　本明細書において、「活性の抑制」は、対象の活性が抑制された状態に変化すること、または抑制された状態を意味する。前記「活性の抑制」が特定のタンパク質または前記特定のタンパク質を介したシグナル経路と組合わせて使用される場合、前記「活性の抑制」は、前記特定のタンパク質または前記特定のタンパク質を介したシグナル経路の機能が抑制された状態に変化すること、または、抑制された状態を意味する。
　本明細書において、「サルコペニアまたはフレイル」は、筋組織の機能に障害が生じることで引き起こされる疾患を意味する。
　本明細書において、「陽性」は、抗原抗体反応を利用して検出されるフローサイトメトリー等の解析方法により、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、高いシグナル等が検出されることを意味する。また、本明細書において、「陰性」は、前記抗原を発現しない陰性対照細胞または前記抗原と反応しない抗体を用いる陰性対照反応と比較して、同等またはそれ以下のシグナル等が検出されることを意味する。
　本明細書において、「処置」は、治療的処置および／または予防的処置を意味する。本明細書において、「治療」は、疾患、病態、もしくは障害の治療、治癒、防止、抑止、寛解、改善、または、疾患、病態、もしくは障害の進行の停止、抑止、低減、もしくは遅延を意味する。本明細書において、「予防」は、疾患もしくは病態の発症の可能性の低下、または疾患もしくは病態の発症の遅延を意味する。前記「治療」は、例えば、対象疾患を発病する対象（患者）に対する治療でもよいし、対象疾患のモデル動物の治療でもよい。
　本明細書において、「対象」は、動物または動物由来の細胞、組織もしくは器官を意味し、特にヒトを含む意味で用いられる。前記動物は、ヒトおよび非ヒト動物を意味する。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。
　本明細書において、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および／または、改変ヌクレオチドのポリマーを意味する。本明細書において、「核酸」が特定のタンパク質と組合わせて用いられる場合、前記「核酸」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドのポリマーを意味する。前記核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられる。前記核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖等であってもよい。前記核酸は、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」と互いに読み替え可能である。
　本明細書において、「宿主」は、外来の核酸を導入される細胞、および／または、個体を意味する。前記宿主が細胞の場合、前記宿主は、宿主細胞ということもできる。
　本明細書において、「ベクター」および「発現ベクター」は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、宿主または宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを意味する。前記「ベクター」および「発現ベクター」は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。
　本明細書において、「形質転換体」は、外来の核酸が導入された宿主を意味する。
　本明細書において、「単離」または「単離された」は、同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「単離」または「単離された」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を経ることにより実施できる。
　以下、本開示について例をあげて説明するが、本開示は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本開示における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
＜プロレニン受容体ポリペプチド＞
　ある態様において、本開示は、プロレニン受容体に対する抗体誘導能が増強されたポリペプチドを提供する。本開示のプロレニン受容体ペプチドは、下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、または（Ｐ３）のポリペプチドを含む：
（Ｐ１）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ２）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ３）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、プロレニン受容体（ＰＲＲ）に対する抗体が、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を制御することで抗腫瘍効果等を示すとの知見を得た。本発明者らは、さらなる研究の結果、ＰＲＲにおける特定のアミノ酸配列を有するペプチドを投与することにより、生体内でＰＲＲに対する抗体を誘導でき、これにより、前記ＰＲＲに対する抗体と同様に、抗腫瘍効果および筋肉量減少の抑制効果が得られることを見出し、本開示を完成するに至った。本開示のＰＲＲペプチドは、前記ＰＲＲペプチドが投与された生体において、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を間接的に制御する抗体の産生誘導を引き起こすことで、抗腫瘍効果および筋肉量減少の抑制効果を示すと推定される。ただし、前記推定は、本開示を何ら制限しない。このため、本開示のＰＲＲペプチドは、例えば、腫瘍（例えば、家族性大腸腺腫症等の良性腫瘍）およびサルコペニアまたはフレイルの処置に好適に使用することができる。
　プロレニン受容体の由来は、特に制限されず、例えば、対象の種類によって適宜設定できる。前記由来は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。各種動物由来のプロレニン受容体は、例えば、既存のデータベースに登録されている情報を参照できる。具体例として、ヒト由来プロレニン受容体は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５７６５で登録されている下記の塩基配列（配列番号４）における１０３－１１５５番目の領域（終始コドン含む）、タンパク質として、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５７５６で登録されている下記のアミノ酸配列（配列番号５）があげられる。配列番号４の塩基配列は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列である。
ヒトプロレニン受容体ｃＤＮＡ（配列番号４）
ctggacgagtccgagcgcgtcacctcctcacgctgcggctgtcgcccgtgtcccgccggcccgttccgtgtcgccccgcagtgctgcggccgccgcggcaccatggctgtgtttgtcgtgctcctggcgttggtggcgggtgttttggggaacgagtttagtatattaaaatcaccagggtctgttgttttccgaaatggaaattggcctataccaggagagcggatcccagacgtggctgcattgtccatgggcttctctgtgaaagaagacctttcttggccaggactcgcagtgggtaacctgtttcatcgtcctcgggctaccgtcatggtgatggtgaagggagtgaacaaactggctctacccccaggcagtgtcatttcgtaccctttggagaatgcagttccttttagtcttgacagtgttgcaaattccattcactccttattttctgaggaaactcctgttgttttgcagttggctcccagtgaggaaagagtgtatatggtagggaaggcaaactcagtgtttgaagacctttcagtcaccttgcgccagctccgtaatcgcctgtttcaagaaaactctgttctcagttcactccccctcaattctctgagtaggaacaatgaagttgacctgctctttctttctgaactgcaagtgctacatgatatttcaagcttgctgtctcgtcataagcatctagccaaggatcattctcctgatttatattcactggagctggcaggtttggatgaaattgggaagcgttatggggaagactctgaacaattcagagatgcttctaagatccttgttgacgctctgcaaaagtttgcagatgacatgtacagtctttatggtgggaatgcagtggtagagttagtcactgtcaagtcatttgacacctccctcattaggaagacaaggactatccttgaggcaaaacaagcgaagaacccagcaagtccctataaccttgcatataagtataattttgaatattccgtggttttcaacatggtactttggataatgatcgccttggccttggctgtgattatcacctcttacaatatttggaacatggatcctggatatgatagcatcatttataggatgacaaaccagaagattcgaatggattgaatgttacctgtgccagaattagaaaagggggttggaaattggctgttttgttaaaatatatcttttagtgtgctttaaagtagatagtatactttacatttataaaaaaaaatcaaattttgttctttattttgtgtgtgcctgtgatgtttttctagagtgaattatagtattgacgtgaatcccactgtggtatagattccataatatgcttgaatattatgatatagccatttaataacattgatttcattctgtttaatgaatttggaaatatgcactgaaagaaatgtaaaacatttagaatagctcgtgttatggaaaaaagtgcactgaatttattagacaaacttacgaatgcttaacttctttacacagcataggtgaaaatcatatttgggctattgtatactatgaacaatttgtaaatgtcttaatttgatgtaaataactctgaaacaagagaaaaggtttttaacttagagtagccctaaaatatggatgtgcttatataatcgcttagttttggaactgtatctgagtaacagaggacagctgttttttaaccctcttctgcaagtttgttgacctacatgggctaatatggatactaaaaatactacattgatctaagaagaaactagccttgtggagtatatagatgcttttcattatacacacaaaaatccctgagggacattttgaggcatgaatataaaacatttttatttcagtaacttttccccctgtgtaagttactatggtttgtggtacaacttcattctatagaatattaagtggaagtgggtgaattctactttttatgttggagtggaccaatgtctatcaagagtgacaaataaagttaatgatgattccaaaaaaaaaa
プロレニン受容体（配列番号５）
MAVFVVLLALVAGVLGNEFSILKSPGSVVFRNGNWPIPGERIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATVMVMVKGVNKLALPPGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRKRLFQENSVLSSLPLNSHSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDEIGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLIRKTRTILEAKQAKNPASPYNLAYKYNFEYSVVFNMVLWIMIALALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRMD
　前記（Ｐ１）において、配列番号１～３のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトプロレニン受容体に由来するポリペプチドである。前記配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトプロレニン受容体のアミノ酸配列（配列番号５）における１９８～２１１番目のアミノ酸配列に対応する。前記配列番号２のアミノ酸配列は、ヒトプロレニン受容体のアミノ酸配列（配列番号５）における２２３～２３６番目のアミノ酸配列に対応する。前記配列番号３のアミノ酸配列は、ヒトプロレニン受容体のアミノ酸配列（配列番号５）における２２１～２３０番目のアミノ酸配列に対応する。
ＰＲＲ１ペプチド（配列番号１）
SRHKHLAKDHSPDL
ＰＲＲ２ペプチド（配列番号２）
GKRYGEDSEQFRDA
ＰＲＲ３ペプチド（配列番号３）
EIGKRYGEDS
　前記（Ｐ２）のポリペプチドにおいて、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｐ２）のポリペプチドが、例えば、担体タンパク質とコンジュゲートを形成した際にＰＲＲに対する抗体産生を誘導可能な範囲とすることが好ましい。「１もしくは数個」は、前記（Ｐ１）のアミノ酸配列において、例えば、１～３個、１または２個、１個である。本開示において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである（以下、同様）。
　前記（Ｐ２）のポリペプチドにおいて、置換は、保存的置換であることが好ましい。前記保存的置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基への置換を意味する。前記保存的置換は、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン等の非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；スレオニン、バリン、イソロイシン等のβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン等の芳香族側鎖を有するアミノ酸残基間の置換；等があげられる。
　前記（Ｐ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｐ３）のポリペプチドが、例えば、担体タンパク質とコンジュゲートを形成した際にＰＲＲに対する抗体産生を誘導可能な範囲とすることが好ましい。「同一性」は、前記（Ｐ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記「同一性」の算出は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出できる（以下、同様）。
　前記ＰＲＲペプチドは、例えば、リンカーアミノ酸またはリンカーペプチドを含んでもよい。前記リンカーアミノ酸またはリンカーペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に担体タンパク質または担体ペプチドと結合させるための付加アミノ酸またはペプチドである。また、前記ＰＲＲペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸の主鎖、および／またはアミノ酸の側鎖が、修飾されてもよい。前記リンカーアミノ酸は、例えば、システインである。
　本開示のＰＲＲペプチドは、例えば、担体ペプチドまたは担体タンパク質と組合せて用いることにより、前記ＰＲＲに対する抗体を誘導できる。
＜コンジュゲート＞
　別の態様において、本開示は、プロレニン受容体に対する抗体誘導能が増強されたコンジュゲートを提供する。本開示は、抗原ペプチドと、担体タンパク質とを含み、前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質と結合し、前記抗原ペプチドは、前記プロレニン受容体ペプチドを含む。
　前記コンジュゲートにおいて、前記担体タンパク質は、前記ＰＲＲペプチドの免疫原性を付与または増強できるタンパク質であればよい。前記担体タンパク質は、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）もしくはジフテリア毒素の変異体、破傷風毒素（ＴＴ）もしくは破傷風毒素の断片Ｃ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはこれらの機能等価物等があげられる。前記機能等価物は、前記担体タンパク質としての機能を有する範囲でアミノ酸配列に変異が導入された変異体である。
　前記ジフテリア毒素の変異体は、例えば、無毒化されたジフテリア毒素ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１９７のＡ鎖（CN103495161）、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Uchidaら(1973) J.Biol.Chem.218:3838-3844）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、ＣＲＭ１０７等があげられる。
　前記担体タンパク質は、例えば、ワクチン組成物として好適に使用できることから、好ましくは、ＣＲＭ１９７である。前記ＣＲＭ１９７は、タンパク質として、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＰＹ５１で登録されている下記アミノ酸配列（配列番号６）の５２番目のグリシンがグルタミン酸に置換されたタンパク質またはその機能等価物があげられる。
ＣＲＭ１９７（配列番号６）
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗原ペプチドと、前記担体タンパク質とは、共有結合により結合している。前記抗原ペプチドにおける前記担体タンパク質との結合位置は、例えば、前記抗原ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、および／またはアミノ酸の側鎖であり、好ましくは、前記Ｎ末端（アミノ基）および／またはＣ末端（カルボキシル基）である。
　前記担体タンパク質における前記抗原ペプチドとの結合位置は、例えば、前記担体タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／またはアミノ酸の側鎖であり、好ましくは、前記アミノ酸側鎖である。前記アミノ酸側鎖は、例えば、システイン残基の側鎖（チオール基）、リジン残基、アルギニン残基、グルタミン残基、もしくはセリン残基の側鎖（アミノ基）、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸の側鎖（カルボキシル基）等があげられる。
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗原ペプチドおよび前記担体タンパク質は、直接または間接的に結合している。前記直接的な結合は、前記抗原ペプチドが、前記担体タンパク質のアミノ酸と直接結合していることを意味する。他方、前記間接的な結合は、前記抗原ペプチドが、リンカーペプチド（ペプチドリンカー）を介して、担体タンパク質と結合していることを意味する。
　前記コンジュゲートにおいて、前記抗原ペプチドは、例えば、前記担体タンパク質のシステイン残基に結合していることが好ましい。前記抗原ペプチドと前記担体タンパク質との結合は、例えば、前記結合に用いる前記抗原ペプチドの反応基と、前記担体タンパク質の反応基とに基づき設定できる。前記抗原ペプチドと前記担体タンパク質とは、例えば、前記抗原ペプチドの反応基と、前記担体タンパク質の反応基とを直接反応させることにより、結合させてもよいし、架橋剤を用いて、前記架橋剤を前記抗原ペプチドおよび前記担体タンパク質と反応させることにより、結合させてもよい。具体例として、前記抗原ペプチドのアミノ基と前記担体タンパク質のシステイン残基の側鎖（チオール基）とを結合させる場合、前記抗原ペプチドと、前記担体タンパク質とは、例えば、異なる反応基を有する架橋剤、より具体的には、アミノ基との反応性を有する反応基と、チオール基との反応性を有する反応基とを有する架橋剤を用いて架橋することにより結合できる。前記架橋剤は、例えば、N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester（EMCS）、N-ε-maleimidocaproyl-oxysulfosuccinimide ester（Sulfo-EMCS）、succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate（SMCC）、sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate（Sulfo-SMCC）、N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester（AMAS）、N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester（BMPS）、N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester（GMBS）等があげられる。
　前記コンジュゲートにおいて、前記担体タンパク質と前記抗原ペプチドとの比率（分子数比、担体タンパク質：抗原ペプチド）は、例えば、１：１～１：１００、または１：１～１：１０があげられる。
　前記コンジュゲートは、対象に投与した場合に、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおいて、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を抑制することが可能な抗体の形成の誘発能を有することが好ましい。前記Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイは、例えば、後述の実施例３（１）に準じて、前記対象のコンジュゲートを投与した対象由来の血漿または血清と、レポーター細胞とを用いて、β－カテニン経路の活性化の程度をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価する系である。前記レポーター細胞は、前記β－カテニン経路が活性化すると、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）が検出される細胞である。
　前記誘発能は、例えば、測定対象のコンジュゲート（測定対象物）を用いて、前記測定対象物を対象に投与（接種）し、前記対象由来の血清または血漿について、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイで評価することにより測定できる。具体的には、前記測定対象物は、例えば、後述の実施例１および２と同様に、任意に免疫賦活剤とを混合し、対象に投与される。前記投与は、２回が好ましい。つぎに、例えば、最後の投与後２～４週間に、前記対象から血液を回収し、血清または血漿を単離する。そして、前記誘発能は、例えば、前記血清または血漿を用いて、前記Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイを行い、生理的食塩水が投与された対象由来の血漿また血清（コントロール）のＷｎｔ／β－カテニン経路の活性と比較することにより評価できる。
　前記コンジュゲートは、例えば、前記Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおける、前記コントロールのＷｎｔ／β－カテニン経路の活性を基準（１００％）として、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上抑制することが可能な抗体の形成の誘発能を有する。
　前記コンジュゲートは、例えば、腫瘍の処置に用いる。前記腫瘍は、良性腫瘍でもよいし、悪性腫瘍（がん）でもよい。前記腫瘍は、例えば、プロレニン受容体陽性の腫瘍があげられる。前記腫瘍は、例えば、大腸がん、膵臓がん、脳腫瘍等があげられる。前記腫瘍は、例えば、良性腫瘍または家族性大腸腺腫症等があげられる。
　前記コンジュゲートは、例えば、合併症を併発する家族性大腸腺腫症の処置に好適に使用できる。前記家族性大腸腺腫症の合併症は、例えば、消化管良性多発腫瘍好発疾患、Ｇａｒｄｎｅｒ症候群、Ｔｕｒｃｏｔ症候群、および／またはデスモイド好発症候群等があげられる。
　本開示のコンジュゲートは、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いてもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏで用いてもよい。本開示のコンジュゲートは、例えば、研究用試薬として使用することもでき、医薬品として使用することもできる。前者の場合、本開示のコンジュゲートは、試験試薬または試験キットということもできる。
　本開示のコンジュゲートの投与対象は、特に制限されない。本開示のコンジュゲートをｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記対象（投与対象）は、例えば、前述の例示を援用できる。前記本開示のコンジュゲートをｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、前記投与対象は、例えば、細胞、組織、器官等があげられ、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞、培養細胞等があげられ、前記組織または器官は、例えば、生体から採取した組織（生体組織）または器官等があげられる。前記細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞等の免疫細胞等があげられる。
　本開示のコンジュゲートをｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、腫瘍を発症していない健常者でもよいし、腫瘍を発症している可能性がある者でもよいし、腫瘍を発症している患者でもよいが、処置が望まれる対象が好ましい。また、前記投与対象が家族性大腸腺腫症を罹患している場合、前記投与対象は、前記家族性大腸腺腫症の合併症に罹患していない患者でもよいし、前記家族性大腸腺腫症の合併症に罹患している可能性がある者でもよいし、前記家族性大腸腺腫症の合併症に罹患している患者でもよいが、処置が望まれる対象が好ましい。さらに、前記投与対象は、サルコペニアまたはフレイルに罹患していない健常者でもよいし、サルコペニアまたはフレイルに罹患している可能性がある者でもよいし、サルコペニアまたはフレイルに罹患している患者でもよいが、処置が望まれる対象が好ましい。
　本開示のコンジュゲートの使用条件（投与条件）は、特に制限されず、例えば、前記コンジュゲートにおける有効成分の種類（タンパク質、ペプチド、ＶＬＰ、ウイルス、核酸等）、投与対象の種類等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。
　本開示のコンジュゲートの投与方法は、例えば、脳内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与等が例示されるが、例えば、投与者の技術によらず、安全におよび安定的に投与できることから、筋肉内投与または皮下投与が好ましい。
　本開示のコンジュゲートの投与量は、対象に投与した場合に、投与していない対象と比較してプロレニン受容体に対する抗体を誘導ができる量、すなわち、有効用量（治療有効用量）であればよい。前記投与量は、例えば、投与対象の年齢、体重、症状等によって適宜決定することができる。
　本開示のコンジュゲートの投与回数は、１または複数回である。前記複数回は、例えば、２回、３回、４回、５回またはそれ以上である。前記投与回数は、対投与象の処置効果を確認しながら、適宜決定されてもよい。前記複数回投与する場合、投与間隔は、投与対象の処置効果を確認しながら、適宜決定でき、例えば、１日１回、１週１回、２週１回、１ヶ月１回、３ヶ月１回、６か月１回等があげられる。
　本開示のコンジュゲートは、投与対象における、腫瘍に起因する、少なくとも１つの症状を予防または軽減しうる。腫瘍発症の症状は、例えば、全身倦怠感、食欲不振、体重減少等があげられる。前記家族性大腸腺腫症の症状は、例えば、内視鏡的に摘出が必要な直径５ｍｍ以上のポリープの数の増加等があげられる。本開示のコンジュゲートは、腫瘍に関連する少なくとも１つの症状の予防または軽減しうる。前記症状の軽減は、例えば、主観的または客観的に評価でき、具体例として、前記投与対象による自己評価；医師の評価；ＱＯＬ（Quality of Life）評価；腫瘍発症の症状の進行遅延、または腫瘍発症の症状の重症度の軽減の評価等があげられる。前記客観的な評価は、動物による評価でもよいし、ヒトによる評価でもよい。
　本開示のコンジュゲートをｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合、前記投与対象は、サルコペニアまたはフレイルに罹患していない健常者でもよいし、サルコペニアまたはフレイルに罹患している可能性がある者でもよいし、サルコペニアまたはフレイルに罹患している患者でもよい。
　本開示のコンジュゲートは、投与対象における、サルコペニアまたはフレイルに起因する、少なくとも１つの症状を予防または軽減しうる。サルコペニアまたはフレイルの症状は、例えば、体重、骨格筋量、筋力（握力）、または身体機能（歩行速度）の低下等があげられる。本開示のコンジュゲートは、サルコペニアまたはフレイルに関連する少なくとも１つの症状の予防または軽減しうる。前記症状の軽減は、例えば、主観的または客観的に評価でき、具体例として、前記投与対象による自己評価；医師の評価；ＱＯＬ（Quality of Life）評価；サルコペニアまたはフレイルの症状の進行遅延、またはサルコペニアまたはフレイルの症状の重症度の軽減の評価等があげられる。前記客観的な評価は、動物による評価でもよいし、ヒトによる評価でもよい。
　本開示のコンジュゲートは、前記プロレニン受容体ペプチドを含むため、ＰＲＲに対する抗体を誘導できる。このため、本開示のコンジュゲートは、がんの処置およびサルコペニアまたはフレイルの処置に好適に使用できる。
＜核酸＞
　別の態様において、本開示は、前記ＰＲＲペプチドをコードする核酸を提供する。本開示の核酸は、本開示のプロレニン受容体ペプチドをコードする。
　前記核酸は、デオキシヌクレオチド残基から構成されてもよいし、リボヌクレオチド残基から構成されてもよいし、両者から構成されてもよい。また、前記核酸は、天然の核酸残基から構成されてもよいし、非天然の核酸残基から構成されてもよいし、両者から構成されてもよい。具体例として、前記核酸は、例えば、天然および／または非天然の核酸残基から構成されるＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡ／ＲＮＡを含む。前記非天然の核酸残基は、例えば、ヌクレオチド残基において、塩基、糖残基、もしくは糖リン酸骨格が修飾された修飾ヌクレオチド残基または修飾リボヌクレオチド残基があげられる。前記糖残基が修飾されている場合、前記非天然の核酸残基は、例えば、cEt(constrained ethyl bicyclic nucleic acid、Ionis Pharmaceuticals社製）、ＬＮＡ（（商標）、Locked Nucleic Acid）、ＥＮＡ（登録商標、2’-O,4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid）等があげられる。前記核酸は、例えば、５’末端に５’キャップを有してもよい。
　前記核酸は、一本鎖の核酸分子でもよいし、二本鎖の核酸分子でもよい。
　本開示の核酸は、前記本開示のＰＲＲペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。前記本開示の核酸の塩基配列は、例えば、コドン最適化されていてもよい。
　本開示において、各種核酸およびプロレニン受容体ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
　本開示の核酸は、前記ＰＲＲペプチドをコードするため、前記ＰＲＲペプチドの合成に好適に使用できる。また、本開示の核酸は、前記ＰＲＲペプチドをコードするため、ワクチンの有効成分として用いた際に、前記ＰＲＲに対する抗体を誘導できる。
＜発現ベクター＞
　別の態様において、本開示は、プロレニン受容体ペプチドの合成または発現に使用可能な発現ベクターを提供する。本開示の発現ベクターは、前記本開示の核酸を含む。本開示の発現ベクターによれば、遺伝子工学的手法により、前記本開示のプロレニン受容体ペプチドを好適に製造できる。
　前記本開示の発現ベクターは、例えば、前記本開示の核酸が、発現ベクターに挿入されている。前記発現ベクターは、例えば、前記核酸が機能的に連結されているということもできる。前記発現ベクターは、例えば、挿入された遺伝子を細胞等の標的内に輸送できる核酸分子を意味する。
　前記発現ベクターは、例えば、前記本開示の核酸のポリヌクレオチドがコードするプロレニン受容体ペプチドを発現可能なように、プロレニン受容体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は、特に制限されない。
　前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、プロレニン受容体ペプチドをコードするポリヌクレオチド、すなわち、前記本開示の核酸を挿入することで作製できる。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。具体的には、前記発現ベクターを遺伝子工学的手法により合成する場合、まず、前記発現ベクターの合成は、例えば、前記プロレニン受容体ペプチドをコードする核酸を設計して合成する。前記設計および合成は、例えば、前記プロレニン受容体ペプチドをコードする核酸を含むベクター等を鋳型とし、所望の核酸領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、得られた核酸を適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクター（発現ベクター）を得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得ることができる（Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)）。
　形質転換に使用する宿主としては、目的の核酸を発現できるものであれば、特に制限されず、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞、哺乳類細胞等があげられる。前記発現ベクターを対象に投与する場合、前記宿主は、例えば、前記投与対象の細胞である。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
　前記発現ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、バキュロウイルス；ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鷄痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、豚痘ウイルス等のポックスウイルス；イヌアデノウイルス等のアデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ヘルペスウイルス；レトロウイルス；等のウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記発現ベクターは、例えば、pETDuet-1、pQE-80L、pUCP26Km等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、pETDuet-1ベクター（ノバジェン社）、pQE-80L（QIAGEN社）、pBR322、pB325、pAT153、pUC8等があげられる。前記酵母に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pYepSec1、pMFa、pYES2等があげられる。前記昆虫細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pAc、pVL等があげられる。前記哺乳類細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pCDM8、pMT2PC等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、前記プロレニン受容体ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現および前記プロレニン受容体ペプチドのポリヌクレオチドがコードする前記本開示のプロレニン受容体ペプチドの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記プロレニン受容体ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現およびこれがコードするポリペプチドの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記発現ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記発現ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
＜形質転換体および形質転換体の製造方法＞
　別の態様において、本開示は、プロレニン受容体ペプチドを製造可能な形質転換体およびその製造方法を提供する。本開示の形質転換体は、本開示のプロレニン受容体ペプチドをコードする核酸を含む。本開示の形質転換体は、本開示のプロレニン受容体ペプチドをコードする核酸を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本開示の形質転換体によれば、前記本開示のプロレニン受容体ペプチドを好適に製造できる。
　本開示の形質転換体の製造方法は、宿主に、前記本開示の核酸を導入する工程を含む。本開示の形質転換体の製造方法は、前記宿主に本開示の核酸を導入することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本開示の形質転換体の製造方法によれば、前記形質転換体を製造できる。本開示の形質転換体およびその製造方法は、前記本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、および発現ベクターの製造方法の説明を援用できる。
　本開示の形質転換体において、前記プロレニン受容体ペプチドをコードする核酸は、前記本開示のプロレニン受容体ペプチドをコードする核酸の説明を援用できる。本開示の核酸としては、前記本開示の発現ベクターを用いてもよい。
　本開示の形質転換体では、本開示の核酸が外来性の分子として存在する。このため、本開示の形質転換体は、例えば、前記宿主に、前記本開示の核酸を導入することにより製造できる。
　前記核酸の導入方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記核酸は、例えば、前記発現ベクターにより導入されてもよい。前記発現ベクターの宿主への導入方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、酵母等を介する方法が好ましい。前記本開示のプロレニン受容体ペプチドのポリヌクレオチドは、例えば、前記本開示の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
＜ＰＲＲペプチドおよびコンジュゲートの製造方法＞
　別の態様において、本開示は、プロレニン受容体ペプチドの製造方法を提供する。本開示のプロレニン受容体ペプチドの製造方法は、本開示のプロレニン受容体ペプチドを発現させる発現工程を含む。本開示のプロレニン受容体ペプチドの製造方法は、前記発現工程を含むことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本開示のプロレニン受容体ペプチドの製造方法によれば、本開示のプロレニン受容体ペプチドを製造できる。
　前記プロレニン受容体ペプチドの製造は、例えば、酵母等の宿主を用いて遺伝子工学的手法により実施してもよいし、無細胞系により実施してもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。前記ポリペプチドの製造は、例えば、国際公開第２０１６／０１７０３７号公報（米国特許出願公開２０１６／０２０２２５１号明細書）を参照できる。
　前記プロレニン受容体ペプチドの製造を前記遺伝子工学的手法により実施する場合、本開示の製造方法は、前記発現工程に先立ち、前記本開示の核酸または発現ベクターを含む形質転換体を準備してもよい。この場合、前記発現工程は、例えば、前記形質転換体を培養する培養工程と、その培養物からプロレニン受容体ペプチドを単離する単離工程を含んでもよい。前記培養工程において、培養の条件は、前記形質転換体の製造に用いた宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記培養物は、培養上清でもよいし、培養細胞もしくは培養菌体等の形質転換体、またはその処理物もしくは破砕物のいずれでもよい。
　前記培養後、前記プロレニン受容体ペプチドが宿主内に生産される場合、本開示の製造方法は、例えば、前記宿主を破砕することによりプロレニン受容体ペプチドを単離する、単離工程を含む。また、前記プロレニン受容体ペプチドが前記宿主外に生産または分泌される場合、本開示の製造方法は、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主を除去する。その後、本開示の製造方法は、例えば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、具体的には、限外ろ過膜による濃縮；硫酸アンモニウム沈殿等の塩析；ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種カラムを用いたクロマトグラフィー；を単独で、または適宜組み合わせて用いることにより、前記プロレニン受容体ペプチドを単離または精製することができる。
　本開示の製造方法では、無細胞合成系を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳により、前記プロレニン受容体ペプチドを得てもよい。この場合は、本開示の作製方法は、前記プロレニン受容体ペプチドをコードするＲＮＡを鋳型にする方法で実施してもよいし、前記プロレニン受容体ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型にする方法（転写および翻訳）により実施してもよい。前記無細胞合成系は、市販のシステムが使用でき、具体例として、Expressway（商標）システム（インビトロジェン社）等を用いることができる。前記翻訳後、本開示の製造方法は、例えば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、具体的には、限外ろ過膜による濃縮；硫酸アンモニウム沈殿等の塩析；ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種カラムを用いたクロマトグラフィー；等を単独で、または適宜組み合わせて用いることにより、前記プロレニン受容体ペプチドを単離または精製することができる。前記単離または精製は、例えば、前記形質転換体を用いた場合と同様に実施できる。
　本開示の製造方法により得られたプロレニン受容体ペプチドは、例えば、そのまま粗精製物として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製物として使用してもよいし、単一に精製した精製物として使用してもよい。
　本開示の製造方法は、得られたプロレニン受容体ペプチドを、例えば、凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化してもよい。この場合、本開示の製造方法は、例えば、プロレニン受容体ペプチドを予め酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、GOODバッファー（例えば、PIPES、MES、MOPS等）等の緩衝液に溶解させておいてもよい。
　本開示の製造方法は、さらに得られたＰＲＲペプチドを、前記担体タンパク質と結合させてもよい。前記結合は、前記ＰＲＲペプチドと、前記担体タンパク質の結合位置に応じて、当該結合位置の置換基（反応基）に基づき決定できる。
＜医薬組成物＞
　本開示は、ＰＲＲに対する抗体を誘導可能な医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、前記本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、および／または発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。本開示の医薬組成物は、有効成分として、プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、および／または発現ベクター（以下、あわせて「有効成分」ともいう）を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本開示の医薬組成物は、有効成分として、前記プロレニン受容体ペプチドもしくはコンジュゲート、またはこれらをコードする核酸を含むため、ワクチンの有効成分として用いた際に、抗腫瘍効果および／または抗筋肉減少効果を示しうる。本開示の医薬組成物は、前記コンジュゲートの説明を援用できる。
　本開示の医薬組成物は、例えば、投与対象に投与することにより、プロレニン受容体ペプチドもしくはコンジュゲート、またはこれらをコードする核酸に対する抗体を誘導できる。このため、本開示の医薬組成物は、ワクチン、ワクチン組成物、またはワクチン製剤ということもできる。
　本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。前記担体は、前記有効成分を投与するための懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等があげられ、本開示の効果を妨げない範囲で適切に添加することができる。
　本発明の医薬組成物は、例えば、さらに免疫賦活化剤を含んでもよい。前記免疫賦活剤は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、Poly I:C、リポポリ多糖（LPS）等のToll様受容体刺激剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン等があげられる。前記サイトカインおよびリンホカインは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ－γ）等のインターフェロン：ＴＮＦ－α等の炎症性サイトカイン；ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３等のインターロイキン；顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）等の成長因子；Ｆｌｔ３リガンド；Ｂ７－１；Ｂ７－２；等があげられる。
＜腫瘍の処置方法＞
　別の態様において、本開示は、腫瘍の処置方法を提供する。本開示の腫瘍の処置方法は、対象に、前記本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物（以下、あわせて「有効成分」ともいう）を使用する。
　本開示の腫瘍の処置方法は、例えば、前記対象に、前記有効成分を投与する工程を含む。前記投与工程における投与条件は、本開示のコンジュゲートにおける投与条件の説明を援用できる。前記投与は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏでもよい。
　本開示の腫瘍の処置方法は、有効成分として、前記プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、または、これらをコードする核酸を含むため、前記対象に対して処置した際に、プロレニン受容体に対する抗体産生を誘導できる。このため、本開示の腫瘍の処置方法は、腫瘍を抑制しうる。
＜サルコペニアまたはフレイルの処置方法＞
　別の態様において、本開示は、サルコペニアまたはフレイルに対する処置方法を提供する。本開示の処置方法は、対象の処置方法であって、前記対象に、前記本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物（以下、あわせて「有効成分」ともいう）を使用する。本開示の処置方法は、有効成分である、プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクターを使用することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
　本開示のサルコペニアまたはフレイルの処置方法は、例えば、前記対象に、前記有効成分を投与する工程を含む。前記投与工程における投与条件は、本開示のコンジュゲートにおける投与条件の説明を援用できる。前記投与は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよいし、ｉｎ　ｖｉｖｏでもよい。
　本開示のサルコペニアまたはフレイルの処置方法は、有効成分として、前記プロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、またはこれらをコードする核酸を含むため、前記対象に対して処置した際に、プロレニン受容体に対する抗体産生を誘導できる。このため、本開示のサルコペニアまたはフレイルの処置方法は、サルコペニアまたはフレイルを抑制しうる。
＜医薬組成物の使用＞
　本開示は、腫瘍の処置に使用するための、本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物、またはその使用である。本開示は、腫瘍を処置するための医薬の製造のための、本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物またはその使用である。本開示は、サルコペニアまたはフレイルの処置に使用するための、本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物、またはその使用である。本開示は、サルコペニアまたはフレイルを処置するための医薬の製造のための、本開示のプロレニン受容体ペプチド、コンジュゲート、核酸、発現ベクター、および／または医薬組成物、またはその使用である。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本開示は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　本開示のＰＲＲペプチドについて、ＰＲＲに対する抗体の誘導能および抗腫瘍効果があることを確認した。
（１）プロレニン受容体ペプチド抗原の作製
　ヒトプロレニン受容体タンパク質（配列番号５）のペプチド断片として、１９８－２１１番目のＰＲＲ１ペプチド（ＰＲＲ１、配列番号１）、２２３－２３６番目のＰＲＲ２ペプチド（ＰＲＲ２、配列番号２）、２２１－２３０番目のＰＲＲ３ペプチド（ＰＲＲ３、配列番号３）、２２４－２３３番目のＰＲＲ４ペプチド（ＰＲＲ４、配列番号７）、および比較例として２００－２１３番目のＰＲＲ０ペプチド（ＰＲＲ０、配列番号８）を調製した。各前記ポリペプチドのアミノ酸のＮ末端に、キャリアタンパク（担体タンパク質）として、ホラ貝タンパク質（キーホールリンベットヘモシアニン：ＫＬＨ）を、公知の方法により連結し、前記ポリペプチド０－４に対応する、ＰＲＲ０－Ｃｇ、ＰＲＲ１－Ｃｇ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、ＰＲＲ３－Ｃｇ、およびＰＲＲ４－Ｃｇを得た。各抗原は、１ｍｇ／ｍｌに調整した。前記連結には、架橋剤（ＥＭＣＳ）を用い、前記ペプチドのアミノ基と、前記ＫＬＨのシステイン残基の側鎖のチオール基とを架橋することにより、コンジュゲートを調製した。
ＰＲＲ４ペプチド（配列番号７）
KRYGEDSEQ
ＰＲＲ０ペプチド（配列番号８）
HKHLAKDHSPDLYS
（２）ＰＲＲ０の抗体価の測定および抗腫瘍効果の検討
　ＰＲＲ０に対する抗体は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍効果を示す。そこで、プロレニン受容体ワクチンとして前記ＰＲＲ０－Ｃｇを、マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、７週齢）に接種し、ＰＲＲに対する抗体価（以下、「抗体価」という）の測定、および抗腫瘍効果の検討を行った。具体的には、前記実施例１（１）で得たＰＲＲ０－Ｃｇ　５μｇまたは２０μｇ（１ｍｇ／ｍｌ）を、アジュバント（Freund’s Complete Adjuvant、Cat No. 014-09541、WAKO社製）と共に前記マウスに接種した（各ｎ＝４）。前記接種の２週後と４週間後、血清を採取した。前記１回目の接種の５週間後、１×１０６細胞のマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を、前記マウスに移植した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度で測定した。また、腫瘍に対する効果は、前記１回目の接種の１０週間後に行った。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウス（ｎ＝２）に接種した以外は、同様の方法で行った。これらの結果を図１および図２に示す。
　図１は、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ０の抗体価を示すグラフである。図１において、横軸は、血清の希釈倍率を示し、縦軸は、吸光度を示す。図１に示すように、ネガティブコントロールのマウスでは、１回目投与の２週後および４週後に抗体価の上昇は認められなかった。また、ＰＲＲ０－Ｃｇを接種したマウスでは、ネガティブコントロールと比較して、１回目投与の２週後および４週後に抗体価の上昇傾向は見られたものの、有意な上昇は認められなかった。
　図２は、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ０－Ｃｇの１回目の接種から１０週間後（マウス大腸がん細胞ＣＴ２６を移植して５週後：Ｄａｙ３５）のマウスを示す写真である。図２の上段は、ネガティブコントロールのマウスを示し、中段は、ＰＲＲ０－Ｃｇを５μｇ接種したマウスを示し、下段は、ＰＲＲ０－Ｃｇを２０μｇ接種したマウスを示す。図２に示すように、ＰＲＲ０－Ｃｇの接種量に関わらず、抗腫瘍効果は見られなかった。以上のことから、ＰＲＲ０に対する抗体は、抗腫瘍効果を示すものの、そのエピトープであるＰＲＲ０は、プロレニン受容体ワクチンとして機能しないことがわかった。
（３）ＰＲＲ１～４の抗体価の測定および抗腫瘍効果の検討
　次に、プロレニン受容体ワクチンとして前記コンジュゲートを、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、７週齢）に接種し、抗体価の測定、および抗腫瘍効果の検討を行った。具体的には、実施例１（１）で得た、１ｍｇ／ｍｌに調製した、５０μｇのＰＲＲ１－Ｃｇ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、ＰＲＲ３－Ｃｇ、またはＰＲＲ４－Ｃｇを、アジュバント（Freud’s Complete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した（ＰＲＲ１－Ｃｇ、２－Ｃｇ、および４－Ｃｇ：ｎ＝９、ＰＲＲ３－Ｃｇ：ｎ＝８）。前記１回目の接種２週間後、再度、５０μｇのＰＲＲ１－Ｃｇ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、ＰＲＲ３－Ｃｇ、またはＰＲＲ４－Ｃｇを、アジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した。前記１回目の接種の３週間後、１×１０５細胞のマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を、前記マウスに移植した。前記１回目の接種の７週間後、前記マウスから血清を採取した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度の半値（Half maximum）として測定した。また、前記１回目の接種の３、４、５、６、および７週間後、前記マウスの腫瘍のサイズを測定した。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウスに接種した（ｎ＝７）以外は、同様の方法で行った。これらの結果を図３および図４に示す。
　図３は、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ１～４の１回目投与７週後（２回目投与５週後）の抗体価を示すグラフである。図３において、横軸は、免疫原の種類を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図３に示すように、ＰＲＲ１－Ｃｇ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、およびＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスにおいて、抗体価が上昇していることがわかった。さらには、ＰＲＲ１－ＣｇおよびＰＲＲ２－Ｃｇを接種したマウスにおいて、抗体価が顕著に上昇していることがわかった。他方、ＰＲＲ４－Ｃｇを接種したマウスにおいて、抗体価の上昇は認められなかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ１ペプチド、ＰＲＲ２ペプチド、およびＰＲＲ３ペプチドは、ＰＲＲに対する抗体誘導機能を有することが分かった。
　図４は、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ１～４の抗腫瘍効果を示すグラフである。図４において、横軸は、ＣＴ２６を移植した後の日数を示し、縦軸は、腫瘍のサイズ（ｍｍ３）を示す。図４に示すように、ＰＲＲ１－Ｃｇ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスにおいて、アジュバントのみを接種したマウスと比べ、腫瘍のサイズが小さいことがわかった。他方、ＰＲＲ４－Ｃｇを接種したマウスにおいて、アジュバントのみを接種したマウスと比べ、腫瘍のサイズの変化は見られなかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ１ペプチド、ＰＲＲ２ペプチド、およびＰＲＲ３ペプチドは、大腸がんに対するプロレニン受容体ワクチンとして機能することがわかった。また、前記ＰＲＲ１ペプチド、ＰＲＲ２ペプチド、およびＰＲＲ３ペプチドは、ＰＲＲに対する抗体を誘導できることから、前記ＰＲＲ１ペプチド、ＰＲＲ２ペプチド、およびＰＲＲ３ペプチドは、これらの抗原により誘導された抗体を介して抗腫瘍効果を示すと推定された。
（４）ＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗腫瘍効果の検討
　抗腫瘍効果が見られたＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇについて、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、６週齢）に接種し、抗腫瘍効果の再検討を行った。具体的には、前記実施例１（１）で得たＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇ　５０μｇ（１ｍｇ／ｍｌ）を、アジュバント（Freund’s Complete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した（各ｎ＝１０）。前記１回目の接種２週間後、再度、５０μｇのＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇ、を、アジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した。前記１回目の接種の３週間後、１×１０５細胞のマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を、前記マウスに皮下移植した。CT26細胞を移植した１４、１７、２１、２４、および２８日後に前記マウスの腫瘍のサイズを測定した。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウスに接種した（ｎ＝１０）以外は、同様の方法で実施した。これらの結果を図５に示す。
　図５は、プロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗腫瘍効果を示すグラフである。図５において、横軸は、ＣＴ２６を移植した後の日数を示し、縦軸は、腫瘍のサイズ（ｍｍ３）を示す。図５に示すように、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスにおいて、アジュバントのみを接種したマウスと比べ、腫瘍のサイズが小さいことが再現された。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、大腸がんに対するプロレニン受容体ワクチンとして機能することが分かった。
（５）組織染色によるＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗腫瘍効果の検討
　大腸がんの大半で、β－カテニンの蓄積が見られる。抗腫瘍効果を示したＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを投与することによって、大腸におけるβ－カテニンの蓄積が軽減されるか、免疫組織化学染色により検討した。具体的には、前記実施例１（３）と同様の方法で得た、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを投与したマウスから腫瘍組織を採取した。ネガティブコントロールとしては、ペプチド抗原の代わりに生理食塩水のみをマウスに接種した（ｎ＝５）以外は、同様の方法で行い、腫瘍組織を採取した。前記採取後、４％のパラホルムアルデヒドを用いて前記大腸組織を固定した。前記固定後、前記大腸組織をパラフィン包埋し、厚さ２μｍのパラフィン包埋切片を調製した。得られたパラフィン包埋切片について、β－カテニンに関する免疫組織化学を行なった。１次抗体として、β－カテニンの染色には、抗β－カテニン抗体（３００倍希釈、Cat.No: 05-665、Merck Millipore社製）を、ネガティブコントロールとしては、ウサギ血清を用いた。これらの結果を図６に示す。
　図６は、大腸組織における活性化β－カテニンの染色の写真である。図６において、上段の写真は、ネガティブコントロールの大腸組織の染色画像を示し、下段左の写真は、ＰＲＲ２－Ｃｇ接種マウスの大腸組織の染色画像を示し、下段右の写真は、ＰＲＲ３－Ｃｇ接種マウスの大腸組織の染色画像を示す。図６に示すように、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを投与したマウスの大腸組織において、活性化β－カテニンの発現はあまり見られなかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドまたはＰＲＲ３ペプチドを投与することで、ＰＲＲに対する抗体が誘導され、これによりＷｎｔ／β－カテニン経路の活性化を抑制されることがわかった。
（６）短期観察におけるＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価の測定
　ＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇについて、短期観察下での抗体価をマウスの性別ごとに測定した。具体的には、前記実施例１（１）で得たＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇ　５０μｇを、アジュバント（Freund’s Complete Adjuvant）と共にマウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）に接種し、血清を採取した（各ｎ＝１０）。前記１回目の接種２週間後、再度、５０μｇのＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを、アジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した。前記１回目の接種２、４、および８週間後、前記マウスから血清を採取した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度の半値（Half maximum）として測定した。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウスに接種した以外は、同様の方法で行った。これらの結果を図７に示す。
　図７は、短期観察下におけるプロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価を示すグラフである。図７において、上段は雄のマウスの結果を示し、下段は雌のマウスの結果を示す。図７において、横軸は、免疫原の種類および１回目の接種後の週数を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図７に示すように、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスにおいて、性別に関わらず、１回目の接種の４週間後に、抗体価が上昇していることがわかった。以上のことから、ＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、性別に関わらず、ＰＲＲに対する抗体が誘導でき、プロレニン受容体ワクチンとして機能することが示唆された。
（７）長期観察におけるＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価の測定
　ＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇについて、長期観察下での抗体価を、マウスの性別ごとに測定した。具体的には、前記実施例１（１）で得たＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇ　５０μｇを、アジュバント（Freund’s Complete Adjuvant）と共にマウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、７週齢）に接種し、血清を採取した（各ｎ＝１０）。前記１回目の接種２週間後、再度、５０μｇのＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを、アジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した。前記１回目の接種の２、４、８、および８９週間後（９、１１、１５、および９６週齢に対応）、前記マウスから血清を採取した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度の半値（Half maximum）として測定した。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウスに接種した以外は、同様の方法で行った。これらの結果を図８に示す。
　図８は、長期観察下におけるプロレニン受容体ワクチンＰＲＲ２およびＰＲＲ３の抗体価を示すグラフである。図８において、上段は雌のマウスの結果を示し、下段は雄のマウスの結果を示す。図８において、横軸は、免疫原の種類およびマウスの週齢を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図８に示すように、ＰＲＲ２－Ｃｇを接種したマウスにおいて、性別に関わらず、１回目の接種の８９週間後（９６週齢）に、抗体価が維持されていることがわかった。また、ＰＲＲ３－Ｃｇを接種した雄マウスにおいて、１回目の接種の８９週間後（９６週齢）に、抗体価が維持されていることがわかった。以上のことから、ＰＲＲ２ペプチドは、性別に関わらず、長期的に抗体価が維持されることが分かった。また、ＰＲＲ３ペプチドは、特に、雄において、長期的に抗体価が維持されることが示唆された。
［実施例２］
　本開示のＰＲＲペプチドについて、担体キャリアタンパク質にＣＲＭ１９７を用いた場合においても、ＰＲＲに対する抗体の誘導能および抗腫瘍効果があることを確認した。
（１）マウスにおけるキャリアタンパク質の検討
　前記ＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇのコンジュゲートには、キャリアタンパク質（担体タンパク質）として、ＫＬＨを使用していた。そこで、本実施例では、前記キャリアタンパク質として、ＫＬＨに代えて、ヒトの臨床で使用可能な無毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７を用いた。前記ＰＲＲ２のポリペプチドのアミノ酸のＮ末端に、キャリアタンパクとして、ＣＲＭ１９７を、公知の方法により連結し、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を得た。前記連結は、前記ＫＬＨに代えてＣＲＭ１９７を用いた以外は同様にして実施した。
　つぎに、前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２が、ＫＬＨをコンジュゲートさせたＰＲＲ２と同様に、プロレニン受容体ワクチンとして機能するか検討した。具体的には、前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、７週齢）に接種し、抗体価を測定した。前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を７ｍｇ／ｍｌの濃度に調製後、さらに１０倍に希釈した。前記希釈後、３０μｌのＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２（約２０μｇ含有）を含む希釈液を、３０μｌのアジュバント（Freund’s Complete Adjuvant）と共に前記マウスに接種し、血清を採取した（ｎ＝１０）。前記１回目の接種２週間後、再度、３０μｌの前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を、アジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant）と共に前記マウスに接種した。前記マウスの血清の採取は、１回目の接種前、１回目の接種後２週間後および４週間後に行った。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度の半値（Half maximum）として測定した。ネガティブコントロールとしては、アジュバントのみをマウスに接種した以外は、同様の方法で行った。これらの結果を図９に示す。
　図９は、マウスにおけるＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２の抗体価を示すグラフである。図９において、横軸は、１回目の投与からの週数を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図９に示すように、アジュバントのみを接種したマウスにおいて、抗体価は上昇しなかった。他方、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を投与した場合マウスにおいて、１回目の投与から２週間後に、抗体価の上昇が少し見られた。さらに、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を投与した場合マウスにおいて、１回目の投与から４週間後に、抗体価が上がっていることがわかった。以上のことから、マウスにおいて、ＣＲＭ１９７をコンジュゲートさせたＰＲＲ２によって、ＫＬＨをコンジュゲートさせたＰＲＲ２と同様に、抗体価が上昇することがわかった。
（２）サルにおけるキャリアタンパク質の検討
　マウスにおいて、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２が、抗体価の上昇に有効であることがわかった。そこで、サルにおいても、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２が、ＰＲＲに対する抗体を誘導するかについて検討した。具体的には、前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を、カニクイザルに接種し、抗体価を測定した。前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２を７ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。前記調製後、前記ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２と等量のアジュバント（２％水酸化アルミニウム）を添加し、３．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、調整物を得た。そして、１および２９日目に、前記調整物を、前記カニクイザルの背部皮下（腰背部）に投与した。前記投与は、低用量群で１４０μｌ、高用量群で４２０μｌの投与とした。前記カニクイザルの血清は、投与前、２９、５７日目に採取した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度の半値（Half maximum）として測定した。これらの結果を図１０に示す。
　図１０は、カニクイザルにおけるＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２の抗体価を示すグラフである。図１０において、横軸は、接種群および１回目の投与からの日数を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図１０に示すように、低用量群および高用量群において、抗体価が日数の経過とともに上昇していることがわかった。さらに、ＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２の用量依存的に、抗体価が上昇していることがわかった。以上のことから、カニクイザルにおいて、ＣＲＭ１９７をコンジュゲートさせたＰＲＲ２によって、抗体価が上昇することがわかった。
［実施例３］
　本開示のＰＲＲペプチドについて、β－カテニン抑制効果、抗腫瘍効果、および副反応について確認した。
（１）ＰＲＲ２およびＰＲＲ３のβ－カテニン抑制効果の検討
　抗腫瘍効果が見られたＰＲＲ２－Ｃｇについて、Ｗｎｔ３ａによって活性化されるβ－カテニンの活性が軽減されるか、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて検討した。具体的には、pGL4.49[luc2P TCF-LEF RE Hygro]ベクター（図１１（Ａ）参照、プロメガ社製）を培養細胞ＨＥＫ２９３細胞に発現させ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでβ－カテニンの活性化を評価できるシステム（レポーター細胞）を構築した。前記レポーター細胞では、Ｗｎｔ／β－カテニン経路が活性化すると、活性化β－カテニン依存的にルシフェラーゼの発現が誘導される。このため、前記レポーター細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を測定できる。前記ＨＥＫ２９３細胞にＷｎｔ３ａと同時にＡＴＰ６ａｐモノクローナル抗体（Clone67_3、国際公開第２０１８／０８４２３６号参照）、またはＰＲＲ２精製抗体を添加し、３７℃で２４時間の条件下で培養した。前記培養後、ルシフェラーゼの基質が含まれるLuciferase assay system（プロメガ社製）を５０μｌ添加し、Centro XS3 LB 960（ベルトールド社製）を用いて発光を測定した。コントロール群には、Ｗｎｔ３ａおよび各抗体を添加しない以外、同様の方法で行った。これらの結果を図１１に示す。
　図１１は、ＨＥＫ２９３細胞におけるβ－カテニンの活性を示すグラフである。図１１（Ｂ）において、横軸は、添加群を示し、縦軸は、ルシフェラーゼ活性を示す。図１１（Ｂ）に示すように、ＡＴＰ６ａｐモノクローナル抗体およびＰＲＲ２精製抗体では、β－カテニンの活性が抑制されることがわかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制可能な抗体を誘導できることがわかった。また、本開示のＰＲＲ２は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路を抑制可能な抗体を誘導することで、がんを抑制することが示唆された。
（２）ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおけるＰＲＲ２およびＰＲＲ３のポリープ形成の抑制効果の検討
　抗腫瘍効果が見られたＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇについて、大腸がん（大腸腺腫症）モデルマウスのポリープ形成を抑制できるかについて検討した。具体的には、大腸腺腫症モデルマウス（C57BL/6J-Apcmin/+）に、前記実施例１（３）と同様の試験プロトコルで、生理的食塩水、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇと、アジュバントとを共に投与した。前記マウスが１６～２０週齢の時に、前記マウスから腸（大腸および小腸）を回収した。前記回収後、腸のポリープを解析した。これらの結果を図１２および図１３に示す。
　図１２は、大腸腺腫症モデルマウスにおけるポリープ形成の抑制効果を示すグラフである。図１２において、（Ａ）は、総ポリープ数のグラフを示し、（Ｂ）は、総ポリープ面積（ｍｍ２）のグラフを示し、（Ｃ）は、アジュバントのみ、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した際の写真を示す。図１２（Ａ）において、横軸は、接種群を示し、縦軸は、ポリープの数を示す。図１２（Ｂ）において、横軸は、接種群を示し、縦軸は、面積（ｍｍ２）を示す。図１２に示すように、アジュバントを接種した群と比較して、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した群において、総ポリープ数および総ポリープ面積が減少していることがわかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、ポリープ形成の抑制効果を示すことがわかった。
　図１３は、大腸腺腫症モデルマウスにおけるポリープ形成の抑制効果を示すグラフである。図１３において、横軸は、ポリープの大きさ（ｍｍ２）を示し、縦軸は、ポリープの数を示す。図１３に示すように、生理食塩水を接種した大腸腺腫症モデルマウス（Control）と比較して、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇの接種によって、大きさが中型（１．１～２．０ｍｍ２）および大型（２．１ｍｍ２以上）のポリープの数が減少することがわかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、ＡＴＰ６ａｐ２を阻害することで、ポリープの増殖を抑制することが示唆された。
（３）免疫染色による、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおける、ＰＲＲ２およびＰＲＲ３のβ－カテニン活性抑制の検討
　大腸腺腫症モデルマウスのポリープ形成の抑制効果が見られたＰＲＲ２およびＰＲＲ３について、β－カテニンの活性が抑制されているか、免疫染色を用いて検討した。具体的には、大腸腺腫症モデルマウス（C57BL/6J-Apcmin/+）に、前記実施例１（３）と同様の試験プロトコルで、生理的食塩水、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇと、アジュバントとを共に投与した。前記マウスが１６～２０週齢の時に、前記マウスから腸を回収した。前記回収後、４％のパラホルムアルデヒドを用いて前記腸を固定した。前記固定後、前記腸をパラフィン包埋し、厚さ２μｍのパラフィン包埋切片を調製した。得られたパラフィン包埋切片について、β－カテニンに関する免疫染色を行なった。１次抗体として、ＡＴＰ６ａｐ２（プロレニン受容体：ＰＲＲ）の染色には、抗ＡＴＰ６ａｐ２抗体（3000倍希釈、東北薬科大学より提供：Takuo Hirose et al., “Gene expression of (pro)renin receptor is upregulated in hearts and kidneys of rats with congestive heart failure, Peptides, Volume 30, Issue 12, 2009, Pages 2316-2322参照）、活性型β－カテニンの染色には、抗活性型β－カテニン抗体（1000倍希釈、Cat.No: 05-665、Merck Millipore社製）を、２次抗体として、horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (Nichirei Biosciences社製）を使用した。これらの結果を図１４に示す。
　図１４は、腸におけるＡＴＰ６ａｐ２または活性型β－カテニンの染色の写真である。図１４において、（Ａ）は、ＡＴＰ６ａｐ２の染色画像を示し、（Ｂ）は、活性型β－カテニンの染色画像を示す。図１４（Ａ）に示すように、生理食塩水を接種したマウスの腸のポリープにおいて、ＡＴＰ６ａｐ２の染色が強く見られた。他方、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスの腸のポリープにおいて、ＡＴＰ６ａｐ２の染色は減弱した。図１４（Ｂ）に示すように、生理食塩水を接種したマウス（Control）の腸の核内において、活性型β－カテニンの染色が強く見られた。他方、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種したマウスの腸の核内において、活性型β－カテニンの染色は減弱した。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、ＡＴＰ６ａｐ２の発現およびβ－カテニンの活性を抑制することがわかった。
（４）ＰＲＲ２およびＰＲＲ３による副反応の検討
　Ｗｎｔ／β－カテニン系シグナル阻害剤では、骨病変等の副反応が問題となっている。そこで、ＰＲＲ２およびＰＲＲ３の接種により、骨病変等の副作用が生じないか検討した。具体的には、大腸腺腫症モデルマウス（C57BL/6J-Apcmin/+）および正常マウス（C57BL/6）に、前記実施例１（３）と同様の試験プロトコルで、生理的食塩水、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇと、アジュバントとを共に投与した。前記投与後２４週に、前記大腸腺腫症モデルマウスにおいて副反応を確認した。前記大腸腺腫症モデルマウスの副反応の指標としては、ＡＳＴ（肝臓）、ＢＵＮ（腎臓）、および骨強度を測定した。また、前記投与後９６週に、前記正常マウスにおいて副反応を確認した。前記正常マウスの副反応の指標としては、ＡＳＴ（肝臓）、クレアチニンクリアランス（腎臓）、および骨強度を測定した。これらの結果を図１５に示す。
　図１５は、大腸腺腫症モデルマウスおよび正常マウスにおける副反応の結果を示すグラフである。図１５（Ａ）～（Ｃ）において、上段は雌のマウスの結果を示し、下段は雄のマウスの結果を示す。図１５において、（Ａ）は、大腸腺腫症モデルマウスにおけるＡＳＴ（肝臓）を示し、（Ｂ）は、大腸腺腫症モデルマウスにおけるＢＵＮ（腎臓）を示し、（Ｃ）は、大腸腺腫症モデルマウスにおける骨強度を示す。（Ｄ）は、正常マウスにおけるＡＳＴ（肝臓）を示し、（Ｅ）は、正常マウスにおけるクレアチニンクリアランス（腎臓）を示し、（Ｆ）は、正常マウスにおける骨強度を示す。図１５（Ａ）において、横軸は、接種群を示し、縦軸は、ＡＳＴ酵素濃度を示す。図１５（Ｂ）において、横軸は、接種群を示し、縦軸は、ＢＵＮ血中濃度を示す。図１５（Ｃ）において、横軸は、接種群および性別を示し、縦軸は、骨強度を示す。図１５（Ｄ）において、横軸は、接種群および性別を示し、縦軸は、ＡＳＴ酵素濃度を示す。図１５（Ｅ）において、横軸は、接種群および性別を示し、縦軸は、クレアチニンクリアランス値を示す。図１５（Ｆ）において、横軸は、接種群および性別を示し、縦軸は、骨強度を示す。図１５（Ａ）～（Ｃ）に示すように、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した大腸腺腫症モデルマウスにおいて、生理食塩水を接種した大腸腺腫症モデルマウス（Control）と同様のＡＳＴ酵素濃度を示すことがわかった。また、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した大腸腺腫症モデルマウスにおいて、生理食塩水を接種した大腸腺腫症モデルマウスと比較して、ＢＵＮ血中濃度の減少および骨強度の増加あるいは増加傾向がみられた。図１５（Ｄ）～（Ｆ）に示すように、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した正常モデルマウスにおいて、生理食塩水を接種した正常マウスと同様のＡＳＴ酵素濃度、ＢＵＮ血中濃度、および骨強度を示すことがわかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、副反応を伴わず、ならびに腺腫から生じる腎機能低下および骨強度低下を改善することがわかった。
（４）ＰＲＲ２およびＰＲＲ３による生存率改善の検討
　大腸腺腫症モデルマウスでは、腺腫増大に伴う腸閉塞、および出血等が原因で、多くの死亡が観察される。そこで、ＰＲＲ２－ＣｇおよびＰＲＲ３－Ｃｇの接種により、生存率が上昇するか検討した。具体的には、大腸腺腫症モデルマウス（C57BL/6J-Apcmin/+）に、実施例１（３）と同様の試験プロトコルで、生理的食塩水、ＰＲＲ２－Ｃｇ、またはＰＲＲ３－Ｃｇ、およびアジュバントを投与した。前記マウスは、前記投与から３０週間、生存率を計測した。なお、前記マウスの体重が１０％減少した場合、死亡したものとみなし、生存率の計測を行った。これらの結果を図１６に示す。
　図１６は、大腸腺腫症モデルマウスの生存率を示したグラフである。図１６において、横軸は１回目の接種からの週数を示し、縦軸は、生存率を示す。図１６に示すように、生理食塩水を接種したマウス（Control）の生存率と比較して、ＰＲＲ２－ＣｇまたはＰＲＲ３－Ｃｇを接種した雌のマウスの生存率は、上昇することがわかった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドおよびＰＲＲ３ペプチドは、予後の改善に有効であることがわかった。
［実施例４］
　本開示のＰＲＲペプチドについて、筋肉減少の抑制効果があることを確認した。
　本開示の新規ペプチドが、筋肉量低下に対して抑制効果があるか検討した。高食塩食は、マウスの筋肉量低下を引き起こすことが知られている。具体的には、前記実施例２（１）で作製したＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２　２０μｇを、３０μｌの生理食塩水およびアジュバント（Freund’s Complete Adjuvant、Cat No. F5881、ＳＩＧＭＡ社製）と混合して、１回目投与用のＰＲＲ２ワクチンを調製した。前記調製後、前記１回目投与用のＰＲＲ２ワクチンを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、オス、８週齢）に接種した。前記投与から２週間後、前記実施例２（１）で作製したＣＲＭ１９７－ＰＲＲ２－Ｃｇ　２０μｇを、３０μｌの生理食塩水およびアジュバント（Freund’s Incomplete Adjuvant、Cat No. F5506、ＳＩＧＭＡ社製）と混合して、２回目投与用のＰＲＲ２ワクチンを調製した。前記調製後、前記２回目投与用のＰＲＲ２ワクチンを、前記マウスに接種した。前記２回目の投与から４週間後、高食塩負荷を開始した。前記高食塩負荷は、高食塩食を前記マウスに２週間与えることで行った。前記高食塩負荷を行なうと、マウスでは、骨格筋の筋肉量の現象が生じるため、前記抗食塩負荷は、サルコペニアまたはフレイルのモデルとなる。実験群としては、（ｉ）アジュバントのみ接種＋通常食（ｎ＝１０）、（ｉｉ）アジュバントのみ接種＋高食塩食（ｎ＝１０）、（ｉｉｉ）ＰＲＲ２ワクチン接種＋通常食（ｎ＝１０）、および（ｉｖ）ＰＲＲ２ワクチン接種＋高食塩食（ｎ＝１０）の４群とした。前記アジュバントのみ接種の群は、ＰＲＲ２ワクチンの代わりに、生理食塩水を用いた。また、前記１回目の接種の６週間後に前記マウスから血清を採取した。前記血清における抗体価は、４５０ｎｍの吸光度で測定した。これらの結果を図１７および図１８に示す。
　図１７は、ＰＲＲ２ワクチンの抗体価を示すグラフである。図１７において、横軸は、実験群を示し、縦軸は、４５０ｎｍの吸光度の半値を示す。図１７に示すように、ＰＲＲ２－Ｃｇを接種したマウスにおいて、高食塩負荷に関わらず、抗体価が上昇していることがわかった。他方、アジュバントを接種したコントロール群のマウスにおいて、高食塩負荷に関わらず、抗体価の上昇は認められなかった。
　図１８は、ＰＲＲ２－Ｃｇによる体重偏移を示したグラフである。図１８において、（Ａ）は、アジュバントのみ投与したコントロール群（ｉ）および（ｉｉ）の体重偏移を示し、（Ｂ）は、ＰＲＲ２ワクチンを接種した群（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の体重偏移を示す。図１８（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、高食塩負荷開始後の日数を示し、縦軸は、マウスの体重を示す。図１８に示すように、アジュバントのみを接種したマウスにおいて、高食塩食の群は、通常食の群と比べ、体重が減少していることがわかった。他方、ＰＲＲ２ワクチンを接種したマウスにおいて、高食塩食の群は、通常食の群と同様の体重であった。以上のことから、本開示のＰＲＲ２ペプチドは、筋肉量低下を抑制する効果があることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０２２年３月３日に出願された日本出願特願２０２２－０３２７０９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜ＰＲＲペプチド＞
（付記１）
下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、または（Ｐ３）のポリペプチドを含む、プロレニン受容体ペプチド：
（Ｐ１）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ２）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｐ３）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリヌクレオチド。
＜コンジュゲート＞
（付記２）
抗原ペプチドと、担体タンパク質とを含み、
前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質と結合し、
前記抗原ペプチドは、付記１に記載のプロレニン受容体ペプチドを含む、コンジュゲート。
（付記３）
前記担体タンパク質は、システイン残基を含み、
前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質のシステイン残基に結合している、付記２に記載のコンジュゲート。
（付記４）
前記担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、または破傷風毒素もしくはその断片である、付記２または３に記載のコンジュゲート。
（付記５）
前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である、付記２から４のいずれかに記載のコンジュゲート。
（付記６）
対象に投与した場合、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおいて、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を抑制することが可能な抗体の形成を誘発する、付記２から５のいずれかに記載のコンジュゲート。
（付記７）
腫瘍の処置に用いるための、付記２から６のいずれかに記載のコンジュゲート。
（付記８）
前記腫瘍は、プロレニン受容体陽性である、付記７に記載のコンジュゲート。
（付記９）
前記腫瘍は、家族性大腸腺腫症である、付記７または８に記載のコンジュゲート。
（付記１０）
消化管良性多発腫瘍好発疾患、Ｇａｒｄｎｅｒ症候群、Ｔｕｒｃｏｔ症候群、および／またはデスモイド好発症候群を合併する家族性大腸腺腫症の処置に用いるための、付記９に記載のコンジュゲート。
（付記１１）
サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、付記２から６のいずれかに記載のコンジュゲート。
＜核酸＞
（付記１２）
付記１に記載のペプチドをコードする、核酸。
＜発現ベクター＞
（付記１３）
付記１２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（付記１４）
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、付記１３に記載の発現ベクター。
＜医薬組成物＞
（付記１５）
付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記２から１１のいずれかに記載のコンジュゲート、付記１２に記載の核酸、および／または、付記１３または１４に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
（付記１６）
さらに、免疫賦活剤を含む、付記１５に記載の医薬組成物。
（付記１７）
対象に投与した場合、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおいて、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を抑制することが可能な抗体の形成を誘発する、付記１５または１６に記載の医薬組成物。
＜腫瘍処置用の用途＞
（付記１８）
腫瘍の処置に用いるのための、付記１５から１７のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記１９）
前記腫瘍は、プロレニン受容体陽性である、付記１８に記載の医薬組成物。
（付記２０）
前記腫瘍は、家族性大腸腺腫症である、付記１８または１９に記載の医薬組成物。
（付記２１）
消化管良性多発腫瘍好発疾患、Ｇａｒｄｎｅｒ症候群、Ｔｕｒｃｏｔ症候群、および／またはデスモイド好発症候群を合併する家族性大腸腺腫症の処置に用いるための、付記２０に記載の医薬組成物。
＜サルコペニアまたはフレイル用の用途＞
（付記２２）
サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、付記１５から１７のいずれかに記載の医薬組成物。
＜形質転換体＞
（付記２３）
付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記１２に記載の核酸、または、付記１３または１４に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
＜製造方法＞
（付記２４）
付記１２に記載の核酸、および／または、付記１３または１４に記載の発現ベクターを発現させる発現工程を含む、プロレニン受容体ペプチドの製造方法。
（付記２５）
前記発現工程は、
　付記２３に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
　前記プロレニン受容体ペプチドを単離する単離工程と、
を含む、付記２４に記載の製造方法。
＜腫瘍の処置方法＞
（付記２６）
対象に、付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記２から１０のいずれかに記載のコンジュゲート、付記１２に記載の核酸、付記１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、付記１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍の処置方法。
＜サルコペニアまたはフレイルの処置方法＞
（付記２７）
対象に、付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記２から６および１１のいずれかに記載のコンジュゲート、付記１２に記載の核酸、付記１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、付記１５から１７および２２のいずれかに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、サルコペニアまたはフレイルの処置方法。
＜使用＞
（付記２８）
腫瘍の処置に用いるための、付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記２から１０のいずれかに記載のコンジュゲート、付記１２に記載の核酸、付記１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、付記１５から２１のいずれかに記載の医薬組成物。
（付記２９）
サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、付記１に記載のプロレニン受容体ペプチド、付記２から６および１１のいずれかに記載のコンジュゲート、付記１２に記載の核酸、付記１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、付記１５から１７および２２のいずれかに記載の医薬組成物。
　以上のように、本開示によれば、プロレニン受容体に対する抗体を誘導可能である。また、本開示によれば、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を間接的に抑制できる。したがって、本開示のプロレニン受容体ペプチドによれば、例えば、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の異常から生じる疾患を処置できる。このため、本開示は、例えば、医薬分野等において極めて有用である。

 

Claims (29)

  1. 下記（Ｐ１）、（Ｐ２）、または（Ｐ３）のポリペプチドを含む、プロレニン受容体ペプチド：
    （Ｐ１）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ｐ２）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （Ｐ３）配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリヌクレオチド。
  2. 抗原ペプチドと、担体タンパク質とを含み、
    前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質と結合し、
    前記抗原ペプチドは、請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチドを含む、コンジュゲート。
  3. 前記担体タンパク質は、システイン残基を含み、
    前記抗原ペプチドは、前記担体タンパク質のシステイン残基に結合している、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記担体タンパク質は、ジフテリア毒素もしくはその変異体、または破傷風毒素もしくはその断片である、請求項２または３に記載のコンジュゲート。
  5. 前記担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である、請求項２から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. 対象に投与した場合、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおいて、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を抑制することが可能な抗体の形成を誘発する、請求項２から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. 腫瘍の処置に用いるための、請求項２から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. 前記腫瘍は、プロレニン受容体陽性である、請求項７に記載のコンジュゲート。
  9. 前記腫瘍は、家族性大腸腺腫症である、請求項７または８に記載のコンジュゲート。
  10. 消化管良性多発腫瘍好発疾患、Ｇａｒｄｎｅｒ症候群、Ｔｕｒｃｏｔ症候群、および／またはデスモイド好発症候群を合併する家族性大腸腺腫症の処置に用いるための、請求項９に記載のコンジュゲート。
  11. サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、請求項２から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. 請求項１に記載のペプチドをコードする、核酸。
  13. 請求項１２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  14. 前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
  15. 請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項２から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の核酸、および／または、請求項１３または１４に記載の発現ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  16. さらに、免疫賦活剤を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 対象に投与した場合、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性アッセイにおいて、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の活性を抑制することが可能な抗体の形成を誘発する、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  18. 腫瘍の処置に用いるための、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記腫瘍は、プロレニン受容体陽性である、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記腫瘍は、家族性大腸腺腫症である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
  21. 消化管良性多発腫瘍好発疾患、Ｇａｒｄｎｅｒ症候群、Ｔｕｒｃｏｔ症候群、および／またはデスモイド好発症候群を合併する家族性大腸腺腫症の処置に用いるための、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項１２に記載の核酸、または、請求項１３または１４に記載の発現ベクターを含む、形質転換体。
  24. 請求項１２に記載の核酸、および／または、請求項１３または１４に記載の発現ベクターを発現させる発現工程を含む、プロレニン受容体ペプチドの製造方法。
  25. 前記発現工程は、
    　請求項２３に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
    　前記プロレニン受容体ペプチドを単離する単離工程と、
    を含む、請求項２４に記載の製造方法。
  26. 対象に、請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項２から１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の核酸、請求項１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、腫瘍の処置方法。
  27. 対象に、請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項２から６および１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の核酸、請求項１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、請求項１５から１７および２２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、サルコペニアまたはフレイルの処置方法。
  28. 腫瘍の処置に用いるための、請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項２から１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の核酸、請求項１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  29. サルコペニアまたはフレイルの処置に用いるための、請求項１に記載のプロレニン受容体ペプチド、請求項２から６および１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載の核酸、請求項１３または１４に記載の発現ベクター、および／または、請求項１５から１７および２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

     
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