CN108392492B

CN108392492B - Ldlr过表达在nk细胞过继治疗中的应用

Info

Publication number: CN108392492B
Application number: CN201711463607.3A
Authority: CN
Inventors: 王红阳; 付静; 秦文昊; 杨知时; 陈瑶
Original assignee: Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla
Current assignee: Oriental Hepatobiliary Surgery Hospital Second Military Medical University Of Chinese Pla
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108392492A

Abstract

本发明涉及LDLR过表达在抗肿瘤NK过继治疗中的应用。揭示了一种通过转基因技术增强NK细胞的抗肿瘤疗效的方法，通过在NK细胞中过表达低密度脂蛋白受体，增强NK细胞抗肿瘤活性，经过改造的NK细胞在肿瘤过继治疗中具有显著增强的疗效。此外，本发明还提供了以胆固醇处理自然杀伤细胞以增强NK细胞的抗肿瘤能力的方法。本发明为NK细胞的过继治疗提供了新的治疗策略和改进思路。

Description

LDLR过表达在NK细胞过继治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及LDLR过表达在抗肿瘤NK过继治疗中的应用。

背景技术

肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的新疗法，该疗法借助于调节肿瘤细胞和宿主免疫反应，来增强免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞的能力。目前肿瘤的免疫治疗可分为以下几类：(1)非特异性免疫治疗，指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机体的免疫功能，激活机体的抗肿瘤免疫应答，以达到治疗肿瘤的目的。(2)免疫检查点阻断治疗，如已经被FDA批准用于恶性肿瘤治疗的抗PD1药物，以及抗CTLA-4药物等。(3)过继免疫治疗，指向将有免疫活性的自体或者同种异体的免疫细胞输给患者，为患者提供现成的免疫能力，直接杀伤肿瘤或激发机体抗瘤免疫效应，从而达到治疗恶性肿瘤的目的，为了达到更好的抗肿瘤效果，用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖能力。

自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别并杀伤靶细胞，此外，NK细胞还参与骨髓移植后移植物抗白血病效应。，在体外NK细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。其发挥作用的效应机制为：(1)自然杀伤活性；(2)杀伤介质主要有穿孔素，NK细胞毒因子和TNF等；(3)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；(4)NK细胞产生的细胞因子，发挥调节免疫和造血以及直接杀伤靶细胞的作用。NK细胞具有非专一性的细胞毒杀作用，其没有T细胞或B细胞所具有的特异性受体，不涉及进行受体的基因重组。NK细胞对靶细胞的识别和杀伤依赖于其细胞表面固定表达的激活性受体和抑制性受体，所以它能迅速识别和杀伤肿瘤细胞，并通过分泌细胞因子等招募并激活T细胞，巨噬细胞等，共同杀伤肿瘤。

目前NK细胞已被用于肿瘤免疫过继治疗，并且取得了很好的疗效，表明制备较强的细胞毒活性的NK细胞在免疫过继治疗领域有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供LDLR过表达在抗肿瘤NK过继治疗中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高自然杀伤(NK)细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法，包括：在自然杀伤细胞中增加低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达；或者，以胆固醇处理自然杀伤细胞。

在一个优选例中，所述的增加低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达包括：在自然杀伤细胞中重组表达外源的低密度脂蛋白受体(LDLR)；较佳地，所述的重组表达外源的低密度脂蛋白受体的方法包括：将表达构建物(如表达载体)引入到自然杀伤细胞中，所述的表达构建物带有低密度脂蛋白受体的表达盒。

在另一优选例中，所述的提高自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法为非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述的在自然杀伤细胞中重组表达外源的低密度脂蛋白受体作为单独唯一的提高自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法。

在另一优选例中，所述的以胆固醇处理自然杀伤细胞包括：将胆固醇加入到含有自然杀伤细胞的溶液、悬浮液或培养基中。较佳地，胆固醇在溶液、悬浮液或培养基中的浓度为0.5～100ug/ml；较佳地为1～50ug/ml；更佳地为5～20ug/ml。

在另一优选例中，所述的肿瘤是能被自然杀伤细胞识别的肿瘤；较佳地，所述的肿瘤包括但不限于：白血病、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胆囊癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌。

在本发明的另一方面，提供一种低密度脂蛋白受体或其编码核酸的用途，用于引入到自然杀伤细胞中，提高自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力。

在一个优选例中，所述的低密度脂蛋白受体或其编码核酸的用途为非治疗性的用途。

在本发明的另一方面，提供一种重组的自然杀伤细胞，该细胞重组表达外源的低密度脂蛋白受体；或该细胞含有或其基因组中整合有外源的低密度脂蛋白受体的编码核酸。

在一个优选例中，所述的低密度脂蛋白受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供所述的自然杀伤细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物包括：所述的自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体；或

所述的药物组合物包括：以胆固醇处理的自然杀伤细胞；或含有胆固醇的溶液、悬浮液或培养基中；较佳地，所述的含有胆固醇的溶液、悬浮液或培养基中，胆固醇浓度为0.5～100ug/ml；较佳地为1～50ug/ml；更佳地为5～20ug/ml。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的自然杀伤细胞；或所述的药物组合物；较佳地，所述的药盒中还包括选自下组的一种或多种：肿瘤化疗药物，肿瘤放疗药物或使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是对照细胞(NK92MI^GFP)，LDLR过表达细胞(NK92MI^LDLR)LDLR蛋白表达水平。

图2是NK92MI^GFP和NK92MI^LDLR细胞LDL-C摄取能力的检测。其中图2A是共聚焦成像结果，图2B是Dil荧光强度量化结果。

图3是NK92MI^GFP和NK92MI^LDLR细胞活化相关基因的表达水平检测。

图4是NK92MI^GFP和NK92MI^LDLR细胞体外细胞毒性检测。

图5是对照组、NK92MI^GFP组和NK92MI^LDLR组细胞体内细胞过继实验的结果。其中图5A是小鼠黑色素瘤荷瘤生长曲线，图5B是小鼠肺癌细胞荷瘤生长曲线。

图6是对照组、NK92MI^GFP组和NK92MI^LDLR组细胞体内细胞过继实验的结果的代表性图片。其中图6A是小鼠黑色素瘤荷瘤结果，图6B是小鼠肺癌细胞荷瘤结果。

图7是通过免疫组化染色方法，验证对照组、NK92MI^GFP组和NK92MI^LDLR组过继免疫细胞在肿瘤局部的浸润。

图8是以胆固醇处理小鼠脾脏内分离得到的NK细胞，处理组和非处理组细胞内胆固醇含量的检测结果。

图9是以胆固醇处理小鼠脾脏内分离得到的NK细胞，处理组和非处理组细胞体外细胞毒性检测。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种通过转基因技术增强自然杀伤细胞(NK细胞)的抗肿瘤疗效的方法，通过在NK细胞中过表达低密度脂蛋白受体，增强NK细胞抗肿瘤活性，经过改造的NK细胞在肿瘤过继治疗中具有显著增强的疗效。此外，本发明还提供了以胆固醇处理自然杀伤细胞以增强NK细胞的抗肿瘤能力的方法。

如本文所用，所述的“肿瘤”是能被自然杀伤细胞识别的“肿瘤”。“肿瘤”这一术语即包括了实体瘤，又包括了非实体瘤；例如，包括但不限于：白血病、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胆囊癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌等等。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因(本发明中为低密度脂蛋白受体)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”或“可操作性地构建”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“过表达”是指细胞内LDLR的含量(如表达量)显著地超过初始细胞(未转入该外源基因的细胞)的水平；如与初始细胞相比，其含量高20％，较佳地高50％；更佳地高100％以上，如高200％，300％...500％或更高。一种“过表达”的情形是将外源的转录因子的编码基因转入细胞中且发生表达。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或不同来源的核苷酸或蛋白质与细胞或生物体之间的关系。例如，特定序列并非天然存在于其所插入的细胞或生物体，那么其对于该细胞或生物体而言是“外源的”。

低密度脂蛋白受体

低密度脂蛋白受体(LDLR)，是近年来发现的一种细胞表面蛋白，属于一种内吞性受体，介导低密度脂蛋白的内吞，从而影响血液中LDL的水平，调控细胞内胆固醇的含量。由于其能够与多种结构及功能各异的配体相互作用，不仅可以对血脂的动态平衡及纤溶功能的稳定进行调节，而且能参与多种生长因子、细胞激酶生物学效应的发挥。

所述的LDLR包括全长的LDLR或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的LDLR的氨基酸序列也包括在本发明中。LDLR的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LDLR的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长LDLR的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LDLR的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的活性。LDLR或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

本发明也可采用经修饰或改良的LDLR，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或效力而加以修饰或改良的LDLR。所述经过修饰或改良的LDLR可以是与天然存在的LDLR具有较小的共同点，但也能发挥与野生型相同或基本相同的功能，且不会带来其它不良影响。也就是说，任何不影响LDLR的生物活性的变化形式都可应用于本发明中。

本发明还包括了编码所述的LDLR的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。作为本发明的优选方式，可对LDLR的编码序列进行密码子优化，以提高表达效率。编码LDLR的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的LDLR的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，得到所要的蛋白。

本发明还包括了包含编码所述LDLR的生物活性片段的核酸分子的表达构建物。所述的表达构建物可包括一个或多个编码所述LDLR的基因表达盒，还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的表达调控序列的设计是本领域公知的。表达调控序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

表达构建物的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，获得了LDLR的序列后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。

NK细胞

自然杀伤(Natural Killer，NK)细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，属于一类独立的淋巴细胞。它来源于骨髓干细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏。NK细胞群是机体抗肿瘤的第一道防线，无需抗原预先致敏即可直接识别和杀伤肿瘤细胞，能发挥特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有杀伤和溶解的作用。同时分泌大量的细胞因子，直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞。并可表达可以诱导细胞凋亡的蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡状态。

NK细胞表面具有两种不同的受体：杀伤细胞活化受体(KAR)，能识别自身组织细胞病毒感染的细胞和某些肿瘤细胞表面的糖基配体，传导活化信号，发挥杀伤作用；杀伤细胞抑制受体(KIR)，能识别自身组织细胞表面的MHC I类分子，介导抑制信号的产生。病毒感染的细胞和某些肿瘤细胞及正常自身组织细胞表面均可和这两种受体结合，对病毒感染的细胞和某些肿瘤细胞而言，表面MHCⅠ类分子表达减少或缺失，则KAR的作用占主导地位，从而表现为杀伤作用；对正常自身组织细胞而言，表面MHC I类分子表达正常或增加，则KIR的作用占主导地位，从而表现为NK细胞失活，自身组织细胞不被破坏。目前，通过转基因技术制备过表达LDLR的NK细胞，用于免疫过继治疗未见报道。

本发明中，所述的NK细胞可以是分离自机体的，包括自体和异体来源的NK细胞；所述的NK细胞可以是体外培养的，可以是原代培养或传代培养的细胞。现在，也已经有一些商品化的NK细胞，可以供本领域技术人员方便地获得，例如，人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞NK-92MI，其可获自ATCC(ATCC CRL-2408)；此外，其它本领域已建立的NK细胞系还包括有：NK92，NKL，YT，HANK-1，NK-YS和SNK-6等，应理解，它们均可被应用于本发明中。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种提高NK细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法，所述方法包括：在NK细胞中增加LDLR的表达；或者，以胆固醇处理自然杀伤细胞。较佳地，所述的增加LDLR的表达包括：在NK细胞中重组表达外源的LDLR。更佳地，所述的重组表达外源的LDLR的方法包括：将表达构建物(如表达载体)引入到自然杀伤细胞中，所述的表达构建物带有LDLR的表达盒。

使细胞过表达外源基因(在本发明中为LDLR)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码LDLR的多核苷酸序列可插入到表达构建物如重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的病毒(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。包含编码LDLR的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化细胞，以使其能够表达所述的LDLR。优选地，所述的重组表达载体是病毒载体，更佳地为慢病毒载体。

如前所述，可将所述的LDLR的编码基因引入到细胞中，使得细胞内过表达所述的LDLR。另外，也可将LDLR蛋白外源表达后，与细胞共培养而使得LDLR蛋白移动到细胞的适当位置。

在本发明的优选方式中，所述的在NK细胞中重组表达外源的LDLR作为单独唯一的治疗手段进行免疫过继治疗。此外，在利用本发明的重组NK细胞进行免疫过继治疗的同时，还联合其它有效的肿瘤治疗方法，如手术治疗、放射治疗等。

所述的以胆固醇处理自然杀伤细胞可以包括：将胆固醇加入到含有自然杀伤细胞的溶液、悬浮液或培养基中。较佳地，胆固醇在溶液、悬浮液或培养基中的浓度为0.5～100ug/ml；较佳地为1～50ug/ml；更佳地为5～20ug/ml。

本发明中，可以应用天然分离的胆固醇或者人工合成的或商品化的胆固醇。本领域也已经发现或合成了一些胆固醇类似物或衍生物，应理解，这类具有与天然胆固醇相同功能的物质也应被涵盖在本发明的保护范围内。

在本发明的优选实施例中，本发明人利用人源NK细胞系NK92MI，过表达LDLR得到NK92MI^LDLR细胞，Western-blot检测证明NK92MI^LDLR细胞LDLR表达水平明显升高，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)摄取加快。体外证明过表达LDLR使NK92MI细胞活性升高，细胞毒性增加。通过皮下注射小鼠来源的黑色素瘤细胞系(B16F10细胞来自于第二军医大学)以及肺癌细胞系(Lewis肺癌细胞，来自于第二军医大学)，建立小鼠荷瘤模型，观察小鼠皮下肿瘤的生长情况和小鼠的生存情况，发现对照组皮下肿瘤生长迅速，而给予NK92MI细胞过继治疗的小鼠肿瘤生长明显减慢，NK92MI^LDLR细胞的过继治疗效果最佳。经上述实验发现，重组表达LDLR可明显增强免疫过继治疗所用NK细胞的活性。本发明为NK细胞过继治疗的临床应用提供了新的思路。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：有效量的所述的重组的NK细胞(如1×10⁴-1×10¹²个；较佳的1×10⁵-1×10¹⁰个)；以及药学上可接受的载体。其含有有效量的所述的NK细胞以及药学上可接受的载体。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：有效量的以胆固醇处理的自然杀伤细胞(如1×10⁴-1×10¹²个；较佳的1×10⁵-1×10¹⁰个)。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：含有胆固醇的自然杀伤细胞悬浮液或培养基；较佳地，其中胆固醇浓度为0.5～100ug/ml；较佳地为1～50ug/ml；更佳地为5～20ug/ml。所述的自然杀伤细胞悬浮液或培养基中，自然杀伤细胞的数量如1×10⁴-1×10¹²个；较佳的1×10⁵-1×10¹⁰个。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的重组的NK细胞的药盒。所述的药盒中还可包括选自下组的一种或多种：肿瘤化疗药物；肿瘤放疗药物；以及说明药盒中药物的使用方法的说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：LDLR过表达慢病毒的构建

LDLR过表达慢病毒购买自上海市吉凯基因公司，基因名称为LDLR(NM_000527)，所用目的基因载体为GV358(购自吉凯基因生物科技有限公司)，克隆位点为AgeI/AgeI，目的基因序列为(SEQ ID NO:1)：

ATGGGGCCCTGGGGCTGGAAATTGCGCTGGACCGTCGCCTTGCTCCTCGCCGCGGCGGGGACTGCAGTGGGCGACAGATGCGAAAGAAACGAGTTCCAGTGCCAAGACGGGAAATGCATCTCCTACAAGTGGGTCTGCGATGGCAGCGCTGAGTGCCAGGATGGCTCTGATGAGTCCCAGGAGACGTGCTTGTCTGTCACCTGCAAATCCGGGGACTTCAGCTGTGGGGGCCGTGTCAACCGCTGCATTCCTCAGTTCTGGAGGTGCGATGGCCAAGTGGACTGCGACAACGGCTCAGACGAGCAAGGCTGTCCCCCCAAGACGTGCTCCCAGGACGAGTTTCGCTGCCACGATGGGAAGTGCATCTCTCGGCAGTTCGTCTGTGACTCAGACCGGGACTGCTTGGACGGCTCAGACGAGGCCTCCTGCCCGGTGCTCACCTGTGGTCCCGCCAGCTTCCAGTGCAACAGCTCCACCTGCATCCCCCAGCTGTGGGCCTGCGACAACGACCCCGACTGCGAAGATGGCTCGGATGAGTGGCCGCAGCGCTGTAGGGGTCTTTACGTGTTCCAAGGGGACAGTAGCCCCTGCTCGGCCTTCGAGTTCCACTGCCTAAGTGGCGAGTGCATCCACTCCAGCTGGCGCTGTGATGGTGGCCCCGACTGCAAGGACAAATCTGACGAGGAAAACTGCGCTGTGGCCACCTGTCGCCCTGACGAATTCCAGTGCTCTGATGGAAACTGCATCCATGGCAGCCGGCAGTGTGACCGGGAATATGACTGCAAGGACATGAGCGATGAAGTTGGCTGCGTTAATGTGACACTCTGCGAGGGACCCAACAAGTTCAAGTGTCACAGCGGCGAATGCATCACCCTGGACAAAGTCTGCAACATGGCTAGAGACTGCCGGGACTGGTCAGATGAACCCATCAAAGAGTGCGGGACCAACGAATGCTTGGACAACAACGGCGGCTGTTCCCACGTCTGCAATGACCTTAAGATCGGCTACGAGTGCCTGTGCCCCGACGGCTTCCAGCTGGTGGCCCAGCGAAGATGCGAAGATATCGATGAGTGTCAGGATCCCGACACCTGCAGCCAGCTCTGCGTGAACCTGGAGGGTGGCTACAAGTGCCAGTGTGAGGAAGGCTTCCAGCTGGACCCCCACACGAAGGCCTGCAAGGCTGTGGGCTCCATCGCCTACCTCTTCTTCACCAACC GGCACGAGGTCAGGAAGATGACGCTGGACCGGAGCGAGTACACCAGCCTCATCCCCAACCTGAGGAACGTGGTCGCTCTGGACACGGAGGTGGCCAGCAATAGAATCTACTGGTCTGACCTGTCCCAGAGAATGATCTGCAGCACCCAGCTTGACAGAGCCCACGGCGTCTCTTCCTATGACACCGTCATCAGCAGAGACATCCAGGCCCCCGACGGGCTGGCTGTGGACTGGATCCACAGCAACATCTACTGGACCGACTCTGTCCTGGGCACTGTCTCTGTTGCGGATACCAAGGGCGTGAAGAGGAAAACGTTATTCAGGGAGAACGGCTCCAAGCCAAGGGCCATCGTGGTGGATCCTGTTCATGGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGAACTCCCGCCAAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACTGAAAACATTCAGTGGCCCAATGGCATCACCCTAGATCTCCTCAGTGGCCGCCTCTACTGGGTTGACTCCAAACTTCACTCCATCTCAAGCATCGATGTCAACGGGGGCAACCGGAAGACCATCTTGGAGGATGAAAAGAGGCTGGCCCACCCCTTCTCCTTGGCCGTCTTTGAGGACAAAGTATTTTGGACAGATATCATCAACGAAGCCATTTTCAGTGCCAACCGCCTCACAGGTTCCGATGTCAACTTGTTGGCTGAAAACCTACTGTCCCCAGAGGATATGGTTCTCTTCCACAACCTCACCCAGCCAAGAGGAGTGAACTGGTGTGAGAGGACCACCCTGAGCAATGGCGGCTGCCAGTATCTGTGCCTCCCTGCCCCGCAGATCAACCCCCACTCGCCCAAGTTTACCTGCGCCTGCCCGGACGGCATGCTGCTGGCCAGGGACATGAGGAGCTGCCTCACAGAGGCTGAGGCTGCAGTGGCCACCCAGGAGACATCCACCGTCAGGCTAAAGGTCAGCTCCACAGCCGTAAGGACACAGCACACAACCACCCGACCTGTTCCCGACACCTCCCGGCTGCCTGGGGCCACCCCTGGGCTCACCACGGTGGAGATAGTGACAATGTCTCACCAAGCTCTGGGCGACGTTGCTGGCAGAGGAAATGAGAAGAAGCCCAGTAGCGTGAGGGCTCTGTCCATTGTCCTCCCCATCGTGCTCCTCGTCTTCCTTTGCCTGGGGGTCTTCCTTCTATGGAAGAACTGGCGGCTTAAGAACATCAACAGCATCAACTTTGACAACCCCGTCTATCAGAAGACCACAGAGGATGAGGTCCACATTTGCCACAACCAGGACGGCTACAGCTACCCCTCGAGACAGATGGTCAGTCTGGAGGATGACGTGGCGTGA；

上述核酸序列编码的LDLR多肽为(SEQ ID NO:2)：

MGPWGWKLRWTVALLLAAAGTAVGDRCERNEFQCQDGKCISYKWVCDGSAECQDGSDESQETCLSVTCKSGDFSCGGRVNRCIPQFWRCDGQVDCDNGSDEQGCPPKTCSQDEFRCHDGKCISRQFVCDSDRDCLDGSDEASCPVLTCGPASFQCNSSTCIPQLWACDNDPDCEDGSDEWPQRCRGLYVFQGDSSPCSAF EFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCAVATCRPDEFQCSDGNCIHGSRQCDREYDCKDMSDEVGCVNVTLCEGPNKFKCHSGECITLDKVCNMARDCRDWSDEPIKECGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKAVGSIAYLFFTNRHEVRKMTLDRSEYTSLIPNLRNVVALDTEVASNRIYWSDLSQRMICSTQLDRAHGVSSYDTVISRDIQAPDGLAVDWIHSNIYWTDSVLGTVSVADTKGVKRKTLFRENGSKPRAIVVDPVHGFMYWTDWGTPAKIKKGGLNGVDIYSLVTENIQWPNGITLDLLSGRLYWVDSKLHSISSIDVNGGNRKTILEDEKRLAHPFSLAVFEDKVFWTDIINEAIFSANRLTGSDVNLLAENLLSPEDMVLFHNLTQPRGVNWCERTTLSNGGCQYLCLPAPQINPHSPKFTCACPDGMLLARDMRSCLTEAEAAVATQETSTVRLKVSSTAVRTQHTTTRPVPDTSRLPGATPGLTTVEIVTMSHQALGDVAGRGNEKKPSSVRALSIVLPIVLLVFLCLGVFLLWKNWRLKNINSINFDNPVYQKTTEDEVHICHNQDGYSYPSRQMVSLEDDVA

质粒构建纯化后，利用293T细胞进行病毒包被，随后进行病毒分离纯化、滴度测定。

实施例2：NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞系构建及鉴定

NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞的制备：接种2×10⁵NK92MI细胞于6孔细胞培养板，按100MOI加入过表达GFP的对照病毒或LDLR过表达慢病毒感染24h。24h后换液，72h后检测细胞荧光情况。通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞，分别命名为NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞，扩增培养后用于后续检测。

用IP裂解液裂解NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞并抽提蛋白，运用Western-blot方法检测两种细胞系LDLR表达水平。

结果如图1所示，与NK92MI^GFP细胞相比，NK92MI^LDLR细胞LDLR表达水平明显升高。

实施例3：NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞系LDL-C摄取能力检测

以无血清培养基培养NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞系12小时后，在培养基中加入10μg/ml Dil标记的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，于细胞培养箱孵育4h，以PBS清洗细胞3次后，加入DAPI标记细胞核，然后用4％多聚甲醛固定15分钟。用共聚焦显微镜拍摄细胞荧光图片，并用流式方法检测细胞红色荧光强度，反应细胞摄取LDL-C含量。

结果如图2A～B所示，NK92MI^LDLR细胞摄取LDL-C的能力明显强于对照NK92MI^GFP细胞。

实施例4：NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞活化相关基因检测

收集NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞并抽提RNA，逆转录得cDNA进行qPCR检测。

结果如图3所示，NK92MI^LDLR细胞活化受体类基因(NCR1)，活化标志物类基因(NOS2、GZMB)，细胞因子类基因(IFNγ、TNFα、Peforin)，趋化因子类基因(CCL3、Chemerin)表达均有所上调，证明过表达LDLR可上调NK92MI细胞的活化水平。

实施例5：NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞体外细胞毒性实验

将状态良好的NK92MI^GFP及NK92MI^LDLR细胞与白血病细胞K562以不同比例在100μl无酚红1640培养基中共培养4小时，随后用LDH检测法(LDH检测试剂盒，Dojindo MolecularTechnologies,Inc.，Japan)检测NK92MI细胞系对K562细胞的杀伤能力。

如图4所示，NK92MI^LDLR细胞对K562细胞有更强的杀伤能力，证明其细胞毒性更强。

实施例6：小鼠肿瘤荷瘤模型的建立

在对照组、NK92MI^GFP组和NK92MI^LDLR组细胞体内细胞过继实验中，选取6-8周龄、雄性C57BL/6J小鼠30只，采用皮下注射方式每只接种2×10⁶个黑色素瘤B16F10细胞，8天后观察成瘤情况。选取肿瘤大小相近小鼠24只，随机分为对照组(8只)、NK92MI^GFP组(8只)和NK92MI^LDLR组(8只)。通过尾静脉分别于第12天，第18天注射2×10⁶个NK92MI^GFP或NK92MI^LDLR细胞，并每3天测量肿瘤大小。对于肺癌细胞LLC荷瘤模型，荷瘤方法和分组情况与上述相同。尾静脉注射NK92MI细胞的时间分别为第16天和第24天，每4天测量一次肿瘤大小。

结果如图5A～B，图6A～B所示，在黑色素瘤模型和肺癌模型中，NK92MI^LDLR细胞的过继治疗疗效最好，说明与NK92MI^GFP相比，其具有更强的体内抗肿瘤能力。

实施例7：细胞过继实验的组织学验证

为验证输注的NK92MI细胞是否能够到达肿瘤局部，本发明人对肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色，检测NK92MI细胞系GFP的表达。

结果如图7所示，NK92MI^GFP组和NK92MI^LDLR组的肿瘤局部均有表达GFP的细胞浸润，说明过继治疗所用的细胞系均能够成功到达肿瘤局部。

实施例8：小鼠脾脏来源NK细胞内胆固醇含量检测

取6周龄C57小鼠的脾脏，过细胞滤网得到单细胞悬液，以小鼠NK细胞纯化试剂盒(购自美天旎公司)分离得到小鼠NK细胞。将胆固醇加入细胞培养基中，浓度为10ug/ml，20ug/ml，处理15分钟。收集非处理组和胆固醇处理后的NK细胞，以胆固醇检测试剂盒(购自Sigma公司)测定细胞内游离胆固醇的含量。

结果如图8所示，胆固醇处理可以明显提高小鼠NK细胞内胆固醇含量。

实施例9：小鼠脾脏来源NK细胞体外细胞毒性实验

将状态良好的胆固醇处理和非处理的小鼠NK细胞与小鼠白血病细胞YAC-1以不同比例在100μl无酚红1640培养基中共培养4小时，随后用LDH检测法(LDH检测试剂盒，Dojindo Molecular Technologies,Inc.，Japan)检测小鼠NK细胞对YAC-1细胞的杀伤能力。

图9是以实施例8的胆固醇处理小鼠脾脏内分离得到的NK细胞，处理组和非处理组细胞体外细胞毒性检测。由图9可见，胆固醇处理可以明显增强小鼠NK细胞的杀伤能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种提高人自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法，其特征在于，所述方法为在人自然杀伤细胞中增加人低密度脂蛋白受体的表达：将带有人低密度脂蛋白受体的表达盒的表达构建物引入到人自然杀伤细胞中，所述表达构建物是表达载体，所述表达载体是病毒，所述病毒是慢病毒；或者，

以胆固醇处理人自然杀伤细胞：将胆固醇加入到含有人自然杀伤细胞的溶液、悬浮液或培养基中，使之浓度为10-20ug/ml；

所述的人自然杀伤细胞是体外培养的细胞；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的体外培养为：原代培养或传代培养。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的在人自然杀伤细胞中增加人低密度脂蛋白受体的表达作为单独唯一的提高人自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力的方法。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括：白血病、黑色素瘤、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胆囊癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌。

5.一种人低密度脂蛋白受体或其编码核酸的用途，用于引入到人自然杀伤细胞中，使之过表达，提高人自然杀伤细胞对于肿瘤细胞的杀伤能力；所述的人自然杀伤细胞是体外培养的细胞；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的体外培养为：原代培养或传代培养。

7.一种重组的人自然杀伤细胞，其特征在于，该细胞过表达外源的人低密度脂蛋白受体，所述过表达是：将带有人低密度脂蛋白受体的表达盒的表达构建物引入到人自然杀伤细胞中，所述表达构建物是表达载体，所述表达载体是病毒，所述病毒是慢病毒。

8.权利要求7所述的人自然杀伤细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

9.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求7所述的人自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

10.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：以10-20ug/ml胆固醇处理的人自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

11.一种用于抑制肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：

权利要求7所述的人自然杀伤细胞；或权利要求9或10所述的药物组合物；其中所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。

12.如权利要求11所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中还包括选自下组的一种或多种：

肿瘤化疗药物；

肿瘤放疗药物

使用说明书。