KR100755991B1

KR100755991B1 - 최적화된 유전자 코돈을 가지는 ｅ7 유전자 및 라이소좀타겟팅 시그널 서열을 포함하는 파필로마바이러스 유발질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100755991B1
Application number: KR1020050073966A
Authority: KR
Inventors: 신정임
Original assignee: 신정임
Priority date: 2005-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2007-09-06
Also published as: KR20070019223A

Abstract

본 발명은 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열, 인간 세포에서 번역 효율이 높도록 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 상기 핵산을 포함하는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하고, 보다 상세하게는 자궁경부암을 예방 또는 치료하기 위한 백신 조성물을 제공한다.

파필로마바이러스, E7 유전자 백신, 코돈 최적화, 라이소좀 타깃

Description

최적화된 유전자 코돈을 가지는 Ｅ7 유전자 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 포함하는 파필로마바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 조성물{A pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of papillomavirus-derived diseases comprising E7 gene having optimized genetic code and lysosomal targeting signal sequence}

도 1은 E7유전자백신의 조성(A) 및 세포내 E7단백질발현(B)을 보여준다.

도 2는 세포외 또는 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터들의 근육주사에 의한 항종양 기억 면역효과를 나타낸다.

도 3은 세포외 또는 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터들의 근육주사에 의한 항종양 일차 면역효과를 나타낸다.

도 4는 높은 종양세포로 첼린지시 E7 유전자 코돈이 최적화되고 동시에 라이소좀에 발현이 타깃되는 E7 발현벡터의 근육주사에 의한 항종양 예방 면역효과를 나타낸다.

도 5는 라이소좀 타깃 없이 코돈만 최적화된 E7 발현벡터의 근육주사에 의한 항종양 예방 면역효과를 나타낸다.

도 6은 E7유전자코돈이 최적화되고 동시에 라이소좀에 발현이 타깃되는 E7 발현벡터의 근육주사에 의한 항종양 치료 효과를 나타낸다.

도 7은 라이소좀 타깃 벡터내에 E7 유전자의 코돈이 최적화시 세포주에서 E7 단백질의 발현 증가를 나타낸다.

도 8은 E7 유전자 코돈이 최적화되거니 그렇지 않은 라이소좀 타깃 E7 발현벡터의 근육주사에 의한 E7 특이IgG 반응(A) 및 IgG 아이소타입(IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)의 반응(B)을 나타낸다.

도 9는 E7 유전자 코돈이 최적화되거니 그렇지 않은 라이소좀 타깃 E7 발현벡터의 근육주사에 의한 E7 특이 Th1 세포증식반응 및 CTL 반응을 나타낸다.

도 10은 코돈 최적화 및 라이소좀 타깃을 포함하는 E7유전자백신의 항종양 효과에 대한 CD8+ T 면역세포군의 역할을 나타낸다.

본 발명은 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열, 인간 세포에서 번역 효율이 높도록 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 상기 핵산을 포함하는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

파필로마바이러스(PV)는 만연하고 있는 심각한 질환으로서, 피부 및 점막 표피의 양성, 이형성 및 악성 과증식을 유도하는 것으로 알려져 있다[참조: Mansur et al., Biochim Biophys Acta, 1155:323-345 (1993); Pfister, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol, 99:111-181 (1984); Broker et al., Cancer Cells, 4:17-36 (1986)].

사람 파필로마바이러스(HPV)는 사람의 편평상피의 과증식, 악성 병변(암종) 등과 관련된 DNA 종양 바이러스이다. 수많은 여성들의 생식계가 사람 파필로마바이러스에 의해 감염되어 있다. 파필로마바이러스 감염이 상당수의 여성들에게 있어 결국에는 경부암으로 진전되며, 여성들의 암 사망중 20%가 HPV와 관련된다.

HPV는 암으로 진행되는 병변에 대한 상대적 경향 및 관련된 임상적 병변에 기초하여 고위험 HPV(예: HPV 타입 16, HPV 타입 18) 및 저위험 HPV(예: HPV-6, HPV-11)로 분류될 수 있다. HPV 타입 16의 감염이 자궁경부암 발생의 주요원인이며[참조: zur Hausen, H., Virol., 184: 9-13, 1991], HPV 단백질중 E6 및 E7 단백질이 자궁경부암의 형성 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다[참조: Scheffner, M. et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 88: 5523-5527, 1991; Werness, B. A. et al., Science, 248: 76-79, 1990; Dyson, N. et al., Science, 243: 934-937, 1989]. HPV 타입 16의 E7 단백질이 아미노산 서열이 이의 핵산 서열로부터 유추되며, 문헌[참조: N. Salzman and P. Hawley, "The Papoviridae", Vol. 2, p. 379, Plenum Press, N.Y. (1987)]에 기술되어 있다.

자궁경부암 환자에서 E7 특이 면역반응이 검출되었으며[참조: de Gruijl, T. D. et al., J. Gen. Virol., 77: 2183-2191, 1996], 이는 E7 단백질이 자궁경부암 면역치료의 목적물이 될 수 있음을 의미한다. 따라서, 여러 동물모델에서 E7 단백질을 이용한 예방 및 치료용 백신의 사용 가능성이 연구되어져 왔다. 그 예로는 E7 재조합 단백질[참조: Fernando, G. J. P. et al., Clin. Exp. Immunol., 115, 1999], E7 발현 유전자 백신[참조: Hung, C. F. et al., Cancer Res., 61: 3698-3703, 2001], E7 또는 E7의 세포독성 T 임파구(CTL) 에피토프를 발현하는 미생물 및 바이러스 벡터[참조: Lamikanra, A. et al., J. Virol., 75: 9654-9664, 2001; Cheng, W. F. et al., Hum. Gene Ther., 13: 553-568, 2002; Liu, D. W. et al., J. Virol., 74: 2888-2894, 2000; Londono, L. P. et al., Vaccine, 14: 545-552, 1996], 및 E7 CTL 에피토프[참조: Feltkamp, M. C. et al., Eur. J. Immunol., 23: 2242-2249, 1993] 등의 이용을 들 수 있다. 이들 연구에서, CD4+ T 임파구 및 특이적인 CTL 기능이 종양생성의 억제에 관여하는 면역세포군으로 밝혀졌다.

유전자 백신은 항원의 세포내 발현 위치를 조정하거나 또는 면역조절물질을 발현하는 유전자를 동시에 주사하는 방법을 통하여 보호면역성 및 항원 특이 면역반응을 증가시킬 수 있다.

E7 유전자를 항원으로 이용한 백신에서, 면역반응을 증대시키기 위한 여러 가지 시도가 진행되었다. 라이소좀 타깃 서열을 결합시켜 유전자백신으로 동물 주사시 항종양보호면역성을 증가시키며 [참조: Ji, H. et al., Hum. Gene Ther., 10: 2727-2740, 1999; Smahel, M. et al., Virology, 281: 231-238, 2001] E7 유전자 에 박테리아의 톡신, 칼레티큐린, VP 22 및 열반응단백질을 코딩하는 유전자를 결합시도 항원특이면역반응 및 항종양면역효과를 증가시킨다고 알려져 있다 [참조: Hung, C. F. et al., Cancer Res. 61: 3698-3703, 2001; Cheng, W. F. et al., J. Clin. Invest., 108: 669-678, 2001; Hung, C. F. et al., J. Virol., 76: 2676-2682, 2002; Hsu, K. F. et al., Gene Ther. 8: 376-383, 2001]. 또한, 아폽토시스를 억제하는 단백질 또는 세린분해효소를 코딩하는 유전자와 동시 주사시도 항원유전자백신의 항종양효과를 증가시키다고 알려져 있다 [참조: Kim T. W. et al., J. Clin. Invest. 112: 109-117, 2003; Kim, T. W. et al., Cancer Res. 64: 400-405, 2004]. 또한, 헤르피스바이러스 gD유전자의 세포외 분비 유도 타깃유전자 부위 또는 세포막 타깃 서열을 제거시 이들 유전자백신의 항원특이 면역반응 및 항바이러스 보호면역성에 영향을 준다고 알려져 있다 [참조: Higgins, T. J. et al., J. Infect. Dis., 182: 1311-1320, 2000; Strasser, J. E. et al., J. Infect. Dis., 182: 1311-1320, 2000]. 특히, 라이소좀 타깃 서열은 여러 다른 항원에 있어서도 그 효과가 증명되었다 [참조: Raviprakash, K. et al., Virology, 290: 74-82, 2001: Lu, Y. et al., Vaccine 21: 2178-2189, 2003: Marques, E.T. et al., J. Biol. Chem. 278: 37926-37936, 2003].

그러나 아직까지 E7 유전자를 항원으로 사용하는 백신은 그 효과가 미흡하고 이는 E7을 코딩하는 핵산을 백신으로 이용하기 위해 해결해야 하는 문제점 중의 하나이다.

이런 배경하에, 본 발명자는 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 인간 등의 포유류 세포에서 발현 효율이 높은 유전자 코돈으로 치환하고 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 결합시켜 마우스에 투여할 경우, E7 특이적 항체 반응 및 CTL 세포증식반응 등의 면역 반응이 증가하며 종양의 예방 및 치료 활성이 예측하지 못한 수준으로 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열, 번역 효율이 높도록 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 투여하여 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하기 위함이다.

항원으로 작용하는 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 DNA 백신 등으로 사용할 때, 이의 효능을 증대시키기 위하여 본 발명자는 하기와 같은 특징을 가지는 핵산을 사용하였다.

우선, 야생형의 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 유전자 코돈을 포유류, 특히 인간 세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 치환시킴으로써 세포내 발현 효율을 극대화시켰다. 또한, 상기 방법으로 치환된 유전자 코돈으로 이루어진 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열과 연결함으로써 항원 특이적 면역 반응을 증대시키고자 하였다. 이와 같은 특징을 모두 가지는 핵산은 이런 특징을 가지지 않거나 또는 단독의 특징을 가지는 핵산과는 달리 예측하지 못한 수준으로 면역 반응이 극대화됨을 확인할 수 있었다.

하나의 양태로서, 본 발명은(1)분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열, (2)하기와 같이 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 (3)라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.

Ala(A)의 코돈 GCT 및 GCA가 GCC로 치환되고;

Arg(R)의 코돈 CGT, CGA, CGG 및 AGA가 CGC로 치환되고;

Asn(N)의 코돈 AAT가 AAC로 치환되고;

Asp(D)의 코돈 GAT가 GAC로 치환되고;

Cys(C)의 코돈 TGT가 TGC로 치환되고;

Gln(Q)의 코돈 CAG가 CAA로 치환되고;

Clu(E)의 코돈 GAA가 GAG로 치환되고;

Gly(G)의 코돈 GGT 및 GGA가 GGC로 치환되고;

His(H)의 코돈 CAT가 CAC로 치환되고;

Ile(I)의 코돈 ATT 및 ATA가 ATC로 치환되고;

Leu(L)의 코돈 CTC, CTT, CTA, TTA 및 TTG가 CTG 또는 TTG로 치환되고;

Lys(K)의 코돈 AAA가 AAG로 치환되고;

Phe(F)의 코돈 TTT가 TTC로 치환되고;

Pro(P)의 코돈 CCT, CCA 및 CCG가 CCC로 치환되고;

Ser(S)의 코돈 TCT 및 TCA가 TCC 또는 AGC로 치환되고;

Thr(T)의 코돈 ACT, ACA 및 ACG가 ACC로 치환되고;

Val(V)의 코돈 GTA 및 GTT가 GTG로 치환되고;

Tyr(Y)의 코돈 TAT가 TAC로 치환된다.

E7 단백질은 파필로마바이러스의 대표적인 항원 단백질이다. 본 발명에서 용어, “항원”이란 면역 반응을 일으킬 수 있는 분자를 의미하고, 상기 항원을 사람을 포함한 동물에게 투여함으로써 면역 반응을 자극하게 된다. 야생형의 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 유전자 코돈을 포유류, 특히 인간 세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 치환시킴으로써 세포내 발현 효율을 극대화시킬 수 있다.

하나의 아미노산은 1 이상의 유전자 코돈에 의해 코딩되고 이를 특이적으로 인지하는 tRNA에 의해 번역된다. 동일 아미노산을 코딩하는 유전자 코돈이라고 하더라도 세포내에서 이를 인지하는 tRNA의 이용 빈도는 상당하게 차이가 난다. 예들 들어, Ala의 경우, GCC, GCT, GCA 및 GCG에 의해 코딩되나 이들 코돈이 인간 세포의 tRNA에 의해 인지되는 확률은 상당히 차이가 난다. 구체적으로, GCC 코돈이 이를 인지하는 tRNA에 의해 인식될 확률은 약 53% 이지만, GCT(17%), GCA(13%), GCG(17%) 코돈이 이를 인지하는 tRNA에 의해 인식될 확률은 매우 낮다. 따라서 야생형의 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 유전자 코돈을 인간 세포에서 tRNA에 의해 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환시킬 경우, 세포내에서 E7 단백질의 발현 정도는 월등히 증가된다.

이러한 개념 하에, 본 발명자는 파필로마바이러스 타입 16 E7 단백질의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 코딩하는 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되지만 최종 생성된 단백질의 서열상에는 변화가 없는 유전자 코돈으로 침묵 돌연변이(silent mutation)시켰다.

상기 개념을 적용하여 모든 종류의 파필로마바이러스 유래의 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 치환시킬 수 있다. 예들 들어, 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus), 유럽고나리 파필러마바이러스(European elk papillomavirus), 사슴 파필로마바이러스(Deer papillomavirus), 양 파필로마바이러스(Ovine papillomavirus), 소 파필로마바이러스(Bovine papillomavirus), 말 파필로마바이러스(Equine papillomavirus), 다유방쥐 파필로마바이러스(Mastomys natalensis papillomavirus), 솜꼬리토끼 파필로마바이러스(Cottontail rabbit papillomavirus), 고양이 파필로마바이러스(Feline papillomavirus), 개구강 파필로마바이러스(Canine oral papillomavirus), 코끼리 파필로마바이러스(Elephant papillomavirus), 순록 파필로마바이러스(Reindeer papillomavirus), 붉은털원숭이 파필로마바이러스(Rhesus monkey papillomavirus) 및 피그미 침팬지 파필로마바이러스(Pigmy chimpanzee papillomavirus) 등에서 유래한 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 치환시킬 수 있다. 보다 바람직하게는 인간 파필로마바이러스 특히, 자궁 경부암 등의 심각한 질환을 유발하는 인간 파필로마바이러스 타입 16 또는 타입 18 유래의 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 치환시킬 수 있다.

또한, 상기와 같이 유전자 코돈이 치환된 E7 단백질의 전체 아미노산 서열 뿐만 아니라 항원으로서의 활성을 가지는 범위 내에서 이의 단편을 항원으로 사용할 수 있다. 예들 들어, 파필로마바이러스 타입 16 과 타입 18의 E7 단백질은 각각 98 과 105 개의 아미노산 길이를 가지고, 전체 길이의 E7 단백질뿐만 아니라, 이의 단편을 항원으로 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 10 내지 105개의 아미노산 길이를 가지는 단백질을 코딩하는 핵산이고, 보다 바람직하게는 80 내지 100개의 아미노산 길이를 가지는 단백질을 코딩하는 핵산이다.

또한, 상기와 같이 유전자 코돈이 치환된 E7 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. E7 단백질의 변이체란 E7 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 또한, E7 단백질은 글리코실화되거나 리피드화(lipidated)될 수 있으며, 항원 제시(presentation)를 증진시키고 항원의 항원 제시 세포에의 표적을 향상시키는 분자를 포함하도록 유도체화 될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 파필로마바이러스 타입 16의 E7 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 유전자 코돈이 상기와 같이 치환된, 서열번호 17로 기재되는 핵산을 사용하였다.

또한, 상기 방법으로 치환된 유전자 코돈으로 이루어진 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열과 연결함으로써 항원 특이적 면역반응을 증대시키고자 하였다.

본 발명에서 “타겟팅 시그널 서열(targeting signal sequence)"이란, 이와 연결되는 단백질의 이동(transprot)을 지시하는 펩타이드를 의미하고, 본 발명의 목적상, 타겟팅 시그널 서열은 라이소좀으로 연결된 단백질을 이동시키는 라이소좀 타겟팅 시그널 서열이다.

라이소좀으로 타겟팅하는 능력을 가지는 한 시그널 서열의 종류는 특별히 제한되지 않고, 라이소좀으로 타겟팅되는 것으로 알려진 단백질인 LAMP1(Lysosome- associated membrane protein 1), LAMP2(Lysosome-associated membrane protein 2), CD63 또는 LAP 단백질에서 유래한 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 예로 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 LAMP1에서 유래한 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 사용하였다. 상기 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 상기의 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열이 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 하부(downstream)에 위치한다.

또한, 상기의 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산은 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열은 특별히 한정되지 않고, 본 발명에서는 herpes simplex virus-2의 gB유전자에서 유래한 분비 시그널 서열을 사용하였다. 상기 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 상기의 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열은 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 상부(upstream)에 위치한다.

따라서, 바람직한 양태에서 포유류 세포, 특히 인간세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 상부에 분비서열을 코딩하는 핵산 서열을 하부에는 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있으며, 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 제공된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 분비 시그널 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트를 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여 되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제기원(replication origin)을 포함한다. 게놈 자체에 통합될 수 있는 벡터도 사용 가능하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 E7 단백질의 타겟팅 시그널 서열 및 유전자 코돈에 따른 파필로마바이러스에 의한 세포증식성 질환 유발에 대한 예방 및 치료 효과를 살펴보았다.

다양한 발현 벡터를 마우스에 3회 주사하여 백신화시킨 후에 2×10⁴의 종양세포로 마우스에 종양을 유발하여 E7 단백질의 타겟팅 부위에 따른 종양 예방 효과를 살펴보았다. 그 결과, 세포핵 타깃되는 E7 발현벡터(pcDNA3-E7)로 주사된 마우스는 90%, 세포막 타깃 되는 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7/TMR)로 주사된 마우스는 70%의 종양 발생율을 보였다. 반면, 분비되는 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7) 및 라이소좀 타깃 되는 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7/LAMP)로 주사된 마우스에는 종양이 전혀 발생되지 않았다(표 1, 도 2). 이에, E7 단백질이 분비될 때와 라이소좀 타깃될 때의 종양 예방 효과를 비교하여 위하여, 마우스를 발현 벡터로 2회 주사하여 백신화시킨 조건에서, 1×10⁴의 종양 세포로 종양을 유발하고 마우스의 종양 발생 여부를 살펴보았다. 그 결과, 분비되는 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7)로 주사된 마 우스에서는 100% 종양이 발생하였으나 라이소좀 타깃 되는 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7/LAMP)로 주사된 종양이 전혀 발생되지 않았다(도 3). 이를 통하여, E7 단백질이 라이소좀 타겟팅될 때 종양 예방 효과가 월등히 증가함을 알 수 있다.

또한, E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 인간 세포에서 발현 효율이 높은 유전자 코돈으로 치환되었을 때의 종양 예방 효과를 살펴보았다. 다양한 pcDNA3-Sig/E7/LAMP 및 pcDNA3-Sig/sE7/LAMP를 마우스에 3회 주사하여 백신화시킨 후에 5×10⁵의 종양세포로 마우스에 종양을 유발하였다. 그 결과, 라이소좀 타깃 발현에서는 주사한 마우스의 60%에서 종양이 발생되었으나, 코돈이 최적화된 E7 유전자의 라이소좀 타깃 발현에서는 종양이 전혀 발생되지 않았다(표 2). 그러나, 최적화된 코돈을 가지는 E7 유전자만으로는 종양 예방 효과를 기대할 수 없었다(도 4). 이를 통하여, E7 단백질의 라이소좀 타겟팅 시그널 서열 및 최적화된 유전자 코돈이 모두 가지는 조건에서만 파필로마바이러스 세포증식성 질환 유발에 대해서 월등히 높은 예방 효과를 가짐을 알 수 있었다.

상기의 라이소좀 타깃되고 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 치환된 E7 단백질을 코딩하는 핵산은 예방뿐만 아니라 치료 효과도 가진다. 종양 세포로 종양을 먼저 유발한 후에 발현 벡터를 주입하여 살펴본 결과, 코돈이 최적화되고 라이소좀 타겟되는 E7 단백질을 코딩하는 핵산을 투여한 마우스에는 70%의 종양 억제 효과를 보였다.

실제, 최적화된 코돈이 이용된 E7 유전자가 라이소좀에 타깃되어 발현될 때 에만 E7 특이 항체가 생성되고(도 8) 최적화된 코돈이 이용된 E7 유전자가 라이소좀에 타깃되어 발현될 때 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 임파구(CTL) 활성이 급격히 증가하였다(도 9 및 도 10). 이는 유전자 백신의 경우에서 CD8+ 임파구군이 TC-1 종양세포주에 대해 항종양기능을 가진다는 다른 연구 결과와 일치하는 것이다[참조: Hung, C. F. et al., Cancer Res., 61: 3698-3703, 2001; Lamikanra, A. et al., J. Virol., 75: 9654-9664, 2001; Cheng, W. F. et al., Hum. Gene Ther., 13: 553-568, 2002; Liu, D. W. et al., J. Virol., 74: 2888-2894, 2000; Lin, K. Y. et al., Cancer Res., 56: 21-26, 1996].

이와 같이 본 발명은 E7 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 코돈을 인간 등의 포유류 세포에서 발현 효율이 높은 유전자 코돈으로 치환하고 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 결합시켜 개체의 세포내로 투여할 때 강력하고 지속적인 세포성 및 체액성 면역 반응을 유도하게 되어, 파필로마바이러스 감염시 즉각적으로 면역반응을 가동하여 파필로마바이러스 감염에 의해 유발되는 세포 증식성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다는 것을 밝힌 것에 의의가 있다.

따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 “세포 증식성 질환”은 파필로마바이러스 감염에 의해 주변 조직과 형태상 상이하게 보이는 악성 및 비악성의 과증식된 세포군이 형성되 는 질환을 의미하고, 성병성의 사마귀(anogenital warts), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁경부이형성(cervical dysplasia), 항문암(anal cancer), 항문이형성(anal dysplasia), 유두종(papillomas), (prostatic cancer), 보웬양 구진증 및 음부암 등을 예로 들 수 있다.

본 발명에서 용어, “예방”이란 상기 핵산을 포함하는 조성물의 투여로 파필로마바이러스 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료”란 상기 핵산을 포함하는 조성물의 투여로 파필로마바이러스 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 상기 핵산을 단독으로 투여되거나 당 분야에 공지된 다른 다른 보조제 또는 사이토킨과 공동 투여될 수 있다. 공동 투여될 수 있는 면역 반응을 자극할 수 있는 사이토킨은 예를 들어 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, TNF-α, INF-γ, Flt3 리간드 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩파이드 독소 등이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 핵산을 투여하여 파필로마바이러스에 의해 유발되는 세포 증식성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "환자"는 파필로마바이러스 감염으로 인한 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가진 인간, 고나리, 사슴, 양, 소, 말, 토끼, 고양이, 개, 코끼리, 순록, 언숭이, 침팬지 등의 동물을 의미한다. 상기 핵산을 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에게 투여함으로써, 상기에서 언급한 파 필로마바이러스 감염 에 의한 유발되는 세포 증식성 질환, 구체적으로 사마귀(anogenital warts), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁경부이형성(cervical dysplasia), 항문암(anal cancer), 항문이형성(anal dysplasia), 유두종(papillomas), 전립선암(prostatic cancer), 보웬양 구진증, 음부암 등을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 파필로마바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식은 피하, 피내, 근육, 정맥 투여 등이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 성인을 기준으로 1회에 0.01 내지 0.2 ㎎/㎏이 바람직하며 2 내지 4주 간격으로 1회 이상 투여 가능하다.

이하, 본원 발명을 구체적인 실시예를 들어 설명하려고 한다. 기술된 실시예는 단지 설명을 위한 것으로서 이로써 본원 발명이 제한되지 않는다.

실시예

통계분석은 스튜던츠 T 시험(The Student's t test) 또는 카이제곱시험 (Chi square test)를 이용하였고, p 수치가 < 0.05일 때 통계적 유의성을 두었다.

실시예 1: 다양한 타깃유형을 가진 E7 발현벡터의 제조

파필로마바이어스 타입 16의 E7 발현이 세포외, 세포막, 라이소좀에 타깃되게 하는 핵산 서열을 PCR 방법을 이용하여 클로닝하였다.

E7 유전자는 2개의 프라이머, 즉, 5'-CGGGATCC CCAGGAGGTATGCATGGA-3' (서열번호 1: BamHI 절단부위 포함) 및 5'-GAGCTCGAGGAATTCTTATGGTTTCTG-3' (서열번호 2: EcoRI 절단부위 포함)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 파필로마바이러스 타입 16의 E7 단백질(서열번호 4)을 코딩하는 유전자(서열번호 3)를 pET-E7벡터 [참조: Kim T.Y. et al., Cancer Res. 62: 7234-7240, 2002] 에서부터 얻었다. 얻어진 E7 유전자를 제한효소(BamHI 및 XhoI)을 이용하여 절단 후 DNA 겔에서 E7 유 전자를 분리하였다. 그 후 분리된 E7 유전자를 pcDNA3 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝시켰다.

pcDNA3-Sig/E7 벡터를 제작하기 위하여 단백질 분비 시그널 서열을 pTV2-gB (부산대학 Dr. K. L. Jang 제공)에서 2개 프라이머, 5'-TTGGGATCCATGTCCCCGTTTTACGGCTACCG-3' (서열번호 5: Bam HI) 및 5'-GAAGATCTCTGCAGGGCCGCCGACGCCACCGC-3' (서열번호 6: Pst I)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 단백질 분비 시그널 서열(서열번호 7)을 얻었다. 또한, E7 유전자는 2개 프라이머, 5'-GAAGATCTCTGCAGATGCATGGAGATACACCT-3'(서열번호 8: Pst I) 및 5'-CTCGAGGAATTCTTATGGTTTCTG-3'(서열번호 9:　Xho I, Eco RI)로 얻고 제한효소 (Bam HI, Pst I 및 Xho I)들을 이용하여 처리한 후 HSV-2 gB의 단백질 분비 시그널 서열(Bam HI-Pst I DNA) 및 E7 유전자 (Pst I-Xho I DNA) 부분들을 pcDNA3 벡터에 함께 클로닝하였다.

pcDNA3-Sig/E7/TMR 벡터를 제작하기 위하여 E7 유전자는 2개 프라이머, 5'-GAAGATCTCTGCAGATGCATGGAGATACACCT-3' (서열번호 8：Pst I) 및 5'- CGGAATTCTGGTTTCTGAGAACAGAT-3' (서열번호 10：Eco RI)를 이용하여, 세포막 타깃 서열 (TMR 서열)(서열번호 11)은 pAPL-gD [Sin, J.I. et al., J. Virol. 74: 11173-11180, 2000] 에서 2개 프라이머, 5'-CGGAATTCGGTATTGCGTTTTGGGTA-3'(서열번호 12: Eco RI) 및 5'-TTTCTAGAGCTAGTAAAACAATGGCTG-3'(서열번호 13: Xba I)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 얻었다. 이들 서열들은 Pst I, Eco R1 및 Xba I으로 제한효소 처리하여 E7 유전자부분 (Pst I-Eco RI), 세포막 타깃 서열 (Eco R1- Xba I), 단백질 분비 시그널 서열(Bam HI-Pst I)과 함께 pcDNA3 벡터에 클로닝하였다.

pcDNA3-Sig/E7/LAMP벡터를 제작하기 위해서 LAMP-1 [Guarnieri, F.G. et al., J. Biol. Chem. 268: 1941-1946, 1993] 유전자에서 2개 프라이머, 5‘-CGGAATTCAACAACATGTTGATCCCCA-3' (서열번호 14: Eco RI) 및5'-TTTCTAGACTAGATGGTCTGATAGCC-3' (서열번호 15: Xba I)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 라이소좀 타깃 서열(서열번호 16)을 얻었다. 제한효소 처리된 LAMP 유전자부분 (Eco RI-Xba I)은 pcDNA3-Sig/E7/TMR의 Eco RI-Xba I 의 TMR 유전자부분과 교체하였다.

pcDNA3-Sig/sE7/LAMP를 제조하기 위하여 바이러스 E7 유전자는 코돈이 최적화된 E7 유전자로 교체되었다. 코돈이 최적화된 E7 유전자는 (주)바이오닉스에 의뢰하여 합성주문구입하였다 (서열번호 17). 발현벡터에 클로닝하기 위하여 2개 프라이머, 5‘-GAAGATCTCTGCAGATGCACGGCGACACCCCCACC-3’ (서열번호 18: Pst I) 및 5‘-CGGAATTCGGGCTTCTGGGAGCAGATG-3’(서열번호 19: Eco RI)를 이용하여 역전사효소연쇄반응으로 얻었다. 제한효소 (Pst I 및 Eco R1)로 처리 후 얻어진 E7유전자가 코돈이 최적화된 유전자로 sE7으로 명명하였고 pcDNA3-Sig/E7/LAMP의 Pst I-Eco RI의 E7 유전자부분과 교체하였다. 이들 유전자의 정확도는 유전자분석을 통해 오차가 없음을 확인하였다. 라이소좀타깃이 되지 않는 E7 코돈이 최적화된 발현벡터 pIn2-eE7 [Cid Arregui, A. et al., J. Virol. 77: 4928-4937, 2003]는 컨터롤로 항종양효과의 연구에 사용되었다.

상기 제조된 E7 유전자 발현벡터들은 Lipofectamine 시약(Invitrogen)을 이용하여 세포주에 전달한 후 2일간 배양하였다. 이들 세포에서 세포단백질을 얻은 후 각 샘플 당 40 μg 씩 12% SDS-PAGE에서 분리시킨 후, 니트로셀룰로즈 막(Amersham, Piscataway, NJ)에 부착시켰다. 이어서, 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST 용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 1시간 담근 후 E7 특이항체(Oncogene, Boston, MA)와 12시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응 후 TBST 용액으로 수회 세척하고, 최종적으로 항-마우스 IgG-HRP(Sigma)와 3시간 동안 반응시킨 후 ECL 용액(Amersham)에서 발색시켰다.

제조된 다양한 E7 발현벡터(도 1A)는 각각의 크기에 상응하는 E7단백질이 세포주에서 발현되었다. 즉, 재조합 단백질 크기는 SDS-PAGE에서 16-24 kD 단백질 사이의 크기로 확인되었으며 면역블롯 검정(immunoblot assay)에서 E7 특이항체와 반응하였다 (도 1B). 이는 제조된 벡터들이 E7 융합단백질을 발현함을 보여 준다.

실시예 2: 항종양 활성

생후 4 내지 6주된 C57BL/6 마우스(대한 바이오링크사)를 동물 모델로 사용하였으며, 50 μg의 E7 발현벡터들을 0.25% bupivacaine-Cl이 첨가된 생리식염수 100 μl에 희석하고 28-게이지 주사침(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)으로 근육 주사하였다.

종양 유도에 사용된 세포주는 TC-1 세포이며, 존홉킨스대학의 Dr. Wu에게서 제공받았고, cRPMI (400 μg/ml의 G418)에서 배양되었다. TC-1은 E7 발현 세포주 로서 C57BL/6 마우스의 폐상피세포(primary lung epithelial cells)에 파필로마바이러스 타입 16의 E6 및 E7, 및 ras 유전자를 이용하여 만든 세포주이다[참조: Wu, T. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11671-11675, 1995]. 각각의 예방 및 치료 효과를 검정하기 위하여 2 x 10⁵및 1-5 x 10⁴개의 TC-1 세포주를 C57BL/6 마우스의 피하에 주사하였다. 다양한 주사 용량이 이미 발표된 바 있다[참조: Lin, K. Y. et al., Cancer Res., 56: 21-26, 1996]. TC-1 세포주는 생리식염수로 2번 세척한 후 주사에 사용하였다.

실시예 2.1: 종양 예방 활성

상기 마우스 동물 모델에서 본원에서 제조한 E7 발현벡터에 의해 유도되는 항종양 효과를 살펴보았다. 각 그룹의 동물(n=10)에 50 μg의 실시에 1에서 제조한 다양한 E7 발현벡터들을 0주, 2주 및 6주에 근육 주사하였다. 마지막 주사 후 2주째에 각 동물당 1 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주를 피하 주사하여 종양을 유발시켰다.

표 1은 E7 발현벡터들을 마우스당 50 μg씩 3번에 걸쳐 근육 주사한 후 1 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주로 주사하여 종양을 유발한 후 종양이 발생한 마우스의 수를 시간별로 살펴본 결과를 나타낸다.

표 1과 같이, 세포핵에 타깃되는 E7 발현벡터 (pcDNA3-E7)로 주사된 그룹을 TC-1 종양세포주로 챌린지시, 대조구와 유사한 90%의 동물에서 종양이 탐지되었다. 한편, 세포막 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 (pcDNA3-Sig/E7/TMR)의 경우에서는 30%의 동물에서 종양이 탐지되지 않았다. 또한, 세포외 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 (pcDNA3-Sig/E7) 및 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 (pcDNA3-Sig/E7/LAMP)에서는 시간이 경과하여도 종양이 전혀 나타나지 않고 100% 항종양 예방 효과를 나타내었다.

표 1과 같이 종양 챌린지 후 50일 뒤에도 전혀 종양이 전혀 생기지 않은 두 동물군 (세포외 타깃 서열 또는 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터)에서 각 동물당 2x10⁵ TC-1 종양세포주로 피하 첼린지 한 다음 시간별로 종양의 생성정도 및 크기를 측정하였다(도 2). 종양 크기는 종양의 평균치[(a+b)/2, a: 종양의 장축길이, b: 종양의 단축길이]로 계산되었다. 종양 주사 후 1달 동안 1주일에 2회씩 측정기를 이용하여 종양 크기를 측정하였다.

도 2의 결과를 보면 종양 세포로 재차 첼린지 후 시간의 경과에 따라 세포외 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터로 주사된 모든 동물군에서 높은 수의 종양세포로 재차 첼린지시 종양생성이 탐지되고 시간이 지남에 따라 종양의 크기가 증가하였다. 반면, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터로 주사된 동물의 경우에서는 재차 첼린지 시도 처음 몇 일은 종양이 탐지되었지만 시간이 지남에 따라 모든 동물에서 종양이 탐지되지 않았다. 이는 항종양 기억 면역반응은 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현백터에서 더 효과적으로 유도됨을 증명한다.

도 3은 세포외 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 (pcDNA3-Sig/E7) 및 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 (pcDNA3-Sig/E7/LAMP)간의 일차적 항종양 예방효과를 비교하기 위하여 50 μg의 E7 발현벡터를 0주 및 2주째 2번 주사하고 4주째 1 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주로 주사한 후의 항종양 활성을 살펴본 결과이다. 세포외 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터로 투여된 모든 동물군에서 종양생성이 탐지되었지만, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터로 투여된 동물에서는 종양생성이 전혀 탐지되지 않았다.

표 1, 도 2 및 도 3에서 입증되는 바와 같이, 라이소좀에 타깃 서열에 결합된 E7 발현벡터가 E7 발현 종양세포주의 성장을 억제할 수 있는 가장 우수한 일차적 면역 반응 및 기억면역반응을 유도함을 증명한다.

다음으로, 최적화된 유전자 코돈을 가지는 E7 유전자를 라이소좀 타깃 서열과 연결시킬 때 유도되는 항종양 예방효과 정도를 살펴보았다. 표 2는 야생형의 E7 유전자 및 코돈이 최적화된 E7유전자를 가지는 라이소좀 타깃 발현벡터를 0, 2, 6주에 50 μg 씩 근육 주사한 다음 8주에 5 x 10⁴ E7 발현 종양세포주로 피하 첼린지한 후, 종양이 발생한 마우스의 수를 시간별로 살펴본 결과이다.

표 2에서 보면 일반 E7 발현벡터의 경우 10 마리의 동물에서 6-7마리에 종양이 탐지되어 30-40%의 항종양 예방효과를 보여주었다. 반면, 코돈이 최적화된 E7 유전자의 라이소좀 타깃 발현은 100%의 동물에서 종양이 생성되지 않았다. 대조구에서는 모든 동물에서 종양생성이 탐지되었고 시간이 지남에 따라 종양의 크기가 증가하였다. 이는 최적화 코돈의 사용과 함께 라이소좀 타깃이 항종양예방면역효과를 증가시키는데 더 효율적이었음을 보여준다.

도 4는 최적화 코돈을 사용하고 라이소좀 타깃 서열를 가지는 E7 유전자의 항종양 예방면역 효과를 살펴보기 위해서 이들 E7 발현벡터를 0주 및 2주째 동물당 50 μg씩 근육주사한 다음 4주째 2 x 10⁵ 종양세포주로 피하 첼린지한 후의 종양 생성된 마우스를 살펴본 결과이다. 라이소좀 타깃 E7 발현벡터의 경우 10 마리의 동물에서 첼린지시 10마리 모두에서 종양이 탐지되었다. 반면, 코돈이 최적화된 E7유전자의 라이소좀 타깃 발현은 모든 동물에서 종양생성이 탐지되지 않았다.

라이소좀 타깃 서열이 결합되지 않은 최적화된 코돈을 가진 E7 유전자의 항종양 예방면역 효과를 살펴보기 위하여, 이들 E7 발현벡터들을 각 동물당 50 μg씩 0주, 2주에 근육주사하고, TC-2 세포를 4주째 2 x 10⁴ 종양세포주로 피하주사하여 종양생성을 측정하였다. 또한, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 최적화된 코돈을 가진 E7 발현벡터 유전자 (pcDNA3-Sig/sE7/LAMP)와의 종양생성율을 비교하여 보았다. 도 5와 같이, 최적화된 코돈을 가지는 E7 유전자의 라이소좀 타깃 발현시 모든 동물에서 종양생성이 전혀 탐지되지 않았으나, 라이소좀 타깃되지 않은 최적화된 코돈을 가지는 E7 유전자의 경우, 대조구와 유사한 수준으로 모든 동물에서 종양생성이 관찰되었다. 우수한 항종양 에방 효과를 위해서는 항원 유전자의 코돈 최적화 및 라이소좀 타깃 서열 모두가 요구됨을 증명하는 바이다.

실시예 2.2: 종양 치료 활성

상기 마우스 동물 모델에서 종양세포주로 피하 첼린지 후 E7 발현벡터의 근육주사에 의해 유도되는 항종양 치료효과를 관측하였다. 각각의 그룹의 동물에 1 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주를 피하주사하고, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터 및 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화된 E7 발현벡터를 근육에 1주 간격으로 3번 근육 주사하였다. 주사 후 1주일에 2회씩 측정기를 이용하여 종양크기를 측정하였다. 종양크기는 종양의 평균치[(a+b)/2, a: 종양의 장축길이, b: 종양의 단축길이]로 계산되었다.

도 6은 1 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주를 피하주사하고 1일 뒤 대조구 벡터(A), 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현벡터(B), 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화된 E7 발현벡터(C)를 근육에 1주 간격으로 3번 근육 주사하면서 각 그룹의 동물 5마리당 종양의 크기를 시간별로 도표화하여 비교하였다. 도 6D에서는 종양세포로 첼린지된 다음 각각의 유전자백신으로 치료 주사된 전체 동물 10 마리에서 종양의 성장이 억제된 수의 퍼센트를 보여준다.

종양 챌린지 후 종양을 갖는 마우스의 종양 감소율을 관측한 결과 라이소좀 타깃 서열이 결합된 E7 발현백터로 주사된 동물군에서는 30%의 동물에서만 종양이 억제되고 나머지 동물에서는 종양이 나타난 반면, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 최적화된 코돈을 가진 E7 발현백터로 주사된 동물군에서는 70%의 동물에서 종양이 완전히 억제되었다. 반면, 대조구에서는 모든 동물에서 종양의 억제가 전혀 탐지되지 않았다(0%)(도 6). 이는 E7 유전자의 코돈 최적화 및 E7의 라이소좀 타깃 모두를 가지는 E7 발현벡터의 경우에서 체내에서 이미 형송되는 E7 발현 종양세포주의 성장을 더 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2.3: 항종양 활성 증가 기전

E7 항원유전자의 코돈 최적화 및 라이소좀 타깃에 의한 항종양 예방 및 치료효과의 증가 기전을 규명하기 위하여 라이소좀 타깃 서열이 결합되거나 또는 되지 않은 최적화된 코돈을 가진 E7 발현벡터(pcDNA3-Sig/E7/LAMP 및 pcDNA3-Sig/sE7/LAMP)를 위의 방법으로 세포주에 전달한 후 2일간 배양하였다. 이들 세포에서 세포단백질을 얻은 후 각 샘플 당 20 μg씩 12% SDS-PAGE에서 분리시킨 후, 니트로셀룰로즈 막(Amersham, Piscataway, NJ)에 부착시켰다. 이어서, 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST 용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20]에 1시간 담근 후 E7 특이 항체(Oncogene, Boston, MA)와 12시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응 후 TBST 용액으로 수회 세척하고, 최종적으로 항-마우스 IgG-HRP(Sigma)와 3시간 동안 반응시킨 후 ECL 용액(Amersham)에서 발색시켰다.

세포주 라이소좀 타깃 서열이 결합된 최적화된 코돈을 가진 E7 발현벡터의 경우, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 최적화된 코돈을 가진 E7 발현벡터에 비하여 E7단백질을 과발현시킴을 SDS-PAGE 및 면역블롯 검정(immunoblot assay) 결과 알 수 있었다. 화살표는 E7 융합단백질을 나타내며 화살표머리는 대조구인 액틴 단백질의 발현 양상을 보여 준다. 최적화된 코돈에 의하여 발현이 증가된 E7 단백질이 라이소좀 부위에 이동하여 더 높은 항종양 예방 및 치료효과를 유도함을 의미한다.

실시예 3: 면역반응유도

실시예 3.1: 항체반응유도

공지된 방법을 이용하여 ELISA를 수행하여 E7 특이적인 항체 생성 정도를 측정하였다[참조: Sin, J. I. et al., Vaccine, 15: 1827-1833, 1997; Sin, J. I. et al., J. Virol., 74: 11173-11180, 2000].

재조합 E7 단백질을 생리식염수에 1 μg/ml의 농도로 희석시켜 50 μl씩 각 웰에 첨가하여 플레이트를 코딩하고 다음날 이용하였다. ELISA 완충액(2% BSA)으로 반응을 차단시킨 후 항-뮤린 IgG-HRP를 1:1000의 농도로 희석하여 50μl씩 각 웰에 가하여 반응시켰다. E7 특이 IgG 아부류를 검출하기 위하여 HRP가 결합된 항-뮤린 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3(Zymed, San Francisco, CA)을 항-뮤린 IgG-HRP 대신 사용하였다.

각 그룹의 동물에 50 μg의 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화되거나 최적화되지 않은 E7 발현벡터를 0주, 2주 및 6주에 근육 주사하였다. IgG 혈청항체의 생성 정도를 측정하기 위하여 8주째 각 동물 그룹(n=10)에서 혈청을 채취하여 1:50으로 희석 후 ELISA를 수행하였다. 동일 용량으로 희석한 각 그룹의 혈청을 1:50으로 희석하여 E7 특이 항체의 IgG 이소타입 생성 정도를 측정하였다. OD 수치는 405 nm에서 측정하였다. E7 주사에 비교해 p < 0.05에서 통계적으로 유의하다.

E7 발현벡터 주사에 의한 E7 특이적인 IgG가 생성된 정도가 도 8A에 나타내었다. 라이소좀 타깃 서열이 결합되고 동시에 E7 유전자 코돈이 최적화된 E7 발현벡터의 경우에만 항체가 생성되었으며 라이소좀 타깃 서열이 결합되었지만 E7 유전자 코돈이 최적화되지 않은 발현벡터의 경우 대조구와 유사하게 IgG가 전혀 생성되지 않았다. 이는, 라이소좀 타깃 서열이 결합되고 유전자 코돈이 최적화 된 E7 단백질 코딩 핵산만이 항체 생성을 유도한다는 것을 의미한다.

도 8B는 E7 특이 항체의 IgG 이소타입을 살펴본 것으로, 라이소좀 타깃 서열이 결합되고 동시에 E7 유전자 코돈이 최적화된 E7 발현벡터의 근육주사에 의해서 IgG2b 이소타입만 생성됨을 보여주는 결과이다. 반면, 다른 IgG 이소타입의 생성은 전혀 탐지되지 않았다.

이러한 결과를 통하여, 라이소좀 타깃 서열의 결합 및 E7 유전자 코돈 최적화에서만 전반적 항체면역반응이 증가되고, IgG 아부류 중 특히 IgG2b의 생성이 증가되는 것을 알 수 있었다.

실시예 3.2: IFN -γ 생성을 통한 Th1 타입 CD4 + T 및 CD8 + T 세포활성

IFN-γ은 Th1 타입 면역반응 및 CTL 반응의 유도에 중요한 역할을 한다. Th1타입의 면역반응과 CTL 정도를 측정하기 위하여 CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성정도를 측정하였다.

각 그룹의 동물을 50 μg의 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화되거나 되지 않은 E7 발현벡터로 0주, 2주 및 6주에 근육 주사하고, 마지막 주사 후 2주째 동물군에서 비장면역세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 6 x 10⁶개/ml로 24 웰 플라스크에 가하고, 재조합 E7 단백질 1 μg/ml 첨가하거나 또는 E7 CTL 에피토프를 1 μg/ml 첨가한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양조건에서 3일 동안 배양하였다. 세포배양액을 취하여 IFN-γ 검출 키트(Biosource, Intl., Camarillo, CA)를 이용하여 분비된 IFN-γ의 양을 측정하였다.

구체적으로, CD4+ T 임파구에서의 IFN-γ 생성정도를 측정하기 위하여 동물에서 채취한 비장 면역세포를 E7 단백질 및 E7 CTL 에피토프로 자극하였다.

도 9는 E7 발현벡터의 주사로 면역 유도된 비장면역세포를 1 μg의 E7 단백질 또는 E7 CTL 에피토프/ml에 첨가한 후 3일 동안 배양한 경우의 IFN-γ 분비를 나타낸다. 이들 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화되거나 되지 않은 E7 발현벡터의 근육주사에서 CD4+ T 임파구에서의 IFN-γ생성은 전혀 탐지되지 않았다. 반면, E7 발현벡터 주사시 CD8+ T 임파구에서의 IFN-γ생성이 탐지되었다. 즉, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화되거나 되지 않은 E7 발현벡터의 경우에 비교해서 라이소좀 타깃 서열이 결합된 코돈 최적화된 E7 발현벡터의 경우에서 훨씬 증가된 IFN-γ생성이 탐지되었다. 라이소좀 타깃 및 코돈 최적화를 가지는 E7 발현벡터의 주사에 의해서 더 높은 CTL 면역반응이 유도됨을 증명한다. 수치 및 막대(bar)는 IFN-γ의 평균값과 오차를 뜻한다. 위 결과는 2회 반복한 결과이며 유사한 결과가 측정되었다.

이런 결과는 Th1 타입의 CD4+ T 임파구는 E7 발현벡터의 근육주사에 의해 유도되지 않음을 의미하며, 이는 IgG2a 이소타입 항체의 생성부재와도 서로 연관이 있음을 의미한다. 반면, CTL 면역반응은 이들 유전자 백신에 의해 유도되며, 특히 E7 유전자의 코돈 최적화시 매우 높은 CTL 면역반응이 유도된다는 사실을 증명한다.

실시예 3.3: 선택적 면역세포 제거 활성

생체내 임파구 제거는 다음과 같이 처리하였다. 미리 프리스탄으로 처리된 누드 마우스에 각각의 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 주사하여 항하이브리도마 세포주-CD4 항체(클론 GK1.5) 및 항-CD8 항체(clone 2.43) 복수액을 채취하였다. 얻어진 100 μl의 복수액(항-CD4 항체 및 항-CD8 항체)를 종양주사하기 전후 3, 0 및 3일에 복강내 주사하였다. FACS를 통해 98% 이상의 CD4+ T 임파구 및 CD8+ T 임파구가 제거됨을 확인하였으며, 0일에 종양을 주사하였다.

항종양 활성에 관여하는 세포군을 동물 모델로 확인한 결과는 도 9와 같다. 도 10은 E7 유전자 백신으로 주사한 후 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 선택적으로 제거한 후 이들 세포군의 항종양 효과를 확인한 결과이다. 구체적으로, 각 그룹의 동물(n=5)을 50 μg의 E7 유전자 백신을 0주, 2주 및 6주에 근육 주사하고, 마지막 주사 후 2주째에 동물에서 CD4+ T 또는 CD8+ T 세포군을 모두 제거한 후 5 x 10⁴개의 TC-1 종양세포주로 피하 주사한 후 20일째 종양을 갖지 않는 마우스의 수를 측정하여 백분율로 나타내었다.

이에 따르면 상기 표 1에서 입증된 바와 같이 E7 유전자 백신을 주사하고 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 제거하지 않은 경우 완전한 종양억제 효과가 관측되었으며, CD4+ T 임파구를 제거했을 경우에는 대조구과 유사하게 종양이 형성되었다. 반면, CD8+ T 임파구가 제거된 동물에서는 항체 비처리군과 유사하게 모든 동물에서 종양이 형성되었다. 이를 통하여, 라이소좀 타깃 서열이 결합된 최적화된 코돈을 가진 E7 발현벡터를 근육주사시 CD8+ T 임파구를 활성화시켜 항종양 효과를 나타냄을 의미한다.

동물 모델에서 항종양 효과가 CD8+ T 임파구에 의해 매개된다는 것을 확인할 수 있었다. E7 유전자 백신 주사에 의해 CD8+ T 임파구가 MHC class I에 연계되어 활성화되어 IFN-γ를 생성함을 의미한다.

E7 발현 벡터의 항원 특이적 면역반응 양상을 요약하여 나타내면 표 3과 같다.

이상에서, 본원 발명을 구체적 양태를 들어 설명하였으나, 당업자라면 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명의 취지 및 범위내에서 다양한 변형이 가능하다. 따라서, 본원 발명은 본원에 예시된 구체적 양태로 제한되지 않는다.

상기에서 기술한 바와 같이, 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열, 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 투여함으로써, 파필로마 바이러스 감염에 의해 유발되는 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(1) 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열과, (2) 상기 분비 시그널 서열의 3’말단에 연결된 핵산서열로서, 하기와 같이 유전자 코돈이 치환된 파필로마바이러스 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 (3) 상기 E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 3’말단에 연결된, 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산:

Ala(A)의 코돈 GCT 및 GCA가 GCC로 치환되고;

Arg(R)의 코돈 CGT, CGA, CGG 및 AGA가 CGC로 치환되고;

Asn(N)의 코돈 AAT가 AAC로 치환되고;

Asp(D)의 코돈 GAT가 GAC로 치환되고;

Cys(C)의 코돈 TGT가 TGC로 치환되고;

Gln(Q)의 코돈 CAA가 CAG로 치환되고;

Clu(E)의 코돈 GAA가 GAG로 치환되고;

Gly(G)의 코돈 GGT 및 GGA가 GGC로 치환되고;

His(H)의 코돈 CAT가 CAC로 치환되고;

Ile(I)의 코돈 ATT 및 ATA가 ATC로 치환되고;

Leu(L)의 코돈 CTC, CTT, CTA, TTA 및 TTG가 CTG 또는 TTG로 치환되고;

Lys(K)의 코돈 AAA가 AAG로 치환되고;

Phe(F)의 코돈 TTT가 TTC로 치환되고;

Pro(P)의 코돈 CCT, CCA 및 CCG가 CCC로 치환되고;

Ser(S)의 코돈 TCT 및 TCA가 TCC 또는 AGC로 치환되고;

Thr(T)의 코돈 ACT, ACA 및 ACG가 ACC로 치환되고;

Val(V)의 코돈 GTA 및 GTT가 GTG로 치환되고;

Tyr(Y)의 코돈 TAT가 TAC로 치환된다.
제1항에 있어서, 파필로마바이러스가 인간 파필로마바이러스 타입 16 또는 18에서 유래한 E7인 핵산.
삭제
제1항에 있어서, E7 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
제1항에 있어서, 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열이 LAMP1, LAMP2, CD63 또는 LAP 단백질을 코딩하는 핵산 서열에서 유래한 핵산.
제5항에 있어서, 라이소좀 타겟팅 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열이 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
제1항에 있어서, 분비 시그널 서열을 코딩하는 핵산 서열이 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산.
삭제
제1항의 핵산을 포함하는 파필로마바이러스에 의해 유발되는 성병성의 사마귀(anogenital warts), 자궁 경부암(cervical cancer), 자궁경부이형성(cervical dysplasia), 항문암(anal cancer), 항문이형성(anal dysplasia), 유두종(papillomas), 전립선암(prostatic cancer), 보웬양 구진증 또는 음부암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 제1항의 핵산이 발현 벡터의 형태인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 바이러스, 플라스미드, 박테리오파아지 또는 코즈미드 유래의 발현 벡터인 약제학적 조성물.
삭제
제9항에 있어서, 조성물이 백신인 약제학적 조성물.