JP2022046617A - 異種ポリペプチドを含むＣｙａＡベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 - Google Patents
異種ポリペプチドを含むＣｙａＡベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】腫瘍退縮及び腫瘍予防において、酸性アミノ酸ストレッチを包含するポリペプチド及び抗原に対して、並びに全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原に対して、強力でかつ長期間持続する細胞防御免疫応答を誘導するために使用し得る免疫原性構造を担持する改善されたベクターを提供する。【解決手段】本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異種ポリペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。本発明はまた、欠失型のボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド、及びこのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療的使用もまた、本発明の一部である。【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキ
メラタンパク質に関する。本発明はまた、欠失型のボルデテラCyaAをコードするポリヌク
レオチド、及びこのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の
少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療
的使用もまた、本発明の一部である。
本発明は、N末端からC末端に、(a)ボルデテラCyaAタンパク質のN末端部分、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)ボルデテラCyaAタンパク質のC末端部分を含む又はこれらからなるキ
メラタンパク質に関する。本発明はまた、欠失型のボルデテラCyaAをコードするポリヌク
レオチド、及びこのキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の
少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物、並びに該組成物の予防的及び/又は治療
的使用もまた、本発明の一部である。
(発明の背景)
ボルデテラ型の、特に、百日咳菌(Bordetella pertussis)のアデニル酸シクラーゼ(Cya
A)は、抗原などのポリペプチドを抗原提示細胞(APC)の細胞質に効率的に送達することが
できる組換えベクターとして広く記載されている[1][2][3]。さらに、組換えCyaAは、腫
瘍を担持するマウスを治療するために効果的に使用されている[4][5][6]。
ボルデテラ型の、特に、百日咳菌(Bordetella pertussis)のアデニル酸シクラーゼ(Cya
A)は、抗原などのポリペプチドを抗原提示細胞(APC)の細胞質に効率的に送達することが
できる組換えベクターとして広く記載されている[1][2][3]。さらに、組換えCyaAは、腫
瘍を担持するマウスを治療するために効果的に使用されている[4][5][6]。
数人の著者らにより、CyaA(ベクターとして使用される)によるポリペプチド送達、特に
、抗原送達の効率は、挿入されるポリペプチド(抗原)の静電電荷及びその立体構造によっ
て良くも悪くも影響され得ることが強調されている。1998年に、Karimovaら[7]は、CyaA
に挿入されたCD8+ T細胞ポリペプチドエピトープの抗原提示細胞への及び抗原提示細胞内
への送達が、挿入されるエピトープの静電電荷に左右され: OVAエピトープを有する組換
えCyaAがAPCに移行し、CTL応答をインビボで誘導することができる一方、4つのグルタミ
ン酸残基がOVAエピトープに融合された同じコンストラクトはもはや移行することができ
ず、検出可能な細胞傷害性T細胞リンパ球(CTL)応答をインビボで誘導しないことを記載し
た。2012年に、Holubovaらは、そのN末端内で欠失しており、OVAエピトープSIINFEKLを含
むCyaAタンパク質、又はそのN末端ドメインが切断され、異なる部位で挿入されたいくつ
かのエピトープを含むCyaAタンパク質のどちらか:のCyaAをベースにした様々なコンスト
ラクトを記載した[25]。Holubovaらは、彼らの実験が、ACドメイン全体が大きな人工CTL
ポリエピトープに置き換えられたCyaAベースの抗原送達の構築のための概念の証拠を提供
するという結論を下している。
、抗原送達の効率は、挿入されるポリペプチド(抗原)の静電電荷及びその立体構造によっ
て良くも悪くも影響され得ることが強調されている。1998年に、Karimovaら[7]は、CyaA
に挿入されたCD8+ T細胞ポリペプチドエピトープの抗原提示細胞への及び抗原提示細胞内
への送達が、挿入されるエピトープの静電電荷に左右され: OVAエピトープを有する組換
えCyaAがAPCに移行し、CTL応答をインビボで誘導することができる一方、4つのグルタミ
ン酸残基がOVAエピトープに融合された同じコンストラクトはもはや移行することができ
ず、検出可能な細胞傷害性T細胞リンパ球(CTL)応答をインビボで誘導しないことを記載し
た。2012年に、Holubovaらは、そのN末端内で欠失しており、OVAエピトープSIINFEKLを含
むCyaAタンパク質、又はそのN末端ドメインが切断され、異なる部位で挿入されたいくつ
かのエピトープを含むCyaAタンパク質のどちらか:のCyaAをベースにした様々なコンスト
ラクトを記載した[25]。Holubovaらは、彼らの実験が、ACドメイン全体が大きな人工CTL
ポリエピトープに置き換えられたCyaAベースの抗原送達の構築のための概念の証拠を提供
するという結論を下している。
2001年に、Gmiraら[8]は、外因性ポリペプチド又は抗原がその触媒ドメインに挿入され
た組換えCyaAの構築を容易にする新しいCyaAベクターを開発した。これらの修飾は、以下
のものであった:
-コドン224の下流への新しいユニークな制限部位を有するマルチクローニング部位配列
の挿入;
-コドン225～234の欠失;並びに
-コドン236、238、及び239の改変;これらの修飾は、このCyaA-抗原ハイブリッドタンパ
ク質をインサイチュAPCの細胞膜を越えて移行させるのに極めて重要であることが以前に
示された、局所的な静電電荷(より低い酸性度)を増大させるために導入された。
た組換えCyaAの構築を容易にする新しいCyaAベクターを開発した。これらの修飾は、以下
のものであった:
-コドン224の下流への新しいユニークな制限部位を有するマルチクローニング部位配列
の挿入;
-コドン225～234の欠失;並びに
-コドン236、238、及び239の改変;これらの修飾は、このCyaA-抗原ハイブリッドタンパ
ク質をインサイチュAPCの細胞膜を越えて移行させるのに極めて重要であることが以前に
示された、局所的な静電電荷(より低い酸性度)を増大させるために導入された。
修飾されたCyaAは、野生型CyaAと同様の侵入活性を有していた。
この著者らは、そのサイズが87～206残基であり、静電電荷が-4～+14である5つの抗原
を試験して、酸性値を有する抗原がその移行効率を喪失することを示し、Karimovaらの以
前の結果を裏付けた。さらに、この著者らは、内部ジスルフィド架橋又は複雑な構造を有
する抗原を有するCyaAを試験し:どれも標的細胞に移行することができず、CyaAの触媒ド
メインに挿入されたポリペプチドは、移行するためにアンフォールディングしなければな
らないという仮説が支持された。
表1:[7]及び[8]から抜粋。酸性電荷を有する挿入物は、APCの細胞質に移行されない。酸
性電荷は、Lys及びArg残基の数からAsp及びGlu残基の数を引くことにより算出される。
を試験して、酸性値を有する抗原がその移行効率を喪失することを示し、Karimovaらの以
前の結果を裏付けた。さらに、この著者らは、内部ジスルフィド架橋又は複雑な構造を有
する抗原を有するCyaAを試験し:どれも標的細胞に移行することができず、CyaAの触媒ド
メインに挿入されたポリペプチドは、移行するためにアンフォールディングしなければな
らないという仮説が支持された。
性電荷は、Lys及びArg残基の数からAsp及びGlu残基の数を引くことにより算出される。
腫瘍退縮アッセイの場合に使用される抗原は、サイズが短い(OVAは長さ8残基である)[4
]か、又はその二次構造が抗原セグメントの内部再配列によって破壊され、最大サイズが1
03残基である[5]かのどちらかであった。
]か、又はその二次構造が抗原セグメントの内部再配列によって破壊され、最大サイズが1
03残基である[5]かのどちらかであった。
これらの研究から、CyaAベクターによるベクター化の効率を改善するための以下の結論
が導き出される:
-CyaAに挿入されるポリペプチドへの酸領域の組み入れを回避すべきである;並びに
-二次及び三次構造は、ポリペプチドが挿入されている酵素的アデニル酸シクラーゼ(AC
)ドメインの適切な内在化に干渉するので、これらの挿入物へのそのような構造の組み入
れを回避すべきである。
が導き出される:
-CyaAに挿入されるポリペプチドへの酸領域の組み入れを回避すべきである;並びに
-二次及び三次構造は、ポリペプチドが挿入されている酵素的アデニル酸シクラーゼ(AC
)ドメインの適切な内在化に干渉するので、これらの挿入物へのそのような構造の組み入
れを回避すべきである。
これらの結論を考慮して、一方がHPV16 E7抗原を含有し、もう一方がHPV18 E7抗原を含
有する、2つの組換えCyaAが構築された。さらに、HPV16抗原とHPV18 E7抗原が合わせて挿
入されている二価組換えCyaAも構築された(特許EP1576967号; Previlleら)。しかしなが
ら、3つ以上のHPV E7タンパク質が同じCyaAベクターに挿入されている組換えCyaAについ
ては、アッセイが報告されなかった。
有する、2つの組換えCyaAが構築された。さらに、HPV16抗原とHPV18 E7抗原が合わせて挿
入されている二価組換えCyaAも構築された(特許EP1576967号; Previlleら)。しかしなが
ら、3つ以上のHPV E7タンパク質が同じCyaAベクターに挿入されている組換えCyaAについ
ては、アッセイが報告されなかった。
したがって、Previlleらは、HPV16型のE7ポリペプチド又はその変異体が挿入されてい
る3つの組換えCyaAベクターを開示している。
-E7タンパク質全長を含有するCyaA-E7fullベクター
-酸性ドメインからaa 30～42が欠失しているE7断片を含有するCyaA-E7Δ30-42ベクター
-E7上に存在するマウスH-2Db拘束性T細胞エピトープを含有するCyaA-E749-57ベクター
。
る3つの組換えCyaAベクターを開示している。
-E7タンパク質全長を含有するCyaA-E7fullベクター
-酸性ドメインからaa 30～42が欠失しているE7断片を含有するCyaA-E7Δ30-42ベクター
-E7上に存在するマウスH-2Db拘束性T細胞エピトープを含有するCyaA-E749-57ベクター
。
マウスを免疫するために及びE7特異的CTL応答を検出するために、これらの組換えCyaA
ベクターが使用された。マウス免疫後の免疫応答を測定するために、CTLクロム放出アッ
セイが実施された。インビボ動物実験で、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullは、CyaA-E749
-57と比較して、最も効率的なCTL免疫応答を生じさせた。
ベクターが使用された。マウス免疫後の免疫応答を測定するために、CTLクロム放出アッ
セイが実施された。インビボ動物実験で、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullは、CyaA-E749
-57と比較して、最も効率的なCTL免疫応答を生じさせた。
これらの組換えCyaAベクターが腫瘍退縮を誘導する能力も評価された。CyaA-E749-57及
びCyaA-E7fullによって付与される腫瘍退縮の割合が目に見えて区別することができなか
ったとしても、CyaA-E7Δ30-42は腫瘍退縮及び成長阻害の点で明らかに優れていた。した
がって、C57BL/6マウスで認識されることが以前に示された単一のCTLエピトープは、効率
的であることが証明されたが、最適な免疫応答を生じさせることはなかった。
びCyaA-E7fullによって付与される腫瘍退縮の割合が目に見えて区別することができなか
ったとしても、CyaA-E7Δ30-42は腫瘍退縮及び成長阻害の点で明らかに優れていた。した
がって、C57BL/6マウスで認識されることが以前に示された単一のCTLエピトープは、効率
的であることが証明されたが、最適な免疫応答を生じさせることはなかった。
次いで、免疫応答の持続性が試験された。3カ月後の一部の生存マウス由来の脾細胞は
、E7抗原を発現するTC-1細胞を溶解させるその能力について試験され、他の生存動物は、
ワクチン接種後100日目に、TC-1細胞で再刺激された。CyaA-E7Δ30-42をワクチン接種し
た動物は、高レベルの防御を示した。CyaA-E749-57をワクチン接種した動物の40％未満が
防御され、一方、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullをワクチン接種した動物の90％～100％
が生存した。
、E7抗原を発現するTC-1細胞を溶解させるその能力について試験され、他の生存動物は、
ワクチン接種後100日目に、TC-1細胞で再刺激された。CyaA-E7Δ30-42をワクチン接種し
た動物は、高レベルの防御を示した。CyaA-E749-57をワクチン接種した動物の40％未満が
防御され、一方、CyaA-E7Δ30-42及びCyaA-E7fullをワクチン接種した動物の90％～100％
が生存した。
この研究から、以下の教示を引き出すことができる:
-HPV16及び/又はHPV18 E7タンパク質を保有するCyaAベクターは、C57BL/6マウスで免疫
応答を生じさせる;
-完全応答は、CD8+ T細胞エピトープのみを有するE749-57エピトープと比較して、その
CD8+ T細胞エピトープとCD4+ T細胞エピトープの両方を有する抗原で得られる;
-優れた効率は、CyaA-E7full又はCyaA-E749-57で処置したマウスと比較して、E7タンパ
ク質が、その酸性領域を残基30から42まで欠失しているCyaA-E7Δ30-42ベクターで処置し
たマウスで得られる;
-これらのベクターで得られる免疫応答は、腫瘍病変の退縮を誘導することができる;
-処置された無腫瘍マウスにおけるTC-1細胞による新たな刺激が拒絶されるので、長期
間持続する応答が得られる;並びに
-各々の抗原がそのエピトープに対する応答をそれぞれ維持する、二価療法を開発する
ための2つの組換えCyaAの同時注射が可能である。
-HPV16及び/又はHPV18 E7タンパク質を保有するCyaAベクターは、C57BL/6マウスで免疫
応答を生じさせる;
-完全応答は、CD8+ T細胞エピトープのみを有するE749-57エピトープと比較して、その
CD8+ T細胞エピトープとCD4+ T細胞エピトープの両方を有する抗原で得られる;
-優れた効率は、CyaA-E7full又はCyaA-E749-57で処置したマウスと比較して、E7タンパ
ク質が、その酸性領域を残基30から42まで欠失しているCyaA-E7Δ30-42ベクターで処置し
たマウスで得られる;
-これらのベクターで得られる免疫応答は、腫瘍病変の退縮を誘導することができる;
-処置された無腫瘍マウスにおけるTC-1細胞による新たな刺激が拒絶されるので、長期
間持続する応答が得られる;並びに
-各々の抗原がそのエピトープに対する応答をそれぞれ維持する、二価療法を開発する
ための2つの組換えCyaAの同時注射が可能である。
したがって、先行技術において、特定のポリペプチド又は抗原に組み込まれた酸性アミ
ノ酸ストレッチ及び全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原は、これらのポリペプ
チドをワクチン接種動物のAPCの細胞膜を越えて移行させるCyaAベクターの効率を変化さ
せることが示されている。このため、該抗原に対する弱い防御的細胞免疫応答が生じるか
、又は該防御的細胞免疫応答が全く生じない。
ノ酸ストレッチ及び全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原は、これらのポリペプ
チドをワクチン接種動物のAPCの細胞膜を越えて移行させるCyaAベクターの効率を変化さ
せることが示されている。このため、該抗原に対する弱い防御的細胞免疫応答が生じるか
、又は該防御的細胞免疫応答が全く生じない。
本発明者らは、このことを薬物候補の設計の欠点とみなし得ると考えている。なぜなら
、そのような酸性アミノ酸配列は、防御的細胞免疫に必要とされる重要なCD4+エピトープ
及び/又はCD8+エピトープを含有する可能性があるからである。
、そのような酸性アミノ酸配列は、防御的細胞免疫に必要とされる重要なCD4+エピトープ
及び/又はCD8+エピトープを含有する可能性があるからである。
したがって、特に、腫瘍退縮及び腫瘍予防において、酸性アミノ酸ストレッチを包含す
るポリペプチド及び抗原に対して、並びに全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原
に対して、強力でかつ長期間持続する細胞防御免疫応答を誘導するために使用し得る免疫
原性構造を担持する改善されたベクターが依然として必要とされている。
るポリペプチド及び抗原に対して、並びに全体として負に帯電したポリペプチド又は抗原
に対して、強力でかつ長期間持続する細胞防御免疫応答を誘導するために使用し得る免疫
原性構造を担持する改善されたベクターが依然として必要とされている。
(図面の簡単な説明)
(A)関連のある制限部位及び挿入配列がCyaA-HPV16E7Δ30-42について示されているpKTRACE5-HPV16E7Δ30-42の模式的地図;(B)関連のある制限部位及び挿入配列がCyaA-HPV18E7Δ32-42について示されているpKTRACE5-HPV18E7Δ32-42の模式的地図。
gtCyaAタンパク質及び設計されたgtCyaA突然変異体。aa(残基)1から400まで、触媒ドメイン(AC); aa 401から1706まで、溶血ドメイン。触媒ドメインにおいて、3つの透明な四角形は、CyaA活性に不可欠といわれている3つの領域を表し([15][16][1]):ドメインI(aa54-77)は、ATPとの相互作用に関与し、ドメインII(aa184-198)は、Mg2+-ATPとの相互作用に関与し、ドメインIII(aa 287-318)は、カルモジュリン(CaM)との相互作用に関与する。gtCyaAd93は、93個のaa(228-320)が欠失しているgtCyaA配列に対応する。gtCyaAd203は、203個のaa.(184-386)が欠失しているgtCyaA配列に対応する。
(A) IPTG誘導性プロモーターの下にgtCyaAd93-pep216ポリヌクレオチド及びcyaC最適化遺伝子を含むpGTPc608ベクターの模式的地図;(B)IPTG誘導性プロモーターの下にgtCyaAd203-pep216ポリヌクレオチド及びcyaC最適化遺伝子を含むpGTPc608ベクターの模式的地図。
CyaAd203-pep105プラスミドの図式的地図。Pep105は、EcoRI制限部位とXmaI制限部位の間にクローニングされた。
プラセボ、ProCervix、又はCyaAd203-PEP105による免疫の7日後に測定された、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264特異的CD8+ Tリンパ球の頻度、並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3)特異的Tリンパ球の頻度。全脾細胞100万個当たりの事象の数を示す。全脾細胞を、左から右に、培地(対照)、MHCクラスI拘束性ペプチドHPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、OVA257-264、#116-2/3ペプチド列、及び#171-1/2/3ペプチド列で、37℃、5％CO2で20時間再刺激した。
プラセボ、ProCervix、又はCyaAd203-PEP105による免疫の7日後に測定された、LCMV GP33-41、OVA323-339、MOG35-55、及びMAGEA3特異的Tリンパ球の頻度;全脾細胞100万個当たりの事象の数を示す。全脾細胞を、左から右に、培地(対照)、LCMV GP33-41、OVA323-339、MOG35-55ペプチド、HisタグMAGE-A3タンパク質で再刺激するか、又はB16腫瘍細胞株B16-GFPの存在下で再刺激し、その後、B16-MAGEA3-GFPをAPCとして使用した。再刺激は全て、37℃、5％CO2で20時間とした。
(A) HPV16、18、及び45 E7タンパク質配列のアラインメント;黒の四角形: pRB結合モチーフ;灰色の四角形:ジンク-フィンガーループに関与するシステイン;黒の矢印は酸性領域を強調している。(B) HPV31、33、52、及び58タンパク質配列のアラインメント;黒の四角形: LXCXEモチーフ;緑色の四角形:ジンク-フィンガーループに関与するシステイン;点線の四角形: HPV52 E7配列について、自己免疫エピトープの位置。
(A)三価候補ワクチン抗原。(B)四価候補ワクチンの再シャッフリングされた抗原配列(N-ter: E7タンパク質のN末端部分; C-ter: E7タンパク質のC末端部分)。
IPTGで3時間誘導した後のタンパク質発現プロファイル(I0:誘導前; I3:誘導後)
免疫の7日後に測定されたHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的CD8+ Tリンパ球の頻度;全脾細胞をMHCクラスI拘束性ペプチドで再刺激した。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γを分泌した細胞の数として表す。
免疫の7日後に測定されたHPV45 E7特異的なIFN-γ分泌Tリンパ球の頻度;全脾細胞を、HPV45 E7完全ペプチド配列を含む15-merの重複ペプチド(サブプール1: #218-1、サブプール2: #218-2、サブプール3: #218-3)で再刺激した。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γを分泌した細胞の数として表す。
三価候補(Btpr_114、Btpr115、及びBTpr_117)を用いたインビボ殺傷アッセイ;左のパネル: HPV18 E7ペプチドライブラリー#171-1及び#171-2がロードされた脾細胞のインビボ殺傷のパーセンテージ;右のパネル: HPV45 E7ペプチドライブラリー#218-3がロードされた脾細胞のインビボ殺傷のパーセンテージ。
HPV16 E7抗原を組み込んだポリ-ICLC免疫増強CyaA候補ワクチンによる治療的ワクチン接種は、TC-1誘導性固形腫瘍除去をもたらす;(A)ワクチン接種スキーム:第0日目に、全てのマウスの右脇腹にTC-1腫瘍細胞を接種した;これらのマウスを第11日目に処置した。(B)第60日目までの腫瘍成長のモニタリング。
TC-1腫瘍細胞株を除去したマウスのLL2-HPV18 E7細胞株又はLL2-GFP細胞株の成長に対する予防的防御。(A)ワクチン接種スキーム:第65日目に、TC-1腫瘍を除去したマウスを2つのサブグループに分け、LL2-HPV18 E7細胞株又は対照LL2-GFP細胞株のどちらかを接種した。(B)第110目日までの腫瘍成長のモニタリング。
免疫の7日後に測定されたHPV16 E7、HPV18 E7、及びHPV52 E7特異的Tリンパ球の頻度-全脾細胞を、HPV16、HPV18、及びHPV52 E7タンパク質配列を含む15-merの重複ペプチドで再刺激した。ペプチドのサブプールを正方形の中に示す。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γスポット形成細胞(sfc)の数として表す。HPV18 E7 sfcは、数え切れなかった(TNTC)。
(A、B、C、及びD):免疫の7日後に測定された、IFN-γを分泌するHPV16 E7、HPV18 E7、HPV33 E7、及びHPV52 E7特異的Tリンパ球の頻度。全脾細胞を、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV52 E7完全ペプチド配列を含む15-merの重複ペプチドで再刺激した(各々のペプチド列は、E7タンパク質のN末端からC末端までのサブプール(ヒストグラムの説明文に示されている)に細分される)。結果を全脾細胞100万個当たりのIFN-γスポット形成細胞の数として表す。
(A及びB):七価候補ワクチンによって誘導された、HPV16 E7ペプチドライブラリー(図17-A)又はHPV18 E7ペプチドライブラリー(図17-B)がぞれぞれロードされた細胞のE7特異的殺傷。
(詳細な説明)
本発明者らは、野生型CyaAのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインに欠失があり、その中
に、サイズの大きい(最大441個のアミノ酸残基を有するが、それに限定されない、配列に
よって例示される)及び/又は酸性電荷とも表記される強い負の静電電荷(最大-46)を提示
する抗原が挿入されている新しいCyaAベクターを開発した。これらのコンストラクトが特
異的なCD8+及びCD4+ T細胞応答及び細胞傷害性を誘導する能力、並びにそれらが腫瘍拒絶
を誘導する能力を試験した。驚くことに、これらの新しいCyaAベクターは、強い負の静電
電荷を有する抗原の標的細胞への送達を可能にすることが示された。さらに、これらの新
しいベクターに挿入されたとき、その酸性ドメインを有する抗原は、これらの酸性ドメイ
ンが除かれた同じ抗原と比較して、ストリンジェントな条件下で行われた細胞傷害性アッ
セイで、より効率的であった。
本発明者らは、野生型CyaAのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインに欠失があり、その中
に、サイズの大きい(最大441個のアミノ酸残基を有するが、それに限定されない、配列に
よって例示される)及び/又は酸性電荷とも表記される強い負の静電電荷(最大-46)を提示
する抗原が挿入されている新しいCyaAベクターを開発した。これらのコンストラクトが特
異的なCD8+及びCD4+ T細胞応答及び細胞傷害性を誘導する能力、並びにそれらが腫瘍拒絶
を誘導する能力を試験した。驚くことに、これらの新しいCyaAベクターは、強い負の静電
電荷を有する抗原の標的細胞への送達を可能にすることが示された。さらに、これらの新
しいベクターに挿入されたとき、その酸性ドメインを有する抗原は、これらの酸性ドメイ
ンが除かれた同じ抗原と比較して、ストリンジェントな条件下で行われた細胞傷害性アッ
セイで、より効率的であった。
本発明は、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、こ
こで、該CyaA由来タンパク質は:
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227(す
なわち、位置182と228の間)に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387(すなわち、位置320と388の間)に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなる。
こで、該CyaA由来タンパク質は:
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227(す
なわち、位置182と228の間)に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387(すなわち、位置320と388の間)に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなる。
配列番号2は、百日咳菌の野生型CyaAタンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号2に示
されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの特定の実施態様は、配列番号1に示されてい
る通りである。配列番号2に示されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの別の特定の実
施態様は、サイレントヌクレオチド突然変異による、すなわち、配列番号2のアミノ酸を
変化させない修飾による、配列番号1の配列の修飾型である。配列番号1の特定の修飾型は
、配列番号69に示される、大腸菌(E. coli)での発現に最適化された配列である。配列番
号69は、本発明の一部である。本発明において、本発明のCyaA由来タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドは、配列番号2をコードするポリヌクレオチドをコードしない又は該
ポリヌクレオチドを含まない。さらに、本発明のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドは、配列番号1を含まない又は配列番号1からならない。
されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの特定の実施態様は、配列番号1に示されてい
る通りである。配列番号2に示されるCyaAをコードするポリヌクレオチドの別の特定の実
施態様は、サイレントヌクレオチド突然変異による、すなわち、配列番号2のアミノ酸を
変化させない修飾による、配列番号1の配列の修飾型である。配列番号1の特定の修飾型は
、配列番号69に示される、大腸菌(E. coli)での発現に最適化された配列である。配列番
号69は、本発明の一部である。本発明において、本発明のCyaA由来タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドは、配列番号2をコードするポリヌクレオチドをコードしない又は該
ポリヌクレオチドを含まない。さらに、本発明のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドは、配列番号1を含まない又は配列番号1からならない。
本発明の該ポリヌクレオチドから入手可能な、結果として生じる本発明のCyaA由来タン
パク質は、同じボルデテラCyaAタンパク質の、1つに融合した又は組み換えられた、2つの
断片を含む又は該断片からなる。「断片」とは、野生型ボルデテラCyaAタンパク質の配列
中に見られる連続的なアミノ酸残基のストレッチ又は連結を意味する。
パク質は、同じボルデテラCyaAタンパク質の、1つに融合した又は組み換えられた、2つの
断片を含む又は該断片からなる。「断片」とは、野生型ボルデテラCyaAタンパク質の配列
中に見られる連続的なアミノ酸残基のストレッチ又は連結を意味する。
第一の断片(CyaA由来ポリペプチドのN末端部分)は、配列番号2の最初の残基から始まり
、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる。
、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる。
この第一の断片は、183～227残基のサイズを有する、すなわち、長さが少なくとも183
残基であり、多くても227残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なくと
も183、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、又は少なくとも220である。特
定の実施態様において、この第一の断片のサイズは、183残基であるか又は227残基である
。
残基であり、多くても227残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なくと
も183、少なくとも190、少なくとも200、少なくとも210、又は少なくとも220である。特
定の実施態様において、この第一の断片のサイズは、183残基であるか又は227残基である
。
したがって、この断片は、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の残基183、1
84、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、2
00、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、2
16、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、及び227からなる群から選択
される残基で終わる。
84、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、2
00、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、2
16、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、及び227からなる群から選択
される残基で終わる。
言い換えると、この第一の断片は、配列番号2の残基1～183、1～184、1～185、1～186
、1～187、1～188、1～189、1～190、1～191、1～192、1～193、1～194、1～195、1～196
、1～197、1～198、1～199、1～200、1～201、1～202、1～203、1～204、1～205、1～206
、1～207、1～208、1～209、1～210、1～211、1～212、1～213、1～ 214、1～215、1～21
6、1～217、1～218、1～219、1～220、1～221、1～222、1～223、1～224、1～225、1～22
6、及び1～227からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
、1～187、1～188、1～189、1～190、1～191、1～192、1～193、1～194、1～195、1～196
、1～197、1～198、1～199、1～200、1～201、1～202、1～203、1～204、1～205、1～206
、1～207、1～208、1～209、1～210、1～211、1～212、1～213、1～ 214、1～215、1～21
6、1～217、1～218、1～219、1～220、1～221、1～222、1～223、1～224、1～225、1～22
6、及び1～227からなる群から選択される配列を含む又は該配列からなる。
特定の実施態様において、この第一の断片は、配列番号2の残基1～227もしくは配列番
号2の残基1～183を含む又はこれらからなる。
号2の残基1～183を含む又はこれらからなる。
特定の実施態様において、該第一の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1
又は配列番号69の最初のヌクレオチドから始まり、配列番号1又は配列番号69の位置549～
位置681に位置するヌクレオチドで終わり、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数
である。したがって、この断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配
列番号69の残基1～549、1～552、1～555、1～558、1～561、1～564、1～567、1～570、1
～573、1～576、1～579、1～582、1～585、1～588、1～591、1～594、1～597、1～600、1
～603、1～606、1～609、1～612、1～615、1～618、1～621、1～624、1～627、1～630、1
～633、1～636、1～639、1～642、1～645、1～648、1～651、1～654、1～657、1～660、1
～663、1～666、1～669、1～672、1～675、1～678、及び1～681からなる群から選択され
る配列を含む又は該配列からなる。
又は配列番号69の最初のヌクレオチドから始まり、配列番号1又は配列番号69の位置549～
位置681に位置するヌクレオチドで終わり、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数
である。したがって、この断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配
列番号69の残基1～549、1～552、1～555、1～558、1～561、1～564、1～567、1～570、1
～573、1～576、1～579、1～582、1～585、1～588、1～591、1～594、1～597、1～600、1
～603、1～606、1～609、1～612、1～615、1～618、1～621、1～624、1～627、1～630、1
～633、1～636、1～639、1～642、1～645、1～648、1～651、1～654、1～657、1～660、1
～663、1～666、1～669、1～672、1～675、1～678、及び1～681からなる群から選択され
る配列を含む又は該配列からなる。
第二の断片(CyaA由来ポリペプチドのC末端部分)は、配列番号2の位置321～位置387に位
置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる。
置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる。
この第二の断片は、1320～1386残基のサイズを有する、すなわち、長さが少なくとも13
20残基であり、多くても1386残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なく
とも1320、少なくとも1330、少なくとも1340、少なくとも1350、少なくとも1360、少なく
とも1370、又は少なくとも1380である。特定の実施態様において、この第二の断片のサイ
ズは、1320残基であるか又は1386残基である。
20残基であり、多くても1386残基である。特定の実施態様において、この断片は、少なく
とも1320、少なくとも1330、少なくとも1340、少なくとも1350、少なくとも1360、少なく
とも1370、又は少なくとも1380である。特定の実施態様において、この第二の断片のサイ
ズは、1320残基であるか又は1386残基である。
したがって、この第二の断片は、配列番号2の残基321、322、323、324、325、326、327
、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343
、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359
、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375
、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、及び387からなる群から選
択される残基から始まり、配列番号2の最後の残基(すなわち、残基1706)で終わる。
、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343
、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359
、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375
、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、及び387からなる群から選
択される残基から始まり、配列番号2の最後の残基(すなわち、残基1706)で終わる。
言い換えると、この第二の断片は、配列番号2の残基321～1706、322～1706、323～1706
、324～1706、325～1706、326～1706、327～1706、328～1706、329～1706、330～1706、3
31～1706、332～1706、333～1706、334～1706、335～1706、336～1706、337～1706、338
～1706、339～1706、340～1706、341～1706、342～1706、343～1706、344～1706、345～1
706、346～1706、347～1706、348～1706、349～1706、350～1706、351～1706、352～1706
、353～1706、354～1706、355～1706、356～1706、357～1706、358～1706、359～1706、3
60～1706、361～1706、362～1706、363～1706、364～1706、365～1706、366～1706、367
～1706、368～1706、369～1706、370～1706、371～1706、372～1706、373～1706、374～1
706、375～1706、376～1706、377～1706、378～1706、379～1706、380～1706、381～1706
、382～1706、383～1706、384～1706、385～1706、386～1706、及び387～1706からなる群
から選択される配列を含む又は該配列からなる。
、324～1706、325～1706、326～1706、327～1706、328～1706、329～1706、330～1706、3
31～1706、332～1706、333～1706、334～1706、335～1706、336～1706、337～1706、338
～1706、339～1706、340～1706、341～1706、342～1706、343～1706、344～1706、345～1
706、346～1706、347～1706、348～1706、349～1706、350～1706、351～1706、352～1706
、353～1706、354～1706、355～1706、356～1706、357～1706、358～1706、359～1706、3
60～1706、361～1706、362～1706、363～1706、364～1706、365～1706、366～1706、367
～1706、368～1706、369～1706、370～1706、371～1706、372～1706、373～1706、374～1
706、375～1706、376～1706、377～1706、378～1706、379～1706、380～1706、381～1706
、382～1706、383～1706、384～1706、385～1706、386～1706、及び387～1706からなる群
から選択される配列を含む又は該配列からなる。
特定の実施態様において、この第二の断片は、配列番号2の残基321～1706もしくは配列
番号2の残基387～1076を含む又はこれらからなる。
番号2の残基387～1076を含む又はこれらからなる。
特定の実施態様において、該第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1
又は配列番号69の位置961～位置1159に位置するヌクレオチドから始まり、配列番号1又は
配列番号69の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わり、但し、該ヌク
レオチド断片の長さは、3の倍数である。したがって、この第二の断片をコードするポリ
ヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号69の残基961～5118、964～5118、967～5118
、970～5118、973～5118、976～5118、979～5118、982～5118、985～5118、988～5118、9
91～5118、994～5118、997～5118、1000～5118、1003～5118、1006～5118、1009～5118、
1012～5118、1015～5118、1018～5118、1021～5118、1024～5118、1027～5118、1030～51
18、1033～5118、1036～5118、1039～5118、1042～5118、1045～5118、1048～5118、1051
～5118、1054～5118、1057～5118、1060～5118、1063～5118、1066～5118、1069～5118、
1072～5118、1075～5118、1078～5118、1081～5118、1084～5118、1087～5118、1090～51
18、1093～5118、1096～5118、1099～5118、1102～5118、1105～5118、1108～5118、1111
～5118、1114～5118、1117～5118、1120～5118、1123～5118、1126～5118、1129～5118、
1132～5118、1135～5118、1138～5118、1141～5118、1144～5118、1147～5118、1150～51
18、1153～5118、1156～5118、及び1159～5118からなる群から選択される配列を含む又は
該配列からなる。
又は配列番号69の位置961～位置1159に位置するヌクレオチドから始まり、配列番号1又は
配列番号69の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わり、但し、該ヌク
レオチド断片の長さは、3の倍数である。したがって、この第二の断片をコードするポリ
ヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号69の残基961～5118、964～5118、967～5118
、970～5118、973～5118、976～5118、979～5118、982～5118、985～5118、988～5118、9
91～5118、994～5118、997～5118、1000～5118、1003～5118、1006～5118、1009～5118、
1012～5118、1015～5118、1018～5118、1021～5118、1024～5118、1027～5118、1030～51
18、1033～5118、1036～5118、1039～5118、1042～5118、1045～5118、1048～5118、1051
～5118、1054～5118、1057～5118、1060～5118、1063～5118、1066～5118、1069～5118、
1072～5118、1075～5118、1078～5118、1081～5118、1084～5118、1087～5118、1090～51
18、1093～5118、1096～5118、1099～5118、1102～5118、1105～5118、1108～5118、1111
～5118、1114～5118、1117～5118、1120～5118、1123～5118、1126～5118、1129～5118、
1132～5118、1135～5118、1138～5118、1141～5118、1144～5118、1147～5118、1150～51
18、1153～5118、1156～5118、及び1159～5118からなる群から選択される配列を含む又は
該配列からなる。
特定の実施態様において、CyaA由来タンパク質は、配列番号10に示される配列のポリペ
プチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号10は、配列番号2の残基1～227からな
る断片が、配列番号2の残基321～1706からなる断片に融合したものからなる。
プチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号10は、配列番号2の残基1～227からな
る断片が、配列番号2の残基321～1706からなる断片に融合したものからなる。
別の特定の実施態様において、CyaA由来タンパク質は、配列番号12に示される配列のポ
リペプチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号12は、配列番号2の残基1～183か
らなる断片が、配列番号2の残基387～1706からなる断片に融合したものからなる。
リペプチドを含み又は該ポリペプチドからなり;配列番号12は、配列番号2の残基1～183か
らなる断片が、配列番号2の残基387～1706からなる断片に融合したものからなる。
他の特定の実施態様も開示される:
-CyaA由来タンパク質は、配列番号19に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1～2
27からなる断片が、配列番号2の残基387～1706からなる断片に融合したものからなる配列
のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる、及び
-CyaA由来タンパク質は、配列番号20に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1～1
83からなる断片が、配列番号2の残基321～1706からなる断片に融合したものからなる配列
のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる。
-CyaA由来タンパク質は、配列番号19に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1～2
27からなる断片が、配列番号2の残基387～1706からなる断片に融合したものからなる配列
のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる、及び
-CyaA由来タンパク質は、配列番号20に示される配列、すなわち、配列番号2の残基1～1
83からなる断片が、配列番号2の残基321～1706からなる断片に融合したものからなる配列
のポリペプチドを含む又は該ポリペプチドからなる。
タンパク質又はポリペプチドに言及する場合の「に融合した」という表現は、各々のペ
プチド部分(例えば、いくつかのCyaA断片、任意に、異種ポリペプチド)がペプチド結合に
よって共有結合していることを意味する。これらの異なるペプチド部分の順序は、本明細
書では、N末端からC末端へのものとして記載されている、すなわち、ある部分の最後のC
末端残基は、ペプチド結合によって他の部分の最初のN-残基に結合している。ポリヌクレ
オチドに言及する場合の「に融合した」という表現は、2以上のポリヌクレオチド部分(例
えば、いくつかのヌクレオチドCyaA断片、任意に、異種ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド)がホスホジエステル結合によって共有結合していることを意味する。これらの異
なるヌクレオチド部分の順序は、本明細書では、5'から3'へのものとして記載されている
、すなわち、ある部分の最後の3'ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって他の部
分の最初の5'ヌクレオチドに結合している。ヌクレオチド配列の融合物からなるポリヌク
レオチドは、特に、cyaAの天然のコード配列中の配列断片の欠失によるものを含め、組換
えポリヌクレオチドとして得られる。
プチド部分(例えば、いくつかのCyaA断片、任意に、異種ポリペプチド)がペプチド結合に
よって共有結合していることを意味する。これらの異なるペプチド部分の順序は、本明細
書では、N末端からC末端へのものとして記載されている、すなわち、ある部分の最後のC
末端残基は、ペプチド結合によって他の部分の最初のN-残基に結合している。ポリヌクレ
オチドに言及する場合の「に融合した」という表現は、2以上のポリヌクレオチド部分(例
えば、いくつかのヌクレオチドCyaA断片、任意に、異種ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド)がホスホジエステル結合によって共有結合していることを意味する。これらの異
なるヌクレオチド部分の順序は、本明細書では、5'から3'へのものとして記載されている
、すなわち、ある部分の最後の3'ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって他の部
分の最初の5'ヌクレオチドに結合している。ヌクレオチド配列の融合物からなるポリヌク
レオチドは、特に、cyaAの天然のコード配列中の配列断片の欠失によるものを含め、組換
えポリヌクレオチドとして得られる。
本発明はまた、変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するもの
であり、ここで、該第一の断片は、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片
との少なくとも95％の類似性を有する変異体であり、該断片の配列は、配列番号2の最初
の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる、及び/又は該
第二の断片は、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最
後の残基で終わる断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体である。
であり、ここで、該第一の断片は、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片
との少なくとも95％の類似性を有する変異体であり、該断片の配列は、配列番号2の最初
の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる、及び/又は該
第二の断片は、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最
後の残基で終わる断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体である。
タンパク質又はポリペプチドに言及する場合の「少なくとも95％の類似性を有する変異
体」とは、そのアミノ酸同一性が、それと異なるポリペプチドと少なくとも95％、少なく
とも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるタンパク質配列
を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリペプチドの両方
の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出される
。したがって、変異体は、その残基の5％が、1以上の付加及び/又は1以上の欠失及び/又
は1以上の置換だけ、このポリペプチドの残基と異なる場合、ポリペプチドとの95％の類
似性を有する。特定の実施態様において、該変異体は、置換、好ましくは、保存的置換だ
けしか該ポリペプチドと異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列と同じ長
さを保持する。別の実施態様において、該変異体は、少なくとも1つの単一アミノ酸欠失
だけ、好ましくは、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの単一アミノ酸欠失だけ、及び置換、
好ましくは、保存的置換だけ、該ポリペプチドと異なる。
体」とは、そのアミノ酸同一性が、それと異なるポリペプチドと少なくとも95％、少なく
とも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるタンパク質配列
を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリペプチドの両方
の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出される
。したがって、変異体は、その残基の5％が、1以上の付加及び/又は1以上の欠失及び/又
は1以上の置換だけ、このポリペプチドの残基と異なる場合、ポリペプチドとの95％の類
似性を有する。特定の実施態様において、該変異体は、置換、好ましくは、保存的置換だ
けしか該ポリペプチドと異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列と同じ長
さを保持する。別の実施態様において、該変異体は、少なくとも1つの単一アミノ酸欠失
だけ、好ましくは、1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの単一アミノ酸欠失だけ、及び置換、
好ましくは、保存的置換だけ、該ポリペプチドと異なる。
本発明はまた、配列番号1の部分(又は断片)をコードするポリヌクレオチドとの少なく
とも75％の類似性を有するポリヌクレオチド変異体に関する。特定の実施態様において、
該第一の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1の最初のヌクレオチドから始
まり、配列番号1の位置549～位置681に位置するヌクレオチドで終わるポリヌクレオチド
との75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。
別の実施態様において、独立に又は上の記述と組み合わせて、該第二の断片をコードする
ポリヌクレオチドは、配列番号1の位置961～位置1159に位置するヌクレオチドから始まり
、配列番号1の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わるポリヌクレオ
チドとの75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数であ
る。特定の実施態様において、該第一及び第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、
その全長配列が、配列番号1との少なくとも75％の類似性を有するポリヌクレオチドに由
来する。そのような変異体の一例は、配列番号69である。特定の実施態様において、該ポ
リヌクレオチド変異体は、上に開示された配列番号1から得られるポリヌクレオチドに、
又は配列番号69のポリヌクレオチドに適用される遺伝暗号の縮重の結果として生じる。特
定の実施態様において、このようにして得られるポリヌクレオチド変異体は、ゆらぎ位置
において縮重塩基を有する。
とも75％の類似性を有するポリヌクレオチド変異体に関する。特定の実施態様において、
該第一の断片をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1の最初のヌクレオチドから始
まり、配列番号1の位置549～位置681に位置するヌクレオチドで終わるポリヌクレオチド
との75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数である。
別の実施態様において、独立に又は上の記述と組み合わせて、該第二の断片をコードする
ポリヌクレオチドは、配列番号1の位置961～位置1159に位置するヌクレオチドから始まり
、配列番号1の最後のヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド5118)で終わるポリヌクレオ
チドとの75％の類似性を有しており、但し、該ヌクレオチド断片の長さは、3の倍数であ
る。特定の実施態様において、該第一及び第二の断片をコードするポリヌクレオチドは、
その全長配列が、配列番号1との少なくとも75％の類似性を有するポリヌクレオチドに由
来する。そのような変異体の一例は、配列番号69である。特定の実施態様において、該ポ
リヌクレオチド変異体は、上に開示された配列番号1から得られるポリヌクレオチドに、
又は配列番号69のポリヌクレオチドに適用される遺伝暗号の縮重の結果として生じる。特
定の実施態様において、このようにして得られるポリヌクレオチド変異体は、ゆらぎ位置
において縮重塩基を有する。
ポリヌクレオチドに言及する場合の「少なくとも75％の類似性を有する変異体」とは、
そのヌクレオチド同一性が、それと異なるポリヌクレオチドと少なくとも75％、少なくと
も79％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくと
も96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるヌクレオチド配列
を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリヌクレオチドの
両方の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出さ
れる。したがって、変異体は、そのヌクレオチドの25％が、1以上のヌクレオチド付加及
び/又は1以上のヌクレオチド欠失及び/又は1以上のヌクレオチド置換だけ、該ポリヌクレ
オチドと異なる場合、ポリヌクレオチドとの75％の類似性を有する。特定の実施態様にお
いて、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それ
と異なる配列と同じ長さを保持する。特定の実施態様において、該変異体は、ヌクレオチ
ドサイレント突然変異だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列に
よってコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードし続ける。特定の実施態様にお
いて、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、該置換の一部は、該ポリヌクレ
オチド変異体によってコードされるタンパク質の配列が、本発明のタンパク質もしくはポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有するか、又は100％の同一性を有するような
、サイレント突然変異である。
そのヌクレオチド同一性が、それと異なるポリヌクレオチドと少なくとも75％、少なくと
も79％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくと
も96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％であるヌクレオチド配列
を意味する。類似性のパーセンテージは、該変異体と該それと異なるポリヌクレオチドの
両方の全長配列を、特に、この2つの配列のうちのより短い方にわたって比較して算出さ
れる。したがって、変異体は、そのヌクレオチドの25％が、1以上のヌクレオチド付加及
び/又は1以上のヌクレオチド欠失及び/又は1以上のヌクレオチド置換だけ、該ポリヌクレ
オチドと異なる場合、ポリヌクレオチドとの75％の類似性を有する。特定の実施態様にお
いて、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それ
と異なる配列と同じ長さを保持する。特定の実施態様において、該変異体は、ヌクレオチ
ドサイレント突然変異だけしか異ならず、したがって、該変異体は、それと異なる配列に
よってコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードし続ける。特定の実施態様にお
いて、該変異体は、ヌクレオチド置換だけしか異ならず、該置換の一部は、該ポリヌクレ
オチド変異体によってコードされるタンパク質の配列が、本発明のタンパク質もしくはポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有するか、又は100％の同一性を有するような
、サイレント突然変異である。
本明細書に示されるヌクレオチド及びタンパク質の類似性パーセンテージは、Needlema
n及びWunschアルゴリズムに基づく周知のプログラム、例えば、MeAlign[18]によって算出
することができる。
n及びWunschアルゴリズムに基づく周知のプログラム、例えば、MeAlign[18]によって算出
することができる。
特定の実施態様において、本明細書で定義される変異体CyaA由来タンパク質は、標的細
胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインを標的細胞の細胞質に移
行させるその能力を保持している。特定の実施態様において、標的細胞は、CD11b発現細
胞、すなわち、CD11b/CD18受容体をその表面に発現する(CD11b+)細胞である。特に、これ
らの細胞は、顆粒球/好中球、マクロファージ、NK細胞、T CD8+のサブセット、B細胞のサ
ブセット、樹状細胞、例えば、ランゲルハンス細胞、又は骨髄樹状細胞である。
胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラーゼ(AC)ドメインを標的細胞の細胞質に移
行させるその能力を保持している。特定の実施態様において、標的細胞は、CD11b発現細
胞、すなわち、CD11b/CD18受容体をその表面に発現する(CD11b+)細胞である。特に、これ
らの細胞は、顆粒球/好中球、マクロファージ、NK細胞、T CD8+のサブセット、B細胞のサ
ブセット、樹状細胞、例えば、ランゲルハンス細胞、又は骨髄樹状細胞である。
標的細胞に結合する本発明の変異体の能力は、特に、EP03291486号又はWO02/22169号出
願に開示されている方法に従ってアッセイすることができる。さらに、そのN末端ドメイ
ンを標的細胞の細胞質に移行させる変異体の能力は、WO02/22169号出願に記載されている
方法、又はp105ペプチドに関して実施例Aに詳述されている方法を適用することによって
アッセイすることができる。
願に開示されている方法に従ってアッセイすることができる。さらに、そのN末端ドメイ
ンを標的細胞の細胞質に移行させる変異体の能力は、WO02/22169号出願に記載されている
方法、又はp105ペプチドに関して実施例Aに詳述されている方法を適用することによって
アッセイすることができる。
百日咳菌CyaAタンパク質の全長野生型配列の変異体が知られており;そのような変異体
の例示は、配列番号4(ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)のCyaAタンパク質)、配
列番号6(ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)のCyaAタンパク質)
、及び配列番号8(気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)のCyaAタンパク質)に示さ
れるそれらの配列を参照することにより提供される。配列番号4、6、及び8をコードする
ヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号3、5、及び7に示されている通りであるか、又
はサイレント突然変異による配列番号3、5、及び7の変異体である。本発明において、該C
yaA由来タンパク質は、配列番号2、4、6、及び8を含まない又はこれらからならない。さ
らに、本発明の変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号3
、5、もしくは7を含まない又はこれらからならない。
の例示は、配列番号4(ボルデテラ・ヒンジイ(Bordetella hinzii)のCyaAタンパク質)、配
列番号6(ボルデテラ・パラペルツッシス(Bordetella parapertussis)のCyaAタンパク質)
、及び配列番号8(気管支敗血症菌(Bordetella bronchiseptica)のCyaAタンパク質)に示さ
れるそれらの配列を参照することにより提供される。配列番号4、6、及び8をコードする
ヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号3、5、及び7に示されている通りであるか、又
はサイレント突然変異による配列番号3、5、及び7の変異体である。本発明において、該C
yaA由来タンパク質は、配列番号2、4、6、及び8を含まない又はこれらからならない。さ
らに、本発明の変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号3
、5、もしくは7を含まない又はこれらからならない。
本発明の特定の実施態様において、変異体CyaA由来タンパク質を、好ましくは、本明細
書で定義される百日咳菌CyaA由来タンパク質の変異体としてコードするポリヌクレオチド
は:
(a)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の最初の残基から始まり、配列番号4、6、も
しくは8の位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号4、6、もしくは8に示され
るボルデテラCyaAタンパク質の断片が、
(b)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の位置321～位置387に位置する残基から始ま
り、配列番号4、6、もしくは8の最後の残基で終わる、それぞれ、配列番号4、6、もしく
は8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
書で定義される百日咳菌CyaA由来タンパク質の変異体としてコードするポリヌクレオチド
は:
(a)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の最初の残基から始まり、配列番号4、6、も
しくは8の位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号4、6、もしくは8に示され
るボルデテラCyaAタンパク質の断片が、
(b)その配列が、配列番号4、6、もしくは8の位置321～位置387に位置する残基から始ま
り、配列番号4、6、もしくは8の最後の残基で終わる、それぞれ、配列番号4、6、もしく
は8に示されるボルデテラCyaAタンパク質の断片に融合したもの
を含む又はこれからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
配列番号2の断片を含む特定のCyaA由来タンパク質について上で与えられている定義は
、配列番号4及び6の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質に等しく適用される。
、配列番号4及び6の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質に等しく適用される。
配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質に関して、配列番号8の最後の残基が
、残基1706ではなく、残基1705であることを除いて、全ての定義が等しく適用される。そ
れゆえ、配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質について、残基1706に関する
全ての態様は、残基1705に置き換えられなければならない。特に、第二の断片は、1319～
1385残基のサイズを有し、好ましくは、1319残基又は1385残基の長さである。配列番号8
の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して、ヌクレ
オチド5118に関する全ての定義及び実施態様は、ヌクレオチド5115に置き換えられなけれ
ばならない。
、残基1706ではなく、残基1705であることを除いて、全ての定義が等しく適用される。そ
れゆえ、配列番号8の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質について、残基1706に関する
全ての態様は、残基1705に置き換えられなければならない。特に、第二の断片は、1319～
1385残基のサイズを有し、好ましくは、1319残基又は1385残基の長さである。配列番号8
の断片を含む変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して、ヌクレ
オチド5118に関する全ての定義及び実施態様は、ヌクレオチド5115に置き換えられなけれ
ばならない。
本発明の変異体CyaA由来タンパク質をコードする特定のポリヌクレオチドは、下記のも
のを含む又は下記のものからなるポリヌクレオチドの中から選択される:
1)配列番号13に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号13は、
配列番号4の残基1～227からなる断片が配列番号4の残基321～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
2)配列番号14に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号14は、
配列番号4の残基1～183からなる断片が配列番号4の残基387～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
3)配列番号15に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号15は、
配列番号6の残基1～227からなる断片が配列番号6の残基321～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
4)配列番号16に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号16は、
配列番号6の残基1～183からなる断片が配列番号6の残基387～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
5)配列番号17に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号17は、
配列番号8の残基1～227からなる断片が配列番号8の残基321～1705からなる断片に融合し
たものからなる;及び
6)配列番号18に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号18は、
配列番号8の残基1～183からなる断片が配列番号8の残基387～1705からなる断片に融合し
たものからなる。
のを含む又は下記のものからなるポリヌクレオチドの中から選択される:
1)配列番号13に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号13は、
配列番号4の残基1～227からなる断片が配列番号4の残基321～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
2)配列番号14に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号14は、
配列番号4の残基1～183からなる断片が配列番号4の残基387～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
3)配列番号15に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号15は、
配列番号6の残基1～227からなる断片が配列番号6の残基321～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
4)配列番号16に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号16は、
配列番号6の残基1～183からなる断片が配列番号6の残基387～1706からなる断片に融合し
たものからなる;
5)配列番号17に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号17は、
配列番号8の残基1～227からなる断片が配列番号8の残基321～1705からなる断片に融合し
たものからなる;及び
6)配列番号18に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;配列番号18は、
配列番号8の残基1～183からなる断片が配列番号8の残基387～1705からなる断片に融合し
たものからなる。
本発明のCyaA由来タンパク質又は変異体CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドは、欠失型の全長ボルデテラCyaAコードヌクレオチド配列、すなわち、その最初のア
ミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置し、その最
後のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する
ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失する程度に配列番号2、4、6、も
しくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと定義す
ることもできる。特定の実施態様において、該ポリヌクレオチドは、その最初のアミノ酸
残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基184、185、186、187、188、189、
190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、
206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、
222、223、224、225、226、227、及び228からなる群から選択され、その最後のアミノ酸
残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基320、321、322、323、324、325、
326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、
342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、
358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、
374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、もしくは386からなる
群から選択されるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失している配列番
号2、4、6、もしくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードする。
チドは、欠失型の全長ボルデテラCyaAコードヌクレオチド配列、すなわち、その最初のア
ミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置し、その最
後のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する
ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失する程度に配列番号2、4、6、も
しくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと定義す
ることもできる。特定の実施態様において、該ポリヌクレオチドは、その最初のアミノ酸
残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基184、185、186、187、188、189、
190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、
206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、
222、223、224、225、226、227、及び228からなる群から選択され、その最後のアミノ酸
残基が、それぞれ、配列番号2、4、6、もしくは8の残基320、321、322、323、324、325、
326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、
342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、
358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、
374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、もしくは386からなる
群から選択されるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが欠失している配列番
号2、4、6、もしくは8を含む又はこれらからなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される、本発明のCyaA由来タンパク質、特に、変異体CyaA由来タンパク
質をコードするポリヌクレオチドを産生する方法も、本発明の一部である。この方法は、
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチドか
ら、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位
置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又
は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、該配列中の連続的なヌク
レオチド残基のヌクレオチド断片を欠失させる工程;及び(b)該ポリヌクレオチドを回収す
る工程を含む。
質をコードするポリヌクレオチドを産生する方法も、本発明の一部である。この方法は、
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチドか
ら、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位
置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又
は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、該配列中の連続的なヌク
レオチド残基のヌクレオチド断片を欠失させる工程;及び(b)該ポリヌクレオチドを回収す
る工程を含む。
或いは、CyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、従来の方法を用いて、
求められるCyaA由来タンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/又は発現の
最適化を考慮して、化学合成される。
求められるCyaA由来タンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/又は発現の
最適化を考慮して、化学合成される。
本発明はまた、本明細書に記載される、本発明のポリヌクレオチドによってコードされ
るCyaA由来タンパク質に関する。特定のCyaA由来タンパク質は、配列番号10、12、13、14
、15、16、17、18、19、及び20に示される配列からなる。
るCyaA由来タンパク質に関する。特定のCyaA由来タンパク質は、配列番号10、12、13、14
、15、16、17、18、19、及び20に示される配列からなる。
本発明の枠内で、変異体CyaA由来タンパク質を含む、CyaA由来タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドは、該CyaA由来タンパク質もしくは変異体CyaA由来タンパク質と、異種
ポリペプチドとを含む又はこれらからなるキメラタンパク質をコードする本発明のキメラ
ポリヌクレオチドを産生するために使用され、その場合、該異種ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、CyaAの欠失したヌクレオチド断片に置き換わる。
ポリヌクレオチドは、該CyaA由来タンパク質もしくは変異体CyaA由来タンパク質と、異種
ポリペプチドとを含む又はこれらからなるキメラタンパク質をコードする本発明のキメラ
ポリヌクレオチドを産生するために使用され、その場合、該異種ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、CyaAの欠失したヌクレオチド断片に置き換わる。
したがって、本発明は、キメラポリヌクレオチド、すなわち、本明細書で定義されるキ
メラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、ここで、CyaA由来タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して本明細書に開示されるありとあらゆる実
施態様が適用される。
メラタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものであり、ここで、CyaA由来タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドに関して本明細書に開示されるありとあらゆる実
施態様が適用される。
したがって、本発明はまた、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生す
る方法であって:
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列
番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、
その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置す
るアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8
の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させ
ること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを回収すること
を含む、方法に関する。
る方法であって:
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列
番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、
その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置す
るアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8
の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させ
ること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを回収すること
を含む、方法に関する。
本発明はまた、キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列
番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、
その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置す
るアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8
の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させ
ること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;及び
(d)該発現したキメラタンパク質を回収すること
を含む、方法に関する。
(a)配列番号2、4、6、もしくは8に示されるボルデテラCyaAをコードするか、又は配列
番号2との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチドから、
その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置す
るアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8
の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠失させ
ること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び欠失したヌクレオチド断片の部位で、異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;及び
(d)該発現したキメラタンパク質を回収すること
を含む、方法に関する。
本発明のキメラタンパク質を産生する方法は、キメラポリヌクレオチドコンストラクト
中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを組み合わせる工程をさらに含み得る。好ましい実施態様において、工程(b)で得
られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該組み合
わせの後、得られるキメラポリヌクレオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌ
クレオチドコンストラクト、次いで、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク
質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含む又はこれらのポリヌクレオチドコ
ンストラクトを含有するような形で、コンストラクト中で組み合わされる。
中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドを組み合わせる工程をさらに含み得る。好ましい実施態様において、工程(b)で得
られるポリヌクレオチド及びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該組み合
わせの後、得られるキメラポリヌクレオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌ
クレオチドコンストラクト、次いで、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク
質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含む又はこれらのポリヌクレオチドコ
ンストラクトを含有するような形で、コンストラクト中で組み合わされる。
本発明において、「最初の3つのヌクレオチド」又は「最後の3つのヌクレオチド」に言
及する場合、これらの3つのヌクレオチドは、遺伝暗号に従って、配列番号2、4、6、又は
8におけるその位置によって特定されるアミノ酸残基に対応するコドンを指すことが理解
される。したがって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失のサイズは、3の倍数である
。さらに、サイズが3の倍数であることに加えて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失
は、インフレームである、すなわち、該欠失は、リーディングフレームを変更することも
、該欠失の周辺(上流及び下流)の残基を変更することもなく、求められるアミノ酸残基を
除去する。
及する場合、これらの3つのヌクレオチドは、遺伝暗号に従って、配列番号2、4、6、又は
8におけるその位置によって特定されるアミノ酸残基に対応するコドンを指すことが理解
される。したがって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失のサイズは、3の倍数である
。さらに、サイズが3の倍数であることに加えて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド欠失
は、インフレームである、すなわち、該欠失は、リーディングフレームを変更することも
、該欠失の周辺(上流及び下流)の残基を変更することもなく、求められるアミノ酸残基を
除去する。
欠失の工程及び挿入の工程の順序は重要ではなく、両工程は、同時に実施することがで
きる。
きる。
本方法の第一の実施態様において、欠失の工程は、挿入の工程の前に実行される。した
がって、ひとたび断片の欠失が実施されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドは、欠失したヌクレオチド断片の部位で挿入される。「欠失したヌクレオチド断片
の部位で」とは、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、CyaAのN末端側(第
一のCyaA断片に相当する)とCyaAのC末端側(第二のCyaA断片に相当する)の間に挿入される
ことを意味する。CyaAのN末端側とC末端側の両方の配列は、配列番号2、4、6、もしくは8
、又は本発明による変異体のN末端部分及びC末端部分の配列と同一であるので、挿入の部
位を容易に特定することができる。
がって、ひとたび断片の欠失が実施されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドは、欠失したヌクレオチド断片の部位で挿入される。「欠失したヌクレオチド断片
の部位で」とは、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、CyaAのN末端側(第
一のCyaA断片に相当する)とCyaAのC末端側(第二のCyaA断片に相当する)の間に挿入される
ことを意味する。CyaAのN末端側とC末端側の両方の配列は、配列番号2、4、6、もしくは8
、又は本発明による変異体のN末端部分及びC末端部分の配列と同一であるので、挿入の部
位を容易に特定することができる。
第二の実施態様において、挿入の工程は、欠失の工程の前に実行される。ひとたび欠失
させるべき断片が特定されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、欠
失させるべき断片の最初の残基をコードする3つのヌクレオチド(コドン)の上流(5')、又
は欠失させるべき断片の最後の残基をコードする最後の3つのヌクレオチド(コドン)の下
流(3')のどちらかに挿入される。ひとたび異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの挿入が行われると、欠失させるべき断片は、CyaA/異種ポリペプチド分子をコードす
るポリヌクレオチドから切り出される。
させるべき断片が特定されると、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、欠
失させるべき断片の最初の残基をコードする3つのヌクレオチド(コドン)の上流(5')、又
は欠失させるべき断片の最後の残基をコードする最後の3つのヌクレオチド(コドン)の下
流(3')のどちらかに挿入される。ひとたび異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドの挿入が行われると、欠失させるべき断片は、CyaA/異種ポリペプチド分子をコードす
るポリヌクレオチドから切り出される。
第三の実施態様において、欠失の工程と挿入の工程の両方は、同時に、すなわち、適当
な制限酵素を用いて、単一の反応工程で実施される。
な制限酵素を用いて、単一の反応工程で実施される。
本方法の特定の実施態様において、欠失の工程は、配列番号2、4、6、もしくは8に示さ
れるボルデテラCyaA、又は本発明による変異体をコードするポリヌクレオチドから、配列
番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2
、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6
、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もし
くは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を除去することを含む。
れるボルデテラCyaA、又は本発明による変異体をコードするポリヌクレオチドから、配列
番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2
、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6
、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配列番号2、4、6、もし
くは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を除去することを含む。
別の実施態様において、欠失の工程は、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69
に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌク
レオチド682～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は
配列番号69のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片を、或いは配列番号1、3
、5、もしくは7、又は配列番号69に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、
もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは
配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオ
チド断片を除去することを含む。
に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌク
レオチド682～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は
配列番号69のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片を、或いは配列番号1、3
、5、もしくは7、又は配列番号69に示されるポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、
もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは
配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオ
チド断片を除去することを含む。
断片の欠失を実施するために、当業者は、場合によっては、CyaAをコードするポリヌク
レオチド中でより大きな欠失を行う必要があるであろうし、その後、異種ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドをクローニングするときに埋め合わせをして、上に開示され
ている欠失を最終結果として達成するであろう。
レオチド中でより大きな欠失を行う必要があるであろうし、その後、異種ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドをクローニングするときに埋め合わせをして、上に開示され
ている欠失を最終結果として達成するであろう。
或いは、本発明のキメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドを、従来の方
法を用いて、求められるキメラタンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/
又は発現の最適化を考慮して、化学合成する。例えば、該化学合成されたポリヌクレオチ
ドを細胞内で発現させ、発現したキメラタンパク質をこのように回収する。
法を用いて、求められるキメラタンパク質配列に従って、任意に、遺伝暗号の縮重及び/
又は発現の最適化を考慮して、化学合成する。例えば、該化学合成されたポリヌクレオチ
ドを細胞内で発現させ、発現したキメラタンパク質をこのように回収する。
本発明はまた、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、5'から3'に
、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に
位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断
片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321
～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示
される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する
変異体をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらからなるポリヌクレオチドに関す
る。
、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に
位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断
片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321
～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示
される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する
変異体をコードするポリヌクレオチドを含む又はこれらからなるポリヌクレオチドに関す
る。
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由
来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
との関連でこれらの断片に等しく適用される。
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由
来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
との関連でこれらの断片に等しく適用される。
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質をコードする
ポリヌクレオチドとの関連で記載される断片の変異体に等しく適用される。
ポリヌクレオチドとの関連で記載される断片の変異体に等しく適用される。
特定の実施態様において、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは:
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される。
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される。
本明細書で定義されるキメラタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドの特定の
実施態様において、(a)のポリヌクレオチドは、(b)のポリヌクレオチドに融合しており、
(b)のポリヌクレオチドは、それ自体、(c)のポリヌクレオチドに融合している。
実施態様において、(a)のポリヌクレオチドは、(b)のポリヌクレオチドに融合しており、
(b)のポリヌクレオチドは、それ自体、(c)のポリヌクレオチドに融合している。
本発明において、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、(c)のポリヌク
レオチドのリーディングフレーム(例えば、その配列が、配列番号2の位置321～位置387に
位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳
菌CyaAタンパク質の断片又はその変異体のリーディングフレーム)を保持するように、3の
倍数となるサイズを有する。
レオチドのリーディングフレーム(例えば、その配列が、配列番号2の位置321～位置387に
位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳
菌CyaAタンパク質の断片又はその変異体のリーディングフレーム)を保持するように、3の
倍数となるサイズを有する。
本発明の特定の実施態様において、キメラポリヌクレオチドは、その3'末端に、ボルデ
テラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含
む。
テラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含
む。
キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法によって入
手し得るか、又は入手可能であり得る。
手し得るか、又は入手可能であり得る。
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、すなわち、変異体CyaA由来タ
ンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はキメラタンパク
質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、核酸ベクター、例えば、プラスミド
に関する。特定の実施態様において、該ベクターは、発現ベクター、すなわち、明示的に
記載されているエレメントの他に、本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動するために必
要な全てのエレメント(発現制御配列)、特に、転写調節エレメントを含むベクターである
。「転写調節エレメント」は、ポリヌクレオチドの転写の調節に関与する任意のDNA領域
を規定するものであり、プロモーター、例えば、IPTGによる誘導が可能なプロモーター、
例えば、lac、tac、もしくはT7プロモーター、又は温度変化による誘導が可能なプロモー
ター、例えば、ラムダファージのpRもしくはpLプロモーター、エンハンサー、或いはシス
作用型調節エレメントを包含する。これらのエレメント、特に、プロモーターは、核酸ベ
クターでトランスフェクトされる細胞の性質に応じて選ばれる。求められる発現レベルに
よる又はトランスフェクトされる細胞による好適なプロモーターの決定は、当業者の知識
の一部をなしている。特定の実施態様において、該ベクターは、プラスミドである。本発
明のベクターの調製に好適な従来のプラスミドの例は、pUC又はpBR322である。
ンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はキメラタンパク
質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、核酸ベクター、例えば、プラスミド
に関する。特定の実施態様において、該ベクターは、発現ベクター、すなわち、明示的に
記載されているエレメントの他に、本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動するために必
要な全てのエレメント(発現制御配列)、特に、転写調節エレメントを含むベクターである
。「転写調節エレメント」は、ポリヌクレオチドの転写の調節に関与する任意のDNA領域
を規定するものであり、プロモーター、例えば、IPTGによる誘導が可能なプロモーター、
例えば、lac、tac、もしくはT7プロモーター、又は温度変化による誘導が可能なプロモー
ター、例えば、ラムダファージのpRもしくはpLプロモーター、エンハンサー、或いはシス
作用型調節エレメントを包含する。これらのエレメント、特に、プロモーターは、核酸ベ
クターでトランスフェクトされる細胞の性質に応じて選ばれる。求められる発現レベルに
よる又はトランスフェクトされる細胞による好適なプロモーターの決定は、当業者の知識
の一部をなしている。特定の実施態様において、該ベクターは、プラスミドである。本発
明のベクターの調製に好適な従来のプラスミドの例は、pUC又はpBR322である。
特定の実施態様において、該核酸ベクターは、ボルデテラ株のCyaCコード配列、例えば
、配列番号21に示される百日咳菌のcyaC遺伝子も含む。別の実施態様において、該核酸ベ
クターは、特定の細胞型でのより良好な発現のために最適化された、特に、大腸菌でのよ
り良好な発現のために最適化された型のボルデテラ株のCyaCコード配列も含む。大腸菌用
の最適化された型のCyaC配列は、配列番号22に示されている通りである。
、配列番号21に示される百日咳菌のcyaC遺伝子も含む。別の実施態様において、該核酸ベ
クターは、特定の細胞型でのより良好な発現のために最適化された、特に、大腸菌でのよ
り良好な発現のために最適化された型のボルデテラ株のCyaCコード配列も含む。大腸菌用
の最適化された型のCyaC配列は、配列番号22に示されている通りである。
本発明で定義されるキメラタンパク質を産生するために使用することができる特定のプ
ラスミドは、材料及び方法に記載されているプラスミドであり、その配列は、配列番号59
、62、65、及び68に示されている通りである。これら4つのプラスミドに含まれる異種ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに置き換えることができる。したがって、配列番号59のプ
ラスミドから出発して、ヌクレオチド904～1731に含まれる配列を除去し、本明細書に記
載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番号62
のプラスミドから出発して、ヌクレオチド772～1599に含まれる配列を除去し、本明細書
に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番
号65のプラスミドから出発して、ヌクレオチド904～1836に含まれる配列を除去し、本明
細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配
列番号68のプラスミドから出発してヌクレオチド772～1704に含まれる配列を除去し、本
明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。
ラスミドは、材料及び方法に記載されているプラスミドであり、その配列は、配列番号59
、62、65、及び68に示されている通りである。これら4つのプラスミドに含まれる異種ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを除去し、本明細書に記載の異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに置き換えることができる。したがって、配列番号59のプ
ラスミドから出発して、ヌクレオチド904～1731に含まれる配列を除去し、本明細書に記
載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番号62
のプラスミドから出発して、ヌクレオチド772～1599に含まれる配列を除去し、本明細書
に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配列番
号65のプラスミドから出発して、ヌクレオチド904～1836に含まれる配列を除去し、本明
細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。或いは、配
列番号68のプラスミドから出発してヌクレオチド772～1704に含まれる配列を除去し、本
明細書に記載の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換える。
特筆すべきことに、核酸ベクターがいくつかのポリヌクレオチドを含有するとき、転写
調節エレメント(複数可)は、全てのポリヌクレオチドに固有のものであっても、それらの
うちの一部によって共有されるものであってもよく、又は対照的に、各々のポリヌクレオ
チドは、1以上の特定の転写調節エレメントと関連するものであってもよい。後者の場合
、いくつかの転写調節エレメントは、類似していても、異なっていてもよい。
調節エレメント(複数可)は、全てのポリヌクレオチドに固有のものであっても、それらの
うちの一部によって共有されるものであってもよく、又は対照的に、各々のポリヌクレオ
チドは、1以上の特定の転写調節エレメントと関連するものであってもよい。後者の場合
、いくつかの転写調節エレメントは、類似していても、異なっていてもよい。
本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、すなわち、変異体CyaA由来タ
ンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはキメラタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、又は本明細書で定義されるベクタ
ーを含む、細胞(好ましくは、単離されたもの)又は細胞培養物に関する。特定の実施態様
において、該細胞又は細胞培養物は、本発明のベクターでトランスフェクトされる。
ンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはキメラタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む、又は本明細書で定義されるベクタ
ーを含む、細胞(好ましくは、単離されたもの)又は細胞培養物に関する。特定の実施態様
において、該細胞又は細胞培養物は、本発明のベクターでトランスフェクトされる。
該細胞は、原核細胞又は原核細胞から作られる細胞培養物であることができる。特定の
実施態様において、該細胞は、組換えタンパク質(複数可)を発現させ及び/又は産生する
のに好適である。特定の実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、細菌又は細菌培養
物である。好ましい実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、BL21、BLR、TG1、又は
HMS174株などの、大腸菌株培養物である。
実施態様において、該細胞は、組換えタンパク質(複数可)を発現させ及び/又は産生する
のに好適である。特定の実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、細菌又は細菌培養
物である。好ましい実施態様において、該細胞又は細胞培養物は、BL21、BLR、TG1、又は
HMS174株などの、大腸菌株培養物である。
したがって、本発明の細胞又は細胞培養物は、本発明のポリヌクレオチド、すなわち、
変異体CyaA由来タンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又
はキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか、及び適切な場合、同時に
、cyaC遺伝子又は最適化された型のcyaC遺伝子を発現する。
変異体CyaA由来タンパク質を含むCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又
はキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか、及び適切な場合、同時に
、cyaC遺伝子又は最適化された型のcyaC遺伝子を発現する。
「CyaA」又は「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」という用語は、翻訳後
修飾型のボルデテラCyaAタンパク質を包含し、好ましくは、翻訳後修飾型のボルデテラCy
aAタンパク質である。したがって、特定の実施態様において、本発明の該「CyaA由来タン
パク質」又は「キメラタンパク質」は、その残基のうちの少なくとも1つ、特に、百日咳
菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の位
置860及び983に位置する残基に対応するか、又は気管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置85
9及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン残基のうちの少なくとも1つ、好ましく
は、該2つのリジン残基の翻訳後アシル化によって修飾される。「アシル化」とは、本明
細書において、パルミトイル化、すなわち、本発明のCyaA、CyaA由来タンパク質、又はキ
メラタンパク質の残基(複数可)上へのパルミテート及び/又はパルミトレート基(複数可)
の付加を意味する。したがって、該「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」は
、これらの残基のいくつかの上に、好ましくは、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もし
くはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の残基860～983に対応するか、又は気
管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置859及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン
残基のうちの1つ、好ましくは、該2つのリジン残基の上にパルミトイル基を担持する。「
に対応する」とは、本発明のCyaA由来タンパク質又はキメラタンパク質中で翻訳後修飾さ
れる残基(複数可)が、その位置が、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテ
ラ・パラペルツッシスCyaA(それぞれ、配列番号2、4、及び6)のCyaAの配列中のリジン860
及び983、又は気管支敗血症菌CyaA(配列番号8)の配列中のリジン859及び982と一致する残
基(複数可)であることを意味する。本発明のタンパク質中のこれらのリジン残基の特定は
、本発明のタンパク質の配列と、配列番号2、4、6、又は8に定義される配列とを整列させ
、比較することにより、当業者によって実施され得る。
修飾型のボルデテラCyaAタンパク質を包含し、好ましくは、翻訳後修飾型のボルデテラCy
aAタンパク質である。したがって、特定の実施態様において、本発明の該「CyaA由来タン
パク質」又は「キメラタンパク質」は、その残基のうちの少なくとも1つ、特に、百日咳
菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の位
置860及び983に位置する残基に対応するか、又は気管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置85
9及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン残基のうちの少なくとも1つ、好ましく
は、該2つのリジン残基の翻訳後アシル化によって修飾される。「アシル化」とは、本明
細書において、パルミトイル化、すなわち、本発明のCyaA、CyaA由来タンパク質、又はキ
メラタンパク質の残基(複数可)上へのパルミテート及び/又はパルミトレート基(複数可)
の付加を意味する。したがって、該「CyaA由来タンパク質」又は「キメラタンパク質」は
、これらの残基のいくつかの上に、好ましくは、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もし
くはボルデテラ・パラペルツッシスCyaAの全長配列の残基860～983に対応するか、又は気
管支敗血症菌CyaAの全長配列の位置859及び982に位置する残基に対応する、2つのリジン
残基のうちの1つ、好ましくは、該2つのリジン残基の上にパルミトイル基を担持する。「
に対応する」とは、本発明のCyaA由来タンパク質又はキメラタンパク質中で翻訳後修飾さ
れる残基(複数可)が、その位置が、百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ、もしくはボルデテ
ラ・パラペルツッシスCyaA(それぞれ、配列番号2、4、及び6)のCyaAの配列中のリジン860
及び983、又は気管支敗血症菌CyaA(配列番号8)の配列中のリジン859及び982と一致する残
基(複数可)であることを意味する。本発明のタンパク質中のこれらのリジン残基の特定は
、本発明のタンパク質の配列と、配列番号2、4、6、又は8に定義される配列とを整列させ
、比較することにより、当業者によって実施され得る。
パルミトイル化のプロセスは、ボルデテラ種の、好ましくは、その天然配列が配列番号
21に示されている百日咳菌のCyaCコード配列のcyaC遺伝子によって媒介される。大腸菌で
の産生用に最適化された、CyaCコード配列の1つの型は、配列番号22に示されている。こ
の(これらの)翻訳後修飾は、CyaAタンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明のCy
aA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本発明のキメラタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドと、該cyaC遺伝子との共発現によって得ることができる。
21に示されている百日咳菌のCyaCコード配列のcyaC遺伝子によって媒介される。大腸菌で
の産生用に最適化された、CyaCコード配列の1つの型は、配列番号22に示されている。こ
の(これらの)翻訳後修飾は、CyaAタンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明のCy
aA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は本発明のキメラタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドと、該cyaC遺伝子との共発現によって得ることができる。
特定の実施態様において、CyaA及びCyaCタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチ
ドコンストラクトは、5'末端から3'末端に、決められた宿主細胞、例えば、大腸菌での発
現用の最適化された配列から有利になるcyaAポリヌクレオチド又は遺伝子、及び決められ
た宿主細胞、例えば、大腸菌での発現用の最適化された配列から有利になるcyaCポリヌク
レオチド又は遺伝子を含む。該コンストラクトへのポリヌクレオチドのこの挿入順序は、
翻訳後修飾型のCyaAの発現の効率を増大させるのに好適なそれぞれの量及び立体構造での
CyaA及びCyaCタンパク質の発現に有利に働く。
ドコンストラクトは、5'末端から3'末端に、決められた宿主細胞、例えば、大腸菌での発
現用の最適化された配列から有利になるcyaAポリヌクレオチド又は遺伝子、及び決められ
た宿主細胞、例えば、大腸菌での発現用の最適化された配列から有利になるcyaCポリヌク
レオチド又は遺伝子を含む。該コンストラクトへのポリヌクレオチドのこの挿入順序は、
翻訳後修飾型のCyaAの発現の効率を増大させるのに好適なそれぞれの量及び立体構造での
CyaA及びCyaCタンパク質の発現に有利に働く。
本発明の特定の実施態様において、本明細書に開示される野生型ボルデテラCyaAタンパ
ク質中で実施される断片[該断片の最初のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号2、4、6、
又は8の残基184～残基228に位置し、該断片の最後のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番
号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する]の欠失を除いて、本発明のCyaA由来タ
ンパク質又はキメラタンパク質のCyaA部分は、配列番号2、4、6、又は8と比較して、いか
なる他の変化(付加、欠失、及び/又は置換)も受けない。
ク質中で実施される断片[該断片の最初のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号2、4、6、
又は8の残基184～残基228に位置し、該断片の最後のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番
号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する]の欠失を除いて、本発明のCyaA由来タ
ンパク質又はキメラタンパク質のCyaA部分は、配列番号2、4、6、又は8と比較して、いか
なる他の変化(付加、欠失、及び/又は置換)も受けない。
興味深いことに、本発明のCyaA由来タンパク質及びキメラタンパク質は、非細胞傷害性
である、すなわち、それらの酵素活性は、その最初のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番
号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置し、その最後のアミノ酸残基が、それぞれ、
配列番号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する断片の欠失の後に不活化されてい
る。それゆえ、特定の実施態様において、挿入も、欠失も、置換も実施されていない。特
に、CyaAの残基188及び189が、本発明のタンパク質中になおも存在する場合、ジペプチド
(例えば、ジペプチドLQ又はGS)は、残基188と189の間に挿入されない。
である、すなわち、それらの酵素活性は、その最初のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番
号2、4、6、又は8の残基184～残基228に位置し、その最後のアミノ酸残基が、それぞれ、
配列番号2、4、6、又は8の残基320～残基386に位置する断片の欠失の後に不活化されてい
る。それゆえ、特定の実施態様において、挿入も、欠失も、置換も実施されていない。特
に、CyaAの残基188及び189が、本発明のタンパク質中になおも存在する場合、ジペプチド
(例えば、ジペプチドLQ又はGS)は、残基188と189の間に挿入されない。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるか、本発明のベクター
から発現されるか、又は本発明の細胞培養物によって産生されるキメラタンパク質に関す
る。
から発現されるか、又は本発明の細胞培養物によって産生されるキメラタンパク質に関す
る。
本発明のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の
残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示
される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を
有する変異体、(b)異種ポリペプチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置38
7に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百
日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変
異体を含む又はこれらからなる。
残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示
される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を
有する変異体、(b)異種ポリペプチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置38
7に位置する残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百
日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくはこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変
異体を含む又はこれらからなる。
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由
来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
との関連でこれらの断片に等しく適用される。
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、CyaA由
来タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド
との関連でこれらの断片に等しく適用される。
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質との関連で記
載される断片に等しく適用される。
載される断片に等しく適用される。
したがって、本発明はまた:
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなる断片;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなる断片;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
本明細書で定義されるキメラタンパク質の特定の実施態様において、(a)の断片は、(b)
の異種ポリペプチドに融合しており、(b)の異種ポリペプチドは、それ自体、(c)の断片に
融合している。
の異種ポリペプチドに融合しており、(b)の異種ポリペプチドは、それ自体、(c)の断片に
融合している。
「キメラの」とは、タンパク質が、本明細書で定義されるように、ボルデテラCyaAに由
来する断片及びボルデテラCyaAに由来しない1つのポリペプチドを含む又はこれらからな
ることを意味する。それゆえ、該ポリペプチドは異種と言われ、すなわち、その全体的な
配列は、ボルデテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部と
は同一でなく;特定の実施態様において、この異種ポリペプチドの全体的な配列は、ボル
デテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部と類似していな
い、すなわち、その配列は、ボルデテラCyaAの一部との、特に、配列番号2、4、6、又は8
に示されるCyaAタンパク質の一部との、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％
未満、30％未満、又は20％未満の類似性を有し、該類似性は、この定義については、異種
ポリペプチドの配列及び同等のサイズのボルデテラCyaAの一部の配列(異種ポリペプチド
及び同じサイズを有するボルデテラCyaAの一部)を比較することにより、算出される。特
定の実施態様において、異種ペプチドの配列及び本明細書で定義されるボルデテラCyaAに
由来する部分(又は断片)の配列は、7を超える連続的なアミノ酸残基にわたって同一性(10
0％類似性)を共有しない。
来する断片及びボルデテラCyaAに由来しない1つのポリペプチドを含む又はこれらからな
ることを意味する。それゆえ、該ポリペプチドは異種と言われ、すなわち、その全体的な
配列は、ボルデテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部と
は同一でなく;特定の実施態様において、この異種ポリペプチドの全体的な配列は、ボル
デテラCyaAの一部、特に、配列番号2、4、6、又は8に示されるCyaAの一部と類似していな
い、すなわち、その配列は、ボルデテラCyaAの一部との、特に、配列番号2、4、6、又は8
に示されるCyaAタンパク質の一部との、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％
未満、30％未満、又は20％未満の類似性を有し、該類似性は、この定義については、異種
ポリペプチドの配列及び同等のサイズのボルデテラCyaAの一部の配列(異種ポリペプチド
及び同じサイズを有するボルデテラCyaAの一部)を比較することにより、算出される。特
定の実施態様において、異種ペプチドの配列及び本明細書で定義されるボルデテラCyaAに
由来する部分(又は断片)の配列は、7を超える連続的なアミノ酸残基にわたって同一性(10
0％類似性)を共有しない。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、9～500アミノ酸残基、特に、9～400残
基、9～300残基、9～200残基、9～100残基、20～500残基、20～400残基、20～300残基、2
0～200残基、20～100残基、50～500残基50～400残基、50～300残基、50～200残基、50～1
00残基、100～500残基、100～400残基、100～300残基、又は100～200のサイズを有する。
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズは、27～1500ヌクレオチド、特
に、27～1200ヌクレオチド、27～900ヌクレオチド、27～600ヌクレオチド、27～300ヌク
レオチド、60～1500ヌクレオチド、60～1200ヌクレオチド、60～900ヌクレオチド、60～6
00ヌクレオチド、60～300ヌクレオチド、150～1500ヌクレオチド150～1200ヌクレオチド
、150～900ヌクレオチド、150～600ヌクレオチド、150～300ヌクレオチド、300～1500ヌ
クレオチド、300～1200ヌクレオチド、300～900ヌクレオチド、又は300～600の範囲であ
り、但し、該ポリヌクレオチドのサイズ(ヌクレオチドの数)は、3の倍数である。
基、9～300残基、9～200残基、9～100残基、20～500残基、20～400残基、20～300残基、2
0～200残基、20～100残基、50～500残基50～400残基、50～300残基、50～200残基、50～1
00残基、100～500残基、100～400残基、100～300残基、又は100～200のサイズを有する。
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズは、27～1500ヌクレオチド、特
に、27～1200ヌクレオチド、27～900ヌクレオチド、27～600ヌクレオチド、27～300ヌク
レオチド、60～1500ヌクレオチド、60～1200ヌクレオチド、60～900ヌクレオチド、60～6
00ヌクレオチド、60～300ヌクレオチド、150～1500ヌクレオチド150～1200ヌクレオチド
、150～900ヌクレオチド、150～600ヌクレオチド、150～300ヌクレオチド、300～1500ヌ
クレオチド、300～1200ヌクレオチド、300～900ヌクレオチド、又は300～600の範囲であ
り、但し、該ポリヌクレオチドのサイズ(ヌクレオチドの数)は、3の倍数である。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、好ましくは、上で定義されたサイズ範
囲との組合せにおいて、負の静電電荷を有する、すなわち、異種ポリペプチドは、酸性で
ある。別の実施態様において、異種ポリペプチドの断片は、負の静電電荷を有する、すな
わち、該異種ポリペプチドのこの断片は、酸性である。異種ポリペプチドの断片は、連続
的なアミノ酸残基の連結と定義され、そのサイズは、異種ポリペプチド全体のサイズの10
％～40％、好ましくは、15％～30％である。
囲との組合せにおいて、負の静電電荷を有する、すなわち、異種ポリペプチドは、酸性で
ある。別の実施態様において、異種ポリペプチドの断片は、負の静電電荷を有する、すな
わち、該異種ポリペプチドのこの断片は、酸性である。異種ポリペプチドの断片は、連続
的なアミノ酸残基の連結と定義され、そのサイズは、異種ポリペプチド全体のサイズの10
％～40％、好ましくは、15％～30％である。
特に、静電電荷は、異種ポリペプチドに含まれるリジン及びアルギニン残基の数からア
スパラギン酸及びグルタミン酸残基の数を引いたものと定義される。一実施態様において
、異種ポリペプチドの静電電荷は、-1と等しいか、又は-1未満であり、特に、-2、-3、-4
、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-45、もしくは-50と等しいか、又はそれら未満である
。特定の実施態様において、好ましくは、前文の値のうちの1つとの組合せにおいて、異
種ポリペプチドの静電電荷は、-55、-60、-70、又は-80以上である。言い換えると、異種
ポリペプチドの静電電荷は、-55～-1、-50～-2、又は-40～-3の範囲である。比較として
、古典的なOVAエピトープ(SIINFEKL)は、0の静電電荷を有する。
スパラギン酸及びグルタミン酸残基の数を引いたものと定義される。一実施態様において
、異種ポリペプチドの静電電荷は、-1と等しいか、又は-1未満であり、特に、-2、-3、-4
、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-45、もしくは-50と等しいか、又はそれら未満である
。特定の実施態様において、好ましくは、前文の値のうちの1つとの組合せにおいて、異
種ポリペプチドの静電電荷は、-55、-60、-70、又は-80以上である。言い換えると、異種
ポリペプチドの静電電荷は、-55～-1、-50～-2、又は-40～-3の範囲である。比較として
、古典的なOVAエピトープ(SIINFEKL)は、0の静電電荷を有する。
本発明のキメラタンパク質において試験されたいくつかの異種ポリペプチドの例を本明
細書で報告する:
-キメラタンパク質Btpr_114及びBtpr_116において試験されたペプチド216(配列番号34)
は、-16の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_115及びBtpr_117において試験されたペプチド217(配列番号36)
は、-37の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_143及びBtpr_144において試験されたペプチド233(配列番号38)
は、-13の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_145及びBtpr-146において試験されたペプチド234(配列番号40)
は、-38の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_161及びBtpr_169において試験されたペプチド326(配列番号42)
は、-11の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_162及びBtpr_170において試験されたペプチド327(配列番号46)
は、-10の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_163及びBtpr_171において試験されたペプチド328(配列番号50)
は、-18の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_164 and Btpr-172において試験されたペプチド329(配列番号54
)は、-19の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_165及びBtpr_173において試験されたペプチド330(配列番号44)
は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_166及びBtpr_174において試験されたペプチド331(配列番号48)
は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_167及びBtpr_175において試験されたペプチド332(配列番号52)
は、-45の静電電荷を有する;並びに
-キメラタンパク質Btpr_168及びBtpr_176において試験されたペプチド333(配列番号56)
は、-46の静電電荷を有する。
細書で報告する:
-キメラタンパク質Btpr_114及びBtpr_116において試験されたペプチド216(配列番号34)
は、-16の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_115及びBtpr_117において試験されたペプチド217(配列番号36)
は、-37の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_143及びBtpr_144において試験されたペプチド233(配列番号38)
は、-13の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_145及びBtpr-146において試験されたペプチド234(配列番号40)
は、-38の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_161及びBtpr_169において試験されたペプチド326(配列番号42)
は、-11の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_162及びBtpr_170において試験されたペプチド327(配列番号46)
は、-10の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_163及びBtpr_171において試験されたペプチド328(配列番号50)
は、-18の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_164 and Btpr-172において試験されたペプチド329(配列番号54
)は、-19の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_165及びBtpr_173において試験されたペプチド330(配列番号44)
は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_166及びBtpr_174において試験されたペプチド331(配列番号48)
は、-30の静電電荷を有する;
-キメラタンパク質Btpr_167及びBtpr_175において試験されたペプチド332(配列番号52)
は、-45の静電電荷を有する;並びに
-キメラタンパク質Btpr_168及びBtpr_176において試験されたペプチド333(配列番号56)
は、-46の静電電荷を有する。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、1つもしくはいくつかの抗原を含み
又は該抗原からなり、各々の抗原は、本明細書で定義される1つ又はいくつかのエピトー
プを含む。本発明において、抗原は、このポリペプチド(免疫原性ポリペプチド)に含まれ
る1つ又はいくつかのエピトープに対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答を誘発すること
ができるポリペプチドと定義される。抗原は、細胞もしくはウイルス起源の全長抗原性ポ
リペプチド、この断片に含まれる抗原性決定基に対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答
を誘発することができるこの全長抗原性ポリペプチドの断片、又は1つに融合した抗原性
ポリペプチドのいくつかの部分からなるエピトープを保有する非天然の合成ポリペプチド
、もしくは1つに融合したいくつかの抗原性ポリペプチドの1つもしくはいくつかの部分か
らなる非天然の合成ポリペプチドのいずれかであり、但し、該合成ポリペプチドは、この
合成ポリペプチドに含まれる抗原性決定基に対するT細胞免疫応答を誘発することができ
る。
又は該抗原からなり、各々の抗原は、本明細書で定義される1つ又はいくつかのエピトー
プを含む。本発明において、抗原は、このポリペプチド(免疫原性ポリペプチド)に含まれ
る1つ又はいくつかのエピトープに対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答を誘発すること
ができるポリペプチドと定義される。抗原は、細胞もしくはウイルス起源の全長抗原性ポ
リペプチド、この断片に含まれる抗原性決定基に対する免疫応答、特に、T細胞免疫応答
を誘発することができるこの全長抗原性ポリペプチドの断片、又は1つに融合した抗原性
ポリペプチドのいくつかの部分からなるエピトープを保有する非天然の合成ポリペプチド
、もしくは1つに融合したいくつかの抗原性ポリペプチドの1つもしくはいくつかの部分か
らなる非天然の合成ポリペプチドのいずれかであり、但し、該合成ポリペプチドは、この
合成ポリペプチドに含まれる抗原性決定基に対するT細胞免疫応答を誘発することができ
る。
したがって、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少な
くとも1つのCD8+エピトープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを担持するか
、該エピトープを含むか、又は該エピトープからなる。「少なくとも」とは、1つ又は複
数のエピトープを意味する。エピトープは、本明細書において、細胞媒介性免疫応答、特
に、T細胞免疫応答の誘発又は誘導に関与する任意のアミノ酸配列と定義され、線形又は
立体構造性のどちらかである。したがって、本明細書に記載のエピトープには、宿主のAP
C(抗原提示細胞)によってプロセッシングされるもの、特に、クラスI MHC(主要組織適合
性複合体)分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD8+ Tリンパ球で
あるエピトープ、又はクラスII MHC分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標
的細胞がCD4+ Tリンパ球であるエピトープが含まれる。本発明におけるエピトープは、好
ましくは、9～17、好ましくは、9～12残基のサイズを有する。本明細書に記載のエピトー
プには、体液性応答に関与するBエピトープ(複数可)も含まれる。
くとも1つのCD8+エピトープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを担持するか
、該エピトープを含むか、又は該エピトープからなる。「少なくとも」とは、1つ又は複
数のエピトープを意味する。エピトープは、本明細書において、細胞媒介性免疫応答、特
に、T細胞免疫応答の誘発又は誘導に関与する任意のアミノ酸配列と定義され、線形又は
立体構造性のどちらかである。したがって、本明細書に記載のエピトープには、宿主のAP
C(抗原提示細胞)によってプロセッシングされるもの、特に、クラスI MHC(主要組織適合
性複合体)分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標的細胞がCD8+ Tリンパ球で
あるエピトープ、又はクラスII MHC分子と関連して認識されるTエピトープ、例えば、標
的細胞がCD4+ Tリンパ球であるエピトープが含まれる。本発明におけるエピトープは、好
ましくは、9～17、好ましくは、9～12残基のサイズを有する。本明細書に記載のエピトー
プには、体液性応答に関与するBエピトープ(複数可)も含まれる。
様々な起源を有するいくつかの抗原を含む特定の異種ポリペプチドが、本発明者らによ
り設計されている。この異種ポリペプチドは、マウス及びヒトMHCクラスI(CD8応答)及びM
HCクラスII(CD4応答)拘束性T細胞エピトープ: GFP11、MOG35-55、OVA257-264、IE191-110
、CLA4、HA512-520、OVA323-339、MELAN-A26-35、HA307-319、LCMV GP33-41、MAGEA3111-
180、MAGEA3244-285、HPV16E7の断片、及びHPV18E7の断片を含む抗原を担持する。この抗
原のアミノ酸配列は、配列番号24に示されている通りであり、本発明の一部である。
り設計されている。この異種ポリペプチドは、マウス及びヒトMHCクラスI(CD8応答)及びM
HCクラスII(CD4応答)拘束性T細胞エピトープ: GFP11、MOG35-55、OVA257-264、IE191-110
、CLA4、HA512-520、OVA323-339、MELAN-A26-35、HA307-319、LCMV GP33-41、MAGEA3111-
180、MAGEA3244-285、HPV16E7の断片、及びHPV18E7の断片を含む抗原を担持する。この抗
原のアミノ酸配列は、配列番号24に示されている通りであり、本発明の一部である。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少な
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、ウイルス起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少
なくとも1つのエピトープは、HIV、HBV、HCV、アデノウイルス、EBV、ヘルペスウイルス
、HTLV.1ウイルス、及びCMVに由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗
原又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種
ポリペプチド、少なくとも1つの抗原、又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来し
ない。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトープもしくは複数の抗
原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、同じ目、同じ群、同
じ科、同じ亜科、同じ属、もしくは同じ種に由来し、及び/又は異なる目、異なる群、異
なる科、異なる亜科、異なる属、もしくは異なる種に由来する。
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、ウイルス起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少
なくとも1つのエピトープは、HIV、HBV、HCV、アデノウイルス、EBV、ヘルペスウイルス
、HTLV.1ウイルス、及びCMVに由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗
原又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種
ポリペプチド、少なくとも1つの抗原、又は少なくとも1つのエピトープは、HPVに由来し
ない。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトープもしくは複数の抗
原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、同じ目、同じ群、同
じ科、同じ亜科、同じ属、もしくは同じ種に由来し、及び/又は異なる目、異なる群、異
なる科、異なる亜科、異なる属、もしくは異なる種に由来する。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少な
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、細胞起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少なく
とも1つのエピトープは、原核細胞又は真核細胞に由来する。
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、細胞起源である。したがって、該少なくとも1つの抗原又は少なく
とも1つのエピトープは、原核細胞又は真核細胞に由来する。
一実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、細菌
、真菌、又は寄生虫、例えば、限定されないが、クラミジア(Chlamydia)、マラリア原虫(
Plasmodium)、カンジダ(Candida)、リューシマニア(Leishmania)、又はヒト結核菌(Mycob
acterium tuberculosis)に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原
又は少なくとも1つのエピトープは、ボルデテラ株に由来しない。別の特定の実施態様に
おいて、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、CyaAではないボルデ
テラ株の抗原に由来する。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトー
プもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、
同じ細菌、同じ真菌、又は同じ寄生虫に由来する。別の実施態様において、該ポリペプチ
ドが、複数のエピトープもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエ
ピトープ又は抗原は、異なる細菌、異なる真菌、又は異なる寄生虫に由来する。
、真菌、又は寄生虫、例えば、限定されないが、クラミジア(Chlamydia)、マラリア原虫(
Plasmodium)、カンジダ(Candida)、リューシマニア(Leishmania)、又はヒト結核菌(Mycob
acterium tuberculosis)に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原
又は少なくとも1つのエピトープは、ボルデテラ株に由来しない。別の特定の実施態様に
おいて、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、CyaAではないボルデ
テラ株の抗原に由来する。特定の実施態様において、該ポリペプチドが、複数のエピトー
プもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエピトープ又は抗原は、
同じ細菌、同じ真菌、又は同じ寄生虫に由来する。別の実施態様において、該ポリペプチ
ドが、複数のエピトープもしくは複数の抗原を含む又はこれらからなる場合、これらのエ
ピトープ又は抗原は、異なる細菌、異なる真菌、又は異なる寄生虫に由来する。
別の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくとも1つのエピトープは、哺
乳動物細胞に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、腫瘍抗原、すなわち、腫瘍によるか又は癌細胞によって発現され
るペプチドに由来するものであり、該腫瘍は、自己のものであるか又は病原体によって誘
導されるものであり;特定の実施態様において、該腫瘍抗原は、自己のもの、特に、ヒト
起源のものである。「腫瘍抗原」という用語は、以下の腫瘍抗原群を包含し、本発明のキ
メラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、以下の群のうちの少なくとも1つにおい
て選択され得る:(a)腫瘍胎児性腫瘍抗原、(b)腫瘍ウイルス性腫瘍抗原、(c)多種多様な正
常組織で発現され、腫瘍で過剰発現される、過剰発現した/蓄積した腫瘍抗原、(d)多くの
腫瘍で発現されるが、正常組織では発現されない共通の腫瘍特異的抗原又は癌精巣抗原(B
AGEファミリー、GAGEファミリー、MAGEファミリー、SAGEファミリー、及びXAGEファミリ
ーを含む)、(e)系譜制限腫瘍抗原、(f)遍在的に発現される遺伝子の点突然変異によって
生じる突然変異した腫瘍抗原;並びに(g)腫瘍の起源となる正常組織で発現されるが、腫瘍
特異的ではない、分化腫瘍抗原。
乳動物細胞に由来する。特定の実施態様において、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、腫瘍抗原、すなわち、腫瘍によるか又は癌細胞によって発現され
るペプチドに由来するものであり、該腫瘍は、自己のものであるか又は病原体によって誘
導されるものであり;特定の実施態様において、該腫瘍抗原は、自己のもの、特に、ヒト
起源のものである。「腫瘍抗原」という用語は、以下の腫瘍抗原群を包含し、本発明のキ
メラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、以下の群のうちの少なくとも1つにおい
て選択され得る:(a)腫瘍胎児性腫瘍抗原、(b)腫瘍ウイルス性腫瘍抗原、(c)多種多様な正
常組織で発現され、腫瘍で過剰発現される、過剰発現した/蓄積した腫瘍抗原、(d)多くの
腫瘍で発現されるが、正常組織では発現されない共通の腫瘍特異的抗原又は癌精巣抗原(B
AGEファミリー、GAGEファミリー、MAGEファミリー、SAGEファミリー、及びXAGEファミリ
ーを含む)、(e)系譜制限腫瘍抗原、(f)遍在的に発現される遺伝子の点突然変異によって
生じる突然変異した腫瘍抗原;並びに(g)腫瘍の起源となる正常組織で発現されるが、腫瘍
特異的ではない、分化腫瘍抗原。
本発明の異種ポリペプチドがいくつかの抗原を含む場合、これらの抗原は、融合してい
るか、ペプチドリンカーによって隔てられているか、又は該抗原のうちの少なくとも2つ
が融合している一方で、該抗原のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられてい
るかのいずれかである。特定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2～10残基の
サイズを有する。該リンカーは、抗原を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するた
めに付加され得る。
るか、ペプチドリンカーによって隔てられているか、又は該抗原のうちの少なくとも2つ
が融合している一方で、該抗原のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられてい
るかのいずれかである。特定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2～10残基の
サイズを有する。該リンカーは、抗原を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するた
めに付加され得る。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原もしくは少な
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは
、HPVに由来する2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、もしくは10の抗原を含む又
はこれらからなる。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも3つ
のHPV抗原を含み、各々のHPV抗原は、異なるHPV型に由来する。特定の実施態様において
、該HPV抗原は、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つのCD8+エピト
ープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを含む又は該エピトープからなる。
くとも1つのエピトープを含み又はこれらからなり、該少なくとも1つの抗原又は少なくと
も1つのエピトープは、HPVに由来する。特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは
、HPVに由来する2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、もしくは10の抗原を含む又
はこれらからなる。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、少なくとも3つ
のHPV抗原を含み、各々のHPV抗原は、異なるHPV型に由来する。特定の実施態様において
、該HPV抗原は、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つのCD8+エピト
ープ及び/もしくは少なくとも1つのCD4+エピトープを含む又は該エピトープからなる。
したがって、本発明は、N末端からC末端に:
(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に
位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは
この断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体;
(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポ
リペプチド;及び
(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2
の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは
この断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に
位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは
この断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体;
(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポ
リペプチド;及び
(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2
の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは
この断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体
を含む又はこれらからなるキメラタンパク質に関する。
その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位置
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関するCyaA由来
タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
の関連でこれらの断片に等しく適用される。
する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関する、及び
その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の最後
の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片に関するCyaA由来
タンパク質についての上記の定義は、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドと
の関連でこれらの断片に等しく適用される。
少なくとも95％を有する変異体に関する上記の定義は、キメラタンパク質との関連で記
載される断片に等しく適用される。同様に、異種ポリペプチドに関する定義は、該異種ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを定義するために適用される。
載される断片に等しく適用される。同様に、異種ポリペプチドに関する定義は、該異種ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを定義するために適用される。
特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～227からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321～1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基321～1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片;
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基387～1705からなる断片;
5)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～227からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片;
6)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基387～1705からなる断片;
7)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321～1706からなる断片;並びに
8)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基321～1705からなる断片
を含む又はこれらからなる。
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～227からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321～1706からなる断片;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基321～1705からなる断片;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片;
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基387～1705からなる断片;
5)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～227からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片;
6)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基387～1705からなる断片;
7)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)少なく
とも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;
及び(c)配列番号2、4、又は6の残基321～1706からなる断片;並びに
8)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHP
V抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号8の残基321～1705からなる断片
を含む又はこれらからなる。
「HPV型」という表現は、任意のHPV型、特に、アルファ-パピローマウイルス属、ベー
タ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、デルタ-パピローマウイルス
属、イプシロン-パピローマウイルス属、ゼータ-パピローマウイルス属、イータ-パピロ
ーマウイルス属、シータ-パピローマウイルス属、イオタ-パピローマウイルス属、カッパ
-パピローマウイルス属、ラムダ-パピローマウイルス属、ミュー-パピローマウイルス属
、ニュー-パピローマウイルス属、グザイ-パピローマウイルス属、オミクロン-パピロー
マウイルス属、及びパイ-パピローマウイルス属の中から選択されるHPV型を包含する。特
定の実施態様において、ヒト指向性を有するパピローマウイルス、例えば、アルファ-パ
ピローマウイルス属、ベータ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、ミ
ュー-パピローマウイルス属、又はニュー-パピローマウイルス属由来の型が好ましい。特
定の実施態様において、異種ポリペプチドは、アルファ-パピローマウイルス属のHPV型、
特に、アルファ-パピローマウイルス属のHPV種7及び9由来の型由来の抗原を含む又は該抗
原からなる[17]。したがって、異種ポリペプチドは、HPVの高腫瘍形成性型の種、例えば
、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、もしくはHPV58由来の抗原を含む
又は該抗原からなる。
タ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、デルタ-パピローマウイルス
属、イプシロン-パピローマウイルス属、ゼータ-パピローマウイルス属、イータ-パピロ
ーマウイルス属、シータ-パピローマウイルス属、イオタ-パピローマウイルス属、カッパ
-パピローマウイルス属、ラムダ-パピローマウイルス属、ミュー-パピローマウイルス属
、ニュー-パピローマウイルス属、グザイ-パピローマウイルス属、オミクロン-パピロー
マウイルス属、及びパイ-パピローマウイルス属の中から選択されるHPV型を包含する。特
定の実施態様において、ヒト指向性を有するパピローマウイルス、例えば、アルファ-パ
ピローマウイルス属、ベータ-パピローマウイルス属、ガンマ-パピローマウイルス属、ミ
ュー-パピローマウイルス属、又はニュー-パピローマウイルス属由来の型が好ましい。特
定の実施態様において、異種ポリペプチドは、アルファ-パピローマウイルス属のHPV型、
特に、アルファ-パピローマウイルス属のHPV種7及び9由来の型由来の抗原を含む又は該抗
原からなる[17]。したがって、異種ポリペプチドは、HPVの高腫瘍形成性型の種、例えば
、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、もしくはHPV58由来の抗原を含む
又は該抗原からなる。
HPV抗原(複数可)又はエピトープ(複数可)を含むキメラタンパク質の特定の実施態様に
おいて、異種ポリペプチドに含まれる該抗原(複数可)は、HPVのE1、E2、E4、E5、E6、及
びE7タンパク質、又はそれらの任意の抗原性断片から選択される。
おいて、異種ポリペプチドに含まれる該抗原(複数可)は、HPVのE1、E2、E4、E5、E6、及
びE7タンパク質、又はそれらの任意の抗原性断片から選択される。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドに含まれる該抗原は、HPV型のE7タンパク
質であるか、又は異種ポリペプチドに含まれる該抗原は、異なるHPV型のE7タンパク質、
もしくはこのE7タンパク質の任意の抗原性断片(E7断片とも呼ばれる)である。好ましい実
施態様において、E7タンパク質又はその断片は、HPV16型(配列番号25)、HPV18型(配列番
号26)、HPV31型(配列番号27)、HPV33型(配列番号28)、HPV45型(配列番号29)、HPV52型(配
列番号30)、又はHPV58型(配列番号32)由来のものである。本発明者らによって、HPV52型(
配列番号30に示されるもの)のE7タンパク質中に同定された天然ヒト自己免疫エピトープ
を除去するために、位置84及び86のアミノ酸残基が置換されており(位置84のM→L、位置8
6のL→M); HPV52型のE7タンパク質のこの修飾された配列は、配列番号31に示されている
通りであり、それ自体として、本発明の一部である。
質であるか、又は異種ポリペプチドに含まれる該抗原は、異なるHPV型のE7タンパク質、
もしくはこのE7タンパク質の任意の抗原性断片(E7断片とも呼ばれる)である。好ましい実
施態様において、E7タンパク質又はその断片は、HPV16型(配列番号25)、HPV18型(配列番
号26)、HPV31型(配列番号27)、HPV33型(配列番号28)、HPV45型(配列番号29)、HPV52型(配
列番号30)、又はHPV58型(配列番号32)由来のものである。本発明者らによって、HPV52型(
配列番号30に示されるもの)のE7タンパク質中に同定された天然ヒト自己免疫エピトープ
を除去するために、位置84及び86のアミノ酸残基が置換されており(位置84のM→L、位置8
6のL→M); HPV52型のE7タンパク質のこの修飾された配列は、配列番号31に示されている
通りであり、それ自体として、本発明の一部である。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、HPV型のE7タンパク質の少なくとも3
つの断片(抗原性断片)を含み又は該断片からなり、これらの断片のうちの少なくとも3つ
は、異なるHPV型のE7タンパク質に由来する。この実施態様において、「少なくとも3つの
断片」は、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片を意味し、但し、これら
の3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片のうち、少なくとも3つは、異なる
HPV型に由来する。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、6つのE7断片を含
み又は該断片からなり、そのうちの3つは、3つの異なるHPV型に由来する。別の好ましい
実施態様において、該異種ポリペプチドは、8つのE7断片を含み又は該断片からなり、そ
のうちの4つは、4つの異なるHPV型に由来する。
つの断片(抗原性断片)を含み又は該断片からなり、これらの断片のうちの少なくとも3つ
は、異なるHPV型のE7タンパク質に由来する。この実施態様において、「少なくとも3つの
断片」は、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片を意味し、但し、これら
の3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、又は10の断片のうち、少なくとも3つは、異なる
HPV型に由来する。好ましい実施態様において、該異種ポリペプチドは、6つのE7断片を含
み又は該断片からなり、そのうちの3つは、3つの異なるHPV型に由来する。別の好ましい
実施態様において、該異種ポリペプチドは、8つのE7断片を含み又は該断片からなり、そ
のうちの4つは、4つの異なるHPV型に由来する。
特定の実施態様において、全てのE7断片は、異なるHPV型に由来する。別の実施態様に
おいて、一部のE7断片(少なくとも3つ)だけが、異なるHPV型に由来し、他のE7断片は、全
て該異なるHPV型のうちの1つに由来するか、該異なるHPV型のうちの2つに由来するか、該
異なるHPV型のうちの3つに由来するか、該異なるHPV型のうちの4つに由来するか、又は該
異なるHPV型のうちの5つに由来する。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、E7
タンパク質の少なくとも4つの断片を含み又は該断片からなり、これらのE7断片のうちの
少なくとも3つは、異なるHPV型のE7タンパク質に由来し、これらのE7断片のうちの少なく
とも2つは、HPV型の同じE7タンパク質に由来する(1つのE7断片は、異なるHPV型のE7断片
の群と同じHPV型のE7断片の群の両方に属する)。非限定的な例として、HPV型の6つのE7断
片を有する異種ポリペプチドについて、以下の組合せを見出し得る: a)第一のHPV型由来
の1つのE7断片、第二のHPV型由来の1つのE7断片、及び第三のHPV型由来の4つのE7断片; b
)第一のHPV型由来の1つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片、及び第三のHPV型由来
の3つのE7断片;並びにc)第一のHPV型由来の2つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片
、及び第三のHPV型由来の2つのE7断片。
おいて、一部のE7断片(少なくとも3つ)だけが、異なるHPV型に由来し、他のE7断片は、全
て該異なるHPV型のうちの1つに由来するか、該異なるHPV型のうちの2つに由来するか、該
異なるHPV型のうちの3つに由来するか、該異なるHPV型のうちの4つに由来するか、又は該
異なるHPV型のうちの5つに由来する。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、E7
タンパク質の少なくとも4つの断片を含み又は該断片からなり、これらのE7断片のうちの
少なくとも3つは、異なるHPV型のE7タンパク質に由来し、これらのE7断片のうちの少なく
とも2つは、HPV型の同じE7タンパク質に由来する(1つのE7断片は、異なるHPV型のE7断片
の群と同じHPV型のE7断片の群の両方に属する)。非限定的な例として、HPV型の6つのE7断
片を有する異種ポリペプチドについて、以下の組合せを見出し得る: a)第一のHPV型由来
の1つのE7断片、第二のHPV型由来の1つのE7断片、及び第三のHPV型由来の4つのE7断片; b
)第一のHPV型由来の1つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片、及び第三のHPV型由来
の3つのE7断片;並びにc)第一のHPV型由来の2つのE7断片、第二のHPV型由来の2つのE7断片
、及び第三のHPV型由来の2つのE7断片。
特定の実施態様において、HPV型の該E7断片は、E7タンパク質のN末端部分又はE7タンパ
ク質のC末端部分からなる。
ク質のC末端部分からなる。
「E7のN末端部分」とは、その配列が、E7タンパク質の少なくとも最初の25％、最初の3
0％、最初の35％、最初の40％であり、かつ最初のN末端アミノ酸残基から始まるE7タンパ
ク質のアミノ酸残基中の多くても最初の50％の長さである断片を意味する。したがって、
「最初の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の残基1から始まり、全長E7タンパク質
のサイズの25％に対応する残基で終わるポリペプチドを意味する。特定の実施態様におい
て、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最初の28％～最初の31％
に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は
、E7タンパク質の最初の31％～最初の41％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様は、配列
番号25の残基1～29からなる断片、配列番号26の残基1～31からなる断片、配列番号27の残
基1～28からなる断片、配列番号28の残基1～29からなる断片、配列番号29の残基1～32か
らなる断片、配列番号31の残基1～29からなる断片、又は配列番号32の残基1～29からなる
断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基1～34からなる断片、配列番号26の残基1
～42からなる断片、配列番号27の残基1～32からなる断片、配列番号28の残基1～31からな
る断片、配列番号29の残基1～37からなる断片、配列番号31の残基1～31からなる断片、又
は配列番号32の残基1～31からなる断片である。
0％、最初の35％、最初の40％であり、かつ最初のN末端アミノ酸残基から始まるE7タンパ
ク質のアミノ酸残基中の多くても最初の50％の長さである断片を意味する。したがって、
「最初の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の残基1から始まり、全長E7タンパク質
のサイズの25％に対応する残基で終わるポリペプチドを意味する。特定の実施態様におい
て、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最初の28％～最初の31％
に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のN末端部分からなる断片は
、E7タンパク質の最初の31％～最初の41％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様は、配列
番号25の残基1～29からなる断片、配列番号26の残基1～31からなる断片、配列番号27の残
基1～28からなる断片、配列番号28の残基1～29からなる断片、配列番号29の残基1～32か
らなる断片、配列番号31の残基1～29からなる断片、又は配列番号32の残基1～29からなる
断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基1～34からなる断片、配列番号26の残基1
～42からなる断片、配列番号27の残基1～32からなる断片、配列番号28の残基1～31からな
る断片、配列番号29の残基1～37からなる断片、配列番号31の残基1～31からなる断片、又
は配列番号32の残基1～31からなる断片である。
「E7のC末端部分」とは、その配列が、最後のアミノ酸残基から始まるE7タンパク質の
アミノ酸残基中の少なくとも最後の25％、最後の30％、最後の40％、最後の50％、最後の
60の長さであり、かつE7タンパク質の多くとも最後の70％又は最後の80％である断片を意
味する。「最後の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の最後の残基で終わり、全長E7
タンパク質のサイズの25％に対応する残基から始まるポリペプチドを意味する。特定の実
施態様において、E7タンパク質のC末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最後の55％
～最後の61％に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のC末端部分か
らなる断片は、E7タンパク質の最後の60％～最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施
態様は、配列番号25の残基43～98からなる断片、配列番号26の残基43～105からなる断片
、配列番号27の残基42～98からなる断片、配列番号28の残基43～97からなる断片、配列番
号29の残基44～106からなる断片、配列番号31の残基45～99からなる断片、又は配列番号3
2の残基44～98からなる断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基35～98からなる
断片、配列番号26の残基43～105からなる断片、配列番号27の残基33～98からなる断片、
配列番号28の残基32～97からなる断片、配列番号29の残基38～106からなる断片、配列番
号31の残基32～99からなる断片、又は配列番号32の残基32～98からなる断片である。
アミノ酸残基中の少なくとも最後の25％、最後の30％、最後の40％、最後の50％、最後の
60の長さであり、かつE7タンパク質の多くとも最後の70％又は最後の80％である断片を意
味する。「最後の25％」とは、その配列が、E7タンパク質の最後の残基で終わり、全長E7
タンパク質のサイズの25％に対応する残基から始まるポリペプチドを意味する。特定の実
施態様において、E7タンパク質のC末端部分からなる断片は、E7タンパク質の最後の55％
～最後の61％に及ぶ配列からなる。別の実施態様において、E7タンパク質のC末端部分か
らなる断片は、E7タンパク質の最後の60％～最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施
態様は、配列番号25の残基43～98からなる断片、配列番号26の残基43～105からなる断片
、配列番号27の残基42～98からなる断片、配列番号28の残基43～97からなる断片、配列番
号29の残基44～106からなる断片、配列番号31の残基45～99からなる断片、又は配列番号3
2の残基44～98からなる断片である。他の実施態様は、配列番号25の残基35～98からなる
断片、配列番号26の残基43～105からなる断片、配列番号27の残基33～98からなる断片、
配列番号28の残基32～97からなる断片、配列番号29の残基38～106からなる断片、配列番
号31の残基32～99からなる断片、又は配列番号32の残基32～98からなる断片である。
特定の実施態様において、該異種ポリペプチドは、同じHPV型のE7タンパク質の本明細
書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含む。特定の実施態様において、該異種ポリペ
プチドが、同じHPV型のE7タンパク質のN末端断片及びC末端断片(融合していない)を含む
場合、N末端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、全長E7タンパク質のサイズを超
えない。
書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含む。特定の実施態様において、該異種ポリペ
プチドが、同じHPV型のE7タンパク質のN末端断片及びC末端断片(融合していない)を含む
場合、N末端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、全長E7タンパク質のサイズを超
えない。
別の実施態様において、該異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細
書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義
されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片を含む。これらのN末端及びC末端断片は、該ポリペプチド中でそれ
ぞれまとまっていてもよい。さらに、それらは、天然のE7タンパク質中のそれらの位置に
関して反転し、C末端断片がN末端断片の上流に位置していてもよい。
書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義
されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片を含む。これらのN末端及びC末端断片は、該ポリペプチド中でそれ
ぞれまとまっていてもよい。さらに、それらは、天然のE7タンパク質中のそれらの位置に
関して反転し、C末端断片がN末端断片の上流に位置していてもよい。
したがって、本発明のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、(i)第一のHPV型のE7タ
ンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパ
ク質のC末端部分、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、及び(ii)該第一のH
PV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のH
PV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を
含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む。
ンパク質のC末端部分、第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパ
ク質のC末端部分、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、及び(ii)該第一のH
PV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のH
PV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を
含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む。
上の定義における「任意に」という用語は、HPVの第四の結合価の存在を指す。したが
って、キメラタンパク質は、上で定義されている第一、第二、及び第三のHPVのE7タンパ
ク質のC末端部分とN末端部分の両方、並びに任意に、異なるHPVの第四のE7タンパク質のC
末端部分とN末端部分を含む。
って、キメラタンパク質は、上で定義されている第一、第二、及び第三のHPVのE7タンパ
ク質のC末端部分とN末端部分の両方、並びに任意に、異なるHPVの第四のE7タンパク質のC
末端部分とN末端部分を含む。
特定の実施態様において、異なるE7断片は、融合しているか、ペプチドリンカーによっ
て隔てられているか、又は該E7断片のうちの少なくとも2つが融合している一方で、該E7
断片のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられているかのいずれかである。特
定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2～10残基のサイズを有する。特定の実
施態様において、該リンカーは、ジペプチドASである。該リンカーは、各々の断片もしく
は一部の断片を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するために付加され得る。特定
の実施態様において、ジペプチドASは、HPVのE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される
。特定の実施態様において、ジペプチドASは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に
、特に、この断片の上流のみに付加される。
て隔てられているか、又は該E7断片のうちの少なくとも2つが融合している一方で、該E7
断片のうちの少なくとも2つがリンカーによって隔てられているかのいずれかである。特
定の実施態様において、該ペプチドリンカーは、2～10残基のサイズを有する。特定の実
施態様において、該リンカーは、ジペプチドASである。該リンカーは、各々の断片もしく
は一部の断片を隔てるために、及び/又は免疫応答を改善するために付加され得る。特定
の実施態様において、ジペプチドASは、HPVのE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される
。特定の実施態様において、ジペプチドASは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に
、特に、この断片の上流のみに付加される。
本発明の特定のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質
のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型のE7
タンパク質のC末端部分に融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融
合し、それが該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型
のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異種ポリペプチドを含む又は該異種
ポリペプチドからなる。
のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型のE7
タンパク質のC末端部分に融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融
合し、それが該第二のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型
のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異種ポリペプチドを含む又は該異種
ポリペプチドからなる。
本発明の別の特定のキメラタンパク質は、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパ
ク質のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型
のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に
融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第二のHPV
型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部
分に融合し、それが該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異
種ポリペプチドを含む又は該異種ポリペプチドからなる。
ク質のC末端部分が第二のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第三のHPV型
のE7タンパク質のC末端部分に融合し、それが第四のHPV型のE7タンパク質のC末端部分に
融合し、それが該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第二のHPV
型のE7タンパク質のN末端部分に融合し、それが該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部
分に融合し、それが該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分に融合したものからなる異
種ポリペプチドを含む又は該異種ポリペプチドからなる。
本明細書に記載のキメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第
三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型である。特定の実施態様において、該第一、第
二、及び第三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型であり、ASジペプチドは、HPV18型
のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一、第二、
及び第三のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一
、第二、及び第三のHPV型は、HPV31、HVP33、及びHPV52型である。別の実施態様において
、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である
。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV
33、及びHPV45型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型
は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一、第二、
第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型であり、ASジペプチドは
、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一
、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型であり、ASジペ
プチドは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。
三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型である。特定の実施態様において、該第一、第
二、及び第三のHPV型は、HPV16、HVP18、及びHPV45型であり、ASジペプチドは、HPV18型
のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一、第二、
及び第三のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一
、第二、及び第三のHPV型は、HPV31、HVP33、及びHPV52型である。別の実施態様において
、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である
。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV
33、及びHPV45型である。別の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型
は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である。別の実施態様において、該第一、第二、
第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型であり、ASジペプチドは
、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。別の実施態様において、該第一
、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型であり、ASジペ
プチドは、HPV18型のE7断片のC末端部分のすぐ上流に付加される。
特定の実施態様において、HPV型のE7タンパク質のN末端部分は、E7タンパク質の最初の
28％～最初の31％に及ぶ配列からなり、該同じHPV型のE7タンパク質のC末端部分は、E7タ
ンパク質の最後の55％～最後の61％に及ぶ配列からなる。同じHPV型のE7タンパク質のN末
端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド内でのそれらの配置がどうであれ、特に
、本明細書に記載の配置に従って、次の通りである:
-配列番号25の残基1～29/配列番号25の残基43～98;
-配列番号26の残基1～31/配列番号26の残基43～105;
-配列番号27の残基1～28/配列番号27の残基42～98;
-配列番号28の残基1～29/配列番号28の残基43～97;
-配列番号29の残基1～32/配列番号29の残基44～106;
-配列番号31の残基1～29/配列番号31の残基45～99;及び
-配列番号32の残基1～29/配列番号32の残基44～98。
28％～最初の31％に及ぶ配列からなり、該同じHPV型のE7タンパク質のC末端部分は、E7タ
ンパク質の最後の55％～最後の61％に及ぶ配列からなる。同じHPV型のE7タンパク質のN末
端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド内でのそれらの配置がどうであれ、特に
、本明細書に記載の配置に従って、次の通りである:
-配列番号25の残基1～29/配列番号25の残基43～98;
-配列番号26の残基1～31/配列番号26の残基43～105;
-配列番号27の残基1～28/配列番号27の残基42～98;
-配列番号28の残基1～29/配列番号28の残基43～97;
-配列番号29の残基1～32/配列番号29の残基44～106;
-配列番号31の残基1～29/配列番号31の残基45～99;及び
-配列番号32の残基1～29/配列番号32の残基44～98。
別の実施態様において、HPV型のE7タンパク質のN末端部分は、E7タンパク質の最初の31
％～最初の41％に及ぶ配列からなり、E7タンパク質のC末端部分は、E7タンパク質の最後
の60％～最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様において、E7タンパク質のN末
端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、E7タンパク質のサイズの多くても100％で
ある。その場合、(2つの断片に分かれた)E7タンパク質全体が、異種ポリペプチドに含ま
れ得る。同じHPV型のE7タンパク質のN末端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド
内でのそれらの配置がどうであれ、特に、本明細書に記載の配置に従って、次の通りであ
る:
-配列番号25の残基1～34/配列番号25の残基35～98;
-配列番号26の残基1～42/配列番号26の残基43～105;
-配列番号27の残基1～32/配列番号27の残基33～98;
-配列番号28の残基1～31/配列番号28の残基32～97;
-配列番号29の残基1～37/配列番号29の残基38～106;
-配列番号31の残基1～31/配列番号31の残基32～99;及び
-配列番号32の残基1～31/配列番号32の残基32～98。
％～最初の41％に及ぶ配列からなり、E7タンパク質のC末端部分は、E7タンパク質の最後
の60％～最後の70％に及ぶ配列からなる。特定の実施態様において、E7タンパク質のN末
端部分のサイズとC末端部分のサイズの合計は、E7タンパク質のサイズの多くても100％で
ある。その場合、(2つの断片に分かれた)E7タンパク質全体が、異種ポリペプチドに含ま
れ得る。同じHPV型のE7タンパク質のN末端部分/C末端部分対の例は、該異種ポリペプチド
内でのそれらの配置がどうであれ、特に、本明細書に記載の配置に従って、次の通りであ
る:
-配列番号25の残基1～34/配列番号25の残基35～98;
-配列番号26の残基1～42/配列番号26の残基43～105;
-配列番号27の残基1～32/配列番号27の残基33～98;
-配列番号28の残基1～31/配列番号28の残基32～97;
-配列番号29の残基1～37/配列番号29の残基38～106;
-配列番号31の残基1～31/配列番号31の残基32～99;及び
-配列番号32の残基1～31/配列番号32の残基32～98。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV
16、HVP18、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号33に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号34に示される配列又は(配列番号35に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号36に示される配列のいずれかからな
る。
16、HVP18、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号33に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号34に示される配列又は(配列番号35に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号36に示される配列のいずれかからな
る。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV
31、HVP52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号41に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号42に示される配列又は(配列番号43に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号44に示される配列のいずれかからな
る。
31、HVP52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号41に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号42に示される配列又は(配列番号43に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号44に示される配列のいずれかからな
る。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、及び第三のHPV型が、HPV
31、HVP33、及びHPV52型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号45に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号46に示される配列又は(配列番号47に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号48に示される配列のいずれかからな
る。
31、HVP33、及びHPV52型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号45に示されるポリ
ヌクレオチドによってコードされる)配列番号46に示される配列又は(配列番号47に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号48に示される配列のいずれかからな
る。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型
が、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号37
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号38又は(配列番号39に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号40に示される配列のいずれかからな
る。
が、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号37
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号38又は(配列番号39に示され
るポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号40に示される配列のいずれかからな
る。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型
が、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号49
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号50に示される配列又は(配列
番号51に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号52に示される配列の
いずれかからなる。
が、HPV16、HVP18、HPV33、及びHPV45型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号49
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号50に示される配列又は(配列
番号51に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号52に示される配列の
いずれかからなる。
キメラタンパク質の特定の実施態様において、該第一、第二、第三、及び第四のHPV型
が、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号53
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号54に示される配列又は(配列
番号55に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号56に示される配列の
いずれかからなる。
が、HPV16、HVP18、HPV45、及びHPV58型である場合、異種ポリペプチドは、(配列番号53
に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号54に示される配列又は(配列
番号55に示されるポリヌクレオチドによってコードされる)配列番号56に示される配列の
いずれかからなる。
本発明はまた、N末端からC末端に、第一のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、第二のHP
V型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、任意に、第四
のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二
のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に
、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるポリペプチドに関
する。本発明のキメラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドについて本明細書で提供さ
れている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、HPV型のE7タンパク質のN末端部分、
HPV型のE7タンパク質のC末端部分、リンカー、特に、ASジペプチドの任意の存在、HPV型
の性質、配列番号25、26、27、28、29、31、及び32由来のE7タンパク質の特定の断片の定
義に関して、等しく適用される。本発明のキメラタンパク質(複数可)を含む組成物につい
て本明細書に提供されている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、該第一、第二、
第三、第四、第五、及び第六のHPV型の、並びに適用可能な場合、該第七のHPV型の一般的
な又は特定の組合せに関して、等しく適用される。
V型のE7タンパク質のC末端部分、第三のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、任意に、第四
のHPV型のE7タンパク質のC末端部分、該第一のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第二
のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、該第三のHPV型のE7タンパク質のN末端部分、任意に
、該第四のHPV型のE7タンパク質のN末端部分を含む又はこれらからなるポリペプチドに関
する。本発明のキメラタンパク質に含まれる異種ポリペプチドについて本明細書で提供さ
れている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、HPV型のE7タンパク質のN末端部分、
HPV型のE7タンパク質のC末端部分、リンカー、特に、ASジペプチドの任意の存在、HPV型
の性質、配列番号25、26、27、28、29、31、及び32由来のE7タンパク質の特定の断片の定
義に関して、等しく適用される。本発明のキメラタンパク質(複数可)を含む組成物につい
て本明細書に提供されている定義は、該ポリペプチドそれ自体に、特に、該第一、第二、
第三、第四、第五、及び第六のHPV型の、並びに適用可能な場合、該第七のHPV型の一般的
な又は特定の組合せに関して、等しく適用される。
特定の実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号34、36、38、40、42、44、46、
48、50、52、54、又は56に示される配列からなる。本発明はまた、これらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、特に、配列番号33、35、37、39、41、43、45、47、49、
51、53、及び55に示されるポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチドを含むベ
クター、並びにこれらのポリヌクレオチド又はこれらのポリヌクレオチドを含むベクター
を含む細胞又は細胞培養物に関するものであり;これらは全て、本明細書で定義されてい
る通りである。
48、50、52、54、又は56に示される配列からなる。本発明はまた、これらのポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、特に、配列番号33、35、37、39、41、43、45、47、49、
51、53、及び55に示されるポリヌクレオチド、並びにこれらのポリヌクレオチドを含むベ
クター、並びにこれらのポリヌクレオチド又はこれらのポリヌクレオチドを含むベクター
を含む細胞又は細胞培養物に関するものであり;これらは全て、本明細書で定義されてい
る通りである。
そのサイズ(200を超える残基)、その複雑さ(いくつかのシステイン残基の存在)、及び
その負の静電電荷にもかかわらず、該ポリペプチドは、驚くことに、抗原提示細胞の細胞
質に効率的に移行し、強くかつ大きいT細胞免疫応答の獲得を可能にすることが示された
。
その負の静電電荷にもかかわらず、該ポリペプチドは、驚くことに、抗原提示細胞の細胞
質に効率的に移行し、強くかつ大きいT細胞免疫応答の獲得を可能にすることが示された
。
特定の実施態様において、本発明は、配列番号58もしくは配列番号61に示される配列を
含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質
は、その配列が配列番号57又は配列番号60に示されている通りのポリヌクレオチドによっ
てそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号58又は配列番号61のキメラ
タンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号59又は配列番号62であるプラスミドから発現
される。
含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質
は、その配列が配列番号57又は配列番号60に示されている通りのポリヌクレオチドによっ
てそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号58又は配列番号61のキメラ
タンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号59又は配列番号62であるプラスミドから発現
される。
特定の実施態様において、本発明はまた、配列番号64又は配列番号67に示される配列を
含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質
は、その配列が配列番号63又は配列番号66に示されている通りのポリヌクレオチドによっ
てそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号64又は配列番号67のキメラ
タンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号65及び配列番号68であるプラスミドから発現
される。
含む又は該配列からなる本発明のキメラタンパク質に関する。これらのキメラタンパク質
は、その配列が配列番号63又は配列番号66に示されている通りのポリヌクレオチドによっ
てそれぞれコードされる。特定の実施態様において、配列番号64又は配列番号67のキメラ
タンパク質は、その配列がそれぞれ配列番号65及び配列番号68であるプラスミドから発現
される。
したがって、本明細書に記載される、HPVに由来する少なくとも1つの抗原もしくは少な
くとも1つのエピトープを含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む任意の本発明
のキメラタンパク質は、配列番号59、配列番号62、配列番号65、及び配列番号68のプラス
ミドを発現ベクターとして用いて発現させることができる。次の順序で、配列番号59のヌ
クレオチド904～1731に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラ
タンパク質を発現させることができる。同様に、配列番号62のヌクレオチド772～1599に
含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させる
ことができる。同様に、配列番号65のヌクレオチド904～1836に含まれるポリヌクレオチ
ドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この
異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。同様に、
配列番号68のヌクレオチド772～1704に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む
本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。
くとも1つのエピトープを含む又はこれらからなる異種ポリペプチドを含む任意の本発明
のキメラタンパク質は、配列番号59、配列番号62、配列番号65、及び配列番号68のプラス
ミドを発現ベクターとして用いて発現させることができる。次の順序で、配列番号59のヌ
クレオチド904～1731に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラ
タンパク質を発現させることができる。同様に、配列番号62のヌクレオチド772～1599に
含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させる
ことができる。同様に、配列番号65のヌクレオチド904～1836に含まれるポリヌクレオチ
ドを除去し、本発明の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この
異種ポリペプチドを含む本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。同様に、
配列番号68のヌクレオチド772～1704に含まれるポリヌクレオチドを除去し、本発明の異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、この異種ポリペプチドを含む
本発明のキメラタンパク質を発現させることができる。
本発明の特定の実施態様において、配列番号59のヌクレオチド904～1731に含まれるポ
リヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配
列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、及び配列番号72の配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドの中から選択される。そのようなコンストラクトは
、配列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、又は配列番号72を有し、それぞれ
、その酸性領域が欠失したHPV31 E7、その酸性領域が欠失したHPV33 E7、その酸性領域が
欠失したHPV58 E7、その酸性領域が欠失したHPV52 E7、及びその酸性領域が欠失したHPV4
5 E7に相当する異種ポリペプチドを含む本発明の一価のキメラタンパク質を発現させるこ
とができる。
リヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配
列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、及び配列番号72の配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドの中から選択される。そのようなコンストラクトは
、配列番号70、配列番号71、配列番号74、配列番号73、又は配列番号72を有し、それぞれ
、その酸性領域が欠失したHPV31 E7、その酸性領域が欠失したHPV33 E7、その酸性領域が
欠失したHPV58 E7、その酸性領域が欠失したHPV52 E7、及びその酸性領域が欠失したHPV4
5 E7に相当する異種ポリペプチドを含む本発明の一価のキメラタンパク質を発現させるこ
とができる。
本発明の特定の実施態様において、配列番号59のヌクレオチド904～1731に含まれるポ
リヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配
列番号75、配列番号76、配列番号79、配列番号78、及び配列番号77の配列を有するポリヌ
クレオチドの中から選択される。
リヌクレオチドを除去し、ユニークなHPV E7タンパク質に由来する本発明の異種ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに置き換え、このポリヌクレオチドは、それぞれ、配
列番号75、配列番号76、配列番号79、配列番号78、及び配列番号77の配列を有するポリヌ
クレオチドの中から選択される。
本発明はまた、少なくとも1つ、好ましくは1つ又は2つの本発明のキメラタンパク質、
特に、少なくとも2つ、好ましくは2つの本発明の異なるキメラタンパク質を含む組成物に
関する。
特に、少なくとも2つ、好ましくは2つの本発明の異なるキメラタンパク質を含む組成物に
関する。
特定の実施態様において、組成物が、複数の異なる、好ましくは2つの異なるキメラタ
ンパク質を含む場合、該キメラタンパク質のCyaA部分(又は断片)の配列は、同じであるか
、又は異なるが、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様において、異なる、
好ましくは2つの異なるキメラタンパク質は、本明細書に記載の異なるキメラタンパク質
から選択される。特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、下記のい
ずれかである:
1) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのH
PV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号2の残基321～1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク
質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が
異なる;又は
2) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのH
PV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号2の残基387～1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク
質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が
異なる。
ンパク質を含む場合、該キメラタンパク質のCyaA部分(又は断片)の配列は、同じであるか
、又は異なるが、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様において、異なる、
好ましくは2つの異なるキメラタンパク質は、本明細書に記載の異なるキメラタンパク質
から選択される。特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、下記のい
ずれかである:
1) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのH
PV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号2の残基321～1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク
質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が
異なる;又は
2) N末端からC末端に、(a)配列番号2の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのH
PV抗原を含み、各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列
番号2の残基387～1706からなる断片を含むもしくはこれらからなる2つのキメラタンパク
質、但し、これらの2つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、その配列及びHPV型が
異なる。
別の実施態様において、該異なる、好ましくは2つの異なるキメラタンパク質のCyaA部
分(又は断片)の配列は異なり、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様におい
て、異なる、好ましくは2つの異なるタイプのキメラタンパク質は、本明細書に記載の異
なるキメラタンパク質から選択される。特定の実施態様において、該異なる、好ましくは
、2つの異なるキメラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端から
C末端に、(a)配列番号2の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、
各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基321
～1706からなる断片を含み又はこれらからなり、該異なる、好ましくは2つの異なるキメ
ラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端からC末端に、(a)配列
番号2の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が
異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド(ここで、該異種ポリペプチドは、その配列及
びHPV型が他の少なくとも1つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドとは異なる);並びに
(c)配列番号2の残基387～1706からなる断片を含む又はこれらからなる。
分(又は断片)の配列は異なり、異種ポリペプチドの配列は異なる。特定の実施態様におい
て、異なる、好ましくは2つの異なるタイプのキメラタンパク質は、本明細書に記載の異
なるキメラタンパク質から選択される。特定の実施態様において、該異なる、好ましくは
、2つの異なるキメラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端から
C末端に、(a)配列番号2の残基1～227からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、
各々のHPV抗原が異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド;及び(c)配列番号2の残基321
～1706からなる断片を含み又はこれらからなり、該異なる、好ましくは2つの異なるキメ
ラタンパク質のうちの少なくとも1つ、好ましくは、1つは、N末端からC末端に、(a)配列
番号2の残基1～183からなる断片、(b)少なくとも3つのHPV抗原を含み、各々のHPV抗原が
異なるHPV型に由来する、異種ポリペプチド(ここで、該異種ポリペプチドは、その配列及
びHPV型が他の少なくとも1つのキメラタンパク質の異種ポリペプチドとは異なる);並びに
(c)配列番号2の残基387～1706からなる断片を含む又はこれらからなる。
複数の異なる、好ましくは2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含む組成物の特定
の実施態様において、異種ポリペプチドは、本明細書で定義されている通りである。特定
の実施態様において、各々の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細
書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義
されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片を含み、ここで、各々の異種ポリペプチドは、他の異種ポリペプチ
ド(複数可)とは異なる配列を有する。
の実施態様において、異種ポリペプチドは、本明細書で定義されている通りである。特定
の実施態様において、各々の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の本明細
書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義
されるN末端断片及びC末端断片、第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片、任意に、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末
端断片及びC末端断片を含み、ここで、各々の異種ポリペプチドは、他の異種ポリペプチ
ド(複数可)とは異なる配列を有する。
特定の実施態様において、組成物は、2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含み、
第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の
本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書
で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で
定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリ
ペプチドは、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断
片、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並び
に第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、
ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、異なるHPV型である。
第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の
本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書
で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で
定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリ
ペプチドは、第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断
片、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並び
に第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、
ここで、該第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、異なるHPV型である。
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、(a)HP
V16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58の中から選択されるか、又は(b)HPV16とHP
V18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52の中から選択される。
V16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58の中から選択されるか、又は(b)HPV16とHP
V18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52の中から選択される。
特定の実施態様において、第一、第二、及び第三のHPV型は、HPV16、HPV18、及びHPV45
である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号34もしくは36に示され
る配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質
は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。
これらの特定の実施態様に、HPV33又はHPV58の中から選択される第四のHPV亜型を関連さ
せることができる。
である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号34もしくは36に示され
る配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質
は、配列番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。
これらの特定の実施態様に、HPV33又はHPV58の中から選択される第四のHPV亜型を関連さ
せることができる。
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、及び第三のHPV型に関する実施態
様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58である。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を
含む又はこれらの配列からなる。
様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV52、及びHPV58である。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を
含む又はこれらの配列からなる。
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、及び第三のHPV型に関する実施態
様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV33、及びHPV52である。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を
含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質は、配列
番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号
34又は36に示される配列は、配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配
列番号58、61、64、又は67に示される配列へと置き換えられている。
様と組み合わせて、第四、第五、及び第六のHPV型は、HPV31、HPV33、及びHPV52である。
特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を
含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、該キメラタンパク質は、配列
番号58、61、64、もしくは67に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号
34又は36に示される配列は、配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配
列番号58、61、64、又は67に示される配列へと置き換えられている。
本発明は、特定の実施態様において、特定のHPV亜型の上記の抗原が、キメラタンパク
質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたも
のの中の、特に、HPV16、HPV18、及びHPV45、又はHPV31、HPV52、及びHPV58、又はHPV31
、HPV33、及びHPV52の群の中の第一、第二、第三、及び任意に、第四のHPVの任意の組合
せに対応するキメラタンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これら
の抗原の組合せに関する。
質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたも
のの中の、特に、HPV16、HPV18、及びHPV45、又はHPV31、HPV52、及びHPV58、又はHPV31
、HPV33、及びHPV52の群の中の第一、第二、第三、及び任意に、第四のHPVの任意の組合
せに対応するキメラタンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これら
の抗原の組合せに関する。
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、及び第六のHPV型は、(a)そ
れぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、又は(b)それぞれ、HPV16とHP
V18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52である。
れぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、又は(b)それぞれ、HPV16とHP
V18とHPV45、HPV31とHPV33とHPV52である。
特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質
については、HPV16、HPV18、HPV45の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、
HPV52、HPV58の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つ
の異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV4
5の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示
される抗原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定
された順序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
については、HPV16、HPV18、HPV45の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、
HPV52、HPV58の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つ
の異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV4
5の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示
される抗原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定
された順序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
特定の実施態様において、組成物は、2つの異なるタイプのキメラタンパク質を含み、
第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の
本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書
で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で
定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定
義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペ
プチドは、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片
、第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに
第七のHPV型のE7タンパク質本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、ここ
で、該第一、第二、第三、第四、第五、第六の、及び第七のHPV型は、異なるHPV型である
。
第一のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペプチドは、第一のHPV型のE7タンパク質の
本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、第二のHPV型のE7タンパク質の本明細書
で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第三のHPV型のE7タンパク質の本明細書で
定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに第四のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定
義されるN末端断片及びC末端断片を含み、第二のタイプのキメラタンパク質の異種ポリペ
プチドは、第五のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片
、第六のHPV型のE7タンパク質の本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片、並びに
第七のHPV型のE7タンパク質本明細書で定義されるN末端断片及びC末端断片を含み、ここ
で、該第一、第二、第三、第四、第五、第六の、及び第七のHPV型は、異なるHPV型である
。
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、第六、及び第七のHPV型は
、(a)HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18、及びHPV45、(b)HPV16、HPV18、HPV33
、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52、
及びHPV33、(d)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58、及びHPV52、(e)HPV16、HPV
18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33、及びHPV52、並びに(f)HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、
HPV31、HPV52、及びHPV58からなる群から選択される。
、(a)HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18、及びHPV45、(b)HPV16、HPV18、HPV33
、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV52、
及びHPV33、(d)HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV58、及びHPV52、(e)HPV16、HPV
18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33、及びHPV52、並びに(f)HPV16、HPV18、HPV45、HPV33、
HPV31、HPV52、及びHPV58からなる群から選択される。
特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HPV18、HPV
33、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号50もし
くは52に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、第一
、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58である。特定の実
施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号54もしくは56に示される配列を含む又は
これらの配列からなる。特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型
は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58である。特定の実施態様において、異種ポリペプチ
ドは、配列番号40もしくは42に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実
施態様において、該第一のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示さ
れる配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、配列番
号40、42、50、52、54、又は56に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67
に示される配列へと置き換えられている。
33、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号50もし
くは52に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実施態様において、第一
、第二、第三、及び第四のHPV型は、HPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58である。特定の実
施態様において、異種ポリペプチドは、配列番号54もしくは56に示される配列を含む又は
これらの配列からなる。特定の実施態様において、第一、第二、第三、及び第四のHPV型
は、HPV31、HPV33、HPV52、及びHPV58である。特定の実施態様において、異種ポリペプチ
ドは、配列番号40もしくは42に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の実
施態様において、該第一のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示さ
れる配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、配列番
号40、42、50、52、54、又は56に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67
に示される配列へと置き換えられている。
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としてのH
PV31、HPV33、HPV52、及びHPV58に関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第
七のHPV型は、HPV16、HPV18、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプ
チドは、配列番号34もしくは36に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の
実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示
される配列を含む又はこれらの配列からなる。
PV31、HPV33、HPV52、及びHPV58に関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第
七のHPV型は、HPV16、HPV18、及びHPV45である。特定の実施態様において、異種ポリペプ
チドは、配列番号34もしくは36に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特定の
実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67に示
される配列を含む又はこれらの配列からなる。
特定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としての
、それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に
関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HP
V52、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、HPV52である。特定の実施態様において、異種ポリ
ペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特
定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としての、そ
れぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に関す
る実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HPV52
、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、及びHPV52である。特定の実施態様において、異種ポリ
ペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特
定の実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67
に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、
配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67に
示される配列へと置き換えられている。
、それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に
関する実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HP
V52、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、HPV52である。特定の実施態様において、異種ポリ
ペプチドは、配列番号42もしくは44に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特
定の実施態様において、独立に、又は第一、第二、第三、及び第四のHPV型としての、そ
れぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45、又はHPV16、HPV18、HPV45、及びHPV58に関す
る実施態様と組み合わせて、第五、第六、及び第七のHPV型は、それぞれ、HPV31、HPV52
、及びHPV58、又はHPV31、HPV33、及びHPV52である。特定の実施態様において、異種ポリ
ペプチドは、配列番号46もしくは48に示される配列を含む又はこれらの配列からなる。特
定の実施態様において、該第二のキメラタンパク質は、配列番号58、61、64、もしくは67
に示される配列を含み又はこれらの配列からなり、配列番号34又は36に示される配列は、
配列番号42、44、46、又は48に示される配列によって、該配列番号58、61、64、又は67に
示される配列へと置き換えられている。
特定の実施態様において、第一、第二、第三、第四、第五、第六、及び第七のHPV型は
、(a)それぞれ、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18及びHPV45、(b)それぞれ、H
PV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)それぞれ、HPV16、HPV18、H
PV45、HPV58、HPV31、HPV52及びHPV33、(d)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV
31、HPV58及びHPV52、並びに(e)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33
、及びHPV52からなる群から選択される。
、(a)それぞれ、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV16、HPV18及びHPV45、(b)それぞれ、H
PV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV31、HPV52、及びHPV58、(c)それぞれ、HPV16、HPV18、H
PV45、HPV58、HPV31、HPV52及びHPV33、(d)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV
31、HPV58及びHPV52、並びに(e)それぞれ、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58、HPV31、HPV33
、及びHPV52からなる群から選択される。
本発明は、特定の実施態様において、特定のHPV亜型の上記の抗原が、キメラタンパク
質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたも
のの中の、特に、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45の群、又はHPV16、HPV18、HPV45、及
びHPV58の群、又はHPV31、HPV52、及びHPV58の群、又はHPV31、HPV33、及びHPV52の群の
中の第一、第二、第三、及び存在する場合、第四のHPVの任意の組合せに対応するキメラ
タンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これらの抗原の組合せに関
する。
質において、HPV亜型の上で指定された引用順序に対応する順序で、或いは引用されたも
のの中の、特に、HPV16、HPV18、HPV33、及びHPV45の群、又はHPV16、HPV18、HPV45、及
びHPV58の群、又はHPV31、HPV52、及びHPV58の群、又はHPV31、HPV33、及びHPV52の群の
中の第一、第二、第三、及び存在する場合、第四のHPVの任意の組合せに対応するキメラ
タンパク質中の抗原の任意の他の提示順序で提供される場合、これらの抗原の組合せに関
する。
特定の実施態様において、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質
については、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58の、及び第二のキメラタンパク質については、
HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様におい
て、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV1
8、HPV45、HPV33の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV52、HPV58の、
本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つの異なるキメラタ
ンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58の、及び
第二のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45の、本明細書に開示される抗
原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定された順
序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
については、HPV16、HPV18、HPV45、HPV58の、及び第二のキメラタンパク質については、
HPV31、HPV33、HPV52の、本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様におい
て、2つの異なるキメラタンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV16、HPV1
8、HPV45、HPV33の、及び第二のキメラタンパク質については、HPV31、HPV52、HPV58の、
本明細書に開示される抗原を含む。別の特定の実施態様において、2つの異なるキメラタ
ンパク質は、第一のキメラタンパク質については、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58の、及び
第二のキメラタンパク質については、HPV16、HPV18、HPV45の、本明細書に開示される抗
原を含む。好ましい実施態様において、このように定義されるHPV抗原は、指定された順
序でキメラタンパク質に挿入されるが、必ずしもそうであるとは限らない。
特定の実施態様において、組成物は、好適な医薬ビヒクルも含み、これは、例えば、緩
衝剤、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタ
ノールなど、及びこれらの組合せから選択される。
衝剤、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、水、エタ
ノールなど、及びこれらの組合せから選択される。
特定の実施態様において、組成物は、好適な医薬ビヒクルとともに又はこれを伴わずに
、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/又は界面活性剤
及び/又は免疫調節物質(例えば、サイトカインもしくはケモカイン)及び/又は成長因子、
例えば、GM-CSFも含む。様々なアジュバントが当技術分野で公知であり、これには、完全
フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタナイドISA(
不完全セピック(seppic)アジュバント)、ムラミルペプチド、例えば、ムラミルジペプチ
ド(MDP)、MDP-Lys(L18)(Nα-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-Neステ
ロイル-L-リジン)、硫酸亜鉛、コロイド水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム
、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CPG ODN)、例えば、CPG ODN 1826及びCPG ODN 2007、
水中の5％スクアレン(w/v)、0.5％Tween(登録商標)80(w/v)、及び0.5％Span(w/v)を含む
、洗剤により安定化された水中油型エマルジョンであるMF59、TLR4リガンド(例えば、MPL
、GLA)、TLR3リガンド(例えば、ポリIC、Hiltonol(登録商標)と呼ばれるポリ-ICLC)、多
糖類(例えば、イヌリン)、並びにリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム、ISCOM)が
含まれる。
、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント、及び/又は界面活性剤
及び/又は免疫調節物質(例えば、サイトカインもしくはケモカイン)及び/又は成長因子、
例えば、GM-CSFも含む。様々なアジュバントが当技術分野で公知であり、これには、完全
フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、モンタナイドISA(
不完全セピック(seppic)アジュバント)、ムラミルペプチド、例えば、ムラミルジペプチ
ド(MDP)、MDP-Lys(L18)(Nα-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-Neステ
ロイル-L-リジン)、硫酸亜鉛、コロイド水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム
、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CPG ODN)、例えば、CPG ODN 1826及びCPG ODN 2007、
水中の5％スクアレン(w/v)、0.5％Tween(登録商標)80(w/v)、及び0.5％Span(w/v)を含む
、洗剤により安定化された水中油型エマルジョンであるMF59、TLR4リガンド(例えば、MPL
、GLA)、TLR3リガンド(例えば、ポリIC、Hiltonol(登録商標)と呼ばれるポリ-ICLC)、多
糖類(例えば、イヌリン)、並びにリポソーム(例えば、カチオン性リポソーム、ISCOM)が
含まれる。
特定の実施態様において、少なくとも1つのアジュバントは、T細胞免疫応答を活性化す
る能力を有する分子の中から選択される。好ましいアジュバントは、免疫細胞(例えば、A
PC)上のTLR(Toll様受容体) 3、4、7、8及び/もしくは9に結合するか、又はこれらに対す
るアゴニストとなるアジュバントである。特定の実施態様において、該アジュバントは、
TLRリガンド、特に、クラス3のTLRリガンド、例えば、ポリ-ICLC、クラス4のTLRリガンド
、例えば、MPL、クラス9のTLRリガンド、例えば、CpG、及びクラス7/8のTLRリガンド、例
えば、イミキモドからなる群から選択されるTLRリガンドである。アジュバントの例は、
イミキモド及びポリ-ICLCである。イミキモドに基づく市販薬は、Aldara(商標)(5％イミ
キモドを含有するクリームとして販売されている)である。ポリ-ICLCは、Oncovir社(WA,
US)からHiltonol(登録商標)として購入することができる。
る能力を有する分子の中から選択される。好ましいアジュバントは、免疫細胞(例えば、A
PC)上のTLR(Toll様受容体) 3、4、7、8及び/もしくは9に結合するか、又はこれらに対す
るアゴニストとなるアジュバントである。特定の実施態様において、該アジュバントは、
TLRリガンド、特に、クラス3のTLRリガンド、例えば、ポリ-ICLC、クラス4のTLRリガンド
、例えば、MPL、クラス9のTLRリガンド、例えば、CpG、及びクラス7/8のTLRリガンド、例
えば、イミキモドからなる群から選択されるTLRリガンドである。アジュバントの例は、
イミキモド及びポリ-ICLCである。イミキモドに基づく市販薬は、Aldara(商標)(5％イミ
キモドを含有するクリームとして販売されている)である。ポリ-ICLCは、Oncovir社(WA,
US)からHiltonol(登録商標)として購入することができる。
特定の実施態様において、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物
は、様々な経路:皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、筋肉内(i.m.)、又は静脈内(i.v.)注射、経口
投与及び粘膜投与、特に、鼻腔内投与、又は吸入によって患者に注入することができる。
特定の実施態様において、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は
、皮内投与される。
は、様々な経路:皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、筋肉内(i.m.)、又は静脈内(i.v.)注射、経口
投与及び粘膜投与、特に、鼻腔内投与、又は吸入によって患者に注入することができる。
特定の実施態様において、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は
、皮内投与される。
さらに、本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、少なくとも1
つ免疫増強物質、例えば、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント
、及び/もしくは界面活性剤及び/もしくは免疫調節物質と組み合わせるか、又はこれらと
混合することができる。「組み合わせる」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質
(複数可)又は組成物と免疫増強物質の両方が、同じもしくは異なる時に、及び/又は同じ
もしくは異なる投与様式によって、好ましくは、同じ接触部位で、宿主と接触させられる
ことを意味する。対照的に、「混合する」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質
(複数可)又は組成物と免疫増強物質が、投与されるときに同じ製剤中にあることを意味す
る。
つ免疫増強物質、例えば、少なくとも1つのアジュバント、好ましくは1つのアジュバント
、及び/もしくは界面活性剤及び/もしくは免疫調節物質と組み合わせるか、又はこれらと
混合することができる。「組み合わせる」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質
(複数可)又は組成物と免疫増強物質の両方が、同じもしくは異なる時に、及び/又は同じ
もしくは異なる投与様式によって、好ましくは、同じ接触部位で、宿主と接触させられる
ことを意味する。対照的に、「混合する」とは、本明細書で定義されるキメラタンパク質
(複数可)又は組成物と免疫増強物質が、投与されるときに同じ製剤中にあることを意味す
る。
本明細書で定義されるキメラタンパク質(複数可)又は組成物は、固体形態(カプセル剤
、散剤、錠剤、丸剤、坐剤、即放錠、胃耐性錠、遅延放出錠)、注射前に、例えば、希釈
剤(複数可)で再構成される必要がある、好ましくは、凍結乾燥後の粉末形態(凍結乾燥形
態もしくは凍結乾燥粉末形態)、又は液体形態、例えば、注射用溶液もしくは注射用懸濁
液であってもよい。
、散剤、錠剤、丸剤、坐剤、即放錠、胃耐性錠、遅延放出錠)、注射前に、例えば、希釈
剤(複数可)で再構成される必要がある、好ましくは、凍結乾燥後の粉末形態(凍結乾燥形
態もしくは凍結乾燥粉末形態)、又は液体形態、例えば、注射用溶液もしくは注射用懸濁
液であってもよい。
投与されるキメラタンパク質(複数可)の分量(投薬量)は、患者の状態、個体の免疫系の
状態、投与経路、及び宿主の重量を考慮することを含め、治療される対象によって決まる
。従来の投薬量は、1～2400μg、100～2000μg、200～1000μg、500～1000μgの範囲であ
る。特定の投薬量は、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、200
0、又は2400μg±10％からなる群から選択される。別の実施態様において、従来の投薬量
は、1～100μg、1～50μg、及び1～10μgのベクター保有ポリペプチド(複数可)の範囲で
ある。本発明の活性成分による全治療のための全用量は、200～2400μg、300～2000μg、
400～1000μg、500～800μgの範囲である。これらの例は、状況に応じて、当業者により
変更され得る。
状態、投与経路、及び宿主の重量を考慮することを含め、治療される対象によって決まる
。従来の投薬量は、1～2400μg、100～2000μg、200～1000μg、500～1000μgの範囲であ
る。特定の投薬量は、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、200
0、又は2400μg±10％からなる群から選択される。別の実施態様において、従来の投薬量
は、1～100μg、1～50μg、及び1～10μgのベクター保有ポリペプチド(複数可)の範囲で
ある。本発明の活性成分による全治療のための全用量は、200～2400μg、300～2000μg、
400～1000μg、500～800μgの範囲である。これらの例は、状況に応じて、当業者により
変更され得る。
本発明はまた、薬剤として使用するための、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組
成物に関する。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物
は、病原体感染の予防又は治療において使用するためのものである。別の実施態様におい
て、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物は、腫瘍原性、好ましくは、腫瘍原性
腫瘍に基づく障害、例えば、腫瘍障害、悪性腫瘍障害、又は悪性新生物の予防又は治療に
おいて使用するためのものである。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質
又は本発明の組成物は、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するため
のものである。
成物に関する。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物
は、病原体感染の予防又は治療において使用するためのものである。別の実施態様におい
て、本発明のキメラタンパク質又は本発明の組成物は、腫瘍原性、好ましくは、腫瘍原性
腫瘍に基づく障害、例えば、腫瘍障害、悪性腫瘍障害、又は悪性新生物の予防又は治療に
おいて使用するためのものである。特定の実施態様において、本発明のキメラタンパク質
又は本発明の組成物は、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するため
のものである。
特定の実施態様において、本発明はまた、病原体感染を呈しているか、又は病原体感染
を有することが疑われる動物又はヒト患者の治療的処置のための方法であって、(a)該動
物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパ
ク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関
する。
を有することが疑われる動物又はヒト患者の治療的処置のための方法であって、(a)該動
物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパ
ク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を含む、方法に関
する。
別の実施態様において、本発明はまた、腫瘍障害を呈している動物又はヒト患者の治療
的処置のための方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投
与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト
患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
的処置のための方法であって、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投
与用量としての、本発明のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト
患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
本発明はまた、動物又はヒト患者の病原体感染を予防する方法であって、(a)該動物又
はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質
又は組成物の投与、及び(b)場合によっては、複数回投与用量としての、該動物又はヒト
患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明のキメラタンパク質
又は組成物の投与、及び(b)場合によっては、複数回投与用量としての、該動物又はヒト
患者の状態の追跡調査を含む、方法に関する。
本発明はまた、動物又はヒト患者における腫瘍障害の出現又は発症を予防する方法であ
って、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明
のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を
含む、方法に関する。
って、(a)該動物又はヒト患者への、場合によっては、複数回投与用量としての、本発明
のキメラタンパク質又は組成物の投与、及び(b)該動物又はヒト患者の状態の追跡調査を
含む、方法に関する。
本発明による治療的処置は、病原体に感染しているもしくはその疑いがあると診断され
た、又は病理学的状態に罹患していると診断された、それを必要とする動物又はヒト患者
の臨床状態の改善を目指している。特定の実施態様において、この処置は、疾患の原因因
子もしくは原因生物の排除、又は該因子もしくは生物の存在量の低下を目指している。ウ
イルス感染の状況においては、該処置は、測定したときに検出することができるものより
も少ない、宿主の標的組織におけるウイルス量の顕著な減少をもたらし得る。腫瘍障害の
場合、該処置は、腫瘍(複数可)のサイズもしくは発症の低減、又は腫瘍細胞の根絶、又は
測定したときに検出することができるものよりも少ないレベルでの腫瘍細胞の数の低下を
もたらし得る。該治療的処置はまた、病原体感染又は腫瘍障害と関連する症状の排除又は
低減による、動物又はヒト患者の臨床状態の改善を目指しており、好ましくは、健康の回
復を目指している。
た、又は病理学的状態に罹患していると診断された、それを必要とする動物又はヒト患者
の臨床状態の改善を目指している。特定の実施態様において、この処置は、疾患の原因因
子もしくは原因生物の排除、又は該因子もしくは生物の存在量の低下を目指している。ウ
イルス感染の状況においては、該処置は、測定したときに検出することができるものより
も少ない、宿主の標的組織におけるウイルス量の顕著な減少をもたらし得る。腫瘍障害の
場合、該処置は、腫瘍(複数可)のサイズもしくは発症の低減、又は腫瘍細胞の根絶、又は
測定したときに検出することができるものよりも少ないレベルでの腫瘍細胞の数の低下を
もたらし得る。該治療的処置はまた、病原体感染又は腫瘍障害と関連する症状の排除又は
低減による、動物又はヒト患者の臨床状態の改善を目指しており、好ましくは、健康の回
復を目指している。
動物又はヒト患者の予防的処置は、該動物もしくはヒト患者の病原体感染の予防、又は
新生物性腫瘍障害の出現もしくは発症の予防、又は該動物もしくはヒト患者における病理
学的状態の発生の予防を目指している。該予防的処置は、ワクチン接種を包含する。
新生物性腫瘍障害の出現もしくは発症の予防、又は該動物もしくはヒト患者における病理
学的状態の発生の予防を目指している。該予防的処置は、ワクチン接種を包含する。
本発明のキメラタンパク質又は組成物を使用する治療的及び予防的処置は、宿主におけ
る、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する効率的な免疫応答、好まし
くは、細胞性免疫応答の誘発に基づくものである。
る、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する効率的な免疫応答、好まし
くは、細胞性免疫応答の誘発に基づくものである。
それゆえ、本発明はまた、本発明のキメラタンパク質又は組成物が投与される宿主にお
ける、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する免疫応答、好ましくは、
細胞性免疫応答(例えば、CTL応答)を誘導又は誘発するための該キメラタンパク質又は組
成物の使用に関する。
ける、異種ポリペプチドに含まれるエピトープ(複数可)に対する免疫応答、好ましくは、
細胞性免疫応答(例えば、CTL応答)を誘導又は誘発するための該キメラタンパク質又は組
成物の使用に関する。
特定の実施態様において、本発明はまた、(i)異種ポリペプチドに含まれる第一の群の
エピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第
一の確定される病理学的状態(複数可)の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペ
プチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによ
る、同じ哺乳動物宿主内の第二の確定される病理学的状態(複数可)に対する予防において
使用するための、本発明のキメラタンパク質又は組成物であって、該免疫応答が、該キメ
ラタンパク質又は該組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトー
プが該異種ポリペプチド中に含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態(複数可)
に対する予防が観察されない、キメラタンパク質又は組成物に関する。
エピトープに対するT細胞免疫応答を誘発することによる、哺乳動物宿主で診断される第
一の確定される病理学的状態(複数可)の免疫療法的治療において、及び(ii)該異種ポリペ
プチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記憶免疫応答を誘発することによ
る、同じ哺乳動物宿主内の第二の確定される病理学的状態(複数可)に対する予防において
使用するための、本発明のキメラタンパク質又は組成物であって、該免疫応答が、該キメ
ラタンパク質又は該組成物の該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトー
プが該異種ポリペプチド中に含まれないとき、該第二の確定される病理学的状態(複数可)
に対する予防が観察されない、キメラタンパク質又は組成物に関する。
実際、本発明者らは、本発明のキメラタンパク質が、APCへのアクセス、APCによるプロ
セッシング及び提示、並びにサイトカインの利用可能性に関して、異なるエピトープ間で
存在する競合を回避することができることを示した。したがって、本発明のキメラタンパ
ク質を用いて、治療的処置において第一の群のエピトープに対する免疫応答を誘導し、予
防的処置において第二の群のエピトープに対する免疫応答をも誘導することが可能である
。したがって、本発明のキメラタンパク質は、宿主内で診断される第一の確定される病理
学的状態(複数可)の免疫療法的治療においてT細胞免疫応答を誘発し、同じ宿主内の第二
の確定される病理学的状態(複数可)のリスクに対する予防においてT細胞記憶免疫応答を
誘発するのに効率的である。
セッシング及び提示、並びにサイトカインの利用可能性に関して、異なるエピトープ間で
存在する競合を回避することができることを示した。したがって、本発明のキメラタンパ
ク質を用いて、治療的処置において第一の群のエピトープに対する免疫応答を誘導し、予
防的処置において第二の群のエピトープに対する免疫応答をも誘導することが可能である
。したがって、本発明のキメラタンパク質は、宿主内で診断される第一の確定される病理
学的状態(複数可)の免疫療法的治療においてT細胞免疫応答を誘発し、同じ宿主内の第二
の確定される病理学的状態(複数可)のリスクに対する予防においてT細胞記憶免疫応答を
誘発するのに効率的である。
(実施例)
(I.材料及び方法)
(マウス)
6週齢の雌C57BL/6マウス(H-2b)をJanvier Laboratoriesから購入した。マウスを、病原
体が存在しない条件下で、水及び餌を自由に摂取できる状態で飼育した。動物及びその世
話が関係する手順は、国内外の法律及び政策を順守し、地方倫理委員会によって審査され
るGenticel社の指針に適合させた。
(I.材料及び方法)
(マウス)
6週齢の雌C57BL/6マウス(H-2b)をJanvier Laboratoriesから購入した。マウスを、病原
体が存在しない条件下で、水及び餌を自由に摂取できる状態で飼育した。動物及びその世
話が関係する手順は、国内外の法律及び政策を順守し、地方倫理委員会によって審査され
るGenticel社の指針に適合させた。
本発明で使用されるHPV型の一部については、異なる遺伝的背景を有する他のマウスを
有利に使用することができる。そのようなマウスは、Janvier laboratoriesから購入する
ことができ、これには、DBA/2JRi(H2Kd/H2Dd)、又はCBA/JRi(H2Kk/H2Dk)SJL/JRi(H2Ks/H2
Ds)及びFVB/NRi(H2Kq/H2Dq)が含まれる。
有利に使用することができる。そのようなマウスは、Janvier laboratoriesから購入する
ことができ、これには、DBA/2JRi(H2Kd/H2Dd)、又はCBA/JRi(H2Kk/H2Dk)SJL/JRi(H2Ks/H2
Ds)及びFVB/NRi(H2Kq/H2Dq)が含まれる。
他のマウス、例えば、HLA、特に、HLA-A2ハプロタイプを有するヒト化マウスもまた、
本発明のコンストラクトによって誘発される免疫応答を決定する際に関心対象となる。ト
ランスジェニックHLA-A2.1マウスをTACONIC(USA)から購入して、記載されたワクチン候補
の選択されたHPV型由来の各々のE7に対する免疫原性を、ヒトHLA-A2.1ハプロタイプを発
現するマウスで試験することができる。
本発明のコンストラクトによって誘発される免疫応答を決定する際に関心対象となる。ト
ランスジェニックHLA-A2.1マウスをTACONIC(USA)から購入して、記載されたワクチン候補
の選択されたHPV型由来の各々のE7に対する免疫原性を、ヒトHLA-A2.1ハプロタイプを発
現するマウスで試験することができる。
これらのマウスを用いて、記載された候補ワクチンの選択されたHPV型由来の各々のE7
に対する免疫原性を試験する。
に対する免疫原性を試験する。
(腫瘍細胞株)
TC-1(組織培養番号1)腫瘍細胞[19]は、HPV16 E6及びE7腫瘍遺伝子並びに活性化ヒトc-H
a-Ras腫瘍遺伝子によるC57BL/6初代マウス肺細胞の形質転換によって調製された。この研
究で使用される細胞は、ATCCから入手された。TC1細胞を各実験の前に解凍し、その後、
注射前に少なくとも10日間、インビトロで培養し、拡大した。
TC-1(組織培養番号1)腫瘍細胞[19]は、HPV16 E6及びE7腫瘍遺伝子並びに活性化ヒトc-H
a-Ras腫瘍遺伝子によるC57BL/6初代マウス肺細胞の形質転換によって調製された。この研
究で使用される細胞は、ATCCから入手された。TC1細胞を各実験の前に解凍し、その後、
注射前に少なくとも10日間、インビトロで培養し、拡大した。
ルイス肺癌(LL2)は、初代ルイス肺癌の移植によって生じた腫瘍を担持するC57BL/6マウ
スの肺から樹立された細胞株である(13)。この株は、転移のモデルとして広く使用されて
おり、癌療法のメカニズムを研究するのに有用である(14)。LL2腫瘍細胞株は、ATCC(CRL-
1642)から購入した。
スの肺から樹立された細胞株である(13)。この株は、転移のモデルとして広く使用されて
おり、癌療法のメカニズムを研究するのに有用である(14)。LL2腫瘍細胞株は、ATCC(CRL-
1642)から購入した。
これらの細胞を、製造元のプロトコル(Vectalys, Labege, France)に従って、HPV18 E7
及びGFP遺伝子又はGFP遺伝子のみを担持するレンチウイルスベクターで形質導入した。3
つのクローンを、MHCクラスI、GFP、及びE7発現に基づいて選択した。1つのクローンを、
その成長プロファイル及びHPV18 E7特異的細胞傷害性T CD8+リンパ球によって標的とされ
るその能力に従って、予防的インビボ選択後に選択し;細胞接種の最適数を求めて、生着
率実験を行った。インビボ選択、生着率、及び処置理想時間の検討は、Oncodesign(Dijon
, France)によって行われた。LL2細胞を各実験の前に解凍し、その後、注射前に少なくと
も10日間、インビトロで培養し、拡大した。
及びGFP遺伝子又はGFP遺伝子のみを担持するレンチウイルスベクターで形質導入した。3
つのクローンを、MHCクラスI、GFP、及びE7発現に基づいて選択した。1つのクローンを、
その成長プロファイル及びHPV18 E7特異的細胞傷害性T CD8+リンパ球によって標的とされ
るその能力に従って、予防的インビボ選択後に選択し;細胞接種の最適数を求めて、生着
率実験を行った。インビボ選択、生着率、及び処置理想時間の検討は、Oncodesign(Dijon
, France)によって行われた。LL2細胞を各実験の前に解凍し、その後、注射前に少なくと
も10日間、インビトロで培養し、拡大した。
B16-IRES-GFP-OVA(B16-GFP)及びB16-MAGEA3-IRES-GFP-OVA(B16-MAGEA3-GFP)細胞を用い
て、処置マウスから得られた脾細胞をエクスビボで再刺激した。B16-MAGEA3細胞は、Vect
alysによってMAGE-A3タンパク質を発現するように形質導入されたB16-F10同系腫瘍細胞で
ある。GFP発現は、通常、MAGE-A3タンパク質発現に関連している。
て、処置マウスから得られた脾細胞をエクスビボで再刺激した。B16-MAGEA3細胞は、Vect
alysによってMAGE-A3タンパク質を発現するように形質導入されたB16-F10同系腫瘍細胞で
ある。GFP発現は、通常、MAGE-A3タンパク質発現に関連している。
(腫瘍細胞接種)
第0日目に、C57BL/6マウスに、TC-1細胞(100μLの1×PBSに希釈したマウス1匹当たり1
×106個の細胞)を右脇腹の皮下経路から注射した。一部の実験では、第65日目に、マウス
に、100μLの1×PBSに希釈したLL2-GFP又はLL2-HPV18 E7-GFP細胞を左脇腹の皮下経路か
ら注射した。
第0日目に、C57BL/6マウスに、TC-1細胞(100μLの1×PBSに希釈したマウス1匹当たり1
×106個の細胞)を右脇腹の皮下経路から注射した。一部の実験では、第65日目に、マウス
に、100μLの1×PBSに希釈したLL2-GFP又はLL2-HPV18 E7-GFP細胞を左脇腹の皮下経路か
ら注射した。
(ワクチン)
(組換えCyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)の構築及び精製)
構築及び精製は、EP1 576 967 B1号で既に記載された。ProCervixと命名された二価組
成物を作製するために、CyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)(図1A)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(
C18-1)(図1B)の2つの最終バルクをGenticelにおいて1:1の比で混合し、その後、これを分
注して-80℃で保存した。
(組換えCyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(C18-1)の構築及び精製)
構築及び精製は、EP1 576 967 B1号で既に記載された。ProCervixと命名された二価組
成物を作製するために、CyaA-HPV16 E7Δ30-42(C16-1)(図1A)及びCyaA-HPV18 E7Δ32-42(
C18-1)(図1B)の2つの最終バルクをGenticelにおいて1:1の比で混合し、その後、これを分
注して-80℃で保存した。
(gtCyaAd93-及びgtCyaAd203-ベースのワクチンの構築及び精製:)
野生型CyaA(CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1)のDNA配列を大腸菌での発現用に最適化し
、合成した(GeneCust)。最適化されたDNA配列をgtCyaAと命名する。この配列は、CyaA-触
媒ドメインへの抗原性配列の挿入を容易にするために付加された以下のユニークな制限部
位を保有している:
。
野生型CyaA(CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1)のDNA配列を大腸菌での発現用に最適化し
、合成した(GeneCust)。最適化されたDNA配列をgtCyaAと命名する。この配列は、CyaA-触
媒ドメインへの抗原性配列の挿入を容易にするために付加された以下のユニークな制限部
位を保有している:
その後、gtCyaAを、pTAC誘導性プロモーターを含むpGTPc608プラスミドに挿入した(プ
ラスミドは、GTP Technology, Labege, Franceによって提供されたものである)。
ラスミドは、GTP Technology, Labege, Franceによって提供されたものである)。
2つの欠失突然変異体:百日咳菌CyaAの位置228～位置320の93アミノ酸の欠失及び百日咳
菌CyaAの位置184～位置386の203アミノ酸の欠失を試験した。93残基の第一の欠失により
、カルモジュリン相互作用ドメイン(ドメインIII)が除去される。203残基の第二の欠失に
より、ドメインII及びIIIが除去される。
菌CyaAの位置184～位置386の203アミノ酸の欠失を試験した。93残基の第一の欠失により
、カルモジュリン相互作用ドメイン(ドメインIII)が除去される。203残基の第二の欠失に
より、ドメインII及びIIIが除去される。
gtCyaA中の93及び203aaの欠失を生成させると同時に、抗原を挿入した。
各々の発現タンパク質の精製をクロマトグラフィー手順によって達成し;特に、イオン
交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
(gtCyaAd93-pep216-CyaCopt及びgtCyaAd203-pep216-CyaCoptの構築及び精製)
全ての抗原は、DNA 2.0.(USA)又はGenecust(Germany)によって合成され、クローニング
は、Solvias, Switzerlandによって行われた。gtCyaAd93-pep216-CyaACopt及びgtCyaAd20
3- pep216-CyaACoptの模式的表示を図3A及び3Bに示す。
全ての抗原は、DNA 2.0.(USA)又はGenecust(Germany)によって合成され、クローニング
は、Solvias, Switzerlandによって行われた。gtCyaAd93-pep216-CyaACopt及びgtCyaAd20
3- pep216-CyaACoptの模式的表示を図3A及び3Bに示す。
BLR細菌株に各々のプラスミドをそれぞれ電気穿孔した。トランスフェクトされた細菌
を従来の培地中で成長させ、IPTGの添加によって産物を誘導した。
を従来の培地中で成長させ、IPTGの添加によって産物を誘導した。
各々の発現タンパク質の精製をクロマトグラフィー手順によって達成し;特に、イオン
交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
交換親和性クロマトグラフィー及び疎水性交換クロマトグラフィー法を実施した。
(CyaAd203-pep105の構築:)
CyaAd203-PEP105optタンパク質は、抗原性挿入物としてポリペプチド105(PEP105)を含
有する、203aaが欠失したアデニル酸シクラーゼ配列によって構成されている。最適化さ
れたCyaA配列を、以前に記載されている通りに、NdeI制限部位及びBamHI制限部位で、pKT
RACEプラスミドにクローニングした。Pep105抗原を合成し、EcoRI制限部位とXmaI制限部
位の間にクローニングした。精製プロトコルは、EP1 576 967 B1号に既に記載された。pK
TRACE CyaAd203-pep105optの模式的表示を図4に示す。
CyaAd203-PEP105optタンパク質は、抗原性挿入物としてポリペプチド105(PEP105)を含
有する、203aaが欠失したアデニル酸シクラーゼ配列によって構成されている。最適化さ
れたCyaA配列を、以前に記載されている通りに、NdeI制限部位及びBamHI制限部位で、pKT
RACEプラスミドにクローニングした。Pep105抗原を合成し、EcoRI制限部位とXmaI制限部
位の間にクローニングした。精製プロトコルは、EP1 576 967 B1号に既に記載された。pK
TRACE CyaAd203-pep105optの模式的表示を図4に示す。
ポリペプチドpep105(配列番号24)は、N末端からC末端に、以下の抗原を含む。ある抗原
は融合しており、他の抗原はリンカーによって隔てられている。免疫応答較正用の強力な
マウスMHCクラスI拘束性エピトープ(H-2b拘束性)を生成させるために、特定のリンカー(A
Sジペプチド)が、
配列の前に導入されている(太字):
は融合しており、他の抗原はリンカーによって隔てられている。免疫応答較正用の強力な
マウスMHCクラスI拘束性エピトープ(H-2b拘束性)を生成させるために、特定のリンカー(A
Sジペプチド)が、
(ワクチン投与)
第11日目に、腫瘍測定後、検出可能な固形腫瘍を有するマウスに、耳真皮への皮内(id)
注射によって、ワクチン接種した(両耳に注射した)。
第11日目に、腫瘍測定後、検出可能な固形腫瘍を有するマウスに、耳真皮への皮内(id)
注射によって、ワクチン接種した(両耳に注射した)。
(アジュバント分子)
ポリ-ICLC(TLR3アゴニスト)は、Oncovir(Inc, WA, US)によって、1mLの2mg/mLの乳白色
の滅菌溶液を含むバイアル中に提供された。ポリ-ICLCをもとの容器に入れたままにして
、+4℃で保存した。注射用のポリ-ICLCは、0.9％塩化ナトリウム溶液中の1.5mg/mLのポリ
-L-リジン及び5mg/mLのカルボキシメチルセルロースナトリウムで安定化され、水酸化ナ
トリウムでpH 7.6～7.8に調整された2mg/mLのポリ-ICを含む。
ポリ-ICLC(TLR3アゴニスト)は、Oncovir(Inc, WA, US)によって、1mLの2mg/mLの乳白色
の滅菌溶液を含むバイアル中に提供された。ポリ-ICLCをもとの容器に入れたままにして
、+4℃で保存した。注射用のポリ-ICLCは、0.9％塩化ナトリウム溶液中の1.5mg/mLのポリ
-L-リジン及び5mg/mLのカルボキシメチルセルロースナトリウムで安定化され、水酸化ナ
トリウムでpH 7.6～7.8に調整された2mg/mLのポリ-ICを含む。
(腫瘍測定)
様々なパラメータを考慮に入れて、マウスにおける腫瘍発生を評価した:
・腫瘍サイズ:腫瘍を、腫瘍細胞接種5日後から始めて60日まで、週に2回、キャリパーを
用いて手作業で測定した。その後、腫瘍体積を次のように計算した:体積＝(長さ×幅2)/2
。
・マウス生存:倫理的な理由で、異常に重大な(限界サイズ: 2000mm3)及び/もしくは壊死
性の腫瘍を発生させるか、又は腫瘍誘導性運動障害を有するマウスを安楽死させた。
・無腫瘍マウスの数:この情報は、治療的ワクチン接種がいつ完全な腫瘍退縮(触診可能な
腫瘍の不在)を誘導したのかを示す。
様々なパラメータを考慮に入れて、マウスにおける腫瘍発生を評価した:
・腫瘍サイズ:腫瘍を、腫瘍細胞接種5日後から始めて60日まで、週に2回、キャリパーを
用いて手作業で測定した。その後、腫瘍体積を次のように計算した:体積＝(長さ×幅2)/2
。
・マウス生存:倫理的な理由で、異常に重大な(限界サイズ: 2000mm3)及び/もしくは壊死
性の腫瘍を発生させるか、又は腫瘍誘導性運動障害を有するマウスを安楽死させた。
・無腫瘍マウスの数:この情報は、治療的ワクチン接種がいつ完全な腫瘍退縮(触診可能な
腫瘍の不在)を誘導したのかを示す。
(CD8 T細胞記憶細胞傷害性応答の測定)
CD8+ T細胞の細胞傷害性をインビボで測定する方法は、広く記載されている[22、23]。
簡潔に述べると、未感作マウス由来の同系脾細胞を異なる濃度のCFSE(カルボキシフルオ
レセインスクシニミジルエステル、Molecular Probes Invitrogen)で標識し、インビトロ
で関連ペプチドでパルスするか、又はパルスしないでおく。ペプチドパルスされた標的細
胞集団とペプチドパルスされていない標的細胞集団の両方を同系のワクチン接種宿主に静
脈内養子移植し、ペプチドパルスされた標的の損失を、脾臓へのフローサイトメトリー(B
D FACSCanto II)によって測定した。殺傷のパーセンテージを、パルスされた標的細胞対
パルスされていない細胞のパーセンテージの比の低下から推定し、初期比によって補正し
た(下記参照)。細胞調製物を注射前にフローサイトメトリーによって解析し、異なる標的
細胞のCFSE標識をモニタリングし、インビボ殺傷パーセンテージの計算用の参照値(各々
の細胞集団の実際のパーセンテージ)を得た。その後、3つの標的細胞集団を、1:1:1の比
で、各々のワクチン接種マウスに静脈内注射した。インビボ殺傷のパーセンテージは、以
下の式を用いて、別所に記載されている通りに算出される[24]:
CD8+ T細胞の細胞傷害性をインビボで測定する方法は、広く記載されている[22、23]。
簡潔に述べると、未感作マウス由来の同系脾細胞を異なる濃度のCFSE(カルボキシフルオ
レセインスクシニミジルエステル、Molecular Probes Invitrogen)で標識し、インビトロ
で関連ペプチドでパルスするか、又はパルスしないでおく。ペプチドパルスされた標的細
胞集団とペプチドパルスされていない標的細胞集団の両方を同系のワクチン接種宿主に静
脈内養子移植し、ペプチドパルスされた標的の損失を、脾臓へのフローサイトメトリー(B
D FACSCanto II)によって測定した。殺傷のパーセンテージを、パルスされた標的細胞対
パルスされていない細胞のパーセンテージの比の低下から推定し、初期比によって補正し
た(下記参照)。細胞調製物を注射前にフローサイトメトリーによって解析し、異なる標的
細胞のCFSE標識をモニタリングし、インビボ殺傷パーセンテージの計算用の参照値(各々
の細胞集団の実際のパーセンテージ)を得た。その後、3つの標的細胞集団を、1:1:1の比
で、各々のワクチン接種マウスに静脈内注射した。インビボ殺傷のパーセンテージは、以
下の式を用いて、別所に記載されている通りに算出される[24]:
(IFN-γ ELISpot(酵素結合免疫スポット)アッセイ)
IFN-γを産生する特異的CD8+ T細胞の頻度を、H-2b拘束性ペプチド(HPV16 E749-57及び
HPV18 E7AS43-49)又はHPV45 E7タンパク質のペプチド列のいずれかによる脾細胞のエクス
ビボ再刺激によって評価した。これを、IFN-γ ELISpotアッセイを行うことによって達成
した:
・ELISpotアッセイをプールされたマウス脾細胞に対して行った。
IFN-γを産生する特異的CD8+ T細胞の頻度を、H-2b拘束性ペプチド(HPV16 E749-57及び
HPV18 E7AS43-49)又はHPV45 E7タンパク質のペプチド列のいずれかによる脾細胞のエクス
ビボ再刺激によって評価した。これを、IFN-γ ELISpotアッセイを行うことによって達成
した:
・ELISpotアッセイをプールされたマウス脾細胞に対して行った。
簡潔に述べると、ワクチン接種マウスから得られた全ての脾細胞を刺激しないでおくか
、又は以下に示すように、1μg/mLの各ペプチドで、37℃、5％CO2で、20時間再刺激する:
・HPV16 E749-57ペプチド(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・OVA257-264(H-2b拘束性非関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・HPV18 E7AS43-49(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり0.25×106細胞
・HPV45 E7ペプチド列を含むウェル1つ当たり1×106細胞。
、又は以下に示すように、1μg/mLの各ペプチドで、37℃、5％CO2で、20時間再刺激する:
・HPV16 E749-57ペプチド(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・OVA257-264(H-2b拘束性非関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり1×106細胞
・HPV18 E7AS43-49(H-2b拘束性関連エピトープ)を含むウェル1つ当たり0.25×106細胞
・HPV45 E7ペプチド列を含むウェル1つ当たり1×106細胞。
CyaAd203-PEP105optを用いる実験のために、さらなる抗原刺激を用いた:
・#116-2/3ペプチド列(5μg/ml):#116-2及び#116-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・#171ペプチド列(3μg/ml):#171-1、#171-2、及び#171-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチ
ド
・1μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチ
ド
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・10μg/mlで使用される、Genticelで生産されたHis-タグ化MAGEA3(TAA_002_MAGE-3)タン
パク質
・脾細胞: B16-GFP細胞(MAGEA3を発現するもの又は発現しないもの)を19:1の比で共培養
した(950000個の脾細胞:50000個のB16細胞)。
・#116-2/3ペプチド列(5μg/ml):#116-2及び#116-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・#171ペプチド列(3μg/ml):#171-1、#171-2、及び#171-3のプール(1×106細胞/ウェル)
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチ
ド
・1μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチ
ド
・10μg/ml(1×106細胞/ウェル)で使用される、MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
・10μg/mlで使用される、Genticelで生産されたHis-タグ化MAGEA3(TAA_002_MAGE-3)タン
パク質
・脾細胞: B16-GFP細胞(MAGEA3を発現するもの又は発現しないもの)を19:1の比で共培養
した(950000個の脾細胞:50000個のB16細胞)。
IFN-γ分泌を、ストレプトアビジン-AKPを用いてBCIP/NBTによって明らかにされるサン
ドイッチベースのELISpotよってモニタリングした。データをBioreader 5000-Pro S(Bios
ys)で解析した。
ドイッチベースのELISpotよってモニタリングした。データをBioreader 5000-Pro S(Bios
ys)で解析した。
(II.結果)
(A.モデル抗原に対する免疫応答を誘導する本発明の新しいベクターの能力の確認)
大きくかつ複数のエピトープを有する抗原を送達するその能力における本発明の新しい
ベクターの効率性を確認するために、441個のアミノ酸(配列番号24)を有するモデル抗原
を設計した。
(A.モデル抗原に対する免疫応答を誘導する本発明の新しいベクターの能力の確認)
大きくかつ複数のエピトープを有する抗原を送達するその能力における本発明の新しい
ベクターの効率性を確認するために、441個のアミノ酸(配列番号24)を有するモデル抗原
を設計した。
マウスに、第0日目に、CyaAd203-pep105optタンパク質をワクチン接種し、第7日目に安
楽死させ、脾臓を収集し、脾細胞を単離した。これらの細胞を用いて、T細胞媒介性応答
を、IFN-γ及びIL-2 ELISpotアッセイを用いて測定した。ProCervixをワクチン接種した
マウスを、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的T細胞応答の誘導の陽性対照として、並びにCyaAd
203-PEP105optによってのみ送達される他の抗原の陰性対照として使用した。全てのワク
チン接種をポリ-ICLCの同時注射によって免疫増強した。
楽死させ、脾臓を収集し、脾細胞を単離した。これらの細胞を用いて、T細胞媒介性応答
を、IFN-γ及びIL-2 ELISpotアッセイを用いて測定した。ProCervixをワクチン接種した
マウスを、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的T細胞応答の誘導の陽性対照として、並びにCyaAd
203-PEP105optによってのみ送達される他の抗原の陰性対照として使用した。全てのワク
チン接種をポリ-ICLCの同時注射によって免疫増強した。
(A.1. HPV16 E7、HPV18 E7、及びOVA257-264特異的IFN-γ応答の誘導)
図5は、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264クラスI拘束性エピトープ、
並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3) 15-merペプチド列による再刺激の
後に得られた結果を示している。以下の結論を引き出すことができる:
-ポリ-ICLC免疫増強プラセボによってワクチン接種したマウスの群では、抗原特異的免
疫応答が検出されなかった。
-ポリ-ICLC免疫増強ProCervixワクチン接種でワクチン接種したマウスの群に関しては
、再刺激がどのようなものであれ、予想通りの結果が得られた:
-HPV16E749-57及びHPV18E7AS43-49クラスI拘束性エピトープによるインビトロ再刺激
は、明瞭なHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答を誘導した;
-OVA257-264再刺激では特異的応答が全く得られなかった;
-ペプチド列(#116-2/3及び#171-1/2/3)で得られたHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-
γ応答の強度は、MHCクラスI拘束性ペプチド(HPV16E749-57、HPV18 E7AS43-49)で得られ
た応答のレベルと近かった。
-ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optでワクチン接種したマウスに関して、HPV16 E7
ペプチド列とHPV18 E7ペプチド列の両方(#116-2/3及び#171-1/2/3)並びにProCervixにつ
いて試験した全てのMHCクラスI拘束性エピトープ: HPV16E749-57、HPV18E7AS43-49による
、また同じく、OVA257-264ペプチドによる、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の検
出。
図5は、HPV16 E749-57、HPV18 E7AS43-49、及びOVA257-264クラスI拘束性エピトープ、
並びにHPV16 E7(#116-2/3)及びHPV18 E7(#171-1/2/3) 15-merペプチド列による再刺激の
後に得られた結果を示している。以下の結論を引き出すことができる:
-ポリ-ICLC免疫増強プラセボによってワクチン接種したマウスの群では、抗原特異的免
疫応答が検出されなかった。
-ポリ-ICLC免疫増強ProCervixワクチン接種でワクチン接種したマウスの群に関しては
、再刺激がどのようなものであれ、予想通りの結果が得られた:
-HPV16E749-57及びHPV18E7AS43-49クラスI拘束性エピトープによるインビトロ再刺激
は、明瞭なHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答を誘導した;
-OVA257-264再刺激では特異的応答が全く得られなかった;
-ペプチド列(#116-2/3及び#171-1/2/3)で得られたHPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-
γ応答の強度は、MHCクラスI拘束性ペプチド(HPV16E749-57、HPV18 E7AS43-49)で得られ
た応答のレベルと近かった。
-ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optでワクチン接種したマウスに関して、HPV16 E7
ペプチド列とHPV18 E7ペプチド列の両方(#116-2/3及び#171-1/2/3)並びにProCervixにつ
いて試験した全てのMHCクラスI拘束性エピトープ: HPV16E749-57、HPV18E7AS43-49による
、また同じく、OVA257-264ペプチドによる、HPV16 E7及びHPV18 E7特異的IFN-γ応答の検
出。
これらの結果は、これら全ての異なるペプチドによるエクスビボ再刺激が、CyaAd203-P
EP105opt皮内ワクチン接種によって誘発されるHPV18 E7、HPV16 E7、及びOVA257-264 抗
原特異的T細胞を再刺激することができることを示した。
EP105opt皮内ワクチン接種によって誘発されるHPV18 E7、HPV16 E7、及びOVA257-264 抗
原特異的T細胞を再刺激することができることを示した。
(A.2.抗原OVA323-339、LCMV GP33-41、MOG35-55、及びMAGEA3に特異的なT細胞媒介性IFN-
γ応答の誘導)
図6は、異なるタイプのエクスビボ再刺激後に得られた結果を示している:
-OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
-MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-His-タグ化MAGEA3タンパク質
-B16-MAGEA3-GFP腫瘍細胞をAPCとして用いて、MAGE-A3タンパク質の内因性プロセッシ
ングから生じるMHCクラスI拘束性エピトープの提示を介して、抗原特異的CD8+ T細胞を刺
激した。MAGE-A3タンパク質を発現していないB16-GFP細胞もMAGEA3免疫応答特異性の陰性
対照として試験した。
γ応答の誘導)
図6は、異なるタイプのエクスビボ再刺激後に得られた結果を示している:
-OVA323-339、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-LCMV GP33-41、MHC-クラスI拘束性ペプチド
-MOG35-55、MHC-クラスII拘束性ペプチド
-His-タグ化MAGEA3タンパク質
-B16-MAGEA3-GFP腫瘍細胞をAPCとして用いて、MAGE-A3タンパク質の内因性プロセッシ
ングから生じるMHCクラスI拘束性エピトープの提示を介して、抗原特異的CD8+ T細胞を刺
激した。MAGE-A3タンパク質を発現していないB16-GFP細胞もMAGEA3免疫応答特異性の陰性
対照として試験した。
本発明者らは、全ての群について、タンパク質His-タグMAGE-3が同じ非特異的応答を誘
導したことを認めることができる。
導したことを認めることができる。
ポリ-ICLC免疫増強プラセボ又はポリ-ICLC免疫増強ProCervixをワクチン接種したマウ
スについては、これらの抗原に対する免疫応答が検出されなかった。
スについては、これらの抗原に対する免疫応答が検出されなかった。
ポリ-ICLC免疫増強CyaAd203-PEP105optをワクチン接種したマウスについては、OVA323-
339、GP33-41、及びMOG35-55ペプチドによる再刺激の後に、抗原特異的なIFN-γ分泌T細
胞が検出されたが、該細胞は、B16-GFP及びB16-MAGEA3-GFP細胞の再刺激の後にも検出さ
れた。
339、GP33-41、及びMOG35-55ペプチドによる再刺激の後に、抗原特異的なIFN-γ分泌T細
胞が検出されたが、該細胞は、B16-GFP及びB16-MAGEA3-GFP細胞の再刺激の後にも検出さ
れた。
これらの結果は、CyaAd203-PEP105optワクチン接種が、I-Ab拘束性OVA323-339、H-2Db
拘束性LCMV GP33-41及びMOG35-55、並びにGFP11抗原特異的T細胞を誘発することを示した
。
拘束性LCMV GP33-41及びMOG35-55、並びにGFP11抗原特異的T細胞を誘発することを示した
。
総合すると、これらの結果は、強力なAg特異的CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の両方を多重エ
ピトープ様式でマウントするCyaAベースのワクチンベクターの優れた効率性を強調するも
のである。
ピトープ様式でマウントするCyaAベースのワクチンベクターの優れた効率性を強調するも
のである。
残念なことに、よく似た頻度のIFN-γ分泌T細胞が両方の細胞株: B16-GFP又はB16-MAGE
A3-GFPによるエクスビボ再刺激の後に得られたので、MAGEA3特異的応答を正確に測定する
ことができなかった。CyaAd203-PEP105optにはGFP11抗原が組み込まれているので、この
ワクチンベクターによる免疫によって、GFP特異的T細胞応答が誘導され、該応答によって
、MAGEA3特異的T細胞応答が覆い隠された。
A3-GFPによるエクスビボ再刺激の後に得られたので、MAGEA3特異的応答を正確に測定する
ことができなかった。CyaAd203-PEP105optにはGFP11抗原が組み込まれているので、この
ワクチンベクターによる免疫によって、GFP特異的T細胞応答が誘導され、該応答によって
、MAGEA3特異的T細胞応答が覆い隠された。
この研究は、203残基欠失CyaAワクチンベクターが、同じワクチン接種マウスにおいて
、いくつかの無関係なT細胞エピトープに対する抗原特異的T細胞応答を誘導することがで
きることを初めて強調するものである。さらに、これらの結果は、この203残基欠失CyaA
ワクチンベクターが、CD4+ T細胞応答とCD8+ T細胞応答の両方(MHC I拘束性ペプチドとMH
C II拘束性ペプチドの両方に対して検出される特異的応答)を誘導する優れた能力も示し
た。
、いくつかの無関係なT細胞エピトープに対する抗原特異的T細胞応答を誘導することがで
きることを初めて強調するものである。さらに、これらの結果は、この203残基欠失CyaA
ワクチンベクターが、CD4+ T細胞応答とCD8+ T細胞応答の両方(MHC I拘束性ペプチドとMH
C II拘束性ペプチドの両方に対して検出される特異的応答)を誘導する優れた能力も示し
た。
(B. HPV抗原の設計)
浸潤性細胞癌(ICC)を有する女性及びHPVに感染しているが、正常な細胞学的所見を有す
る女性におけるその罹患率に基づいて、7つの最もリスクの高いHPV型(16、18、45、31、3
3、52、及び58)由来の7つのE7配列: HPV16 E7変異体(gi_30172006;配列番号25)、HPV18 E
7変異体(gi_167996747;配列番号26)、HPV31 E7変異体(gi_148727610;配列番号27)、HPV33
E7変異体(gi_257472286;配列番号28)、HPV45 E7変異体(gi_549287;配列番号29)、HPV52
E7変異体(gi_237861305;配列番号30)、及びHPV58変異体(gi_19111001;配列番号32)を選択
した[9][10]。
浸潤性細胞癌(ICC)を有する女性及びHPVに感染しているが、正常な細胞学的所見を有す
る女性におけるその罹患率に基づいて、7つの最もリスクの高いHPV型(16、18、45、31、3
3、52、及び58)由来の7つのE7配列: HPV16 E7変異体(gi_30172006;配列番号25)、HPV18 E
7変異体(gi_167996747;配列番号26)、HPV31 E7変異体(gi_148727610;配列番号27)、HPV33
E7変異体(gi_257472286;配列番号28)、HPV45 E7変異体(gi_549287;配列番号29)、HPV52
E7変異体(gi_237861305;配列番号30)、及びHPV58変異体(gi_19111001;配列番号32)を選択
した[9][10]。
E7は、酸性領域によって隔てられた2つの機能ドメインから構成される。これらのドメ
インは、広く記載されている[11-13]。このタンパク質のN末端部分は、pRB結合モチーフ(
LXCXE)を含有し、このタンパク質のC末端部分は、ジンク-フィンガーループを含有する。
HPV16、18、及び45のE7タンパク質のアラインメントを図7Aに示し、HPV 31、33、52、及
び58のE7タンパク質のアラインメントを図7Bに示す。
インは、広く記載されている[11-13]。このタンパク質のN末端部分は、pRB結合モチーフ(
LXCXE)を含有し、このタンパク質のC末端部分は、ジンク-フィンガーループを含有する。
HPV16、18、及び45のE7タンパク質のアラインメントを図7Aに示し、HPV 31、33、52、及
び58のE7タンパク質のアラインメントを図7Bに示す。
2つの組換え抗原は、それぞれ、HPV16、18、及び45の3つのE7配列(酸性領域あり又は酸
性領域なし)の各々における融合によって構成された。さらに、2つの組換え抗原は、それ
ぞれ、HPV 31、33、52、及び58の4つのE7配列(酸性領域あり又は酸性領域なし)の各々に
おける融合によって構成された。各々のE7の酸性領域の有無は、WO 2005089792号に示さ
れた論拠に従うものであり、該文献によって決定された規則に従うものである。実際、Cy
aA中の酸性配列は、CyaAの触媒ドメインの細胞質への正常な移入に有害であると記載され
ている[8]。したがって、ここでは、この領域を含む配列及びそれを含まない配列により
、本発明の新しいベクター(gtCyaAd93及びgtCyaAd203)がこれらの抗原をAPCの細胞質に送
達する能力を試験することができた。
性領域なし)の各々における融合によって構成された。さらに、2つの組換え抗原は、それ
ぞれ、HPV 31、33、52、及び58の4つのE7配列(酸性領域あり又は酸性領域なし)の各々に
おける融合によって構成された。各々のE7の酸性領域の有無は、WO 2005089792号に示さ
れた論拠に従うものであり、該文献によって決定された規則に従うものである。実際、Cy
aA中の酸性配列は、CyaAの触媒ドメインの細胞質への正常な移入に有害であると記載され
ている[8]。したがって、ここでは、この領域を含む配列及びそれを含まない配列により
、本発明の新しいベクター(gtCyaAd93及びgtCyaAd203)がこれらの抗原をAPCの細胞質に送
達する能力を試験することができた。
HPV16、18、及び45のE7配列から構成される抗原を設計して、候補三価CyaA-ベクター化
ワクチンを作製した。これらの配列は、酸性領域が欠失させられているか又は欠失させら
れていない(全長)かのいずれかであり、該E7配列は、図8Aに表示された配置を得るように
分割され、反転させられている。2つの三価候補抗原の配列は、WO 2005089792号に記載さ
れている強力なT細胞マウスエピトープを誘導するようにさらに修飾されている。このエ
ピトープは、タンパク質のC末端部分にあり、酸性領域に隣接しているHPV18 E7の配列
の始点にジペプチドアラニン-セリン(AS)を挿入することによって作製される。
ワクチンを作製した。これらの配列は、酸性領域が欠失させられているか又は欠失させら
れていない(全長)かのいずれかであり、該E7配列は、図8Aに表示された配置を得るように
分割され、反転させられている。2つの三価候補抗原の配列は、WO 2005089792号に記載さ
れている強力なT細胞マウスエピトープを誘導するようにさらに修飾されている。このエ
ピトープは、タンパク質のC末端部分にあり、酸性領域に隣接しているHPV18 E7の配列
HPV31、33、52、及び58のE7配列から構成される抗原を設計して、候補四価CyaA-ベクタ
ー化ワクチンを作製した。三価抗原の場合と同様、これらの配列は、酸性領域が欠失させ
られているか又は欠失させられておらず、該E7配列は、図8Bに表示された配置を得るよう
に分割され、反転させられている。
ー化ワクチンを作製した。三価抗原の場合と同様、これらの配列は、酸性領域が欠失させ
られているか又は欠失させられておらず、該E7配列は、図8Bに表示された配置を得るよう
に分割され、反転させられている。
各々の候補について、ヒトタンパク質に対する応答を誘導し得るエピトープ(複数可)の
存在の探索を行った。驚くべきことに、HPV52 E7の野生型配列は、そもそも、自己免疫エ
ピトープのB*2705エピトープ(9-mer、MHC I)となり得る配列を含有する。このエピトープ
の配列は、ヒトITPR3(イノシトール1,4,5-三リン酸受容体、3型)の配列と100％同一であ
る。このエピトープを回避するために、HPV31、33、及び58型のE7タンパク質との配列相
同性に基づいてHPV52 E7の配列を修飾し、配列番号30の位置84でメチオニンをロイシンに
、位置86でロイシンをメチオニンに置換した(修飾された配列は、
)である。HPV52の修飾された全長E7タンパク質の配列は、配列番号31に示されている通り
である。したがって、該四価抗原の配列の新規性は、E7タンパク質のC末端及びN末端の配
置、並びにHPV 52 E7配列中で実施される2つの修飾の存在に由来する。
存在の探索を行った。驚くべきことに、HPV52 E7の野生型配列は、そもそも、自己免疫エ
ピトープのB*2705エピトープ(9-mer、MHC I)となり得る配列を含有する。このエピトープ
の配列は、ヒトITPR3(イノシトール1,4,5-三リン酸受容体、3型)の配列と100％同一であ
る。このエピトープを回避するために、HPV31、33、及び58型のE7タンパク質との配列相
同性に基づいてHPV52 E7の配列を修飾し、配列番号30の位置84でメチオニンをロイシンに
、位置86でロイシンをメチオニンに置換した(修飾された配列は、
である。したがって、該四価抗原の配列の新規性は、E7タンパク質のC末端及びN末端の配
置、並びにHPV 52 E7配列中で実施される2つの修飾の存在に由来する。
これらの特定の抗原の静電電荷を上で説明されている通りに算出した。これらの抗原は
、-6よりも劣る酸性電荷を有し、それぞれ、三価抗原中に21個のシステイン及び四価抗原
中に28個のシステインを保有する。これらの抗原の特徴を表2にまとめる。
表2:様々なHPV抗原の特性
、-6よりも劣る酸性電荷を有し、それぞれ、三価抗原中に21個のシステイン及び四価抗原
中に28個のシステインを保有する。これらの抗原の特徴を表2にまとめる。
(C. CyaAの触媒ドメイン内の大きな欠失は、大きくかつ複雑な抗原の挿入を可能にする)
三価Pep216及びPep217抗原並びに四価Pep233及びPep234抗原のDNAを合成し、新しいgtC
yaAd93及びgtCyaAd203ベクターにクローニングした。対照として、各々のE7タンパク質を
個別にgtCyaAd93に挿入し、HPV31、33、45、52、及び58のE7配列に問題があるかどうかを
調べた。というのは、これらの配列は、CyaAタンパク質に挿入されたことがこれまで一度
もなかったからである。
表3:本発明のキメラタンパク質の特徴(BTpr_114の配列は、配列番号58に示されている通
りであり; BTpr_116の配列は、配列番号61に示されている通りであり; BTpr_115の配列は
、配列番号64に示されている通りであり; BTpr_117の配列は、配列番号67に示されている
通りである); BTpr_131のE7挿入物の配列は、配列番号70に示されている通りであり; BTp
r_132のE7挿入物の配列は、配列番号71に示されている通りであり; BTpr_133のE7挿入物
の配列は、配列番号73に示されている通りであり; BTpr_134のE7挿入物の配列は、配列番
号74に示されている通りであり; BTpr_120のE7挿入物の配列は、配列番号72に示されてい
る通りである。
三価Pep216及びPep217抗原並びに四価Pep233及びPep234抗原のDNAを合成し、新しいgtC
yaAd93及びgtCyaAd203ベクターにクローニングした。対照として、各々のE7タンパク質を
個別にgtCyaAd93に挿入し、HPV31、33、45、52、及び58のE7配列に問題があるかどうかを
調べた。というのは、これらの配列は、CyaAタンパク質に挿入されたことがこれまで一度
もなかったからである。
りであり; BTpr_116の配列は、配列番号61に示されている通りであり; BTpr_115の配列は
、配列番号64に示されている通りであり; BTpr_117の配列は、配列番号67に示されている
通りである); BTpr_131のE7挿入物の配列は、配列番号70に示されている通りであり; BTp
r_132のE7挿入物の配列は、配列番号71に示されている通りであり; BTpr_133のE7挿入物
の配列は、配列番号73に示されている通りであり; BTpr_134のE7挿入物の配列は、配列番
号74に示されている通りであり; BTpr_120のE7挿入物の配列は、配列番号72に示されてい
る通りである。
これらの一価、三価、及び四価抗原の生産及び分析的特徴を評価した。
したがって、プレ-マスター細胞バンク(プレ-MCB)を各々の構築について実施し、IPTG
による関心対象のタンパク質の誘導について試験した(図9)。一価及び三価候補は、SDS-p
ageゲル解析で、誘導後の正常なプロファイルを有していたが、四価候補は、予想される
サイズに弱いバンドを示している。
による関心対象のタンパク質の誘導について試験した(図9)。一価及び三価候補は、SDS-p
ageゲル解析で、誘導後の正常なプロファイルを有していたが、四価候補は、予想される
サイズに弱いバンドを示している。
このプロファイルを、5リットル発酵槽で発酵させた各々の分子について確認した。生
産されたキメラタンパク質の特徴を表4に示す。
表4:一価、三価、及び四価キメラタンパク質の生産及び分析特性
産されたキメラタンパク質の特徴を表4に示す。
生産の観点からは、どのような欠失であれ、一価及び三価抗原を有する組換えgtCyaAが
、許容できる収率及び純度(＞90％)を生じさせる一方で、四価候補は、低下した純度(関
心対象のタンパク質の11％)を有する。
、許容できる収率及び純度(＞90％)を生じさせる一方で、四価候補は、低下した純度(関
心対象のタンパク質の11％)を有する。
93残基の欠失を担持する候補と203残基欠失した候補を比較したときの全体的な純度を
考慮すると、後者が、gtCyaAd93(Btpr114及びBtpr_115)コンストラクトに劣る収率を有す
ることは明白である。より短い組換えgtCyaAの方がより生産しやすいと予想されるので、
この違いは実に驚くべきものである。
考慮すると、後者が、gtCyaAd93(Btpr114及びBtpr_115)コンストラクトに劣る収率を有す
ることは明白である。より短い組換えgtCyaAの方がより生産しやすいと予想されるので、
この違いは実に驚くべきものである。
それらの抗原を有する両方のベクターには酵素活性がなく、これは、該欠失が、ベクタ
ーの毒性を中和するのに十分であることを強調するものである。
ーの毒性を中和するのに十分であることを強調するものである。
(D.少なくとも4つのE7を有するGtCyaAの生産は配列依存的である)
本発明者らは、四価候補で得られた結果が、CyaA中のE7ポリペプチド配列の数によるも
のであるのか、それともCyaA中のE7ポリペプチド配列の特定のアセンブリによるものであ
るかどうかをさらに調べた。その目的のために、様々なコンストラクトを試験した(表5)
。
表5:三価及び四価HPV抗原を有するキメラタンパク質
本発明者らは、四価候補で得られた結果が、CyaA中のE7ポリペプチド配列の数によるも
のであるのか、それともCyaA中のE7ポリペプチド配列の特定のアセンブリによるものであ
るかどうかをさらに調べた。その目的のために、様々なコンストラクトを試験した(表5)
。
プレ-MCB誘導試験を実施し、驚くことに、CyaA中のE7配列の数は、制限となるものでは
なかった。制限となるのはむしろ、抗原の全体的な配列の性質であった。さらに、Btpr_1
61、162、169、及び170は、全長抗原(BTpr_165、166、173、及び174)と比較したとき、関
心対象のタンパク質のより低い収率を示した(表6)。
表6:プレ-MCB誘導結果のまとめ
なかった。制限となるのはむしろ、抗原の全体的な配列の性質であった。さらに、Btpr_1
61、162、169、及び170は、全長抗原(BTpr_165、166、173、及び174)と比較したとき、関
心対象のタンパク質のより低い収率を示した(表6)。
上記の実験から、本発明者らは、gtCyaAd93及びgtCyaAd203が、少なくとも4つのE7タン
パク質に対応する同等のポリペプチド配列を許容すると結論付けることができる。しかし
ながら、選ばれたE7断片の配列及び配置は、収率及び純度に影響を及ぼす可能性があり、
したがって、いくぶん有利な産業化の可能性を有する。
パク質に対応する同等のポリペプチド配列を許容すると結論付けることができる。しかし
ながら、選ばれたE7断片の配列及び配置は、収率及び純度に影響を及ぼす可能性があり、
したがって、いくぶん有利な産業化の可能性を有する。
(プレ-MCBで観察された結果の確認)
本発明者らは、プレ-MCBレベルで得られた結果が、gtCyaAd93ベクター中の四価コンス
トラクトに特に焦点を当てて確認されるかどうかをさらに調べた。
本発明者らは、プレ-MCBレベルで得られた結果が、gtCyaAd93ベクター中の四価コンス
トラクトに特に焦点を当てて確認されるかどうかをさらに調べた。
BTpr_143よりも良好な又はBTpr_115と同等の発現プロファイルを有するタンパク質を5L
スケールで試験した。以下の表は、得られた結果をまとめたものである。
表7:プレ-MCB誘導及び5L生産の結果のまとめ
スケールで試験した。以下の表は、得られた結果をまとめたものである。
上記の実験から、以下の結論が下される:
1.全体的な生産性及び純度は、Btpr_175を除いて、試験した全てのコンストラクトにつ
いて改善された。
2.生産性及び発現プロファイルは、gtCyaAd93よりもgtCyaAd203による組換えタンパク
質で常に劣っている。
3. gtCyaAd93ベクターは、gtCyaAd203ベクターよりも良好な収率及び純度での4つのHPV
抗原を含む組換えタンパク質の生産を可能にする。
4.これらの結果は、プレ-MCBで行われた観察を裏付けるものである。
1.全体的な生産性及び純度は、Btpr_175を除いて、試験した全てのコンストラクトにつ
いて改善された。
2.生産性及び発現プロファイルは、gtCyaAd93よりもgtCyaAd203による組換えタンパク
質で常に劣っている。
3. gtCyaAd93ベクターは、gtCyaAd203ベクターよりも良好な収率及び純度での4つのHPV
抗原を含む組換えタンパク質の生産を可能にする。
4.これらの結果は、プレ-MCBで行われた観察を裏付けるものである。
(E.大きな抗原を含むgtCyaAd93及びgtCyaAd203は免疫原性である)
(E.1 BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117の免疫原性)
BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117キメラタンパク質の免疫原性をさらに調
べた。マウスに、それぞれ、プラセボ又はProCervix(CyaA-HPV16 E7＋CyaA-HPV18 E7から
構成される陽性対照)又はBtpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pe
p217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep2
17-CyaCopt)のいずれかを皮内ワクチン接種した。全ての群をポリIC-LCで免疫増強した。
ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、以前に同定されたMHCクラスI拘
束性ペプチドで再刺激した。結果を図10に示した。
(E.1 BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117の免疫原性)
BTpr_114、BTpr_115、BTpr_116、及びBTpr_117キメラタンパク質の免疫原性をさらに調
べた。マウスに、それぞれ、プラセボ又はProCervix(CyaA-HPV16 E7＋CyaA-HPV18 E7から
構成される陽性対照)又はBtpr_114(gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pe
p217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep2
17-CyaCopt)のいずれかを皮内ワクチン接種した。全ての群をポリIC-LCで免疫増強した。
ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、以前に同定されたMHCクラスI拘
束性ペプチドで再刺激した。結果を図10に示した。
図10から、以下のことが示された:
-10μgのProCervixによる免疫は、予想されたレベルのHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43
-49特異的IFN-γ応答を誘導した。
-三価候補ワクチンで得られる抗原特異的応答は、ProCervixで得られるものと同等であ
った。
-三価候補間で、特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった。
-HPV16抗原に対するより低い応答は、HPV16エピトープがHPV18エピトープ(該エピトー
プ対して、C56LB/6マウスは非常に感受性がある)よりも弱いという事実によるものである
。
-10μgのProCervixによる免疫は、予想されたレベルのHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43
-49特異的IFN-γ応答を誘導した。
-三価候補ワクチンで得られる抗原特異的応答は、ProCervixで得られるものと同等であ
った。
-三価候補間で、特異的T細胞応答の頻度に差は認められなかった。
-HPV16抗原に対するより低い応答は、HPV16エピトープがHPV18エピトープ(該エピトー
プ対して、C56LB/6マウスは非常に感受性がある)よりも弱いという事実によるものである
。
これらの観察から、ポリ-ICLC免疫増強gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216
-CyaCopt、gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptが、皮内免疫後
のマウスにおけるHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的IFN-γ応答の誘導において、
ポリ-ICLC免疫増強ProCervixと同程度に効率的であるという結論を下すことができた。
-CyaCopt、gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptが、皮内免疫後
のマウスにおけるHPV16 E749-57及びHPV18 E7AS43-49特異的IFN-γ応答の誘導において、
ポリ-ICLC免疫増強ProCervixと同程度に効率的であるという結論を下すことができた。
実験の時点では、マウスで、HPV45 E7についてのMHC-I拘束性ペプチドが同定されてい
なかったので、脾細胞を、3つのサブプール(#218-1、#218-2、及び#218-3)に分けられたH
PV45 E7-ペプチドライブラリーで再刺激した。この実験は、既知のエピトープに対応する
ペプチドではなく、ペプチドライブラリーで行われた、本発明者らに知られている初めて
の再刺激である。
なかったので、脾細胞を、3つのサブプール(#218-1、#218-2、及び#218-3)に分けられたH
PV45 E7-ペプチドライブラリーで再刺激した。この実験は、既知のエピトープに対応する
ペプチドではなく、ペプチドライブラリーで行われた、本発明者らに知られている初めて
の再刺激である。
図11により、#218-1及び#218-2サブプールではなく、#218-3ペプチドサブプールによる
インビトロ再刺激が、gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd
93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptワクチン接種によって誘発されたT
細胞を再刺激することができることが示された。この免疫応答に関与するペプチド配列は
、
である。
インビトロ再刺激が、gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt、gtCyaAd
93-PEP217-CyaCopt、及びgtCyaAd203-PEP217-CyaCoptワクチン接種によって誘発されたT
細胞を再刺激することができることが示された。この免疫応答に関与するペプチド配列は
、
注目すべきことに、よく似た応答が、HPV45 E7配列を保有しないProCervixをワクチン
接種した群で認められた。この結果は、#218-3プールに存在するエピトープとProCervix
ワクチンに含まれるHPV16 E7又はHPV18 E7配列との交差反応性によって説明することがで
きる。
接種した群で認められた。この結果は、#218-3プールに存在するエピトープとProCervix
ワクチンに含まれるHPV16 E7又はHPV18 E7配列との交差反応性によって説明することがで
きる。
総合すると、これらの結果は、複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗
原が、gtCyaAd93及びgtCyaAd203によって正確に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプ
ロセッシングされることを示している。これは、Previlleらの文献[5]、Karimovaらの文
献[7]、及びGmiraらの文献[8]で教示されている結果を考慮すると、予想外のことである
。
原が、gtCyaAd93及びgtCyaAd203によって正確に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプ
ロセッシングされることを示している。これは、Previlleらの文献[5]、Karimovaらの文
献[7]、及びGmiraらの文献[8]で教示されている結果を考慮すると、予想外のことである
。
さらに、CyaAの触媒ドメインで行われる欠失は、CyaA特異的T細胞応答及びCyaA特異的B
細胞応答のレベルを減少させることによって、送達される異種ポリペプチドに関する利点
を提供することができた(該欠失は、主に、CyaAのMHCクラスI及びクラスII拘束性エピト
ープの数の減少をもたらした)。
細胞応答のレベルを減少させることによって、送達される異種ポリペプチドに関する利点
を提供することができた(該欠失は、主に、CyaAのMHCクラスI及びクラスII拘束性エピト
ープの数の減少をもたらした)。
(E.2 Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及び
BTpr_175に存する新しいリードの免疫原性)
Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及びBTpr
_175に存する新しいリードの免疫原性をC57BL/6マウスでさらに調べた。
BTpr_175に存する新しいリードの免疫原性)
Btpr_163、BTpr_164、BTpr_165、BTpr_166、BTpr_167、BTpr_168、BTpr_173、及びBTpr
_175に存する新しいリードの免疫原性をC57BL/6マウスでさらに調べた。
マウスに、プラセボ又は各々のリードのいずれかを、それぞれ、皮内ワクチン接種した
。全ての群をポリ-ICLCで免疫増強した。
。全ての群をポリ-ICLCで免疫増強した。
ワクチン接種の7日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を、試験した各々のE7抗原のペプ
チドライブラリーで再刺激した。試験したリードは全て、免疫原性であった。
チドライブラリーで再刺激した。試験したリードは全て、免疫原性であった。
HPV31、45、及び58に対する免疫原性は、C57BL/6マウスで試験されなかったが、それは
、これらのツールが適合しなかった(このマウスの遺伝的背景が相応しくなかった)からで
あった。これらのE7タンパク質に対する免疫原性は、材料及び方法に記載されている他の
マウス系統で試験される。
表8: C57BL/6マウスにおける被験リードの免疫原性
、これらのツールが適合しなかった(このマウスの遺伝的背景が相応しくなかった)からで
あった。これらのE7タンパク質に対する免疫原性は、材料及び方法に記載されている他の
マウス系統で試験される。
これらの結果から、以下のことが示された:
-10μgの各々のリードによる免疫は、特異的IFN-γ応答を誘導した。
-gtCyaAd93及びgtCyaAd203は、抗原を抗原提示細胞に正確に送達した。
-HPV16、18、33、及び52 E7タンパク質に対する特異的免疫応答が測定された。
-10μgの各々のリードによる免疫は、特異的IFN-γ応答を誘導した。
-gtCyaAd93及びgtCyaAd203は、抗原を抗原提示細胞に正確に送達した。
-HPV16、18、33、及び52 E7タンパク質に対する特異的免疫応答が測定された。
これらの結果から、六価及び七価混合物に対する免疫応答のさらなる検討が可能になっ
た。
た。
(E.3:六価候補ワクチンの免疫原性)
2つの三価リードの六価混合物の免疫応答をC57BL/6マウスで評価した。これらのリード
は、それぞれ、HPV 16-18-45 E7タンパク質及びHPV 31-52-58 E7タンパク質を含むBTpr_1
14及びBTpr_165であった。先に記載されたものと同じプロトコルを使用した。実験の時点
では、HPV52 E7についてマウスで同定されたMHCI拘束性ペプチドが知られていないので、
脾細胞を、3つのサブプール(221-1、221-2、及び221-3)に分けられたHPV52 E7-ペプチド
ライブラリーで再刺激した。HPV16E7及びHPV18E7再刺激のために、3つサブプール(それぞ
れ、116-1、116-II、116-III、並びに171-I、171-II、及び171-3)に分けられたペプチド
ライブラリーも使用した。
2つの三価リードの六価混合物の免疫応答をC57BL/6マウスで評価した。これらのリード
は、それぞれ、HPV 16-18-45 E7タンパク質及びHPV 31-52-58 E7タンパク質を含むBTpr_1
14及びBTpr_165であった。先に記載されたものと同じプロトコルを使用した。実験の時点
では、HPV52 E7についてマウスで同定されたMHCI拘束性ペプチドが知られていないので、
脾細胞を、3つのサブプール(221-1、221-2、及び221-3)に分けられたHPV52 E7-ペプチド
ライブラリーで再刺激した。HPV16E7及びHPV18E7再刺激のために、3つサブプール(それぞ
れ、116-1、116-II、116-III、並びに171-I、171-II、及び171-3)に分けられたペプチド
ライブラリーも使用した。
これらの結果を図15に示す。
これらの結果から、以下のことが確認される:
-10μgの六価混合物による免疫は、IFN-γ ELISpotによって測定される、HPV16 E7、HP
V18 E7、及びHPV52 T細胞応答を誘導した。
-そのそれぞれの抗原を有する各々のgtCyaAd93は、それらを抗原提示細胞(APC)に送達
すること、及び測定可能なHPV型に対する抗原特異的T細胞応答を促進することができた。
-三価成分のみと六価候補ワクチンの間で、E7特異的T細胞応答の頻度に差は認められな
かった(データは示さない)。
-10μgの六価混合物による免疫は、IFN-γ ELISpotによって測定される、HPV16 E7、HP
V18 E7、及びHPV52 T細胞応答を誘導した。
-そのそれぞれの抗原を有する各々のgtCyaAd93は、それらを抗原提示細胞(APC)に送達
すること、及び測定可能なHPV型に対する抗原特異的T細胞応答を促進することができた。
-三価成分のみと六価候補ワクチンの間で、E7特異的T細胞応答の頻度に差は認められな
かった(データは示さない)。
これらの観察から、ポリ-ICLC免疫増強Btpr_114及びBtpr_165が、皮内免疫後に、C57BL
/6マウスで、HPV16 E7、HPV18E7、及びHPV52 E7特異的T細胞応答を誘導するのに効率的で
あるという結論を下すことができた。
/6マウスで、HPV16 E7、HPV18E7、及びHPV52 E7特異的T細胞応答を誘導するのに効率的で
あるという結論を下すことができた。
(E.4. 2つの七価候補ワクチンの免疫原性)
生産性及び純度の結果に基づいて、2つの七価組合せ: Btpr_165＋Btpr_163及びBtpr_16
6＋Btpr_164をC57BL/6マウスで試験した。マウスを、10μgの各々の七価候補ワクチンで
、それぞれ、皮内免疫した。
生産性及び純度の結果に基づいて、2つの七価組合せ: Btpr_165＋Btpr_163及びBtpr_16
6＋Btpr_164をC57BL/6マウスで試験した。マウスを、10μgの各々の七価候補ワクチンで
、それぞれ、皮内免疫した。
図16に示すように、これらの結果から、以下のことが示される:
-HPV16 E7について:#116-2j(c+d)ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方
の七価候補ワクチン又はHPV16E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発され
たT細胞を再刺激することができた。
-HPV18 E7について:#171-I及び#171-IIペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は
、両方の七価候補ワクチン及びHPV18E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘
発されるT細胞を再刺激することができた。
-HPV33 E7について:
・Btpr_166及びBtpr_164から構成された七価候補ワクチンについて、#220-2ペプチドサ
ブプールよるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激する
ことができた。
・Btpr_165及びBtpr_163から構成された七価候補ワクチンについて、#220-1、#220-2、
及び#220-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発さ
れたT細胞を再刺激することができた。
-HPV52 E7について: #221-2及び#221-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は
、両方の七価候補ワクチン又はHPV52 E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘
発されたT細胞を再刺激することができた。
-HPV16 E7について:#116-2j(c+d)ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、両方
の七価候補ワクチン又はHPV16E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘発され
たT細胞を再刺激することができた。
-HPV18 E7について:#171-I及び#171-IIペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は
、両方の七価候補ワクチン及びHPV18E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘
発されるT細胞を再刺激することができた。
-HPV33 E7について:
・Btpr_166及びBtpr_164から構成された七価候補ワクチンについて、#220-2ペプチドサ
ブプールよるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発されたT細胞を再刺激する
ことができた。
・Btpr_165及びBtpr_163から構成された七価候補ワクチンについて、#220-1、#220-2、
及び#220-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は、ワクチン接種によって誘発さ
れたT細胞を再刺激することができた。
-HPV52 E7について: #221-2及び#221-3ペプチドサブプールによるインビトロ再刺激は
、両方の七価候補ワクチン又はHPV52 E7を有するその成分のみのワクチン接種によって誘
発されたT細胞を再刺激することができた。
総合すると、生産及び免疫原性に関するこれらの結果から、以下のことが示される:
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する組換えgtCyaAd93を良好な生産性で生産及び精
製することができる;
-組換えgtCyaAd203タンパク質も生産及び精製することができるが、生産性は同じ抗原
を含むgtCyaAd93ベクターよりも劣る。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する2つの組換えgtCyaAd93は、その抗原をAPCに正
確に送達することができる。
-特異的な免疫応答が、各々の免疫原性HPV型に対してC57BL/6マウスで測定される。
-組換えgtCyaAd93を用いたE7タンパク質の設計は、例えば、HPV33 E7に関して示されて
いるような、E7抗原に対する免疫応答に影響を及ぼし得る。
-複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗原は、gtCyaAd93によって正確
に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプロセッシングされる。これは、Gmiraらの文献
(2001)及びFayolleらの文献(1998)の結果を考慮すると、予想外のことである。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する組換えgtCyaAd93を良好な生産性で生産及び精
製することができる;
-組換えgtCyaAd203タンパク質も生産及び精製することができるが、生産性は同じ抗原
を含むgtCyaAd93ベクターよりも劣る。
-3つ及び4つのHPV E7タンパク質を有する2つの組換えgtCyaAd93は、その抗原をAPCに正
確に送達することができる。
-特異的な免疫応答が、各々の免疫原性HPV型に対してC57BL/6マウスで測定される。
-組換えgtCyaAd93を用いたE7タンパク質の設計は、例えば、HPV33 E7に関して示されて
いるような、E7抗原に対する免疫応答に影響を及ぼし得る。
-複雑な構造(21個のシステイン)及び酸性電荷を有する抗原は、gtCyaAd93によって正確
に送達され、抗原提示細胞(APC)によってプロセッシングされる。これは、Gmiraらの文献
(2001)及びFayolleらの文献(1998)の結果を考慮すると、予想外のことである。
(F.候補の細胞傷害効率)
(F.1 三価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
細胞傷害性誘導における三価候補の効率を比較するために、アジュバントを用いて及び
アジュバントを用いずに、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を
収集し、それぞれ、HPV16、HPV18、及びHPV45 E7タンパク質由来のペプチドライブラリー
をローディングした。
(F.1 三価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
細胞傷害性誘導における三価候補の効率を比較するために、アジュバントを用いて及び
アジュバントを用いずに、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マウス由来の脾細胞を
収集し、それぞれ、HPV16、HPV18、及びHPV45 E7タンパク質由来のペプチドライブラリー
をローディングした。
4つの群のマウスに、それぞれ、ポリIC-LCの存在下又は非存在下で、プラセボ、gtCyaA
d93-pep216-CyaCopt、gtCyaAd93-pep217- CyaCopt、及びgtCyaAd203-pep217-CyaCoptをワ
クチン接種した。
d93-pep216-CyaCopt、gtCyaAd93-pep217- CyaCopt、及びgtCyaAd203-pep217-CyaCoptをワ
クチン接種した。
アジュバントの存在下では、候補間に差は認められなかった(データは示さない)。図12
の左のパネル(ライブラリー#171-1及び#171-2のローディング)において、殺傷のパーセン
テージは、欠失した抗原pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスと比較
して、全長抗原(pep217)を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスで優れている
。同様に、図12の右のパネル(ペプチドライブラリー#218-3のローディング)において、殺
傷のパーセンテージは、プラセボと比較したとき、pep217を含むキメラタンパク質をワク
チン接種したマウスで優れているが、pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種した
マウスでは、殺傷が認められない。ポリ-LCLCアジュバントを使用しない場合、全長抗原
を有するgtCyaAは、この酸ドメインが欠失している抗原と比較して、その標的細胞を殺傷
するのに効率的であった。全長抗原は、E7酸性ドメインを含み、文献の教示によれば、こ
の酸ドメインが欠失している抗原よりも効率が低いはずであるので、これは予想外のこと
である。
の左のパネル(ライブラリー#171-1及び#171-2のローディング)において、殺傷のパーセン
テージは、欠失した抗原pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスと比較
して、全長抗原(pep217)を含むキメラタンパク質をワクチン接種したマウスで優れている
。同様に、図12の右のパネル(ペプチドライブラリー#218-3のローディング)において、殺
傷のパーセンテージは、プラセボと比較したとき、pep217を含むキメラタンパク質をワク
チン接種したマウスで優れているが、pep216を含むキメラタンパク質をワクチン接種した
マウスでは、殺傷が認められない。ポリ-LCLCアジュバントを使用しない場合、全長抗原
を有するgtCyaAは、この酸ドメインが欠失している抗原と比較して、その標的細胞を殺傷
するのに効率的であった。全長抗原は、E7酸性ドメインを含み、文献の教示によれば、こ
の酸ドメインが欠失している抗原よりも効率が低いはずであるので、これは予想外のこと
である。
これらの結果から、以下のことが示される
-全長抗原は、CD8+ Tリンパ球による殺傷応答に有利に働くエピトープ(ヘルパーT細胞
エピトープ)を有する可能性が高い;及び
-gtCyaAベクターは、酸性領域を有する抗原の送達を可能にする。
-全長抗原は、CD8+ Tリンパ球による殺傷応答に有利に働くエピトープ(ヘルパーT細胞
エピトープ)を有する可能性が高い;及び
-gtCyaAベクターは、酸性領域を有する抗原の送達を可能にする。
(F.2 七価候補ワクチンのCD8媒介性細胞傷害効率)
E7特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導するその能力における七価候補ワクチンの効
率を比較するために、アジュバントを用いて、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マ
ウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16及びHPV18 E7タンパク質由来のペプチドラ
イブラリーをローディングした。
E7特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導するその能力における七価候補ワクチンの効
率を比較するために、アジュバントを用いて、インビボ殺傷アッセイを行った。未感作マ
ウス由来の脾細胞を収集し、それぞれ、HPV16及びHPV18 E7タンパク質由来のペプチドラ
イブラリーをローディングした。
3つの群のマウスに、それぞれ、ポリ-ICLCの存在下で、プラセボ、BTpr165＋BTpr163、
及びBTpr166＋BTpr164をワクチン接種した。
及びBTpr166＋BTpr164をワクチン接種した。
プラセボ群では、E7特異的殺傷が認められなかった。両方の七価候補ワクチンは、それ
ぞれ、HPV16 E7ペプチドライブラリー(図17-A)又はHPV18 E7ペプチドライブラリー(図17-
B)がロードされた細胞のE7特異的殺傷を誘導した。
ぞれ、HPV16 E7ペプチドライブラリー(図17-A)又はHPV18 E7ペプチドライブラリー(図17-
B)がロードされた細胞のE7特異的殺傷を誘導した。
これらの結果から、両方の七価候補が、機能的なHPV16及びHPV18 E7特異的CTLを誘導す
ることが示される。
ることが示される。
(G. TC-1腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍退縮アッセイ)
本発明者らは、TC-1腫瘍細胞モデルを用いて、4つの三価候補Btpr_114(gtCyaAd93-PEP2
16-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaC
opt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の治療効率をさらに検討した。
本発明者らは、TC-1腫瘍細胞モデルを用いて、4つの三価候補Btpr_114(gtCyaAd93-PEP2
16-CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaC
opt)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の治療効率をさらに検討した。
第0日目に、全てのマウスに(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1細胞を接種した。第1群は、
処置しないで放置した。第2群は、PBS及びポリ-ICLCで処置し、第3群は、ポリ-ICLCを免
疫増強したProCervixで処置し、第4群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtCyaAd93-pep216で
処置し、第5群は、ポリIC-LCを免疫増強したgtCyaAd203-pep216で処置し、第6群は、ポリ
IC-LCを免疫増強したgtCyaAd93-pep217で処置し、第7群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtC
yaAd203-pep217で処置した。各群は、10匹のマウスから構成された。
処置しないで放置した。第2群は、PBS及びポリ-ICLCで処置し、第3群は、ポリ-ICLCを免
疫増強したProCervixで処置し、第4群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtCyaAd93-pep216で
処置し、第5群は、ポリIC-LCを免疫増強したgtCyaAd203-pep216で処置し、第6群は、ポリ
IC-LCを免疫増強したgtCyaAd93-pep217で処置し、第7群は、ポリ-ICLCを免疫増強したgtC
yaAd203-pep217で処置した。各群は、10匹のマウスから構成された。
図13は、全てのマウスが腫瘍を発生させたことを示している。しかしながら、HPV16 E7
抗原が組み込まれたCyaA候補ワクチンをワクチン接種し、ポリ-ICLCを免疫増強したマウ
スは、第65日目に強い腫瘍除去率を示し: ProCervix＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウス
のうちの9匹は、腫瘍を除去し(第3群); gtCyaAd93-pep216＋ポリ-ICLCで処置した10匹の
マウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第4群); gtCyaAd203-pep216＋ポリ-ICLCで処置し
た10匹のマウスのうちの8匹は、腫瘍を退縮させ(第5群); gtCyaAd93-pep217＋ポリ-ICLC
で処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第6群); gtCyaAd203-pep217＋
ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させた(第7群)。未処置の1
0匹のマウスのうちの0匹及びプラセボ＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの1匹が
、それぞれ、腫瘍を退縮させた(第1群及び第2群)。したがって、HPV16 E7抗原を含む候補
ワクチンをワクチン接種したマウスのみが、腫瘍を顕著に退縮させることができた。この
4つのワクチン候補間で、腫瘍を退縮させるその能力に差は認められなかった。
抗原が組み込まれたCyaA候補ワクチンをワクチン接種し、ポリ-ICLCを免疫増強したマウ
スは、第65日目に強い腫瘍除去率を示し: ProCervix＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウス
のうちの9匹は、腫瘍を除去し(第3群); gtCyaAd93-pep216＋ポリ-ICLCで処置した10匹の
マウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第4群); gtCyaAd203-pep216＋ポリ-ICLCで処置し
た10匹のマウスのうちの8匹は、腫瘍を退縮させ(第5群); gtCyaAd93-pep217＋ポリ-ICLC
で処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させ(第6群); gtCyaAd203-pep217＋
ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの9匹は、腫瘍を退縮させた(第7群)。未処置の1
0匹のマウスのうちの0匹及びプラセボ＋ポリ-ICLCで処置した10匹のマウスのうちの1匹が
、それぞれ、腫瘍を退縮させた(第1群及び第2群)。したがって、HPV16 E7抗原を含む候補
ワクチンをワクチン接種したマウスのみが、腫瘍を顕著に退縮させることができた。この
4つのワクチン候補間で、腫瘍を退縮させるその能力に差は認められなかった。
これらの結果から、本発明のキメラタンパク質、例えば、Btpr_114(gtCyaAd93-PEP216-
CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt
)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の投与が、腫瘍形成性障害を引き起こす腫
瘍を効率的に退縮させることができることが示される。
CyaCopt)、BTpr_115(gtCyaAd93-pep217-CyaCopt)、BTpr_116(gtCyaAd203-pep216-CyaCopt
)、及びBTpr_117(gtCyaAd203-pep217-CyaCopt)の投与が、腫瘍形成性障害を引き起こす腫
瘍を効率的に退縮させることができることが示される。
(H.三価候補の治療的及び予防的効果)
異なる抗原を発現する第一の腫瘍の根絶の後に、ワクチン接種マウスが、腫瘍の発生及
び成長から防御されることができるかどうかをさらに評価した。HPV18 E7抗原を発現する
LL2腫瘍細胞及び対照細胞株LL2-GFPを、(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1移植腫瘍を事前に
完全に退縮させた、生き残ったワクチン接種マウスの脇腹に接種した。
異なる抗原を発現する第一の腫瘍の根絶の後に、ワクチン接種マウスが、腫瘍の発生及
び成長から防御されることができるかどうかをさらに評価した。HPV18 E7抗原を発現する
LL2腫瘍細胞及び対照細胞株LL2-GFPを、(HPV16 E7抗原を発現する)TC-1移植腫瘍を事前に
完全に退縮させた、生き残ったワクチン接種マウスの脇腹に接種した。
生き残ったマウスの各々の群を、LL2-HPV18 E7細胞又はLL2-GFP細胞のどちらかが接種
される2つのサブ群に分けた。結果を図14に示す。
される2つのサブ群に分けた。結果を図14に示す。
HPV18 E7抗原が組み込まれたgtCyaA候補ワクチンをワクチン接種し、ポリ-ICLCを免疫
増強したマウスは、LL2-HPV18 E7細胞株の成長に対して強い防御作用を示した(第3b群、
第4b群、第5b群、第6b群、及び第7b群では、マウスは腫瘍を発生させなかった)が、LL2-G
FP細胞株の成長に対しては、それを示さなかった(第3a群、第4a群、第5a群、第6a群、及
び第7a群では、全てのマウスが腫瘍を発生させた)。
増強したマウスは、LL2-HPV18 E7細胞株の成長に対して強い防御作用を示した(第3b群、
第4b群、第5b群、第6b群、及び第7b群では、マウスは腫瘍を発生させなかった)が、LL2-G
FP細胞株の成長に対しては、それを示さなかった(第3a群、第4a群、第5a群、第6a群、及
び第7a群では、全てのマウスが腫瘍を発生させた)。
総合すると、これらの結果から、三価候補をワクチン接種し、TC-1腫瘍を排除したマウ
スは、LL2-HPV18E7腫瘍からも防御されたことが強調されており、HPV16 E7抗原に対する
治癒的な抗原特異的T細胞応答を発生させた該ワクチン接種マウスは、HPV18 E7抗原に対
する防御的な抗原特異的T細胞応答も発生させたことを示している。
スは、LL2-HPV18E7腫瘍からも防御されたことが強調されており、HPV16 E7抗原に対する
治癒的な抗原特異的T細胞応答を発生させた該ワクチン接種マウスは、HPV18 E7抗原に対
する防御的な抗原特異的T細胞応答も発生させたことを示している。
(参考文献)
(参考文献)
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位
置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の
最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体に融合したもの
:を含む又はこれからなるCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（構成２）
前記CyaA由来タンパク質が:
1)配列番号10に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
2)配列番号12に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
3)配列番号19に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
4)配列番号20に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体
からなる群から選択される、構成1記載のポリヌクレオチド。
（構成３）
前記変異体CyaA由来タンパク質が、
1)その配列が配列番号13に示されている通りであるポリペプチド;
2)その配列が配列番号14に示されている通りであるポリペプチド;
3)その配列が配列番号15に示されている通りであるポリペプチド;
4)その配列が配列番号16に示されている通りであるポリペプチド;
5)その配列が配列番号17に示されている通りであるポリペプチド;もしくは
6)その配列が配列番号18に示されている通りであるポリペプチド
:を含む又はこれらのポリペプチドからなる、構成1又は2記載のポリヌクレオチド。
（構成４）
キメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドであって、5'から3'に、(a)そ
の配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～227に位置する残基
で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なく
とも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～387に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなる、前記キメラポリヌクレ
オチド。
（構成５）
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される、構成4記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成６）
前記変異体CyaA由来タンパク質が標的細胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラ
ーゼドメインを標的細胞の細胞質に移行させることができる、構成1～3のいずれか１記載
のポリヌクレオチド又は構成4又は5記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成７）
構成1～3又は6のいずれか１記載のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド
の、該CyaA由来タンパク質及び異種ポリペプチドを含む又はこれらからなるキメラタンパ
ク質の産生への使用であって、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、構
成1記載のCyaAの前記断片1)と2)の間にクローニングされる、前記使用。
（構成８）
その3'末端に、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドをさらに含む、構成4～7のいずれか１記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成９）
構成1～3のいずれか１記載のポリヌクレオチド又は構成4～8のいずれか１記載のキメラ
ポリヌクレオチド、及び発現制御配列を含み、任意に、ボルデテラ株のcyaCコード配列を
さらに含む、ベクター、好ましくは、プラスミド。
（構成１０）
構成1～3のいずれか１記載のポリヌクレオチドもしくは構成4～8のいずれか１記載のキ
メラポリヌクレオチドを含むか、又は構成9記載のベクターを含む細胞培養物、好ましく
は、大腸菌株培養物。
（構成１１）
構成1～8のいずれか１記載のポリヌクレオチドによってコードされるか、構成9記載の
ベクターから発現されるか、又は構成10記載の細胞培養物によって産生される、CyaA由来
タンパク質。
（構成１２）
構成4～8のいずれか１記載のキメラポリヌクレオチドによってコードされるか、構成9
記載のベクターから発現されるか、又は構成10記載の細胞培養物によって産生される、キ
メラタンパク質。
（構成１３）
N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の
位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク
質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプ
チド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配
列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又
はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる、キメ
ラタンパク質。
（構成１４）
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片を含む
又はこれらからなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片を含む又はこれ
らからなるタンパク質;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質
:からなる群から選択される、構成13記載のキメラタンパク質。
（構成１５）
前記異種ポリペプチドが、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つの
CD8 + エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4 + エピトープを担持する、構成13又は14記載
のキメラタンパク質。
（構成１６）
前記異種ポリペプチドが、1つ又はいくつかのウイルス性又は細胞性又は細菌性又は真
菌性又は寄生虫性抗原又はエピトープを含む、構成13～15のいずれか１記載のキメラタン
パク質。
（構成１７）
前記異種ポリペプチドが、9～500又は20～500又は50～500又は100～500アミノ酸残基の
サイズを有する、構成12～14のいずれか１記載のキメラタンパク質。
（構成１８）
前記異種ポリペプチドが、負の静電電荷を有するか、又はそのサイズの10～40％が負の
静電電荷を有する断片を有する、構成13～17のいずれか１記載のキメラポリペプチド。
（構成１９）
前記異種ポリペプチドが、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、又は配
列番号74の配列を有する、構成1～17のいずれか１記載のキメラタンパク質。
（構成２０）
構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質及び好適な医薬ビヒクル、及び任意に
、少なくとも1つのアジュバントを含む組成物。
（構成２１）
特に、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するための薬剤として使
用するための、構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質又は構成20記載の組成物
。
（構成２２）
病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、構成13～19の
いずれか１記載のキメラタンパク質又は構成20記載の組成物。
（構成２３）
(i)前記ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発す
ることによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治
療において、及び(ii)該ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記
憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態
に対する予防において使用するための、構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質
又は構成20記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は組成物の該宿主
への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該投与されるベクター保有ポリ
ペプチドに含まれないとき、第二の確定される病理学的状態に対する該予防が観察されな
い、前記キメラタンパク質又は組成物。
（構成２４）
キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド
から、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に
位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、
又は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠
失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び該欠失したヌクレオチド断片の部位で、異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;並びに
(d)該発現キメラタンパク質を回収すること
を含む、前記方法。
（構成２５）
キメラポリヌクレオチドコンストラクト中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及
びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程を含み、特に、該キ
メラポリヌクレオチドコンストラクトは、該組み合わせの後、該得られるキメラポリヌク
レオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、それに
続いて、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドコンストラクトを含む又は含有するように、該工程(b)で得られるポリヌクレオチド
及び該CyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記工程a)が、配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌ
クレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド
断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、
又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配
列番号2、4、6、もしくは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を欠失させるこ
とにあるか、或いは前記a)が、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示される
ポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド68
2～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69
のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは
7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号
1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオチド断片
を欠失させることにある、構成24又は25記載の方法。
（構成１）
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位
置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の
最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体に融合したもの
:を含む又はこれからなるCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（構成２）
前記CyaA由来タンパク質が:
1)配列番号10に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
2)配列番号12に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
3)配列番号19に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
4)配列番号20に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体
からなる群から選択される、構成1記載のポリヌクレオチド。
（構成３）
前記変異体CyaA由来タンパク質が、
1)その配列が配列番号13に示されている通りであるポリペプチド;
2)その配列が配列番号14に示されている通りであるポリペプチド;
3)その配列が配列番号15に示されている通りであるポリペプチド;
4)その配列が配列番号16に示されている通りであるポリペプチド;
5)その配列が配列番号17に示されている通りであるポリペプチド;もしくは
6)その配列が配列番号18に示されている通りであるポリペプチド
:を含む又はこれらのポリペプチドからなる、構成1又は2記載のポリヌクレオチド。
（構成４）
キメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドであって、5'から3'に、(a)そ
の配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～227に位置する残基
で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なく
とも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～387に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなる、前記キメラポリヌクレ
オチド。
（構成５）
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される、構成4記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成６）
前記変異体CyaA由来タンパク質が標的細胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラ
ーゼドメインを標的細胞の細胞質に移行させることができる、構成1～3のいずれか１記載
のポリヌクレオチド又は構成4又は5記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成７）
構成1～3又は6のいずれか１記載のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド
の、該CyaA由来タンパク質及び異種ポリペプチドを含む又はこれらからなるキメラタンパ
ク質の産生への使用であって、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、構
成1記載のCyaAの前記断片1)と2)の間にクローニングされる、前記使用。
（構成８）
その3'末端に、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドをさらに含む、構成4～7のいずれか１記載のキメラポリヌクレオチド。
（構成９）
構成1～3のいずれか１記載のポリヌクレオチド又は構成4～8のいずれか１記載のキメラ
ポリヌクレオチド、及び発現制御配列を含み、任意に、ボルデテラ株のcyaCコード配列を
さらに含む、ベクター、好ましくは、プラスミド。
（構成１０）
構成1～3のいずれか１記載のポリヌクレオチドもしくは構成4～8のいずれか１記載のキ
メラポリヌクレオチドを含むか、又は構成9記載のベクターを含む細胞培養物、好ましく
は、大腸菌株培養物。
（構成１１）
構成1～8のいずれか１記載のポリヌクレオチドによってコードされるか、構成9記載の
ベクターから発現されるか、又は構成10記載の細胞培養物によって産生される、CyaA由来
タンパク質。
（構成１２）
構成4～8のいずれか１記載のキメラポリヌクレオチドによってコードされるか、構成9
記載のベクターから発現されるか、又は構成10記載の細胞培養物によって産生される、キ
メラタンパク質。
（構成１３）
N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の
位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク
質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプ
チド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配
列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又
はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる、キメ
ラタンパク質。
（構成１４）
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片を含む
又はこれらからなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片を含む又はこれ
らからなるタンパク質;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質
:からなる群から選択される、構成13記載のキメラタンパク質。
（構成１５）
前記異種ポリペプチドが、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つの
CD8 + エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4 + エピトープを担持する、構成13又は14記載
のキメラタンパク質。
（構成１６）
前記異種ポリペプチドが、1つ又はいくつかのウイルス性又は細胞性又は細菌性又は真
菌性又は寄生虫性抗原又はエピトープを含む、構成13～15のいずれか１記載のキメラタン
パク質。
（構成１７）
前記異種ポリペプチドが、9～500又は20～500又は50～500又は100～500アミノ酸残基の
サイズを有する、構成12～14のいずれか１記載のキメラタンパク質。
（構成１８）
前記異種ポリペプチドが、負の静電電荷を有するか、又はそのサイズの10～40％が負の
静電電荷を有する断片を有する、構成13～17のいずれか１記載のキメラポリペプチド。
（構成１９）
前記異種ポリペプチドが、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、又は配
列番号74の配列を有する、構成1～17のいずれか１記載のキメラタンパク質。
（構成２０）
構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質及び好適な医薬ビヒクル、及び任意に
、少なくとも1つのアジュバントを含む組成物。
（構成２１）
特に、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するための薬剤として使
用するための、構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質又は構成20記載の組成物
。
（構成２２）
病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、構成13～19の
いずれか１記載のキメラタンパク質又は構成20記載の組成物。
（構成２３）
(i)前記ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発す
ることによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治
療において、及び(ii)該ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記
憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態
に対する予防において使用するための、構成13～19のいずれか１記載のキメラタンパク質
又は構成20記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は組成物の該宿主
への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該投与されるベクター保有ポリ
ペプチドに含まれないとき、第二の確定される病理学的状態に対する該予防が観察されな
い、前記キメラタンパク質又は組成物。
（構成２４）
キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド
から、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に
位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、
又は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠
失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び該欠失したヌクレオチド断片の部位で、異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;並びに
(d)該発現キメラタンパク質を回収すること
を含む、前記方法。
（構成２５）
キメラポリヌクレオチドコンストラクト中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及
びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程を含み、特に、該キ
メラポリヌクレオチドコンストラクトは、該組み合わせの後、該得られるキメラポリヌク
レオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、それに
続いて、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドコンストラクトを含む又は含有するように、該工程(b)で得られるポリヌクレオチド
及び該CyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記工程a)が、配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌ
クレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド
断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、
又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配
列番号2、4、6、もしくは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を欠失させるこ
とにあるか、或いは前記a)が、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示される
ポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド68
2～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69
のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは
7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号
1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオチド断片
を欠失させることにある、構成24又は25記載の方法。
Claims (26)
1)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～位置227に位
置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の
最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体に融合したもの
:を含む又はこれからなるCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体が、
2)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配列番号2の
最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、もしくは該
断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体に融合したもの
:を含む又はこれからなるCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
前記CyaA由来タンパク質が:
1)配列番号10に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
2)配列番号12に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
3)配列番号19に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
4)配列番号20に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体
からなる群から選択される、請求項1記載のポリヌクレオチド。
1)配列番号10に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
2)配列番号12に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
3)配列番号19に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体;
4)配列番号20に示される配列を含むもしくは該配列からなるポリペプチド、又はこのポ
リペプチドとの少なくとも95％の類似性を有する変異体
からなる群から選択される、請求項1記載のポリヌクレオチド。
前記変異体CyaA由来タンパク質が、
1)その配列が配列番号13に示されている通りであるポリペプチド;
2)その配列が配列番号14に示されている通りであるポリペプチド;
3)その配列が配列番号15に示されている通りであるポリペプチド;
4)その配列が配列番号16に示されている通りであるポリペプチド;
5)その配列が配列番号17に示されている通りであるポリペプチド;もしくは
6)その配列が配列番号18に示されている通りであるポリペプチド
:を含む又はこれらのポリペプチドからなる、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
1)その配列が配列番号13に示されている通りであるポリペプチド;
2)その配列が配列番号14に示されている通りであるポリペプチド;
3)その配列が配列番号15に示されている通りであるポリペプチド;
4)その配列が配列番号16に示されている通りであるポリペプチド;
5)その配列が配列番号17に示されている通りであるポリペプチド;もしくは
6)その配列が配列番号18に示されている通りであるポリペプチド
:を含む又はこれらのポリペプチドからなる、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。
キメラタンパク質をコードするキメラポリヌクレオチドであって、5'から3'に、(a)そ
の配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～227に位置する残基
で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なく
とも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～387に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなる、前記キメラポリヌクレ
オチド。
の配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の位置183～227に位置する残基
で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又は該断片との少なく
とも95％の類似性を有する変異体をコードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～387に位置す
る残基から始まり、配列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaA
タンパク質の断片、又は該断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなる、前記キメラポリヌクレ
オチド。
1)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される、請求項4記載のキメラポリヌクレオチド。
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
2)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
3)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
4)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
5)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基387～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
6)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～227からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基387～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
7)5'から3'に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～183からなるポリペプチド断片を
コードするポリヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及
び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなるポリペプチド断片をコードする
ポリヌクレオチドを含む又はこれらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;並び
に
8)5'から3'に、(a)配列番号8の残基1～183からなるポリペプチド断片をコードするポリ
ヌクレオチド、(b)異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(c)配列番号8
の残基321～1705からなるポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む又はこ
れらのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド;
からなる群から選択される、請求項4記載のキメラポリヌクレオチド。
前記変異体CyaA由来タンパク質が標的細胞に結合し、及び/又はそのアデニル酸シクラ
ーゼドメインを標的細胞の細胞質に移行させることができる、請求項1～3のいずれか一項
記載のポリヌクレオチド又は請求項4又は5記載のキメラポリヌクレオチド。
ーゼドメインを標的細胞の細胞質に移行させることができる、請求項1～3のいずれか一項
記載のポリヌクレオチド又は請求項4又は5記載のキメラポリヌクレオチド。
請求項1～3又は6のいずれか一項記載のCyaA由来タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドの、該CyaA由来タンパク質及び異種ポリペプチドを含む又はこれらからなるキメラタ
ンパク質の産生への使用であって、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
、請求項1記載のCyaAの前記断片1)と2)の間にクローニングされる、前記使用。
チドの、該CyaA由来タンパク質及び異種ポリペプチドを含む又はこれらからなるキメラタ
ンパク質の産生への使用であって、該異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
、請求項1記載のCyaAの前記断片1)と2)の間にクローニングされる、前記使用。
その3'末端に、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドをさらに含む、請求項4～7のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチド。
ヌクレオチドをさらに含む、請求項4～7のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチド。
請求項1～3のいずれか一項記載のポリヌクレオチド又は請求項4～8のいずれか一項記載
のキメラポリヌクレオチド、及び発現制御配列を含み、任意に、ボルデテラ株のcyaCコー
ド配列をさらに含む、ベクター、好ましくは、プラスミド。
のキメラポリヌクレオチド、及び発現制御配列を含み、任意に、ボルデテラ株のcyaCコー
ド配列をさらに含む、ベクター、好ましくは、プラスミド。
請求項1～3のいずれか一項記載のポリヌクレオチドもしくは請求項4～8のいずれか一項
記載のキメラポリヌクレオチドを含むか、又は請求項9記載のベクターを含む細胞培養物
、好ましくは、大腸菌株培養物。
記載のキメラポリヌクレオチドを含むか、又は請求項9記載のベクターを含む細胞培養物
、好ましくは、大腸菌株培養物。
請求項1～8のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによってコードされるか、請求項9
記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生される、
CyaA由来タンパク質。
記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生される、
CyaA由来タンパク質。
請求項4～8のいずれか一項記載のキメラポリヌクレオチドによってコードされるか、請
求項9記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生さ
れる、キメラタンパク質。
求項9記載のベクターから発現されるか、又は請求項10記載の細胞培養物によって産生さ
れる、キメラタンパク質。
N末端からC末端に、(a)その配列が、配列番号2の最初の残基から始まり、配列番号2の
位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク
質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプ
チド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配
列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又
はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる、キメ
ラタンパク質。
位置183～位置227に位置する残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク
質の断片、又はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体、(b)異種ポリペプ
チド、及び(c)その配列が、配列番号2の位置321～位置387に位置する残基から始まり、配
列番号2の最後の残基で終わる、配列番号2に示される百日咳菌CyaAタンパク質の断片、又
はこの断片との少なくとも95％の類似性を有する変異体を含む又はこれらからなる、キメ
ラタンパク質。
1)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、もしくは6の残基1～227からなる断片、(b)異
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片を含む
又はこれらからなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片を含む又はこれ
らからなるタンパク質;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質
:からなる群から選択される、請求項13記載のキメラタンパク質。
種ポリペプチド、及び(c)配列番号2、4、もしくは6の残基321～1706からなる断片を含む
又はこれらからなるタンパク質;
2)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～227からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基321～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質;
3)N末端からC末端に、(a)配列番号2、4、又は6の残基1～183からなる断片、(b)異種ポ
リペプチド、及び(c)配列番号2、4、又は6の残基387～1706からなる断片を含む又はこれ
らからなるタンパク質;並びに
4)N末端からC末端に、(a)配列番号8の残基1～183からなる断片、(b)異種ポリペプチド
、及び(c)配列番号8の残基387～1705からなる断片を含む又はこれらからなるタンパク質
:からなる群から選択される、請求項13記載のキメラタンパク質。
前記異種ポリペプチドが、少なくとも1つのエピトープ、好ましくは、少なくとも1つの
CD8+エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+エピトープを担持する、請求項13又は14記
載のキメラタンパク質。
CD8+エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+エピトープを担持する、請求項13又は14記
載のキメラタンパク質。
前記異種ポリペプチドが、1つ又はいくつかのウイルス性又は細胞性又は細菌性又は真
菌性又は寄生虫性抗原又はエピトープを含む、請求項13～15のいずれか一項記載のキメラ
タンパク質。
菌性又は寄生虫性抗原又はエピトープを含む、請求項13～15のいずれか一項記載のキメラ
タンパク質。
前記異種ポリペプチドが、9～500又は20～500又は50～500又は100～500アミノ酸残基の
サイズを有する、請求項12～14のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
サイズを有する、請求項12～14のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
前記異種ポリペプチドが、負の静電電荷を有するか、又はそのサイズの10～40％が負の
静電電荷を有する断片を有する、請求項13～17のいずれか一項記載のキメラポリペプチド
。
静電電荷を有する断片を有する、請求項13～17のいずれか一項記載のキメラポリペプチド
。
前記異種ポリペプチドが、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、又は配
列番号74の配列を有する、請求項1～17のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
列番号74の配列を有する、請求項1～17のいずれか一項記載のキメラタンパク質。
請求項13～19のいずれか一項記載のキメラタンパク質及び好適な医薬ビヒクル、及び任
意に、少なくとも1つのアジュバントを含む組成物。
意に、少なくとも1つのアジュバントを含む組成物。
特に、予防的免疫応答又は治療的免疫応答の誘導において使用するための薬剤として使
用するための、請求項13～19のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の
組成物。
用するための、請求項13～19のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の
組成物。
病原体感染又は腫瘍形成性障害の予防又は治療において使用するための、請求項13～19
のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の組成物。
のいずれか一項記載のキメラタンパク質又は請求項20記載の組成物。
(i)前記ポリペプチドに含まれる第一の群のエピトープに対するT細胞免疫応答を誘発す
ることによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治
療において、及び(ii)該ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記
憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態
に対する予防において使用するための、請求項13～19のいずれか一項記載のキメラタンパ
ク質又は請求項20記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は組成物の
該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該投与されるベクター保
有ポリペプチドに含まれないとき、第二の確定される病理学的状態に対する該予防が観察
されない、前記キメラタンパク質又は組成物。
ることによる、哺乳動物宿主で診断される第一の確定される病理学的状態の免疫療法的治
療において、及び(ii)該ポリペプチドに含まれる第二の群のエピトープに対するT細胞記
憶免疫応答を誘発することによる、同じ哺乳動物宿主中の第二の確定される病理学的状態
に対する予防において使用するための、請求項13～19のいずれか一項記載のキメラタンパ
ク質又は請求項20記載の組成物であって、該免疫応答が該キメラタンパク質又は組成物の
該宿主への投与後に得られ、ここで、該第二の群のエピトープが該投与されるベクター保
有ポリペプチドに含まれないとき、第二の確定される病理学的状態に対する該予防が観察
されない、前記キメラタンパク質又は組成物。
キメラタンパク質を産生する方法であって:
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド
から、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に
位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、
又は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠
失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び該欠失したヌクレオチド断片の部位で、異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;並びに
(d)該発現キメラタンパク質を回収すること
を含む、前記方法。
(a)配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌクレオチド
から、その最初の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、又は8の残基184～残基228に
位置するアミノ酸残基をコードし、その最後の3つのヌクレオチドが、配列番号2、4、6、
又は8の残基320～残基386に位置するアミノ酸残基をコードする、ヌクレオチド断片を欠
失させること;
(b)(a)で得られるポリヌクレオチドに、及び該欠失したヌクレオチド断片の部位で、異
種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入すること;
(ここで、工程(a)及び(b)は、任意の順序で又は同時に実施され得る);
(c)細胞内で、(b)で得られるポリヌクレオチドを発現させること;並びに
(d)該発現キメラタンパク質を回収すること
を含む、前記方法。
キメラポリヌクレオチドコンストラクト中で、工程(b)で得られるポリヌクレオチド及
びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程を含み、特に、該キ
メラポリヌクレオチドコンストラクトは、該組み合わせの後、該得られるキメラポリヌク
レオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、それに
続いて、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドコンストラクトを含む又は含有するように、該工程(b)で得られるポリヌクレオチド
及び該CyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項24記載の方法。
びCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み合わせる工程を含み、特に、該キ
メラポリヌクレオチドコンストラクトは、該組み合わせの後、該得られるキメラポリヌク
レオチドが、5'末端から3'末端に、工程(b)のポリヌクレオチドコンストラクト、それに
続いて、ボルデテラ株の、特に、百日咳菌株のCyaCタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドコンストラクトを含む又は含有するように、該工程(b)で得られるポリヌクレオチド
及び該CyaCタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項24記載の方法。
前記工程a)が、配列番号2、4、6、又は8に示されるボルデテラCyaAをコードするポリヌ
クレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド
断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、
又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配
列番号2、4、6、もしくは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を欠失させるこ
とにあるか、或いは前記a)が、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示される
ポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド68
2～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69
のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは
7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号
1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオチド断片
を欠失させることにある、請求項24又は25記載の方法。
クレオチドから、配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～320をコードするヌクレオチド
断片、又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基184～386をコードするヌクレオチド断片、
又は配列番号2、4、6、もしくは8の残基228～386をコードするヌクレオチド断片、又は配
列番号2、4、6、もしくは8の残基184～320をコードするヌクレオチド断片を欠失させるこ
とにあるか、或いは前記a)が、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69に示される
ポリヌクレオチドから、配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド68
2～960からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは7、又は配列番号69
のヌクレオチド550～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号1、3、5、もしくは
7、又は配列番号69のヌクレオチド682～1158からなるヌクレオチド断片、或いは配列番号
1、3、5、もしくは7、又は配列番号69のヌクレオチド550～960からなるヌクレオチド断片
を欠失させることにある、請求項24又は25記載の方法。
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