ES2780525T3 - Proteínas quiméricas basadas en cyaa que comprenden un polipéptido heterólogo y sus usos en la inducción de respuestas inmunes - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido quimérico que codifica una proteína derivada de CyaA en donde dicha proteína derivada de CyaA comprende o consiste en: 1) Un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, compenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO:2 y terminando con un resto localizado de la posición 183 a la posición 227 de la SEQ ID NO:2, fusionado a 2) Un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa fusionada a 3) Un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado de la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO:2.
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas quiméricas basadas en cyaa que comprenden un polipéptido heterólogo y sus usos en la inducción de respuestas inmunes
Campo de la invención
La invención se refiere a una proteína quimérica que comprende o que consiste en, de N-terminal hacia C- terminal, (a) un fragmento de la parte N-terminal de una proteína CyaA de Borderella, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado de la posición 183 a la posición 227 de la s Eq ID NO:2, (b) un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un fragmento de la parte C-terminal de una proteína CyaA de Bordetella, tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado de la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando en el último resto de la SEQ ID NO: 2. La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica una versión delecionada de una CyaA, así como a un polinucleótido que codifica para una versión de una CyaA de Bordetella que tiene deleción, así como a un polinucleótido que codifica para esta proteína quimérica. También son parte de la invención una composición que comprende al menos una proteína o proteínas quiméricas de la invención y los usos profilácticos y/o terapéuticos de dicha composición. Antecedentes de la invención
La Adenilato Ciclasa (CyaA) de los tipos de Bordetella en particular de Bordetella pertussis, ha sido descrita exhaustivamente como un vector recombinante capaz de suministrar en forma eficiente polipéptidos, tal como antigenos, en el citosol de células presentadoras de antigeno (APC) [1], [2], [3]. Más, las CyaAs recombinantes se han utilizado para tratar en forma eficaz ratones que portan tumores [4], [5], [6].
Varios autores han resaltado que la eficiencia del suministro de polipéptido, en particular suministro de antígeno, mediante CyaA (utilizada como un vector) puede ser afectada positiva o negativamente por la carga electrostática del polipéptido insertado (antigeno) y su conformación. En 1998, Karimova & al. [7] describieron que el suministro de epítopos de polipéptido de célula T CD8+, insertados en CyaA, hacia y dentro de células presentadoras de antígeno es dependiente de la carga electrostática de los epítopos insertados: una CyaA recombinante que aloja al epítopo OVA fue capaz de translocarse en la APC y de inducir una respuesta CTL in vivo, mientras que la misma construcción con 4 restos glutámicos fusionados al epítopo OVA, ya no puede traslocarse, y no induce una respuesta de linfocito de célula T citotóxica (CTL) detectable in vivo. En 2012, Holubova et al. describieron diversas construcciones basadas en CyaA: ya sea proteínas CyaA con deleción dentro de sus N-terminales que comprenden el epítopo OVA SIINFEKL, o proteínas CyaA truncadas respecto a sus dominios N-terminales y que comprenden varios epítopos insertados en sitios diferentes [25]. Holubova et al. concluyen que sus experimentos proveen una prueba de concepto para la construcción de suministro de antígeno basada en CyaA que tiene el dominio AC completo remplazado por poliepítopo de CTL artificial grande. En 2001, Gmira et al. [8] desarrollaron un nuevo vector CyaA para facilitar la construcción de CyaAs recombinantes con polipéptidos o antígenos exógenos insertados dentro de sus dominios catalíticos. Estas modificaciones son:
- la inserción de una secuencia de sitio de clonación múltiple con nuevos sitios de restricción únicos corriente abajo desde el codón 224;
- la deleción de los codones 225 a 234; y
- el cambio de los codones 236, 238 y 239; estas modificaciones se introdujeron para incrementar la carga electrostática local (menos ácido), lo cual previamente se demostró que es crítico para la translocación de esta proteína hibrida CyaA-antígeno a través de la membrana celular de a Pc in situ.
La CyaA modificada tiene actividad invasiva similar que la CyaA de tipo silvestre.
Los autores analizaron 5 antígenos, cuyo tamaño varía de 87 a 206 restos, con una carga electrostática de -4 a 14, y mostraron que aquellos que tienen un valor ácido perdieron su eficiencia de translocación, lo que confirma los resultados previos de Karimova et al. Asimismo, éstos analizaron CyaAs con antígenos con puentes de disulfuro internos o estructuras complejas: ninguno fue capaz de translocación en las células elegidas como blanco, lo que soporta la hipótesis de que los polipéptidos insertados en el dominio catalítico de CyaA se deben desdoblar para que sean translocalizados.
Tabla 1: extraida de [7] y [8]. Las inserciones con carga ácida no se translocan en el citosol de las APC. La carga ácida se calcula del número de restos de Lys y Arg menos el número de restos de Asp y Glu.
Referencias rCyaA Nombre delTamaño delCarga electros
antígeno / origen antígeno (aa) tática Actividad (+ o -)
(continuación)
Referencias rCyaA Nombre delTamaño del Carga electros
antígeno / origen antígeno (aa) tática Actividad (+ o -) , CyaA Ninguno NA NA CyaA-Neuro Neurocalcina 8
bovino de192 -6
Restrictocina de
Gmira et al. , CyaA-Rest Aspergillus 148 5
2001 Restrictus
CyaA-DHFR D
re
i
d
h
u
id
c
r
t
o
a
f
s
o
a
la
d to 187 7
e ratón
CyaA-T at Tat-VIH 87 14 CyaA-Nef Nef-VIH 206 -4 -CyaA-Ova21 Epítopo clase I de Q
8 0
Karimova et al. Ova
1998 , CyaA- Epítopo clase I de
Ova 4 ácidos 12 -4
Ova21-4E glutámicos
Los antígenos utilizados en el caso de pruebas de regresión de tumor tienen ya sea un tamaño corto (OVA es de 8 restos de longitud) [4] o sus estructuras secundarias están alteradas por reacomodos internos de segmentos de antígeno y con un tamaño máximo de 103 restos [5].
A partir de estos estudios, se sacaron las siguientes conclusiones para mejorar la eficiencia de vectorización utilizando el vector CyaA:
- Se debe evitar la inclusión de regiones ácidas en un polipéptido que se va a insertar en CyaA; y
- Se debe evitar la inclusión de estructuras secundarias y terciarias en estos insertos porque dichas estructuras interfieren con la interiorización apropiada del dominio enzimático de la adenilato ciclasa (AC) en el cual se ha insertado el polipéptido.
En vista de estas conclusiones, se construyeron dos CyaAs recombinantes, una que contiene el antígeno E7 de HPV16 y la otra al antígeno E7 de HPV18. Además, también se construye una CyaA recombinante bivalente en la cual los antígenos E7 de HPV16 y HPV18 se han insertado juntos (patente EP1576967; Préville et al.). Sin embargo, no se reporta ninguna prueba con una CyaA recombinante en la cual se hayan insertado más de 2 proteínas E7 de HPV en el mismo vector CyaA.
Por lo tanto, Préville et al., describen tres vectores CyaA recombinantes en los cuales se ha insertado el polipéptido E7 del tipo de HPV16 o variantes del mismo.
- el vector CyaA-E7fuN, que contiene la longitud completa de la proteína E7,
- el vector CyaA-E7A30-42 , que contiene fragmentos de E7 eliminados del dominio ácido desde los aa 30 a 42 - el vector CyaA-E749-57 , que contiene un epítopo de célula T restringido en H-2D de mundo presente en E7. Estos vectores CyaA recombinantes se utilizan para inmunizar ratones y para detectar respuestas de CTL específicas de E7. Para medir la respuesta inmune después de la inmunización de los ratones, se efectuan pruebas de liberación de cromo de CTL. En experimentos en animales in vivo, CyaA-E7A30-42 y CyaA-E7full~ dieron las respuestas inmunes de CTL más eficientes en comparación con CyaA-E749-57.
También se evalua la capacidad de estos vectores CyaA recombinantes para inducir regresión de tumor. Si la tasa de regresión de tumor conferida por CyaA-E749-57 y CyaA- E7fuN no puede ser diferenciada en forma notable, CyaA-E7a30-42 es claramente superior en términos de regresión de tumor e inhibición de crecimiento. Por lo tanto, el epítopo de CTL individual que demostró previamente ser reconocido en ratones C57BL/6 ha probado ser eficiente, pero no da la respuesta inmune más óptima.
Después se evalúa la persistencia de la respuesta inmune. Se analizan esplenocitos provenientes de algunos ratones sobrevivientes después de 3 meses respecto a su capacidad para lisar células TC-1 que expresan el antígeno E7 y los otros animales sobrevivientes se vuelven a desafiar con células TC-1 en el día 100 después de la vacunación. Los animales vacunados con CyaA-E7AA30-42 despliegan un nivel alto de protección. Menos del 40% de los animales vacunados con CyaA-E749-57 fueron protegidos mientras que 90% a 100% de los animales vacunados con CyaA-E7AA30-42 y CyaA-E7full~ sobrevivieron.
De este trabajo se pueden extraer las siguientes enseñanzas:
- los vectores CyaA que portan las proteínas E7 de HPV16 y/o HPV18 llevan a una respuesta inmune en ratones
C57BL/6;
- se obtiene una respuesta completa con un antígeno que tiene sus epítopos tanto de célula T CDE8+ como de célula T CD4+ en comparación con el epítopo E749-57 el cual tiene solamente un epítopo de célula T CD8+; - se obtiene una eficiencia superior en ratones tratados con el vector CyaA-E7A30-42 en la cual la proteína E7 tiene su región ácida eliminada desde los restos 30 a 42, en comparación con ratones tratados con CyaA-E7full~ o CyaA-E749-57;
- la respuesta inmune obtenida con estos vectores es capaz de inducir regresión de lesiones de tumor,
- se obtiene una respuesta perdurable, debido a que se rechaza un nuevo desafío con células TC-1, en ratones libres de tumor tratados; y
- es posible la co-inyección de dos CyaAs recombinantes con el fin de desarrollar una terapia bivalente, manteniendo cada antígeno la respuesta contra sus epítopos respectivamente.
Holubova J. et al (Infection and Immunity vol. 80. n.° 3., marzo de 2012) describe construcciones de CyaA recombinantes para la administración de polipéptidos heterólogos grandes a través de la membrana citoplasmática de la APC. Los fragmentos de CyaA utilizados para este propósito pueden estar desprovistos del dominio de adenil ciclasa.
Karst J. et al (Journal of Biological Chemistry, vol 287, n.° 12, 2012) desvela que la eliminación del dominio catalítico de CyaA (restos de aminoácidos 1-384) no elimina la capacidad de la proteína para translocarse a través de la membrana celular de las células diana. Fayolle C. et al (Vaccine, vol 28, n.° 42. 2010) describe la inserción de proteína (s) TAT en diferentes sitios de la proteína CyaA en donde la eliminación de los restos de aminoácidos 1-485 de CyaA en la construcción recombinante elimina la presentación eficaz del antígeno.
Fayolle C. et al (Vaccine, vol 75, n.° 16. 2001) desvela la inserción o epítopos en la proteína cyaA y su administración por CyaA de Borderella pertussis destoxificada recombinante que permite la activación de una respuesta inmune protectora específica de CTL.
El documento EP 1188446 desvela el uso de CyaA en la fabricación de un vector de proteína para dirigir células que expresan CD11b.
Por lo tanto, en la técnica antecedente, tramos de aminoácido ácidos incrustados en ciertos polipéptidos o antígenos y polipéptidos o antígenos cargados negativamente en su totalidad han demostrado alterar la eficiencia de un vector CyaA para translocar estos polipéptidos, a través de la membrana celular de la APC en los animales vacunados. Esto lleva a respuestas inmunes celulares débiles o no protectoras contra dichos antígenos.
Los inventores consideran que esto podría ser considerado como un obstáculo para el diseño de candidatos de fármaco, debido a que dichas secuencias de aminoácido ácidas pueden contener epítopos CD4+ y/o epítopos CD8+ importantes, requeridos para inmunidad celular protectora.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de vectores mejorados que porten construcciones inmunogénicas que puedan ser utilizadas para inducir respuestas inmunes protectoras celulares fuertes y perdurables, en particular en regresión de tumores y en prevención de tumor, contra polipéptidos y antígenos que abarcan tramos de aminoácido ácidos y contra polipéptidos o antígenos cargados negativamente en su totalidad.
Breve descripción de las figuras
Figuras 1A-1B: (Figura 1A) Mapa esquemático de pKTRACE5-HPV16E7A30-42 en el cual se indican los sitios de restricción y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV16E7A30-42 ; (Figura 1B) Mapa esquemático de pKTRACE5- HPV18E7fi32-42 en el cual se indican los sitios de restricción y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV18E7fi32-42 .
Figura 2: La proteína gtCyaA y los mutantes de gtCyaA diseñados. Desde los aminoácidos (restos) 1 a 400, el dominio catalítico (AC); desde los aminoácidos 401 a 1706, el dominio hemolítico. Dentro del dominio catalítico, tres recuadros claros representan las tres regiones descritas como esenciales para la actividad de CyaA ([15], [16], [1]): el dominio I (aa 54-77) implicado en la interacción con ATP, el dominio II (aa 184-198) implicado en la interacción con Mg2+-ATP y el dominio III (aa 287-318) implicado en la interacción con la Calmodulina (CaM). gtCyaAd93 corresponde a la secuencia gtCyaA con 93 aa (228320) eliminados. gtCyaAd203 corresponde a la secuencia gtCyaA con 203 aa (184-386) eliminados.
Figuras 3A-3B: (Figura 3A) Mapa esquemático del vector pGTPc608 que comprende al polinucleótido gtCyaAd93- pep216 y al gen optimizado cyaC bajo el promotor inducible IPTG; (Figura 3B) mapa esquemático del vector pGTPc608 que comprende el polinucleótido gtCyaAd203-pep216 y al gen cyaC optimizado bajo el promotor inducible IPTG.
Figura 4: Mapa gráfico del plásmido CyaAd203- pep105. Pep105 se clona entre los sitios de restricción EcoRI y Xmal.
Figura 5: Frecuencias de E749-57 de HPV16, E7as43-49 de HPV18 y OVA257-264 y de linfocitos T CD8+ específicos y frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (n.°116-2/3) y E7 de HPV18 (n.°171-1/2/3), medidas siete días después de la inmunización con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105. Se muestra el número de eventos por millón de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), péptidos restringidos de clase I del MHC de E749-57 de HPV16, E7AS43-49 de HPV18, OVA257-264, bancos de péptidos n.°116-2/3 y bancos de péptidos n.°171-1/2/3, durante 20 horas a
37°C, 5% de CO2.
Figura 6: Frecuencias de linfocitos T específicos de GP33-4Í de LCMV, OVA323-339, MOG35-55 y MAGEA3 medidas siete días después de la inmunización con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105; Se muestra el número de eventos por millón de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), péptidos GP33-41 de LCMV, OVA323-339, MOG35-55, proteína Histag MAGE-A3, o se vuelven a estimular en presencia de la línea B16-GFP de células de tumor B16 y después B16-MAGEA3-GFP utilizada como APC, todas las reestimulaciones durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2.
Figuras 7A-7B: (Figura 7A) Alineación de las secuencias de proteína E7 de HPV16, 18 y 45; recuadro negro: el motivo de unión de pRB; recuadros grises: las cisteínas implicadas en el asa de dedo de zinc; la flecha negra resalta la región ácida; (Figura 7B) Alineación de las secuencias de proteína HPV31, 33, 52 y 58; recuadro negro: motivo LXCXE; recuadros verdes: cisteínas implicadas en el asa de dedo de zinc; recuadro de línea discontinua: para la secuencia de E7 de HPV52, posición del epítopo auto-inmune.
Figuras 8A-8B: (Figura 8A) Antígenos de vacunas candidatas trivalentes; (Figura 8B) secuencias de antígenos re-entremezcladas de vacunas candidatas tetravalentes (N- ter: parte N-terminal de la proteína E7; C-ter: parte C- terminal de la proteína E7).
Figura 9: perfil de expresión de proteína después de 3 horas de inducción con IPTG (I0: antes de la inducción; I3: después de la inducción)
Figura 10: Frecuencias de linfocitos T CD8+ específicos de E749-57 de HPV16 y E7a s 43-4 9 de HPV18 medidas siete días después de la inmunización; los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos restringidos con clase I del MHC. Los resultados se expresan como número de células que secretan IFN-y por millón de esplenocitos totales.
Figura 11: Frecuencias de linfocitos T secretores de IFN-y de E7 de HPV45 medidas siete días después de la inmunización, los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren la secuencia de péptido completa de E7 de HPV45 (subcombinado 1: n.°218-1, sub-combinado 2: n.°218-2, sub combinado 3: n.°218-3). Los resultados se expresan como número de células que secretan IFN-y por millón de esplenocitos totales.
Figuras 12A-12B: Prueba de aniquilación in vivo con candidatos trivalentes (Btpr_114, Btpr115 y BTpr_117); Figura 12A: porcentaje de aniquilación in vivo de esplenocitos cargados con las genotecas n.°171-1 y n.°171-2 del péptido E7 de HPV18; Figura 12B: porcentaje de aniquilación in vivo de esplenocitos cargados con la genoteca n.°218-3 del péptido E7 de HPV45.
Figuras 13A-13B: La vacunación terapéutica utilizando vacunas candidatas de CyaA con coadyuvante poli- ICLC incrustando el antígeno de E7 de HPV16 lleva a eliminación de tumor sólido inducido por TC-1; (Figura 13A) esquema de vacunación: todos los ratones se inoculan en el flanco derecho en el día 0 con células de tumor TC-1; éstos se tratan en el día 11. (Figuras 13B(a-g)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el día 60.
Figuras 14: protección profiláctica de ratones que eliminaron la línea de célula de tumor TC-1 contra el crecimiento de la línea celular LL2-HPV18 E7 o de la línea celular LL2-GFP (Figura 14A) Esquema de vacunación: en el día 65, los ratones que han eliminado los tumores TC-1 se dividen en dos sub-grupos y se inoculan ya sea con la línea celular LL2-HPV18 E7 o con la línea celular LL2-GFP de control. (Figuras 14B(a-j)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el día 110.
Figuras 15A-15C: Frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (Figura 15A), E7 de HPV18 (Figura 15B) y E7 de HPV52 (Figura 15C) medidas siete días después de la inmunización - Los esplenocitos totales se volvieron a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren las secuencias de la proteína E7 de HPV16 (Figura 15A), HPV18 (Figura 15B) y HPV52 (Figura 15C) . Los sub-combinados de péptidos se indican en los cuadrados. Los resultados se expresan como número de células formadoras de mancha (sfc por sus siglas en inglés) de IFN-y por millón de esplenocitos totales. Las sfc de E7 de HPV18 son muy numerosas para contar (TNTC por sus siglas en inglés).
Figuras 16A-16D: Frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (Figura 16A), E7 de HPV18 (Figura 16B), E7 de HPV33 (Figura 16C) y E7 de HPV52 (Figura 16D) secretores de IFN-y medidas siete días después de la inmunización. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren secuencias de péptido completo de E7 de HPV16 (Figura 16A), HpV18 (Figura 16B), HPV33 (Figura 16c) y HPV52 (Figura 16D) (cada banco de péptido se subdivide en sub-combinados desde el N-terminal hacia el C-terminal de la proteína E7 (como se indica en las leyendas de los histogramas). Los resultados se expresan como números de células formadoras de manchas de IFN-y por millón de esplenocitos totales.
Figuras 17A-17B: Aniquilación específica de E7 de células cargadas respectivamente con genoteca de péptido E7 de HPV16 (Figura 17A) o genoteca de péptido E7 de HPV18 (Figura 17B) inducida por vacunas candidatas heptavalentes.
Descripción detallada de la invención
Los inventores de la presente invención han desarrollado vectores CyaA nuevos los cuales tienen deleción en el dominio de adenilato ciclasa (AC) de la CyaA de tipo silvestre, y en los cuales se han insertado antígenos de tamaño grande (ilustrado con secuencias que tienen hasta 441 restos de aminoácido pero sin limitarse a lo mismo) y/o presentan cargas electrostáticas altamente negativas también designadas como cargas ácidas (hasta - 46). Se analizó la capacidad de estas construcciones para inducir respuestas de célula T CD8+ y CD4+ y citotoxicidad así como su capacidad para inducir rechazos de tumor. De manera sorpresiva, estos nuevos vectores CyaA han demostrado permitir el suministro de antígenos con carga electrostática negativa alta a las células diana. Asimismo,
cuando se insertan en estos nuevos vectores, los antígenos con sus dominios ácidos son más eficientes, en pruebas citotóxicas efectuadas bajo condiciones astringentes, en comparación con los mismos antígenos privados de estos dominios ácidos.
La divulgación describe un polinucleótido quimérico que codifica para una proteína derivada de CyaA, en la cual dicha proteína derivada de CyaA comprende o consiste en:
1) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 182 y 228), fusionado a
2) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 320 y 388) y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácido de la proteína CyaA de tipo silvestre de Bordetella pertussis. Una realización particular de un polinucleótido, que codifica para la CyaA como se indica en la SEQ ID NO: 2, es como se indica en la SEQ ID NO: 1. Otra realización particular de un polinucleótido, que codifica para la CyaA como se indica en la SEQ ID NO: 2, es una versión modificada de la secuenciala SEQ ID NO: 1, mediante mutaciones de nucleótido silenciosas, es decir, mediante modificaciones que no dan como resultado un cambio al aminoácido de la SEQ ID NO: 2. Una versión modificada particular de la SEQ ID NO: 1 es una secuencia, optimizada para expresión en E. coli, como se indica en la SEQ ID NO: 69. Dentro de la presente invención, un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA de la invención no codifica o no comprende un polinucleótido que codifique parala SEQ ID NO: 2. Asimismo, un polinucleótido que codifica para proteína derivada de CyaA de la invención no comprende o no consiste en la SEQ ID NO: 1.
La proteína resultante derivada de CyaA usada para el fin de la invención que se puede obtener a partir de dicho polinucleótido comprende o consiste en dos fragmentos, fusionados entre sí o recombinados, de la misma proteína CyaA de Bordetella. Mediante "fragmentos", se quiere decir un tramo o una concatenación de restos de aminoácido consecutivos encontrados en la secuencia de la proteína CyaA de Bordetella de tipo silvestre.
El primer fragmento (la porción N-terminal del polipéptido derivado de CyaA) comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y termina con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2.
Este primer fragmento tiene un tamaño que varía de 183 a 227 restos, es decir, es de al menos 183 restos y es de cuando mucho 227 restos de longitud. En una realización particular, este fragmento es de al menos 183, al menos 190, al menos 200, al menos 210 o al menos 220. En una realización particular, el tamaño de este primer fragmento es de 183 restos o es de 227 restos.
Por lo tanto, este fragmento comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y termina con un resto que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 y 227 de la SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este primer fragmento comprende o consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1193, 1-194, 1-195, 1-196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206, 1-207, 1-208, 1209, 1-210, 1 211, 1-212, 1-213, 1-214, 1-215, 1-216, 1217, 1-218, 1-219, 1-220, 1-221, 1-222, 1-223, 1-224, 1225, 1-226, y 1-227 de la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, este primer fragmento comprende o consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 o de los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, el polinucleótido que codifica para dicho primer fragmento comienza con el primer nucleótido de la SEQ ID NO: 1 y termina con un nucleótido localizado desde la posición 549 hasta la posición 681 de la SEQ ID NO: 1, con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. Por lo tanto, el polinucleótido que codifica para este fragmento comprende o consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 1-549, 1-552, 1-555, 1558, 1-561, 1-564, 1-567, 1-570, 1-573, 1-576, 1 579, 1582, 1-585, 1-588, 1-591, 1-594, 1-597, 1-600, 1-603, 1606, 1-609, 1-612, 1-615, 1-618, 1-621, 1-624, 1-627, 1630, 1-633, 1-636, 1-639, 1-642, 1-645, 1-648, 1-651, 1654, 1-657, 1-660, 1-663, 1-666, 1-669, 1-672, 1-675, 1 678 y 1-681 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69.
El segundo fragmento (la porción C-terminal del polipéptido derivado de CyaA) comienza con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ iD NO: 2 y termina con el último resto de la SEQ ID NO: 2. Este segundo fragmento tiene un tamaño que varía de 1320 a 1386 restos, es decir, es de al menos 1320 restos y
es de cuando mucho 1386 restos de longitud. En una realización particular, este fragmento es al menos 1320, al menos 1330, al menos 1340, al menos 1350, al menos 1360, al menos 1370 o al menos 1380. En una realización particular, el tamaño de este segundo fragmento es de 1320 restos o es de 1386 restos.
Por lo tanto, este segundo fragmento comienza con un resto que se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 y 387 de la SEQ ID NO: 2 y termina con el último resto (es decir resto 1706) de la SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este segundo fragmento consiste en una secuencia que se selecciona a partir del grupo que comprende o consiste en los restos 321-1706, 322-1706, 323-1706, 324-1706, 325-1706, 326-1706, 327-1706, 328 1706, 329-1706, 330-1706, 331-1706, 332-1706, 333-1706, 334-1706, 335-1706, 336-1706, 337-1706, 338-1706, 339-1706, 340-1706, 341-1706, 342-1706, 343-1706, 344-1706, 345-1706, 346-1706, 347-1706, 348-1706, 349 1706, 350-1706, 351-1706, 352-1706, 353-1706, 354-1706, 355-1706, 356-1706, 357-1706, 358-1706, 359-1706, 360-1706, 361-1706, 362-1706, 363-1706, 364-1706, 365-1706, 366-1706, 367-1706, 368-1706, 369-1706, 370 1706, 371-1706, 372-1706, 373-1706, 374-1706, 375-1706, 376-1706, 377-1706, 378-1706, 379-1706, 380-1706, 381-1706, 382-1706, 383-1706, 384-1706, 385-1706, 386-1706, y 3871706 de la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, este segundo fragmento comprende o consiste en los restos 321-1706 de la SEQ ID NO: 2 o en los restos 387-1706 de la SEQ ID NO: 2.
También se desvela un polinucleótido que codifica para dicho segundo fragmento comienza con un nucleótido localizado desde la posición 961 hasta la posición 1159 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69 y termina con el último nucleótido (es decir, el nucleótido 5118) de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69, con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. Un polinucleótido que codifica para este segundo fragmento comprende o consiste en una secuencia que se selecciona a partir de grupo que consiste en los restos 961-5118, 964-5118, 967-5118, 970-5118, 973-5118, 976-5118, 979-5118, 982-5118, 985-5118, 988-5118, 991 5118, 994-5118, 997-5118, 1000-5118, 1003-5118, 10065118, 1009-5118, 1012-5118, 1015-5118, 1018-5118, 10215118, 1024-5118, 1027-5118, 1030-5118, 1033-5118, 10365118, 1039-5118, 1042-5118, 1045-5118, 1048 5118, 10515118, 1054-5118, 1057-5118, 1060-5118, 1063-5118, 10665118, 1069-5118, 1072-5118, 1075-5118, 1078-5118, 10815118, 1084-5118, 1087-5118, 1090-5118, 1093-5118, 10965118, 1099-5118, 1102-5118, 1105 5118, 1108-5118, 11115118, 1114-5118, 1117-5118, 1120-5118, 1123-5118, 11265118, 1129-5118, 1132-5118, 1135-5118, 1138-5118, 11415118, 1144-5118, 1147-5118, 1150-5118, 1153-5118, 1156-5118 y 1159-5118 de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 69.
La divulgación describe la proteína derivada de CyaA que comprende o consiste en un polipéptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 10; la SEQ ID NO: 10 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto de la divulgación, la proteína derivada de CyaA comprende o consiste en un polipéptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 12; la SEQ ID NO: 12 que consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
También se desvela otro aspecto de la descripción:
- la proteína derivada de CyaA comprende o consiste en un polipéptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 19, es decir, una secuencia que consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, y
- la proteína derivada de CyaA comprende o consiste en un polipéptido de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 20, es decir, una secuencia que consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
La expresión "fusionado(a) a" cuando se hace referencia a una proteína o un polipéptido significa que cada parte del péptido (por ejemplo varios fragmentos de CyaA, y opcionalmente un polipéptido heterólogo) están ligados covalentemente entre sí mediante un enlace peptídico. El orden de estas diferentes partes de péptido se describe en la presente solicitud de N-terminal hacia C- terminal, es decir, el último resto C-terminal de una parte está ligado al primer resto N-terminal de la otra parte mediante un enlace peptídico. La expresión "fusionado(a) a" cuando se hace referencia a un polinucleótido, significa que dos o más partes del polinucleótido (por ejemplo, varios fragmentos de CyaA de nucleótido, y un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo) están ligados covalentemente entre sí mediante un enlace tipo fosfodiéster. El orden de estas diferentes partes de nucleótido se describe en la presente invención como de 5' hacia 3', es decir, el último nucleótido 3' de una parte está ligado al primer nucleótido 5' de la otra parte mediante un enlace tipo fosfodiéster. El polinucleótido que consiste en una fusión de secuencias de nucleótido se obtiene en particular como un polinucleótido recombinante, incluyendo mediante deleción de fragmentos de secuencia en la secuencia codificadora nativa de CyaA.
La descripción también describe un polinucleótido que codifica una proteína variante derivada de CyaA, en donde dicho primer fragmento es una variante con al menos un 95 % de similitud con un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto ubicado desde la posición 183 a la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, y/o en el que dicho segundo fragmento es una variante con al menos un 95 % de similitud con un fragmento comenzando con un resto ubicado desde la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2.
Por "una variante con al menos un 95 % de similitud" cuando se hace referencia a una proteína o un polipéptido, se entiende una secuencia de proteínas cuya identidad de aminoácidos es al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % con el polipéptido del que varía.El porcentaje de similitud se calcula, comparando la secuencia de longitud completa de dicha variante y dicho polipéptido del que varía, en particular en la más corta de las dos secuencias. Por lo tanto, una variante tiene un 95 % de similitud con un polipéptido, cuando el 5 % de sus restos difieren de los restos de este polipéptido, por una o más adiciones y/o una o más deleciones y/o una o más sustituciones. En una realización particular, dicha variante difiere de dicho polipéptido solo por sustituciones, preferentemente conservativas y, por consiguiente, mantienen la misma longitud que la secuencia de la que varía. En otra realización, dicha variante difiere de dicho polipéptido en al menos 1 única deleción de aminoácido, preferentemente por 1, 2, 3, 4 o 5 deleciones de un solo aminoácido, y por sustituciones, preferentemente sustituciones conservativas.
La divulgación también describe variantes de polinucleótidos que tienen una similitud de al menos el 75 % con los polinucleótidos que codifican porciones (o fragmentos) de la SEQ ID NO: 1. En particular, el polinucleótido que codifica dicho primer fragmento tiene una similitud del 75 % con un polinucleótido que comienza con el primer nucleótido de la SEQ ID NO: 1 y termina con un nucleótido ubicado desde la posición 549 a la posición 681 de la SEQ ID NO: 1 siempre que la longitud de dicho fragmento de nucleótido es un múltiplo de 3. Independientemente o en combinación con la declaración anterior, el polinucleótido que codifica dicho segundo fragmento tiene una similitud del 75 % con un polinucleótido que comienza con un nucleótido ubicado desde la posición 961 a la posición 1159 de la SEQ ID NO: 1 y termina con el último nucleótido (es decir, el nucleótido 5118) de la SEQ ID NO: 1, siempre que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. Se desvela que los polinucleótidos que codifican dichos primer y segundo fragmentos se originan a partir de un polinucleótido, cuya secuencia de longitud completa tiene al menos un 75 % de similitud con la SEQ ID NO: 1. Un ejemplo de dicha variante es la SEQ ID NO: 69. Por ejemplo, la variante polinucleotídica resulta de la degeneración del código genético aplicado al polinucleótido obtenido de la SEQ ID NO: 1 como se describe anteriormente o al polinucleótido de la SEQ ID NO: 69. Se desvela que la variante de polinucleótido así obtenida tiene una base degenerada en la posición de oscilación.
Por "una variante con al menos un 75 % de similitud" cuando se hace referencia a un polinucleótido, se entiende una secuencia de nucleótidos cuya identidad de nucleótidos es al menos el 75 %, al menos el 79 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, en al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % con el polinucleótido del cual varía. El porcentaje de similitud se calcula comparando la secuencia de longitud completa tanto de dicha variante como del polinucleótido del cual varía, en particular sobre la más corta de las dos secuencias. Por lo tanto, una variante tiene un 75 % de similitud con un polinucleótido, cuando el 25 % de sus nucleótidos difieren de los nucleótidos de dicho polinucleótido, en una o más adición(es) de nucleótidos y/o una o más deleción(es) de nucleótidos y/o una o más sustituciones de nucleótidos. En una realización particular, dicha variante difiere solo por las sustituciones de nucleótidos, y en consecuencia mantiene la misma longitud como la secuencia de la que varía. En una realización particular, dicha variante difiere solo por mutaciones silenciosas de nucleótidos, y en consecuencia sigue codificando la misma proteína que la que codifica por la secuencia de la que varía. Según la descripción, dicha variante difiere solo por las sustituciones de nucleótidos, una parte de las cuales son mutaciones silenciosas, de modo que la secuencia de la proteína codificada por dicha variante polinucleotídica tiene al menos un 95 % de similitud con una proteína o polipéptido de la invención, o tiene el 100 % de identidad.
Los porcentajes de similitud de nucleótidos y proteínas como se indica en el presente documento pueden calcularse mediante programas bien conocidos basados en el algoritmo Needleman y Wunsch, como MeAlign [18].
En un aspecto particular de la divulgación, la variante de la proteína derivada de CyaA tal como se define en el presente documento mantiene su capacidad para unirse a células diana y/o para translocar su dominio de adenilato ciclasa (AC) en el citosol de las células diana. En una realización particular, las células diana son células que expresan CD11b, es decir células que expresan al receptor CD11b/CD18 sobre sus superficies (CD11b+) . En particular, estas células son granulocitos/neutrófilos, macrófagos, células NK, subconjuntos de T CD8+, subconjuntos de células B, células dendríticas tales como las células de Langerhans o células dendríticas mieloides.
La capacidad de las variantes desveladas para unirse a las células diana se puede analizar en especial de conformidad con los métodos descritos en el documento EP03291486 o en la solicitud WO02/22169. Asimismo, se puede analizar la capacidad de la variante para translocar su dominio N-terminal en el citosol de las células diana aplicando el método descrito en la solicitud WO02/22169, o el método detallado en el ejemplo A con el péptido p105.
Las variantes de la secuencia de tipo silvestre de longitud completa de la proteína de CyaA de Bordetella pertussis son conocidas; la ilustración de dichas variantes se provee mediante referencia a sus secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 4 (proteína CyaA de Bordetella hinzii),la SEQ ID NO: 6 (proteína CyaA de Bórdetela parapertussis) y la SEQ ID NO: 8 (proteína CyaA de Bordetella bronchiseptica). La secuencia de nucleótido, que codifica parala SEQ ID NOs: 4, 6 y 8, es como se indica en la SEQ ID NOs: 3, 5 y 7 respectivamente o es una variante de la SEQ ID Nos: 3, 5 y 7 mediante mutaciones silenciosas. Dentro de la presente invención, la proteína derivada de CyaA no comprende o no consiste en la SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y 8. Asimismo, un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA variante de la invención no comprende o no consiste en la SEQ ID NOs: 3, 5 o 7.
En un aspecto particular de la divulgación, un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA variante, preferentemente como variante de una proteína derivada de CyaA de B. pertussis como se define en el presente documento, es un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende o que consiste en:
(a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con el primer resto de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8 y termina con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8 fusionado a
(b) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella como se indica respectivamente en la SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 4, 6, u 8 y termina con el último resto de la SEQ ID NO: 4, 6 u 8.
Las definiciones dadas anteriormente para la proteína derivada de CyaA particular que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 2 se aplican de forma idéntica a la variante de proteína derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID No : 4 y 6.
Con respecto a la variante de proteína derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todas las definiciones se aplican en forma idéntica, excepto que el último resto de la SEQ ID NO: 8 es el resto 1705 en lugar del resto 1706. Por lo tanto, para la proteína derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todos los aspectos que se refieren al resto 1706 deben ser reemplazados por el resto 1705. En particular, el segundo fragmento tiene un tamaño que varía de 1319 a 1385 restos, y preferentemente es de 1319 restos o 1385 restos de longitud. Con respecto a un polinucleótido que codifica para la variante de proteína derivada de CyaA que comprende los fragmentos de la SEQ ID NO: 8, todas las definiciones y realizaciones que se refieren al nucleótido 5118 deben ser remplazados por el nucleótido 5115.
Los polinucleótidos que codifican para las variantes de proteínas derivadas de CyaA se seleccionan de entre un polinucleótido que comprende o que consiste en:
1) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en la SEQ ID NO: 13;la SEQ ID NO: 13 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 4;
2) un polinucleótido que codifica para el polipéptido en la SEQ ID NO: 14;la SEQ ID NO: 14 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 4;
3) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en la SEQ ID NO: 15;la SEQ ID NO: 15 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 6;
4) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en la SEQ ID NO: 16;la SEQ ID NO: 16 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 6;
5) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en la SEQ ID NO: 17;la SEQ ID NO: 17 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; y
6) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en la SEQ ID NO: 18;la SEQ ID NO: 18 consiste en un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
El polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA o la variante de proteína derivada de CyaA para su uso de acuerdo con la invención también se puede definir como una versión, que tiene deleción, de la secuencia de nucleótido que codifica para CyaA de Bordetella de longitud completa, es decir, un polinucleótido que codifica para un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 2 hasta el grado en que éste tenga deleción para un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido cuyo primer resto de aminoácido está localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, y cuyo último resto de aminoácido está localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2. En una realización particular, dicho polinucleótido codifica para un polipéptido que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2, el cual tiene deleción para un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido cuyo primer resto de aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, y 228 de la
SEQ ID NO: 2, respectivamente, y cuyo último resto de aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste en los restos 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385 o 386 de la SEQ ID NO: 2.
También es parte de la invención un método para producir un polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA que se describe en la presente solicitud. Este método comprende los pasos de (a) eliminar, de un polinucleótido que codifica para CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido de restos de nucleótido consecutivos en dichas secuencias, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, y cuyos últimos tres nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8; y (b) recuperar dicho polinucleótido.
De manera alternativa, el polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA se sintetiza químicamente, utilizando métodos convencionales, de conformidad con la secuencia de proteína derivada de CyaA que se busca, y tomando en consideración opcionalmente la degeneración del código genético y/o la optimización de la expresión. La divulgación también describe las proteínas derivadas de CyaA codificadas por los polinucleótidos de la invención, descritos en la presente solicitud. La divulgación describe las proteínas derivadas de CyaA particulares que consisten en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.
Dentro del marco de la invención, se utiliza un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA, incluyendo una proteína derivada de CyaA variante, para producir un polinucleótido quimérico de la invención que codifica para una proteína quimérica que comprende o que consiste en dicha proteína derivada de CyaA o proteína derivada de CyaA variante, y un polipéptido heterólogo, en el cual el polinucleótido codifica para dicho polipéptido heterólogo sustituye el fragmento de nucleótido de CyaA eliminado.
Por consiguiente, la invención se refiere a un polinucleótido quimérico, es decir, un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica como se define en la presente solicitud, en la cual se aplican todas y cada una de las realizaciones descritas en la presente solicitud con relación al polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para producir un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica, que comprende:
(a) eliminar, de un polinucleótido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, cuyos últimos 3 nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8;
(b) insertar, en el polinucleótido obtenido en (a) y en el sitio de fragmento de nucleótido eliminado, un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultáneamente; y
(c) recuperar dicho polinucleótido que codifica para una proteína quimérica.
La divulgación también describe un método para producir una proteína quimérica, que comprende:
(a) eliminar, a partir de un polinucleótido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o que codifica una variante con al menos el 95 % de similitud con la SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos últimos 3 nucleótidos codifican para un resto de aminoácido localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8;
(b) insertar, en el polinucleótido obtenido en (a) y en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado, un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultáneamente;
(c) expresar, en una célula, el polinucleótido obtenido en (b); y
(d) recuperar dicha proteína quimérica expresada.
El método para producir la proteína quimérica de la invención también puede comprender el paso de combinar en una construcción de polinucleótido quimérico el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteína CyaA. En una realización preferida, el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteína CyaA se puede combinar en una construcción en tal forma que después de dicha combinación, el polinucleótido quimérico obtenido comprende o contiene, del extremo 5' hacia el extremo 3', la construcción de polinucleótido del paso (b) seguido por una construcción de polinucleótido que codifica para una proteína CyaA de una cepa de Bordetella pertussis.
Dentro de la presente invención, cuando se hace referencia a los "primeros tres nucleótidos" o a los" últimos tres nucleótidos", se entiende que estos tres nucleótidos se refieren a un codón que corresponde, de conformidad con el código genético, a un resto de aminoácido identificado por su posición en la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, el tamaño de la deleción del nucleótido del polinucleótido es un múltiplo de 3. Asimismo, además de ser un múltiplo de 3 en tamaño, la deleción de nucleótido del polinucleótido está en marco, es decir, la deleción retira los restos de aminoácidos buscados sin modificar el marco de lectura, y sin modificar los restos que rodean (corriente arriba y corriente abajo) la deleción.
El orden de los pasos de deleción y del paso de inserción es indiferente y ambos pasos se pueden efectuar simultáneamente.
En una primera realización del método, el paso de deleción se implementa antes del paso de inserción. Por lo tanto, una vez que se ha efectuado la deleción del fragmento, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado. Con "en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado" se quiere decir que el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta entre el lado N-terminal de CyaA (correspondientes al primer fragmento de CyaA) y el lado C-terminal de CyaA (correspondiente al segundo fragmento de CyaA). El sitio de inserción se puede identificar fácilmente, debido a que la secuencia tanto del lado N-terminal como del lado C- terminal de CyaA son idénticas a la secuencia de la parte N-terminal y parte C-terminal de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o variantes de conformidad con la invención.
En una segunda realización, el paso de inserción se implementa antes del paso de deleción. Una vez que el fragmento que se va a eliminar ha sido identificado, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta ya sea corriente arriba (en 5') de los tres nucleótidos (codón) que codifican para el primer resto del fragmento que se va a eliminar, o corriente abajo (en 3') de los últimos tres nucleótidos (codón) que codifican para el ultimo resto del fragmento que se va a eliminar. Una vez que se ha hecho la inserción del polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo, el fragmento que se va a eliminar se corta del polinucleótido que codifica para la molécula de CyaA/polipéptido heterólogo.
En una tercera realización los pasos de deleción y de inserción se llevan a cabo de forma simultánea, es decir, en un solo paso de reacción, utilizando enzimas de restricción apropiadas.
En una realización particular del método, el paso de deleción comprende eliminar, de un polinucleótido que codifica para una CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido que codifica para los restos 228 a 320 de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de nucleótido que codifica para los restos 184 a 386 de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de nucleótido que codifica para los restos 228 a 386 de la SEQ ID NO: 2, o un fragmento de nucleótido que codifica para los restos 184 a 320 de la SEQ ID NO: 2.
En otra realización, el paso de deleción comprende eliminar, de un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69, un fragmento de nucleótido que consiste en los nucleótidos 682 a 960 de la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste en los nucleótidos 550 a 1158 de la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69, o un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste en los nucleótidos 682 a 1158 de la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste en los nucleótidos 550 a 960 de la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 69.
Para efectuar la deleción del fragmento, el experto en la técnica posiblemente necesite efectuar una deleción mas grande en el polinucleótido que codifica para CyaA y después compensar cuando clone el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo para lograr la deleción antes descrita como un resultado final.
De manera alternativa, el polinucleótido quimérico que codifica para la proteína quimérica de la invención se sintetiza químicamente, utilizando métodos convencionales, de conformidad con la secuencia de proteína quimérica buscada, y opcionalmente tomando en consideración la degeneración del código genético y/o la optimización de la expresión. Por lo tanto, dicho polinucleótido sintetizado químicamente se expresa en una célula y la proteína quimérica expresada de este modo se recupera.
La invención se refiere a un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica, dicho polinucleótido comprende o consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo, en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, con respecto al fragmento de la proteína
CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2, se aplican en forma idéntica a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteína quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a las variantes con al menos el 95% se aplican idénticamente a las variantes de los fragmentos descritos en el contexto del polinucleótido que codifica una proteína quimérica. En una realización particular, dicho polinucleótido que codifica para una proteína quimérica se selecciona a partir del grupo que consiste en:
1) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde el polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2;
2) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' a 3', (a) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO:2, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2;
3) un polinucleótido que comprende o consiste en, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2;
4) u polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo y en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2; a De acuerdo con la divulgación, en cualquier polinucleótido que codifica para una proteína quimérica como se define en la presente solicitud, el polinucleótido de (a) está fusionado al polinucleótido de (b) el cual por sí mismo está fusionado al polinucleótido de (c).
Dentro de la presente invención, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo tiene un tamaño que es un múltiplo de 3, con el fin de mantener el marco de lectura del polinucleótido de (c) (por ejemplo, el marco de lectura del fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2 o variante de la misma).
En una realización particular de la invención, el polinucleótido quimérico también comprende, en su extremo 3' un polinucleótido que codifica para la proteína CyaA de una cepa de Bordetella en particular de una cepa de Bordetella pertussis.
Utilizando el método descrito en la presente solicitud se puede obtener o es obtenible un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica.
La invención también está dirigida a un vector de ácido nucleico, tal como un plásmido, que comprende un polinucleótido como el definido en la presente solicitud, es decir, un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica. En una realización particular, el vector es un vector de expresión, es decir, un vector que comprende, además de los elementos explícitamente mencionados, todos los elementos necesarios para controlar la expresión del polinucleótido de la invención (secuencia de control de expresión), y particularmente los elementos reguladores de la transcripción. "Elemento regulador de la transcripción" define cualesquiera regiones de ADN implicadas en la regulación de la transcripción del polinucleótido y abarca un promotor, tal como un promotor inducible mediante IPTG, por ejemplo el promotor lac, tac o T7, o un promotor inducible por cambio de temperatura, por ejemplo el promotor pR o pL de fago lambda, elementos incrementadores o reguladores que actúan en cis. Estos elementos, y en particular el promotor, se eligen dependiendo de la naturaleza de las células que se van a transfectar con el vector de ácido nucleico. La determinación del promotor apropiado, de conformidad con el nivel de expresión buscado o con la célula transfectada, forma parte del conocimiento del experto en la técnica. En una realización
particular, dicho vector es un plásmido. Los ejemplos de plásmidos convencionales apropiados para la preparación del vector de la invención son pUC o pBR322.
Dicho vector de ácido nucleico también comprende la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella, tal como el gen de CyaC de B. pertussis como se indica en la s Eq ID NO: 21. En otra realización, dicho vector de ácido nucleico también comprende una versión de la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella la cual está optimizada para una mejor expresión en un tipo celular particular, en particular optimizada para una mejor expresión en E. coli. Una versión optimizada de la secuencia de CyaC para E. coli es como se indica en la SEQ ID NO: 22.
Los plásmidos particulares que se pueden utilizar para producir una proteína quimérica como se define en la invención son aquellos descritos en la sección de materiales y métodos, y cuyas secuencias se indican en la SEQ ID NOs: 59, 62, 65 y 68. El polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo contenido en estos cuatro plásmidos se puede eliminar y remplazar con un polinucleótido que codifique para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. Por lo tanto, partiendo del plásmido de la SEQ ID NO: 59, la secuencia contenida entre los nucleótidos 904 y 1731 se elimina y remplaza con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de la SEQ ID NO: 62, la secuencia obtenida entre los nucleótidos 772 y 1599 se retira y es remplazada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de la SEQ ID NO: 65, la secuencia contenida entre los nucleótidos 904 y 1836 se retira y es remplazada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de la SEQ ID NO: 68, la secuencia contenida entre los nucleótidos 772 y 1704 se retira y es remplazada por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud.
Vale la pena mencionar que, cuando el vector nucleico contiene varios polinucleótidos, el(los) elemento(s) regulador(es) de la transcripción puede(n) ser único(s) para todos los polinucleótidos o ser compartido(s) por algunos de ellos o en contraste cada polinucleótido puede estar asociado con uno o más elementos reguladores de transcripción particulares. En el último caso, los diversos elementos reguladores de transcripción pueden ser similares o diferentes.
La invención también está dirigida a un cultivo celular que comprende un polinucleótido de la invención como el definido en la presente solicitud, es decir, cualquiera de un polinucleótido que codifica una proteína quimérica, o que comprende un vector como el definido en la presente solicitud. En un aspecto de la divulgación, dicha célula o cultivo celular se transfecta con un vector de la invención.
Dicha célula puede ser una célula procariota o un cultivo celular hecho a partir de células procariotas. Dicha célula es apropiada para expresar y/o para producir proteína(s) recombinante(s). En una realización particular, dicha célula o cultivo celular es una bacteria o un cultivo bacteriano. En un aspecto de la divulgación, dicha célula o cultivo celular es un cultivo de cepa de E. coli, tal como la cepa BL21, BLR, TG1 o HMS174.
Por lo tanto, la célula o cultivo celular de la invención expresa el polinucleótido de la invención, es decir, que codifica una proteína quimérica, y cuando sea apropiado, simultáneamente el gen cyaC o una versión optimizada del gen cyaC.
El término "CyaA" o "proteína derivada de CyaA" o "proteína quimérica" abarca, y preferentemente es, una versión modificada posterior a la traducción de la proteína CyaA de Bordetella. Por lo tanto, en una realización particular, dicha "proteína derivada de CyaA" o "proteína quimérica" de la invención es modificada mediante acilación posterior a la traducción de al menos uno de sus restos, en particular al menos uno de los dos, preferentemente los dos restos lisina correspondientes a los restos localizados en las posiciones 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los restos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica. Con "acilación", se quiere decir en la presente solicitud modificación con palmitoilo, es decir, adición de palmitato y/o grupo(s) palmitoleato en el resto o restos de CyaA, de la proteína derivada de CyaA o de la proteína quimérica de la invención. Por lo tanto, dicha "proteína derivada de CyaA" o "proteína quimérica" lleva un grupo palmitoilo en algunos de estos restos, preferentemente en uno de los dos, o los dos restos lisina correspondientes a los restos 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B.pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los restos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica. Con "correspondiente a", se quiere decir que el resto o restos que está(n) modificado(s) posterior a la traducción en la proteína derivada de CyaA o proteína quimérica de la invención es(son) aquellos cuya posición coincide con las lisinas 860 y 983 en la secuencia de CyaA de B. pertussis, B. hinzii o B. parapertussis (SEQ ID NO: 2, 4 y 6 respectivamente) o las lisinas 859 y 982 en la secuencia de CyaA de B. bronchiseptica (SEQ ID NO: 8). La identificación de estos restos lisina en las proteínas de la invención puede ser efectuada por el experto de la técnica, alineando y comprando la secuencia de las proteínas de la invención con la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 2.
El procedimiento de modificación con palmitoilo es mediado por el gen cyaC de una especie de Bordetella, preferentemente de la secuencia que codifica para CyaC de Bordetella pertussis, cuya secuencia natural se indica en la SEQ ID NO: 21. Una versión de la secuencia que codifica para CyaC, optimizada para producción en E. coli, se indica en la SEQ ID NO: 22. Esta modificación o modificaciones posteriores a la traducción se puede(n) obtener mediante co-expresión del polinucleótido que codifica para la proteína CyaA, el polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA de la invención o el polinucleótido que codifica para la proteína quimérica de la invención, y del gen cyaC.
En una realización particular, la construcción de polinucleótido de la invención que expresa las proteínasquiméricas CyaC y CyaA comprende del extremo 5' hacia el extremo 3' , el polinucleótido o gen cyaA, que consiste en manera conveniente de una secuencia optimizada para expresión en una célula hospedadora determinada, por ejemplo E. coli y el polinucleótido o gen cyaC, que consiste en manera conveniente de una secuencia optimizada para expresión en una célula hospedadora determinada, por ejemplo E. coli. Este orden de la inserción de los polinucleótidos en la construcción favorece la expresión de las proteínas quiméricas CyaA y CyaC en cantidades respectivas y conformación apropiada para incrementar la eficiencia de expresión de la versión de CyaA modificada después de la traducción.
En una realización particular de la invención, excepto por la deleción del fragmento [cuyo primer resto de aminoácido está localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, respectivamente, y cuyo último resto de aminoácido está localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, respectivamente] efectuada en la proteína CyaA de Bordetella pertussis de tipo silvestre descrita en la presente solicitud, la parte de CyaA de la proteína quimérica no experimenta ninguna otra variación (adición, deleción y/o sustitución) en comparación conla SEQ ID NO: 2.
Como un aspecto interesante, la proteína derivada de CyaA así como la proteína quimérica de la invención son no citotóxicas es decir, su actividad enzimática ha sido inactivada después de la deleción del fragmento cuyo primer resto de aminoácido está localizado desde el resto 184 hasta el resto 228 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo último resto de aminoácido está localizado desde el resto 320 hasta el resto 386 de la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. Por lo tanto, en una realización particular, no se ha efectuado inserción, deleción o sustitución. En particular, cuando los restos 188 y 189 de CyaA todavía siguen presentes en las proteínas de la invención, no se inserta dipéptido (tal como el dipéptido LQ o g S) entre los restos 188 y 189.
La invención también está dirigida a una proteína quimérica la cual es codificada por un polinucleótido de la invención, expresada a partir de un vector de la invención o que se produce mediante un cultivo celular de la invención.
Una proteína quimérica de la invención comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando en un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo, en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, y (c) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando en el último resto de la SEQ ID NO: 2.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteína derivada de CyaA, con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto ubicado desde la posición 183 a la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto ubicado desde la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2, se aplican idénticamente a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica una proteína quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a las variantes con al menos el 95 % se aplican idénticamente a los fragmentos descritos en el contexto de una proteína quimérica.
Por lo tanto, la invención también está dirigida a una proteína quimérica que comprende o consiste en:
1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido tiene una carga electrostática negativa y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2;
2) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que contiene un antígenoE7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO:2; y
En una realización particular de las proteínas quiméricas como se definen en la presente solicitud, el fragmento de (a) está fusionado al polipéptido heterólogo de (b) el cual por sí mismo está fusionado al fragmento de (c).
Con "quimérico", se quiere decir que la proteína comprende o consiste en, como se define en la presente solicitud, de fragmentos que se originan a partir de una CyaA de Bordetella, y un polipéptido el cual no se origina a partir de una CyaA de Bordetella. Por lo tanto, dicho polipéptido se dice heterólogo, es decir, su secuencia global no es idéntica a una parte de una CyaA de Bordetella, en particular, a una parte de una CyaA como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8; en una realización particular, la secuencia global de este polipéptido heterólogo no es similar a una parte de una CyaA de Bordetella, en particular a una parte de una CyaA como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, es decir, su secuencia tiene una similitud que es inferior al 80 %, inferior al 70 %, inferior al 60 %, inferior al 50 %, inferior al 40 %, inferior al 30 % o inferior al 20 % con una parte de una CyaA de Bordetella, en particular con una parte de una proteína CyaA como se establece en la SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, calculando dicha similitud para esta definición comparando la secuencia del polipéptido heterólogo y la de la parte de una CyaA de Bordetella en tamaño equivalente (el polipéptido heterólogo y la parte de una CyaA de Bordetella que tiene el mismo tamaño). Se describe que la secuencia del péptido heterólogo y la secuencia de las porciones (o fragmentos) que se originan de la CyaA de Bordetella como se define en el presente documento, no comparten identidad (100 % de similitud) sobre más de 7 restos de aminoácidos consecutivos.
Según la descripción, el polipéptido heterólogo tiene un tamaño que varía de 9 a 500 restos de aminoácidos, en particular de 9 a 400 restos, de 9 a 300 restos, de 9 a 200 restos, de 9 a 100 restos, de 20 a 500 restos, de 20 a 400 restos, 20 a 300 restos, 20 a 200 restos, 20 a 100 restos, 50 a 500 restos, 50 a 400 restos, 50 a 300 restos, 50 a 200 restos, 50 a 100 restos, 100 a 500 restos, 100 a 400 restos , 100 a 300 restos o 100 a 200. El tamaño del polinucleótido que codifica el polipéptido heterólogo varía de 27 a 1500 nucleótidos, en particular 27 a 1200 nucleótidos, 27 a 900 nucleótidos, 27 a 600 nucleótidos, 27 a 300 nucleótidos, 60 a 1500 nucleótidos, 60 a 1200 nucleótidos, 60 a 900 nucleótidos, 60 a 600 nucleótidos, 60 a 300 nucleótidos, 150 a 1500 nucleótidos 150 a 1200 nucleótidos, 150 a 900 nucleótidos, 150 a 600 nucleótidos, 150 a 300 nucleótidos, 300 a 1500 nucleótidos, 300 a 1200 nucleótidos, 300 a 900 nucleótidos o 300 a 600, siempre que el tamaño (número de nucleótidos) del polinucleótido sea un múltiplo de 3.
De acuerdo con la invención, el polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa, es decir, el polipéptido heterólogo es ácido. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, un fragmento del polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática que es negativa, es decir, este fragmento de dicho polipéptido heterólogo es ácido. Un fragmento del polipéptido heterólogo se define como una concatenación de restos de aminoácido consecutivos, cuyo tamaño es de 10% hasta 40%, preferentemente 15% a 30%, del tamaño del polipéptido heterólogo completo.
En particular, la carga electrostática se define como el número de restos lisina y arginina menos el número de restos de ácido aspártico y ácido glutámico contenidos en el polipéptido heterólogo. En un aspecto de la divulgación, la carga electrostática del polipéptido heterólogo es igual a -1 o es menos de -1, y en particular es igual o a menor que -2, -3, -4, -5, -10, -15, -20, -30, -40, -45 o -50. En particular, preferentemente en combinación con uno de los valores de la oración anterior, la carga electrostática del polipéptido heterólogo no es menor de -55, -60, -70 o -80. En otras palabras, la carga electrostática del polipéptido heterólogo está en el intervalo de -55 a -1, -50 a -2, o -40 a -3. Como comparación, el epítopo OVA clásico (SIINFEKL) tiene una carga electrostática de 0.
Los ejemplos de varios polipéptidos heterólogos, analizados dentro de las proteínas quiméricas de la invención, se reportan en la presente solicitud:
péptido 216 (SEQ ID NO: 34), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_114 y Btpr_116, tiene una carga electrostática de -16;
péptido 217 (SEQ ID NO: 36), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_115 y Btpr_117, tiene una carga electrostática de -37;
péptido 233 (SEQ ID NO: 38), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_143 y Btpr_144, tiene una carga melectrostática de -13
péptido 234 (SEQ ID NO: 40), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_145 y Btpr_146, tiene una carga melectrostática de -38
péptido 326(SEQ ID NO: 42), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_161 y Btpr_169, tiene una carga electrostática de -11 ;
péptido 327 (SEQ ID NO: 46), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_162 y Btpr_170, tiene una carga electrostática de -10;
péptido 328 (SEQ ID NO: 50), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_163 y Btpr_1171, tiene una carga electrostática de -18;
péptido 329 (SEQ ID NO: 54), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_164 y Btpr_172, tiene una carga electrostática de -19;
péptido 330 (SEQ ID NO: 44), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_165 y Btpr_173, tiene una carga
electrostática de -30;
- péptido 331 (SEQ ID NO: 48), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_166 y Btpr_174; tiene una carga electrostática de -30;
- péptido 332 (SEQ ID NO: 52), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_167 y Btpr_175; tiene una carga electrostática de -45; y
- péptido 333 (SEQ ID NO: 56), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_168 y Btpr_176; tiene una carga electrostática de -46.
En una realización particular, dicho polipéptido mheterólogo comprende o consiste en uno o varios antígenos, comprendiendo cada antígeno uno o varios epítopos como se define en la presente solicitud. Dentro de la presente invención, un antígeno se define como un polipéptido que es capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de célula T contra uno o varios epítopos contenidos en este polipéptido (polipéptido inmunogénico). Un antígeno es cualquiera de un polipéptido antigénico de longitud completa de origen celular o viral, un fragmento de este polipéptido antigénico de longitud completa capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de célula T, contra un determinante antigénico contenido en este fragmento, o un polipéptido sintético, no natural que porta al epítopo o epítopos que consisten en varías partes del polipéptido antigénico fusionadas entre sí o un polipéptido sintético, no natural que consiste en una o varias partes de varios polipéptidos antigénicos fusionadas entre sí, con la condición que el polipéptido sintético sea capaz de provocar una respuesta de célula inmune T, contra un determinante antigénico contenido en este polipéptido sintético.
Por lo tanto, dicho polipéptido heterólogo lleva, comprende o consiste en al menos un epítopo o epítopos, preferentemente al menos un epítopo o epítopos CD8+ y/o al menos un epítopo o epítopos CD4+. Con la expresión m"al menos" se quiere decir uno o una pluralidad de epítopos. Un epítopo se define en la presente solicitud como cualquier secuencia de aminoácido implicada en la provocación o inducción de una respuesta inmune mediada por célula, especialmente una respuesta inmune de célula T, y puede ser lineal o conformacional. Por consiguiente, los epítopos descritos en la presente solicitud incluyen aquellos que son procesados por las APC (células presentadoras de antígeno) en un hospedador, especialmente epítopos T reconocidos en asociación con el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I, tal como los epítopos cuyas células diana son linfocitos T CD8+, o epítopos T reconocidos en asociación con moléculas del MHC clase II tal como aquellos cuyas células diana son linfocitos T CD4+. Los epítopos dentro de la presente invención preferentemente tienen un tamaño que varía de 9 a 17, preferentemente 9 a 12 restos. Los epítopos descritos en la presente solicitud incluyen también epítopo(s) B implicado(s) en la respuesta humoral.
Los presentes inventores han diseñado un polipéptido heterólogo particular que comprende varios antígenos con varios orígenes. Este polipéptido heterólogo porta antígenos que incluyen epítopos de célula T restringidos por la clase I de MHC (respuesta CD8) y clase II de MHC (respuesta CD4) de humano y de múrido: GFP11 ,Mo G35-55, OVA257-264 , IE191-110, CLA4, HA512-520, OVA323-339, MELAN-A26-35, HA307-319, LCMV GP33-41, MAGEA3i i i -180, MAGEA3244-285, fragmento de E7 de HPV16 y fragmento de E7 de HPV18.
La secuencia de aminoácido de este antígeno es como se indica en la SEQ ID NO: 24, y es parte de la presente invención. La descripción describe que dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos, siendo dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos de origen vírico. Por lo tanto, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se origina a partir de VIH, VHB, VHC, adenovirus, VEB, virus del herpes, virus HTLV.1 y CMV. En una realización particular, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se originan a partir del HPV. En una realización particular, cuando el polipéptido comprende o consiste en más de un epítopo o más de un antígeno, estos epítopos o antígenos se originan del mismo Orden, del mismo Grupo, de la misma Familia, de la misma Subfamilia, del mismo Género o de la misma especie y/o se origina de diferentes órdenes, de diferentes grupos, de diferentes familias, de diferentes subfamilias, de diferentes géneros o de diferentes especies.
En una realización particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en al menos un antígeno o antígenos, o al menos un epítopo o epítopos, siendo dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos de origen celular. Por lo tanto, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se origina de una célula procariota o eucariota.
La divulgación describe que dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se origina de bacterias, hongos o un parásito, tal como, pero sin limitación, Chlamydia, Plasmodium, Candida, Leishmania o Mycobacterium tuberculosis. En una realización particular, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos no se origina de una cepa de Bordetella. Se desvela que dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se puede originar de un antígeno de cepa de Bordetella que no es CyaA. Se desvela que cuando el polipéptido comprende o consiste en más de un epítopo o más de un antígeno, estos epítopos o antígenos se originan de la misma bacteria, del mismo hongo o del mismo parásito. En otra realización, cuando el polipéptido comprende o consiste en más de un epítopo o más de un antígeno, estos epítopos o antígenos se originan de diferentes bacterias, de diferentes hongos o de diferentes parásitos.
Se desvela que dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se origina en una célula de mamífero. De acuerdo con la descripción, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o
epítopos son de un antígeno tumoral, es decir, un péptido expresado por un tumor o por células cancerosas, siendo el tumor autoinducido o inducido por un patógeno; según un aspecto de la divulgación, el antígeno tumoral es propio, en particular de origen humano. El término "antígeno tumoral" abarca los siguientes grupos de antígenos tumorales, y el polipéptido heterólogo contenido en la proteína quimérica de la invención puede elegirse en al menos uno de los siguientes grupos: (a) antígenos tumorales oncofetales, (b) antígenos tumorales oncovirales, (c) antígenos tumorales sobreexpresados/ acumulados, expresados en una amplia variedad de tejidos normales y sobreexpresados en tumores, (d) antígenos específicos de tumor compartidos o antígenos de cáncer de testículo, expresados en muchos tumores pero no en tejidos normales (incluida la familia BAGE,la familia GAGE, la familia MAGE, la familia SAGE y la familia XAGE), (e) antígenos tumorales de linaje restringido, (f) antígenos tumorales mutados, resultantes de mutaciones puntuales en genes que se expresan ubicuamente, y (g) antígenos tumorales de diferenciación, expresado en el tejido normal de origen de los tumores pero que no son específicos del tumor.
Cuando un polipéptido heterólogo comprende varios antígenos, estos antígenos están ya sea fusionados, están separados por enlazadores peptídicos o al menos dos de dichos antígenos están fusionados mientras que al menos dos de dichos antígenos están separados por un enlazador. En una realización particular, dicho enlazador peptídico tiene un tamaño que varía de 2 a 10 restos. Los enlazadores se pueden agregar a antígenos separados y/o para mejorar la respuesta inmune.
En un aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en al menos un antígeno o antígenos, o al menos un epítopo o epítopos, dicho al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos se origina de un h Pv . En una realización particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 antígenos que se originan a partir de HPV. En una realización preferida, dicho polipéptido heterólogo comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV. En una realización particular, dicho antigeno o antigenos de HPV comprenden o consisten en al menos un epitope o epitopes, preferentemente al menos un epítopo o epítopos de CD8+ y/o al menos un epítopo o epítopos de CD4+.
Por lo tanto, la divulgación describe una proteína quimérica que comprende o que consiste en, de N- terminal hacia C-terminal:
(a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2 o una variante con al menos el 95 % de similitud con este fragmento;
(b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV;
(c) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2 o una variante con al menos el 95 % de similitud con este fragmento.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, referentes al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO: 2 y terminando con un resto localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de la SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO: 2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO: 2, se aplican en forma idéntica a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteína quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a las variantes con al menos el 95 % se aplican idénticamente a los fragmentos descritos en el contexto de una proteína quimérica. De manera similar, las definiciones relacionadas con el polipéptido heterólogo se aplican para definir el polinucleótido que codifica dicho polipéptido heterólogo.
La divulgación describe la proteína quimérica que comprende o consiste en,
1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, cada antígeno de HPV se origina de un tipo de h Pv diferente; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO:2, 4 o 6; 2) de N-terminal a C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO:8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8;
3) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a
partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
4) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; 5) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6;
6) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1705 de la SEQ ID NO: 8; 7) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, 4 o 6; y
8) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1705 de la SEQ ID NO: 8.
La expresión "tipo de HPV" abarca cualquier tipo de HPV especialmente los tipos de HPV que se seleccionan dentro de los géneros Alfa-papilomavirus, Beta- papilomavirus, Gama-papilomavirus, Delta-papilomavirus, Epsilonpapilomavirus, Zeta-papilomavirus, Theta- papilomavirus, Iota-papilomavirus, Kappa-papilomavirus, Lambdapapilomavirus, Mu-papilomavirus, Nu-papilomavirus Xi-papilomavirus, Omicron-papilomavirus y Pi-papilomavirus. En una realización particular, se prefieren los papilomavirus que tienen un tropismo humano, tal como los tipos del género Alfa-papilomavirus, Beta-papilomavirus, Gamma- papilomavirus, Mu-papilomavirus o Nu-papilomavirus. En una realización particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en los antígenos de los tipos de HPV del género alfa-papilomavirus, especialmente un tipo de las especies 7 y 9 de HPV del género alfa-papilomavirus [17]. Por lo tanto, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en los antígenos de las especies de tipo altamente oncogénicas de HPV, tales como HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 o HPV58.
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica que comprende antígeno o antígenos o epítopo o epítopos de HPV, dicho antígeno o antígenos, contenidos en el polipéptido heterólogo se selecciona(n) a partir de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6 y E7 de HPV o cualquier fragmento antigénico del mismo.
De acuerdo con la invención, dicho antigeno, contenido en el polipéptido heterólogo, es la proteina E7 de un tipo de HPV o cualquier fragmento antigénico de esta proteína E7 (también llamado fragmento de E7). La proteína E7 o fragmento de la misma puede ser del tipo de HPV16 (SEQ ID NO: 25), el tipo de HPV18 (SEQ ID NO: 26), el tipo de HPV31 (SEQ ID NO: 27), el tipo de HPV33 (SEQ ID NO: 28), el tipo de HPV45 (SEQ ID NO: 29), el tipo de HPV52 (SEQ ID NO: 30) o el tipo de HPV58 (SEQ ID NO: 32). Para eliminar un epítopo auto-inmune naturalmente humano identificado por los inventores en la proteína E7 del tipo de HPV52 (indicado en la SEQ ID NO: 30), el resto de aminoácido en las posiciones 84 y 86 ha sido sustituido (M->L en la posición 84 y L->M en la posición 86); esta secuencia modificada de la proteína E7 de tipo HPV52 es como se indica en la SEQ ID NO: 31.
En un aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en al menos 3 fragmentos (fragmentos antigénicos) de una proteína E7 de un tipo de VPH, al menos 3 de estos fragmentos se originan a partir de proteínas E7 de diferentes tipos de VPH. En consecuencia, "al menos 3 fragmentos" significa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 fragmentos, siempre que entre estos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 fragmentos, al menos 3 , se originan de diferentes tipos de VPH. En un aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en 6 fragmentos E7, 3 de los cuales se originan a partir de tres tipos diferentes de VPH. En otro aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste en 8 fragmentos E7, 4 de los cuales se originan a partir de cuatro tipos diferentes de VPH.
En un aspecto de la divulgación, todos los fragmentos E7 se originan a partir de diferentes tipos de VPH. En otro aspecto de la divulgación, solo algunos fragmentos E7 (al menos 3) se originan de diferentes tipos de VPH, los otros fragmentos E7 se originan en uno de dichos tipos diferentes de VPH, se originan en dos de dichos tipos diferentes de VPH, se originan en tres de dichos tipos de VPH diferentes, se originan en cuatro de dichos tipos de VPH diferentes o se originan en cinco de dichos tipos de VPH diferentes. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en al menos 4 fragmentos de la proteína E7, al menos 3 de estos fragmentos E7 procedentes de proteínas E7 de diferentes tipos de VPH, y al menos 2 de estos fragmentos E7 procedentes de misma proteína E7 de un tipo de VPH (un fragmento E7 está en el grupo del fragmento E7 de diferentes tipos de VPH y en el grupo del fragmento E7 del mismo tipo de VPH). Como ejemplo no limitativo, para un polipéptido heterólogo con 6 fragmentos E7 de tipos de VPH, se pueden encontrar las siguientes combinaciones: a) 1 fragmento E7 de un primer tipo de VPH, 1 fragmento E7 de un segundo tipo de VPH y 4 fragmentos E7 de un tercer tipo de VPH; b) 1 fragmento E7 de un primer tipo de VPH, 2 fragmentos E7 de un segundo tipo de VPH y 3 fragmentos E7 de un tercer tipo de VPH; yc) 2 fragmentos E7 de un primer tipo de VPH, 2 fragmentos E7 de un segundo tipo de
VPH y 2 fragmentos E7 de un tercer tipo de VPH.
De acuerdo con la descripción, dicho fragmento E7 de tipo HPV consiste en la parte N-terminal de la proteína E7 o en la parte C-terminal de la proteína E7.
Con "parte N-terminal de E7" se quiere decir un fragmento cuya secuencia es al menos el primer 25%, el primer 30%, el primer 35%, el primer 40% de la proteína E7 y es cuando mucho el primer 50% de la longitud en restos de aminoácido de la proteína E7 comenzando desde el primer resto de aminoácido N-terminal. Por consiguiente, con "el primer 25%", se quiere decir un polipéptido cuya secuencia comienza en el resto 1 de la proteína E7 y termina en el resto que corresponda al 25% del tamaño de la proteína E7 de longitud completa. En un aspecto de la divulgación, un fragmento que consiste en la parte N-terminal de la proteína E7 consiste en una secuencia que varía desde el primer 28% hasta el primer 31% de la proteína E7. En otro aspecto de la divulgación, un fragmento que consiste en la parte N-terminal de la proteína E7 consiste en una secuencia que varía desde el primer 31% hasta el primer 41% de la proteína E7. Se desvela un fragmento que consisten en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 32. Otros aspectos desvelados son un fragmento que consiste en los restos 1 a 34 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 1 a 42 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 1 a 37 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 32.
Con "parte C-terminal de E7", se quiere decir un fragmento cuya secuencia es al menos el último 25%, el ultimo 30%, el último 40%, el último 50%, el último 60% de la longitud en restos de aminoácido de la proteína E7 comenzando desde el último resto de aminoácido y es cuando mucho el último 70% o el último 80% de la proteína E7. Con "el último 25%" se quiere decir un polipéptido cuya secuencia termina en el último resto de la proteína E7 y comienza en el resto que corresponde a 25% del tamaño de la proteína E7 de longitud completa. En un aspecto de la divulgación, un fragmento que consiste en la parte C- terminal de la proteína E7 consiste en una secuencia que varía desde el último 55% hasta el último 61% de la proteína E7. En otro aspecto de la divulgación, un fragmento que consiste en la parte C-terminal de la proteína E7 consiste en una secuencia que varía desde el último 60% hasta el último 70% de la proteína E7. Los aspectos particulares desvelados son un fragmento que consiste en los restos 43 a 98 de la SEQ iD NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 42 a 98 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 43 a 97 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 44 a 106 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 45 a 99 de la SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 44 a 98 de la SeQ ID NO: 32. Otros aspectos desvelados son un fragmento que consiste en los restos 35 a 98 de la SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste en los restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste en los restos 33 a 98 de la SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste en los restos 32 a 97 de la SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste en los restos 38 a 106 de la SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste en los restos 32 a 99 de la s Eq ID NO: 31 o un fragmento que consiste en los restos 32 a 98 de la SEQ ID NO: 32.
En un aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 del mismo tipo de HPV. En un aspecto de la divulgación, cuando dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal de la proteína E7 del mismo tipo de HPV (no fusionado), la suma del tamaño de la parte N-terminal y del tamaño de la parte C-terminal no excede el tamaño de la proteína E7 de longitud completa.
En otro aspecto de la divulgación, dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV. Estos fragmentos N-terminales y C-terminales se pueden agrupar respectivamente en los polipéptidos. Asimismo, estos se pueden invertir con respecto a su posición en la proteína E7 nativa, estando los fragmentos C-terminales localizados corriente arriba del extremo N-terminal.
Por lo tanto, se desvela una proteína quimérica que comprende un polipéptido heterólogo que comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (i) la parte C-terminal de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, y (ii) la parte N- terminal de la proteína E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
El término "opcionalmente" en la definición anterior se refiere a la presencia de la cuarta valencia de HPV. Por consiguiente, la proteína quimérica comprende tanto la parte C-terminal como la parte N-terminal de las proteínas E7 de un primer, un segundo y un tercer HPV como se definieron anteriormente, y opcionalmente la parte C- terminal y la parte N-terminal de una cuarta proteína E7 de un HPV diferente.
En un aspecto de la divulgación, los fragmentos de E7 diferentes están ya sea fusionados o están separados por enlazadores peptídicos o al menos dos de los fragmentos de E7 están fusionados mientras que al menos dos de los fragmentos de E7 están separados por un enlazador peptídico. En un aspecto de la divulgación, dicho enlazador peptídico tiene un tamaño que varía de 2 a 10 restos. En una realización particular, dicho enlazador es el dipéptido AS. Los enlazadores se pueden agregar para separar cada fragmento o algunos fragmentos, y/o para mejorar la respuesta inmune. En una realización particular, se agrega un dipéptido AS inmediatamente corriente arriba hacia la parte C-terminal de un fragmento de E7 de HPV. En una realización particular, un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de un fragmento de E7 de tipo de HPV18, y en particular solo corriente arriba de este fragmento.
Se desvela una proteína quimérica particular que comprende o que consiste en un polipéptido heterólogo que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C- terminal de la proteína E7 de un primer tipo de h Pv , fusionada a la parte C-terminal de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho tercer tipo de HPV.
Se desvela otra proteína quimérica que comprende o que consiste en un polipéptido heterólogo que consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
En la divulgación de una proteína quimérica descrita en la presente solicitud, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45. En un aspecto de la divulgación, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45, y un dipéptido AS está agregado inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo HPV18. En otro aspecto de la divulgación, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58. En otro aspecto de la divulgación, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HVP33 y HPV52. En otro aspecto de la divulgación, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58. En otra realización, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45. En otro aspecto de la divulgación, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En otro aspecto de la divulgación, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45 y un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de el fragmento de E7 de tipo HPV18. En otro aspecto e la divulgación, dichos primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, y un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo de HPV18.
En un aspecto de la divulgación, la parte N-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV consiste en una secuencia que varía desde el primer 28% hasta el primer 31 % de la proteína E7 y la parte C-terminal de la proteína E7 de dicho mismo tipo de HPV consiste en una secuencia que varía desde el último 55% hasta el último 61% de la proteína E7. Los ejemplos de pares de parte N- terminal/parte C-terminal de la proteína E7 del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo dentro de dicho polipéptido heterólogo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud son los siguientes:
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 25 / restos 43 a 98 de la SEQ ID NO: 25;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 26 / restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26;
- restos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 27 / restos 42 a 98 de la SEQ ID NO: 27;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 28 / restos 43 a 97 de la SEQ ID NO: 28;
- restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 29 / restos 44 a 106 de la SEQ ID NO: 29;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 31 / restos 45 a 99 de la SEQ ID NO: 31;
- restos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 32 / restos 44 a 98 de la SEQ ID NO: 32;
En otro aspecto de la divulgación, la parte N-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV consiste en una secuencia que varía desde el primer 31% hasta el primer 41% de la proteína E7 y la parte C-terminal de la proteína E7 consiste en una secuencia que varía desde el último 60% hasta el último 70% de la proteína E7. En otro aspecto de la divulgación, la suma del tamaño de la parte N-terminal de la proteína E7 y el tamaño de la parte C-terminal es cuando mucho 100% del tamaño de la proteína E7. En tal caso, la proteína E7 (en dos fragmentos), puede estar contenida en el polipéptido heterólogo. Los ejemplos de pares de parte N-terminal/parte C-terminal de la proteína E7
del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo de dicho polipéptido heterólogo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud, son los siguientes:
- restos 1 a 34 de la SEQ ID NO: 25 / restos 35 a 98 de la SEQ ID NO: 25;
- restos 1 a 42 de la SEQ ID NO: 26 / restos 43 a 105 de la SEQ ID NO: 26;
- restos 1 a 32 de la SEQ ID NO: 27 / restos 33 a 98 de la SEQ ID NO: 27;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 28 / restos 32 a 97 de la SEQ ID NO: 28;
- restos 1 a 37 de la SEQ ID NO: 29 / restos 38 a 106 de la SEQ ID NO: 29;
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 31 / restos 32 a 99 de la SEQ ID NO: 31; y
- restos 1 a 31 de la SEQ ID NO: 32 / restos 32 a 98 de la SEQ ID NO: 32;
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 y HPV45, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 34 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 33) o la secuencia indicada como se indica en la SEQ ID NO: 36 (codificada por un nucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 35).
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 41) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 44 (codificada por un nucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 43).
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33 y HPV52, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia que se indica en la SEQ ID NO: 46 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 45) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 48 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 47).
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 38 (codificada por un polinucleótido como se indica en la s Eq ID NO: 37) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 39).
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 50 (codificada por un polinucleótido como se indica en la s Eq ID NO: 49) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 52 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 51).
En un aspecto de la divulgación de una proteína quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 54 (codificada por un polinucleótido como se indica en la s Eq ID NO: 53) o la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 56 (codificada por un polinucleótido como se indica en la SEQ ID NO: 55).
La divulgación también describe un polipéptido, que comprende o que consiste en, de N-terminal hacia C- terminal, la parte C-terminal de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N- terminal de la proteína E7 de dicho cuarto tipo de HPV. Las definiciones provistas en la presente solicitud para un polipéptido heterólogo contenido en una proteína quimérica de la invención se aplican en forma idéntica al polipéptido como tal, en particular con respecto a las definiciones de la parte N-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV, de la parte C-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV, la presencia opcional de un enlazador, en particular el dipéptido AS, la naturaleza de los tipos de HPV, los fragmentos particulares de las proteínas E7 de la SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 31 y 32. Las definiciones provistas en la presente solicitud para una composición que comprende proteína o proteínas quiméricas se aplican de forma idéntica a los polipéptidos como tal, en particular con respecto a combinaciones generales o específicas de dicho primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV y, cuando sea aplicable, de dicho séptimo tipo de HPV. En un aspecto de la divulgación, dicho polipéptido consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 o 56. La divulgación también describe los polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos, en particular los polinucleótidos como se indican en la SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 y 55, así como un vector que comprende dichos polinucleótidos y una célula o cultivo celular que comprende estos polinucleótidos o un vector que comprende dichos polinucleótidos; todos como se definieron en la presente solicitud.
A pesar de su tamaño (más de 200 restos), su complejidad (presencia de varios restos cisteína) y su carga electrostática negativa, se ha demostrado de manera sorpresiva que dicho polipéptido es translocado en forma eficiente en el citosol de células presentadoras de antígeno, lo que permite obtener respuestas inmunes de célula T
fuertes y grandes.
En un aspecto, la divulgación describe una proteína quimérica que comprende o consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58 o en la SEQ ID NO: 61. Estas proteínas quiméricas son codificadas respectivamente por un polinucleótido cuya secuencia es como se indica en la SEQ ID NO: 57 o en la SEQ ID NO: 60. En un aspecto de la divulgación, la proteína quimérica de la SEQ ID NO: 58 o la SEQ ID NO: 61 se expresa a partir de los plásmidos cuya secuencia esla SEQ ID NO: 59 o la SEQ ID NO: 62 respectivamente.
En un aspecto, la divulgación describe una proteína quimérica que comprende o consiste en una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 64 o en la SEQ ID NO: 67. Estas proteínas quiméricas son codificadas respectivamente por un polinucleótido cuya secuencia es como se indica en la SEQ ID NO: 63 o en la SEQ ID NO: 66. En una realización particular, la proteína quimérica de la SEQ ID NO: 64 o la SEQ ID NO: 67 son expresadas a partir de plásmidos cuyas secuencias sonla SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO: 68 respectivamente.
Por lo tanto, se puede expresar cualquier proteína quimérica que comprende un polipéptido heterólogo que comprende o consiste en al menos un antígeno o antígenos o al menos un epítopo o epítopos que se originan de HPV, como se describe en la presente solicitud, utilizando los plásmidos de la SEQ ID NO: 59, la SEQ ID NO: 62,la SEQ ID NO: 65 y la SEQ ID NO: 68, como vectores de expresión. En este orden, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de la SEQ ID NO: 59 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención, lo que permite que se exprese una proteína quimérica que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 772 y 1599 de la SEQ ID NO: 62 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, lo que permite expresar una proteína quimérica que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1836 de la SEQ ID NO: 65 es eliminado, y remplazado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, lo que permite expresar una proteína quimérica que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 772 y 1704 de la SEQ ID NO: 68 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, que permite expresar una proteína quimérica que comprende este polipéptido heterólogo.
En una realización particular de la invención, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de la SEQ ID NO:59 se elimina y se sustituye por un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo de la invención derivado de una única proteína E7 de HPV, siendo seleccionado este polinucleótido de entre los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que tienen respectivamente la secuencia de la SEQ ID NO:70, la SEQ ID NO:71, la SEQ ID NO:74, la SEQ ID NO:73 y la SEQ ID NO:72. Tales construcciones permiten expresar una proteína quimérica monovalente de la invención que comprende un polipéptido heteróligo que tiene la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO:71, la SEQ ID NO:74, o la SeQ ID No :72 y que representa respectivamente la E7 de HPV31 delecionada de su región ácida, la E7 de HPV33 delecionada de su región ácida, la E7 de HPV58 delecionada de su región ácida, la E7 del HPV52 delecionada de su región ácida y la E7 de HPV45 delecionada de su región ácida.
En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de la SEQ ID NO:59 se elimina y se sustituye por un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo derivado de una única proteína E7 de HPV, siendo este polinucleótido seleccionad de entre los polinucleótidos que tienen respectivamente la secuencia de la SEQ ID NO:75, la SEQ ID NO:76, la SEQ ID NO:79, la SEQ ID NO:78 y la SEQ ID NO:77.
La invención también está dirigida a una composición que comprende una proteína quimérica de la invención.
En un aspecto de la divulgación, cuando la composición comprende más de una proteína quimérica diferente, preferentemente dos proteínas quiméricas diferentes, las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas proteínas quiméricas son las mismas o son diferentes, mientras que las secuencias de los polipéptidos heterólogos son diferentes. En un aspecto de la divulgación, las diferentes proteínas quiméricas, preferentemente dos proteínas quiméricas diferentes se seleccionan a partir de las proteínas quiméricas diferentes como se describe en la presente solicitud. En una realización particular, las dos proteínas quiméricas diferentes son cualquiera de:
1) 2 proteínas quiméricas que comprenden o consisten en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, con la condición que los polipéptidos heterólogos de estas dos proteínas quiméricas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV; o
2) 2 proteínas quiméricas que comprenden o consisten en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, con la condición que los polipéptidos heterólogos de estas dos proteínas quiméricas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV.
En otro aspecto de la divulgación, las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas proteínas quiméricas diferentes, preferentemente 2 proteínas quiméricas diferentes son diferentes y la secuencia del
polipéptido heterólogo es diferente. En un aspecto de la divulgación, las diferentes proteínas quiméricas, preferentemente 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas se pueden seleccionar a partir de las proteínas quiméricas diferentes como se describen en la presente solicitud. En una realización particular, al menos una, preferentemente una, de las proteínas quiméricas diferentes, preferentemente 2 proteínas quiméricas diferentes comprende o consiste en, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV; y (c) un fragmento que comprende o consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO: 2, y al menos una, preferentemente una, de las proteínas quiméricas diferentes, preferentemente 2 proteínas quiméricas, diferentes, comprende o consiste en, de N-terminal hacía C-terminal, (a) un fragmento que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende al menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV, en el cual dicho polipéptido heterólogo difiere en su secuencia y tipos de HPV del polipéptido heterólogo de la otra al menos una proteína quimérica; y (c) un fragmento que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO: 2.
En un aspecto de la divulgación de una composición que comprende más de una proteína quimérica, diferente, preferentemente 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas, los polipéptidos heterólogos son como se definen en el presente documento. En un aspecto de la divulgación, cada polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, en el cual cada polipéptido heterólogo tiene una secuencia que es diferente del otro u otros polipéptidos heterólogos.
En un aspecto de la divulgación, la composición comprende 2 tipos de proteínas quiméricas, el polipéptido heterólogo del primer tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, y el polipéptido heterólogo del segundo tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un quinto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un sexto tipo de HPV, en la cual el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, y sexto tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En un aspecto de la divulgación, el primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV (a) se eligen de entre HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52, y HPV58 o (b) se eligen de entre HPV16, HPV18 y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52.
En un aspecto de la divulgaciónr, el primer, segundo y tercer tipos de HPV son HPV16, HPV18 y HPV45. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36. En un aspecto de la divulgación, dicha proteína quimérica comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67. A estos aspectos, se puede asociar un cuarto subtipo de HPV, el cual se elige entre HPV33 o HPV58.
En un aspecto de la divulgación, independientemente o en combinación con la realización referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto y quinto sexto tipos de HPV son HPV31, HPV52 y HPV58. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 o 44.
En un aspecto de la divulgación, independientemente o en combinación con la realización referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son HPV31, HPV33 y HPV52. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 46 o 48. En un aspecto de la divulgación, dicha proteína quimérica comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en los cuales la secuencia como se indica en la SEQ ID No: 34 o 36 ha sido remplazada con la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42, 44, 46 o 48.
La divulgación describe la combinación de los antígenos antes recitados de los subtipos de HPV especificados, cuando estos antígenos son provistos en las proteínas quiméricas en un orden correspondiente al orden o cita especificada anteriormente de los subtipos de HPV o de manera alternativa en cualquier otro orden de presentación de los antígenos en las proteínas quiméricas que pudiera corresponder a cualquier combinación del primero, segundo, tercero, y opcionalmente cuarto HPV entre aquellos citados y en particular entre los grupos de HPV16, HPV18 y HPV45 o HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33 y HPV52.
En un aspecto de la divulgación, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son (a) HPV16,
HPV18, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente o (b) HPV16, HPV18, y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera proteína quimérica y de los HPV31, HPV52, HPV58 para la segunda proteína quimérica. En otro aspecto de la divulgación, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera proteína quimérica y de los HPV31, HPV33, HPV52 para la segunda proteína quimérica. En un aspecto de la divulgación, los antígenos de HPV así definidos se insertan en las proteínas quiméricas en el orden especificado.
En un aspecto de la divulgación, la composición comprende 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas, el polipéptido heterólogo del primer tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N-terminal, un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, y el polipéptido heterólogo del segundo tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un quinto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de E7 de un sexto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la siguiente solicitud de la proteína E7 de un séptimo tipo de HPV, en los cuales, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, y séptimo tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En un aspecto de la divulgación, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste en (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16, HPV18 y HPV45, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52, (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 y (f) HPV16, HPV18, HPV45, HPV33, HPV31, HPV52 y HPV58.
En un aspecto de la divulgación, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45. En una realización particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 50 o 52. En un aspecto de la divulgación, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo que comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 54 o 56. En una realización particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV31, HPV33, HPV52, y HPV58 . En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40 o 42. En una realización particular, dicha primera proteína quimérica comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en la cual la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 40, 42, 50, 52, 54 o 56.
En un aspecto de la divulgación, independientemente o en combinación con la realización que se refiere a los HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58 como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV16, HPV18 y HPV45. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36. En un aspecto de la divulgación, dicha segunda proteína quimérica consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67.
En un aspecto de la divulgación, independientemente o en combinación con la realización que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33, y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33, HPV52. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42 o 44. En un aspecto de la divulgación, independientemente o en combinación con la realización que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPv 33 y HPV52. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido heterólogo comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 46 o 48. En un aspecto de la divulgación, dicha segunda proteína quimérica comprende o consiste en la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 58, 61, 64 o 67, en la cual la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 34 o 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 42, 44, 46 o 48.
En un aspecto de la divulgación, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste en (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16 HPV18 y HPV45 respectivamente, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33 respectivamente, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52 respectivamente y (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
La cantidad de proteina o proteínas quiméricas que se va administrar (dosis) depende del individuo a ser tratado, incluyendo considerar la condición del paciente, el estado del sistema inmune del individuo, la vía de administración y el peso del hospedador. Las dosis convencionales varían de 1 a 2400 |jg, 100 a 2000 |jg, 200 a 1000 |jg, 500 a 1000 jg. Una dosis particular se selecciona a partir del grupo que consiste en 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 o 2400 jg ± 10%. En otra realización, las dosis convencionales varían de 1 a 100 jg, 1 a 50 jg y 1 a 10 jg de polipéptido o polipéptidos portados por el vector. La dosis total para el tratamiento completo con el ingrediente activo de la invención varía desde 200 hasta 2400 jg, 300 a 2000 jg, 400 a 1000 jg, 500 a 800 jg. Estos ejemplos pueden ser modificados por un experto en la técnica, dependiendo de las circunstancias.
La invención también está dirigida a una proteína quimérica de la invención o una composición de la invención, para uso como un medicamento. En una realización particular, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para uso en la profilaxis o tratamiento de una infección de patógeno por HPV. En otra realización, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para su uso en la profilaxis o el tratamiento de un trastorno oncogénico relacionado con una infección por HPV. En una realización particular, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para uso en la inducción de una respuesta inmune profiláctica o de una respuesta inmune terapéutica contra HPV.
En un aspecto, la divulgación describe un método para el tratamiento terapéutico de un animal o un paciente humano que se presenta con una infección con un patógeno o que se sospecha tiene una infección por patógenos que comprende (a) la administración de una proteína quimérica o una composición en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
En otro aspecto, la divulgación describe un método para el tratamiento terapéutico de un animal o un paciente humano que se presenta con trastornos de tumor que comprende (a) la administración de una proteína quimérica o una composición en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
La divulgación también describe un método para prevenir una infección por patógeno de un animal o un paciente humano que comprende (a) la administración de una proteína quimérica o una composición en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples.
La divulgación también describe un método para prevenir la aparición o desarrollo de trastornos de tumor en un animal o un paciente humano que comprende (a) la administración de una proteína quimérica o una composición en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
Un tratamiento terapéutico descrito está dirigido a mejorar la condición clínica de un animal o paciente humano en necesidad de lo mismo, que ha sido diagnosticado como infectado o se sospecha que está infectado por un patógeno o que padece de un estado patológico. En un aspecto de la divulgación, este tratamiento está dirigido a la eliminación del agente u organismo causante de la enfermedad, o a disminuir la abundancia de dicho agente u organismo. En una situación de infección viral, el tratamiento puede dar como resultado un decremento significativo de la carga viral en los tejidos elegidos como blanco del hospedador que sea menor de lo que se pueda detectar cuando se midió. En caso de trastornos tumorales, el tratamiento puede dar como resultado una disminución del tamaño o del desarrollo del tumor o tumores, o la erradicación de las células de tumor, o la reducción del número de células de tumor a un nivel que sea menor que lo que se puede detectar cuando se midió. El tratamiento terapéutico también está dirigido a mejorar la condición clínica del animal o paciente humano, eliminando o disminuyendo los síntomas asociados con la infección por patógeno o los trastornos de tumor, y preferentemente está dirigido a restaurar la salud.
Un tratamiento profiláctico de un animal o un paciente humano está dirigido a prevenir la infección por patógeno de dicho animal o un paciente humano, o prevenir la aparición o desarrollo de trastornos tumorales neoplásicos, o prevenir la ocurrencia de un estado patológico en dicho animal o paciente humano. El tratamiento profiláctico abarca vacunación.
Los tratamientos terapéuticos y profilácticos, utilizando una proteína quimérica o una composición de la invención, se basan en la provocación de una respuesta inmune eficiente, preferentemente una respuesta inmune celular, contra el epítopo o epítopos contenidos en el polipéptido heterólogo en el hospedador.
Por lo tanto, la invención también está dirigida al uso de una proteína quimérica o una composición de la invención para inducir o provocar una respuesta inmune, preferentemente una respuesta inmune celular (tal como una respuesta de CTL) contra el epítopo o epítopos contenidos en el polipéptido heterólogo, en el hospedador al cual se administra dicha proteína quimérica o composición.
En una realización particular, la invención también se dirige a una proteína quimérica o composición de la invención
p a r a u s o ( i ) e n e l t r a t a m ie n t o in m u n o t e r a p é u t i c o d e la ( s ) p r im e r a ( s ) c o n d ic ió n o c o n d i c io n e s p a t o l ó g ic a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) d i a g n o s t i c a d a ( s ) e n u n h o s p e d a d o r m a m í f e r o p r o v o c a n d o u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e c é l u la T c o n t r a u n p r im e r g r u p o d e e p í t o p o s c o n t e n i d o s e n e l p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o y ( i i ) e n la p r o f i l a x is c o n t r a la ( s ) s e g u n d a ( s ) c o n d ic ió n o c o n d i c io n e s p a t o l ó g i c a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) e n e l m is m o h o s p e d a d o r m a m í f e r o p r o v o c a n d o u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e m e m o r i a d e c é l u la T c o n t r a u n s e g u n d o g r u p o d e e p í t o p o s d e c o n t e n i d o s e n d i c h o p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o , d i c h a s r e s p u e s t a s in m u n e s s e o b t ie n e n d e s p u é s d e la a d m in i s t r a c i ó n d e d i c h a p r o t e í n a q u i m é r i c a o d i c h a c o m p o s i c ió n e n d i c h o h o s p e d a d o r , e n la c u a l d i c h a p r o f i l a x is c o n t r a la ( s ) s e g u n d a ( s ) c o n d ic ió n o c o n d ic io n e s p a t o l ó g i c a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) n o s e o b s e r v a c u a n d o d i c h o s e g u n d o g r u p o d e e p í t o p o s n o e s t á c o n t e n i d o e n d i c h o p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o .
E n e f e c t o , lo s i n v e n t o r e s h a n d e m o s t r a d o q u e la p r o t e í n a q u i m é r i c a d e la in v e n c ió n p e r m i t e e v i t a r la c o m p e t e n c i a q u e e x i s t e e n t r e e p í t o p o s d i f e r e n t e s , y a s e a c o n r e s p e c t o a l a c c e s o a la A P C , p r o c e s a m ie n t o y p r e s e n t a c i ó n p o r p a r t e d e la A P C y d i s p o n i b i l i d a d d e c i t o c in a s . P o r lo t a n t o , u t i l i z a n d o la p r o t e í n a q u i m é r i c a d e la i n v e n c ió n e s p o s ib le in d u c i r u n a r e s p u e s t a i n m u n e c o n t r a e l p r im e r g r u p o d e e p í t o p o s d e n t r o d e u n t r a t a m ie n t o t e r a p é u t i c o e in d u c i r t a m b ié n u n a r e s p u e s t a i n m u n e in d u c id a c o n t r a e l s e g u n d o g r u p o d e e p í t o p o s d e n t r o d e u n t r a t a m ie n t o p r o f i lá c t i c o . P o r lo t a n t o , la p r o t e í n a q u i m é r i c a d e la in v e n c ió n e s e f i c i e n t e p a r a p r o v o c a r u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e c é l u la T d e n t r o d e u n t r a t a m ie n t o in m u n o t e r a p é u t i c o d e la ( s ) p r im e r a ( s ) c o n d ic ió n o c o n d i c io n e s p a t o l ó g ic a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) d i a g n o s t i c a d a ( s ) e n u n h o s p e d a d o r y d e p r o v o c a r u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e m e m o r i a d e c é l u la T d e n t r o d e la p r o f i l a x is c o n t r a e l r ie s g o d e la ( s ) s e g u n d a ( s ) c o n d ic ió n o c o n d i c io n e s p a t o l ó g i c a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) e n e l m is m o h o s p e d a d o r .
Ejemplos
I. M a t e r i a le s y m é t o d o
R a to n e s
S e a d q u ie r e n r a t o n e s d e g é n e r o f e m e n in o ( H - 2 ) C 57 B L / 6 d e s e i s s e m a n a s d e e d a d d e J a n v i e r L a b o r a t o r ie s . L o s r a t o n e s s e a lo ja n b a jo c o n d i c io n e s l i b r e s d e p a t ó g e n o s c o n a g u a y c o m id a a d lib itum . L o s p r o c e d i m i e n t o s q u e im p l i c a n a n i m a le s y s u c u i d a d o s e a ju s t a n a la s p a u t a s d e G e n t i c e l q u e c u m p le n c o n la s le y e s y p o l í t i c a s n a c i o n a l e s e i n t e r n a c i o n a l e s y q u e s o n r e v is a d a s p o r e l c o m i t é d e é t i c a lo c a l .
P a r a a l g u n o s d e lo s t i p o s d e H P V u t i l i z a d o s e n la p r e s e n t e in v e n c ió n , t a m b ié n s e p u e d e n u t i l i z a r d e m a n e r a c o n v e n ie n t e o t r o s r a t o n e s , lo s c u a l e s t ie n e n u n f o n d o g e n é t i c o d i f e r e n t e . D i c h o s r a t o n e s s e p u e d e n a d q u i r i r d e J a n v i e r la b o r a t o r i o s e in c lu y e n D B A / 2 J R i ( H 2 K d/ H 2 D d ), o C B A / J R i ( H 2 K k/ H 2 D k) S J L / J R i ( H 2 K s/ H 2 D s) y F V B / N R i ( H 2 K q/ H 2 D q ).
O t r o s r a t o n e s t a le s c o m o lo s r a t o n e s h u m a n i z a d o s q u e t i e n e n u n H L A e n p a r t i c u l a r u n h a p lo t ip o H L A - A 2 t a m b ié n s o n d e in t e r é s p a r a d e t e r m i n a r la r e s p u e s t a in m u n e p r o v o c a d a p o r la s c o n s t r u c c io n e s d e la in v e n c ió n . L o s r a t o n e s t r a n s g é n i c o s H L A - A 2.1 s e p u e d e n c o m p r a r d e T A C O N I C ( E . U . A . ) p a r a p r o b a r la i n m u n o g e n i c id a d d e lo s c a n d id a t o s d e v a c u n a d e s c r i t o s c o n t r a c a d a E 7 p r o v e n i e n t e d e lo s t i p o s d e H P V s e l e c c io n a d o s e n r a t o n e s q u e e x p r e s a n e l h a p lo t ip o H L A - A 2.1.
E s t o s r a t o n e s s e u t i l i z a n p a r a a n a l i z a r la i n m u n o g e n i c id a d d e la s v a c u n a s c a n d id a t a s d e s c r i t a s c o n t r a c a d a E 7 p r o v e n i e n t e d e lo s t i p o s d e H P V s e l e c c io n a d o s .
L í n e a s d e c é l u la s d e t u m o r
S e p r e p a r a n c é l u la s d e t u m o r T C - 1 ( c u l t i v o d e t e j i d o n ú m e r o u n o ) [ 19 ] m e d ia n t e t r a n s f o r m a c ió n d e c é l u la s d e p u lm ó n d e r a t ó n p r im a r ia s C 57 B L / 6 c o n lo s o n c o g e n e s E 6 y E 7 d e H P V 16 y e l o n c o g é n c - H a - R a s a c t i v a d o d e h u m a n o . L a s c é l u la s u t i l i z a d a s e n e s t e e s t u d i o s e o b t ie n e n d e l A T C C . L a s c é l u la s T C 1 s e d e s c o n g e la n a n t e s d e c a d a e x p e r i m e n t o y d e s p u é s s e c u l t i v a n y e x p a n d e n in v itro d u r a n t e a l m e n o s 10 d í a s a n t e s d e la in y e c c ió n .
E l c a r c in o m a d e p u lm ó n d e L e w is ( L L 2 ) e s u n a l í n e a c e l u la r e s t a b l e c id a a p a r t i r d e l p u lm ó n d e u n r a t ó n C 57 B L / 6 q u e p o r t a u n t u m o r q u e r e s u l t a d e u n a im p l a n t a c ió n d e c a r c in o m a d e p u l m ó n d e L e w is p r im a r io ( 13 ) . E s t a l í n e a e s a m p l i a m e n t e u t i l i z a d a c o m o u n m o d e l o p a r a m e t á s t a s i s y e s ú t i l p a r a e s t u d i a r lo s m e c a n i s m o s d e t e r a p ia p a r a c á n c e r ( 14 ) . L a l í n e a d e c é l u la d e t u m o r L L 2 s e a d q u ie r e d e l A T C C ( C R L - 1642 ) .
E s t a s c é l u la s s e t r a n s d u c e n c o n v e c t o r e s le n t i v i r a l e s q u e p o r t a n lo s g e n e s d e E 7 d e H P V 18 y G F P o s o l a m e n t e e l g e n d e G F P d e c o n f o r m i d a d c o n e l p r o t o c o lo d e l f a b r i c a n t e ( V e c t a ly s , L a b é g e , F r a n c ia ) . S e s e l e c c io n a n 3 c lo n e s t o m a n d o c o m o b a s e la e x p r e s i ó n d e M H C c la s e I, G F P , y E 7. S e s e l e c c io n a u n c lo n d e s p u é s d e s e l e c c ió n p r o f i l á c t i c a in v ivo d e c o n f o r m i d a d c o n s u p e r f i l d e c r e c im ie n t o y s u c a p a c id a d p a r a s e r e l e g id a c o m o b la n c o p o r p a r t e d e l i n f o c i t o s C D 8 T c i t o t ó x i c o s e s p e c í f i c o s d e E 7 d e H P V 18 ; s e e f e c t ú a u n e x p e r i m e n t o d e v e l o c id a d d e t o m a p a r a e l n ú m e r o ó p t im o d e i n o c u la c ió n d e c é lu la s . L o s e s t u d i o s d e s e l e c c ió n in vivo, v e l o c id a d d e t o m a y t i e m p o id e a l d e t r a t a m ie n t o f u e r o n r e a l i z a d o s p o r O n c o d e s i g n ( D i jo n , F r a n c ia ) . L a s c é l u la s L L 2 s e d e s c o n g e la n a n t e s d e c a d a e x p e r i m e n t o y d e s p u é s s e c u l t i v a n y e x p a n d e n in v itro d u r a n t e a l m e n o s 10 d í a s a n t e s d e la in y e c c ió n .
Las células B16-IRES-GFP-OVA (B16-GFP) y B16- MAGEA3-IRES-GFP-OVA (B16-MAGEA3-GFP) se utilizan para volver a estimular ex vivo los esplenocitos obtenidos a partir de los ratones tratados. Las células B16-MAGEA3 son células de tumor singenéicas B16-F10 transducidas por Vectalys con para expresar la proteína MAGE-A3. La expresión de GFP normalmente está vinculada en la expresión de la proteína MAGE-A3.
Inoculación de células de tumor
En el día 0, los ratones C57BL/6 se inyectan con células TC-1 (1 x106 células por ratón diluidas en 100 pl de PBS 1 X por vía subcutánea en el flanco derecho. En algunos experimentos los ratones se inyectan en el día 65 con células LL2-GFP o LL2-HPV18 E7-GFP diluidas en 100 pl de PBS 1 X por vía subcutánea en el flanco izquierdo.
Vacuna
Construcción y purificación de CyaA-HPV16 E7a3q-42 (C16-1) y CyaA-HPV18 E7a32-42 (C18-1) recombinantes La construcción y purificación ya fueron descritas en el documento EP1 576 967 B1. Las dos masas finales de CyaA-HPV16 E7a30-42 (C16-1) (Figura 1A) y CyaA-HPV18 E7a32-42 (C18-1) (Figura 1B) se mezclan en Genticel a una relación 1:1 para producir la composición bivalente llamada ProCervix la cual después se almacena a -80°C en alícuotas.
Construcción y purificación de vacunas basadas en gtCyaAd93 y gtCyaAd203
La secuencia de ADN de CyaA de tipo silvestre (CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1) se optimiza y sintetiza (GeneCust) para la expresión en E. coli. La secuencia de ADN optimizada se nombra gtCyaA. Esta secuencia porta los siguientes sitios de restricción únicos que se agregan para facilitar la inserción de la secuencia antigénica en el dominio catalítico de CyaA: Nde I (CATATG) , BamH I (GGATCC), EcoR I (GAATTC), EcoR V (GATATC), Pci I (ACATGT), Bcl I (TGATCA), Age I (ACCGGT) , Xma I (CCCGGG), Nco I (CCATGG).
La gtCyaA se inserta después en el plásmido pGTPc608 que contiene un promotor inducible pTAC (plásmido provisto por GTP Technology, Labége, Francia).
Se analizan dos mutantes por deleción: una deleción de 93 aminoácidos desde la posición 228 hasta la posición 320 de CyaA de B. pertussis y una deleción de 203 aminoácidos desde la posición 184 hasta la posición 386 de CyaA de B. pertussis. La primera deleción de 93 restos elimina el dominio que interactúa con calmodulina (dominio III). La segunda deleción de 203 restos elimina los dominios II y III.
Las deleciones de 93 y 203 aminoácidos en gtCyaA se generan mientras se están insertando los antígenos.
La purificación de cada proteína expresada se logra utilizando procedimientos de cromatografía; en particular se efectúan técnicas de cromatografía de afinidad por intercambio iónico y cromatografía de intercambio hidrofóbico. Construcción y purificación de gtCyaAd93-pep216- CyaCopt y gtCvaAd203-pep216-CvaCopt
Todos los antígenos fueron sintetizados por DNA 2.0. (E.U.A.) o Genecust (Alemania) y la clonación fue realizada por Solvías, Suiza. Una representación esquemática de gtCyaAd93-pep216-CyaACopt y gtCyaAd203- pep216-CyaACopt se da en las Figuras 3A y 3B.
Las cepas bacterianas BLR se someten a electroporación con cada plásmido respectivamente. Las bacterias transfectadas se hacen crecer en medio clásico y las producciones se inducen por adición de IPTG.
La purificación de cada proteína expresada se logra utilizando procedimientos de cromatografía; en particular se efectúan técnicas de cromatografía de afinidad por intercambio iónico y cromatografía de intercambio hidrofóbico. Construcción de CyaAd203-pep105
La proteína CyaAd2 03-PEP105opt está constituida por una secuencia de adenilato ciclasa con 203 aminoácidos eliminados, que contiene, como un inserto antigénico, el polipéptido 105 (PEP105). La secuencia optimizada de CyaA se clona en el plásmido pKTRACE como se describió previamente en los sitios de restricción Ndel y BamHI. Se sintetiza el antígeno Pep105 y se clona entre los sitios de restricción EcoRI y XmaI. El protocolo de purificación ya fue descrito en el documento EP1 576 967 B1. Una representación esquemática de pKTRACE CyaAd203-pep105opt se da en la Figura 4.
El polipéptido pep105 (SEQ ID NO: 24) comprende de N-terminal hacia C-terminal los siguientes antígenos. Algunos antígenos están fusionados mientras que otros están separados mediante enlazador. Un enlazador particular (dipéptido AS) se introduce antes de la secuencia GVNHQHl para generar un epítopo restringido por MHC clase I
fuerte de múrido (restringido con H-2 ) para calibración de la respuesta inmune (en negritas):
- sitios de restricción: MGIR
- GFP11: SRDHMVLHEYVNAAGIT
- enlazador: GSDR
- MOG35-55 : MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
- OVA257 -264 (péptido restringido con MHC clase I proveniente de la proteína ovoalbúmina): SIINFEKL
- IE191 -110 : VRVDMVRHRIKEHMLKKYTQ
- CLA4-TCR H-2Kd HA512 -520 : IYSTVASSL
- enlazador: SGEK
- OVA323 -339 (péptido restringido con MHC clase II): ISQAVHAAHAEINEAGR
- MELAN-A26 -35 : ELAGIGILTV
- HA307 -319 : PKYVKQNTLKLAT
- GP33-41 restringido con LCMV H2-Db: KAVYNFATC
- sitios de restricción: SG
- MAGEA311-180:RKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQ YFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFAT
- MAGEA3244-285 : KLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVK
- sitios de restricción: TG
- HPV16E7 (secuencia truncada): MHGDTPTLHEYMLDLQP
ETTDLYCYEQLNGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGT LGIVCPICSQKP
- HPV18E7 (secuencia truncada): MHGPKATLQDIVLHLEP QNEIPVDLLCHEQLSASGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLR AFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
- sitios de restricción: LKGP
Administración de la vacuna
E n e l d í a 11 , d e s p u é s d e m e d i r e l t u m o r , lo s r a t o n e s c o n t u m o r e s s ó l id o s d e t e c t a b le s s e v a c u n a r o n m e d ia n t e in y e c c ió n i n t r a d é r m ic a ( i . d . ) e n la d e r m is d e la s o r e ja s ( a m b a s o r e ja s s e in y e c t a r o n ) .
M o lé c u la s d e c o a d y u v a n t e
M e d ic i ó n d e t u m o r
S e t o m a n e n c u e n t a d i f e r e n t e s p a r á m e t r o s p a r a e v a l u a r e l d e s a r r o l l o d e t u m o r e n lo s r a t o n e s :
o T a m a ñ o d e l t u m o r : L o s t u m o r e s s e m id e n m a n u a l m e n t e u t i l i z a n d o u n c a l i b r a d o r d o s v e c e s p o r s e m a n a c o m e n z a n d o 5 d í a s d e s p u é s d e la i n o c u la c ió n d e c é l u la s d e t u m o r y h a s t a e l d í a 60. E l v o l u m e n d e l t u m o r s e c a l c u la d e s p u é s d e la s i g u ie n t e m a n e r a : v o l u m e n = lo n g i t u d x a n c h u r a 2 ) /2.
o S u p e r v i v e n c i a d e lo s r a t o n e s : p o r r a z o n e s é t i c a s s e s a c r i f i c a n lo s r a t o n e s q u e d e s a r r o l l a n t u m o r e s a n o r m a lm e n t e im p o r t a n t e s ( l í m i t e d e t a m a ñ o : 2000 m m 3 ) y / o n e c r ó t i c o s , o c o n d i s m i n u c ió n e n la m o v i l i d a d i n d u c id a p o r t u m o r .
o N ú m e r o d e r a t o n e s s in t u m o r e s : E s t a in f o r m a c ió n in d ic a c u a n d o la v a c u n a c ió n t e r a p é u t i c a h a i n d u c id o u n a r e g r e s ió n c o m p le t a d e l t u m o r ( a u s e n c i a d e t u m o r p a lp a b le ) .
Medición de respuestas citotóxicas de memoria de célula T CD8
E l m é t o d o p a r a m e d i r la c i t o t o x ic i d a d d e c é l u la s T C D 8 in v i v o h a s id o d e s c r i t o e x h a u s t i v a m e n t e [ 22 , 23 ] . B r e v e m e n t e , lo s e s p l e n o c i t o s s i n g e n é i c o s p r o v e n i e n t e s d e r a t o n e s s in t r a t a m ie n t o s e m a r c a n c o n c o n c e n t r a c i o n e s d i f e r e n t e s d e C F S E ( é s t e r s u c c i n im id í l i c o d e c a r b o x i f l u o r e s c e í n a , M o le c u la r P r o b e s I n v i t r o g e n ) y y a s e a q u e s e p u l s e n in v i t r o c o n lo s p é p t i d o s r e le v a n t e s o s e d e je n s in p u ls a r . L a s p o b la c i o n e s d e c é l u la s d i a n a t a n t o p u l s a d a s c o n p é p t i d o c o m o s in p u l s a r s e t r a n s f i e r e n a d o p t i v a m e n t e p o r v í a i n t r a v e n o s a e n lo s h o s p e d a d o r s v a c u n a d o s s in g e n é i c o s y s e m id e la p é r d i d a d e o b j e t i v o s p u l s a d o s c o n p é p t i d o m e d ia n t e c i t o m e t r í a d e f lu j o ( B D F A C S C a n t o I I) e n e l b a z o . E l p o r c e n t a j e d e a n i q u i la c i ó n s e c a l c u la a p a r t i r d e la r e d u c c i ó n e n la r e la c ió n d e l p o r c e n t a j e d e c é l u la s d i a n a p u l s a d a s a c é l u la s n o p u l s a d a s , s e c o r r i g e u t i l i z a n d o la r e la c i ó n in ic ia l ( v é a s e m á s a d e la n t e ) . L a s p r e p a r a c i o n e s c e l u la r e s s e a n a l i z a n m e d ia n t e c i t o m e t r í a d e f lu j o a n t e s d e la i n y e c c ió n p a r a m o n i t o r e a r e l m a r c a d o c o n C F S E d e la s d i f e r e n t e s c é l u la s d i a n a y o b t e n e r v a l o r e s d e r e f e r e n c ia ( p o r c e n t a je r e a l d e c a d a p o b la c i ó n c e l u la r ) p a r a e l c á l c u lo d e l p o r c e n t a j e d e a n i q u i la c i ó n in v iv o . L a s t r e s p o b la c i o n e s d e c é l u la s d i a n a s e i n y e c t a n d e s p u é s p o r v í a in t r a v e n o s a a u n a r e la c i ó n 1 :1 :1 a c a d a u n o d e lo s r a t o n e s v a c u n a d o s . E l p o r c e n t a j e d e a n i q u i l a c i ó n in v i v o s e c a l c u la c o m o s e d e s c r ib e e n a lg u n a o t r a p a r t e c o n la s i g u ie n t e f ó r m u l a [ 24 ] :
PORCENTAJE DE ANIQUILACIÓN = 100-([% de péptido pulsado en los vacunados/% de no pulsados en los vacunados)/(% de péptido pulsado antes de la inyección/% de no pulsados antes de la inyección)] x 100)
Prueba ELISpot de IFN-y (inmunomancha ligada a enzima)
Las frecuencias de células T CD8+ específicas productoras de IFN-y se evalúan mediante una reestimulación ex vivo de los esplenocitos con cualquiera de péptidos restringidos con H-2 (HPV16E749-57 y HPV18E7a s 43-4 9 ) o banco de péptido de la proteína E7 de HPV45. Esto se logra efectuando una prueba ELISpot de IFN-y:
o La prueba ELISpot se efectúa en esplenocitos combinados de ratones.
Brevemente, los esplenocitos totales obtenidos a partir de ratones vacunados se dejan sin estimular o se reestimulan durante 20 horas a 37oC, 5% de CO2 con 1 pg/ml de cada péptido como se describe a continuación:
o 1x106 células/cavidad con el péptido HPV16E749-57 (epítopo relevante restringido con H-2 )
o 1x106 células/cavidad con 0 VA257 -264 (epítopob irrelevante restringido con H-2 )
o 0.25x106 células/cavidad con HPV18 E7AS43-49b(epítopo relevante restringido con H-2 )
o 1x106 células/cavidad con el banco de péptido de E7 de HPV45.
Para el experimento con la CyaAd203-PEP105opt, se utilizan estimulaciones antigénicas adicionales:
o banco de péptidos n.°116-2/3 (5 pg/ml): combinado de n.°116-2 y n.°116-3 (1x106 células por cavidad) o banco de péptidos n.°171 (3 pg/ml): combinado de n.°171-1, n.°171-2 y n.°171-3 (1x106 células por cavidad) o -OVA323 -339 , péptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (1x106 células por cavidad)
o -LCMV GP33-4i, péptido restringido con MHC-clase I utilizado a 1 pg/ml (1x106células por cavidad)
o -MOG35 -55 , péptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (1x106células por cavidad)
o -proteína MAGEA3 (TAA 002_MAGE-3) marcado con histidina producido en Genticel, utilizada a 10 pp/ml. o -Esplenocitos: las células B16-GFP (que expresan o no a MAGEA3) se co-cultivan a una relación de 19:1 (950000 esplenocitos: 50000 células B16).
La secreción de IFN-y se monitorea mediante una ELISpot basada en emparedado que se revela mediante BCIP/NBT utilizando estreptavidina-AKP. Los datos se analizan en un aparato Bioreader 5000-Pro S (Biosys).
II. Resultados
A. Confirmación de la capacidad de los nuevos vectores de la invención para inducir respuesta inmune
contra un antígeno modelo
Con el fin de confirmar la eficiencia de los nuevos vectores de la invención en sus capacidades para suministrar antígenos grandes y multi-epitópicos, se diseña un antígeno modelo con 441 aminoácidos (SEQ ID NO:24).
Los ratones se vacunan con la proteína CyaAd203- pep105opt, en el día 0 y se sacrifican en el día 7, se recolectan los bazos y se aíslan los esplenocitos. Utilizando estas células, se miden las respuestas mediadas por célula T utilizando pruebas ELISpot de IFN-y e IL-2. Los ratones vacunados con ProCervix se utilizan como controles positivos para inducción de respuestas de célula T específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 y como control negativo para los otros antígenos los cuales son solamente suministrados por la proteína CyaAd203-PEP105opt. Todas las vacunas se coadyuvan mediante co-inyección de Poli-ICLC.
A.1.Inducción de respuestas de IFN-v específicas de E7 de HPV16, E7 de HPV18 y OVA257-264
La Figura 5 ilustra los resultados obtenidos después de re-estimulación con los péptidos restringidos con la clase I HPV16 E749 -57 , HPV18 E7a s 43-49 y OVA257 -264 y con bancos de péptidos de 15-meros de E7 de HPV16 (n.°116-2/3) y E7 de HPV18 (n.°171-1/2/3). Se pueden sacar las siguientes conclusiones:
- No se detectan respuestas inmunes específicas de antígenos en el grupo de ratones vacunados con Placebo coadyuvado con Poli-ICLC.
- Respecto al grupo de ratones vacunados con la vacuna Procervix coadyuvada con Poli-ICLC, cualquiera que sea la re-estimulación, se obtienen los resultados esperados:
- la re-estimulación in vitro con péptidos restringidos con la clase I HPV16E749-57 y HPV18E7a s 43-49 induce respuestas claras de IFN-y específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18;
- no hay respuesta específica obtenida con la reestimulación con OVA257 -264 ;
- la intensidad de las respuestas de IFN-y específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 obtenidas con los bancos de péptidos (n.°116-2/3 y n.°171-1/2/3) son cercanas al nivel de las respuestas obtenidas con los
péptidos restringidos con MHC-clase I (HPV16E749-57 , HPV18 E7a s 43-4 9 ).
- Con respecto a los ratones vacunados con la proteína CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con Poli-ICLC, la detección de respuestas de IFN-y específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 con los bancos de péptido tanto de E7 de HPV16 como de E7 de HPV18 (n.°116-2/3 y n.°171-1/2/3) y todos los y todos los péptidos restringidos con MHC clase I analizados para Procervix: HPV16E749-57 , HPV18E7a s 43-49 y también con el péptido OVA257 -264 . Estos resultados muestran que la re-estimulación ex vivo con todos estos péptidos diferentes fue capaz de re estimular las células T específicas de antígeno E7 de HPV18, E7 de HPV16 y OVA257-264 provocado por la vacunación intradérmica de CyaAd203-PEP105opt.
A. 2. Inducción de respuestas de IFN-y mediadas por células T específicas para los antígenos OVA323 -339. LCMV GP33-41, MOG35-55 y MAGEA3
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos después de diferentes tipos de re-estimulación ex vivo:
- OVA323 -339 , péptido restringido con MHC-clase II
- LCMV GP33-4i, péptido restringido con MHC-clase I
- MOG35 -55 , péptido restringido con MHC-clase II
- proteína MAGEA3 marcada con Histidina.
- Se utilizan células de tumor B16-MAGEA3-GFP como APC para estimular las células T CD8+ específicas de antígeno a través de la presentación de epítopos restringidos con MHC-clase I que resultan del procesamiento endógeno de la proteína MAGE-A3. Las células B16-GFP que no expresan la proteína MAGE-A3 se analizan también como un control negativo para la especificidad de la respuesta inmune de MAGEA3.
Se puede observar que para todos los grupos. la proteína MAGE-3 marcada con histidina induce la misma respuesta no específica.
Para los ratones vacunados con placebo coadyuvado con poli-ICLC o Procervix coadyuvado con poli-ICLC, no se detectan respuestas inmunes hacia estos antígenos.
Para los ratones vacunados con la proteína CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con poli-ICLC, las células T secretoras de IFN-y específicas de antígeno se detectan después de re-estimulación con los péptidos OVA323 -339 , GP33 -42 y MOG35 -55 , pero también después de re-estimulación con células B16-GFP y B16-MAGEA3-GFP.
Estos resultados muestran que la vacunación con CyaAd203-PEP105opt provoca células T específicas de antígeno OVA323 -339 restringido con 1-Ab, LCMV GP33 -42 y MOG35-55 restringidos con H-2D y GFP11.
Tomados juntos, estos resultados resaltan la eficiencia exquisita de vectores de vacuna basadas en CyaA para aumentar tanto células T CD4+ como células T CD8 específicas de antígeno fuertes en un modo multi-epitópico. Por desgracia, las respuestas específicas de MAGEA3 no se pudieron medir correctamente ya que se obtienen frecuencias similares de células T secretoras de IFN-y después de re-estimulación ex vivo con ambas líneas celulares: B16-GFP o B16-MAGEA3-GFP. Debido a que la proteína CyaAd203-PEP105opt incrusta el antígeno de GFP11, la inmunización con este vector de vacuna induce respuestas de célula T específicas de GFP las cuales enmascaran la respuesta de célula T específica de MAGEA3.
Este estudio resalta por primera vez la capacidad de un vector de vacuna de CyaA con 203 restos eliminados para inducir, en el mismo ratón vacunado, respuestas de célula T específicas de antígeno contra varios epítopos de célula T no relacionados. Además, estos resultados también muestran la capacidad exquisita de este vector de vacuna de CyaA con 203 restos eliminados para inducir respuestas de célula T tanto CD4+ como CD8+ (respuestas específicas detectadas contra péptidos restringidos tanto por MHC I como por MHC II).
B. Diseño de antígenos de HPV
Se seleccionan siete secuencias de E7 a partir de los 7 tipos de HPV de más alto riesgo (16, 18, 45, 31, 33, 52 y 58) tomando como base su prevalencia en mujeres con carcinoma de célula invasivo (ICC) y en mujeres infectadas por HPV pero con citología normal [9], [10]: variante de E7 de HPV16 (gi_30172006;la SEQ ID NO:25), variante de E7 de HPV18 (gi 167996747;la SEQ ID NO:26), variante de E7 de HPV31 (gi_148727610;la SEQ ID NO:27), variante de E7 de HPV33 (gi_257472286;la SEQ ID NO:28), variante de E7 de HPV45 (gi_549287;la SEQ ID NO:29), variante de E7 de HPV52 (gi_237861305;la SEQ ID NO:30) y variante de HPV58 (gi_191 11001;la SEQ ID NO:32). E7 está constituida dos dominios funcionales separados por una región ácida. Estos dominios han sido descritos exhaustivamente [11-13]. La parte N-terminal de la proteína contiene el motivo de unión a pRB (LXCXE) y la parte C-terminal de la proteína contiene el asa de dedo de zinc. La alineación de las proteínas E7 de HPV16, 18 y 45 se provee en la Figura 7A, y la alineación de las proteínas E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se provee en la Figura 7B.
Se elaboran dos antígenos recombinantes mediante fusión en cada una de las tres secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 respectivamente (con o sin las regiones ácidas). Además, se elaboran dos antígenos recombinantes mediante fusión de cuatro secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 respectivamente (con o sin las regiones ácidas). La presencia o no de la región ácida de cada E7 sigue el fundamento expuesto en el documento WO 2005089792, que sigue las reglas dictadas por la literatura. En efecto, las secuencias ácidas en CyaA han sido descritas como perjudiciales para la translocación normal del dominio catalítico de CyaA en el citosol [8]. Por lo tanto, en este caso las secuencias con y sin esta región permiten analizar la capacidad de los nuevos vectores de la invención (gtCyaAd93 y gtCyaAd203) para suministrar estos antígenos al citosol de las APCs.
Los antígenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 se han diseñado para generar vacunas con vector de CyaA trivalentes candidatas. Éstas secuencias tienen ya sea eliminada la región ácida o no tienen deleción (longitud completa) y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8a . Las secuencias de los dos antígenos candidatos trivalentes se modificaron adicionalmente para introducir un epítopo de múrido de célula T fuerte descrito en el documento WO 2005089792. Este epítopo se genera mediante inserción de un dipéptido de Alanina-Serina (AS) al inicio de la secuencia GVNHQHL de E7 de HPV 18, la cual está en la parte C-terminal de la proteína, flanqueando la región ácida.
Los antígenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se han diseñado para generar vacunas con vector de CyaA tetravalentes candidatas. Al igual que para los antígenos trivalentes, estas secuencias tienen eliminada la región ácida o no tienen deleción, y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8B.
Para cada candidato, se realiza una búsqueda respecto a la presencia de epítopo(s) que pudiera(n) inducir una respuesta contra proteínas de humano. De manera sorpresiva, la secuencia de tipo silvestre de E7 de HPV52 contiene en forma natural una secuencia que podría ser un epítopo autoinmune, un epítopo B*2705 (9-meros, MHC I). La secuencia de este epítopo es 100% idéntica a una secuencia de ITPR3 de humano (receptor de inositol 1,4,5-tri-fosfato, tipo 3). Para evitar este epítopo, la secuencia de E7 de HPV52 se modifica tomando como base la homología de secuencia con las proteínas E7 de los tipos de HPV 31, 33 y 58, para reemplazar una metionina por una leucina en la posición 84 y una leucina por una metionina en la posición 86 de la SEQ ID NO: 30 (la secuencia modificada es LRTLQQLLM). La secuencia de la proteína E7 de longitud completa modificada de HPV52 es como se indica en la SEQ ID NO: 31. Por lo tanto, la novedad de las secuencias de los antigenos tetravalentes se deriva del acomodo de la parte C-terminal y N-terminal de las proteínas E7, y de la presencia de las dos modificaciones efectuadas en la secuencia de E7 de HPV52.
La carga electrostática de estos antígenos particulares se calcula como se explicó anteriormente. Estos antígenos tienen una carga ácida inferior a -6 y portan respectivamente 21 cisteínas en los antígenos trivalentes y 28 cisteínas en los antígenos tetravalentes. Las características de estos antígenos se presentan en forma resumida en la Tabla 2.
Tabla 2 Características de diversos antígenos de HPV
Tamaño Carga Nombre y la SEQ ID Valencias de HPV
(restos) electrostática Pep216 Proteínas E7 de HPV16, 18 y 45 (trivalente), con
ido eliminado 276 -16
(SEQ ID NO:34) el dominio ác
Pep217 Proteínas E7 de HPV16, 18 y 45 de longitud
(SEQ ID NO:36) completa (trivalente) 311 -37 Pep233 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58
do eliminado 337 -13
(SEQ ID NO:38) (tetravalente), con el dominio áci
Pep234 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58 de longitud
(SEQ ID NO:40) completa (tetravalente), 392 -38
C. Deleciones grandes dentro del dominio catalítico de CyaA permiten la inserción de antígenos grandes y complejos
Se sintetiza el ADN de los antígenos trivalentes Pep216 y Pep217 y de los antígenos tetravalentes Pep233 y Pep234 y se clona en los nuevos vectores gtCyaAd93 y gtCyaAd203. Como controles, cada proteína E7 se inserta individualmente en gtCyaAd93, para ver si la secuencia de E7 de HPV31, 33, 45, 52 y 58 es problemática ya que nunca antes se habían insertado en una proteína CyaA.
Tabla 3 Características de las proteínas quiméricas de la invención (La secuencia de BTpr 114 es como se indica en
la SEQ ID NO: 58; la secuencia de BTpr 116 es como se indica en la SEQ ID NO: 61; la secuencia de BTpr 115 es como se indica en la SEQ ID NO: 64; la secuencia de BTpr 117 es como se indica en la SEQ ID NO: 67; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 131 es como se indica en la SEQ ID NO: 70; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 132 es como se indica en la SEQ ID NO: 71; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 133 es como se indica en la SEQ ID NO: 73; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 134 es como se indica en la SEQ ID NO:74; la secuencia del inserto de E7 de BTpr 120 es como se indica en la SEQ ID NO: 72)._______________ ... . , . Código de laValencia de los 3 Deleción de
candidatos . Especificidad de los antígenos
prot .eína gtCyaA (Vector)
BTpr114 93 Proteínas E7 de HPV16, 18, 45, dominio
ácido eliminado con el BTpr115 203 Proteínas E7 de HPV16, 18, 45, dominio
ácido eliminado con el Trivalente BTpr116 93 Proteínas E7 de HPV16, 18, 45 de
completa longitud BTpr117 203 Proteínas E7 de HPV16, 18, 45 de completa__________________________ longitud BTpr143 93 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58, con el dominio ácido eliminado
BTpr_144 203 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58, con el dominio ácido eliminado
Tetravalente BTpr145 93 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y longitud ,
completa 58 de BTpr146 203 Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y longitud ,
completa______________________ *58 de BTpr131 93 E7 de HPV31, con la región ácida eliminada BTpr132 93 E7 de HPV33, con la región ácida eliminada Monovalente BTpr 133 93 E7 de HPV52, con la región ácida eliminada BTpr134 93 E7 de HPV58, con la región ácida eliminada BTpr120 93 E7 de HPV45, con la región ácida eliminada
Se evalúa la producción y las características analíticas de estos antígenos monovalentes, trivalentes y tetravalentes. Por lo tanto, se efectúan Pre-bancos de célula maestra (pre-MCB) para cada construcción y se analizan respecto a inducción de las proteínas de interés con IPTG (Figura 9). Los candidatos monovalentes y trivalentes tienen un perfil normal después de inducción en análisis en gel de SDS-PAGE mientras que los candidatos tetravalentes muestran una banda débil en el tamaño esperado.
Este perfil se confirma para cada molécula ermentada en fermentador de 5 litros. Las características e las proteínas quiméricas producidas se presentan en orma resumida en la Tabla 4.
Tabla 4: Producción y características analíticas de proteínas quiméricas monovalentes, trivalentes y tetravalentes Código de de ática
laPureza % Contenido deContenido Actividad enzim
proteína LPS EU/mg HCP (prueba cAMP)
BTpr114 93 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr116 91 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr115 93 >100 y <500 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr117 90 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr143 11 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr 144 11 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_131 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr132 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_133 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Btpr_134 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Btpr 120 97 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Desde un punto de vista de producción, cuaiquiera que sea la deleción, las gtCyaAs con los antígenos monovalentes y trivalentes dan rendimiento y pureza aceptables (>90%), mientras que los candidatos tetravalentes tienen una pureza reducida (11% de la proteína de interés).
Considerando la pureza general cuando se comparan los candidatos que llevan la dimensión de 93 restos contra los candidatos con 203 restos eliminados, parece ser que estos últimos tienen un rendimiento inferior al de las construcciones de gtCyaAd93 (Btpr114 y Btpr_115). Esta diferencia es bastante sorpresiva ya que se esperaría que la gtCyaA más corta fuera más fácil de producir.
Ambos vectores con sus antígenos no tienen actividad enzimática lo que resalta que la deleción es suficiente para desintoxicar los vectores.
D. La producción de GtCyaAs con al menos 4 E7 es dependiente de la secuencia
Se investiga también si los resultados obtenidos con los candidatos tetravalentes se deben al número de secuencias de polipéptido E7 en la CyaA o a un ensamblado particular de las secuencias del polipéptido E7 en CyaA. Para dicho propósito, se analizan diversas construcciones (Tabla 5).
Tabla 5: Proteínas quiméricas con antígenos de HPV trivalentes y tetravalentes Código de Deleción de Tipos de HPV en el inserto Tamaño del proteína gtCyaA inserto Btpr 161 93 Proteínas E731, 52, 58, con sus regiones ácidas
eliminadas 253aa Btpr 162 93 Proteínas E731, 33, 52, con sus regiones ácidas
eliminadas 253aa Btpr 163 93 Proteínas E7 16, 18, 45, 33
elimina
,
d
c
a
o
s n sus regiones ácidas 360aa Btpr 164 93 Proteínas E7 16, 18,
e
45
lim
, 5
in
8
a
,
d
c
a
o
s n sus regiones ácidas 360aa Btpr 165 93 Proteínas E731, 52, 58 de longitud completa 2 95aa Btpr 166 93 Proteínas E731, 33, 52 de longitud completa 294aa Btpr 167 93 Proteínas E716, 18, 45, 33 de longitud completa 408aa Btpr 168 93 Proteínas E716, 18, 45, 58 de longitud completa 409aa Btpr 169 203 Proteínas E731, 52, 58, con sus regione
eliminadas s ácidas 253aa Btpr 170 203 Proteínas E731, 33, 52, con sus regiones ácidas
eliminadas 253aa Btpr171 203 Proteínas E7 16, 18, 45, 33, con sus regiones ácidas
eliminadas 360aa Btpr_172 203 Proteínas E7 16, 18, 45, 58, con sus regiones ácidas
eliminadas 360aa Btpr 173 Proteínas E731, 52, 58 de longitud completa 2 95aa Btpr 174 Proteínas E731, 33, 52 de longitud completa 294aa Btpr 175 Proteínas E716, 18, 45, 33 de longitud completa 408aa Btpr 176 Proteínas E716, 18, 45, 58 de longitud completa 409aa Se efectuaron pruebas de inducción de Pre-MCB y de manera sorpresiva el número de secuencias de E7 en CyaA no es el límite. Más bien es la naturaleza de la secuencia total del antígeno. Asimismo, Btpr_161, 162, 169 y 170 muestran rendimientos de proteína de interés más bajos cuando se comparan con los antígenos de longitud completa (BTpr_165, 166, 173 y 174) (Tabla 6).
Tabla 6: Resumen de los resultados de inducción con pre-MCB
Código de
proteína Tipos de HPV en el inserto Deleción de
gtCyaA Resultados de inducibilidad Btpr 161 Proteínas E7 31, 52, 58, con s roteína más débil que regiones ácidas eliminadas us 93 Expresión de p
Btpr 165
Btpr 162 Prot 3, 52, con sus 93 Expresión de proteína más débil que re eín
o
a
n
s
es
E7
ác
31, 3
gi idas eliminadas BTpr166
Btpr 163 Proteínas E7 16, 18, 45, 33, con sus 93 Significativamente mejor perfil de regiones ácidas eliminadas expresión que BTpr 143 Btpr 164 Proteínas E7 16, 18, 45, 58, con sus
regiones ácidas eliminadas 93 Significativamente mejor perfil de expresión que BTpr 143 Btpr 165 Proteínas E731, 52, 58 de longitud 93 Perfil de expresión de proteína similar completa a BTpr114
Btpr 166 Proteínas E731, 33, 52 de longitud 93 Perfil de expresión de proteína similar completa a BTpr114
Btpr 167 Proteínas E7 16, 18, 45, 33 de longitud 93 completa /
Btpr 168 Proteínas E7 16, 18, 45, 58 de longitud
completa 93 /
Proteínas E731, 52, 58, con
Btpr 169 203 Expresión de proteína más débil que sus regiones ácidas eliminadas Btpr 173
(continuación)
Código de
proteína Tipos de HPV en el inserto Deleción de
gtCyaA Resultados de inducibilidad Btpr 170 Proteínas E7 31, 33, 52, con sus roteína más débil que regiones ácidas eliminadas 203 Expresión de p
Btpr 174
Btpr 171 Proteínas E7 16, 18, 45, 33, con sus
regiones ácidas eliminadas 203 /
Btpr 172 Proteínas E7 16, 18, 45, 58, con sus 203 /regiones ácidas eliminadas
Btpr 173 Proteínas E731, 52, 58 de longitud 203 Perfil de expresión de proteína similar completa a BTpr_114
Btpr 174 Proteínas E731, 33, 52 de longitud 203 Perfil de expresión de proteína similar completa a BTpr_114
Btpr 175 Proteínas E7 16, 18, 45, 33 de longitud
completa 203 /
Btpr 176 Proteínas E7 16, 18, 45, 58 de longitud 203 / completa
A partir de los experimentos anteriores, se puede concluir que gtCyaAd93 y gtCyaAd203 aceptan la secuencia de polipéptido equivalente que corresponde a al menos 4 proteínas E7. Sin embargo, la secuencia y el acomodo de los fragmentos de E7 elegidos pueden tener un impacto sobre el rendimiento y pureza y por lo tanto tiene más o menos potencial de industrialización favorable.
Confirmación de resultados observados con el pre-MCB
Los inventores investigaron adicionalmente si los resultados obtenidos en el nivel pre-MCB son confirmados con un enfoque particular sobre construcciones tetravalentes en el vector gtCyaAd93. Las proteínas que tienen un mejor perfil de expresión que BTpr_143 o equivalente a BTpr_115 son analizadas a una escala de 5 litros. La siguiente tabla presenta en forma resumida los resultados obtenidos.
T l 7: R m n l in i n r -M B r l r i n l lir
A p a r t i r d e l e x p e r i m e n t o a n t e r io r , s e c o n c l u y e q u e :
1. L a p r o d u c t i v i d a d y p u r e z a t o t a l h a s id o m e jo r a d a p a r a t o d a s la s c o n s t r u c c io n e s a n a l i z a d a s e x c e p t o p a r a B t p r _ 175.
2. L o s p e r f i l e s d e p r o d u c t i v i d a d y e x p r e s i ó n s ie m p r e s o n i n f e r io r e s e n p r o t e í n a s r e c o m b in a n t e s c o n g t C y a A d 203 q u e c o n g t C y a A d 93.
3. E l v e c t o r g t C y a A d 93 p e r m i t e la p r o d u c c i ó n d e p r o t e í n a s r e c o m b in a n t e s q u e c o n t ie n e n 4 a n t í g e n o s d e H P V c o n u n m e jo r r e n d i m i e n t o y p u r e z a q u e e l v e c t o r g t C y a A d 203.
4. E s t o s r e s u l t a d o s c o n f i r m a n la s o b s e r v a c i o n e s h e c h a s e n e l p r e - M C B .
E . g t C y a A d 93 y g t C y a A d 203 q u e c o n t ie n e n a n t í g e n o s g r a n d e s s o n in m u n o g é n i c o s
E .1 I n m u n o g e n i c id a d d e B T p r 114 , B T p r 115 , B T p r 116 y B T p r 117
L a i n m u n o g e n i c id a d d e la s p r o t e í n a s q u i m é r i c a s B T p r _ 114 , B T p r _ 115 , B T p r _ 116 y B T p r _ 117 , s e in v e s t i g ó a d i c io n a lm e n t e . L o s r a t o n e s f u e r o n v a c u n a d o s p o r v í a i n t r a d é r m ic a y a s e a c o n e l p l a c e b o o c o n P r o C e r v i x ( c o n t r o l p o s i t i v o c o m p u e s t o d e C y a A - H P V 16 E 7 C y a A - H P V 18 E 7 ) o c o n B t p r _ 114 ( g t C y a A d 93 - P E P 216 - C y a C o p t ) , B T p r _ 115 ( g t C y a A d 93 - p e p 217 - C y a C o p t ) , B T p r _ 116 ( g t C y a A d 203 - p e p 216 - C y a C o p t ) y B T p r _ 117 ( g t C y a A d 203 -p e p 217 - C y a C o p t ) r e s p e c t i v a m e n t e . T o d o s lo s g r u p o s s e c o a d y u v a n c o n p o l i - I C - L C . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a n 7 d e s p u é s d e la v a c u n a c ió n y lo s e s p l e n o c i t o s s o n r e - e s t i m u l a d o s c o n p é p t i d o s r e s t r in g id o s c o n M H C c la s e I a n t e r i o r m e n t e i d e n t i f i c a d o s . L o s r e s u l t a d o s s e p r e s e n t a n e n la F ig u r a 10.
L a F ig u r a 10 m u e s t r a q u e :
D e b id o a q u e n o s e i d e n t i f i c ó n in g ú n p é p t i d o r e s t r in g id o c o n M H C - l p a r a E l d e H P V 45 e n lo s r a t o n e s e n e l m o m e n t o d e l e x p e r i m e n t o , lo s e s p l e n o c i t o s s o n r e e s t im u la d o s c o n u n a g e n o t e c a d e p é p t i d o d e E 7 d e H P V 45 d i v id a e n t r e s s u b - c o m b in a d o s ( n . ° 218 - 1 , n . ° 218 - 2 y n . ° 218 - 3 ) . E s t e e x p e r i m e n t o e s la p r im e r a r e - e s t i m u l a c ió n , c o n o c id a p o r lo s in v e n t o r e s , h e c h a c o n u n a g e n o t e c a d e p é p t i d o e n l u g a r d e c o n u n p é p t i d o q u e c o r r e s p o n d e a u n e p í t o p o c o n o c id o . L a F ig u r a 11 m u e s t r a q u e la r e - e s t i m u l a c ió n in v i t r o r e s t i m u la t io n c o n e l s u b - c o m b in a d o d e p é p t i d o n . ° 218 - 3 , p e r o n o lo s s u b - c o m b in a d o s n . ° 218 - 1 y n . ° 218 - 2 , e s c a p a z d e r e e s t im u la r c é l u la s T in d u c id a s p o r v a c u n a c ió n c o n g t C y a A d 93 - P E P 216 - C y a C o p t , g t C y a A d 203 - P E P 216 - C y a C o p t , g t C y a A d 93 - P E P 217 - C y a C 0 p t y g t C y a A d 203 -P E p 217 - C y a C o p t . L a s e c u e n c ia d e p é p t i d o r e s p o n s a b le p a r a e s t a r e s p u e s t a i n m u n e e s I E L T V E S S A E D L R T l .
D e m a n e r a s o r p r e s iv a , s e o b s e r v ó u n a r e s p u e s t a s im i l a r c o n e l g r u p o v a c u n a d o c o n P r o C e r v i x , e l c u a l n o p o r t a la s e c u e n c ia d e E 7 d e H P V 45. E s t e r e s u l t a d o s e p u e d e e x p l i c a r m e d ia n t e u n a r e a c t i v id a d c r u z a d a e n t r e lo s e p í t o p o s p r e s e n t e s e n e l c o m b in a d o n . ° 218 - 3 y la s s e c u e n c ia s d e E 7 d e H P V 16 o d e E 7 d e H P V 18 c o n t e n i d a s e n la v a c u n a P r o C e r v i x .
J u n t o s , e s t o s r e s u l t a d o s m u e s t r a n q u e lo s a n t í g e n o s c o n u n a e s t r u c t u r a c o m p le ja ( 21 c is t e í n a s ) y c a r g a s á c i d a s s o n s u m in i s t r a d o s c o r r e c t a m e n t e p o r g t C y a A d 93 y g t C y a A d 203 y p r o c e s a d o s p o r c é l u la s P r e s e n t a d o r a s d e A n t í g e n o ( A P C ) . E s t o e s i n e s p e r a d o t o m a n d o e n c o n s i d e r a c ió n lo s r e s u l t a d o s e n s e ñ a d o s e n P r e v i l l e e t a l . [ 5 ] , K a r i m o v a e t a l .
[ 7 ] y G m i r a e t a l . [ 8 ] .
L a i n m u n o g e n i c id a d d e lo s n u e v o s l í d e r e s q u e c o n s i s t e n e n B t p r _ 163 , B T p r _ 164 , B T p r _ 165 , B T p r _ 166 , B T p r _ 167 ,
BTpr_168, BTpr_173 y BTpr_175, se analiza adicionalmente en ratones C57BL/6.
Los ratones son vacunados por vía intradérmica ya sea con el placebo o con cada líder, respectivamente. Todos los grupos se coadyuvan con poli-ICLC.
Los ratones se sacrifican 7 días después de la vacunación y los esplenocitos son re-estimulados con genotecas de péptido de cada antígeno de E7 analizado. Todos los líderes analizados son inmunogénicos. La inmunogenicidad contra HPV31, 45 y 58 no se analiza en ratones C57BL/6 debido a que las herramientas no están adaptadas (el fondo genético de los ratones no es apropiado). La inmunogenicidad contra está proteínas E7 se analiza en otras cepas de ratones como se describe en Materiales y Métodos.
T l : Inm n ni i lí r n liz n r n 7BL
Estos resultados muestran que:
- La inmunización con 10 |jg de cada líder induce una respuesta de IFN-y específica.
- gtCyaAd93 y gtCyaAd203 suministran correctamente los antígenos a las células presentadoras de antígeno. - Se miden respuestas inmunes específicas contra proteínas E7 de HPV16, 18, 33 y 52.
Estos resultados permiten la investigación adicional de la respuesta inmune contra mezclas hexavalentes y heptavalentes.
E.3 Inmunogenicidad de una vacuna hexavalente candidato
La respuesta inmune de una mezcla hexavalente de dos líderes trivalentes, se evalúa en ratones C57BL/6. Estos líderes son BTpr_114 y BTpr_165 que contienen respectivamente proteínas E7 de HPV 16-18-45, y proteínas E7 de HPV 31-52-58. Se utiliza el mismo protocolo que el descrito anteriormente. Debido a que no hay un péptido restringido con MHCI conocido identificado para E7 de HPV52 en los ratones al momento del experimento, se re estimulan los esplenocitos con una genoteca de péptido de E7 de HPV52 dividida en tres sub-combinados (221-1, 221-2 y 221-3). Para re-estimulaciones con HPV16E7 y HPV18E7, también se utilizan genotecas de péptido divididas en 3 sub-combinados (116-1, 116-II, 116-III y 171-I, 171-II y 171-3 respectivamente).
Los resultados se muestran en la Figura 15.
Estos resultados confirman que:
- La inmunización con 10 jg de la mezcla hexavalente induce respuestas de célula T para E7 de HPV16, E7 de
HPV18 y HPV52 como se mide mediante ELISpot de IFN-y.
- Cada gtCyaAd93 con sus antígenos respectivos es capaz de suministrarlos a la célula presentadora de antígeno (APC) y promover respuestas de célula T específicas de antígeno contra tipos de HPV medibles.
- No se observan diferencias entre componentes trivalentes solos en la frecuencia de respuestas de célula T específicas de E7 y la vacuna hexavalente candidato, (datos no mostrados)
Estas observaciones permiten concluir que Btpr_1 14 y Btpr_165 coadyuvados con poli-ICLC son eficientes para inducir respuestas de célula T específicas de E7 de HPV16, E7 de HPV18E7 y E7 de HPV52 en ratones C57BL/6 después de inmunización intradérmica.
E. 4 Inmunogenicidad de dos vacunas heptavalentes candidato
Tomando como base los resultados de productividad y pureza, se analizan dos combinaciones heptavalentes en ratones C57BL/6: Btpr_165+Btpr_163 y Btpr_166 Btpr_164. Los ratones se inmunizan por vía intradérmica con 10 |jg de cada vacuna heptavalente candidato, respectivamente.
Tal como se muestra en la Figuras 16A-16D, estos resultados indican que para:
- E7 de HPV16: la re-estimulación in vitro con sub-combinado de péptidos n.°116-2j (c+d), es capaz de re estimular células T inducidas por vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV16.
- E7 de HPV18: la re-estimulación in vitro con sub-combinados de péptidos n.°171-I y n.°171-II son capaces de re estimular células T inducidas mediante vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato y sus componentes solos que albergan E7 de HPV18.
- E7 de HPV33:
o Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_166 y Btpr_164, la re-estimulación in vitro con el sub-combinado de péptido n.°220-2, es capaz de re-estimular células T inducidas mediante vacunación, o Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_165 y Btpr_163, la re-estimulación in vitro con los sub-combinados de péptido n.°220-1, n.°220-2 y n.°220-3 son capaces de re-estimular células T inducidas mediante vacunación.
- E7 de HPV52: la re-estimulación in vitro con el sub-combinado de péptidos n.°221-2 y n.°221-3 es capaz de reestimular células T inducidas mediante vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV52.
Juntos, estos resultados de producción e inmunogenicidad indican que:
- Se puede producir y purificar gtCyaAd93 recombinante con 3 y 4 proteínas E7 de HPV con una buena productividad;
- También se pueden producir y purificar proteínas gtCyaAd203 recombinantes pero con una productividad que es inferior con respecto a los vectores gtCyaAd93 que contienen los mismos antígenos.
- Dos gtCyaAd93 recombinantes con 3 y 4 proteínas E7 de HPV pueden suministrar correctamente sus antígenos a las APCs.
- Se mide una respuesta inmune específica contra cada tipo de HPV inmunogénico en ratones C57BL/6
- El diseño de las proteínas E7 con un gtCyaAd93 recombinante puede tener un impacto en la respuesta inmune contra antígenos E7 por ejemplo como se ilustró con E7 de HPV33.
- Los antígenos con una estructura compleja (21 cisteínas) y cargas ácidas son suministrados correctamente mediante gtCyaAd93 y procesados por células Presentadoras de Antígeno (APC). Esto es inesperado tomando en consideración los resultados de Gmira et al. 2001, y Fayolle et al., 1998.
F. Eficiencia citotóxica de los candidatos
F.1 Eficiencia citotóxica mediada por CD8 de las vacunas trivalentes candidato
Con el fin de comparar la eficiencia de los candidatos trivalentes en la inducción de citotoxicidad, se efectuaron pruebas de aniquilación in vivo con y sin coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de péptido provenientes de proteínas E7 de HPV16, HPV18 y HPV45, respectivamente.
Se vacunan 4 grupos de ratones con un placebo, con gtCyaAd93-pep216-CyaCopt, con gtCyaAd93-pep217-CyaCopt y con gtCyaAd203-pep217-CyaCopt en presencia o no de poli- IC-LC, respectivamente.
En presencia de coadyuvante, no se observa ninguna diferencia entre candidatos (datos no mostrados). En la Figura 12A (cargando con genotecas n.°171-1 y n.°171-2), el porcentaje de aniquilación es superior en los ratones vacunados con la proteína quimérica que contiene los antígenos de longitud completa (pep217) en comparación con
ratones vacunados con la proteína quimérica que contienen el antígeno eliminado pep216. De manera similar, en la Figura 12B (cargando con la genoteca de péptido n.°218-3), el porcentaje de aniquilación es superior en los ratones vacunados con la proteína quimérica que contiene pep217 mientras que no se observa aniquilación alguna en los ratones vacunados con la proteína quimérica que contiene pep216 cuando se compara con el placebo. Sin el coadyuvante poli-LCLC, las gtCyaAs que albergan los antígenos de longitud completa son más eficientes para aniquilar sus células diana en comparación con los antígenos eliminados para este dominio ácido. Esto es inesperado ya que los antígenos de longitud completa contienen los dominios ácidos de E7 y de conformidad con la enseñanza de la literatura deberían ser menos eficientes que los antígenos eliminados para este dominio ácido. Estos resultados indican que
- los antígenos de longitud completa probablemente tienen epítopos (epítopos de célula T auxiliar) que favorecen la respuesta de aniquilación mediante linfocitos T CD8 ; y
- los vectores gtCyaA permiten el suministro de antígenos con regiones ácidas
F. 2 eficiencia citotóxica mediada por CD8 de las vacunas heptavalentes candidato
Con el fin de comparar la eficiencia de las vacunas heptavalentes candidato respecto a su capacidad de inducir linfocitos T citotóxicos específicos de E7 (CTL), se efectuaron pruebas de aniquilación in vivo con coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de péptido provenientes de proteínas E7 de HPV16 y HPV18, respectivamente.
Se vacunan 3 grupos de ratones con un placebo, con BTpr165 BTpr163 y BTpr166 BTpr164 en presencia de Poli-ICLC, respectivamente.
No se observa aniquilación específica de E7 en el grupo con placebo. Ambas vacunas heptavalentes candidato inducen aniquilación específica de E7 de células cargadas respectivamente con la genoteca de péptido E7 de HPV16 E7 (Figura 17-A) o la genoteca de péptido E7 de HPV18 E7 (Figura 17-B).
Estos resultados indican que ambos candidatos heptavalentes inducen CTL específicos de E7 de HPV16 y HPV18 funcionales.
G. Pruebas de regresión de tumor en ratones que portan tumores TC-1
Se investiga adicionalmente la eficiencia terapéutica de los cuatro candidatos trivalentes Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93-pep217- CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) utilizando el modelo de células de tumor TC-1.
Todos los ratones fueron inoculados con células TC-1 (que expresan el antígeno E7 de HPV16) en el día 0. El grupo 1 se deja sin tratamiento. El grupo 2 se trata con PBS y Poli-ICLC, el grupo 3 se trata con ProCervix coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 4 se trata con gtCyaAd93-pep216 coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 5 con gtCyaAd203-pep216 coadyuvado con poli-IC-LC, el grupo 6 con gtCyaAd93-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC y el grupo 7 con gtCyaAd203-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC. Cada grupo está compuesto de 10 ratones.
Las Figuras 13A-13B(a-g) muestran que todos los ratones desarrollan tumores. Sin embargo, los ratones vacunados con una vacuna candidato de CyaA que incorpora el antígeno E7 de HPV16 y coadyuvada con Poli-ICLC muestran una tasa de eliminación del tumor más fuerte en el día 65: 9 de 10 ratones tratados con ProCervix Poli-ICLC eliminaron los tumores (grupo 3) (Figura 13Bc); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep216 Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 4) (Figura 13Bd); 8 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep216 Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 5) (Figura 13Be); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep217 Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 6) (Figura 13Bf); 9 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep217 Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 7) (Figura 13Bg). 0 de 10 y 1 de 10 ratones no tratados o tratados con el placebo Poli-ICLC presentaron regresión de tumores respectivamente (grupo 1 (Figura 13Ba) y grupo 2 (Figura 13Bb) ). Por lo tanto, únicamente los ratones que fueron vacunados con una vacuna candidato que contiene el antígeno E7 de HPV16 fueron capaces de presentar regresión de tumores de manera significativa. Entre las cuatro vacunas candidato, no se observa diferencia en su capacidad para presentar regresión de tumores.
Estos resultados muestran que la administración de las proteínas quiméricas de la invención, tales como Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93- pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) permite presentar regresión de tumores que provocan trastornos oncogénicos de manera eficiente.
H. Efecto terapéutico y profiláctico de los candidatos trivalentes
Se evaluó adicionalmente la capacidad de los ratones vacunados de ser protegidos contra el desarrollo y
crecimiento de un tumor, después de la erradicación de un primer tumor que expresa un antígeno diferente. Se inoculan células de tumor LL2 que expresan antígeno E7 de HPV18 y la línea celular de control LL2-GFP en el flanco de los ratones vacunados supervivientes, los cuales previamente habían presentado regresión de tumor de los tumores injertados de TC-1 (que expresan el antígeno E7 de HPV16).
Cada grupo de ratones supervivientes fue dividido en dos sub-grupos que fueron inoculados ya sea con células LL2-HPV18 E7 o células LL2-GFP. Los resultados se muestran en las Figuras 14A-14B(a-j).
Los ratones vacunados con una vacuna candidato de gtCyaA que incorporan el antígeno E7 de HPV18 y coadyuvados con Poli-ICLC muestran un fuerte efecto protector contra el crecimiento de la línea celular de LL2-HPV18 E7 (ningún ratón desarrolló tumor en los grupos 3b (Figura 14Bb), 4b(Figura 14Bd), 5b(Figura 14Bf), 6b (Figura 14Bh) y 7b (Figura 14Bj)) pero no contra el crecimiento de la línea celular LL2-GFP (todos los ratones desarrollaron tumores en los grupos 3a (Figura 14Ba), 4a (Figura 14Bc), 5a (Figura 14Be), 6a (Figura 14Bg)y 7a (Figura 14Bi)).
Juntos, estos resultados destacan que los ratones vacunados con los candidatos trivalentes, los cuales eliminaron los tumores de TC-1, también están protegidos contra los tumores de LL2-HPV18E7 e indica que dichos ratones vacunados, los cuales desarrollaron una respuesta de célula T específica de antígeno curativa en contra del antígeno E7 de HPV16, también desarrollaron una respuesta de célula T específica de antígeno protectora contra el antígeno E7 de HPV18
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[18] Khafizov et al . A study of the evolution of inverted-topology repeats from LeuT-fold transporters using
Claims (21)
1. Un polinucleótido quimérico que codifica una proteína derivada de CyaA en donde dicha proteína derivada de CyaA comprende o consiste en:
1) Un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, compenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer resto de la SEQ ID NO:2 y terminando con un resto localizado de la posición 183 a la posición 227 de la s Eq ID NO:2, fusionado a
2) Un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa fusionada a
3) Un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un resto localizado de la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando con el último resto de la SEQ ID NO:2.
2. El polinucleótido quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende, en su extremo 3', un polinucleótido que codifica la proteína CyaC de una cepa de Bordetella, en particular, de una cepa de Bordetella pertussis.
3. El polinucleótido quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, seleccionado del grupo que consiste en:
1) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' a 3', (a) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO:2, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO:2;
2) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' a 3', (a) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO:2, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO:2;
3) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' a 3', (a) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 227 de la SEQ ID NO:2, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 387 a 1706 de la SEQ ID NO:2;
4) un polinucleótido que comprende o que consiste en, de 5' a 3', (a) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 1 a 183 de la SEQ ID NO:2, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido que consiste en los restos 321 a 1706 de la SEQ ID NO:2;
4. Uso de un polinucleótido quimérico que codifica una proteína derivada de la CyaA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la producción de una proteína quimérica que comprende o que consiste en dicha proteína derivada de CyaA y un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa.
5. Un vector, preferentemente un plásmido, que comprende el polinucleótido quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y secuencias de control de la expresión y que además comprende la secuencia codificante de cyaC de una cepa de Bordetella.
6. Un cultivo celular, preferentemente un cultivo de cepa de E. coli, que comprende el polinucleótido quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una proteína derivada de CyaA codificada por el polinucleótido quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, expresada a partir del vector de acuerdo con la reivindicación 5 o producido por un cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una proteína quimérica codificada por el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende o que consiste en, de N-terminal a C-terminal, (a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en el primer resto de la SEQ ID NO:2 y terminando en un resto localizado de la posición 183 a la posición 227 de la SEQ ID NO:2, (b) un polipéptido heterólogo que contiene un antígeno E7 de HPV o un fragmento antigénico del mismo en donde dicho polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática negativa y (c) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en ala SEQ ID NO:2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en un resto localizado de la posición 321 a la posición 387 de la SEQ ID NO:2 y terminando en el último resto de la SEQ ID NO:2.
9. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 8 , s e le c c io n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n :
1 ) u n a p r o t e í n a q u e c o m p r e n d e o q u e c o n s i s t e e n , d e N - t e r m i n a l a C - t e r m in a l , ( a ) u n f r a g m e n t o q u e c o n s i s t e e n lo s r e s t o s 1 a 227 d e la S E Q ID n O : 2 , ( b ) u n p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o q u e c o n t ie n e u n a n t í g e n o E 7 d e H P V o u n f r a g m e n t o a n t i g é n i c o d e l m is m o e n d o n d e d i c h o p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o t i e n e u n a c a r g a e l e c t r o s t á t i c a n e g a t i v a y ( c ) u n f r a g m e n t o q u e c o n s i s t e e n lo s r e s t o s 321 a 1706 d e la S E Q ID N O : 2 ;
2 ) u n a p r o t e í n a q u e c o m p r e n d e o q u e c o n s i s t e e n , d e N - t e r m i n a l a C - t e r m i n a l , ( a ) u n f r a g m e n t o q u e c o n s i s t e e n lo s r e s t o s 1 a 1 8 3 d e la S E Q ID N O : 2 , ( b ) u n p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o q u e c o n t ie n e u n a n t í g e n o E 7 d e H P V o u n f r a g m e n t o a n t i g é n i c o d e l m is m o e n d o n d e d i c h o p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o t i e n e u n a c a r g a e l e c t r o s t á t i c a n e g a t i v a y ( c ) u n f r a g m e n t o q u e c o n s i s t e e n lo s r e s t o s 387 a 1706 d e la S E Q ID N O : 2 ;
10. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 8 o 9 , e n d o n d e d i c h o p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o l l e v a a l m e n o s u n e p í t o p o .
11. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 10 , q u e l l e v a a l m e n o s u n e p í t o p o C D 8 y / o a l m e n o s u n e p í t o p o C D 4 .
12. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 8 a 11 , e n d o n d e e l p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o q u e c o n t ie n e u n a n t í g e n o E 7 d e H P V o u n f r a g m e n t o a n t i g é n i c o d e l m is m o e n d o n d e d i c h o p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o t i e n e u n t a m a ñ o q u e v a r í a d e 9 a 500 o d e 20 a 500 o d e 50 a 500 o d e 100 a 500 r e s t o s d e a m in o á c id o s .
13. U n a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 1 a 12 , e n d o n d e e l p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o c o n t i e n e u n a n t í g e n o E 7 d e H P V o u n f r a g m e n t o a n t i g é n i c o d e l m is m o e n d o n d e d i c h o p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o t i e n e la s e c u e n c ia d e la S E Q ID N O : 70 , la S E Q ID N O : 71 , la S E Q ID N O : 72 , la S E Q ID N O : 73 o la S E Q ID N O : 74.
14. U n a c o m p o s i c ió n q u e c o m p r e n d e u n a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 8 a 13 y u n v e h í c u l o f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e , y o p c i o n a l m e n t e a l m e n o s u n c o a d y u v a n t e .
15. U n a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 8 a 13 o u n a c o m p o s i c ió n d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 15 , p a r a s u u s o c o m o u n m e d ic a m e n t o e n la in d u c c ió n d e u n a r e s p u e s t a in m u n e p r o f i l á c t i c a o d e u n a r e s p u e s t a i n m u n e t e r a p é u t i c a c o n t r a H P V .
16. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 8 a 13 p a r a s u u s o e n la p r o f i l a x is o e l t r a t a m ie n t o d e u n a i n f e c c i ó n p a t ó g e n a p o r H P V o d e u n t r a s t o r n o o n c o g é n ic o r e la c i o n a d o c o n i n f e c c i ó n p o r H P V .
17. L a p r o t e í n a q u i m é r i c a s e g ú n c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c io n e s 8 a 13 o la c o m p o s i c ió n s e g ú n la r e iv i n d ic a c ió n 14 , p a r a s u u s o ( i ) e n e l t r a t a m ie n t o in m u n o t e r a p é u t i c o d e la p r im e r a a f e c c ió n p a t o l ó g ic a d e t e r m i n a d a d i a g n o s t i c a d a e n u n h o s p e d a d o r m a m í f e r o p r o v o c a n d o u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e i n f o c i t o s T c o n t r a u n p r im e r g r u p o d e e p í t o p o s c o n t e n i d o s e n d i c h o ( s ) p o l i p é p t i d o ( s ) y ( i i ) e n la p r o f i l a x is c o n t r a la ( s ) s e g u n d a ( s ) a f e c c ió n ( e s ) p a t o l ó g ic a ( s ) d e t e r m i n a d a ( s ) e n e l m is m o h o s p e d a d o r m a m í f e r o a l p r o v o c a r u n a r e s p u e s t a i n m u n e d e l i n f o c i t o s T d e m e m o r ia c o n t r a u n s e g u n d o g r u p o d e e p í t o p o s c o n t e n i d o s e n d i c h o ( s ) p o l ip é p t i d o ( s ) , d i c h a s r e s p u e s t a s d e l s i s t e m a in m u n e o b t e n i d a s d e s p u é s d e la a d m in i s t r a c i ó n d e la p r o t e í n a o c o m p o s i c ió n q u i m é r i c a e n d i c h o h o s p e d a d o r , e n d o n d e d i c h a p r o f i l a x is c o n t r a s e g u n d a s a f e c c io n e s p a t o l ó g i c a s d e t e r m i n a d a s n o s e o b s e r v a c u a n d o d i c h o s e g u n d o g r u p o d e e p í t o p o s n o e s t á c o n t e n i d o e n d i c h o ( s ) p o l i p é p t i d o ( s ) t r a n s p o r t a d o ( s ) p o r e l v e c t o r a d m in is t r a d o .
18. U n m é t o d o p a r a p r o d u c i r la p r o t e í n a q u i m é r i c a d e a c u e r d o c o n la r e iv i n d ic a c ió n 1 , q u e c o m p r e n d e :
( a ) d e l e c io n a r , d e u n p o l i n u c le ó t i d o q u e c o d i f i c a la C y a A d e Bordetella pertussis t a l c o m o s e e s t a b l e c e e n la S E Q ID N O : 2 , u n f r a g m e n t o d e n u c le ó t id o , c u y o s t r e s p r im e r o s n u c l e ó t i d o s c o d i f i c a n u n r e s t o d e a m in o á c id o lo c a l i z a d o d e l r e s t o 184 a l r e s t o 228 d e la S E Q ID N O : 2 , y c u y o s 3 ú l t i m o s n u c l e ó t i d o s c o d i f i c a n u n r e s t o d e a m in o á c id o lo c a l i z a d o d e l r e s t o 320 a l r e s t o 386 d e la S E Q i D N O : 2 ;
( b ) in s e r t a r , e n e l p o l i n u c le ó t i d o o b t e n i d o e n ( a ) y e n e l s i t i o d e l f r a g m e n t o d e n u c l e ó t i d o s d e l e c io n a d o , u n p o l i n u c le ó t i d o q u e c o d i f i c a u n p o l ip é p t i d o h e t e r ó lo g o q u e c o n t ie n e u n a n t í g e n o E 7 d e H P V o u n f r a g m e n t o a n t i g é n i c o d e l m is m o e n d o n d e d i c h o p o l i p é p t i d o h e t e r ó lo g o t i e n e u n a c a r g a e l e c t r o s t á t i c a n e g a t i v a ;
( c ) e n d o n d e la s e t a p a s ( a ) y ( b ) s e p u e d e n l l e v a r a c a b o e n c u a l q u i e r o r d e n o d e m a n e r a s im u l t á n e a ; y , d e e s t e m o d o , a b a r c a r u n p o l i n u c le ó t i d o q u i m é r i c o d e a c u e r d o c o n la r e i v i n d i c a c ió n 1 ;
( d ) e x p r e s a r , e n u n a c é lu la , e l p o l i n u c le ó t i d o o b t e n i d o e n ( b ) ; y
( e ) r e c u p e r a r d i c h a p r o t e í n a q u i m é r i c a e x p r e s a d a .
19. U n m é t o d o d e a c u e r d o c o n la r e i v i n d i c a c ió n 18 , q u e c o m p r e n d e la e t a p a d e c o m b in a r e n u n a c o n s t r u c c ió n d e p o l i n u c le ó t i d o q u im é r i c o , e l p o l i n u c le ó t i d o o b t e n i d o e n la e t a p a ( b ) y u n p o l i n u c le ó t i d o q u e c o d i f i c a la p r o t e í n a C y a C , e n p a r t i c u la r , la c o n s t r u c c ió n d e p o l i n u c le ó t i d o q u i m é r i c o c o m p r e n d e e l p o l i n u c le ó t i d o o b t e n i d o e n la e t a p a ( b ) y u n p o l i n u c le ó t i d o q u e c o d i f i c a la p r o t e í n a C y a C d e t a l m a n e r a q u e t r a s d i c h a c o m b in a c ió n , e l p o l i n u c le ó t i d o q u i m é r i c o o b t e n i d o c o m p r e n d e o c o n t ie n e , d e l e x t r e m o 5 ' a l e x t r e m o 3 ’ , la c o n s t r u c c ió n d e p o l i n u c le ó t i d o d e la e t a p a ( b )
seguida por unna construcción de polinucleótido que codifica una proteína CyaC de una cepa de Bordetella pertussis proporcionando de ste modo un polinucleótido quimérico de acuerd con la reivindicación 2.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha etapa a) consiste en la detección de un polinucleótido que codifica una CyaA de Bordetella pertussis tal como se establece en la SEQ ID NO:2:
- un fragmento de nucleótidos que codifica los restos 228 a 320 de la SEQ ID NO:2 o,
- un fragmento de nucleótidos que codifica los restos 184 a 386 de la SEQ ID NO: 2, o
- un fragmento de nucleótidos que codifica los restos 228 a 386 de la SEQ ID NO: 2, o
- un fragmento de nucleótidos que codifica los restos 184 a 320 de la SEQ ID NO: 2.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 19 en donde dicha etapa a) consiste en delecionar, de un polinucleótido tal como se establece en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO:69:
- un fragmento de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 682 a 960 de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:69, o
- un fragmento de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 550 a 1158 de la SEQ ID NO:1 o de la SEQ ID NO: 69, o
- un fragmento de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 682 a 1158 de la SEQ ID NO:1 o de la SEQ ID NO:69, o
- un fragmento de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 550 a 960 de la SEQ ID NO:1 o de la SEQ ID NO:69.
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