MX2015001018A - Proteinas quimericas basadas en cyaa que comprenden un polipeptido heterologo y sus usos en la induccion de respuestas inmunes. - Google Patents

Proteinas quimericas basadas en cyaa que comprenden un polipeptido heterologo y sus usos en la induccion de respuestas inmunes.

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Abstract

La invención se refiere a una proteína quimérica que comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) una parte N-terminal de una proteína CyaA de Bordetella (b) un polipéptido heterólogo, y (c) una parte C-terminal de una proteína CyaA de Bordetella. La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica para una versión de una CyaA de Bordetella que tiene una deleción, así como a un polinucleótido que codifica para esta proteína quimérica. También son parte de la invención una composición que comprende por lo menos una proteína o proteínas quiméricas de la invención y los usos profilácticos y/o terapéuticos de dicha composición.

Description

PROTEÍNAS QUIMÉRICAS BASADAS EN CYAA QUE COMPRENDEN UN POLIPÉPTIDO HETERÓLOGO Y SUS USOS EN LA INDUCCIÓN DE RESPUESTAS INMUNES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una proteina quimérica que comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) una parte N-terminal de una proteina CyaA de Bordetella (b) un polipéptido heterólogo, y (c) una parte C-terninal de una proteina CyaA de Bordetella . La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica para una versión de una CyaA de Bordetella que tiene una deleción, asi como a un polinucleótido que codifica para esta proteina quimérica. También son parte de la invención una composición que comprende por lo menos una proteina o proteínas quiméricas de la invención y los usos profilácticos y/o terapéuticos de dicha composición.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Adenilato Cielasa (CyaA) de los tipos de Bordetella en particular de Bordetella pertussis, ha sido descrita exhaustivamente como un vector recombinante capaz de suministrar en forma eficiente polipéptidos, tal como antígenos, en el citosol de células presentadoras de antígeno (APC) [1], [2], [3]. Más, las CyaAs recombinantes se han utilizado para tratar en forma eficaz ratones que portan tumores [4], [5], [6].
Varios autores han resaltado que la eficiencia del suministro de polipéptido, en particular suministro de antigeno, mediante CyaA (utilizada como un vector) puede ser afectada positiva o negativamente por la carga electrostática del polipéptido insertado (antigeno) y su conformación. En 1998, Karimova & al. [7] describieron que el suministro de epitopes de polipéptido de célula T CD8+, insertados en CyaA, hacia y dentro de células presentadoras de antigeno es dependiente de la carga electrostática de los epitopes insertados: una CyaA recombinante que aloja al epitope OVA fue capaz de translocarse en la APC y de inducir una respuesta CTL in vivo, mientras que la misma construcción con 4 residuos glutámicos fusionados al epitope OVA, ya no puede traslocarse, y no induce una respuesta de linfocito de célula T citotóxica (CTL) detectable in vivo. En 2012, Holubova et al. describieron diversas construcciones basadas en CyaA: ya sea proteínas CyaA con deleción dentro de sus N-terminales que comprenden el epitope OVA SIINFEKL, o proteínas CyaA truncadas respecto a sus dominios N-terminales y que comprenden varios epitopes insertados en sitios diferentes [25].
Holubova et al. concluyen que sus experimentos proveen una prueba de concepto para la construcción de suministro de antígeno basada en CyaA que tiene el dominio AC completo remplazado por poliepítope de CTL artificial grande.
En 2001, Gmira et al. [8] desarrollaron un nuevo vector CyaA para facilitar la construcción de CyaAs recombinantes con polipéptidos o antigenos exógenos insertados dentro de sus dominios catalíticos. Estas modificaciones son: la inserción de una secuencia de sitio de clonación múltiple con nuevos sitios de restricción únicos corriente abajo desde el codón 224; la deleción de los codones 225 a 234; y el cambio de los codones 236, 238 y 239; estas modificaciones se introdujeron para incrementar la carga electrostática local (menos ácido), lo cual previamente se demostró gue es crítico para la translocación de esta proteína híbrida CyaA-antígeno a través de la membrana celular de APC in situ.
La CyaA modificada tiene actividad invasiva similar que la CyaA de tipo silvestre.
Los autores analizaron 5 antígenos, cuyo tamaño varía de 87 a 206 residuos, con una carga electrostática de -4 a +14, y mostraron que aquellos que tienen un valor ácido perdieron su eficiencia de translocación, lo que confirma los resultados previos de Karimova et al.
Asimismo, éstos analizaron CyaAs con antígenos con puentes de disulfuro internos o estructuras complejas: ninguno fue capaz de translocación en las células elegidas como blanco, lo que soporta la hipótesis de que los polipéptidos insertados en el dominio catalítico de CyaA se deben desdoblar para que sean translocalizados.
TABLA 1 La Tabla 1 se extrajo de [7] y [8]. Los insertos con una carga ácida no se translocalizan en el citosol de las APCs. La carga ácida se calcula a partir del número de residuos Lys y Arg menos el número de residuos Asp y Glu Los antígenos utilizados en el caso de pruebas de regresión de tumor tienen ya sea un tamaño corto (OVA es de 8 residuos de longitud) [4] o sus estructuras secundarias están alteradas por reacomodos internos de segmentos de antigeno y con un tamaño máximo de 103 residuos [5].
A partir de estos estudios, se sacaron las siguientes conclusiones para mejorar la eficiencia de vectorización utilizando el vector CyaA: Se debe evitar la inclusión de regiones ácidas en un polipéptido que se va a insertar en CyaA; y Se debe evitar la inclusión de estructuras secundarias y terciarias en estos insertos porque dichas estructuras interfieren con la interiorización apropiada del dominio enzimático de la adenilato cielasa (AC) en el cual se ha insertado el polipéptido.
En vista de estas conclusiones, se construyeron dos CyaAs recombinantes, una que contiene el antigeno E7 de HPV16 y la otra al antigeno E7 de HPV18. Además, también se construye una CyaA recombinante bivalente en la cual los antigenos E7 de HPV16 y HPV18 se han insertado juntos (patente EP1576967; Préville et al.). Sin embargo, no se reporta ninguna prueba con una CyaA recombinante en la cual se hayan insertado más de 2 proteínas E7 de HPV en el mismo vector CyaA.
Por lo tanto, Préville et al., describen tres vectores CyaA recombinantes en los cuales se ha insertado el polipéptido E7 del tipo de HPV16 o variantes del mismo. el vector CyaA-E7fu11, que contiene la longitud completa de la proteina E7, el vector CyaA-E7A30-42, que contiene fragmentos de E7 eliminados del dominio ácido desde los aa 30 a 42 el vector CyaA-E749_57, que contiene un epitope de célula T restringido en H-2Db de múrido presente en E7.
Estos vectores CyaA recombinantes se utilizan para inmunizar ratones y para detectar respuestas de CTL especificas de E7. Para medir la respuesta inmune después de la inmunización de los ratones, se efectúan pruebas de liberación de cromo de CTL. En experimentos en animales in vivo, CyaA-E7A30-42 y CyaA-E7fu11 dieron las respuestas inmunes de CTL más eficientes en comparación con CyaA-E749-57.
También se evalúa la capacidad de estos vectores CyaA recombinantes para inducir regresión de tumor. Si la tasa de regresión de tumor conferida por CyaA-E749_57 y CyaA-E7fu11 no puede ser diferenciada en forma notable, CyaA-E7A30-42 es claramente superior en términos de regresión de tumor e inhibición de crecimiento. Por lo tanto, el epitope de CTL individual que demostró previamente ser reconocido en ratones C57BL/6 ha probado ser eficiente, pero no da la respuesta inmune más óptima.
Después se evalúa la persistencia de la respuesta inmune. Se analizan esplenocitos provenientes de algunos ratones sobrevivientes después de 3 meses respecto a su capacidad para lisar células TC-1 que expresan el antigeno E7 y los otros animales sobrevivientes se vuelven a desafiar con células TC-1 en el día 100 después de la vacunación. Los animales vacunados con CyaA-E7¿30-42 despliegan un nivel alto de protección. Menos del 40% de los animales vacunados con CyaA-E749-57 fueron protegidos mientras que 90% a 100% de los animales vacunados con CyaA-E7ñ3o-42 y CyaA-E7fu11 sobrevivieron.
De este trabajo se pueden extraer las siguientes enseñanzas: los vectores CyaA que portan las proteínas E7 de HPV16 y/o HPV18 llevan a una respuesta inmune en ratones C57BL/6; se obtiene una respuesta completa con un antígeno que tiene sus epítopes tanto de célula T CDE8+ como de célula T CD4+ en comparación con el epítope E74g_57 el cual tiene solamente un epítope de célula T CD8+; se obtiene una eficiencia superior en ratones tratados con el vector CyaA-E7A30-42 en la cual la proteína E7 tiene su región ácida eliminada desde los residuos 30 a 42, en comparación con ratones tratados con CyaA-E7fu11 o CyaA—E749-5-7; - la respuesta inmune obtenida con estos vectores es capaz de inducir regresión de lesiones de tumor, se obtiene una respuesta perdurable, debido a que se rechaza un nuevo desafío con células TC-1, en ratones libres de tumor tratados; y es posible la co-inyección de dos CyaAs recombinantes con el fin de desarrollar una terapia bivalente, manteniendo cada antígeno la respuesta contra sus epítopes respectivamente.
Por lo tanto, en la téenica antecedente, tramos de aminoácido ácidos incrustados en ciertos polipéptidos o antígenos y polipéptidos o antígenos cargados negativamente en su totalidad han demostrado alterar la eficiencia de un vector CyaA para translocar estos polipéptidos, a través de la membrana celular de la APC en los animales vacunados. Esto lleva a respuestas inmunes celulares débiles o no protectoras contra dichos antígenos.
Los inventores consideran que esto podría ser considerado como un obstáculo para el diseño de candidatos de fármaco, debido a que dichas secuencias de aminoácido ácidas pueden contener epítopes CD4+ y/o epítopes CD8+ importantes, requeridos para inmunidad celular protectora.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de vectores mejorados que porten construcciones inmunogénicas que puedan ser utilizadas para inducir respuestas inmunes protectoras celulares fuertes y perdurables, en particular en regresión de tumores y en prevención de tumor, contra polipéptidos y antigenos que abarcan tramos de aminoácido ácidos y contra polipéptidos o antigenos cargados negativamente en su totalidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B: (Figura 1A) Mapa esquemático de pKTRACE5-HPV16E7A30-42 en el cual se indican los sitios de restricción y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV16E7¿30-42; (Figura IB) Mapa esquemático de pKTRACE5-HPV18E7A32-42 en el cual se indican los sitios de restricción y las secuencias insertadas relevantes para CyaA-HPV18E7¿32-42.
Figura 2: La proteina gtCyaA y los mutantes de gtCyaA diseñados. Desde los aminoácidos (residuos) 1 a 400, el dominio catalítico (AC); desde los aminoácidos 401 a 1706, el dominio hemolítico. Dentro del dominio catalítico, tres recuadros claros representan las tres regiones descritas como esenciales para la actividad de CyaA ([15], [16], [1]): el dominio I (aa 54-77) implicado en la interacción con ATP, el dominio II (aa 184-198) implicado en la interacción con Mg2+-ATP y el dominio III (aa 287-318) implicado en la interacción con la Calmodulina (CaM). gtCyaAd93 corresponde a la secuencia gtCyaA con 93 aa (228-320) eliminados. gtCyaAd203 corresponde a la secuencia gtCyaA con 203 aa (184-386) eliminados.
Figuras 3A-3B: (Figura 3A) Mapa esquemático del vector pGTPc608 que comprende al polinucleótido gtCyaAd93-pep216 y al gen optimizado cyaC bajo el promotor inducible IPTG; (Figura 3B) mapa esquemático del vector pGTPc608 que comprende el polinucleótido gtCyaAd203-pep216 y al gen cyaC optimizado bajo el promotor inducible IPTG.
Figura 4: Mapa gráfico del plásmido CyaAd203-pepl05. Pepl05 se clona entre los sitios de restricción EcoRI y Xmal.
Figura 5: Frecuencias de E749-57 de HPV16, E7As43-9 de HPV18 y OVA257-264 y de linfocitos T CD8+ específicos y frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (#116-2/3) y E7 de HPV18 (#171-1/2/3), medidas siete días después de la inmunización con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105. Se muestra el número de eventos por millón de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), péptidos restringidos de clase I del MHC de E749-57 de HPV16, E7¾343-49 de HPV18, OVA257-264f bancos de péptidos #116-2/3 y bancos de péptidos #171-1/2/3, durante 20 horas a 37°C, 5% de 002.
Figura 6: Frecuencias de linfocitos T específicos de GP33-41 de LCMV, OVA323-339, MOG35_55 y MAGEA3 medidas siete días después de la inmunización con placebo, ProCervix o CyaAd203-PEP105; Se muestra el número de eventos por millón de esplenocitos totales. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular, de izquierda a derecha, con medio (control), péptidos GP33-4I de LCMV, OVA323-339, MOG35-55, proteina Histag MAGE-A3, o se vuelven a estimular en presencia de la linea B16-GFP de células de tumor B16 y después B16-MAGEA3-GFP utilizada como APC, todas las reestimulaciones durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2.
Figuras 7A-7B: (Figura 7A) Alineación de las secuencias de proteina E7 de HPV16, 18 y 45; recuadro negro: el motivo de unión de pRB; recuadros grises: las cisteinas implicadas en el asa de dedo de zinc; la flecha negra resalta la región ácida; (Figura 7B) Alineación de las secuencias de proteina HPV31, 33, 52 y 58; recuadro negro: motivo LXCXE; recuadros verdes: cisteinas implicadas en el asa de dedo de zinc; recuadro de linea discontinua: para la secuencia de E7 de HPV52, posición del epitope auto-inmune.
Figuras 8A-8B: (Figura 8A) Antigenos de vacunas candidatas trivalentes; (Figura 8B) secuencias de antigenos re-entremezcladas de vacunas candidatas tetravalentes (N-ter: parte N-terminal de la proteina E7; C-ter: parte C-terminal de la proteina E7).
Figura 9: perfil de expresión de proteina después de 3 horas de inducción con IPTG (10: antes de la inducción; 13: después de la inducción) Figura 10: Frecuencias de linfocitos T CD8+ específicos de E749_57 de HPV16 y E7¾s43-49 de HPV18 medidas siete días después de la inmunización; los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos restringidos con clase I del MHC. Los resultados se expresan como número de células que secretan IFN-g por millón de esplenocitos totales.
Figura 11: Frecuencias de linfocitos T secretores de IFN-g de E7 de HPV45 medidas siete días después de la inmunización, los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren la secuencia de péptido completa de E7 de HPV45 (sub combinado 1: #218-1, sub-combinado 2: #218-2, sub-combinado 3: #218-3). Los resultados se expresan como número de células que secretan IFN-g por millón de esplenocitos totales.
Figuras 12A-12B: Prueba de aniquilación in vivo con candidatos trivalentes (Btpr_114, Btprll5 y BTpr_117); Figura 12A: porcentaje de aniquilación in vivo de esplenocitos cargados con las genotecas #171-1 y #171-2 del péptido E7 de HPV18; Figura 12B: porcentaje de aniquilación in vivo de esplenocitos cargados con la genoteca #218-3 del péptido E7 de HPV45.
Figuras 13A-13B(a-g): La vacunación terapéutica utilizando vacunas candidatas de CyaA con coadyuvante poli-ICLC incrustando el antígeno de E7 de HPV16 lleva a eliminación de tumor sólido inducido por TC-1; (Figura 13A) esquema de vacunación: todos los ratones se inoculan en el flanco derecho en el día 0 con células de tumor TC-1; éstos se tratan en el dia 11. (Figura 13B(a-g)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el dia 60.
Figuras 14A-14B(a-j): protección profiláctica de ratones que eliminaron la linea de célula de tumor TC-1 contra el crecimiento de la linea celular LL2-HPV18 E7 o de la linea celular LL2-GFP (Figura 14A) Esquema de vacunación: en el dia 65, los ratones que han eliminado los tumores TC-1 se dividen en dos sub-grupos y se inoculan ya sea con la linea celular LL2-HPV18 E7 o con la linea celular LL2-GFP de control. (Figura 14B (a-j)) Monitoreo del crecimiento de tumor hasta el dia 110.
Figuras 15A-15C: Frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (Figura 15A), E7 de HPV18 (Figura 15B) y E7 de HPV52 (Figura 15C) medidas siete días después de la inmunización - Los esplenocitos totales se volvieron a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren las secuencias de la proteína E7 de HPV16 (Figura 15A), HPV18 (Figura 15B) y HPV52 (Figura 15C). Los sub-combinados de péptidos se indican en los cuadrados. Los resultados se expresan como número de células formadoras de mancha (sfc por sus siglas en inglés) de IFN-g por millón de esplenocitos totales. Las sfc de E7 de HPV18 son muy numerosas para contar (TNTC por sus siglas en inglés).
Figuras 16A-16D: Frecuencias de linfocitos T específicos de E7 de HPV16 (Figura 16A), E7 de HPV18 (Figura 16B), E7 de HPV33 (Figura 16C) y E7 de HPV52 (Figura 16D) secretores de lFN-g medidas siete días después de la inmunización. Los esplenocitos totales se vuelven a estimular con péptidos traslapantes de 15-meros que cubren secuencias de péptido completo de E7 de HPV16 (Figura 16A), HPV18 (Figura 16B), HPV33 (Figura 16C) y HPV52 (Figura 16D) (cada banco de péptido se subdivide en sub-combinados desde el N-terminal hacia el C-terminal de la proteína E7 (como se indica en las lcyendas de los histogra as). Los resultados se expresan como números de células formadoras de manchas de IFN-g por millón de esplenocitos totales.
Figuras 17A-17B: Aniquilación específica de E7 de células cargadas respectivamente con genoteca de péptido E7 de HPV16 (Figura 17A) o genoteca de péptido E7 de HPV18 (Figura 17B) inducida por vacunas candidatas heptavalentes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente invención han desarrollado vectores CyaA nuevos los cuales tienen deleción en el dominio de adenilato cielasa (AC) de la CyaA de tipo silvestre, y en los cuales se han insertado antígenos de tamaño grande (ilustrado con secuencias que tienen hasta 441 residuos de aminoácido pero sin limitarse a lo mismo) y/o presentan cargas electrostáticas altamente negativas también designadas como cargas ácidas (hasta -46). Se analizó la capacidad de estas construcciones para inducir respuestas de célula T CD8+ y CD4+ y citotoxicidad asi como su capacidad para inducir rechazos de tumor. De manera sorpresiva, estos nuevos vectores CyaA han demostrado permitir el suministro de antigenos con carga electrostática negativa alta a las células objetivo. Asimismo, cuando se insertan en estos nuevos vectores, los antigenos con sus dominios ácidos son más eficientes, en pruebas citotóxicas efectuadas bajo condiciones astringentes, en comparación con los mismos antigenos privados de estos dominios ácidos.
La invención está dirigida a un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA, en la cual dicha proteina derivada de CyaA comprende o consiste de: 1) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 182 y 228), fusionado a 2) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 (es decir, entre las posiciones 320 y 388) y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácido de la proteina CyaA de tipo silvestre de Bordetella pertussis . Una modalidad particular de un polinucleótido, que codifica para la CyaA como se indica en SEQ ID NO: 2, es como se indica en SEQ ID NO: 1. Otra modalidad particular de un polinucleótido, que codifica para la CyaA como se indica en SEQ ID NO: 2, es una versión modificada de la secuencia SEQ ID NO: 1, mediante mutaciones de nucleótido silenciosas, es decir, mediante modificaciones que no dan como resultado un cambio al aminoácido de SEQ ID NO: 2. Una versión modificada particular de SEQ ID NO: 1 es una secuencia, optimizada para expresión en E. colí, como se indica en SEQ ID NO: 69. SEQ ID NO: 69 es parte de la invención. Dentro de la presente invención, un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA de la invención no codifica o no comprende un polinucleótido que codifique para SEQ ID NO: 2. Asimismo, un polinucleótido que codifica para proteina derivada de CyaA de la invención no comprende o no consiste de SEQ ID NO: 1.
La proteina derivada de CyaA resultante de la invención que se puede obtener a partir de dicho polinucleótido de la invención comprende o consiste de dos fragmentos, fusionados entre si o recombinados, de la misma proteina CyaA de Bordetella . Mediante "fragmentos", se quiere decir un tramo o una concatenación de residuos de aminoácido consecutivos encontrados en la secuencia de la proteina CyaA de Bordetella de tipo silvestre.
El primer fragmento (la porción N-terminal del polipéptido derivado de CyaA) comienza con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y termina con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2.
Este primer fragmento tiene un tamaño que varia de 183 a 227 residuos, es decir, es de por lo menos 183 residuos y es de cuando mucho 227 residuos de longitud. En una modalidad particular, este fragmento es de por lo menos 183, por lo menos 190, por lo menos 200, por lo menos 210 o por lo menos 220. En una modalidad particular, el tamaño de este primer fragmento es de 183 residuos o es de 227 residuos.
Por lo tanto, este fragmento comienza con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y termina con un residuo que se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 y 227 de SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este primer fragmento comprende o consiste de una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1-193, 1-194, 1-195, 1-196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1- 201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206, 1-207, 1-208, 1- 209, 1-210, 1-211, 1-212, 1-213, 1-214, 1-215, 1-216, 1- 217, 1-218, 1-219, 1-220, 1-221, 1-222, 1-223, 1-224, 1- 225, 1-226, y 1-227 de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad particular, este primer fragmento comprende o consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2 o de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad particular, el polinucleótido que codifica para dicho primer fragmento comienza con el primer nucleótido de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69 y termina con un nucleótido localizado desde la posición 549 hasta la posición 681 de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69, con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. Por lo tanto, el polinucleótido que codifica para este fragmento comprende o consiste de una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 1-549, 1-552, 1-555, 1-558, 1-561, 1-564, 1-567, 1-570, 1-573, 1-576, 1-579, 1- 582, 1-585, 1-588, 1-591, 1-594, 1-597, 1-600, 1-603, 1- 606, 1-609, 1-612, 1-615, 1-618, 1-621, 1-624, 1-627, 1- 630, 1-633, 1-636, 1-639, 1-642, 1-645, 1-648, 1-651, 1- 654, 1-657, 1-660, 1-663, 1-666, 1-669, 1-672, 1-675, 1-678 y 1-681 de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69.
El segundo fragmento (la porción C-terminal del polipéptido derivado de CyaA) comienza con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y termina con el último residuo de SEQ ID NO: 2.
Este segundo fragmento tiene un tamaño que varia de 1320 a 1386 residuos, es decir, es de por lo menos 1320 residuos y es de cuando mucho 1386 residuos de longitud. En una modalidad particular, este fragmento es por lo menos 1320, por lo menos 1330, por lo menos 1340, por lo menos 1350, por lo menos 1360, por lo menos 1370 o por lo menos 1380. En una modalidad particular, el tamaño de este segundo fragmento es de 1320 residuos o es de 1386 residuos.
Por lo tanto, este segundo fragmento comienza con un residuo que se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 y 387 de SEQ ID NO: 2 y termina con el último residuo (es decir residuo 1706) de SEQ ID NO: 2.
En otras palabras, este segundo fragmento comprende o consiste de una secuencia que se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 321-1706, 322-1706, 323-1706, 324-1706, 325-1706, 326-1706, 327-1706, 328-1706, 329-1706, 330-1706, 331-1706, 332-1706, 333-1706, 334-1706, 335-1706, 336-1706, 337-1706, 338-1706, 339-1706, 340-1706, 341-1706, 342-1706, 343-1706, 344-1706, 345-1706, 346-1706, 347-1706, 348-1706, 349-1706, 350-1706, 351-1706, 352-1706, 353-1706, 354-1706, 355-1706, 356-1706, 357-1706, 358-1706, 359-1706, 360-1706, 361-1706, 362-1706, 363-1706, 364-1706, 365-1706, 366-1706, 367-1706, 368-1706, 369-1706, 370-1706, 371-1706, 372-1706, 373-1706, 374-1706, 375-1706, 376-1706, 377-1706, 378-1706, 379-1706, 380-1706, 381-1706, 382-1706, 383-1706, 384-1706, 385-1706, y 387- 1706 de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad particular, este segundo fragmento comprende o consiste de los residuos 321-1706 de SEQ ID NO: 2 o de los residuos 387-1076 de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad particular, el polinucleótido que codifica para dicho segundo fragmento comienza con un nucleótido localizado desde la posición 961 hasta la posición 1159 de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69 y termina con el último nucleótido (es decir, el nucleótido 5118) de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69, con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. Por lo tanto, el polinucleótido que codifica para este segundo fragmento comprende o consiste de una secuencia que se selecciona a partir de grupo que consiste de los residuos 961-5118, 964-5118, 967-5118, 970-5118, 973-5118, 976-5118, 979-5118, 982-5118, 985-5118, 988-5118, 991-5118, 994-5118, 997-5118, 1000-5118, 1003-5118, 1006-5118, 1009-5118, 1012-5118, 1015-5118, 1018-5118, 1021-5118, 1024-5118, 1027-5118, 1030-5118, 1033-5118, 1036-5118, 1039-5118, 1042-5118, 1045-5118, 1048-5118, 1051-5118, 1054-5118, 1057-5118, 1060-5118, 1063-5118, 1066-5118, 1069-5118, 1072-5118, 1075-5118, 1078-5118, 1081-5118, 1084-5118, 1087-5118, 1090-5118, 1093-5118, 1096-5118, 1099-5118, 1102-5118, 1105-5118, 1108-5118, 1111-5118, 1114-5118, 1117-5118, 1120-5118, 1123-5118, 1126-5118, 1129-5118, 1132-5118, 1135-5118, 1138-5118, 1141-5118, 1144-5118, 1147-5118, 1150-5118, 1153-5118, 1156-5118 y 1159-5118 de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 69.
En una modalidad particular, la proteina derivada de CyaA comprende o consiste de un polipéptido de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 10 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad particular, la proteina derivada de CyaA comprende o consiste de un polipéptido de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 12 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2.
También se describen otras modalidades particulares: la proteina derivada de CyaA comprende o consiste de un polipéptido de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 19, es decir, una secuencia que consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, y la proteina derivada de CyaA comprende o consiste de un polipéptido de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 20, es decir, una secuencia que consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2.
La expresión "fusionado(a) a" cuando se hace referencia a una proteina o un polipéptido significa que cada parte del péptido (por ejemplo varios fragmentos de CyaA, y opcionalmente un polipéptido heterólogo) están ligados covalentemente entre si mediante un enlace peptidico. El orden de estas diferentes partes de péptido se describe en la presente solicitud de N-terminal hacia C-terminal, es decir, el último residuo C-terminal de una parte está ligado al primer residuo N-terminal de la otra parte mediante un enlace peptidico. La expresión "fusionado (a) a" cuando se hace referencia a un polinucleótido, significa que dos o más partes del polinucleótido (por ejemplo, varios fragmentos de CyaA de nucleótido, y opcionalmente un nucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo) están ligados covalentemente entre si mediante un enlace tipo fosfodiéster. El orden de estas diferentes partes de nucleótido se describe en la presente invención como de 5' hacia 3', es decir, el último nucleótido 3' de una parte está ligado al primer nucleótido 5' de la otra parte mediante un enlace tipo fosfodiéster. El polinucleótido que consiste de una fusión de secuencias de nucleótido se obtiene en particular como un polinucleótido recombinante, incluyendo mediante deleción de fragmentos de secuencia en la secuencia codificadora nativa de CyaA.
La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA variante, en la cual dicho primer fragmento es una variante con por lo menos 95% de similitud con un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2, y/o en la cual dicho segundo fragmento es una variante con por lo menos 95% de similitud con un fragmento que comienza con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y que termina con el último residuo de SEQ ID NO: 2.
Con la expresión "una variante con por lo menos 95% de similitud" cuando se hace referencia a una proteina o un polipéptido, significa una secuencia de proteina cuya identidad de aminoácido es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% con el polipéptido a partir del cual éste varia. El porcentaje de similitud se calcula, comparando la secuencia de longitud completa tanto de dicha variante como de dicho polipéptido a partir del cual ésta varia, en particular a lo largo de la más corta de las dos secuencias. Por lo tanto, una variante tiene 95% de similitud con un polipéptido, cuando 5% de sus residuos difieren de los residuos de este polipéptido, en una o más adiciones y/o una o más deleciones y/o una o más sustituciones. En una modalidad particular, dicha variante difiere de dicho polipéptido solamente por sustituciones, de preferencia sustituciones conservadoras y por consiguiente ésta mantiene la misma longitud que la secuencia a partir de la cual ésta varia. En otra modalidad, dicha variante difiere de dicho polipéptido en por lo menos 1 deleción de aminoácido individual, de preferencia en 1, 2, 3, 4 ó 5 deleciones de aminoácido individual, de preferencia sustituciones conservadoras.
La invención también se refiere a variantes de polinucleótido que tienen una similitud de por lo menos 75% con los polinucleótidos que codifican para porciones (o fragmentos) de SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, el polinucleótido que codifica para dicho primer fragmento tiene una similitud de 75% con un polinucleótido que comienza con el primer nucleótido de SEQ ID NO: 1 y termina con un nucleótido localizado desde la posición 549 hasta la posición 681 de SEQ ID NO: 1 con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. En otra modalidad, independientemente o en combinación con la afirmación anterior, el polinucleótido que codifica para dicho segundo fragmento tiene una similitud de 75% con un polinucleótido que comienza con un nucleótido localizado desde la posición 961 hasta la posición 1159 de SEQ ID NO: 1 y que termina con el último nucleótido (es decir, el nucleótido 5118) de SEQ ID NO: 1, con la condición que la longitud de dicho fragmento de nucleótido sea un múltiplo de 3. En una modalidad particular, los polinucleótidos que codifican para dichos primero y segundo fragmentos se originan a partir de un polinucleótido, cuya secuencia de longitud completa tiene por lo menos 75% de similitud con SEQ ID NO: 1. Un ejemplo de dicha variante es SEQ ID NO: 69. En una modalidad particular, la variante de polinucleótido resulta de la degeneración del código genético aplicado al polinucleótido obtenido a partir de SEQ ID NO: 1 como se describe anteriormente o al polinucleótido de SEQ ID NO: 69. En una modalidad particular, la variante de polinucleótido obtenida de esta manera tiene una base degenerada en la posición oscilante.
Con la expresión "una variante con por lo menos 75% de similitud" cuando se hace referencia a un polinucleótido, quiere decir una secuencia de nucleótido cuya identidad de nucleótido es por lo menos 75%, por lo menos 79%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% con el polinucleótido a partir del cual ésta varia. El porcentaje de similitud se calcula, comparando la secuencia de longitud completa tanto de dicha variante como del polinucleótido a partir del cual ésta varia, en particular a través de la más corta de las dos secuencias. Por lo tanto, una variante tiene 75% de similitud con un polinucleótido, cuando el 25% de sus nucleótidos difiere de los nucleótidos de dicho polinucleótido, en una o más adiciones de nucleótido y/o una o más deleciones de nucleótido y/o una o más sustituciones de nucleótido. En una modalidad particular, dicha variante difiere solamente por sustituciones de nucleótido, y por consiguiente ésta mantiene la misma longitud que la secuencia a partir de la cual ésta varia. En una modalidad particular, dicha variante difiere solamente por mutaciones silenciosas de nucleótido, y por consiguiente ésta sigue codificando para la misma proteina que aquella codificada por la secuencia a partir de la cual ésta varía. En una modalidad particular, dicha variante difiere solamente por sustituciones de nucleótido, de las cuales una parte son mutaciones silenciosas, tal que la secuencia de la proteína codificada por dicha variante de polinucleótido tiene por lo menos 95% de similitud con una proteina de polipéptido de la invención, o tiene 100% de identidad.
Los porcentajes de similitud de nucleótido y proteína como se indican en la presente solicitud se pueden calcular utilizando programas bien conocidos basados en el algoritmo de Needleman y Wunsch, tal como MeAlign [18].
En una modalidad particular, la proteina derivada de CyaA variante como se define en la presente solicitud mantiene su capacidad para unirse a células objetivo y/o para translocar su dominio de adenilato cielasa (AC) en el citosol de las células objetivo. En una modalidad particular, las células objetivo son células que expresan CDllb, es decir células que expresan al receptor CDllb/CD18 sobre sus superficies (CDllb+). En particular, estas células son granulocitos/neutrófilos, macrófagos, células NK, subconjuntos de T CD8+, subconjuntos de células B, células dendriticas tales como las células de Langerhans o células dendriticas mieloides.
La capacidad de las variantes de la invención para unirse a las células objetivo se puede analizar en especial de conformidad con los métodos descritos en el documento EP03291486 o en la solicitud WO02/22169. Asimismo, se puede analizar la capacidad de la variante para translocar su dominio N-terminal en el citosol de las células objetivo aplicando el método descrito en la solicitud WO02/22169, o el método detallado en el ejemplo A con el péptido pl05.
Las variantes de la secuencia de tipo silvestre de longitud completa de la proteina de CyaA de Bordetella pertussis son conocidas; la ilustración de dichas variantes se provee mediante referencia a sus secuencias como se indica en SEQ ID NO: 4 (proteina CyaA de Bordetella hinzii) , SEQ ID NO: 6 (proteína CyaA de B rdetela parapertussis) y SEQ ID NO: 8 (proteína CyaA de Bordetella bronchiseptica ) . La secuencia de nucleótido, que codifica para SEQ ID NOs: 4, 6 y 8, es como se indica en SEQ ID NOs: 3, 5 y 7 respectivamente o es una variante de SEQ ID Nos: 3, 5 y 7 mediante mutaciones silenciosas. Dentro de la presente invención, la proteina derivada de CyaA no comprende o no consiste de SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y 8. Asimismo, un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA variante de la invención no comprende o no consiste de SEQ ID NOs: 3, 5 ó 7.
En una modalidad particular de la invención, un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA variante, de preferencia como variante de una proteína derivada de CyaA de B. pertussis como se define en la presente solicitud, es un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende o consiste de: a) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con el primer residuo de SEQ ID NO: 4, 6 u 8 y termina con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 4, 6 u 8 fusionado a b) un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella como se indica respectivamente en SEQ ID NO: 4, 6 u 8, la secuencia de dicho fragmento comienza con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 4, 6, u 8 y termina con el último residuo de SEQ ID NO: 4, 6 u 8.
Las definiciones dadas anteriormente para la proteina derivada de CyaA particular que comprende los fragmentos de SEQ ID NO: 2 se aplican de forma idéntica a la proteina derivada de CyaA variante que comprende los fragmentos de SEQ ID NO: 4 y 6.
Con respecto a la proteina derivada de CyaA variante que comprende los fragmentos de SEQ ID NO: 8, todas las definiciones se aplican en forma idéntica, excepto que el último residuo de SEQ ID NO: 8 es el residuo 1705 en lugar del residuo 1706. Por lo tanto, para la proteina derivada de CyaA variante que comprende los fragmentos de SEQ ID NO: 8, todos los aspectos que se refieren al residuo 1706 deben ser reemplazados por el residuo 1705. En particular, el segundo fragmento tiene un tamaño que varía de 1319 a 1385 residuos, y de preferencia es de 1319 residuos o 1385 residuos de longitud. Con respecto a un polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA variante que comprende los fragmentos de SEQ ID NO: 8, todas las definiciones y modalidades que se refieren al nucleótido 5118 deben ser remplazados por el nucleótido 5115.
Los polinucleótidos particulares que codifican para las proteínas derivadas CyaA variantes de la invención se seleccionan de entre un polinucleótido que comprende o consiste de: 1) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 13 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 4; 2) un polinucleótido que codifica para el polipéptido en SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 14 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 4 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 4; 3) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 15 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 6; 4) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 16 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 6 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 6; 5) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 17 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO: 8; y 6) un polinucleótido que codifica para el polipéptido como se indica en SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 18 consiste de un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8 fusionado a un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8.
El polinucleótido que codifica para la proteina derivada de CyaA o la proteina derivada de CyaA variante de la invención también se puede definir como una versión, que tiene deleción, de la secuencia de nucleótido que codifica para CyaA de Bordetella de longitud completa, es decir, un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende o que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 hasta el grado en que éste tenga deleción para un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido cuyo primer residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo último residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. En una modalidad particular, dicho polinucleótido codifica para un polipéptido que comprende o consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, el cual tiene deleción para un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido cuyo primer residuo de aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, y 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo último residuo de aminoácido se selecciona a partir del grupo que consiste de los residuos 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385 ó 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente.
También es parte de la invención un método para producir un polinucleótido que codifica para la proteina derivada de CyaA en particular una proteina derivada de CyaA variante de la invención que se describe en la presente solicitud. Este método comprende los pasos de (a) eliminar, de un polinucleótido que codifica para CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleótido de residuos de nucleótido consecutivos en dichas secuencias, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8, y cuyos últimos tres nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8; y (b) recuperar dicho polinucleótido.
De manera alternativa, el polinucleótido que codifica para la proteina derivada de CyaA se sintetiza químicamente, utilizando métodos convencionales, de conformidad con la secuencia de proteína derivada de CyaA que se busca, y tomando en consideración opcionalmente la degeneración del código genético y/o la optimización de la expresión.
La invención también está dirigida a las proteínas derivadas de CyaA codificadas por los polinucleótidos de la invención, descritos en la presente solicitud. Las proteínas derivadas de CyaA particulares consisten de una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20.
Dentro del marco de la invención, se utiliza un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA, incluyendo una proteína derivada de CyaA variante, para producir un polinucleótido quimérico de la invención que codifica para una proteína quimérica que comprende o que consiste de dicha proteína derivada de CyaA o proteína derivada de CyaA variante, y un polipéptido heterólogo, en el cual el polinucleótido codifica para dicho polipéptido heterólogo sustituye el fragmento de nucleótido de CyaA eliminado.
Por consiguiente, la invención se refiere a un polinucleótido quimérico, es decir, un polinucleótido que codifica para una proteina quimérica como se define en la presente solicitud, en la cual se aplican todas y cada una de las modalidades descritas en la presente solicitud con relación al polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para producir un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica, que comprende: (a) eliminar, de un polinucleótido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8 o que codifica para una variante con por lo menos 95% de similitud con SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos últimos 3 nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6, u 8; (b) insertar, en el polinucleótido obtenido en (a) y en el sitio de fragmento de nucleótido eliminado, un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultáneamente; y (c) recuperar dicho polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
La invención también se refiere a un método para producir una proteina quimérica, que comprende: (a) eliminar, a partir de un polinucleótido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o que codifica para una variante con por lo menos 95% de similitud con SEQ ID NO: 2, un fragmento de nucleótido, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos últimos 3 nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8; (b) insertar, en el polinucleótido obtenido en (a) y en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado, un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo; en el cual los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultáneamente; (c) expresar, en una célula, el polinucleótido obtenido en (b); y (d) recuperar dicha proteína quimérica expresada.
El método para producir la proteína quimérica de la invención también puede comprender el paso de combinar en una construcción de polinucleótido quimérico el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteina CyaA. En una modalidad preferida, el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteína CyaA se combinan en una construcción en tal forma que después de dicha combinación, el polinucleótido quimérico obtenido comprende o contiene, del extremo 5' hacia el extremo 3', la construcción de polinucleótido del paso (b) seguido por una construcción de polinucleótido que codifica para una proteína CyaA de una cepa de Bordetella , en particular de una cepa de Bordetella pertussis .
Dentro de la presente invención, cuando se hace referencia a los "primeros tres nucleótidos" o a los" últimos tres nucleótidos", se entiende que estos tres nucleótidos se refieren a un codón que corresponde, de conformidad con el código genético, a un residuo de aminoácido identificado por su posición en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8. Por lo tanto, el tamaño de la deleción del nucleótido del polinucleótido es un múltiplo de 3. Asimismo, además de ser un múltiplo de 3 en tamaño, la deleción de nucleótido del polinucleótido está en marco, es decir, la deleción retira los residuos de aminoácidos buscados sin modificar el marco de lectura, y sin modificar los residuos que rodean (corriente arriba y corriente abajo) la deleción.
El orden de los pasos de deleción y del paso de inserción es indiferente y ambos pasos se pueden efectuar simultáneamente.
En una primera modalidad del método, el paso de deleción se implementa antes del paso de inserción. Por lo tanto, una vez que se ha efectuado la deleción del fragmento, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado. Con "en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado" se quiere decir que el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta entre el lado N-terminal de CyaA (correspondientes al primer fragmento de CyaA) y el lado C-terminal de CyaA (correspondiente al segundo fragmento de CyaA). El sitio de inserción se puede identificar fácilmente, debido a que la secuencia tanto del lado N-terminal como del lado C-terminal de CyaA son idénticas a la secuencia de la parte N-terminal y parte C-terminal de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o variantes de conformidad con la invención.
En una segunda modalidad, el paso de inserción se implementa antes del paso de deleción. Una vez que el fragmento que se va a eliminar ha sido identificado, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo se inserta ya sea corriente arriba (en 5') de los tres nucleótidos (codón) que codifican para el primer residuo del fragmento que se va a eliminar, o corriente abajo (en 3') de los últimos tres nucleótidos (codón) que codifican para el ultimo residuo del fragmento que se va a eliminar. Una vez que se ha hecho la inserción del polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo, el fragmento que se va a eliminar se corta del polinucleótido que codifica para la molécula de CyaA/polipéptido heterólogo.
En una tercera modalidad, tanto los pasos de deleción como de inserción se efectúan simultáneamente, es decir, en un solo paso de reacción, utilizando enzimas de restricción apropiadas.
En una modalidad particular del método, el paso de deleción comprende eliminar, de un polinucleótido que codifica para una CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 228 a 320 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 184 a 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 228 a 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 184 a 320 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o variantes de conformidad con la invención.
En otra modalidad, el paso de deleción comprende eliminar, de un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69, un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 682 a 960 de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 550 a 1158 de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69, o un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 682 a 1158 de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 550 a 960 de SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 o SEQ ID NO: 69.
Para efectuar la deleción del fragmento, el experto en la téenica posiblemente necesite efectuar una deleción mas grande en el polinucleótido que codifica para CyaA y después compensar cuando clone el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo para lograr la deleción antes descrita como un resultado final.
De manera alternativa, el polinucleótido quimérico que codifica para la proteina quimérica de la invención se sintetiza químicamente, utilizando métodos convencionales, de conformidad con la secuencia de proteina quimérica buscada, y opcionalmente tomando en consideración la degeneración del código genético y/o la optimización de la expresión. Por lo ttaannttoo,, dicho polinucleótido sintetizado químicamente se expresa en una célula y la proteina quimérica expresada de este modo se recupera.
La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica para una proteína quimérica, dicho polinucleótido comprende o consiste, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2, o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteína derivada de CyaA, con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2, se aplican en forma idéntica a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a las variantes con por lo menos 95% se aplican en forma idéntica a las variantes de los fragmentos descritos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
En una modalidad particular, dicho polinucleótido que codifica para una proteina quimérica se selecciona a partir del grupo que consiste de: 1) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 2) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 3) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 4) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3' , (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 5) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 6) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 7) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo, y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; y 8) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO: 8; En una modalidad particular de cualquier polinucleótido que codifica para una proteina quimérica como se define en la presente solicitud, el polinucleótido de (a) está fusionado al polinucleótido de (b) el cual por si mismo está fusionado al polinucleótido de (c).
Dentro de la presente invención, el polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo tiene un tamaño que es un múltiplo de 3, con el fin de mantener el marco de lectura del polinucleótido de (c) (por ejemplo, el marco de lectura del fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2 o variante de la misma).
En una modalidad particular de la invención, el polinucleótido quimérico también comprende, en su extremo 3' un polinucleótido que codifica para la proteina CyaA de una cepa de Bordetella en particular de una cepa de Bordetella pertussis .
Utilizando el método descrito en la presente solicitud se puede obtener o es obtenible un polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
La invención también está dirigida a un vector de ácido nucleico, tal como un plásmido, que comprende un polinucleótido como el definido en la presente solicitud, es decir, cualquiera de un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA incluyendo una proteina derivada de CyaA variante, o un polinucleótido que codifica para una proteina quimérica. En una modalidad particular, el vector es un vector de expresión, es decir, un vector que comprende, además de los elementos explícitamente mencionados, todos los elementos necesarios para controlar la expresión del polinucleótido de la invención (secuencia de control de expresión), y particularmente los elementos reguladores de la transcripción. "Elemento regulador de la transcripción" define cualesquiera regiones de ADN implicadas en la regulación de la transcripción del polinucleótido y abarca un promotor, tal como un promotor inducible mediante IPTG, por ejemplo el promotor lac, tac o T7, o un promotor inducible por cambio de temperatura, por ejemplo el promotor pR o mL de fago lambda, elementos incrementadores o reguladores que actúan en cis. Estos elementos, y en particular el promotor, se eligen dependiendo de la naturaleza de las células que se van a transfectar con el vector de ácido nucleico. La determinación del promotor apropiado, de conformidad con el nivel de expresión buscado o con la célula transfectada, forma parte del conocimiento del experto en la téenica. En una modalidad particular, dicho vector es un plásmido. Los ejemplos de plásmidos convencionales apropiados para la preparación del vector de la invención son pUC o pBR322.
En una modalidad particular, dicho vector de ácido nucleico también comprende la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella, tal como el gen de CyaC de B. pertussis como se indica en SEQ ID NO: 21. En otra modalidad, dicho vector de ácido nucleico también comprende una versión de la secuencia que codifica para CyaC de una cepa de Bordetella la cual está optimizada para una mejor expresión en un tipo celular particular, en particular optimizada para una mejor expresión en E. coli . Una versión optimizada de la secuencia de CyaC para E. coli es como se indica en SEQ ID NO: 22.
Los plásmidos particulares que se pueden utilizar para producir una proteina quimérica como se define en la invención son aquellos descritos en la sección de materiales y métodos, y cuyas secuencias se indican en SEQ ID NOs: 59, 62, 65 y 68. El polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo contenido en estos cuatro plásmidos se puede eliminar y remplazar con un polinucleótido que codifique para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. Por lo tanto, partiendo del plásmido de SEQ ID NO: 59, la secuencia contenida entre los nucleótidos 904 y 1731 se elimina y remplaza con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de SEQ ID NO: 62, la secuencia obtenida entre los nucleótidos 772 y 1599 se retira y es remplazada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de SEQ ID NO: 65, la secuencia contenida entre los nucleótidos 904 y 1836 se retira y es remplazada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud. De manera alternativa, partiendo del plásmido de SEQ ID NO: 68, la secuencia contenida entre los nucleótidos 772 y 1704 se retira y es remplazada por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo como se describe en la presente solicitud.
Vale la pena mencionar que, cuando el vector nucleico contiene varios polinucleótidos, el(los) elemento(s) regulador(es) de la transcripción puede(n) ser único(s) para todos los polinucleótidos o ser compartido(s) por algunos de ellos o en contraste cada polinucleótido puede estar asociado con uno o más elementos reguladores de transcripción particulares. En el último caso, los diversos elementos reguladores de transcripción pueden ser similares o diferentes.
La invención también está dirigida a una célula (de preferencia aislada) o a un cultivo celular que comprende un polinucleótido como el definido en la presente solicitud, es decir, cualquiera de un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA incluyendo una proteina derivada de CyaA variante, o un polinucleótido que codifica para una proteina quimérica, o que comprende un vector como el definido en la presente solicitud. En una modalidad particular, dicha célula o cultivo celular se transfecta con un vector de la invención.
Dicha célula puede ser una célula procariota o un cultivo celular hecho a partir de células procariotas. En una modalidad particular, dicha célula es apropiada para expresar y/o para producir proteína(s) recombinante(s). En una modalidad particular, dicha célula o cultivo celular es una bacteria o un cultivo bacteriano. En una modalidad preferida, dicha célula o cultivo celular es un cultivo de cepa de E. coli, tal como la cepa BL21, BLR, TG1 o HMS174.
Por lo tanto, la célula o cultivo celular de la invención expresa el polinucleótido de la invención, es decir, ya sea un polinucleótido que codifica para una proteína derivada de CyaA incluyendo la proteína derivada de CyaA variante, o un polinucleótido que codifica para una proteina quimérica, y cuando sea apropiado, simultáneamente el gen cyaC o una versión optimizada del gen cyaC.
El término "CyaA" o "proteina derivada de CyaA" o "proteina quimérica" abarca, y de preferencia es, una versión modificada posterior a la traducción de la proteina CyaA de Bordetella . Por lo tanto, en una modalidad particular, dicha "proteina derivada de CyaA" o "proteina quimérica" de la invención es modificada mediante acilación posterior a la traducción de por lo menos uno de sus residuos, en particular por lo menos uno de los dos, de preferencia los dos residuos lisina correspondientes a los residuos localizados en las posiciones 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los residuos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica. Con "acilación", se quiere decir en la presente solicitud modificación con palmitoilo, es decir, adición de palmitato y/o grupo(s) palmitoleato en el residuo o residuos de CyaA, de la proteina derivada de CyaA o de la proteina quimérica de la invención. Por lo tanto, dicha "proteina derivada de CyaA" o "proteina quimérica" lleva un grupo palmitoilo en algunos de estos residuos, de preferencia en uno de los dos, o los dos residuos lisina correspondientes a los residuos 860 y 983 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B.pertussis, B. hinzii o B. parapertussis o correspondientes a los residuos localizados en las posiciones 859 y 982 de la secuencia de longitud completa de CyaA de B. bronchiseptica . Con "correspondiente a", se quiere decir que el residuo o residuos que está(n) modificado(s) posterior a la traducción en la proteina derivada de CyaA o proteina quimérica de la invención es(son) aquellos cuya posición coincide con las U sinas 860 y 983 en la secuencia de CyaA de B. pertussis , B. hinzii o B. parapertussis (SEQ ID NO: 2, 4 y 6 respectivamente) o las U sinas 859 y 982 en la secuencia de CyaA de B. bronchiseptica (SEQ ID NO: 8). La identificación de estos residuos lisina en las proteínas de la invención puede ser efectuada por el experto de la téenica, alineando y comprando la secuencia de las proteínas de la invención con la secuencia como se define en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.
El procedimiento de modificación con palmitoilo es mediado por el gen cyaC de una especie de Bordetella, de preferencia de la secuencia que codifica para CyaC de Bordetella pertussis, cuya secuencia natural se indica en SEQ ID NO: 21. Una versión de la secuencia que codifica para CyaC, optimizada para producción en E. coli, se indica en SEQ ID NO: 22. Esta modificación o modificaciones posteriores a la traducción se puede(n) obtener mediante co-expresión del polinucleótido que codifica para la proteína CyaA, el polinucleótido que codifica para la proteína derivada de CyaA de la invención o el polinucleótido que codifica para la proteína quimérica de la invención, y del gen cyaC.
En una modalidad particular, la construcción de polinucleótido de la invención que expresa las proteínas CyaC y CyaA comprende del extremo 5' hacia el extremo 3', el polinucleótido o gen cyaA, que consiste de manera conveniente de una secuencia optimizada para expresión en una célula hospedera determinada, por ejemplo E. coli y el polinucleótido o gen cyaC, que consiste de manera conveniente de una secuencia optimizada para expresión en una célula hospedera determinada, por ejemplo E. coli . Este orden de la inserción de los polinucleótidos en la construcción favorece la expresión de las proteínas CyaA y CyaC en cantidades respectivas y conformación apropiada para incrementar la eficiencia de expresión de la versión de CyaA modificada después de la traducción.
En una modalidad particular de la invención, excepto por la deleción del fragmento [cuyo primer residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo último residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente] efectuada en la proteína CyaA de Bordetella de tipo silvestre descrita en la presente solicitud, la proteína derivada de CyaA de la invención o la parte de CyaA de la proteína quimérica no experimenta ninguna otra variación (adición, deleción y/o sustitución) en comparación con SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8.
Como un aspecto interesante, la proteína derivada de CyaA así como la proteína quimérica de la invención son no citotóxicas es decir, su actividad enzimática ha sido inactivada después de la deleción del fragmento cuyo primer residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente, y cuyo último residuo de aminoácido está localizado desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. Por lo tanto, en una modalidad particular, no se ha efectuado inserción, deleción o sustitución. En particular, cuando los residuos 188 y 189 de CyaA todavía siguen presentes en las proteínas de la invención, no se inserta dipéptido (tal como el dipéptido LQ o GS) entre los residuos 188 y 189.
La invención también está dirigida a una proteína quimérica la cual es codificada por un polinucleótído de la invención, expresada a partir de un vector de la invención o que se produce mediante un cultivo celular de la invención.
Una proteína quimérica de la invención comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando en un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando en el último residuo de SEQ ID NO: 2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteína CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2, se aplican en forma idéntica a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a las variantes con por lo menos 95% se aplican en forma idéntica a los fragmentos descritos en el contexto de una proteina quimérica.
Por lo tanto, la invención también está dirigida a una proteina quimérica que comprende o consiste de: 1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 2) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 3) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; y 4) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8.
En una modalidad particular de las proteínas quiméricas como se definen en la presente solicitud, el fragmento de (a) está fusionado al polipéptido heterólogo de (b) el cual por sí mismo está fusionado al fragmento de (c).
Con "quimérico", se quiere decir que la proteína comprende o consiste de, como se define en la presente solicitud, de fragmentos que se originan a partir de una CyaA de Bordetella, y un polipéptido el cual no se origina a partir de una CyaA de Bordetella . Por lo tanto, se dice que dicho polipéptido es heterólogo, es decir, su secuencia general no es idéntica a una parte de una CyaA de Bordetella, en particular, a una parte de CyaA como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8; en una modalidad particular, la secuencia general de este polipéptido heterólogo no es similar a una parte de una CyaA de Bordetella, en particular a una parte de una CyaA como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, es decir, su secuencia tiene una similitud que es menor de 80%, menor de 70%, menor de 60%, menor de 50%, menor de 40%, menor de 30%, o menor de 20% con una parte de una CyaA de Bordetella, en particular con una parte de una proteína CyaA como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, dicha similitud se calcula para esta definición comparando la secuencia del polipéptido heterólogo y la de la parte de una CyaA de Bordetella en tamaño equivalente (el polipéptido heterólogo y la parte de una CyaA de Bordetella tienen el mismo tamaño). En una modalidad particular, la secuencia del péptido heterólogo y la secuencia de las porciones (o fragmento) que se originan a partir de CyaA de Bordetella como se define en la presente solicitud, no comparten identidad (100% de similitud) a lo largo de más de 7 residuos de aminoácido consecutivos.
En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo tiene un tamaño que varia de 9 a 500 residuos de aminoácido, en particular 9 a 400 residuos, 9 a 300 residuos, 9 a 200 residuos, 9 a 100 residuos, 20 a 500 residuos, 20 a 400 residuos, 20 a 300 residuos, 20 a 200 residuos, 20 a 100 residuos, 50 a 500 residuos, 50 a 400 residuos, 50 a 300 residuos, 50 a 200 residuos, 50 a 100 residuos, 100 a 500 residuos, 100 a 400 residuos, 100 a 300 residuos, o 100 a 200. El tamaño del polinucleótido que codifica para el polipéptido heterólogo varia de 27 a 1500 nucleótidos, en particular 27 a 1200 nucleótidos, 27 a 900 nucleótidos, 27 a 600 nucleótidos, 27 a 300 nucleótidos, 60 a 1500 nucleótidos, 60 a 1200 nucleótidos, 60 a 900 nucleótidos, 60 a 600 nucleótidos, 60 a 300 nucleótidos, 150 a 1500 nucleótidos, 150 a 1200 nucleótidos, 150 a 900 nucleótidos, 150 a 600 nucleótidos, 150 a 300 nucleótidos, 300 a 1500 nucleótidos, 30 a 1200 nucleótidos, 300 a 900 nucleótidos o 300 a 600, con la condición que el tamaño (número de nucleótidos) del polinucleótido sea un múltiplo de 3.
En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo, de preferencia en combinación con los intervalos de tamaño definidos anteriormente, tiene una carga electrostática negativa, es decir, el polipéptido heterólogo es ácido. En otra modalidad, un fragmento del polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática que es negativa, es decir, este fragmento de dicho polipéptido heterólogo es ácido. Un fragmento del polipéptido heterólogo se define como una concatenación de residuos de aminoácido consecutivos, cuyo tamaño es de 10% hasta 40%, de preferencia 15% a 30%, del tamaño del polipéptido heterólogo completo.
En particular, la carga electrostática se define como el número de residuos lisina y arginina menos el número de residuos de ácido aspártico y ácido glutámico contenidos en el polipéptido heterólogo. En una modalidad, la carga electrostática del polipéptido heterólogo es igual a -1 o es menos de -1, y en particular es igual o a menor que -2, -3, -4, -5, -10, -15, -20, -30, -40, -45 ó -50. En una modalidad particular, de preferencia en combinación con uno de los valores de la oración anterior, la carga electrostática del polipéptido heterólogo no es menor de -55, -60, -70 ó -80. En otras palabras, la carga electrostática del polipéptido heterólogo está en el intervalo de -55 a -1, -50 a -2, ó -40 a -3. Como comparación, el epitope OVA clásico (SIINFEKL) tiene una carga electrostática de 0.
Los ejemplos de varios polipéptidos heterólogos, analizados dentro de las proteínas quiméricas de la invención, se reportan en la presente solicitud: - péptido 216 (SEQ ID NO: 34), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_114 y Btpr_116, tiene una carga electrostática de -16; - péptido 217 (SEQ ID NO: 36), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_115 y Btpr_117, tiene una carga electrostática de -37; - péptido 233 (SEQ ID NO: 38), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_143 y Btpr_144, tiene una carga electrostática de -13; - péptido 234 (SEQ ID NO: 40), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_145 y Btpr_146, tiene una carga electrostática de -38; - péptido 326(SEQ ID NO: 42), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_161 y Btpr_169, tiene una carga electrostática de -11; - péptido 327 (SEQ ID NO: 46), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_162 y Btpr_170, tiene una carga electrostática de -10; - péptido 328 (SEQ ID NO: 50), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_163 y Btpr_1171, tiene una carga electrostática de -18; - péptido 329 (SEQ ID NO: 54), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_164 y Btpr_172, tiene una carga electrostática de -19; - péptido 330 (SEQ ID NO: 44), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_165 y Btpr_173, tiene una carga electrostática de -30; - péptido 331 (SEQ ID NO: 48), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_166 y Btpr_17 , tiene una carga electrostática de -30; - péptido 332 (SEQ ID NO: 52), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_167 y Btpr_175, tiene una carga electrostática de -45; y - péptido 333 (SEQ ID NO: 56), analizado en las proteínas quiméricas Btpr_168 y Btpr_176, tiene una carga electrostática de -46.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de uno o varios antígenos, comprendiendo cada antígeno uno o varios epítopes como se define en la presente solicitud. Dentro de la presente invención, un antigeno se define como un polipéptido que es capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de célula T contra uno o varios epitopes contenidos en este polipéptido (polipéptido inmunogénico). Un antigeno es cualquiera de un polipéptido antigénico de longitud completa de origen celular o viral, un fragmento de este polipéptido antigénico de longitud completa capaz de provocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune de célula T, contra un determinante antigénico contenido en este fragmento, o un polipéptido sintético, no natural que porta al epitope o epitopes que consisten de varias partes del polipéptido antigénico fusionadas entre si o un polipéptido sintético, no natural que consiste de una o varias partes de varios polipéptidos antigénicos fusionadas entre si, con la condición que el polipéptido sintético sea capaz de provocar una respuesta de célula inmune T, contra un determinante antigénico contenido en este polipéptido sintético.
Por lo tanto, dicho polipéptido heterólogo lleva, comprende o consiste de por lo menos un epitope o epitopes, de preferencia por lo menos un epitope o epitopes CD8+ y/o por lo menos un epitope o epitopes CD4+. Con la expresión "por lo menos" se quiere decir uno o una pluralidad de epitopes. Un epitope se define en la presente solicitud como cualquier secuencia de aminoácido implicada en la provocación o inducción de una respuesta inmune mediada por célula, especialmente una respuesta inmune de célula T, y puede ser lineal o conformacional. Por consiguiente, los epitopes descritos en la presente solicitud incluyen aquellos que son procesados por las APC (células presentadoras de antigeno) en un hospedero, especialmente epitopes T reconocidos en asociación con el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I, tal como los epitopes cuyas células objetivo son linfocitos T CD8+, o epitopes T reconocidos en asociación con moléculas del MHC clase II tal como aquellos cuyas células objetivo son linfocitos T CD4+. Los epitopes dentro de la presente invención de preferencia tienen un tamaño que varia de 9 a 17, de preferencia 9 a 12 residuos. Los epitopes descritos en la presente solicitud incluyen también epítope(s) B implicado(s) en la respuesta humoral.
Los inventores han diseñado un polipéptido heterólogo particular que comprende varios antigenos con varios orígenes. Este polipéptido heterólogo porta antigenos que incluyen epitopes de célula T restringidos por la clase I de MHC (respuesta CD8) y clase II de MHC (respuesta CD4) de humano y de múrido: GFP11,MOG35-55, OVA257-264 r IE191-110, CLA4, HA512-52O r OVA323-339 r MELAN-A26-35, HA307-319 LCMV GP33_4i, MAGEA3111-180, MAGEA3244-285 fragmento de E7 de HPV16 y fragmento de E7 de HPV18. La secuencia de aminoácido de este antigeno es como se indica en SEQ ID NO: 24, y es parte de la presente invención.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o dicho por lo menos un epitope o epitopes son de origen viral. Por lo tanto, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de V1H, VHB, VHC, adenovirus, EBV, herpes virus, virus HTLV.l y CMV. En una modalidad particular, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de HPV. En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo, por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes no se originan a partir de HPV. En una modalidad particular, cuando el polipéptido comprende o consiste de más de un epitopes o de más de un antigeno, dichos epitopes o antigenos se originan a partir del mismo Orden, el mismo Grupo, la misma Familia, la misma Subfamilia, el mismo Género o la misma Especie y/o se origina a partir de Ordenes diferentes, Grupos diferentes, Familias diferentes, Subfamilias diferentes, Géneros diferentes o Especies diferentes.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos un antígeno o antígenos o por lo menos un epítope o epitopes, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes son de origen celular. Por lo tanto, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de una célula procariota o eucariota.
En una modalidad, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de bacterias, hongos o un parásito, tal como, pero sin limitarse a, Chlamydia, Plasmodium, Candida, Leishmania o Mycobacterium tuberculosis. En una modalidad particular, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes no se originan a partir de cepa de Bordetella . En otra modalidad particular, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de un antigeno de una cepa de Bordetella la cual no es CyaA. En una modalidad particular, cuando el polipéptido comprende o consiste de más de un epitope o más de un antigeno, dichos epitopes o antigenos se originan a partir de las mismas bacterias, los mismos hongos o el mismo parásito. En otra modalidad, cuando el polipéptido comprende o consiste de más de un epitope o más de un antigeno, dichos epitopes o antigenos se originan a partir de bacterias diferentes, hongos diferentes o parásitos diferentes.
En otra modalidad, dicho por lo menos un antigeno o antigenos o por lo menos un epitope o epitopes se originan a partir de célula de mamífero. En una modalidad particular, dicho por lo menos un antígeno o antígenos o por lo menos un epitope o epitopes provienen de un antígeno de tumor, es decir, un péptido expresado por tumor o por células cancerosas, siendo el tumor propio o inducido por un patógeno; en una modalidad particular, el antígeno de tumor es propio, en particular de origen humano. El término "antígeno de tumor" abarca los siguientes grupos de antígenos de tumor, y el polipéptido heterólogo contenido en la proteína quimérica de la invención se puede elegir en por lo menos los siguientes grupos: (a) antígenos de tumor oncofetal, (b) antígenos de tumor oncoviral, (c) antígenos de tumor sobre-expresados/acumulados, expresados en una amplia variedad de tejidos normales y sobre-expresados en tumores, (d) antígenos específicos de tumor compartidos o antígenos de testículo de cáncer, expresados en muchos tumores pero no en los tejidos normales incluyendo la familia BAGE, familia GAGE, familia MAGE, familia SAGE y familia XAGE, (e) antígenos de tumor restringidos por linaje, (f) antígenos de tumor mutados, que resultan de mutaciones puntuales en los genes que están expresados en forma ubicua, y (g) antígenos de tumor de diferenciación, expresados en el tejido normal de origen de los tumores pero que no son específicos de tumor.
Cuando un polipéptido heterólogo de la invención comprende varios antígenos, estos antígenos están ya sea fusionados, están separados por enlazadores peptídicos o por lo menos dos de dichos antígenos están fusionados mientras que por lo menos dos de dichos antígenos están separados por un enlazador. En una modalidad particular, dicho enlazador peptídico tiene un tamaño que varía de 2 a 10 residuos. Los enlazadores se pueden agregar a antígenos separados y/o para mejorar la respuesta inmune.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos un antígeno o antígenos o por lo menos un epítope o epítopes, dicho por lo menos un antígeno o antígenos o por lo menos un epítope o epítopes se originan a partir de HPV. En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 antígenos que se originan a partir de HPV. En una modalidad preferida, dicho polipéptido heterólogo comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV. En una modalidad particular, dicho antígeno o antígenos de HPV comprenden o consisten de por lo menos un epítope o epítopes, de preferencia por lo menos un epítope o epítopes de CD8+ y/o por lo menos un epítope o epítopes de CD4+.
Por lo tanto, la invención está dirigida a una proteina quimérica que comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal: (a) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento; (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antigenos de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; (c) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento.
Las definiciones descritas anteriormente para la proteina derivada de CyaA, referentes al fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO: 2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO: 2, y con respecto al fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO: 2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO: 2, se aplican en forma idéntica a estos fragmentos en el contexto del polinucleótido que codifica para una proteina quimérica.
Las definiciones descritas anteriormente con respecto a variantes con por lo menos 95% se aplican de forma idéntica a los fragmentos descritos en el contexto de una proteina quimérica. De manera similar las definiciones que se refieren al polipéptido heterólogo se aplican para definir al polinucleótido que codifica para dicho polipéptido heterólogo.
En una modalidad particular, la proteina quimérica de la invención comprende o consiste de, 1) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos un antigeno de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 24 ó 6; 2) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 3) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 4) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 5) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antigenos de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; 6) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antigenos de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO: 8; 7) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antigenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, 4 ó 6; y 8) de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 8, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antigenos de HPV, originándose cada antigeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO: 8.
La expresión "tipo de HPV" abarca cualquier tipo de HPV especialmente los tipos de HPV que se seleccionan dentro de los géneros Alfa-papilomavirus, Beta-papilomavirus, Gama-papilomavirus, Delta-papilomavirus, Epsilon-papilomavirus, Zeta-papilomavirus, Theta-papilomavirus, Iota-papilomavirus, Kappa-papilomavirus, Lambda-papilomavirus, Mu-papilomavirus, Nu-papilomavirus Xi-papilomavirus, Omicron-papilomavirus y Pi-papilomavirus. En una modalidad particular, se prefieren los papilomavirus que tienen un tropismo humano, tal como los tipos del género Alfa-papilomavirus, Beta-papilomavirus, Gamma-papilomavirus, Mu-papilomavirus o Nu-papilomavirus. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de los antigenos de los tipos de HPV del género alfa-papilomavirus, especialmente un tipo de las especies 7 y 9 de HPV del género alfa-papilomavirus [17]. Por lo tanto, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de los antigenos de las especies de tipo altamente oncogénicas de HPV, tales como HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 ó HPV58.
En una modalidad particular de una proteina quimérica que comprende antigeno o antigenos o epitope o epitopes de HPV, dicho antígeno o antigenos, contenidos en el polipéptido heterólogo se selecciona(n) a partir de las proteínas El, E2, E4, E5, E6 y E7 de HPV o fragmento antigénico de las mismas.
En una modalidad particular, dicho antígeno, contenido en el polipéptido heterólogo, es la proteína E7 de un tipo de HPV o dichos antígenos, contenidos en el polipéptido heterólogo, son las proteínas E7 de tipos diferentes de HPV, o cualquier fragmento antigénico de esta proteína E7 (también llamado fragmento de E7). En una modalidad preferida, la proteína E7 o fragmento de la misma es del tipo de HPV16 (SEQ ID NO: 25), el tipo de HPV18 (SEQ ID NO: 26), el tipo de HPV31 (SEQ ID NO: 27), el tipo de HPV33 (SEQ ID NO: 28), el tipo de HPV45 (SEQ ID NO: 29), el tipo de HPV52 (SEQ ID NO: 30) o el tipo de HPV58 (SEQ ID NO: 32). Para eliminar un epítope auto-inmune naturalmente humano identificado por los inventores en la proteína E7 del tipo de HPV52 (indicado en SEQ ID NO: 30), el residuo de aminoácido en las posiciones 84 y 86 ha sido sustituido (M-L en la posición 84 y L—>M en la posición 86); esta secuencia modificada de la proteína E7 de tipo HPV52 es como se indica en SEQ ID NO: 31 y como tal es parte de la invención.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos 3 fragmentos (fragmentos antigénicos) de una proteína E7 de un tipo de HPV, por lo menos 3 de estos fragmentos se originan a partir de proteínas E7 de tipos diferentes de HPV. En esta modalidad, "por lo menos tres fragmentos" significa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 fragmentos, con la condición que entre estos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 fragmentos, por lo menos 3, se originan a partir de tipos diferentes de HPV. En una modalidad preferida, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de 6 fragmentos de E7, 3 de los cuales se originan a partir de 3 tipos diferentes de HPV. En otra modalidad preferida, dicho polipéptido heterólogo comprende o consiste de 8 fragmentos de E7, 4 de los cuales se originan a partir de cuatro tipos diferentes de HPV.
En una modalidad particular, todos los fragmentos de E7 se originan a partir de tipos diferentes de HPV. En otra modalidad, solamente algunos fragmentos de E7 (por lo menos 3) se originan a partir de tipos diferentes de HPV, los otros fragmentos de E7 se originan todos ya sea a partir de uno de dichos tipos diferentes de HPV, se originan a partir de 2 de dichos tipos diferentes de HPV, se originan a partir de 3 de dichos tipos diferentes de HPV, se originan a partir de 4 de dichos tipos diferentes de HPV o se originan a partir de 5 de dichos tipos diferentes de HPV. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos 4 fragmentos de la proteina E7, por lo menos 3 de estos fragmentos de E7 se originan a partir de proteínas E7 de tipos diferentes de HPV, y por lo menos 2 de estos fragmentos de E7 se originan a partir de la misma proteína E7 de un tipo de HPV (estando un fragmento de E7 tanto en el grupo del fragmento de E7 de tipos diferentes de HPV como en el grupo del fragmento de E7 del mismo tipo de HPV). Como un ejemplo no limitativo, para un polipéptido heterólogo con 6 fragmentos de E7 de tipos de HPV, se pueden encontrar las siguientes combinaciones: a) 1 fragmento de E7 proveniente de un primer tipo de HPV, un fragmento de E7 proveniente de un segundo tipo de HPV, y 4 fragmentos de E7 provenientes de un tercer tipo de HPV; b) 1 fragmento de E7 proveniente de un primer tipo de HPV, 2 fragmentos de E7 provenientes de un segundo tipo de HPV, y 3 fragmentos de E7 provenientes de un tercer tipo de HPV; y c) 2 fragmentos de E7 provenientes de un primer tipo de HPV, 2 fragmentos de E7 provenientes de un segundo tipo de HPV, y 2 fragmentos de E7 provenientes de un tercer tipo de HPV.
En una modalidad particular, dicho fragmento de E7 de tipo de HPV consiste de la parte N-terminal de la proteina E7 o de la parte C-terminal de la proteina E7.
Con "parte N-terminal de E7" se quiere decir un fragmento cuya secuencia es por lo menos el primer 25%, el primer 30%, el primer 35%, el primer 40% de la proteina E7 y es cuando mucho el primer 50% de la longitud en residuos de aminoácido de la proteina E7 comenzando desde el primer residuo de aminoácido N-terminal. Por consiguiente, con "el primer 25%", se quiere decir un polipéptido cuya secuencia comienza en el residuo 1 de la proteina E7 y termina en el residuo que corresponda al 25% del tamaño de la proteína E7 de longitud completa. En una modalidad particular, un fragmento que consiste de la parte N-terminal de la proteína E7 consiste de una secuencia que varía desde el primer 28% hasta el primer 31% de la proteína E7. En otra modalidad, un fragmento que consiste de la parte N-terminal de la proteína E7 consiste de una secuencia que varía desde el primer 31% hasta el primer 41% de la proteína E7. Las modalidades particulares son un fragmento que consisten de los residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 28 de SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 32 de SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste de los residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 32. Otras modalidades son un fragmento que consiste de los residuos 1 a 34 de SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 42 de SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 32 de SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 37 de SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste de los residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste de los residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 32.
Con "parte C-terminal de E7", se quiere decir un fragmento cuya secuencia es por lo menos el último 25%, el ultimo 30%, el último 40%, el último 50%, el último 60% de la longitud en residuos de aminoácido de la proteina E7 comenzando desde el último residuo de aminoácido y es cuando mucho el último 70% o el último 80% de la proteina E7. Con "el último 25%" se quiere decir un polipéptido cuya secuencia termina en el último residuo de la proteina E7 y comienza en el residuo que corresponde a 25% del tamaño de la proteina E7 de longitud completa. En una modalidad particular, un fragmento que consiste de la parte C-terminal de la proteina E7 consiste de una secuencia que varia desde el último 55% hasta el último 61% de la proteina E7. En otra modalidad, un fragmento que consiste de la parte C-terminal de la proteina E7 consiste de una secuencia que varia desde el último 60% hasta el último 70% de la proteina E7. Las modalidades particulares son un fragmento que consiste de los residuos 43 a 98 de SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste de los residuos 43 a 105 de SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste de los residuos 42 a 98 de SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste de los residuos 43 a 97 de SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste de los residuos 44 a 106 de SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste de los residuos 45 a 99 de SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste de los residuos 44 a 98 de SEQ ID NO: 32. Otras modalidades son un fragmento que consiste de los residuos 35 a 98 de SEQ ID NO: 25, un fragmento que consiste de los residuos 43 a 105 de SEQ ID NO: 26, un fragmento que consiste de los residuos 33 a 98 de SEQ ID NO: 27, un fragmento que consiste de los residuos 32 a 97 de SEQ ID NO: 28, un fragmento que consiste de los residuos 38 a 106 de SEQ ID NO: 29, un fragmento que consiste de los residuos 32 a 99 de SEQ ID NO: 31 o un fragmento que consiste de los residuos 32 a 98 de SEQ ID NO: 32.
En una modalidad particular, dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 del mismo tipo de HPV. En una modalidad particular, cuando dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal de la proteina E7 del mismo tipo de HPV (no fusionado), la suma del tamaño de la parte N-terminal y del tamaño de la parte C-terminal no excede el tamaño de la proteina E7 de longitud completa.
En otra modalidad, dicho polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV. Estos fragmentos N-terminales y C-terminales se pueden agrupar respectivamente en los polipéptidos. Asimismo, estos se pueden invertir con respecto a su posición en la proteina E7 nativa, estando los fragmentos C-terminales localizados corriente arriba del extremo N-terminal.
Por lo tanto, una proteina quimérica de la invención comprende un polipéptido heterólogo que comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (i) la parte C-terminal de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV, y (ii) la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
El término "opcionalmente" en la definición anterior se refiere a la presencia de la cuarta valencia de HPV. Por consiguiente, la proteina quimérica comprende tanto la parte C-terminal como la parte N-terminal de las proteínas E7 de un primer, un segundo y un tercer HPV como se definieron anteriormente, y opcionalmente la parte C-terminal y la parte N-terminal de una cuarta proteína E7 de un HPV diferente.
En una modalidad particular, los fragmentos de E7 diferentes están ya sea fusionados o están separados por enlazadores peptídicos o por lo menos dos de los fragmentos de E7 están fusionados mientras que por lo menos dos de los fragmentos de E7 están separados por un enlazador peptídico. En una modalidad particular, dicho enlazador peptídico tiene un tamaño que varía de 2 a 10 residuos. En una modalidad particular, dicho enlazador es el dipéptido AS. Los enlazadores se pueden agregar para separar cada fragmento o algunos fragmentos, y/o para mejorar la respuesta inmune. En una modalidad particular, se agrega un dipéptido AS inmediatamente corriente arriba hacia la parte C-terminal de un fragmento de E7 de HPV. En una modalidad particular, un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de un fragmento de E7 de tipo de HPV18, y en particular sólo corriente arriba de este fragmento.
Una proteína quimérica particular de la invención comprende o consiste de un polipéptido heterólogo que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho tercer tipo de HPV.
Otra proteina quimérica particular de la invención comprende o consiste de un polipéptido heterólogo que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV, fusionada a la parte C-terminal de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho primer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho segundo tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho tercer tipo de HPV, fusionada a la parte N-terminal de la proteina E7 de dicho cuarto tipo de HPV.
En la modalidad particular de una proteina quimérica descrita en la presente solicitud, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45. En una modalidad particular, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HVP18 y HPV45, y un dipéptido AS está agregado inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo HPV18. En otra modalidad, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58. En otra modalidad, dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HVP33 y HPV52. En otra modalidad, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58. En otra modalidad, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45. En otra modalidad, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En otra modalidad, dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45 y un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal de el fragmento de E7 de tipo HPV18. En otra modalidad, dichos primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, y un dipéptido AS se agrega inmediatamente corriente arriba de la parte C-terminal del fragmento de E7 de tipo de HPV18.
En una modalidad particular, la parte N-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV consiste de una secuencia que varía desde el primer 28% hasta el primer 31% de la proteína E7 y la parte C-terminal de la proteína E7 de dicho mismo tipo de HPV consiste de una secuencia que varía desde el último 55% hasta el último 61% de la proteína E7. Los ejemplos de pares de parte N-terminal/parte C-terminal de la proteína E7 del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo dentro de dicho polipéptido heterólogo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud son los siguientes: - residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 25 / residuos 43 a 98 de SEQ ID NO: 25; - residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 26 / residuos 43 a 105 de SEQ ID NO: 26; - residuos 1 a 28 de SEQ ID NO: 27 / residuos 42 a 98 de SEQ ID NO: 27; - residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 28 / residuos 43 a 97 de SEQ ID NO: 28; - residuos 1 a 32 de SEQ ID NO: 29 / residuos 44 a 106 de SEQ ID NO: 29; - residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 31 / residuos 45 a 99 de SEQ ID NO: 31; - residuos 1 a 29 de SEQ ID NO: 32 / residuos 44 a 98 de SEQ ID NO: 32; En otra modalidad, la parte N-terminal de la proteina E7 de un tipo de HPV consiste de una secuencia que varia desde el primer 31% hasta el primer 41% de la proteina E7 y la parte C-terminal de la proteina E7 consiste de una secuencia que varia desde el último 60% hasta el último 70% de la proteina E7. En una modalidad particular, la suma del tamaño de la parte N-terminal de la proteina E7 y el tamaño de la parte C-terminal es cuando mucho 100% del tamaño de la proteina E7. En tal caso, la proteina E7 (en dos fragmentos), puede estar contenida en el polipéptido heterólogo. Los ejemplos de pares de parte N-terminal/parte C-terminal de la proteina E7 del mismo tipo de HPV, cualquiera que sea su acomodo de dicho polipéptido heterólogo, y en particular de conformidad con el acomodo descrito en la presente solicitud, son los siguientes: - residuos 1 a 34 de SEQ ID NO: 25 / residuos 35 a 98 de SEQ ID NO: 25; - residuos 1 a 42 de SEQ ID NO: 26 / residuos 43 a 105 de SEQ ID NO: 26; - residuos 1 a 32 de SEQ ID NO: 27 / residuos 33 a 98 de SEQ ID NO: 27; - residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 28 / residuos 32 a 97 de SEQ ID NO: 28; - residuos 1 a 37 de SEQ ID NO: 29 / residuos 38 a 106 de SEQ ID NO: 29; - residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 31 / residuos 32 a 99 de SEQ ID NO: 31; y - residuos 1 a 31 de SEQ ID NO: 32 / residuos 32 a 98 de SEQ ID NO: 32; En una modalidad particular de una proteina quimérica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18 y HPV45, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 34 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 33) o la secuencia indicada como se indica en SEQ ID NO: 36 (codificada por un nucleótido como se indica en SEQ ID NO: 35).
En una modalidad particular de una proteina quimérica, cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV52 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 42 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 41) o la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 44 (codificada por un nucleótido como se indica en SEQ ID NO: 43).
En una modalidad particular de una proteina quimérica cuando dicho primero, segundo y tercer tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33 y HPV52, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia que se indica en SEQ ID NO: 46 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 45) o la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 48 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 47).
En una modalidad particular de una proteina quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 38 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 37) o la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 40 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 39).
En una modalidad particular de una proteina quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 50 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 49) o la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 52 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 51).
En una modalidad particular de una proteína quimérica, cuando dicho primer, segundo, tercer y cuarto tipos de HPV son los tipos HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58, el polipéptido heterólogo consiste ya sea de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 54 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 53) o la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 56 (codificada por un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 55).
La invención también se refiere a un polipéptido, que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, la parte C-terminal de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, la parte C-terminal de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, opcionalmente la parte C-terminal de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho primer tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho segundo tipo de HPV, la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho tercer tipo de HPV, y opcionalmente la parte N-terminal de la proteína E7 de dicho cuarto tipo de HPV. Las definiciones provistas en la presente solicitud para un polipéptido heterólogo contenido en una proteína quimérica de la invención se aplican en forma idéntica al polipéptido como tal, en particular con respecto a las definiciones de la parte N-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV, de la parte C-terminal de la proteína E7 de un tipo de HPV, la presencia opcional de un enlazador, en particular el dipéptido AS, la naturaleza de los tipos de HPV, los fragmentos particulares de las proteínas E7 de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 31 y 32. Las definiciones provistas en la presente solicitud para una composición que comprende proteina o proteínas quiméricas de la invención se aplican de forma idéntica a los polipéptidos como tal, en particular con respecto a combinaciones generales o específicas de dicho primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV y, cuando sea aplicable, de dicho séptimo tipo de HPV.
En una modalidad particular, dicho polipéptido consiste de una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 ó 56. La invención también está dirigida a los polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos, en particular los polinucleótidos como se indican en SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 y 55, así como un vector que comprende dichos polinucleótidos y una célula o cultivo celular que comprende estos polinucleótidos o un vector que comprende dichos polinucleótidos; todos como se definieron en la presente solicitud.
A pesar de su tamaño (más de 200 residuos), su complejidad (presencia de varios residuos cisteína) y su carga electrostática negativa, se ha demostrado de manera sorpresiva que dicho polipéptido es translocado en forma eficiente en el citosol de células presentadoras de antígeno, lo que permite obtener respuestas inmunes de célula T fuertes y grandes.
En una modalidad particular, la invención está dirigida a una proteina quimérica que comprende o consiste de una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58 o en SEQ ID NO: 61. Estas proteínas quiméricas son codificadas respectivamente por un polinucleótido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO: 57 o en SEQ ID NO: 60. En una modalidad particular, la proteína quimérica de SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 61 se expresa a partir de los plásmidos cuya secuencia es SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 62 respectivamente.
En una modalidad particular, la invención también está dirigida a una proteína quimérica de la invención que comprende o consiste de una secuencia como se indica en SEQ ID NO: 64 o en SEQ ID NO: 67. Estas proteínas quiméricas son codificadas respectivamente por un polinucleótido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO: 63 o en SEQ ID NO: 66. En una modalidad particular, la proteína quimérica de SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 67 son expresadas a partir de plásmidos cuyas secuencias son SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 68 respectivamente.
Por lo tanto, se puede expresar cualquier proteína quimérica de la invención que comprende un polipéptido heterólogo que comprende o consiste de por lo menos un antígeno o antígenos o por lo menos un epítope o epítopes que se originan a partir de HPV, como se describe en la presente solicitud, utilizando los plásmidos de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 68, como vectores de expresión. En este orden, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de SEQ ID NO: 59 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención, lo que permite que se exprese una proteina quimérica de la invención que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 772 y 1599 de SEQ ID NO: 62 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención, lo que permite expresar una proteina quimérica de la invención que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1836 de SEQ ID NO: 65 es eliminado, y remplazado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención, lo que permite expresar una proteina quimérica de la invención que comprende este polipéptido heterólogo. De manera similar, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 772 y 1704 de SEQ ID NO: 68 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención, que permite expresar una proteina quimérica de la invención que comprende este polipéptido heterólogo.
En una modalidad particular de la invención, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de SEQ ID NO: 59 es eliminado, y remplazado por un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención derivado a partir de una proteina E7 de HPV única, siendo seleccionado este polinucleótido de entre los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos que tienen respectivamente la secuencia de SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 72. Dichas construcciones permiten expresar una proteina quimérica monovalente de la invención que comprende un polipéptido heterólogo que tiene SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 72 y que representa respectivamente E7 de HPV31 con su región ácida eliminada, E7 de HPV33 con su región ácida eliminada, E7 de HPV58 con su región ácida eliminada, E7 de HPV52 con su región ácida eliminada y E7 de HPV45 con su región ácida eliminada.
En una modalidad particular, de la invención, el polinucleótido contenido entre los nucleótidos 904 y 1731 de SEQ ID NO: 59 es eliminado, y remplazado con un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo de la invención derivado a partir de una proteina E7 de HPV única, siendo seleccionado este polinucleótido de entre los polinucleótidos que tienen respectivamente la secuencia de SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 77.
La invención también está dirigida a una composición que comprende por lo menos una, de preferencia una o dos, proteína(s) quimérica(s) de la invención, en particular por lo menos dos, de preferencia dos proteínas quiméricas diferentes de la invención.
En una modalidad particular, cuando la composición comprende más de una proteína quimérica diferente, de preferencia dos proteínas quiméricas diferentes, las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas proteínas quiméricas son las mismas o son diferentes, mientras que las secuencias de los polipéptidos heterólogos son diferentes. En una modalidad particular, las diferentes proteínas quiméricas, de preferencia dos proteínas quiméricas diferentes se seleccionan a partir de las proteínas quiméricas diferentes como se describe en la presente solicitud. En una modalidad particular, las dos proteínas quiméricas diferentes son cualquiera de: 1) 2 proteínas quiméricas que comprenden o consisten de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, con la condición que los polipéptidos heterólogos de estas dos proteínas quiméricas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV; o 2) 2 proteínas quiméricas que comprenden o consisten de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV diferente; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2, con la condición que los polipéptidos heterólogos de estas dos proteínas quiméricas difieran en sus secuencias y en los tipos de HPV.
En otra modalidad, las secuencias de las porciones de CyaA (o fragmentos) de dichas proteínas quiméricas diferentes, de preferencia 2 proteínas quiméricas diferentes son diferentes y la secuencia del polipéptido heterólogo es diferente. En una modalidad particular, las diferentes proteínas quiméricas, de preferencia 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas se seleccionan a partir de las proteínas quiméricas diferentes como se describen en la presente solicitud. En una modalidad particular, por lo menos una, de preferencia una, de las proteínas quiméricas diferentes, de preferencia 2 proteínas quiméricas diferentes comprende o consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo de HPV; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO: 2, y por lo menos una, de preferencia una, de las proteínas quiméricas diferentes, de preferencia 2 proteínas quiméricas, diferentes, comprende o consiste de, de N-terminal hacía C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO: 2, (b) un polipéptido heterólogo que comprende por lo menos 3 antígenos de HPV, originándose cada antígeno de HPV a partir de un tipo diferente de HPV, en el cual dicho polipéptido heterólogo difiere en su secuencia y tipos de HPV del polipéptido heterólogo de la otra por lo menos una proteína quimérica; y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad particular de una composición que comprende más de una proteína quimérica, diferente, de preferencia 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas, los polipéptidos heterólogos son como se definen en la presente solicitud. En una modalidad particular, cada polipéptido heterólogo comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV y, opcionalmente, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV, en el cual cada polipéptido heterólogo tiene una secuencia que es diferente del otro u otros polipéptidos heterólogos.
En una modalidad particular, la composición comprende 2 tipos de proteínas quiméricas, el polipéptido heterólogo del primer tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un tercer tipo de HPV, y el polipéptido heterólogo del segundo tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un cuarto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un quinto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un sexto tipo de HPV, en la cual el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, y sexto tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En una modalidad particular, el primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV (a) se eligen de entre HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52, y HPV58 o (b) se eligen de entre HPV16, HPV18 y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52.
En una modalidad particular, el primer, segundo y tercer tipos de HPV son HPV16, HPV18 y HPV45. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 34 ó 36. En una modalidad particular, dicha proteína quimérica comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58, 61, 64 ó 67. A estas modalidades particulares, se puede asociar un cuarto subtipo de HPV, el cual se elige entre HPV33 o HPV58.
En una modalidad particular, independientemente o en combinación con la modalidad referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto y quinto sexto tipos de HPV son HPV31, HPV52 y HPV58. En una modalidad particular el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 42 ó 44.
En una modalidad particular, independientemente o en combinación con la modalidad referente al primer, segundo y tercer tipos de HPV, el cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son HPV31, HPV33 y HPV52. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 46 ó 48. En una modalidad particular, dicha proteina quimérica comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58, 61, 64 ó 67, en los cuales la secuencia como se indica en SEQ ID No: 34 ó 36 ha sido remplazada con la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 42, 44, 46 ó 48.
La invención se refiere en una modalidad particular, a la combinación de los antigenos antes recitados de los subtipos de HPV especificados, cuando estos antigenos son provistos en las proteínas quiméricas en un orden correspondiente al orden o cita especificada anteriormente de los subtipos de HPV o de manera alternativa en cualquier otro orden de presentación de los antígenos en las proteínas quiméricas que pudiera corresponder a cualquier combinación del primero, segundo, tercero, y opcionalmente cuarto HPV entre aquellos citados y en particular entre los grupos de HPV16, HPV18 y HPV45 o HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33 y HPV52.
En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto tipos de HPV son (a) HPV16, HPV18, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente o (b) HPV16, HPV18, y HPV45, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
En una modalidad particular, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera proteína quimérica y de los HPV31, HPV52, HPV58 para la segunda proteína quimérica. En otra modalidad particular, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45 para la primera proteína quimérica y de los HPV31, HPV33, HPV52 para la segunda proteína quimérica. En una modalidad preferida, pero no necesariamente, los antígenos de HPV así definidos se insertan en las proteínas quiméricas en el orden especificado.
En una modalidad particular, la composición comprende 2 tipos diferentes de proteínas quiméricas, el polipéptido heterólogo del primer tipo de proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteína E7 de un primer tipo de HPV, un fragmento N- terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un segundo tipo de HPV y un fragmento N-terminal, un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un tercer tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un cuarto tipo de HPV, y el polipéptido heterólogo del segundo tipo de proteina quimérica comprende un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de la proteina E7 de un quinto tipo de HPV, un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la presente solicitud de E7 de un sexto tipo de HPV y un fragmento N-terminal y un fragmento C-terminal como se define en la siguiente solicitud de la proteina E7 de un séptimo tipo de HPV, en los cuales, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, y séptimo tipos de HPV son tipos de HPV diferentes.
En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste de (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16, HPV18 y HPV45, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52, (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 y (f) HPV16, HPV18, HPV45, HPV33, HPV31, HPV52 y HPV58.
En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18 HPV33 y HPV45. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 50 ó 52. En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo que comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 54 ó 56. En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV son HPV31, HPV33, HPV52, y HPV58. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 40 ó 42. En una modalidad particular, dicha primera proteina quimérica comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58, 61, 64 ó 67, en la cual la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 34 ó 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 40, 42, 50, 52, 54 ó 56.
En una modalidad particular, independientemente o en combinación con la modalidad que se refiere a los HPV31, HPV33, HPV52 y HPV58 como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV16, HPV18 y HPV45. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 34 ó 36. En una modalidad particular, dicha segunda proteina quimérica comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58, 61, 64 ó 67.
En una modalidad particular, independientemente o en combinación con la modalidad que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33, y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33, HPV52. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 42 ó 44. En una modalidad particular, independientemente o en combinación con la modalidad que se refiere a los HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45 o el HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 respectivamente, como el primero, segundo, tercero y cuarto tipos de HPV, el quinto, sexto y séptimo tipos de HPV son respectivamente HPV31, HPV52 y HPV58 o HPV31, HPV33 y HPV52. En una modalidad particular, el polipéptido heterólogo comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 46 ó 48. En una modalidad particular, dicha segunda proteina quimérica comprende o consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 58, 61, 64 ó 67, en la cual la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 34 ó 36 ha sido remplazada por la secuencia como se indica en SEQ ID NO: 42, 44, 46 ó 48.
En una modalidad particular, el primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo tipos de HPV se seleccionan a partir del grupo que consiste de (a) HPV31, HPV33, HPV52, HPV58, HPV16 HPV18 y HPV45 respectivamente, (b) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV52 y HPV58 respectivamente, (c) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV52 y HPV33 respectivamente, (d) HPV16, HPV18, HPV33, HPV45, HPV31, HPV58 y HPV52 respectivamente y (e) HPV16, HPV18, HPV45, HPV58, HPV31, HPV33 y HPV52 respectivamente.
La invención se refiere en una modalidad particular, a la combinación de los antigenos antes recitados de los sub-tipos de HPV especificados, cuando estos antigenos están provistos en las proteínas quiméricas en un orden correspondiente al orden o cita antes especificado de los subtipos de HPV o de manera alternativa en cualquier otro orden de presentación de los antígenos en las proteínas quiméricas que pudiera corresponder a cualquier combinación del primero, segundo, tercero y cuando esté presente el cuarto HPV entre aquellos citados y en particular entre los grupos HPV16, HPV18, HPV33 y HPV45 o el grupo de HPV16, HPV18, HPV45 y HPV58 o el grupo de HPV31, HPV52 y HPV58 o el grupo de HPV31, HPV33 y HPV52.
En una modalidad particular, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antigenos como los descritos en la presente invención de los HPV16, HPV18, HPV45, HPV58 para la primera proteina quimérica y de los HPV31, HPV33, HPV52 para la segunda proteina quimérica. En otra modalidad particular, las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como se describen en la presente solicitud de los HPV16, HPV18, HPV45, HPV33 para la primera proteína quimérica y de los HPV31, HPV52, HPV58 para la segunda proteína quimérica. En otra modalidad particular las dos proteínas quiméricas diferentes comprenden los antígenos como los descritos en la presente invención de los HPV31, HPV33, HPV52, HPV58 para la primera proteína quimérica y de los HPV16, HPV18, HPV45 para la segunda proteína quimérica. En una modalidad preferida, pero no necesariamente, los antígenos de HPV definidos de esta manera se insertan en las proteínas quiméricas en el orden especificado.
En una modalidad particular, la composición también comprende un vehículo farmacéutico apropiado, el cual se selecciona por ejemplo a partir de agentes amortiguadores, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, agua, etanol y similares y combinaciones de los mismos.
En una modalidad particular, la composición, con o sin vehículo farmacéutico apropiado, también comprende por lo menos un coadyuvante, de preferencia un coadyuvante, y/o un agente tensoactivo y/o sustancias inmuno-moduladoras (tal como citocinas o quimiocinas) y/o factores de crecimiento tal como GM-CSF. En la téenica se conocen diversos coadyuvantes e incluyen coadyuvante completo de Freund (CFA), coadyuvante incompleto de Freund (IFA), ISA de montanuro (coadyuvante sépico incompleto), péptidos de muramilo tales como dipéptido de muramilo (MDP) MDP-Lys (L18) (Na-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil- Neesteoroil-L-lisina), sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio, oligodesoxinucleótidos de CpG (CPG ODN) tales como CPG ODN 1826 y CPG ODN 2007, MF59 el cual es una emulsión aceite en agua estabilizada con detergente que contiene 5% de escualeno (p/v), 0.5% de Tween® 80 (p/v) y 0.5% de Span (p/v) en agua, ligandos de TLR4 (tales como MPL, GLA) ligandos de TLR3 (tales como Poli-IC, Poli-ICLC llamado Hiltonol®), polisacáridos (tal como Inulina) y liposomas (tal como los liposomas catiónicos, ISCOMs).
En una modalidad particular, por lo menos un coadyuvante se elige entre moléculas que tienen la capacidad de activar la respuesta inmune de célula T. Los coadyuvantes preferidos son aquellos que ligan o son agonistas para TLR (receptor tipo Toll) 3, 4, 7, 8 y/o 9 en células del sistema inmune (tales como APC). En una modalidad particular, el coadyuvante es un ligando de TLR, en particular un ligando de TLR que se selecciona a partir del grupo que consiste de ligandos de TLR de la clase 3, tal como poli-ICLC, ligandos de TLR de la clase 4, tal como MPL, ligandos de TLR de la clase 9, tal como CpG, y ligandos de TLR de las clases 7/8, tal como Imiquimod. Los ejemplos de coadyuvantes son Imiquimod y Poli-ICLC. Un fármaco comercialmente disponible basado en Imiquimod es Aldara™ (vendido como una crema que contiene 5% de Imiquimod) Poli-ICLC se puede adquirir de Oncovir Inc, (WA, EE.UU.) como Hiltonol®.
En una modalidad particular, la proteina o proteínas quiméricas o composiciones definidas en la presente solicitud se pueden inyectar en un paciente a través de vías diferentes: inyección subcutánea (s.c), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.), o intravenosa (i.v.), administración por vía oral y administración a las mucosas, especialmente administración o inhalación intranasal. En una modalidad particular, la proteína o proteínas quiméricas o composiciones definidas en la presente solicitud se administra(n) por vía intradérmica.
Asimismo, la proteína o proteínas quiméricas o la composición como se definen en la presente solicitud se pueden combinar o mezclar con por lo menos un inmuno-potenciador, tal como por lo menos un coadyuvante, de preferencia un coadyuvante, y/o un agente tensoactivo y/o sustancias inmunomoduladoras. Con "combinar", se quiere decir que la proteina o proteínas quiméricas o la composición como se define en la presente solicitud y el inmunopotenciador se ponen ambos en contacto con el hospedero, al mismo tiempo o en tiempos diferentes y/o mediante el mismo modo o modos diferentes de administración, de preferencia en el mismo sitio de contacto. En contraste, "mezclar" significa que la proteína o proteínas quiméricas o la composición como se define en la presente solicitud y el inmunopotenciador están en la misma formulación cuando se administran.
La proteína o proteínas quiméricas o composiciones definas en la presente solicitud pueden estar en forma sólida (cápsula, polvo, tableta, píldora, supositorio, tableta de liberación rápida, tableta gastro-resistente, tableta de liberación retardada), una forma en polvo, de preferencia después de liofilización (forma liofilizada o en forma de polvo liofilizado) la cual necesita ser reconstituida por ejemplo con diluyente o diluyentes antes de la inyección, o en una forma líquida, tal como una solución inyectable o suspensión inyectable.
La cantidad de proteína o proteínas quiméricas que se va administrar (dosis) depende del individuo a ser tratado, incluyendo considerar la condición del paciente, el estado del sistema inmune del individuo, la via de administración y el peso del hospedero. Las dosis convencionales varían de 1 a 2400 mg, 100 a 2000 pg, 200 a 1000 pg, 500 a 1000 pg. Una dosis particular se selecciona a partir del grupo que consiste de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 o 2400 mg ± 10%. En otra modalidad, las dosis convencionales varían de 1 a 100 pg, 1 a 50 pg y 1 a 10 pg de polipéptido o polipéptidos portados por el vector. La dosis total para el tratamiento completo con el ingrediente activo de la invención varía desde 200 hasta 2400 pg, 300 a 2000 pg, 400 a 1000 pg, 500 a 800 pg. Estos ejemplos pueden ser modificados por un experto en la téenica, dependiendo de las circunstancias.
La invención también está dirigida a una proteína quimérica de la invención o una composición de la invención, para uso como un medicamento. En una modalidad particular, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por patógeno. En otra modalidad, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para uso en la profilaxis o tratamiento de un trastorno basado en tumor oncogénico, de preferencia tumor oncogénico, tal como un trastorno tumoral, trastorno de tumor maligno o neoplasma maligno. En una modalidad particular, la proteína quimérica de la invención o la composición de la invención es para uso en la inducción de una respuesta inmune profiláctica o de una respuesta inmune terapéutica.
En una modalidad particular, la invención también se refiere a un método para el tratamiento terapéutico de un animal o un paciente humano que se presenta con una infección con un patógeno o que se sospecha tiene una infección por patógenos que comprende (a) la administración de una proteina quimérica o una composición de la invención en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
En otra modalidad, la invención también se refiere a un método para el tratamiento terapéutico de un animal o un paciente humano que se presenta con trastornos de tumor que comprende (a) la administración de una proteina quimérica o una composición de la invención en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
La invención también se refiere a un método para prevenir una infección por patógeno de un animal o un paciente humano que comprende (a) la administración de una proteina quimérica o una composición de la invención en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples.
La invención también se refiere a un método para prevenir la aparición o desarrollo de trastornos de tumor en un animal o un paciente humano que comprende (a) la administración de una proteína quimérica o una composición de la invención en dicho animal o paciente humano, posiblemente como dosis administradas múltiples, y (b) el seguimiento de la condición de dicho animal o paciente humano.
Un tratamiento terapéutico de conformidad con la invención está dirigido a mejorar la condición clínica de un animal o paciente humano en necesidad de lo mismo, que ha sido diagnosticado como infectado o se sospecha que está infectado por un patógeno o que padece de un estado patológico. En una modalidad particular, este tratamiento está dirigido a la eliminación del agente u organismo causante de la enfermedad, o a disminuir la abundancia de dicho agente u organismo. En una situación de infección viral, el tratamiento puede dar como resultado un decremento significativo de la carga viral en los tejidos elegidos como blanco del hospedero que sea menor de lo que se pueda detectar cuando se midió. En caso de trastornos tumorales, el tratamiento puede dar como resultado una disminución del tamaño o del desarrollo del tumor o tumores, o la erradicación de las células de tumor, o la reducción del número de células de tumor a un nivel que sea menor que lo que se puede detectar cuando se midió. El tratamiento terapéutico también está dirigido a mejorar la condición clínica del animal o paciente humano, eliminando o disminuyendo los síntomas asociados con la infección por patógeno o los trastornos de tumor, y de preferencia está dirigido a restaurar la salud.
Un tratamiento profiláctico de un animal o un paciente humano está dirigido a prevenir la infección por patógeno de dicho animal o un paciente humano, o prevenir la aparición o desarrollo de trastornos tumorales neoplásicos, o prevenir la ocurrencia de un estado patológico en dicho animal o paciente humano. El tratamiento profiláctico abarca vacunación.
Los tratamientos terapéuticos y profilácticos, utilizando una proteína quimérica o una composición de la invención, se basan en la provocación de una respuesta inmune eficiente, de preferencia una respuesta inmune celular, contra el epítope o epítopes contenidos en el polipéptido heterólogo en el hospedero.
Por lo tanto, la invención también está dirigida al uso de una proteina quimérica o una composición de la invención para inducir o provocar una respuesta inmune, de preferencia una respuesta inmune celular (tal como una respuesta de CTL) contra el epitope o epitopes contenidos en el polipéptido heterólogo, en el hospedero al cual se administra dicha proteina quimérica o composición.
En una modalidad particular, la invención también está dirigida a una proteina quimérica o composición de la invención para uso (i) en el tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) condición o condiciones patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedero mamífero provocando una respuesta inmune de célula T contra un primer grupo de epitopes contenidos en el polipéptido heterólogo y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) condición o condiciones patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedero mamífero provocando una respuesta inmune de memoria de célula T contra un segundo grupo de epitopes de contenidos en dicho polipéptido heterólogo, dichas respuestas inmunes se obtienen después de la administración de dicha proteína quimérica o dicha composición en dicho hospedero, en la cual dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) condición o condiciones patológica (s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epitopes no está contenido en dicho polipéptido heterólogo.
En efecto, los inventores han demostrado que la proteína quimérica de la invención permite evitar la competencia que existe entre epitopes diferentes, ya sea con respecto al acceso a la APC, procesamiento y presentación por parte de la APC y disponibilidad de citocinas. Por lo tanto, utilizando la proteina quimérica de la invención es posible inducir una respuesta inmune contra el primer grupo de epitopes dentro de un tratamiento terapéutico e inducir también una respuesta inmune inducida contra el segundo grupo de epitopes dentro de un tratamiento profiláctico. Por lo tanto, la proteina quimérica de la invención es eficiente para provocar una respuesta inmune de célula T dentro de un tratamiento inmunoterapéutico de la(s) primera(s) condición o condiciones patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedero y de provocar una respuesta inmune de memoria de célula T dentro de la profilaxis contra el riesgo de la(s) segunda(s) condición o condiciones patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedero.
EJEMPLOS . Materiales y método Ra tones Se adquieren ratones de género femenino (H-2b) C57BL/6 de seis semanas de edad de Janvier Laboratories. Los ratones se alojan bajo condiciones libres de patógenos con agua y comida ad libitum. Los procedimientos que implican animales y su cuidado se ajustan a las pautas de Genticel que cumplen con las lcyes y políticas nacionales e internacionales y que son revisadas por el comité de ética local.
Para algunos de los tipos de HPV utilizados en la presente invención, también se pueden utilizar de manera conveniente otros ratones, los cuales tienen un fondo genético diferente. Dichos ratones se pueden adquirir de Janvier laboratorios e incluyen DBA/2JRÍ (H2Kd/H2Dd), o CBA/JRi (H2Kk/H2Dk) SJL/JRi (H2KS/H2DS) y FVB/NRi (H2Kq/H2Dq).
Otros ratones tales como los ratones humanizados que tienen un HLA en particular un haplotipo HLA-A2 también son de interés para determinar la respuesta inmune provocada por las construcciones de la invención. Los ratones transgénicos HLA-A2.1 se pueden comprar de TACONIC (E.U.A.) para probar la inmunogenicidad de los candidatos de vacuna descritos contra cada E7 proveniente de los tipos de HPV seleccionados en ratones que expresan el haplotipo HLA-A2.1.
Estos ratones se utilizan para analizar la inmunogenicidad de las vacunas candidatas descritas contra cada E7 proveniente de los tipos de HPV seleccionados.
Lineas de células de tumor Se preparan células de tumor TC-1 (cultivo de tejido número uno) [19] mediante transformación de células de pulmón de ratón primarias C57BL/6 con los oncogenes E6 y E7 de HPV16 y el oncogén c-Ha-Ras activado de humano. Las células utilizadas en este estudio se obtienen del ATCC. Las células TC1 se descongelan antes de cada experimento y después se cultivan y expanden in vitro durante por lo menos 10 dias antes de la inyección.
El carcinoma de pulmón de Lewis (LL2) es una linea celular establecida a partir del pulmón de un ratón C57BL/6 que porta un tumor que resulta de una implantación de carcinoma de pulmón de Lewis primario (13). Esta linea es ampliamente utilizada como un modelo para metástasis y es útil para estudiar los mecanismos de terapia para cáncer (14). La linea de célula de tumor LL2 se adquiere del ATCC (CRL-1642).
Estas células se transducen con vectores lentivirales que portan los genes de E7 de HPV18 y GFP o solamente el gen de GFP de conformidad con el protocolo del fabricante (Vectalys, Labége, Francia). Se seleccionan 3 clones tomando como base la expresión de MHC clase I, GFP, y E7 . Se selecciona un clon después de selección profiláctica in vivo de conformidad con su perfil de crecimiento y su capacidad para ser elegida como blanco por parte de linfocitos CD8+ T citotóxicos específicos de E7 de HPV18; se efectúa un experimento de velocidad de toma para el número óptimo de inoculación de células. Los estudios de selección in vivo, velocidad de toma y tiempo ideal de tratamiento fueron realizados por Oncodesign (Dijon, Francia). Las células LL2 se descongelan antes de cada experimento y después se cultivan y expanden in vitro durante por lo menos 10 días antes de la inyección.
Las células B16-IRES-GFP-OVA (B16-GFP) y B16-MAGEA3-IRES-GFP-OVA (B16-MAGEA3-GFP) se utilizan para volver a estimular ex vivo los esplenocitos obtenidos a partir de los ratones tratados. Las células B16-AGEA3 son células de tumor singenéicas B16-F10 transducidas por Vectalys con para expresar la proteina MAGE-A3. La expresión de GFP normalmente está vinculada en la expresión de la proteína MAGE-A3.
Inoculación de células de tumor En el día 0, los ratones C57BL/6 se inyectan con células TC-1 (1 xlO6 células por ratón diluidas en 100 ml de PBS 1 X por vía subcutánea en el flanco derecho. En algunos experimentos los ratones se inyectan en el día 65 con células LL2-GFP o LL2-HPV18 E7-GFP diluidas en 100 ml de PBS 1 X por vía subcutánea en el flanco izquierdo.
Vacuna Construcción y purificación de CyaA-HPV16 E7D30_42 (C16-1) y CyaA-HPV18 E7D32-42 (C18-1) recombinantes La construcción y purificación ya fueron descritas en el documento EP1 576 967 Bl. Las dos masas finales de CyaA-HPV16 E7D30-42 (C16-1) (Figura 1A) y CyaA- HPV18 E7D32-42 (C18-1) (Figura IB) se mezclan en Genticel a una relación 1:1 para producir la composición bivalente llamada ProCervix la cual después se almacena a -80°C en alícuotas.
Construcción y purificación de vacunas basadas en gtCyaAd93 y gtCyaAd203 La secuencia de ADN de CyaA de tipo silvestre (CyaAwt: GeneBank: CAE41066.1) se optimiza y sintetiza (GeneCust) para la expresión en E. coli . La secuencia de ADN optimizada se nombra gtCyaA. Esta secuencia porta los siguientes sitios de restricción únicos que se agregan para facilitar la inserción de la secuencia antigénica en el dominio catalítico de CyaA: Nde I (CATATG), BamH I (GGATCC), EcoR I (GAATTC), EcoR V (GATATC), Pci I (ACATGT), Bel I (TGATCA), Age I (ACCGGT), Xma I (CCCGGG), Neo I (CCATGG).
La gtCyaA se inserta después en el plásmido pGTPc608 que contiene un promotor inducible pTAC (plásmido provisto por GTP Technology, Labége, Francia).
Se analizan dos mutantes por deleción: una deleción de 93 aminoácidos desde la posición 228 hasta la posición 320 de CyaA de B. pertussis y una deleción de 203 aminoácidos desde la posición 184 hasta la posición 386 de CyaA de B. pertussis . La primera deleción de 93 residuos elimina el dominio que interactúa con calmodulina (dominio III). La segunda deleción de 203 residuos elimina los dominios II y III.
Las deleciones de 93 y 203 aminoácidos en gtCyaA se generan mientras se están insertando los antigenos.
La purificación de cada proteina expresada se logra utilizando procedimientos de cromatografía; en particular se efectúan téenicas de cromatografía de afinidad por intercambio iónico y cromatografía de intercambio hidrofóbico.
Construcción y purificación de gtCyaAd93-pep216-CyaCopt y gtCyaAd203-pep216-CyaCopt Todos los antígenos fueron sintetizados por DNA 2.0. (E.U.A.) o Genecust (Alemania) y la clonación fue realizada por Solvías, Suiza. Una representación esquemática de gtCyaAd93-pep216-CyaACopt y gtCyaAd203-pep216-CyaACopt se da en las Figuras 3A y 3B.
Las cepas bacterianas BLR se someten a electroporación con cada plásmido respectivamente. Las bacterias transíectadas se hacen crecer en medio clásico y las producciones se inducen por adición de IPTG.
La purificación de cada proteína expresada se logra utilizando procedimientos de cromatografía; en particular se efectúan técnicas de cromatografía de afinidad por intercambio iónico y cromatografía de intercambio hidrofóbico.
Construcción de CyaAd203-pepl05 La proteina CyaAd203-PEP105opt está constituida por una secuencia de adenilato cielasa con 203 aminoácidos eliminados, que contiene, como un inserto antigénico, el polipéptido 105 (PEP105). La secuencia optimizada de CyaA se clona en el plásmido pKTRACE como se describió previamente en los sitios de restricción Ndel y BamHI. Se sintetiza el antigeno Pepl05 y se clona entre los sitios de restricción EcoRI y Xmal. El protocolo de purificación ya fue descrito en el documento EP1 576 967 Bl. Una representación esquemática de pKTRACE CyaAd203-pepl05opt se da en la Figura 4.
El polipéptido pepl05 (SEQ ID NO: 24) comprende de N-terminal hacia C-terminal los siguientes antigenos. Algunos antigenos están fusionados mientras que otros están separados mediante enlazador. Un enlazador particular (dipéptido AS) se introduce antes de la secuencia GVNHQHL para generar un epitope restringido por MHC clase I fuerte de múrido (restringido con H-2b) para calibración de la respuesta inmune (en negritas): - sitios de restricción: MGIR - GFP11: SRDHMVLHEYVNAAGIT - enlazador: GSDR - MOG35-55: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK - OVA257-264 (péptido restringido con MHC clase I proveniente de la proteina ovoalbúmina): SIINFEKL - IEigx-no: VRVDMVRHRIKEHMLKKYTQ - CLA4-TCR H-2Kd HA512-520 : IYSTVASSL enlazador: SGEK - OVA323-339 (peptido restringido con MHC clase II): ISQAVHAAHAEINEAGR - MELAN-A26-35: ELAGIGILTV - HA307-319: PKYVKQNTLKLAT - GP33-41 restringido con LCMV H2-Db: KAVYNFATC - sitios de restricción: SG - MAGEA3n_i8o: RKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQ YFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFAT MAGEA3244-285: KLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPR ALVETSYVK sitios de restricción: TG - HPV16E7 (secuencia truncada): MHGDTPTLHEYMLDLQP ETTDLYCYEQLNGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGT LGIVCPICSQKP - HPV18E7 (secuencia truncada): MHGPKATLQDIVLHLEP QNEIPVDLLCHEQLSASGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLR AFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ - sitios de restricción: LKGP Administración de la vacuna En el día 11, después de medir el tumor, los ratones con tumores sólidos detectables se vacunaron mediante inyección intradérmica (i.d.) en la dermis de las orejas (ambas orejas se inyectaron).
Moléculas de coadyuvante Poli-ICLC (agonista de TLR3) fue provisto por Oncovir (Inc, WA, EE.UU.) en viales que contienen 1 mi de solución estéril opalescente a 2 mg/ml. El poli-ICLC se deja en el recipiente original y se almacena a +4°C. Poli-ICLC para inyección contiene 2 mg/ml de poli-IC estabilizado con 1.5 mg/ml de poli-L-Lisina y 5 mg/ml de carboximetilcelulosa de sodio en solución al 0.9% de cloruro de sodio y se ajusta a pH 7.6-7.8 con hidróxido de sodio.
Medición de tumor Se toman en cuenta diferentes parámetros para evaluar el desarrollo de tumor en los ratones: Tamaño del tumor: Los tumores se miden manualmente utilizando un calibrador dos veces por semana comenzando 5 dias después de la inoculación de células de tumor y hasta el día 60. El volumen del tumor se calcula después de la siguiente manera: volumen = longitud x anchura2)/2.
Supervivencia de los ratones: por razones éticas se sacrifican los ratones que desarrollan tumores anormalmente importantes (limite de tamaño: 2000 mm3) y/o necróticos, o con disminución en la movilidad inducida por tumor.
- Número de ratones sin tumores: Esta información indica cuando la vacunación terapéutica ha inducido una regresión completa del tumor (ausencia de tumor palpable).
Medición de respuestas citotóxicas de memoria de célula T CD8 El método para medir la citotoxicidad de células T CD8+ in vivo ha sido descrito exhaustivamente [22, 23]. Brevemente, los esplenocitos singenéicos provenientes de ratones sin tratamiento se marcan con concentraciones diferentes de CFSE (éster succinimidilico de carboxifluoresceina, Molecular Probes Invitrogen) y ya sea que se pulsen in vitro con los péptidos relevantes o se dejen sin pulsar. Las poblaciones de células objetivo tanto pulsadas con péptido como sin pulsar se transfieren adoptivamente por via intravenosa en los hospederos vacunados singenéicos y se mide la pérdida de objetivos pulsados con péptido mediante citometria de flujo (BD FACSCanto II) en el bazo. El porcentaje de aniquilación se calcula a partir de la reducción en la relación del porcentaje de células objetivo pulsadas a células no pulsadas, se corrige utilizando la relación inicial (véase más adelante). Las preparaciones celulares se analizan mediante citometria de flujo antes de la inyección para monitorear el marcado con CFSE de las diferentes células objetivo y obtener valores de referencia (porcentaje real de cada población celular) para el cálculo del porcentaje de aniquilación in vivo. Las tres poblaciones de células objetivo se inyectan después por via intravenosa a una relación 1:1:1 a cada uno de los ratones vacunados. El porcentaje de aniquilación in vivo se calcula como se describe en alguna otra parte con la siguiente fórmula [24]: PORCENTAJE DE ANIQUILACIÓN = 100- ([% de péptido pulsado en los vacunados/% de no pulsados en los vacunados)/(% de péptido pulsado antes de la inyección/% de no pulsados antes de la inyección)] x 100) Prueba ELISpot de IFN-g (inmunomancha ligada a enzima) Las frecuencias de células T CD8+ especificas productoras de IFN-g se evalúan mediante una reestimulación ex vivo de los esplenocitos con cualquiera de péptidos restringidos con H-2b (HPV16E749_57y HPV18E7AS43-49) o banco de péptido de la proteina E7 de HPV45. Esto se logra efectuando una prueba ELISpot de IFN-g: - La prueba ELISpot se efectúa en esplenocitos combinados de ratones.
Brevemente, los esplenocitos totales obtenidos a partir de ratones vacunados se dejan sin estimular o se reestimulan durante 20 horas a 37°C, 5% de CO2 con 1 mg/ml de cada péptido como se describe a continuación: - lxlO6 células/cavidad con el péptido HPV16E749_57 (epítope relevante restringido con H-2b) lxlO6 células/cavidad con OVA257-264 (epítope irrelevante restringido con H-2b) 0.25xl06 células/cavidad con HPV18 E7A343_49 (epítope relevante restringido con H-2b) - lxlO6células/cavidad con el banco de péptido de E7 de HPV 5.
Para el experimento con la CyaAd203-PEP105opt, se utilizan estimulaciones antigénicas adicionales: - banco de péptidos #116-2/3 (5 pg/ml): combinado de #116-2 y #116-3 (lxlO6 células por cavidad) - banco de péptidos #171 (3 pg/ml): combinado de #171-1, #171-2 y #171-3 (lxlO6 células por cavidad) -OVA323-339, péptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (lxlO6 células por cavidad) -LCMV GP33-41, péptido restringido con MHC-clase I utilizado a 1 pg/ml (lxl06células por cavidad) -MOG35-55, péptido restringido con MHC-clase II, utilizado a 10 pg/ml (lxl06células por cavidad) -proteína MAGEA3 (T?A 002_MAGE-3) marcado con histidina producido en Genticel, utilizada a 10 pg/ml.
-Esplenocitos: las células B16-GFP (que expresan o no a MAGEA3) se co-cultivan a una relación de 19:1 (950000 esplenocitos: 50000 células B16).
La secreción de IFN-g se monitorea mediante una ELISpot basada en emparedado que se revela mediante BCIP/NBT utilizando estreptavidina-AKP. Los datos se analizan en un aparato Bioreader 5000-Pro S (Biosys).
II. Resultados A. Confirmación de la capacidad de los nuevos vectores de la invención para inducir respuesta inmune contra un antigeno modelo Con el fin de confirmar la eficiencia de los nuevos vectores de la invención en sus capacidades para suministrar antigenos grandes y multi-epitópicos, se diseña un antigeno modelo con 441 aminoácidos (SEQ ID NO:24).
Los ratones se vacunan con la proteina CyaAd203-pepl05opt, en el dia 0 y se sacrifican en el dia 7, se recolectan los bazos y se aíslan los esplenocitos. Utilizando estas células, se miden las respuestas mediadas por célula T utilizando pruebas ELISpot de IFN-g e IL-2. Los ratones vacunados con ProCervix se utilizan como controles positivos para inducción de respuestas de célula T específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 y como control negativo para los otros antígenos los cuales son solamente suministrados por la proteína CyaAd203-PEP105opt. Todas las vacunas se coadyuvan mediante co-inyección de Poli-ICLC.
A.1.Inducción de respuestas de IFN-g específicas de E7 de HPV16, E7 de HPV18 y 0nA257-264 La Figura 5 ilustra los resultados obtenidos después de re-estimulación con los péptidos restringidos con la clase I HPV16 E749_57, HPV18 E7¾g43_4g y OV 257-264 y con bancos de péptidos de 15-meros de E7 de HPV16 (#116-2/3) y E7 de HPV18 (#171-1/2/3). Se pueden sacar las siguientes conclusiones: - No se detectan respuestas inmunes específicas de antígenos en el grupo de ratones vacunados con Placebo coadyuvado con Poli-ICLC.
- Respecto al grupo de ratones vacunados con la vacuna Procervix coadyuvada con Poli-ICLC, cualquiera que sea la re-estimulación, se obtienen los resultados esperados: la re-estimulación in vitro con péptidos restringidos con la clase I HPV16E749-57 y HPV18E7AS43-49 induce respuestas claras de IFN-y específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18; - no hay respuesta específica obtenida con la reestimulación con OVA257-264' -la intensidad de las respuestas de IFN-y específicas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 obtenidas con los bancos de péptidos (#116-2/3 y #171-1/2/3) son cercanas al nivel de las respuestas obtenidas con los péptidos restringidos con MHC-clase I (HPV16E749_57, HPV18 E7AS43-49).
- Con respecto a los ratones vacunados con la proteina CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con Poli-ICLC, la detección de respuestas de IFN-g especificas de E7 de HPV16 y E7 de HPV18 con los bancos de péptido tanto de E7 de HPV16 como de E7 de HPV18 (#116-2/3 y #171-1/2/3) y todos los y todos los péptidos restringidos con MHC clase I analizados para Procervix: HPV16E749_57, HPV18E7¾S43-49 y también con el péptido OVA257-264· Estos resultados muestran que la re-estimulación ex vivo con todos estos péptidos diferentes fue capaz de re-estimular las células T especificas de antigeno E7 de HPV18, E7 de HPV16 y OVA257-264 provocado por la vacunación intradérmica de CyaAd203-PEP105opt· A.2. Inducción de respuestas de IFN-y mediadas por células T especificas para los antigenos OVA323-339, LCMV GP33-41, MOG35-55 y MAGEA3 La Figura 6 muestra los resultados obtenidos después de diferentes tipos de re-estimulación ex vivo: - OVA323-339, péptido restringido con MHC-clase II - LCMV GP33-41, péptido restringido con MHC-clase I - MOG35-55, péptido restringido con MHC-clase II - proteina MAGEA3 marcada con Histidina.
Se utilizan células de tumor B16-MAGEA3-GFP como APC para estimular las células T CD8+ específicas de antígeno a través de la presentación de epítopes restringidos con MHC-clase I que resultan del procesamiento endógeno de la proteína MAGE-A3. Las células B16-GFP que no expresan la proteína MAGE-A3 se analizan también como un control negativo para la especificidad de la respuesta inmune de MAGEA3.
Se puede observar que para todos los grupos, la proteína MAGE-3 marcada con histidina induce la misma respuesta no específica.
Para los ratones vacunados con placebo coadyuvado con poli-ICLC o Procervix coadyuvado con poli-ICLC, no se detectan respuestas inmunes hacia estos antígenos.
Para los ratones vacunados con la proteína CyaAd203-PEP105opt coadyuvada con poli-ICLC, las células T secretoras de IFN-g específicas de antígeno se detectan después de re-estimulación con los péptidos OVA323-339, GP33-41 y MOG35-55, pero también después de re-estimulación con células B16-GFP y B16-MAGEA3-GFP.
Estos resultados muestran que la vacunación con CyaAd203-PEP105opt provoca células T específicas de antígeno OVA323-339 restringido con 1-Ab, LCMV GP33-41 y MOG35-55 restringidos con H-2Db y GFP11.
Tomados juntos, estos resultados resaltan la eficiencia exquisita de vectores de vacuna basadas en CyaA para aumentar tanto células T CD4+ como células T CD8+ específicas de antígeno fuertes en un modo multi-epitópico.
Por desgracia, las respuestas específicas de MAGEA3 no se pudieron medir correctamente ya que se obtienen frecuencias similares de células T secretoras de IFN-g después de re-estimulación ex vivo con ambas líneas celulares: B16-GFP o B16-MAGEA3-GFP. Debido a que la proteína CyaAd203-PEP105opt incrusta el antígeno de GFP11, la inmunización con este vector de vacuna induce respuestas de célula T específicas de GFP las cuales enmascaran la respuesta de célula T específica de MAGEA3.
Este estudio resalta por primera vez la capacidad de un vector de vacuna de CyaA con 203 residuos eliminados para inducir, en el mismo ratón vacunado, respuestas de célula T específicas de antígeno contra varios epítopes de célula T no relacionados. Además, estos resultados también muestran la capacidad exquisita de este vector de vacuna de CyaA con 203 residuos eliminados para inducir respuestas de célula T tanto CD4+ como CD8+ (respuestas específicas detectadas contra péptidos restringidos tanto por MHC I como por MHC II).
B. Diseño de antígenos de HPV Se seleccionan siete secuencias de E7 a partir de los 7 tipos de HPV de más alto riesgo (16, 18, 45, 31, 33, 52 y 58) tomando como base su prevalencia en mujeres con carcinoma de célula invasivo (ICC) y en mujeres infectadas por HPV pero con citología normal [9], [10]: variante de E7 de HPV16 (gi_30172006; SEQ ID NO:25), variante de E7 de HPV18 (gi_167996747; SEQ ID NO:26), variante de E7 de HPV31 (gi_148727610; SEQ ID NO:27), variante de E7 de HPV33 (gi_257472286; SEQ ID NO:28), variante de E7 de HPV45 (gi_549287; SEQ ID NO:29), variante de E7 de HPV52 (gi_237861305; SEQ ID NO:30) y variante de HPV58 (gi_1911 1001; SEQ ID NO:32).
E7 está constituida dos dominios funcionales separados por una región ácida. Estos dominios han sido descritos exhaustivamente [11-13]. La parte N-terminal de la proteína contiene el motivo de unión a pRB (LXCXE) y la parte C-terminal de la proteína contiene el asa de dedo de zinc. La alineación de las proteínas E7 de HPV16, 18 y 45 se provee en la Figura 7A, y la alineación de las proteínas E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se provee en la Figura 7B.
Se elaboran dos antígenos recombinantes mediante fusión en cada una de las tres secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 respectivamente (con o sin las regiones ácidas). Además, se elaboran dos antígenos recombinantes mediante fusión de cuatro secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 respectivamente (con o sin las regiones ácidas). La presencia o no de la región ácida de cada E7 sigue el fundamento expuesto en el documento WO 2005089792, que sigue las reglas dictadas por la literatura. En efecto, las secuencias ácidas en CyaA han sido descritas como perjudiciales para la translocación normal del dominio catalítico de CyaA en el citosol [8]. Por lo tanto, en este caso las secuencias con y sin esta región permiten analizar la capacidad de los nuevos vectores de la invención (gtCyaAd93 y gtCyaAd203) para suministrar estos antígenos al citosol de las APCs.
Los antígenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 16, 18 y 45 se han diseñado para generar vacunas con vector de CyaA trivalentes candidatas. Éstas secuencias tienen ya sea eliminada la región ácida o no tienen deleción (longitud completa) y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8A. Las secuencias de los dos antígenos candidatos trivalentes se modificaron adicionalmente para introducir un epítope de múrido de célula T fuerte descrito en el documento WO 2005089792. Este epítope se genera mediante inserción de un dipéptido de Alanina-Serina (AS) al inicio de la secuencia GVNHQHL de E7 de HPV 18, la cual está en la parte C-terminal de la proteína, flanqueando la región ácida.
Los antígenos elaborados a partir de las secuencias de E7 de HPV 31, 33, 52 y 58 se han diseñado para generar vacunas con vector de CyaA tetravalentes candidatas. Al igual que para los antígenos trivalentes, estas secuencias tienen eliminada la región ácida o no tienen deleción, y las secuencias de E7 se han dividido e invertido para obtener el acomodo representado en la Figura 8B.
Para cada candidato, se realiza una búsqueda respecto a la presencia de epítope(s) que pudiera(n) inducir una respuesta contra proteínas de humano. De manera sorpresiva, la secuencia de tipo silvestre de E7 de HPV52 contiene en forma natural una secuencia que podría ser un epítope autoinmune, un epítope B*2705 (9-meros, MHC I). La secuencia de este epítope es 100% idéntica a una secuencia de ITPR3 de humano (receptor de inositol 1,4,5-tri-fosfato, tipo 3). Para evitar este epítope, la secuencia de E7 de HPV52 se modifica tomando como base la homología de secuencia con las proteínas E7 de los tipos de HPV 31, 33 y 58, para reemplazar una metionina por una leucina en la posición 84 y una leucina por una metionina en la posición 86 de SEQ ID NO: 30 (la secuencia modificada es LRTLQQLLM). La secuencia de la proteína E7 de longitud completa modificada de HPV52 es como se indica en SEQ ID NO: 31. Por lo tanto, la novedad de las secuencias de los antígenos tetravalentes se deriva del acomodo de la parte C-terminal y N-terminal de las proteínas E7, y de la presencia de las dos modificaciones efectuadas en la secuencia de E7 de HPV52.
La carga electrostática de estos antigenos particulares se calcula como se explicó anteriormente. Estos antigenos tienen una carga ácida inferior a -6 y portan respectivamente 21 cisteinas en los antigenos trivalentes y 28 cisteinas en los antigenos tetravalentes. Las características de estos antígenos se presentan en forma resumida en la Tabla 2.
TABLA 2 Características de diversos antigenos de HPV C. Deleciones grandes dentro del dominio catalítico de CyaA permiten la inserción de antigenos grandes y complejos Se sintetiza el ADN de los antígenos trivalentes Pep216 y Pep217 y de los antígenos tetravalentes Pep233 y Pep234 y se clona en los nuevos vectores gtCyaAd93 y gtCyaAd203. Como controles, cada proteina E7 se inserta individualmente en gtCyaAd93, para ver si la secuencia de E7 de HPV31, 33, 45, 52 y 58 es problemática ya que nunca antes se hablan insertado en una proteina CyaA.
TABLA 3 Características de las proteínas quiméricas de la invención Código de Delación de Valencia de la gtCyaA Especificidad de los antigenos loscandidatos proteina (Vector) Proteínas E7 de HPV16, 18,45,con el BTpr_114 93 dominio ácido eliminado Proteínas E7 de HPV16, 18,45,con el BTpr_115 203 dominio ácido eliminado Trivalente Proteínas E7 de HPV16, 18,45 de longitud BTpr_116 93 completa Proteínas E7 de HPV16, 18, 45 de longitud BTpr_117 203 completa Proteínas E7 de HPV31,33, 52 y 58,con el BTpr_143 93 dominio ácido eliminado Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58,con el BTpr_144 203 dominio ácido eliminado Tetravalente Proteínas E7 de HPV31,33,52 y 58 de BTpr_145 93 longitud completa Proteínas E7 de HPV31, 33, 52 y 58 de BTpr_146 203 longitud completa TABLA 2 (cont.) Código de Deleción de Valencia de la gtCyaA Especificidad de los antigenos los candidatos proteina (Vector) BTpr_134 93 E7 de HPV58,con la región ácida eliminada BTpr_120 93 E7 de HPV45,con la región ácida eliminada La secuencia de BTpr_114 es como se indica en SEQ ID NO: 58 ; la secuencia de BTpr_116 es como se indica en SEQ ID NO: 61; la secuencia de BTpr_115 es como se indica en SEQ ID NO: 64 ; la secuencia de BTpr_117 es como se indica en SEQ ID NO: 67 ; la secuencia del inserto de E7 de BTpr_131 es como se indica en SEQ ID NO: 70; la secuencia del inserto de E7 de BTpr_132 es como se indica en SEQ ID NO: 71; la secuencia del inserto de E7 de BTpr_133 es como se indica en SEQ ID NO: 73; la secuencia del inserto de E7 de BTpr_134 es como se indica en SEQ ID NO: 74 ; la secuencia del inserto de E7 de BTpr_120 es como se indica en SEQ ID NO: 72.
Se evalúa la producción y las características analíticas de estos antígenos monovalentes, trivalentes y tetravalentes.
Por lo tanto, se efectúan Pre-bancos de célula maestra (pre-MCB) para cada construcción y se analizan respecto a inducción de las proteínas de interés con IPTG (Figura 9). Los candidatos monovalentes y trivalentes tienen un perfil normal después de inducción en análisis en gel de SDS-PAGE mientras que los candidatos tetravalentes muestran una banda débil en el tamaño esperado.
Este perfil se confirma para cada molécula fermentada en termentador de 5 litros. Las características de las proteínas quiméricas producidas se presentan en forma resumida en la Tabla 4.
TABLA 4 Producción y características analíticas de proteínas quiméricas monovalentes , trivalentes y tetravalentes Código de Pureza % Contenido Contenido Actividad enzimática la proteína de LPS de HCP (prueba cAMP) EU/mg BTpr_114 93 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_116 91 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_115 93 >100 y <2 No se detecta actividad enzimática <500 BTpr_117 90 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_143 11 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_144 11 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_131 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_132 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática BTpr_133 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Btpr_!34 96 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Btpr_120 97 <100 <2 No se detecta actividad enzimática Desde un punto de vista de producción, cualquiera que sea la deleción, las gtCyaAs con los antigenos monovalentes y trivalentes dan rendimiento y pureza aceptables (>90%), mientras que los candidatos tetravalentes tienen una pureza reducida (11% de la proteína de interés).
Considerando la pureza general cuando se comparan los candidatos que llevan la dimensión de 93 residuos contra los candidatos con 203 residuos eliminados, parece ser que estos últimos tienen un rendimiento inferior al de las construcciones de gtCyaAd93 (Btprll4 y Btpr_115). Esta diferencia es bastante sorpresiva ya que se esperaría que la gtCyaA más corta fuera más fácil de producir.
Ambos vectores con sus antígenos no tienen actividad enzimática lo que resalta que la deleción es suficiente para desintoxicar los vectores.
D. La producción de GtCyaAs con por lo menos 4 E7 es dependiente de la secuencia Se investiga también si los resultados obtenidos con los candidatos tetravalentes se deben al número de secuencias de polipéptido E7 en la CyaA o a un ensamblado particular de las secuencias del polipéptido E7 en CyaA. Para dicho propósito, se analizan diversas construcciones (Tabla 5).
TABLA 5 Proteínas quimericas con antígenos de HPV trivalentes tetravalentes Código de Deleción Tamaño del Tipos de HPV en el inserto proteína degtCyaA inserto Proteínas E731, 52, 58, con sus regiones Btpr_161 93 253aa ácidas eliminadas Proteínas E731, 33, 52,con sus regiones Btpr_162 93 253aa ácidas eliminadas ProteínasE716, 18, 45, 33,con sus regiones Btpr_163 93 360aa ácidas eliminadas ProteínasE716, 18, 45,58,con sus regiones Btpr_164 93 360aa ácidas eliminadas Btpr_165 93 Proteínas E731,52, 58 de longitud completa 295aa Btpr_166 93 Proteínas E731,33, 52 de longitud completa 294aa Proteínas E716, 18,45,33 de longitud Btpr_167 93 408aa completa ProteínasE716, 18,45,58 de longitud Btpr_168 93 409aa completa Proteínas E731, 52, 58,con sus regiones Btpr_169 203 253aa ácidas eliminadas Proteínas E731, 33, 52, con sus regiones Btpr_170 203 253aa ácidas eliminadas ProteínasE716, 18, 45, 33,con sus regiones Btpr_171 203 360aa ácidas eliminadas ProteínasE716, 18, 45, 58,con sus regiones Btpr_172 203 360aa ácidas eliminadas Btpr_173 203 Proteínas E731,52, 58 de longitud completa 295aa Btpr_174 203 Proteínas E731, 33, 52 de longitud completa 294aa Proteínas E716, 18, 45, 33de longitud Btpr_175 203 408aa completa ProteínasE716, 18,45,58de longitud Btpr_176 203 409aa completa Se efectuaron pruebas de inducción de Pre-MCB y de manera sorpresiva el número de secuencias de E7 en CyaA no es el limite. Más bien es la naturaleza de la secuencia total del antigeno. Asimismo, Btpr_161, 162, 169 y 170 muestran rendimientos de proteina de interés más bajos cuando se comparan con los antigenos de longitud completa (BTpr_165, 166, 173 y 174) (Tabla 6).
TABLA 6 Resumen de los resultados de inducción con pre-MCB Código de Tipos de HPV en el inserto Deleción de Resultados de inducibilidad proteína gtCyaA Btpr_161 Proteínas E731, 52, 58,con 93 Expresión de proteínamás sus regiones ácidas débil que Btpr_165 eliminadas Btpr_162 Proteínas E731, 33, 52,con 93 Expresión de proteínamás sus regiones ácidas débil que BTpr 166 eliminadas Btpr_163 Proteínas E716, 18, 45, 33, 93 Significativamentemejor con sus regiones ácidas perfil de expresión que eliminadas BTpr_143 Btpr_164 Proteínas E716, 18, 45,58, 93 Significativamentemejor con sus regiones ácidas perfil de expresión que eliminadas BTpr_143 Btpr_165 Proteínas E731, 52, 58de 93 Perfil de expresión de longitud completa proteina similar a BTpr_114 Btpr_166 ProteínasE731, 33, 52 de 93 Perfil de expresión de longitud completa proteína similar a BTpr_114 Btpr_167 Proteínas E716, 18, 45,33 93 / de longitud completa TABLA 6 (cont . ) Código de Tiposde HPV en el inserto Deleción de Resultados de inducibilidad proteina gtCyaA Btpr_168 Proteínas E716, 18, 45, 58 93 / de longitud completa Btpr_169 Proteínas E731, 52, 58,con 203 Expresión de proteinamás sus regiones ácidas débil que Btpr_173 eliminadas Btpr_170 Proteínas E731, 33, 52,con 203 Expresión de proteinamás sus regiones ácidas débil que Btpr_174 eliminadas Btpr_171 Proteínas E716, 18, 45, 33, 203 / con sus regionesácidas eliminadas Btpr_172 Proteínas E716, 18, 45, 58, 203 con sus regionesácidas eliminadas Btpr_173 ProteínasE731,52, 58 de 203 Perfil de expresión de longitud completa proteína similar a BTpr_114 Btpr_174 Proteínas E731,33, 52 de 203 Perfil de expresión de longitud completa proteína similar a BTpr_114 Btpr_175 Proteínas E716, 18, 45, 33 203 / de longitud completa Btpr_176 Proteínas E716, 18, 45, 58 203 / de longitud completa A partir de los experimentos anteriores, se puede concluir que gtCyaAd93 y gtCyaAd203 aceptan la secuencia de polipéptido equivalente que corresponde a por lo menos 4 proteínas E7. Sin embargo, la secuencia y el acomodo de los fragmentos de E7 elegidos pueden tener un impacto sobre el rendimiento y pureza y por lo tanto tiene más o menos potencial de industrialización favorable.
Confirmación de resultados observados con el pre- MCB Los inventores investigaron adicionalmente si los resultados obtenidos en el nivel pre-MCB son confirmados con un enfoque particular sobre construcciones tetravalentes en el vector gtCyaAd93. Las proteínas que tienen un mejor perfil de expresión que BTpr_143 o equivalente a BTpr_115 son analizadas a una escala de 5 litros. La siguiente tabla presenta en forma resumida los resultados obtenidos.
TABLA 7 Resumen de la inducción pre-MCB y resultados de producción a escala de 5 litros . _ _ _ _ _ _ TABLA 7 (cont.) ; . - , :-; : _ _ _ _ que: 1. La productividad y pureza total ha sido mejorada para todas las construcciones analizadas excepto para Btpr_175. 2. Los perfiles de productividad y' expresión siempre son inferiores en proteínas recombinantes con gtCyaAd203 que con gtCyaAd93. 3. El vector gtCyaAd93 permite la producción de proteínas recombinantes que contienen 4 antígenos de HPV con un mejor rendimiento y pureza que el vector gtCyaAd203. 4. Estos resultados confirman las observaciones hechas en el pre-MCB.
E. gtCyaAd93 y gtCyaAd203 que contienen antígenos grandes son inmunogenicos E.l Inmunogenicidad de BTpr 114, BTpr 115, BTpr 116 y BTpr 117 La inmunogenicidad de las proteínas quiméricas BTpr_114, BTpr_115, BTpr_116 y BTpr_117, se investigó adicionalmente. Los ratones fueron vacunados por vía intradérmica ya sea con el placebo o con ProCervix (control positivo compuesto de CyaA-HPV16 E7 + CyaA-HPV18 E7) o con Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93-pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) respectivamente. Todos los grupos se coadyuvan con poli-IC-LC. Los ratones se sacrifican 7 después de la vacunación y los esplenocitos son re-estimulados con péptidos restringidos con MHC clase I anteriormente identificados. Los resultados se presentan en la Figura 10.
La Figura 10 muestra que: - la inmunización con 10 mg de ProCervix induce un nivel esperado de respuesta de IFN-g especifica de E749-57 de HPV16 y E7As43-49 de HPV18. las respuestas específicas de antígeno obtenidas con vacunas trivalentes candidatas son equivalentes a la obtenida con ProCervix. no se observan diferencias entre candidatos trivalentes, en la frecuencia de respuestas de célula T específicas. - la respuesta más baja contra el antígeno de HPV16 se debe al hecho que el epítope de HPV16 es más débil que el epitope de HPV 18 al cual los ratones C56LB/6 son muy sensibles.
Estas observaciones permiten concluir que gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd93-PEP217-CyaCopt y gtCyaAd203-PEP217-CyaCopt coadyuvados con poli-ICLC son tan eficientes como ProCervix coadyuvado con poli-ICLC en la inducción de respuestas de IFN-g específicas de de HPV16 E749_57 y de HPV18 E7AS43-49 en ratones después de inmunización transdérmica.
Debido a que no se identificó ningún péptido restringido con MHC-1 para E7 de HPV45 en los ratones en el momento del experimento, los esplenocitos son re estimulados con una genoteca de péptido de E7 de HPV45 divida en tres sub-combinados (#218-1, #218-2 y #218-3). Este experimento es la primera re-estimulación, conocida por los inventores, hecha con una genoteca de péptido en lugar de con un péptido que corresponde a un epitope conocido.
La Figura 11 muestra que la re-estimulación in vitro restimulation con el sub-combinado de péptido #218-3, pero no los sub-combinados #218-1 y #218-2, es capaz de re estimular células T inducidas por vacunación con gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd203-PEP216-CyaCopt, gtCyaAd93-PEP217-CyaC0pt y gtCyaAd203-PEP217-CyaCopt. La secuencia de péptido responsable para esta respuesta inmune es IELTVESSAEDLRTL.
De manera sorpresiva, se observó una respuesta similar con el grupo vacunado con ProCervix, el cual no porta la secuencia de E7 de HPV45. Este resultado se puede explicar mediante una reactividad cruzada entre los epitopes presentes en el combinado #218-3 y las secuencias de E7 de HPV16 o de E7 de HPV18 contenidas en la vacuna ProCervix.
Juntos, estos resultados muestran que los antígenos con una estructura compleja (21 cisteínas) y cargas ácidas son suministrados correctamente por gtCyaAd93 y gtCyaAd203 y procesados por células Presentadoras de Antigeno (APC). Esto es inesperado tomando en consideración los resultados enseñados en Preville et al. [5], Karimova et al. [7] y Gmira et al. [8].
Además, la deleción efectuada en el dominio catalítico de CyaA podría proveer una ventaja con relación al polipéptido heterólogo suministrado, reduciendo el nivel de respuestas de celulá T específicas de CyaA y respuestas de célula B específicas de CyaA (dicha deleción resulta en la reducción en número principalmente de epítopes restringidos por MHC clase I y clase II de CyaA) E.2 Inmunogenicidad de nuevos líderes que consisten de Btpr 163, BTpr 164, BTpr 165, BTpr 166, BTpr 167, BTpr 168, BTpr 173 y BTpr 175 La inmunogenicidad de los nuevos líderes que consisten de Btpr_163, BTpr_164, BTpr_165, BTpr_166, BTpr_167, BTpr_168, BTpr_173 y BTpr_175, se analiza adicionalmente en ratones C57BL/6.
Los ratones son vacunados por vía intradérmica ya sea con el placebo o con cada líder, respectivamente. Todos los grupos se coadyuvan con poli-ICLC.
Los ratones se sacrifican 7 días después de la vacunación y los esplenocitos son re-estimulados con genotecas de péptido de cada antigeno de E7 analizado. Todos los lideres analizados son inmunogénicos. La inmunogenicidad contra HPV31, 45 y 58 no se analiza en ratones C57BL/6 debido a que las herramientas no están adaptadas (el fondo genético de los ratones no es apropiado). La inmunogenicidad contra está proteínas E7 se analiza en otras cepas de ratones como se describe en Materiales y Métodos.
TABLA 8 Inmunogenicidad de lideres analizados en ratones C57BL/6 . · , - _ _ TABLA 8 (cont.) ; : , - - Estos resultados muestran que: - La inmunización con 10 mg de cada líder induce una respuesta de IFN-g especifica. gtCyaAd93 y gtCyaAd203 suministran correctamente los antigenos a las células presentadoras de antigeno.
- Se miden respuestas inmunes especificas contra proteínas E7 de HPV16, 18, 33 y 52.
Estos resultados permiten la investigación adicional de la respuesta inmune contra mezclas hexavalentes y heptavalentes.
E.3 Inmunogenicidad de una vacuna hexavalente candidato La respuesta inmune de una mezcla hexavalente de dos lideres trivalentes, se evalúa en ratones C57BL/6. Estos lideres son BTpr_114 y BTpr_165 que contienen respectivamente proteínas E7 de HPV 16-18-45, y proteínas E7 de HPV 31-52-58. Se utiliza el mismo protocolo que el descrito anteriormente. Debido a que no hay un péptido restringido con MHCI conocido identificado para E7 de HPV52 en los ratones al momento del experimento, se re-estimulan los esplenocitos con una genoteca de péptido de E7 de HPV52 dividida en tres sub combinados (221-1, 221-2 y 221-3). Para re-estimulaciones con HPV16E7 y HPV18E7, también se utilizan genotecas de péptido divididas en 3 sub-combinados (116-1, 116-11, 116-III y 171-I, 171-11 y 171-3 respectivamente).
Los resultados se muestran en las Figuras 15A- 15C.
Estos resultados confirman que: La inmunización con 10 mg de la mezcla hexavalente induce respuestas de célula T para E7 de HPV16, E7 de HPV18 y HPV52 como se mide mediante ELISpot de IFN-g.
- Cada gtCyaAd93 con sus antígenos respectivos es capaz de suministrarlos a la célula presentadora de antígeno (APC) y promover respuestas de célula T específicas de antígeno contra tipos de HPV medibles.
- No se observan diferencias entre componentes trivalentes solos en la frecuencia de respuestas de célula T especificas de E7 y la vacuna hexavalente candidato, (datos no mostrados) Estas observaciones permiten concluir que Btpr_l 14 y Btpr_165 coadyuvados con poli-ICLC son eficientes para inducir respuestas de célula T especificas de E7 de HPV16, E7 de HPV18E7 y E7 de HPV52 en ratones C57BL/6 después de inmunización intradérmica.
E.4 Inmunogenicidad de dos vacunas heptavalentes candidato Tomando como base los resultados de productividad y pureza, se analizan dos combinaciones heptavalentes en ratones C57BL/6: Btpr_165+Btpr_163 y Btpr_166 + Btpr_164. Los ratones se inmunizan por via intradérmica con 10 mg de cada vacuna heptavalente candidato, respectivamente.
Tal como se muestra en la Figuras 16A-16D, estos resultados indican que para: - E7 de HPV16: la re-estimulación in vitro con sub-combinado de péptidos #116-2j (c+d), es capaz de re estimular células T inducidas por vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV16.
- E7 de HPV18: la re-estimulación in vitro con sub-combinados de péptidos #171-1 y #171-11 son capaces de re-estimular células T inducidas mediante vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato y sus componentes solos que albergan E7 de HPV18.
- E7 de HPV33: - Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_166 y Btpr_164, la re-estimulación in vitro con el sub-combinado de péptido #220-2, es capaz de re-estimular células T inducidas mediante vacunación, - Para la vacuna heptavalente candidato compuesta de Btpr_165 y Btpr_163, la re-estimulación in vitro con los sub-combinados de péptido #220-1, #220-2 y #220-3 son capaces de re-estimular células T inducidas mediante vacunación.
- E7 de HPV52: la re-estimulación in vitro con el sub-combinado de péptidos #221-2 y #221-3 es capaz de re estimular células T inducidas mediante vacunación con ambas vacunas heptavalentes candidato o sus componentes solos que alojan E7 de HPV52.
Juntos, estos resultados de producción e inmunogenicidad indican que: Se puede producir y purificar gtCyaAd93 recombinante con 3 y 4 proteínas E7 de HPV con una buena productividad; También se pueden producir y purificar proteínas gtCyaAd203 recombinantes pero con una productividad que es inferior con respecto a los vectores gtCyaAd93 que contienen los mismos antigenos.
- Dos gtCyaAd93 recombinantes con 3 y 4 proteínas E7 de HPV pueden suministrar correctamente sus antigenos a las APCs.
- Se mide una respuesta inmune especifica contra cada tipo de HPV inmunogénico en ratones C57BL/6 - El diseño de las proteínas E7 con un gtCyaAd93 recombinante puede tener un impacto en la respuesta inmune contra antigenos E7 por ejemplo como se ilustró con E7 de HPV33.
- Los antígenos con una estructura compleja (21 cisteínas) y cargas ácidas son suministrados correctamente mediante gtCyaAd93 y procesados por células Presentadoras de Antigeno (APC). Esto es inesperado tomando en consideración los resultados de Gmira et al. 2001, y Fayolle et al., 1998.
F. Eficiencia citotóxica de los candidatos F.l Eficiencia citotóxica mediada por CD8 de las vacunas trivalentes candidato Con el fin de comparar la eficiencia de los candidatos trivalentes en la inducción de citotoxicidad, se efectuaron pruebas de aniquilación in vivo con y sin coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de péptido provenientes de proteínas E7 de HPV16, HPV18 y HPV45, respectivamente.
Se vacunan 4 grupos de ratones con un placebo, con gtCyaAd93-pep216-CyaCopt, con gtCyaAd93-pep217-CyaCopt y con gtCyaAd203-pep217-CyaCopt en presencia o no de poli-IC-LC, respectivamente.
En presencia de coadyuvante, no se observa ninguna diferencia entre candidatos (datos no mostrados). En la Figura 12A (cargando con genotecas #171-1 y #171-2), el porcentaje de aniquilación es superior en los ratones vacunados con la proteina quimérica que contiene los antigenos de longitud completa (pep217) en comparación con ratones vacunados con la proteina quimérica que contienen el antigeno eliminado pep216. De manera similar, en la Figura 12B (cargando con la genoteca de péptido #218-3), el porcentaje de aniquilación es superior en los ratones vacunados con la proteina quimérica que contiene pep217 mientras que no se observa aniquilación alguna en los ratones vacunados con la proteina quimérica que contiene pep216 cuando se compara con el placebo. Sin el coadyuvante poli-LCLC, las gtCyaAs que albergan los antigenos de longitud completa son más eficientes para aniquilar sus células objetivo en comparación con los antigenos eliminados para este dominio ácido. Esto es inesperado ya que los antigenos de longitud completa contienen los dominios ácidos de E7 y de conformidad con la enseñanza de la literatura deberían ser menos eficientes que los antígenos eliminados para este dominio ácido.
Estos resultados indican que los antígenos de longitud completa probablemente tienen epítopes (epítopes de célula T auxiliar) que favorecen la respuesta de aniquilación mediante linfocitos T CD8+; y - los vectores gtCyaA permiten el suministro de antígenos con regiones ácidas F.2 eficiencia citotóxica mediada por CD8 de las vacunas heptavalentes candidato Con el fin de comparar la eficiencia de las vacunas heptavalentes candidato respecto a su capacidad de inducir linfocitos T citotóxicos específicos de E7 (CTL), se efectuaron pruebas de aniquilación in vivo con coadyuvante. Se recolectan esplenocitos provenientes de ratones no afectados por tratamiento y se cargan con genotecas de péptido provenientes de proteínas E7 de HPV16 y HPV18, respectivamente.
Se vacunan 3 grupos de ratones con un placebo, con BTprl65 + BTprl63 y BTprl66 + BTprl64 en presencia de Poli-ICLC, respectivamente.
No se observa aniquilación específica de E7 en el grupo con placebo. Ambas vacunas heptavalentes candidato inducen aniquilación específica de E7 de células cargadas respectivamente con la genoteca de péptido E7 de HPV16 E7 (Figura 17-A) o la genoteca de péptido E7 de HPV18 E7 (Figura 17-B).
Estos resultados indican que ambos candidatos heptavalentes inducen CTL específicos de E7 de HPV16 y HPV18 funcionales.
G. Pruebas de regresión de tumor en ratones que portan tumores TC-1 Se investiga adicionalmente la eficiencia terapéutica de los cuatro candidatos trivalentes Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93-pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) utilizando el modelo de células de tumor TC-1.
Todos los ratones fueron inoculados con células TC-1 (que expresan el antígeno E7 de HPV16) en el día 0. El grupo 1 se deja sin tratamiento. El grupo 2 se trata con PBS y Poli-ICLC, el grupo 3 se trata con ProCervix coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 4 se trata con gtCyaAd93-pep216 coadyuvado con Poli-ICLC, el grupo 5 con gtCyaAd203-pep216 coadyuvado con poli-IC-LC, el grupo 6 con gtCyaAd93-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC y el grupo 7 con gtCyaAd203-pep217 coadyuvado con Poli-ICLC. Cada grupo está compuesto de 10 ratones.
Las Figuras 13A-13B(a-g) muestran que todos los ratones desarrollan tumores. Sin embargo, los ratones vacunados con una vacuna candidato de CyaA que incorpora el antigeno E7 de HPV16 y coadyuvada con Poli-ICLC muestran una tasa de eliminación del tumor más fuerte en el dia 65: 9 de 10 ratones tratados con ProCervix + Poli-ICLC eliminaron los tumores (grupo 3) (Figura 13Bc); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep216 + Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 4) (Figura 13Bd); 8 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep216 + Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 5) (Figura 13Be); 9 de 10 ratones tratados con gtCyaAd93-pep217 + Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 6) (Figura 13Bf); 9 de 10 ratones vacunados con gtCyaAd203-pep217 + Poli-ICLC presentaron regresión de tumores (grupo 7) (Figura 13Bg).0 de 10 y 1 de 10 ratones no tratados o tratados con el placebo + Poli-ICLC presentaron regresión de tumores respectivamente (grupo 1 (Figura 13Ba) y grupo 2 (Figura 13Bb)). Por lo tanto, únicamente los ratones que fueron vacunados con una vacuna candidato que contiene el antigeno E7 de HPV16 fueron capaces de presentar regresión de tumores de manera significativa. Entre las cuatro vacunas candidato, no se observa diferencia en su capacidad para presentar regresión de tumores.
Estos resultados muestran que la administración de las proteínas quiméricas de la invención, tales como Btpr_114 (gtCyaAd93-PEP216-CyaCopt), BTpr_115 (gtCyaAd93-pep217-CyaCopt), BTpr_116 (gtCyaAd203-pep216-CyaCopt) y BTpr_117 (gtCyaAd203-pep217-CyaCopt) permite presentar regresión de tumores que provocan trastornos oncogénicos de manera eficiente.
H. Efecto terapéutico y profiláctico de los candidatos trivalentes Se evaluó adicionalmente la capacidad de los ratones vacunados de ser protegidos contra el desarrollo y crecimiento de un tumor, después de la erradicación de un primer tumor que expresa un antigeno diferente. Se inoculan células de tumor LL2 que expresan antigeno E7 de HPV18 y la linea celular de control LL2-GFP en el flanco de los ratones vacunados supervivientes, los cuales previamente habían presentado regresión de tumor de los tumores injertados de TC-1 (que expresan el antígeno E7 de HPV16).
Cada grupo de ratones supervivientes fue dividido en dos sub-grupos que fueron inoculados ya sea con células LL2-HPV18 E7 o células LL2-GFP. Los resultados se muestran en las Figuras 14A-14B(a-j).
Los ratones vacunados con una vacuna candidato de gtCyaA que incorporan el antígeno E7 de HPV18 y coadyuvados con Poli-ICLC muestran un fuerte efecto protector contra el crecimiento de la línea celular de LL2-HPV18 E7 (ningún ratón desarrolló tumor en los grupos 3b (Figura 14Bb), 4b(Figura 14Bd), 5b(Figura 14Bf), 6b (Figura 14Bh) y 7b (Figura 14Bj)) pero no contra el crecimiento de la linea celular LL2-GFP (todos los ratones desarrollaron tumores en los grupos 3a (Figura 14Ba), 4a (Figura 14Bc), 5a (Figura 14Be), 6a (Figura 14Bg)y 7a (Figura 14Bi)).
Juntos, estos resultados destacan que los ratones vacunados con los candidatos trivalentes, los cuales eliminaron los tumores de TC-1, también están protegidos contra los tumores de LL2-HPV18E7 e indica que dichos ratones vacunados, los cuales desarrollaron una respuesta de célula T especifica de antígeno curativa en contra del antígeno E7 de HPV16, también desarrollaron una respuesta de célula T específica de antígeno protectora contra el antígeno E7 de HPV18 BIBLIOGRAFÍA [1] Ladant D, Glaser P, Ullmann A. Insertional mutagenesis of Bordetella pertussis adenylate cyclase. J Biol Chem 1992;267: 2244-50. [2] Sebo P, Fayolle C, d'Andria 0, Ladant D, Leclerc C, Ullmann A. Cell-invasive activity of epitope-tagged adenylate cyclase of Bordetella pertussis allows in vitro presentation of a foreign epitope to CD8+ cytotoxic T cells. Infect Immun 1995;63: 3851 -7. [3] Dadaglio G, Moukrim Z, Lo-Man R, Sheshko V, Sebo P, Leclerc C. Induction of a polarized Thl response by insertion of múltiple copies of a viral T-cell epitope into adenylate cyclase of Bordetella pertussis . Infect Immun 2000;68: 3867-72. [4] Fayolle C, Ladant D, Karimova G, Ullmann A, Leclerc C. Therapy of murine tumours with recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase carrying a cytotoxic T cell epitope. J Im unol 1999;162: 4157-62. [5] Preville X, Ladant D, Timerman B, Leclerc C.
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Claims (26)

REIVINDICACIONES 1.- Un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA que comprende o que consiste de: 1) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO:2 y terminando con un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO:2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento, fusionado a 2) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO:2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO:2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento. 2.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha proteina derivada de CyaA se selecciona a partir del grupo que consiste de: 1) un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO:10 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este polipéptido; 2) un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO:12 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este polipéptido; 3) un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO:19 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este polipéptido; 4) un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia como se indica en SEQ ID NO:20 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este polipéptido. 3.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha proteina derivada de CyaA variante comprende o consiste de: 1) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:13; 2) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:14; 3) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:15; 4) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:16; 5) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:17; o 6) un polipéptido cuya secuencia es como se indica en SEQ ID NO:18. 4.- Un polinucleótido quimérico que codifica para una proteina quimérica, dicho polinucleótido comprende o consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con el primer residuo de SEQ ID NO:2 y terminando con un residuo localizado entre las posiciones 183 y 227 de SEQ ID NO:2, o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento con un residuo localizado entre las posiciones 321 y 387 de SEQ ID NO:2 y terminando con el último residuo de SEQ ID NO:2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con dicho fragmento. 5.- El polinucleótido quimérico de conformidad con la reivindicación 4 que se selecciona a partir del grupo que consiste de 1) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6; 2) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO:8; 3) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6; 4) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO:8; 5) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6; 6) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO:8; 7) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6; y 8) un polinucleótido que comprende o que consiste de, de 5' hacia 3', (a) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:8, (b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo y (c) un polinucleótido que codifica para un fragmento de polipéptido que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO:8. 6.- El polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polinucleótido quimérico de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque dicha proteina derivada de CyaA variante es capaz de unirse a las células objetivo y/o de translocar su dominio de adenilato cielasa en el citosol de las células objetivo. 7.- El uso de un polinucleótido que codifica para una proteina derivada de CyaA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6 para la producción de una proteina quimérica que comprende o que consiste de dicha proteina derivada de CyaA y un polipéptido heterólogo, en el cual el polinucleótido que codifica para dicho polipéptido heterólogo se clona entre dichos fragmentos 1) y 2) de CyaA como se describe en la reivindicación 1. 8.- Un polinucleótido quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende también, en su extremo 3' un polinucleótido que codifica para la proteina CyaC de una cepa de Bordetella, en particular de una cepa de Bordetella pertussis . 9.- Un vector, de preferencia un plásmido, que comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polinucleótido quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, y secuencias de control de expresión, y opcionalmente comprende también la secuencia codificadora de cyaC de una cepa de Bordetella. 10.- Un cultivo celular, de preferencia un cultivo de cepa de E. coli, que comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polinucleótido quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 9. 11.- Una proteina derivada de CyaA codificada por un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, expresada a partir de un vector de conformidad con la reivindicación 9 o producida por un cultivo celular de conformidad con la reivindicación 10. 12.- Una proteina quimérica codificada por un polinucleótido quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, expresada a partir de un vector de conformidad con la reivindicación 9 o producida por un cultivo celular de conformidad con la reivindicación 10. 13.- Una proteina quimérica que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en el primer residuo de SEQ ID NO:2 y terminando en un residuo localizado desde la posición 183 hasta la posición 227 de SEQ ID NO:2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento, (b) un polipéptido heterólogo, y (c) un fragmento de la proteina CyaA de Bordetella pertussis como se indica en SEQ ID NO: 2, comenzando la secuencia de dicho fragmento en un residuo localizado desde la posición 321 hasta la posición 387 de SEQ ID NO:2 y terminando en el último residuo de SEQ ID NO:2 o una variante con por lo menos 95% de similitud con este fragmento. 14.- Una proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 13, que se selecciona a partir del grupo que consiste de:
1) una proteina que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1706 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6;
2) una proteina que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 227 de SEQ ID NO:8, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 321 a 1705 de SEQ ID NO:8;
3) una proteina que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:2, 4 ó 6, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1706 de SEQ ID N0:2, 4 ó 6; y
4) una proteina que comprende o que consiste de, de N-terminal hacia C-terminal, (a) un fragmento que consiste de los residuos 1 a 183 de SEQ ID NO:8, (b) un polipéptido heterólogo y (c) un fragmento que consiste de los residuos 387 a 1705 de SEQ ID NO:8. 15.- La proteina quimérica de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizada porque dicho polipéptido heterólogo corta por lo menos un epítope(s), de preferencia por lo menos un epítope(s) CD8+ y/o por lo menos un epítope(s) CD4+. 16.- La proteina quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque dicho polipéptido heterólogo comprende uno o varios antigenos o epitopes virales o celulares o bacterianos o fúngicos. 17.- La proteina quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque el polipéptido heterólogo tiene un tamaño que varia de 9 a 500 ó 20 a 500 ó 50 a 500 ó 100 a 500 residuos de aminoácido. 18.- El polipéptido quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por el polipéptido heterólogo tiene una carga electrostática que es negativa o tiene un fragmento del cual 10 a 40% de su tamaño tiene una carga electrostática que es negativa. 19.- Una proteina quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque el polipéptido heterólogo tiene la secuencia de SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 74. 20.- Una composición que comprende una proteina quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 y un vehículo farmacéutico apropiado, y opcionalmente por lo menos un coadyuvante. 21.- Una proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o una composición de conformidad con la reivindicación 20, para uso como un medicamento, en particular para uso en la inducción de una respuesta inmune profiláctica o de una respuesta inmune terapéutica. 22.- Una proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o una composición de conformidad con la reivindicación 20, para uso en la profilaxis o tratamiento de una infección por patógeno o de un trastorno oncogénico. 23.- Una proteína quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19 o una composición de conformidad con la reivindicación 20, para uso (i) en el tratamiento inmuno-terapéutico de la(s) primera(s) condición (ones) patológica(s) determinada(s) diagnosticada(s) en un hospedero mamífero provocando una respuesta inmune de célula T contra un primer grupo de epítopes contenidos en dicho(s) polipéptido(s) y (ii) en la profilaxis contra la(s) segunda(s) condición(ones) patológica(s) determinada(s) en el mismo hospedero mamífero provocando una respuesta inmune de memoria de célula T contra un segundo grupo de epítopes contenidos en dicho(s) polipéptido(s), dichas respuestas inmunes se obtienen después de la administración de la proteína quimérica o composición en dicho hospedero, caracterizada porque dicha profilaxis contra la(s) segunda(s) condición(ones) patológica(s) determinada(s) no se observa cuando dicho segundo grupo de epítopes no está contenido en dicho(s) polipéptido(s) portado(s) con vector administrado(s). 24.- Un método para producir una proteína quimérica, que comprende: (a) eliminar, de un polinucleótido que codifica para la CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleótido, cuyos primeros tres nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizados desde el residuo 184 hasta el residuo 228 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, cuyos últimos 3 nucleótidos codifican para un residuo de aminoácido localizados desde el residuo 320 hasta el residuo 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8; (b) insertar, en el polinucleótido obtenido en (a) y en el sitio del fragmento de nucleótido eliminado, un polinucleótido que codifica para un polipéptido heterólogo; caracterizado porque los pasos (a) y (b) se pueden efectuar en cualquier orden o simultáneamente; (c) expresar, en una célula, el polinucleótido obtenido en (b); y (d) recuperar dicha proteína quimérica expresada. 25.- Un método de conformidad con la reivindicación 24, que comprende el paso de combinar en una construcción de polinucleótido quimérico el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteína CyaC, en particular la construcción de polinucleótido quimérico comprende el polinucleótido obtenido en el paso (b) y un polinucleótido que codifica para la proteína CyaC de tal manera que después de dicha combinación, el polinucleótido quimérico obtenido comprende o contiene, del extremo 5' hacia el extremo 3', la construcción de polinucleótido del paso (b) seguido por una construcción de polinucleótido que codifica para una proteina CyaC de una cepa de Bordetella, en particular de una cepa de Bordetella pertussis . 26.- El método de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque dicho paso a) consiste en eliminar, de un polinucleótido que codifica para una CyaA de Bordetella como se indica en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 228 a 320 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 184 a 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 228 a 386 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento de nucleótido que codifica para los residuos 184 a 320 de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 o en donde dicho paso a) consiste en eliminar, de un polinucleótido como se indica en SEQ ID NO: 1 , 3, 5 ó 7 o en SEQ ID NO:69, un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 682 a 960 de SEQ ID NO: 1 , 3, 5 ó 7 o de SEQ ID NO:69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 550 a 1158 de SEQ ID NO: 1 , 3, 5 ó 7 o de SEQ ID NO:69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 682 a 1158 de SEQ ID NO: 1 , 3, 5 ó 7 o de SEQ ID NO:69, o un fragmento de nucleótido que consiste de los nucleótidos 550 a 960 de SEQ ID NO: 1 , 3, 5 ó 7 o de SEQ ID NO:69.
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