PT1684801E - A toxina de adenilato ciclase recombinante da bordetella induz respostas das células t contra antigénios tumorais - Google Patents

A toxina de adenilato ciclase recombinante da bordetella induz respostas das células t contra antigénios tumorais Download PDF

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PT1684801E
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Benoit Van Den Eynde
Claude Leclerc
Daniel Ladant
Gilles Dadaglio
Sandra Morel
Cecile Bauche
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Pasteur Institut
Ludwig Inst Cancer Res
I N S E R M Inst Nat Sante Rec
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Description

1
DESCRIÇÃO "A TOXINA DE ADENILATO CICLASE RECOMBINANTE DA BORDETELLA INDUZ RESPOSTAS DAS CÉLULAS T CONTRA ANTIGÉNIOS TUMORAIS" A invenção é relativa a uma toxina de adenilato ciclase recombinante da Bordetella, que induz respostas das células T contra antigénios tumorais.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção é relativa a composições e a métodos destinados ao tratamento do cancro.
Em muitos modelos tumorais animais, as células T desempenham um papel importante na rejeição de tumores. Identificou-se uma série de antigénios tumorais, reconhecidos pelas células T reactivas a tumores CD4+ ou CD8+, tanto em tumores murinos como humanos (1). Os linfócitos citotóxicos CD8+ (CTL) revestem-se de particular interesse, pois estas células reconhecem de forma especifica as células tumorais e matam-nas. Por conseguinte, um objectivo importante na imunoterapia oncológica é o de activar os CTL específicos de tumores. 0 estudo de antigénios reconhecidos pelas células T CD8+ no melanoma humano identificou vários epítopos tumorais restritos a MHC, que correspondem a péptidos mutados ou não mutados, derivados de várias proteínas self (2). Vários destes péptidos derivam de proteínas de diferenciação não mutadas, tais como a tirosinase, a Melan-A/Mart-1 e a gplOO. Estas proteínas expressam-se de forma específica na maior parte dos melanócitos/melanomas e, assim, os epitopos 2 HLA-restritos são apresentados pela maior parte das células de melanoma de doentes que expressam as moléculas HLA relevantes. Por isso, estes antigénios poderão ser os alvos de estratégias imunoterapêuticas que se baseiem na imunização contra epitopos tumorais.
Também foram descritos outros antigénios expressos em células tumorais, por exemplo, um péptido que deriva de uma sequência de intrão do gene que codifica a N-acetilglucosaminil-transferase V (GnT-V) (3). Este intrão é especificamente expresso nas células de melanoma e encontra-se presente em cerca de 50% das células de melanoma.
Desenvolveu-se diversos protocolos de vacinação concebidos para induzir respostas de CTL antitumorais específicas contra estes epitopos, inclusive protocolos que empregam péptido livre em IFA (4), vectores virais recombinantes (5 -7), ou células dendríticas (8 - 11). A aplicação destas abordagens à vacinação humana continua limitada devido a uma potencial toxicidade dos adjuvantes, com uma tendência no sentido de resposta contra péptido epitópico derivado de vector, ou por serem "laboratorialmente exigentes" (DC manipuladas in vitro).
Empregou-se anteriormente plasmídeos recombinantes para a expressão da adenilato ciclase (cyaA) da Bordetella sp. e um ADN heterólogo inserido num local permissivo da CyaA. Estes plasmídeos e as proteínas recombinantes resultantes têm sido úteis na indução de respostas imunitárias. As respostas imunitárias despoletadas foram em linfócitos T CD8+ com complexos de histocompatibilidade major de classe I, assim como em linfócitos T CD4+ com complexos de 3 histocompatibilidade major de classe II. (ver as patentes US N.°s 5,503,829, 5,679,784 e 5,935,580). Mais especificamente, as proteínas recombinantes podem ser fornecidas às células que expressam o CDllb, como as células dendríticas. (ver o pedido de patente europeia EPl 188 446 Al, "Proteinaceous vectors for molecule delivery to CDllb expressing cells", e o WO/2122169 A2 "Vectors for Molecule Delivery to CD11 b Expressing Cells", correspondendo ao pedido de patente U. S. 387,486, e ao pedido de patente europeia N.° 03291486.3, "Modified Bordetella Adenylate Cyclase Comprising or Lacking CDllb/CD18 Interaction Domain and Uses thereof"). Consultar também El-Azami-El-Idrissi, et al., 2003, "Interaction of Bordetella pertussis Adenylate Cyclase with CDllb/CD18", J. Biol. Chem., vol. 278, pág. 38 514-21. Há na técnica a necessidade de novos tratamentos antitumorais que permitam uma focalização específica nas células imunitárias e nas respostas das células T. Estas novas estratégias deverão ter por resultado uma amplificação específica das respostas imunitárias contra antigénios tumorais.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção contribui para satisfazer as necessidades da técnica, ao fornecer proteínas CyaA recombinantes que induzem respostas imunitárias. Estas respostas podem dirigir-se a antigénios tumorais. A invenção proporciona novos métodos para o tratamento do cancro e uma composição imunogénica definida nas reivindicações. 4 0 pedido fornece uma composição imunogénica contendo uma proteína recombinante, sendo que essa proteína recombinante contém uma adenilato ciclase (CyaA) da Bordetella e um péptido que corresponde a uma antigénio tumoral. 0 pedido revela um método destinado ao tratamento de um doente com cancro, englobando (1) a administração de uma composição imunogénica ao doente, sendo que essa composição imunogénica contém uma proteína recombinante, indo esta proteína recombinante conter uma CyaA da Bordetella ou um respectivo fragmento específico, e um péptido que corresponde a um antigénio tumoral, e (2) a indução de uma resposta imunitária, como uma resposta das células T, no doente. 0 pedido descreve um método para o tratamento de um doente com cancro, contemplando (1) a administração de uma composição imunogénica ao doente, em que a composição imunogénica contém um vector que expressa uma proteína recombinante, indo essa proteína recombinante conter a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento específico, e um péptido que corresponde a uma antigénio tumoral, e (2) a indução de uma resposta das células T no doente. A resposta das células T é uma resposta dos CTL ou uma resposta das células T auxiliares ou uma reposta dos CTL e das células T auxiliares.
Em conformidade com a invenção, o tumor é um melanoma.
Em conformidade com a invenção, o antigénio tumoral é um epítopo HLA*0201. 5
No âmbito da invenção está contemplada a proteína recombinante CyaA-E5-Tyr.
Noutra execução da invenção, a proteína recombinante contém mais do que um antigénio tumoral. Numa execução particular, pelo menos um antigénio tumoral é diferente do(s) outro(s). 0 antigénio tumoral está localizado em qualquer local permissivo da CyaA.
Numa execução da invenção, a CyaA é da Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella bronchiseptica. Numa execução preferida, a CyaA é da Bordetella pertussis. A invenção também fornece uma composição imunogénica contendo uma proteína recombinante, sendo que a proteína recombinante contém pelo menos um fragmento específico da proteína adenilato ciclase, que é reconhecido como um ligando nas células humanas e animais, e pelo menos um epítopo definido nas reivindicações. Na proteína recombinante da composição imunogénica, a CyaA e o antigénio tumoral poderão estar geneticamente fundidos ou ligados de forma química (WO 02/22169). A invenção também fornece uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão, que contém a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento específico, e um péptido que corresponde a um antigénio que contém o epítopo Tyr como definido nas reivindicações. Numa execução particular, a referida sequência está incluída no plasmídeo depositado no C. N. C. M., Paris, França, em 31 de Maio de 2001, com o número de registo 1-2679. 6
Outra execução da invenção consiste num vector que expressa uma proteína recombinante que inclui a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento específico, e um péptido que corresponde a um antigénio que contém o epítopo Tyr definido nas reivindicações. Numa execução particular, o referido vector foi depositado no C. N. C. M., Paris, França, em 31 de Maio de 2001, com o número de registo I-2679. A invenção contempla ainda uma célula hospedeira que expressa uma proteína recombinante que inclui a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento específico, e um péptido que corresponde a um antigénio contendo o epítopo Tyr definido nas reivindicações. Numa execução particular, a célula hospedeira expressa o vector depositado no C. N. C. M., Paris, França, em 31 de Maio de 2001, com o número de registo 1-2679.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Descreve-se a presente invenção com referência às figuras, em que: A Figura 1 mostra a indução in vivo de respostas de CTL pela CyaA recombinante tendo epítopos de melanoma HLA*0201-restritos. Ratos HHD receberam injecções i. p. nos dias 0, 21 e 42 de 50 pg de toxina de CyaA de controlo (·,ο) ou toxinas de CyaA recombinantes tendo epítopos de melanoma (1, □) (A, CyaA-Tyr; B, CyaA-GnT-V), na presença de 1 mg de alúmen. Sete dias após a última injecção, estimulou-se as células do baço de ratos imunes in vitro com o péptido de priming pTyr (A) ou pGnT-V (B), na presença de células do 7 baço singénicas irradiadas. Mediu-se a actividade citotóxica destas células efectoras em células-alvos RMA-S-HHD marcadas com 51Cr pulsadas com o respectivo péptido (·, ) ou incubadas unicamente com o meio (o, □) . Os dados representam médias de duplicados (SD < 10%). Os quadrantes representam o número de ratos positivos versus o número de ratos testados, e as curvas representam médias t SD de ratos respondedores por grupo de três experiências. A Figura 2 mostra a indução de respostas de CTL especificas de melanoma pela CyaA recombinante tendo epitopos de melanoma, com o uso de diferentes vias de imunização. Os painéis A e B: imunizou-se i. p. ratos HHD duas vezes nos dias 0 e 21 com 50 pg de CyaA de tipo selvagem (·,ο) ou CyaA-Tyr recombinante (, □), na presença (A) ou na ausência de 1 mg de alúmen (B). Os painéis C e E: imunizou-se ratos HHD com uma injecção i. v. com 50 pg de CyaA de tipo selvagem de controlo (·, O) ou CyaA-Tyr recombinante (, □) (C) ou CyaA-GnT-V recombinante (, □) (E) na ausência de adjuvante. Os painéis D e F: imunizou-se ratos
HHD com uma injecção i. v. com 50 pg de CyaA-E5 destoxifiçada de controlo (·, o) ou CyaA-E5-Tyr recombinante destoxifiçada (, □) (D) ou CyaA-E5-GnTV recombinante (, □) (F) na ausência de adjuvante. Sete dias após a última injecção, estimulou-se as células do baço de ratos imunes in vítro com péptidos de priming, na presença de células de baço singénicas irradiadas. Mediu-se a actividade citotóxica em células-alvos RMA-S-HHD marcadas com 51Cr, pulsadas com o péptido de priming (·, ) ou incubadas unicamente com o meio (o, □) . Os resultados mostram os dados cumulativos de 2 - 4 experiências. Os quadrantes representam o número de ratos positivos versus o 8 número de ratos testados, e as curvas representam médias ± SD dos ratos respondedores por grupo. Os resultados obtidos após imunização com CyaA tóxica e destoxifiçada não são estatisticamente diferentes realizando um teste t. A Figura 3 demonstra que a imunização dos ratos com CyaA-Tyr induz uma actividade de CTL de memória especifica de longa duração. Imunizou-se os ratos HHD i. p. duas vezes nos dias 0 e 21 com 50 pg de CyaA de tipo selvagem (·, o) ou CyaA-Tyr recombinante (, □), na presença de 1 mg de alúmen. Três meses (A) ou cinco meses (B) após a última injecção, removeu-se os baços e mediu-se a actividade de CTL especifica após a estimulação in vítro como descrito na Figura 1 em células-alvos RMA-S-HHD marcadas com 51Cr, pulsadas com o péptido pTyr (·, ) ou incubadas unicamente com o meio (O, □) . Os quadrantes representam o número de ratos positivos versus o número de ratos testados. As curvas representam médias ± SD dos ratos respondedores por grupo de uma experiência. A Figura 4 mostra a estimulação de clones de CTL específicos humanos por células dendriticas (DC) humanas incubadas com CyaA-E5-GnT-V ou CyaA-E5-Tyr recombinante. Devido à citotoxicidade da CyaA, apenas se testou as CyaA recombinantes destoxifiçadas in vítro. Incubou-se HLA*0201+ DC imaturas derivadas de monócitos humanos com CyaA-E5 (o), CyaA-E5-Tyr recombinante (·) (A), CyaA-E5-GnT-V (·) (B) ou com o péptido antigénico relevante (A), e foram empregues como APC (células que apresentam antigénios) para estimular o clone de CTL anti-tirosinase IVS-B (A) ou o clone de CTL anti-GnT-V CMU 579 6/3 (B) . Avaliou-se a secreção do lFN-γ pelos clones de CTL recorrendo a ELISA. 9
Expressa-se os resultados na forma de concentração média do IFN-γ libertado nos sobrenadantes dos poços em duplicado, e os mesmos são representativos de três experiências independentes. Indica-se os erros padrão da média.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS EXECUÇÕES PREFERIDAS
Desenvolveu-se recentemente uma nova abordagem da activação de CTL com base em toxinas bacterianas, capazes de fornecer epitopos antigénicos através da membrana celular plasmática para o interior do citosol, onde pode ocorrer o processamento e a interacção apropriados com as moléculas do MHC de classe I. A toxina de adenilato ciclase (CyaA) da Bordetella pertussis (Glasser, P., et al. 1988 "Bordetella pertussis adenylate cyclase: the gene and the protein", Tokai J. Exp. Clin. Med.r 13 Sup.: 239) tem a capacidade de fornecer o respectivo domínio catalítico no interior do citosol das células eucarióticas (12). 0 fornecimento de um epitopo das células T CD8+, inserido no dominio catalítico da CyaA, resulta num processamento e numa apresentação intracelulares do epitopo pelas moléculas do MHC de classe I na superfície das células que apresentam o antigénio (13). Além disso, a CyaA liga-se especificamente à integrina αΜβ2 (CDllb/CD18) (14) e, com isso, fica dirigida à subpopulação de CDllb+ DC, que induz de forma muito eficiente as respostas imunitárias primárias (15). Por conseguinte, a imunização dos ratos com uma toxina de CyaA recombinante tendo um epitopo virai leva à indução de fortes respostas de CTL e a uma protecção total contra um confronto virai letal (16).
Além disso, as toxinas de CyaA que têm um único epitopo de CTL também podem estimular uma imunidade antitumoral 10 protectora e terapêutica eficiente nos ratos (17). É importante o facto de os toxóides de CyaA geneticamente destoxifiçados reterem a propriedade de induzir uma imunidade protectora antiviral ou antitumoral (17, 18). Por conseguinte, a CyaA parece ser um vector não-replicativo eficiente e seguro para induzir respostas imunitárias especificas nos ratos. No entanto, tendo em vista elaborar uma imunoterapia oncológica com a CyaA, é particularmente importante demonstrar que os epitopos tumorais humanos inseridos na CyaA são processados e apresentados de forma eficiente em associação com as moléculas do MHC humano.
Numa execução da invenção, produziu-se uma CyaA recombinante tendo o epitopo de melanoma HLA*0201-restrito derivado da tirosinase como definido nas reivindicações. A potência desta CyaA recombinante em induzir in vivo respostas de CTL HLA*0201-restritas contra os epitopos inseridos, e a sua capacidade de fornecer estes epitopos a células apresentando antigénios humanas encontram-se demonstradas nos exemplos em baixo.
Descobriu-se que a CyaA da Bordetella pertussis é capaz de fornecer epitopos das células T CD8+ no interior do citosol de CDllb+ células dendriticas a seguir à sua interacção especifica com a integrina αΜβ2 (CDllb/CDl8). Este fornecimento tem por resultado o processamento e a apresentação intracelulares pelas moléculas do MHC de classe I dos epitopos das células T CD8+ inseridos na CyaA. De facto, as toxinas de CyaA que têm um único epitopo de CTL podem induzir uma imunidade antitumoral protectora e terapêutica eficiente nos ratos. 11
Descobriu-se ainda que estas proteínas de CyaA recombinantes induzem fortes respostas de CTL anti-melanoma nos ratos HLA*0201-transgénicos, mesmo após uma única imunização intravenosa sem adjuvante. As respostas são de longa duração, sendo detectadas até cinco meses após a última injecção.
Por fim, descobriu-se que as células dendríticas humanas, tratadas com a CyaA recombinante, processam e apresentam de forma eficiente epítopos de melanoma para clones de CTL humanos. As proteínas CyaA recombinantes da invenção demonstram que os epítopos tumorais inseridos na CyaA são processados e apresentados de forma eficiente em ligação com as moléculas do MHC humanas. Por conseguinte, a CyaA é capaz de activar CTL antitumorais nos humanos e é um novo factor para a imunoterapia oncológica.
Como empregue no presente documento, o termo "composição imunogénica" é relativo a uma composição que leva a uma resposta imunológica e que está associada a tratamentos terapêuticos, como é o caso dos tratamentos contra o cancro.
Como empregue no presente documento, o termo "CyaA da Bordetella" ou "adenilato ciclase da Bordetella" engloba a CyaA ou um respectivo fragmento, seja modificada(o) ou não. A modificação poderá incluir a delecção de alguns aminoácidos internos. Por exemplo, a CyaA poderá não ter actividade catalítica, mas não ficam afectados a ligação específica ao receptor de CDllb/CDl8 e o processo de translocação do domínio catalítico. 0 termo "Bordetella" refere-se à proteína adenilato ciclase de um agente patogénico das espécies Bordetella. 0 referido agente 12 patogénico poderá ser Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella bronchiseptica.
Como empregue no presente documento, o termo "antigénio" ou "epítopo" refere-se a um péptido que inclui uma proteína capaz de induzir uma resposta imunitária. 0 termo "heterólogo" refere-se à natureza do antigénio ligado à proteína CyaA, que induz uma resposta imunitária diferente da proteína CyaA. Um antigénio ou epítopo heterólogo pode estar fundido na CyaA ou pode estar ligado de forma química à CyaA, por exemplo.
Como empregue no presente documento, o termo "imunogénico" refere-se a uma característica de a proteína ser capaz de activar uma resposta imunitária num mamífero, em particular no ser humano. 0 termo "resposta imunitária" refere-se a muitos efeitos provocados por células do sistema imunitário, como, por exemplo, uma resposta dos CTL e/ou uma resposta das células auxiliares T, e engloba, no contexto da invenção, sem ficar a ela limitado, a activação de linfócitos citotóxicos específicos de tumores. Como empregue no presente documento, o termo "imunoterapia" refere-se a uma terapia direccionada a uma doença com base numa resposta imunitária.
Além da proteína ou do vector recombinante da invenção, a composição imunogénica da invenção poderá conter adjuvantes e excipientes, para permitir um aumento e uma modulação da resposta imunitária. Estes adjuvantes são de natureza diversa. Podem, por exemplo, incluir lipossomas, fases oleicas, por exemplo, os adjuvantes do tipo de Freund, que são geralmente empregues na forma de uma emulsão com uma fase aquosa ou, mais comumente, podem conter sais 13 inorgânicos insolúveis na água. Estes sais inorgânicos podem conter, por exemplo, hidróxido de alumínio, sulfato de zinco, hidróxido de ferro coloidal, fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio. 0 hidróxido de alumínio (A1(0H)3) é o adjuvante empregue mais comum. A invenção também contempla as proteínas recombinantes que contêm a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento específico, e o péptido pTyr (YMDGTMSQV). 0 referido péptido poderá conter sequências flanqueadoras ampliadas. 0 péptido pTyr corresponde ao epítopo HLA*0201-restrito de melanoma da região 369 - 377 da tirosinase. Ter em atenção que os aminoácidos 369 - 377 da tirosinase humana são YMNGTMSQV. No entanto, o resíduo Asn na posição 371 (N) da tirosinase é naturalmente desaminado para Asp (D) deste epítopo na célula viva, pelo que o verdadeiro epítopo reconhecido pelos clones de CTL in vivo é a sequência de reconhecimento YMDGTMSQV.
Além disso, um epítopo com uma sequência flanqueadora ampliada do aminoácido 360 - 385 da tirosinase humana é SSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPI (em que ο N371 passou a D).
Numa execução preferida da invenção, a proteína recombinante é CyaA-Tyr. O termo "CyaA-Tyr" significa uma proteína de fusão que contém o epítopo de melanoma da tirosinase do hla*0201, que pode ser preparada como descrito no Exemplo 1, e a CyaA da Bordetella pertussis. O termo "CyaA-E5-Tyr" refere-se à proteína CyaA-Tyr na qual se desactivou geneticamente a actividade catalítica da CyaA. Ver, por exemplo, o Exemplo 1. 14
Ainda noutra execução da invenção, a proteína recombinante entre CyaA e pTyr está modificada em relação à estrutura de CyaA-Tyr ou CyaA-E5-Tyr. A modificação destas execuções poderá contemplar a adição de regiões flanqueadoras, que são sequências de aminoácidos que rodeiam os péptidos contendo a proteína recombinante e que foram acima descritas. Estas sequências flanqueadoras podem aumentar o processamento. As sequências flanqueadoras também podem ser sequências que não rodeiem naturalmente o antigénio mas que aumentem de forma específica o processamento de antigénios por células de prevenção de antigénios.
Ainda noutra execução, é possível modificar as proteínas recombinantes ao incluir múltiplos epítopos heterólogos idênticos. Por exemplo, o epítopo Tyr, como acima descrito, ou outros epítopos de melanoma.
Noutras execuções da invenção, a proteína recombinante poderá incluir pelo menos um fragmento específico da proteína adenilato ciclase, tais como, sem ficarem a eles limitados, CyaA a região 373 - 1 706 ou a região 1 166 - 1 281, que são reconhecidos como um ligando nas células humanas e animais, como as células dendríticas, e pelo menos um epítopo específico para um antigénio cancerígeno, como, sem ficar a ele limitado, o pTyr.
Noutra execução da invenção, a proteína recombinante pode incluir múltiplos epítopos de ou mais antigénios tumorais.
Outra execução da invenção inclui locais permissivos da CyaA que são diferentes dos fornecidos nos exemplos. A porção de antigénio da proteína recombinante empregue nos testes da invenção pode estar localizada em qualquer local 15 permissivo da proteína adenilato ciclase CyaA WO 93/21324. Além disso, a invenção contempla testes e composições imunogénicas que utilizem apenas fragmentos da adenilato ciclase CyaA na proteína recombinante (consultar o epo 03/291486.3).
Como empregue no presente documento, o termo "local permissivo" é relativo a um local onde é possível inserir o péptido heterólogo, sem afectar de forma substancial as propriedades funcionais pretendidas para a toxina de adenilato ciclase, ou seja, sem afectar os domínios necessários à ligação específica ao receptor de CDllb/CDl8 e, de forma vantajosa, sem afectar o processo de translocação do domínio catalítico.
Os locais permissivos da adenilato ciclase da Bordetella pertussis incluem, sem ficarem a eles limitados, os resíduos 137 - 138 (Val-Ala), os resíduos 224 - 225 (Arg-Ala), os resíduos 228 - 229 (Glu-Ala), os resíduos 235 -236 (Arg-Glu) e os resíduos 317 - 318 (Ser-Ala) (ver Sebo et al., 1985). Os seguintes locais permissivos adicionais também se encontram incluídos em execuções da invenção: os resíduos 107 - 108 (Gly-His), os resíduos 132 - 133 (Met-Ala), os resíduos 232 - 233 (Gly-Leu) e 335 - 336 (Gly-Gln) e 336 - 337. (ver em geral Glaser et al., 1988 "Bordetella pertussis adenylate cyclase: the gene and the protein", Tokai J. Exp. Clin. Med., 13 Supl.: 239-52.)
Como empregue no presente documento, o termo "região específica da proteína adenilato ciclase " ou "fragmento da adenilato ciclase CyaA" é relativo a um fragmento da referida proteína, inclusive a proteína em que alguns aminoácidos, que não estão nas partes tumorais da proteína, 16 foram delectados, e em que as propriedades funcionais pretendidas para a toxina de adenilato ciclase não foram substancialmente afectadas, ou seja, não foram afectados os domínios necessários à ligação específica ao receptor de CDllb/CDl8 e o processo de translocação do domínio catalítico. 0 termo "antigénio tumoral" ou "antigénio cancerígeno" refere-se a qualquer substância de um tumor que despolete uma resposta imunitária e reaja de forma específica com os anticorpos ou com as células T. A referida substância poderá ser de qualquer origem, quer espontânea quer de um vírus, transformando as células para que estas formem um tumor. Os exemplos dos vírus deste tipo são HHV8, HCV e HBV. 0 antigénio ou o epítopo tem de estar presente na superfície da célula tumoral.
Como empregue no presente documento, o termo "um péptido que corresponde a um antigénio " contempla um antigénio, um epítopo ou um antigénio ou um epítopo flanqueados por regiões flanqueadoras que ocorrem naturalmente ou não, as quais amplificam de forma específica o processamento de antigénios pelas células que apresentam antigénios. 0 termo "epítopo" refere-se à mínima sequência peptídica de um antigénio que é capaz de induzir uma resposta imunitária. 0 termo "péptido" refere-se a uma série de aminoácidos ligados por ligações amida, contendo pelo menos 3 aminoácidos e, preferencialmente, pelo menos 6 aminoácidos. 17 É possível empregar a composição imunogénica da invenção em solução, por exemplo mas sem limitação, em PBS ou com adjuvantes, por exemplo mas sem limitação, alúmen. É possível ministrar a composição imunogénica por via intramuscular, subcutânea, intravenosa ou intradérmica. É possível ministrar a composição imunogénica em quantidades de 0,5 - 10 mg, de preferência de 1 - 5 mg, de 1,5 - 3 mg ou, com maior preferência, de 1,50 mg. Os efeitos destes tratamentos podem ser monitorizados ao testar os níveis de IFN-γ por meio de ensaios de activação de CTL, ELISPOT ou ELISA, ou com outros imunoensaios apropriados.
Existem publicações que ilustram a utilização da adenilato ciclase recombinante da Bordetella sp. no diagnóstico e na imunomonitorização, ou seja, Vordermeier H. Martin et al (Infection and Immunity, Novembro de 2004, pág. 6 255 - 2 261) e Schlecht G, et al (The Journal of Immunology 2004, pág. 6 089 - 6 097). A adenilato ciclase da Bordetella Sp. representa um novo sistema de fornecimento capaz de estimular de forma específica os linfócitos T CD8+, levando à imunidade protectora antiviral e antitumoral nos ratos (16, 17) . A CyaA é um vector não-replicativo potente para induzir imunidade adaptativa e pode ser empregue em vacinas. A demonstração, de acordo com a invenção, de que os epítopos inseridos podem ser processados e apresentados em ligação com as moléculas do MHC humanas é um pré-requisito indispensável para a utilização deste vector nos humanos.
Ao utilizar CyaA recombinante na qual estejam presentes epítopos de melanoma humanos que expressem a molécula HLA*0201 de classe 1 humana, será possível induzir 18 respostas de CTL específicas de melanoma fortes e de longa duração em ratos HLA transgénicos. Obteve-se resultados semelhantes com a CyaA destoxifiçada recombinante desprovida de actividade de adenilato ciclase. A CyaA representa um vector eficiente na indução de respostas de CTL específicas in vivo, visto que mais de 80% dos ratos HHD imunizados responderam ao epítopo de tirosinase inserido na CyaA, a seguir a uma injecção i. v. sem adjuvante, enquanto apenas 26% dos ratos HHD reagem a este epítopo a seguir a uma injecção de 100 pg do péptido na presença de IFA (parcialmente em 26). Além disso, observou-se de forma surpreendente, de acordo com a presente invenção, que as DC humanas processavam de forma eficiente estas moléculas recombinantes para a apresentação de péptido antigénico para CTL humanos. De forma impressionante, a CyaA-Tyr recombinante era muito mais eficiente do que o péptido sintético no fornecimento do epítopo de tirosinase às DC.
Em alternativa, os sistemas de fornecimento de antigénios com base em vírus recombinantes usualmente resultam numa eficiência de apresentação in vitro inferior ao péptido sintético. Os resultados surpreendentes de experiências in vivo e in vitro de acordo com a invenção salientam a capacidade da CyaA como sistema de fornecimento, e mostram que é possível obter respostas de CTL nos humanos após imunização com CyaA recombinante e, assim, que se pode conseguir uma imunoterapia eficiente com este vector. No entanto, os níveis de imunogenicidade das duas CyaA recombinantes testadas neste estudo eram bastante diferentes. De facto, induziu-se fortes repostas de CTL nos ratos HHD com apenas uma injecção i. p. da CyaA-Tyr na ausência de adjuvante, enquanto foram necessárias três 19 injecções i. p. da CyaA-GnT-V, na presença de alúmen, para gerar repostas de CTL específicas. A fraca eficiência da CyaA-GnT-V em fornecer o epítopo de melanoma GnT-V também foi evidenciada in vitro, dado que DC humanas incubadas com este vector estimularam de forma muito fraca um clone de CTL anti-GnT-V em comparação com a CyaA-Tyr, que estimulou de forma eficiente um clone de CTL anti-tirosinase específico.
Esta diferença pode ser explicada pelo facto de o péptido GnT-V enxertado na CyaA-GnT-V ser pobremente processado em comparação com o péptido de tirosinase inserido na CyaA-Tyr. De facto, sabe-se que as regiões flanqueadoras de um determinado epítopo influenciam a produção proteolítica do péptido maduro (27 - 29) e isto em particular no caso de epítopos subdominantes e/ou crípticos (30). Por isso, prevê-se que uma modificação do contexto molecular do epítopo GnT-V na CyaA consiga aumentar a eficiência de processamento deste epítopo pelas APC. Pelo contrário, a sequência que flanqueia o epitopo de tirosinase na CyaA-Tyr parece permitir o seu processamento eficiente.
Além disso, a CyaA-Tyr é muito eficiente na activação da célula T CD8+ HLA*0201-restrita in vivo, pois uma única imunização intravenosa ou duas injecções i. p. sem adjuvante foi ou foram suficientes para gerar fortes respostas de CTL específicas, isto explica-se pelo facto de a CyaA se dirigir de forma especifica às CDllb+ DC, as APC mais potentes na indução da resposta primária, em resultado da sua interacção com a integrina αΜβ2 expressa por estas células (14). Assim, a CyaA tem a propriedade excepcional de fornecer de forma especifica antigénios à via de 20 apresentação de classe I de Ag citosólica das APC profissionais.
Também são possíveis outros aperfeiçoamentos à estratégia recombinante da CyaA. Primeiro, já se conseguiu com êxito múltiplas inserções de epítopos de células T CD8+ na mesma molécula recombinante. De facto, a imunização de ratos com a CyaA recombinante tendo três epítopos diferentes, inclusive um epítopo LCMV, leva à indução de respostas de CTL específicas para cada um dos três epítopos, assim como à protecção contra um confronte de LCMV letal (31). A CyaA destoxifiçada tendo múltiplos epítopos de melanoma constitui uma boa alternativa para induzir repostas de CTL multiespecíficas. Além disso, também é possível a inserção adicional de péptidos epitópicos de células T CD4+. Embora o envolvimento das células T CD8+ na erradicação de tumores estabelecidos tenha sido claramente demonstrado (32), também poderão ser necessárias células auxiliares T para induzir repostas antitumorais eficientes (33 - 35) . A CyaA recombinante também pode fornecer epítopos na via de processamento do MHC de classe II (36) e é capaz de induzir, in vivo, tanto respostas das Thl como dos CTL específicas (37). Esta característica reveste-se de enorme interesse no âmbito de estratégias de vacinação, nas quais seja necessário induzir ambos os tipos de repostas das células T, em particular no contexto da imunoterapia oncológica. O plasmídeo pTRACE5-GnTV é um derivado do vector de expressão pTRACG, que expressa os genes cyaC e cyaA da Bordetella pertussis sob o controlo do promotor Pr do fago A (o pTRCAG também contém um marcador seleccionável de resistência à ampicilina e o repressor A termossensível 21
Cl857 ) . No pTRACE5-GnTV, o gene cyaA está modificado pela inserção de um dipéptido Leu-Gln entre os códões 188 e 189 da CyaA de tipo selvagem (resultando na desactivação da actividade de adenilato ciclase) e pela inserção de uma sequência de ADN que codifica a sequência peptidica que se segue PASVLPDVFIRCGT, inserida entre os códões 224 e 240 da CyaA. O péptido sublinhado (YLPDVFIRC) corresponde ao epitopo de melanoma HLA-A2-restrito NA17-A, derivado do gene da N-acetilglucosaminil-transferase V. (G. Dadaglio, et al. (2003) "Recombinant adenylate cyclase of Bordetella pertussis induces CTL responses against HLA-A2-restricted melanoma epitope". Int. Immuno.) O plasmideo XLl/pTRACE5-GnTV foi depositado no C. N. C. M. no dia 16 de Outubro de 2003, com o número de registo 1-3111. O plasmideo pTRACE-5-Tyros369 é um derivado do vector de expressão pTRACG que expressa os genes cyaC e cyaA da Bordetella pertussis, sob o controlo do promotor Pr do fago λ (o pTRCAG também contém um marcador seleccionável de resistência à ampicilina e o repressor λ termossensivel Cl857 ) . No pTRACE5-Tyros369, o gene cyaA está modificado pela inserção de um dipéptido Leu-Gin entre os códões 188 e 189 da CyaA de tipo selvagem (o que resulta na desactivação da actividade de adenilato ciclase) e pela inserção de uma sequência de ADN que codifica a seguinte sequência peptidica PASYMDGTMSQVGTRARLK, inserida entre os códões 224 e 240 da CyaA. O péptido sublinhado (YMDGTMSQV) corresponde à sequência de aminoácidos 369 - 377 da tirosinase. O plasmideo XLl/pTRACE5-Tyros369 foi depositado no C. N. C. M. em 31 de Maio de 2001, como número de registo 1-2679.
Emprega-se as seguintes abreviaturas: CTL: linfócitos T citotóxicos; DC: células dendríticas; PBMC: células 22 mononucleares sanguíneas periféricas; CyaA: adenilato ciclase da Bordetella sp; Tyr: tirosinase; GnT-V: N-acetilglucosaminil-transferase V; GM-CSF: factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos; ifn: interferão; i. p.: intraperitoneal; i. v.: intravenosa.
Descrever-se-á a presente invenção em maior detalhe nos exemplos que se seguem. EXEMPLO 1
Materiais e métodos
Ratos. Os ratos HHD são ratos de duplo knock out H-2D_/~ β2πΓ/_ que expressam o transgene HHD, contendo os domínios αΐ (H) e α2 (H) do HLA*0201 ligados a transmembrana a3 e domínios citoplásmicos de H-2Db (D), com o domínio al ligado à p2-microglobulina humana. Assim, a única molécula do MHC de classe I expressa pelos ratos HHD é a molécula HLA*0201 modificada (19) . Os ratos HHD nasceram e viveram em instalações destinadas a animais do Institut Pasteur.
Péptidos. Os péptidos sintéticos pTyr (YMDGTMSQV), correspondendo ao epítopo HLA*0201-restrito de melanoma da região 369 - 377 da tirosinase (20, 21), e pGnT-V (VLPDVFIRC), que corresponde ao epítopo HLA*0201-restrito NA17-A derivado de um intrão do gene da N- acetilglucosaminil-transferase V (3), foram comprados à Neosystem (Estrasburgo, França).
Construção de toxinas e toxóides de adenilato ciclase da
Bordetella pertussis recombinantes tendo epítopos de melanoma. A toxina CyaA recombinante, a CyaA-Tyr, tem uma 23 sequência polipeptídica com um comprimento de 14 aminoácidos (PASYMDGTMSQVGT, código de uma letra para aminoácido) geneticamente inserida entre os resíduos 224 e 225 da CyaA. Esta sequência contém uma única cópia do epítopo de melanoma HLA*0201-restrito derivado da tirosinase (aminoácido 369 - 377, a sequência acima sublinhada). A toxina de CyaA recombinante CyaA-GnT-V tem uma inserção com um comprimento de 14 aminoácidos (PASVLPDVFIRCGT) na mesma posição e contém uma única cópia do epítopo de melanoma HLA*0201-restrito NA17-A derivado do gene da N-acetilglucosaminil-transferase V (a sequência sublinhada anterior).
Produziu-se estas toxinas recombinantes na estirpe BLR da E. coli (Novagen), recorrendo a vectores de expressão que são derivados do plasmídeo pTRACG (22), modificado pela inserção entre os locais de restrição Nhe I e Kpnl de oligonucleótidos de cadeia dupla sintéticos apropriados, que codificam as sequências polipeptídicas indicadas. Empregou-se a estirpe XLl-Blue da E. coli (Stratagene) em todas as manipulações de ADN realizadas de acordo com protocolos padrão. Purificou-se as proteínas recombinantes com vista à homogeneidade dos corpos de inclusão, por meio de um procedimento em duas etapas, que inclui cromatografias em DEAE-Sepharose e fenil-Sepharose, como previamente descrito (23) .
As toxinas recombinantes CyaA-Tyr e CyaA-GnT-V são enzimaticamente activas e logo citotóxicas. Os toxóides recombinantes CyaA-E5-Tyr e CyaA-E5-GnT-V são enzimaticamente inactivos, as variantes destoxifiçadas de CyaA-Tyr e CyaA-GnT-V respectivamente. São incapazes de sintetizar cAMP em resultado de uma inserção dipeptídica 24 numa região crítica do local catalítico (23). Os toxóides CyaA-E5-Tyr e CyaA-E5-GnT-V foram produzidos em E. coli, por meio dos vectores de expressão que são derivados do plasmídeo pTRACES: obteve-se este plasmídeo por inserção do hexanucleótido CTGCAG num local EcoEV localizado no par 5' da sequência de ADN do cyaA. Isto tem por resultado uma inserção in-frame do dipéptido Leu-Gln entre os Aspl88 e Ilel89 da CyaA (23). Os mesmos oligonucleótidos de cadeia dupla sintéticos acima descritos foram inseridos entre os locais NheI e Kpnl do pTRACEã para criar os plasmídeos pTRAC-E5-Tyr e pTRAC-E5-GnT-V. Purificou-se os toxóides recombinantes CyaA-E5-Tyr e CyaA-E5-GnT-V com vista a uma homogeneidade, como descrito (23).
Todas as toxinas e todos os toxóides recombinantes apresentavam uma pureza superior a 90%, como observado por análise em SDS-gel. Determinou-se as concentrações de toxinas por espectrofotometria a partir da absorção nos 280 nm, recorrendo a um coeficiente de extinção molecular de 142 000 M-l cuT1. A síntese de oligonucleótidos e o sequenciamento de ADN foram realizados pela Genaxis (França). As culturas nos fermentadores foram realizadas pelo "Service des Fermentations" do Institut Pasteur.
Imunização dos ratos. Imunizou-se ratos fêmeas HHD com seis a dez semanas com duas ou três injecções i. p., em intervalos de 21 dias, de 50 pg de CyaA ou de CyaA recombinante tendo os epítopos de melanoma, na presença ou na ausência de 1 mg de alúmen. Em algumas experiências, imunizou-se os ratos com uma injecção i. v. de 50 pg da CyaA recombinante em PBS. Empregou-se CyaA-E5 recombinantes 25 destoxifiçados sob as mesmas condições. Removeu-se cirurgicamente os baços sete dias após a última injecção, à excepção da análise de respostas de longa duração, situação em que se removeu os baços três a cinco meses após a última injecção.
Ensaio citotóxico in vitro. Estimulou-se as células do baço de ratos imunizados in vitro com 10 pg/mL do péptido pTyr ou pGnT-V, correspondendo ao epitopo de priming na presença de células de baço naive irradiadas singénicas em meio completo (meio RPMI 1640 contendo o dipéptido L-alanil-L-glutemina complementado com soro fetal de vitelo a 10%, 2-mercaptoetanol 5 x 10“5 M, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL, de estreptomicina e Hepes 20 mM) durante cinco dias. Testou-se a actividade citotóxica destas células efectoras num ensaio de libertação de 51Cr de 4 h em células TAP~/_ RMA-S HHD-transfectadas (RMA-S-HHD) carregadas com os péptidos relevantes como células-alvos. Realizou-se a marcação com 51Cr como se segue: um dia antes do teste citotóxico, incubou-se células RMA-S-HHD durante a noite à temperatura ambiente em meio RPMI 1640 equilibrado com CO2 a 7%, complementado com Hepes 20 mM. Em seguida, incubou-se as células durante 3 h à temperatura ambiente com ou sem 20 pg/mL do péptido relevante, lavou-se uma vez e radiotitulou-se com 100 pCi de 51Cr durante 1 h nos 37°C.
Empregou-se várias relações de efectores para alvo e realizou-se todos os ensaios em duplicado. Mediu-se a radioactividade libertada no sobrenadante de cada poço. Calculou-se a percentagem de lise especifica como 100 x (libertação experimental - libertação espontânea)/ (libertação máxima - libertação espontânea) . Gerou-se a libertação máxima ao adicionar triton X-100 a 10% às 26 células-alvos e obteve-se a libertação espontânea tendo as células-alvos incubadas unicamente em meio. Considera-se que o ratos são respondedores quando se tenha observado pelo menos 20% de lise específica na relação de E/T (efectores/alvo) mais elevada. Os resultados são expressos como médias ± SD de ratos respondedores por grupo. Não se obteve actividade de CTL específica com os esplenócitos de ratos imunizados estimulados in vitro com péptidos irrelevantes. Células dendrlticas humanas. As células dendríticas humanas derivaram de monócitos aderentes como se segue: isolou-se células mononucleares sanguíneas periféricas de camadas leucocitárias obtidas do doente com HLA*0201-hemocromatose LB2050, por centrifugação em tubos Leucosep (Greiner, Frickenhausen, Alemanha), previamente centrifugados durante 30 s nas 2 200 rpm com 15 mL de Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega). Centrifugou-se estes tubos nas 2 200 rpm durante 20 min à temperatura ambiente e a parte de cima contendo plasma foi descartada. A fase intermédia contendo as PBMC foi colhida e lavada pelo menos três vezes em tampão fosfato frio com EDTA 1 mM, de modo a eliminar as plaquetas restantes. Deixou-se depois as PBMC aderir durante 1 h em caixas de cultura com uma densidade de 2 x 106 células/cm2 em RPMI 1640 complementado com aminoácidos (L-arginina 116 pg/mL, L-asparagina 36 pg/mL, L-glutamina 216 pg/mL), antibióticos e soro de vitelo fetal a 10% (seguidamente referido meio de cultura) . Descartou-se as células não aderentes, lavou-se as células aderentes duas vezes cuidadosamente com 20 mL de meio e incubou-se em meio de cultura com 200 U/mL de IL-4 humana e 70 ng/mL de GM-CSF humano. No dia dois e no dia quatro, removeu-se 5 mL do meio e adicionou-se 10 mL contendo 700 ng do GM-CSF. Também 27 se complementou com 200 U/mL da IL-4 até se atingir o volume total da caixa de cultura. Empregou-se as células entre o dia cinco e o dia sete.
Clones de CTL humanos. O clone de CTL IVS-B dirigido contra o epitopo da Tyr HLA*0201-restrito (posições 369 - 377) da tirosinase encontra-se previamente descrito (24) . Estimulou-se semanalmente o clone com 50 U/mL de IL-2 humana, células de melanoma MZ2-MEL HLA*0201-transfectadas irradiadas, pulsadas com 2 pg/mL do péptido pTyr, e células LG2-EBV irradiadas como células alimentadoras (feeder cells) . O clone de CTL CMU 579 6/3 especifico do epitopo HLA*0201-restrito derivado da GnT-V foi obtido do sangue de um dador saudável, seguindo um método recentemente descrito (25). Resumidamente, estimulou-se as PBMC durante duas semanas com o péptido antigénico pGnT-V, as IL-2, IL-4 e IL-7 humanas. No dia 13, corou-se as PBMC com um tetrâmero HLA*0201 dobrado com o péptido pGnT-V. Clonou-se linfócitos tetrâmero-positivos utilizando citometria de fluxo. Estimulou-se os mesmos durante duas semanas com células B transformadas com EBV HLA*0201-positivas alogénicas irradiadas, pulsadas com o péptido, PBL alogénicos irradiados, IL-2, IL-4 e IL-7, e depois foi feita a respectiva manutenção por estimulação semanal com células EBV-B alogénicas irradiadas e células tumorais alogénicas pulsadas com péptido HLA*0201-positivas irradiadas. Manteve-se os dois clones de CTL em meio de iscove complementado com 10% de soro humano, aminoácidos e antibióticos.
Ensaio de estimulação in vitro de clones de CTL humanos. Com vista ao ensaio de estimulação, fez-se a cultura de 10 000 células dendriticas imaturas em microplacas de fundo em 28 U, em 25 pL de meio X-Vivo 10 (Whittaker Bioprodutcs, Walkersville, EUA) . Adicionou-se ao poço 25 pL de preparações de CyaA diluídas em meio X-Vivo 10 com diferentes concentrações. Passados 30 min de incubação, incubou-se os clones de CTL correspondentes com estas células (75 pL de meio X-vivo contendo 104 do clone de CTL anti-tirosinase IVS-B ou 104 do clone de CTL anti-GnT-V CMU 579 6/3) e IL-2 (com uma concentração final de 25 U/mL) . Colheu-se os sobrenadantes passadas 20 h e determinou-se o respectivo teor de IFN-y por meio de ELISA (Biosource International, Camarillo, CA) . De modo a controlar a capacidade de as DC incubadas com os diversos toxóides recombinantes destoxifiçados estimularem os clones de CTL, as mesmas foram carregadas de forma exógena com os péptidos antigénicos relevantes, foram incubadas com os clones de CTL relevantes e avaliou-se de forma semelhante a produção do IFN-γ (dados não mostrados). EXEMPLO 2
Indução de respostas de CTL específicas de melanoma por meio de imunização de ratos transgénicos HHD com CyaA recombinante tendo epitopos de melanoma HLA*0201-restritos
De modo a determinar se a toxina CyaA é capaz de induzir respostas de CTL específicas contra os antigénios tumorais humanos, construiu-se duas CyaA recombinantes tendo epitopos de melanoma humanos HLA*0201-restritos. A primeira CyaA recombinante expressa o epítopo 369 - 377 do antigénio de tirosinase (CyaA-Tyr) e a segunda expressa o epítopo NA17-A derivado de um intrão da N-acetiglucosaminil-transferase V (CyaA-GnT-V). Avaliou-se a capacidade de a CyaA recombinante induzir respostas de CTL contra estes 29 dois epítopos in vivo em ratos HHD, que são transgénicos para a molécula HLA*0201 do MHC humano de classe I e que se demonstrou desenvolverem repostas de CTL HLA*0201-restritas contra péptidos tumorais (26). imunizou-se ratos hhd com 3 injecções i. p. de 50 pg de CyaA recombinante com alúmen. Após estimulação in vitro de esplenócitos com o péptido correspondente, testou-se as respostas de CTL num ensaio de libertação de crómio, recorrendo a células RMA-S-HHD pulsados por péptido como alvos, que expressam o mesmo transgene que os ratos HHD. Como mostrado na Figura 1, ambas as toxinas recombinantes tendo o epitopo Tyr ou GnT-V induzem fortes respostas de CTL contras as células-alvos carregadas com o péptido relevante. Estas respostas de CTL eram especificas de antigénio, dado que apenas foram mortas as células sensibilizadas com o péptido e que não se detectou actividade de CTL nas células-alvos carregadas com péptidos irrelevantes (dados não mostrados). Como previsto, não se observou repostas de CTL significativas nos ratos imunizados com a CyaA de tipo selvagem, mostrando que a indução de respostas de CTL especificas necessitava de priming in vivo pelo epitopo inserido na CyaA recombinante.
Em seguida, analisou-se a indução de respostas de CTL pela CyaA-Tyr, recorrendo a diferentes protocolos de imunização com ou sem alúmen como adjuvante. Como ilustrado nas Figuras 2A e B, foram suficientes duas injecções i. p. de CyaA-Tyr para induzir respostas de CTL específicas contra o epitopo de tirosinase, mesmo na ausência de alúmen. Também se observou a indução de fortes respostas de CTL especificas a seguir a uma única injecção de 50 pg de CyaA-Tyr sem adjuvante pela via i. v. (Figura 2C). Como previsto, apenas se observou estas respostas de CTL no caso de se empregar células-alvos pulsadas com péptido e 30 esplenócitos de ratos imunizados com a CyaA-Tyr recombinante, o que mostra a especificidade das respostas. Estes resultados demonstram a grande eficiência da CyaA-Tyr na indução de respostas de CTL específicas contra o epítopo de melanoma de tirosinase. No entanto, ao empregar condições semelhantes de imunização (2 injecções ou 1 injecção i. p. com ou sem alúmen), não se observou qualquer resposta de CTL específica com a toxina recombinante CyaA-GnT-V, o que indica que esta toxina é menos eficiente na produção de resposta de CTL específica do que a CyaA-Tyr (dados não mostrados). Por via intravenosa, contudo, foi suficiente uma injecção de CyaA-GnT-V para induzir uma forte resposta de CTL (Figura 2E).
Por fim, analisou-se as respostas de CTL induzidas por mutantes geneticamente destoxifiçados da CyaA, tendo epítopos de tirosinase ou de GnTV desprovidos de actividade de adenilato ciclase, a seguir à inserção de um dipéptido no local catalítico. Os ratos HHD, imunizados com estas moléculas destoxifiçadas, desenvolveram respostas de CTL específicas tanto contra os epítopos de tirosinase com contra os epítopos de GnTV (Figuras 2D, 2F), que eram comparáveis às respostas dos ratos imunizados com as formas tóxicas da CyaA tendo o epítopo correspondente. Estes resultados indicam que a indução de CTL HLA*0201-restrita é independente da actividade catalítica, como foi claramente demonstrado no caso de um epítopo virai de LCMV em ratos BALB/C (18). 31 EXEMPLO 3 A CyaA-Tyr recombinante induz respostas de CTL de memória de longa duração
Com vista a analisar a persistência das respostas de CTL induzidas pela CyaA recombinante tendo o epitopo de melanoma, ratos HHD receberam duas injecções i. p. de 50 pg de CyaA-Tyr na presença de alúmen. Três a cinco meses após a última injecção, estimulou-se os esplenócitos de ratos imunizados in vitro durante cinco dias com o péptido pTyr e, em seguida, testou-se a sua actividade citolítica contra células-alvos RMA-S-HHD pulsados com péptido. Como mostrado na Figura 3, a CyaA-Tyr induziu uma resposta de CTL especifica de longa duração, pois foi possível detectar actividade citotóxica específica em todos os ratos três meses após a última injecção e mesmo passados cinco meses num animal. EXEMPLO 4
Os péptidos HLA*0201-restritos Inseridos na CyaA são processados e apresentados por HLA*0201+ DC humanas A indução in vivo de respostas de CTL específicas pela CyaA recombinante indica que os epítopos inseridos são processados e apresentados de forma eficiente pelas APC murinas. No entanto, é importante demonstrar que as APC humanas também são capazes de processar e apresentar estes epítopos HLA*0201-restritos inseridos na CyaA. Dado que as DC são as APC mais importantes na indução das respostas das células T primárias, determinou-se a capacidade de HLA*0201+ DC incubadas com a CyaA recombinante estimularem 32 clones de CTL humanos específicos dos epítopos inseridos na CyaA recombinante. Com vista a estas experiências, produziu-se DC humanas in vitro a partir de PBMC aderentes a HLA*0201+ PBMC na presença de GM-CSF e il-4. Em seguida, adicionou-se doses crescentes de CyaA-E5-Tyr, CyaA-E5-GnT-V ou CyaA-E5 de controlo, e avaliou-se a apresentação dos péptidos antigénicos ao medir a capacidade de as DC tratadas estimularem os CTL relevantes num ensaio de produção de IFN-y.
Como mostrado na Figura 4A, as DC humanas incubadas com o CyaA-E5-Tyr induziram uma grande produção de lFN-γ pelo clone de CTL específico da tirosinase, indicando que o epítopo da tirosinase é processado e apresentado de forma eficiente em associação com as moléculas HLA*0201. A especificidade deste reconhecimento foi confirmada pela falta de estimulação de dois clones de CTL irrelevantes (dados não mostrados) e pela falta de estimulação do clone específico da tirosinase pelas DC tratadas com o toxóide de controlo CyaA-E5 (Figura 4A). A apresentação do epítopo de tirosinase era proporcional à dose de CyaA-Tyr de até 30 nM. Sob estas condições, doses mais elevadas deram mostras de ser tóxicas para as DC, como indicado pelo baixo reconhecimento das DC tratadas e pela sua menor capacidade de apresentar o péptido sintético carregado de forma exógena (dados não mostrados).
De modo a avaliar a eficiência relativa da apresentação de antigénios usando a CyaA como sistema de fornecimento, também se realizou uma curva de titulação do péptido sintético de tirosinase, que foi pulsado em DC semelhantes.
Como mostrado na Figura 4A, a CyaA-Tyr era até 100 vezes 33 mais eficiente do que o péptido sintético na indução da apresentação pelas DC do epitopo. DC humanas incubadas com o CyaA-E5-GnT-V induziram uma produção fraca mas reproduzível do IFN-γ pelo clone de CTL específico de GnTV, em comparação com as DC incubadas com o péptido pGnT-V (Figura 4B). Este resultado indica que as DC humanas são capazes de apresentar o epitopo GnT-V inserido na CyaA, embora com uma eficiência moderada.
Em resumo, estes resultados demonstram claramente a capacidade de as DC humanas processarem e apresentarem epítopos humanos inseridos na CyaA. EXEMPLO comparativo 5
Construções de toxinas de CyaA que não induzem uma resposta A CyaA-Mel 21, que contém o epitopo gpl00-280 e inclui a sequência inserida YLEPGTVTA do antigénio tumoral associado ao melanoma GP 100, não inclui uma resposta de CTL. De modo semelhante, a CyaA-CEA 13, que contém o epitopo CEA 571 -579 e tem a sequência inserida YLSGANLNL do Carcinoma Embryoníc Antigen (antigénio carcino-embriónico), não induz uma resposta de CTL. Nenhuma destas toxinas induz uma resposta de CTL específica dos epítopos inseridos no rato HHD. Além disso, algumas células dendríticas humanas não conseguem apresentar o epitopo inserido CyaA-Mel 21 (epitopo gpl00-280) para um clone de CTL humano. Por isso, esta toxina também é provavelmente ineficaz nos humanos. Estas duas toxinas, a CyaA-Mel21 e a CyaA-CEAl3, são idênticas à CyaA-Tyr e à CyaA-GnTV, mas diferem apenas nas sequências inseridas. Por conseguinte, apenas os epítopos 34 são diferentes e, assim, as respostas à CyaA-Tyr e à CyaA-GNTV são especificas de epitopo.
Por fim, a toxina Cya-Mage, que contém o epitopo Mage A10/A2 com a sequência inserida GLYDGMEHL da proteína do melanoma Mage 10, induz uma resposta de CTL muito boa no rato HHD, mas é ineficiente nos humanos de acordo com o protocolo acima descrito. Por conseguinte, uma resposta positiva no rato nem sempre é indicadora de uma resposta positiva nos humanos. Em geral, as respostas humanas são específicas de epitopo e de espécie.
Referências
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> INSTOL/T PASTEUR INSEAM
UUDWIG INSTÍTUTE FOR CÂNCER RESEARCH CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SOENTIF1DUE
<120> TOXINA DE XBSNILATO CICLASS EECOMBINANTS BA BORnSTELLA IMXM RESPOSTAS BAS CÉLULAS T CEMTRA. A^FICÉNIOS TÍSOEAIS 41
<13Q*e821SA-ADi»EAL <14Θ> Dea-oossliecidO -·:141> 2004-11-19 <1SQ»US8í]lflS23t6S2 <1t1* 2003-11-21 <:1©G»11 <170» Patentfn Ver, 2.1
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Lisboa, 2 de Março de 2010

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição imunogénica que contém uma proteína recombinante, sendo que essa proteína recombinante engloba uma CyaA da Bordetella ou um respectivo fragmento, e um péptido correspondendo a um péptido que corresponde a um antigénio de melanoma ou a um epítopo derivado de um antigénio de melanoma, em que o referido péptido é um epítopo HLA-A*0201 derivado da tirosinase que é a região 369 - 377 da tirosinase ou YMDGTMSQV.
2. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a CyaA da Bordetella, ou um respectivo fragmento, e o péptido se encontram geneticamente fundidos um no outro ou quimicamente ligados um ao outro.
3. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a CyaA da Bordetella é desintoxicada ou desprovida de actividade catalítica.
4. A composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína recombinante é: uma proteína recombinante contendo a CyaA da Bordetella ou um respectivo fragmento específico, desprovida/o de actividade catalítica, e o péptido com a sequência YMDGTMSQV (pTyr), ou - uma proteína de fusão contendo a CyaA da Bordetella pertussis e um péptido que corresponde a um antigénio englobando o epítopo Tyr e que é codificado pela sequência incluída no plasmídeo depositado no CMCM com 2 o número 1-2679.
5. Composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que a proteína recombinante contém mais do que um péptido.
6. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 5, em que os péptidos são iguais ou pelo menos um é diferente do(s) outro(s).
7. Composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido péptido se encontra localizado em qualquer local permissivo da CyaA.
8. Composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido péptido inclui regiões flanqueadoras.
9. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 8, em que o péptido é: SSMHNALHIYMDGTMSQVQGSANDPI.
10. Composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que a composição é empregue como uma imunoterapia.
11. Composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 ou 5 a 10, em que a CyaA da Bordetella é da B. pertussis, B. parapertussis ou B. bronchiseptica.
12. Uma composição imunogénica contendo um vector, em que o referido vector expressa uma proteina recombinante, 3 como definido na composição imunogénica de uma das reivindicações 1 a 11.
13. Um ácido nucleico que codifica uma proteina de fusão, em que a proteina de fusão contém a CyaA da Bordetella ou um respectivo fragmento, e um péptido como definido numa das reivindicações 1 a 3.
14. Um vector que expressa uma proteina recombinante, em que a proteina recombinante contém a CyaA da Bordetella ou um respectivo fragmento, e um péptido como definido numa das reivindicações 1 a 3.
15. 0 plasmideo depositado no C. N. C. M. com o número de registo 1-2679.
16. Uma composição imunogénica contendo um vector que expressa uma proteina recombinante, como definido numa das reivindicações 1 a 12, destinada a ser utilizada no tratamento de um doente com cancro, para induzir uma resposta das células T no referido doente.
17. Uma composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 12 superfície da célula tumoral, destinada a ser utilizada no tratamento de um doente com cancro, para induzir uma resposta das células T no referido doente.
18. Uma composição imunogénica de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que a referida resposta das células T é uma resposta dos CTL.
19. Utilização de uma composição imunogénica de acordo com 4 uma das reivindicações 1 a 12, na preparação de um fármaco para o tratamento do cancro.
20. Utilização de uma composição imunogénica de acordo com a reivindicação 19, em que o referido cancro é um melanoma.
21. Uma composição imunogénica de acordo com uma das reivindicações 1 a 12 para o tratamento do cancro.
22. Uma composição imunogénica de acordo com a reivindicação 21, em que o referido cancro é um melanoma. Lisboa, 2 de Março de 2010
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