BRPI1013485A2

BRPI1013485A2 - poliptídeo, derivado de polipeptídeo, composição farmacêutica, uso de um derivado de poliptídeo, e, método para a preparação de um vetor proteináceo

Info

Publication number: BRPI1013485A2
Application number: BRPI1013485-9A
Authority: BR
Inventors: Peter Sebo; Adriana Osickova; Jiri Masin; Catherine Fayolle; Jan Krusek; Marek Basler; Claude Leclerc; Radim Osicka
Original assignee: Institute Of Microbiology Of The ASCR, V.V.I; Institute Of Physiology Of The Ascr, V.V.I; Institut Pasteur
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2010-03-23
Publication date: 2021-05-04
Also published as: US20120052083A1; US8017132B2; US20100239550A1

Abstract

POLIPEPTÍDEO, DERIVADO DE POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM DERIVADO DE POLIPEPTÍDEO, E, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM VETOR PROTEINÁCEO. A invenção diz respeito a polipeptídeos CyaA/E570Q+K860 mutantes adequados para uso como vetores proteináceos para dispensar uma ou mais moléculas de interesse em uma célula expressando o receptor CD11b. A invenção diz respeito adicionalmente a derivados de polipeptídeo adequados para elicitar uma resposta imune em um hospedeiro. A invenção diz respeito mais particularmente a polipeptídeos derivados de uma proteína adenilato ciclase (CyaA) tanto na forma de uma toxina quanto de um toxóide, que são polipeptídeos mutantes. Os ditos polipeptídeos mutantes são capazes de reter a atividade de ligação de CyaA nativa para um célula alvo e, preferivelmente, reter também a atividade de translocação de CyaA nativa através de seu domínio N terminal nas células alvos e, além disso, têm uma atividade formadora de poros que é reduzida ou suprimida comparada com aquela da toxina CyaA nativa.

Description

“POLIPEPTÍDEO, DERIVADO DE POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM DERIVADO DE POLIPEPTÍDEO, E, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UM VETOR PROTEINÁCEO” . A invenção diz respeito a polipeptídeos adequados para uso na — dispensação de uma ou mais moléculas em uma célula.

: Em particular, a invenção diz respeito a polipeptídeos adequados para uso na dispensação de uma ou mais moléculas que são capazes de elicitar uma resposta imune em um hospedeiro, especialmente alvejando células que expressam o receptor CDI 1b/CD18 (também referidas —aquicomo “células que expressam CD11b”).

A invenção diz respeito mais particularmente a polipeptídeos derivados de uma proteína adenilato ciclase (CyaA), esta sendo usada tanto na forma de um toxina quanto de uma proteína destoxificada, ou toxóide, que são polipeptídeos mutantes. Os ditos polipeptídeos mutantes são capazes de reter a atividade de ligação de CyaA nativa para um célula alvo e preferivelmente de reter também a atividade de translocação de CyaA nativa através de seu domínio N terminal nas células alvos e, além disso, têm uma atividade formadora de poros que é reduzida ou suprimida comparada com aquela da toxina CyaÃ nativa.

A invenção diz respeito em particular ao uso dos ditos polipeptídeos como vetores proteináceos. Dessa maneira, os polipeptídeos mutantes são adicionalmente combinados com moléculas não CyaA, dando origem por meio disso a derivados de polipeptídeo, em que as ditas moléculas têm um interesse vacinal e/ou terapêutico preventivo quando administradas a umhbospedeiro Os polipeptídeos de acordo com a invenção são adequados para uso como vetores proteináceos para a dispensação de um molécula, em particular de um molécula polipeptídica com uma sequência de aminoácidos compreendendo um ou mais epítopos, especialmente antígenos, em uma célula, em particular em células que expressam CD11b.

A invenção assim também diz respeito a um derivado de polipeptídeo (um derivado do polipeptídeo mutante da invenção) que compreende ou consiste em um polipeptídeo mutante de acordo com a — invenção recombinada com uma ou mais moléculas, em particular com uma 7 ou mais moléculas adequadas para elicitar uma resposta imune, constituindo assim um polipeptídeo recombinante ou um polipeptídeo de fusão. A invenção também diz respeito a derivados de polipeptídeo obtidos enxertando quimicamente a(s) dita(s) molécula(s) com os polipeptídeos mutantes.

De acordo com uma modalidade, os derivados de polipeptídeo de acordo com a invenção são adequados para uso em tratamento profilático e especialmente em vacinação e em terapia incluindo em imunoterapia, em particular para elicitar uma resposta imune em um sujeito.

A CyaA nativa usada no contexto da presente invenção para o projeto dos polipeptídeos da invenção é a adenilato ciclase produzida basicamente em organismos Bordetella, especialmente em Bordetella Pertussis e que tem os seguintes recursos e propriedades revelados com o propósito de caracterizar a dita proteína no contexto da invenção.

A toxina hemolisina da adenilato ciclase RTX bifuncional (também designada aqui como a toxina da adenilato ciclase (CyaA, ACT, ou AC-Hly) é um fator de virulência chave de Bordetella Pertussis que é o agente causador de coqueluche (1). Seu polipeptídeo de 1.706 resíduos de comprimento é uma fusão de um domínio de enzima da adenilato ciclase N terminal (AC) ou parte (400 resíduos) com uma hemolisina RTX formadora — de poros (citolisina Repeat in Toxin (citolisina com repetições)) de —1306 resíduos constituindo a parte ou domínio C terminal (2). Esta hospeda os sítios de ativação de proCyaA a CyaA por palmitoilação pós-translacional covalente de grupos e-amino de Lys** e Lys”, bem como as numerosas repetições de RTX que formam +40 sítios de ligação de cálcio, o carregamento dos quais é exigido para atividade citotóxica de CyaA (3,4). À proteína CyaA é certamente dimensionada como uma protoxina inativa que é convertida em uma toxina ativa por palmitoilação pós-translacional de dois . resíduos de lisina interna (lisinas 860 e 983). Esta modificação pós- — translacional exige a expressão com o gene de cyaÃ de um gene acessório, : isto é, cyaC que é localizado próximo a cyaA no cromossomo B. pertussis.

A toxina visa basicamente fagócitos de mielóide hospedeiro que expressam o receptor de integrina om», conhecido também como CDI15/CDI8, CR3 ou Mac-l (5). A dita toxina especialmente se liga ao — receptor CDI1b/CDI8 de células que expressam o mesmo através de um sítio de ligação do receptor presente em sua parte C terminal. Estas células são dessa maneira células alvos para a toxina nativa e também para os polipeptídeos da invenção. CyaA insere na membrana citoplásmica de células e transloca o domínio de enzima AC no citosol das ditas células alvos (6, 7).

Dentro das células, o AC é ativado por calmodulina e catalisa a conversão descontrolada de ATP celular em cAMP, uma segunda molécula mensageira chave que provoca prejuízo de funções bactericidas de fagócitos (1). Em altas doses (>100 ng/mL), a dissipação catalisada por CyaA de ATP em cAMP torna-se citotóxica e promove apoptose ou mesmo morte necrótica rápida e —lisedemonócitos CDI 1b* (8,9).

Recentemente, os inventores mostraram que CyaA liga oligossacarídeos N ligados de seu receptor CDI 11/CD18 (10). Isto sugere que interações de baixa especificidade com glicanos de proteínas de superfície celular onipresentes ou glicolipídios podem ser responsáveis por cerca de — duas ordens de magnitude a menos, mas capacidade facilmente detectável de CyaA penetrar também nas células que não têm CDI1b/CD18. Certamente, devido à atividade catalítica específica extremamente alta do domínio AC, observou-se que CyaA eleva substancialmente cCAMP também em eritrócitos, linfócitos, linfoma, neuroblastoma, CHO, ou células epiteliais traqueais de mamífero e ave (1, 11).

Já foi proposto na tecnologia anterior fornecer toxina destoxificada, também chamada toxóide, em que a atividade da adenilato . ciclase é diminuída, de forma essencial especialmente suprimida. Tal toxóide S —CyaA/AC pode ser usado para obter a preparação dos polipeptídeos da : invenção.

Além de elevar cAMP, a toxina exibe também uma atividade hemolítica moderada nos eritrócitos de mamífero e ave. Isto é devido à capacidade de formar pequenos poros seletivos de cátion de um diâmetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, que permeabiliza a membrana celular e eventualmente provoca lise de célula osmótica coloidal (12). Recentemente, os inventores e outros mostraram que a atividade formadora de poros de CyaÃ sinergiza com sua atividade de enzima AC invasiva da célula e contribui com a potência citolítica total de CyaA nas células CD11b* (13, 14).

Devido a uma capacidade formadora de poros intacta (hemolítica), na ausência de osmoprotetores tal como soro, o toxóide CyaA/AC enzimaticamente inativo (15) exibe ainda uma atividade hemolítica completa nos eritrócitos e uma atividade citolítica residual, cerca de dez vezes menor nos monócitos que expressam CDI11b (8), que estabelece um limite para seu usoemterapia.

As atividades hemolíticas (formação de poro) e translocação da membrana AC (invasiva da célula) de CyaA foram inicialmente consideradas dissociáveis por baixa concentração de cálcio, baixa temperatura (16) e pela extensão e natureza de acilação de CyaA (4, 12, 17). Além do mais, as duas atividades diferem substancialmente em sensibilidade para reversão da carga ou substituição neutra de glutamatos nas posições 509, 516, 570 e 581 no domínio hdrofóbico (8, 13, 18). Assim, foi proposto que as atividades invasivas e formadora de poros da célula de CyaA são mutuamente independentes e operam em paralelo na membrana da célula alvo. O modelo ilustrado na figura SA sugere que dois conformadores de CyaA distintos inserem na membrana da célula alvo em paralelo, um sendo o precursor de . translocação, considerando a dispensação do domínio AC através da . membrana celular com influxo concomitante de íons de cálcio nas células, o 5 outro sendo um precursor do poro que forma eventualmente poros F oligoméricos (13, 18, 19).

Os inventores testaram agora este modelo e o aperfeiçoaram, mostrando que a atividade formadora de poros não está envolvida em translocação do domínio AC através da célula alvo.

Na presente invenção, os inventores inicialmente projetaram polipeptídeos mutantes de CyaA, baseados especialmente na adenilato ciclase de Bordetella pertussis, tanto na toxina quanto no formato de toxóide, tendo uma combinação de substituição nos domínios formadora de poros (E570Q) e que carregam a acilação (K860R) e mostraram que esta combinação específica de substituição aboliu seletivamente a atividade de permeabilização da célula de CyaA, eliminando assim a atividade citolítica residual de toxóides CyaA/AC' nas células CDI1b". Ao mesmo tempo, o construto ESTOQ+K860R reteve uma capacidade total de translocar o domínio AC no citosol de células para elevar cAMP celular e seu toxóide foi completamente — capaz de dispensar moléculas contendo epítopos inseridas no dito construto no caminho citosólico de células dendríticas para apresentação e indução restritas a MHC classe I de resposta in vivo de célula T citotóxica específica.

O CyaA mutante/233OVA/ESTOQ+K860R projetado pelos inventores, e em que um peptídeo antigênico OVA é inserido da maneira — descrita nos exemplos, é o primeiro construto ilustrativo da capacidade de o CyaA mutante fornecer uma capacidade notadamente reduzida de permeabilizar células permanecendo ao mesmo tempo completamente capaz de translocar o domínio AC através da membrana celular.

Os inventores projetaram agora construtos particulares,

ilustrados especialmente como um toxóide CyaA/ES70Q+K860R/AC' e mostraram que apesar de sua atividade muito reduzida de permeabilização da , célula (citolítica), ele permanece completamente ativo na dispensação de : antígeno nos APCs CD11b*. Os inventores mostraram adicionalmente que a — atividade citolítica total do toxóide CyaA/ESTOQ+K860R/AC' ilustrativo é Í muito baixa. Ele é assim isento de toxicidade residual em um hospedeiro animal ou humano e é, portanto, muito adequado para uso em terapia.

A invenção diz respeito assim a polipeptídeos inéditos, que são toxóides e têm um melhor perfil de segurança e podem ser usados como vetores proteináceos para a dispensação de moléculas de interesse, em particular de sequências peptídicas imunogênicas, para células de um paciente que necessita de um tratamento e, mais particularmente, para células que expressam CD11b.

Com base nos experimentos realizados pelos inventores foi assim possível definir e fornecer um polipeptídeo que é um mutante de uma proteína adenilato ciclase (polipeptíideo mutante) e cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma das seguintes sequências: a) a sequência de aminoácidos da adenilato ciclase (CyaA) de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii em que as mutações seguintes foram realizadas: (1) a substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 570 por um resíduo de glutamina (ES70Q) ou por um resíduo de aminoácido conservativo, e (ii) a substituição do resíduo de lisina na posição 860 por um — resíduo de arginina (K860R) ou por um resíduo de aminoácido conservativo, ou; b) uma sequência de aminoácidos de um fragmento da adenilato ciclase de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii, cujo fragmento tem a capacidade da proteína CyaA de ligar

Bordetella Pertussis a uma célula alvo e a capacidade de translocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal ou parte deste na dita célula, , em que o dito fragmento adicionalmente contém os seguintes resíduos de R aminoácidos mutados localizados nas posições 570 e 860 na dita adenilato ciclase: ES70Q e K860R, ou f c) uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos da maneira definida em a) ou b) por uma ou mais substituição e/ou inserções de resíduo de aminoácido e que tem a capacidade de a proteína CyaA de Bordetella Pertussis ligar a uma célula alvo e a capacidade de — translocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal ou parte deste na dita célula, em que a dita sequência de aminoácidos adicionalmente contém os seguintes resíduos de aminoácidos mutados localizados nas posições 570 e 860 na dita adenilato ciclase: ES70Q e K860R, ou d) a sequência de aminoácidos da adenilato ciclase (CyaA) de Bordetella bronchiseptica em que as mutações seguintes foram realizadas:

(1) a substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 569 por um resíduo de glutamina (ES69Q) ou por um resíduo de aminoácido conservativo, e

(ii) a substituição do resíduo de lisina na posição 859 por um

— resíduo de arginina (K859R) ou por um resíduo de aminoácido conservativo, ou;

e) uma sequência de aminoácidos de um fragmento da adenilato ciclase de Bordetella bronchiseptica, cujo fragmento tem a capacidade de a proteína CyaA de Bordetella Pertussis ligar a uma célula alvo ea capacidade de translocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal ou parte deste na dita célula, em que o dito fragmento adicionalmente contém os seguintes resíduos de aminoácidos mutados localizados nas posições 569 e 859 na dita adenilato ciclase: ES69Q e K859R, ou f) uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos da maneira definida em d) ou e) por uma ou mais substituição - e/ou inserções de resíduo de aminoácido e que tem a capacidade de a proteína . CyaA de Bordetella Pertussis ligar a uma célula alvo e a capacidade de S — translocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal ou parte deste " na dita célula, em que a dita sequência de aminoácidos adicionalmente contém os seguintes resíduos de aminoácidos mutados localizados nas posições 569 e 859 na dita adenilato ciclase: ES69Q e K859R. Com o propósito da invenção, o domínio N terminal do fragmento descrito é a sequência de aminoácidos do fragmento que inclui os resíduos de aminoácidos contínuos da parte N terminal da proteína CyaA nativa, por exemplo, a parte N terminal do fragmento é todo ou parte dos resíduos contínuos que formam a sequência de 400 resíduos de aminoácidos do domínio N terminal da proteína CyaA de Bordetella Pertussis.

Aqui, “ES70Q” engloba substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 570 de CyaA nativa de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii por um resíduo de glutamina ou por um outro resíduo conservativo, em particular um resíduo cujos tamanho e natureza hidrofílica da cadeia lateral são próximos a do ácido glutâmico. O resíduo de ácido glutâmico na posição 570 é preferivelmente substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp.

Aqui, “K860R” engloba substituição do resíduo de lisina na posição 860 de CyaA nativa de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii por um resíduo de arginina ou por um outro resíduo conservativo, em particular um resíduo cujos tamanho e natureza hidrofílica da cadeia lateral são próximos a da lisina. O resíduo de lisina na posição 860 é preferivelmente substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, He.

Aqui, “ES69Q” engloba substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 569 de CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica por - um resíduo de glutamina ou por um outro resíduo conservativo, em particular : um resíduo cujos tamanho e natureza hidrofílica da cadeia lateral são — próximos ado ácido glutâmico. O resíduo de ácido glutâmico na posição 569 é preferivelmente substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp. Aqui, “K859R” engloba substituição do resíduo de lisina na posição 859 de CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica por um resíduo de arginina ou por um outro resíduo conservativo, em particular um resíduo cujos tamanho e natureza hidrofílica da cadeia lateral são próximos a da lisina. O resíduo de lisina na posição 859 é preferivelmente substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, Ne.

Nas modalidades descritas a seguir, as proteínas CyaÃ de Bordetella Pertussis mutantes ou fragmentos da proteína que carregam as substituições de “ES70Q” e “K860R” podem ser substituídos por proteínas CyaA de Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii mutantes ou fragmentos da proteína que carregam as substituições de “ES70Q” e “K860R” equivalentes, ou por proteínas CyaA Bordetella bronchiseptica mutantes ou fragmento de proteína que carregam as substituições “ES69Q” e “K859R” equivalentes.

A CyaA nativa de Bordetella Pertussis foi também descrita como uma sequência de aminoácidos e uma sequência de nucleotídeo por —Glaser,P.etal, 1988, Molecular Microbiology 2(1), 19-30. Esta sequência é referida como SEQ ID Nº1 conforme ilustrado na figura 6. Dessa maneira, quando resíduos de aminoácidos ou sequências ou nucleotídeos ou sequências de nucleotídeos da proteína CyaA de B. pertussis, são citadas na presente invenção suas posições são dadas com relação às sequências reveladas na dita publicação de Glaser et al. 1988. Em uma modalidade da presente invenção o sequência amino - da adenilato ciclase Bordetella Pertussis é a sequência revelada como SEQ ID . NºL. s Quando referência é feita a SEQ ID Nº] ou a SEQ ID Nº2 aqui, é especialmente salientado que, a menos que não seja tecnicamente relevante, os recursos revelados se aplicariam similarmente a uma sequência modificada por inserção de resíduos na SEQ ID Nº1 ou SEQ ID Nº2 a fim de destoxificar a proteína CyaA. Em um caso desses, a numeração dos resíduos 10 de aminoácidos deve ser adaptada (especialmente no que diz respeito as posições 570 e 860 da sequência nativa).

Vantajosamente, a proteína CyaA ou um fragmento desta é uma proteína ou um fragmento desta, que é o resultado da coexpressão em uma célula, especialmente em uma célula recombinante, tanto de genes cyaA quanto cyaC. Certamente mostrou-se que a fim de ter propriedades invasivas para células alvos, CyaA tem de passar por modificações pós-translacionais que são permitidas pela expressão tanto dos genes cyaA quanto cyaC (WO 93/2132), Em uma modalidade particular da invenção, a proteína CyaA é uma proteína bacteriana. Em uma modalidade preferida, proteina CyaA é derivada de uma espécie Bordetella.

Entre espécie Bordetella de interesse, de acordo com a invenção, uma delas é Bordetella Pertussis. Outras cepas de Bordetella de interesse são aquelas de Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii ou — Bordetella bronchiseptica. A sequência de proteína CyaA de B. parapertussis foi revelada especialmente com o número de acesso NC 002928.3 (como uma sequência de 1740 aminoácidos) e em Parkhill J. et al (Nat. Genet. DOI, 10 (2003)), para B. hinzii em Donato G.M. et al. (J. Bacteriol. 2005 Nov, 187(22):7579-88) e para B. bronchiseptica em Betsou F. et al (Gene 1995,

August 30; 162(1): 165-6). A sequência de Bordetella parapertussis foi revelada especialmente com o número de acesso CAB76450, referida aqui : como SEQ ID Nº7 conforme ilustrado na figura 14. A sequência de . Bordetella hinzii foi revelada especialmente com o número de acesso —AAYST2OL, referida aqui como SEQ ID Nº8 conforme ilustrado na figura 15. E A sequência de Bordetella bronchiseptica foi revelada especialmente com o número de acesso CAA8S481, referida aqui como SEQ ID Nº 9 conforme ilustrado na figura 16. Dessa maneira, quando resíduos de aminoácidos ou sequências da proteína CyaA de Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii ou Bordetella bronchiseptica, são citados na presente invenção suas posições são dadas com relação às sequências reveladas na SEQ ID Nº7, 8 e 9 repectivamente.

A expressão “polipeptídeo mutante da proteína adenilato ciclase” exclui a adenilato ciclase nativa expressa por Bordetella. Conforme declarado anteriormente, ela é caracterizada por uma diferença primária com a proteína nativa, disposta na substituição combinada de dois resíduos de aminoácidos específicos. Ela pode ser adicionalmente modificada com relação à dita proteína nativa e ela pode especialmente ser um fragmento da proteína assim mutada, tal como, por exemplo, uma variante truncada da dita proteína mutada, em que resíduos em qualquer das ambas extremidades terminais são deletados. Em particular, resíduos na extremidade C terminal podem ser deletados até o ponto em que eles não afetam o sítio de reconhecimento e ligação para o receptor de célula CDIIb/CDI8. Alternativamente ou adicionalmente resíduos podem ser deletados na extremidade N terminal de maneira que eles não afetem a capacidade de translocação do polipeptídeo mutante obtido. Eles podem também ser um fragmento obtido depois deleções internas de um ou mais resíduos da proteína CyaÃ mutada nativa. Onde a invenção diz respeito a um polipeptídeo mutante que é um fragmento conforme aqui declarado, o dito fragmento que necessariamente compreende os resíduos mutados ES70Q e K860R (quando referência é feita à sequência amino da proteína CyaA de Bordetella -: Pertussis) também retêm a capacidade da CyaA de comprimento total mutado — de ligar células e translocar seu domínio N terminal no citosol de células ' alvos, especialmente de células que expressam CD11b/CD18.

A invenção diz respeito assim a polipeptídeos mutantes adequados para uso no projeto de meios para a dispensação de uma ou mais moléculas em uma célula, especialmente uma célula alvo que expressa o receptor CDI1b/CDI8.

Em particular, a invenção diz respeito a polipeptídeos mutantes de uma proteína CyaA, onde a dita proteína tanto é derivada da toxina CyaA quanto é preferivelmente derivada de um toxóide deste, especialmente um toxóide CyaA/AC”. Os polipeptídeos mutantes são capazes deligara uma célula, especialmente a uma célula alvo, especialmente uma célula alvo que expressa o receptor CD] 1b/CD18, são capazes de translocar seu domínio N terminal ou a molécula inserida no dito domínio ou enxertado na célula e sua atividade formadora de poros é totalmente ou parcialmente suprimida comparada com aquela da toxina ou toxóide CyaÃ.

A capacidade de o polipeptíideo mutante alvejar células CDI 1b/CDI8 pode ser ensaiada especialmente de acordo com os métodos revelados em EP 03291486.3 and El-Azami-El-Idrissi M. et al, J. Biol. Chem., 278(40)38514-21 ou em WO 02/22169. Além disso, a capacidade do polipeptídeo mutante de translocar o(s) epítopo(s) ou polipeptídeo(s) — contendo o(s) dito(s) epítopo(s) no citosol de célula alvo pode ser ensaiada aplicando o método descrito em WO 02/22169.

Supressão total ou parcial da atividade formadora de poros da toxina ou toxóide CyaA, ou capacidade de permeabilização da célula, deve ser entendida como a supressão total ou parcial da capacidade de formar poros, em poros seletivos cátion particular de um diâmetro estimado de 0,6 a 0,8 nm, que permeabiliza uma membrana celular e eventualmente provoca - lise de célula osmótica coloidal. A atividade formadora de poros pode ser . medida usando o experimento de clampeamento de canais iônicos de célula — total única da maneira descrita nos exemplos.

A atividade formadora de poros da toxina CyaAÃ contribui com sua atividade citolítica ou hemolítica total nas células. Certamente, no contexto da presente invenção, a atividade citolítica ou hemolítica total de .- CyaA (ou sua “atividade citotóxica total”) deve ser entendida como o resultante de pelo menos as atividades de ciclase e formadora de poros de adenilato da toxina CyaA. Assim, supressão total ou parcial da atividade formadora de poros da toxina CyaA permite uma supressão pelo menos parcial de sua atividade citolítica.

Em uma modalidade preferida, a atividade citolítica total do

15. polipeptídeo de acordo com a invenção, em particular nas células que expressam o receptor CDIIb/CDI8, é total ou parcialmente reduzida comparada com aquela da toxina CyaA de Bordetella Pertussis. A atividade citolítica do polipeptídeo inventivo pode ser determinada medindo-se a quantidade de hemoglobulina (para eritrócitos) ou de lactato deidrogenase —(paramonócitos) liberada pelas células quando incubadas com o polipeptídeo testado da maneira descrita nos exemplos.

Em uma modalidade preferida, a atividade citolítica total do polipeptídeo de acordo com a invenção nas células que expressam o receptor CDI1b/CDI18 é pelo menos 75 % menor, preferivelmente ainda pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % menor, do que a toxina CyaÃ de Bordetélla Pertussis, ou do que a de uma proteína CyaA de Bordetella Pertussis cuja atividade da adenilato ciclase é parcialmente ou totalmente suprimida (ou “toxóide CyaA”). Em uma modalidade particularmente preferida, a atividade citolítica total do polipeptídeo de acordo com a invenção nas células que expressam o receptor CDIIb/CDI8 é pelo menos 75 % menor, preferivelmente ainda pelo menos 80 % ou 85 % menor, do que a toxóide - CyaA Bordetella Pertussis cuja sequência de aminoácidos é mostrada na - figura 2 (SEQID Nº2). Em uma modalidade preferida, a invenção diz respeito a um ' polipeptídeo que é um mutante de uma adenilato ciclase e cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos (1) que é mutada com relação às sequência de aminoácidos reveladas na SEQ ID Nº] as ditas mutações compreendendo pelo menos as substituições ES70Q e K860R ou (ii) que é um fragmento da proteína CyaA tendo a dita sequência de aminoácidos revelada como SEQ ID Nº1, até o ponto em que o dito fragmento tem uma sequência de aminoácidos incluindo substituições ES70Q e K860R e em que o polipeptídeo é capaz de ligar a uma célula alvo e de translocar seu domínio N terminal na célula.

Em uma modalidade particular da presente invenção, o fragmento incluindo uma substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 570 da SEQ ID Nº1 por um resíduo de glutamina (referido como “ESTOQ”), e a substituição do resíduo de lisina na posição 860 da SEQ ID Nº1 por um resíduo de arginina (referido como “K860R”) engloba pelo menos a sequência de aminoácidos da proteina CyaA começando com o primeiro resíduo N terminal ou de um dos resíduos de aminoácidos compreendidos entre as posições 1 e 400, preferivelmente entre as posições 1 e 380 e estendendo até os resíduos que formam o sítio de reconhecimento e ligação para o receptor de célula CDI 1b/CDI8 e o dito fragmento contém — resíduos correspondentes aos resíduos ES70Q e K860R mutados ou consiste na dita sequência de aminoácidos. Em uma modalidade particular, o fragmento incluindo as substituições ES70Q e K860R não compreendem a sequência de aminoácidos que vai do aminoácido na posição 1 da SEQ ID Nº1 para o aminoácido na posição 372 da SEQ ID Nº1.

Em uma modalidade preferida, o fragmento que é assim preparado tem de forma perda essencial da atividade da enzima adenil ciclase - (atividade AC) . Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo mutante da invenção é produzido por coexpressão em uma célula recombinante de um ' gene mutado que codifica a sequência de aminoácidos de CyaA mutada ES70Q e R860R e do gene cyaC, seguido pela recuperação do fragmento expresso selecionado de CyaA mutante. : Preferivelmente, o polipeptídeo mutante da invenção tem um resíduo de lisina que corresponde ao resíduo de lisina na posição 983 da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 e que é acilada, em particular, que é palmitoilada ou palmitoleilada.

Alternativamente, o polipeptídeo mutante da invenção tem um resíduo de lisina que corresponde ao resíduo de lisina na posição 983 da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 que não é acilada.

Em uma modalidade específica, o polipeptídeo mutante da invenção tem uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de CyaA revelada na SEQ ID Nº1 por mutação de resíduos resultante em ES70Q e K860R e tem uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 50 %, preferivelmente pelo menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID Nº1.

Em uma outra modalidade específica, o polipeptídeo mutante — da invenção tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 por mutação de resíduos resultante em ES70Q e K860R e por mutações adicionalmente resultantes em 1 a 500, em particular, 1 a 400, 1 a 300, 1 a 200, 1 a 100, 1a 50, 1 a 40,1 a 30, la2S, La20, 1 al1S lal0oulas substituições, deleções e/ou inserções de resíduo de aminoácido incluindo as substituições ES70Q e K860R. . Em uma modalidade específica, o polipeptídeo mutante da - invenção não carrega substituições, deleções e/ou inserções de resíduo de i 5 aminoácido comparados com a sequência de aminoácidos de CyaA de P Bordetella Pertussis sem ser as substituições ES70Q e K860R. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo mutante tem sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº2 conforme ilustrado na figura 7. Em uma outra modalidade e específica, somente substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido — adicional comparados com a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº2 consistem em substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido que suprime total ou parcialmente o atividade enzimática de adenil ciclase da proteína CyaA, tal como em particular a inserção de um dipeptídeo, por exemplo, um dipeptídeo “LQ” ou “GS” entre os aminoácidos nas posições 188 6 189.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo mutante da invenção difere da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 por 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições, deleções e/ou inserções de resíduo de aminoácido além das substituições ES70Q e K860R.

Em uma modalidade particular, além das substituições ES70Q e K860R, o resíduo de leucina na posição 247 da proteína CyaA nativa de Bordetella Pertussis é substituído por um resíduo de glutamina (L247Q) ou por um outro resíduo de aminoácido em particular um resíduo de aminoácido conservativo.

Um polipeptídeo mutante da invenção que é um fragmento da maneira revelada aqui da sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID Nº 1 deve ser entendido como uma sequência que compreende um ou mais fragmentos tendo pelo menos cerca de 350 resíduos de aminoácidos e até cerca de 1.705 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos SEQ ID

Nº1, em particular, fragmentos compreendendo um intervalo de pelo menos 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600 : resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº1, englobando resíduos ES70Q e - K860R. Um polipeptídeo mutante da invenção pode também ser definido comoum fragmento da sequência de aminoácidos revelada na SEQ ID Nº2 TD que compreende um ou mais fragmentos tendo pelo menos cerca de 350 resíduos de aminoácidos e até cerca de 1.705 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos SEQ ID Nº2, em particular, fragmentos .: compreendendo um intervalo de pelo menos 400, 500, 600, 700, 800, 900,

1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº2, englobando 570 e 860 resíduos. Os ditos fragmentos preferivelmente retêm a capacidade de ligar no receptor de célula CDI 1b/CD18 e a capacidade de translocar seu domínio N terminal nas células alvos. Preferivelmente, o polipeptídeo mutante da invenção que é um fragmento como esse que tem um intervalo de aminoácidos compreendendo 570 resíduos de aminoácidos como E570Q a 860 como K860R ou 1 a 860, ou 2 a 860 da SEQ ID Nº1 até o ponto em que as mutações ES70Q e K860R são observadas com relação à SEQ ID Nº! original.

Em uma modalidade preferida, o fragmento adicionalmente compreende 1.166 a 1281 resíduos de aminoácidos ou 1.208 a 1.243 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 de proteína CyaA para interação com células alvos CDL 15/CD18. Um fragmento particular engloba assim toda ou parte da parte do C terminal da proteína nativa cuja parte é responsável pela ligação do —polipeptídeo da invenção na membrana do receptor da célula alvo e/ou CDI1IL/CDI8, e pela dispensação subsequente do domínio N terminal do polipeptídeo no citosol da célula. Um polipeptídeo particular da invenção é o fragmento de proteína CyaA que contém 373 a 1.706 resíduos de aminoácidos de proteína CyaA especialmente da SEQ ID Nº], até o ponto em que os 570 e

860 resíduos são mutados como E570Q e K860R.

Em uma outra modalidade preferida, o polipeptídeo mutante - que é um fragmento como esse compreende : " a) uma primeira sequência de aminoácidos que corresponde a | 5 um intervalo de pelomenos 100 resíduos de aminoácidos contínuos da SEQ ' ID Nº1 compreendendo 570 resíduos de aminoácidos como ES70Q, e adicionalmente incluindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções, substituições ou : inserções comparadas com SEQ ID Nº1 e ' b) uma segunda sequência de aminoácidos que corresponde a um intervalo de pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contínuos da SEQ ID Nº1 compreendendo 860 resíduos de aminoácidos como K860R, e adicionalmente incluindo 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções, substituições ou inserções comparadas com SEQ ID Nº 1 e preferivelmente, c) uma terceira sequência de aminoácidos compreendendo 1166 a 1.281 resíduos de aminoácidos ou 1.208 a 1.243 resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1 de proteína CyaÃ para interação com células alvos CDH 1Lb/CDI8. Um outro polipeptídeo particular da invenção é um fragmento que é um que corresponde à proteína CyaA mutada ES70Q e K860R, em que 225 a 234 resíduos de aminoácidos foram deletados, fornecendo assim um fragmento contendo 1 a 224 e 235 a 1.706 resíduos da proteína mutada.

Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento de polipeptídeo de acordo com a invenção se liga a uma célula que expressa o receptor CD1 16/CD18 em decorrência de ligação específica no dito receptor.

Em uma modalidade preferida, atividade da adenilato ciclase do polipeptídeo em uma célula é parcialmente ou totalmente suprimida comparada com aquela da toxina CyaA de Bordetella Pertussis.

Conforme declarado anteriormente, a expressão “proteína CyaA” diz respeito tanto à forma de toxina quanto preferivelmente à forma de toxóide da proteína.

Dessa maneira, cada modalidade da invenção diz respeito ao polipeptídeo que é um mutante da proteína CyaÃ e se aplica a cada qual da forma de toxina ou toxóide da proteina. - Supressão total ou parcial de adenilato ciclase CyaA ou — atividade enzimática deve ser entendida como a supressão total ou parcial da ' capacidade de converter ATP em cAMP em um ambiente celular comparado com aquele de uma toxina CyaA produzida por coexpressão dos genes cyaÃ e : cyaC em uma célula.

A capacidade de converter ATP em cAMP pode ser : determinada medindo-se o nível de cAMP intracelular da maneira descrita nos exemplos.

Tal supressão total ou parcial pode ser obtida em decorrência de inativação genética, por exemplo, por introdução de uma sequência pequena de sequência de aminoácidos, compreendendo, por exemplo, de um a dez aminoácidos, em particular um dipeptídeo em um sítio da sequência de aminoácidos de CyaA que é parte do sítio catalítico, isto é, em um sítio localizado nos primeiros 400 aminoácidos (domínio AC) da SEQ ID Nº1 ou por deleção ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nºl que é essencial para a atividade enzimática.

Em uma modalidade preferida, supressão total ou parcial da atividade enzimática CyaA é obtida por inserção de um dipeptídeo, por exemplo, um dipeptídeo “LQ” ou “GS”, entre os aminoácidos na posição 188 e 189 da sequência CyaA apresentada na SEQ ID Nº1. Isto pode ser obtido inserindo um oligonucleotídeo, tal como “CTG CAG” ou “CGATCC”, no sítio EcoRV na posição 564 da fase de codificação do gene cyaA.

Ver Ladant et al., 1992. Alternativamente, supressão total ou parcial da atividade enzimática pode também ser obtida por mutagênese direcionada, por exemplo, substituindo o resíduo de lisina na posição 58 ou 65 da proteína CyaA nativa de Bordetella Pertussis (Glaser et al., 1989) por um resíduo de Gln.

O polipeptídeo de acordo com a invenção pode também ser definido como um polipeptídeo que pode ser obtido de um polipeptídeo de - CyaA com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID Nº 1,7, 8 - ou 9. Ss a) substituindo o resíduo de ácido glutâmico na posição 570 da ' SEQ ID Nº 1, 7, 8 ou na posição 569 da SEQ ID Nº 9 por um resíduo de glutamina ou por um resíduo de aminoácido conservativo, ' b) substituindo o resíduo de lisina na posição 860 da SEQ ID . Nº 1,7, 8 ou na posição 859 da SEQ ID Nº 9 por um resíduo de arginina ou —porum resíduo de aminoácido conservativo, e opcionalmente, realizando uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de resíduo de aminoácido nos locais sem ser os locais relatados em a) e b), desde que o polipeptídeo assim obtido tenha a capacidade de a proteína CyaA de Bordetella Pertussis ligar a uma célula alvo —etranslocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal ou parte deste na dita célula.

Preferivelmente, na etapa a) o resíduo de ácido glutâmico é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp, mais preferivelmente por Gln.

Preferivelmente, na etapa b), o resíduo de lisina é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado de Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, Ile, mais preferivelmente por Arg.

Em uma modalidade específica, não são realizadas substituições, inserções e/ou deleções de resíduo de aminoácido adicionais na etapac).

Em particular, a etapa c) pode compreender truncação de qualquer ou ambas extremidades terminais. Em particular, resíduos na extremidade C terminal podem ser deletados até o ponto em que eles não afetam o sítio de reconhecimento e ligação para o receptor de célula

CDI1IW/CDI8. Alternativamente, ou adicionalmente, resíduos podem ser deletados na extremidade N terminal, desde que eles não afetem a capacidade - de translocação do polipeptídeo mutante obtido. Deleções internas de um ou . mais resíduos da proteína CyaA nativa localizada nas posições sem ser — aquelas citadas nas etapas a) e b) podem também ser realizadas. Em uma 1 modalidade particular, a etapa c) compreende a deleção de até 380 ou até 400 aminoácidos na sequência de aminoácidos do N terminal do polipeptídeo de Y CyaA, preferivelmente o deleção do intervalo de aminoácidos que vai do .: aminoácido na posição 1 da SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9 até o aminoácido na —posição372 da SEQIDNº1,7,8ou9.

Preferivelmente, depois da etapa de realização c), O polipeptídeo obtido engloba toda ou parte da parte do C terminal da proteína nativa cuja parte é responsável pela ligação do polipeptídeo da invenção na membrana do receptor da célula alvo e/ou CD11b/CD18, e pela dispensação subsequente do domínio N terminal do polipeptídeo no citosol da célula. Em uma modalidade particular, na etapa c), 373 a 1.706 resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº1, 7 ou 8, ou resíduos de aminoácidos 373 a 1.705 da SEQ ID Nº 9 não são deletados. Em uma modalidade preferida, na etapa c), resíduos de aminoácidos 1208 a 1243 da SEQ ID Nº1, 7 ou 8, ou 1.207 a 1.242 — resíduos de aminoácidos da SEQ ID Nº 9 não são deletados.

Em uma modalidade preferida, a etapa c) compreende substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido que suprimem total ou parcialmente a atividade enzimática de adenil ciclase da proteína CyaA. Tal supressão total ou parcial pode ser obtida por introdução de uma sequência pequena de aminoácido, compreendendo, por exemplo, de um a dez aminoácidos, em particular um dipeptídeo em um sítio localizado nos primeiros 400 aminoácidos (domínio AC) da SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9 ou por deleção ou substituição de uma parte da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9 que é essencial para a atividade enzimática.

Em uma modalidade preferida, supressão total ou parcial da atividade enzimática CyaA é obtida por inserção de um dipeptídeo, por - exemplo, um dipeptídeo “LQ” ou “GS”, entre os aminoácidos nas posições - 188 e 189 da sequência CyaA apresentada na SEQ ID Nº1, 7, 8B ou 9. S — Alternativamente, supressão total ou parcial da atividade enzimática pode ' também ser obtida por mutagênese direcionada, por exemplo, substituindo o resíduo de lisina na posição 58 ou 65 da proteína CyaA nativa Bordetella : Pertussis (Glaser et al., 1989) por um resíduo de Gn. : Preferivelmente, na etapa c) o resíduo de lisina na posição 983 — da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1, 7, 8 ou na posição 982 na SEQ ID Nº 9 não é substituído nem deletado.

Em uma modalidade, este resíduo de lisina é acilado, em particular é palmitoilado ou palmitoleilado.

Alternativamente, este resíduo de lisina não é acilado.

Preferivelmente, depois da etapa de realização c), Oo polipeptídeo obtido tem uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 50 %, preferivelmente pelo menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID Nº1, T 8 ou.

Ainda preferivelmente, depois da etapa de realização c), o —polipeptídeo obtido tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência apresentada na SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9 pelas substituições de resíduo de aminoácido resultantes das etapas a) e b), e por 1 a 500, em particular, 1 a 400, 1 a 300, 1 a 200, 1 a 100, 1a 50, 1 a 40, 1a 30, 1a25,1a 20,1 a15,1a100oula5 substituições, deleções e/ou inserções adicionais de — resíduo de aminoácido.

Em uma modalidade particular, depois da etapa de realização c), o polipeptídeo obtido difere da sequência de aminoácidos de CyaA apresentada na SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9 por 1,2, 3,4, 5,6,7,8,9 ou 10 substituições, deleções e/ou inserções de resíduo de aminoácido além das substituições realizadas nas etapas a) e b).

A invenção também diz respeito a um derivado de polipeptídeo compreendendo ou consistindo em polipeptídeo mutante de . acordo com a invenção que é adicionalmente combinado com uma ou mais ? moléculas de interesse. Em uma modalidade preferida, uma molécula de interesse é uma molécula biologicamente ativa tanto quando considerada ' sozinha quanto quando combinada no polipeptídeo da invenção. As ditas moléculas podem especialmente ser de valor profilático ou valor terapêutico, ' isto é, podem ter uma atividade profilática ou uma terapêutica, ou podem - aumentar uma atividade profilática ou terapêutica.

Em modalidades específicas, as moléculas de interesse são selecionadas no grupo compreendendo: peptídeos, glicopeptídeos, lipopeptídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucléicos, lipídios e substâncias químicas.

Em uma modalidade específica, a uma ou mais moléculas de interesse são moléculas polipeptídicas ou contêm moléculas polipeptídicas. Sua sequência de aminoácidos pode compreender 2 a 1.000, preferivelmente 5 a 800, 5 a 500, 5 a 200, 5 a 100,8 a 50,5 a 25,5 a 20 ou 8 a 16, ou 300 a 600, 400 a 500 resíduos de aminoácido.

Em uma modalidade preferida, a uma ou mais moléculas de — interesse são sequências de aminoácidos heterólogas adequadas para elicitar uma resposta imune (também referidas como “antígenos heterólogos”), em particular sequências de aminoácidos que compreendem ou consistem em um epítopo, incluindo antígenos. Da maneira usada, o termo “heterólogo” refere- se a um antígeno sem ser o polipeptídeo mutante que é usado no seu próprio vetor Da maneira usada, o termo “epítopo” refere-se a uma molécula heteróloga e especialmente um peptídeo heterólogo que pode elicitar uma resposta imune, quando apresentado no sistema imune de um hospedeiro. Em particular, um epítopo como esse pode compreender ou consistir em um intervalo de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 resíduos de aminoácido. Ele pode alternativamente consistir em um antígeno de comprimento total ou consistir em fragmento(s) de antígeno(s). à" Em uma modalidade específica, um derivado de polipeptídeo ; de acordo com a invenção pode ser codificado por um plasmídeo que — corresponde ao plasmídeo OVA-QR-AC' depositado com o número de acesso ' CNCM 1-4137 (figura 12) em que a sequência de DNA que codifica a sequência antigênica “OVA” é substituída por uma sequência de DNA que ' codifica uma sequência antigênica compreendendo um ou mais epítopos. - A molécula polipeptídica adequada para elicitar uma resposta imune é especialmente uma que elicita uma resposta imune da célula T, incluindo como um exemplo uma resposta CTL.

A molécula polipeptídica adequada para elicitar uma resposta imune pode também ser uma que elicita uma resposta imune da célula B.

Em modalidades específicas, o antígeno heterólogo é selecionado do grupo que consiste em um antígeno de um patógeno bacteriano, um antígeno de célula tumoral, um antígeno viral, um antígeno retroviral, um antígeno de fungo ou um antígeno de célula parasita.

Uma molécula de interesse pode ser especialmente um antígeno selecionado do grupo que consiste em: um antígeno da Clamídia, um — antígeno do Micoplasma, um antígeno do vírus da hepatite, um antígeno da poliovírus, um antígeno do vírus de HIV, um antígeno do vírus influenza, um antígeno do vírus de coriomeningite, um antígeno do tumor, ou uma parte de qualquer desses antígenos que compreende pelo menos um epítopo.

Em uma modalidade preferida do derivado de polipeptídeo da — invenção, a sequência de aminoácidos de cada qual da(s) dita(s) molécula(s) adequada(s) para elicitar uma resposta imune compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de um antígeno de Clamídia, um antígeno de Micoplasma, um antígeno do vírus da hepatite, um antígeno de poliovírus, um antígeno do vírus de HIV, um antígeno do vírus influenza, uma sequência do vírus de coriomeningite, um antígeno do tumor, ou compreende ou consiste em uma parte de uma sequência de aminoácidos de qualquer desses antígenos . que compreende pelo menos um epítopo. é Em uma modalidade particularmente preferida, a molécula de interesse é um antígeno associado a tumor (TAA). Antígenos associados a À tumor foram caracterizados para inúmeros tumores tais como, por exemplo: Melanoma, especialmente melanoma metastática; carcinoma do pulmão; ' carcinoma da cabeça e pescoço; carcinoma cervical, carcinoma esofageal; r carcinoma da bexiga, especialmente carcinoma infiltrativo da bexiga; — carcinoma de próstata; carcinoma de mama; carcinoma colorretal; carcinoma de célula renal; Sarcoma; leucemia; mieloma. Para esses vários tipos histológicos de cânceres, mostrou-se que peptídeos antigênicos são especificamente expressos nas amostras de tumor e são reconhecidos por células T, especialmente por células T CD8* ou células T CD.

1 Uma revisão de peptídeos considerados como antígenos associados a tumor nesses tipos de tumores é feita por Van der Bruggen P. et al (Imunological Reviews, 2002, vol 188:51-64). Especialmente, a revelação dos peptídeos contida na tabela 3 da dita revisão é referida aqui para fornecer exemplos de tais antígenos associados a tumor e a dita tabela 3 está incorporada pela referência no presente pedido.

Os antígenos seguintes são citados como exemplos de antígenos associados a tumor reconhecidos pelas células T, de acordo com a publicação de Kawakami Y. et al (Cancer Sci, October 2004, vol.95, no. 10, p784-791) que também fornece métodos para classificar esses antígenos ou —um adicional: antígenos compartilhado por vários cânceres, incluindo MAGE (especialmente em Melanoma), NY-ESO-1, Her2/neu, WTI, Survivin, hTERT, CEA, AFP, SART3, GnT-V, antígenos específicos para alguns cânceres particulares tais como fB-catenina, CDKA4, MART-2, MUM3, gp100, MART-I, tirosinase para Melanoma; bcr-abl, TEL-AML1 para leucemia;

PSA, PAP, PSM, PSMA para câncer de próstata; Proteinase 3 para leucemia mielogenosa; MUC-1 para cânceres de mama, ovário ou pâncreas; EBV- - EBNA, HTLYV-1 tax para linfoma, câncer ATL ou cervical; HLA-A2 mutado - para câncer de célula renal; HAI para leucemia/linfoma. Antígenos — associados a tumor em animais foram também descritos tal como Ciclina DI e É Ciclina D2 em tumores que afetam gatos ou cães. Antígenos associados a tumor reconhecidos por células T ' foram também revelados em Novellino L. et al (Imunol Imunother 2004, - 54:187-207).

Mais geralmente, TAA de interesse na presente invenção são aqueles correspondentes aos antígenos mutados, ou aos antígenos que são sobre-expressos nas células do tumor, para antígenos compartilhados, antígenos de diferenciação específicos de tecido ou para antígenos virais.

Em uma modalidade particular da invenção, o antígeno — associado a tumor é um antígeno de papilomavírus (HPV) ou é tirosinase.

De acordo com uma outra modalidade particular da invenção, as sequências de aminoácidos das moléculas polipeptídicas que compreendem ou consistem em um epítopo foram modificadas com relação a sua sequência de aminoácidos nativa, por exemplo, a fim de diminuir o número de resíduos de aminoácidos negativamente carregados na sequência. Uma modificação como essa pode ser obtida removendo alguns desses resíduos de aminoácidos negativamente carregados ou também adicionando alguns resíduos de aminoácidos positivamente carregados, especialmente as resíduos de flanqueamento dos epítopos. Polipeptídeos compreendendo assim resíduos — negativamente menos carregados podem favorecer a translocação do domínio catalítico do derivado de polipeptídeo da invenção no citosol de células alvos.

As sequências de aminoácidos das moléculas polipeptídicas que compreendem ou consistem em um epítopo ou um antígeno, podem também ser projetadas de uma maneira tal que elas sejam desdobradas quando elas são inseridas no derivado de polipeptídeo da invenção, que aumenta a eficiência da internalização da(s) molécula(s) de interesse de acordo com a - invenção nas células alvos. Tal desdobramento em polipeptídeos que passam - por dobramento como uma consequência de seu teor de aminoácido, pode ser — obtido, por exemplo, removendo ou substituindo resíduos de cisteína a fim de õ evitar formação de ligações de dissulfeto que podem estar envolvidas em dobramento de polipeptídeos. Em alguns casos, é possível impedir f dobramento dos polipeptídeos preparando-os na presença de agentes de - redução para permitir evitar redobramento in vivo.

Em uma modalidade particular, as sequências de aminoácidos, especialmente o antígeno, podem compreender ou consistir em epítopos crípticos.

Os inventores certamente determinaram que construtos derivados de polipeptídeo, que compreendem (i) um polipeptídeo da invenção queé um mutante de uma proteína CyaA (polipeptídeo mutante) de acordo com as definições reveladas aqui e (11) uma molécula polipeptídica com uma sequência de aminoácidos que carrega um ou diversos fragmentos antigênicos de um ou diversos antígenos, permitem que epítopos crípticos dos ditos antígenos se tornem imunogênicos em decorrência de sua apresentação nos —construtos. Especialmente, os ditos construtos que envolvem polipeptídeos mutantes da maneira definida na presente invenção compreendendo a(s) molécula(s) polipeptídica(s) derivada(s) de antígenos de interesse para aplicações especialmente profiláticas ou terapêuticas, incluindo propósitos de vacinação imunoterapêutica, são processados em células alvos onde a(s) —molécula(s) polipeptídica(s) são permitidas ser internalizadas em decorrência da translocação do domínio N terminal do polipeptídeo mutante. Tal processamento permite apresentação de epítopos através das moléculas MHC classe I das células alvos, e os dito epítopos podem compreender epítopos crípticos do antígeno que torna-se naturalmente imunogênico e em particular para aumentar uma resposta da célula T em um hospedeiro, especialmente uma resposta CTL. - A invenção assim também diz respeito a um derivado de . polipeptídeo, em particular a uma proteína recombinante compreendendo uma Í 5 — oudiversasmoléculas polipeptídicas com uma sequência de aminoácidos que " carrega um ou diversos epítopos de um ou diversos antígenos, ou que carrega a(s) dita(s) sequência(s) de aminoácido do(s) dito(s) antígeno(s) da(s) dita(s) ' molécula(s) polipeptídica(s) sendo inseridos nos mesmos ou em diferentes . sítios, especialmente em diferentes sítios permissivos de um polipeptídeo mutante de acordo com a invenção, a dita proteína recombinante retendo a propriedade da toxina CyaA de alvejar células que apresentam antígeno (APC), em que pelo menos um do(s) dito(s) epítopo(s) é um epítopo da célula T críptico subdominante e em que o dito derivado de polipeptídeo, especialmente a dita proteína recombinante, é capaz de elicitar uma resposta específica de antígeno contra a(s) dita(s) molécula(s) polipeptídica(s).

Em uma modalidade específica do derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção, a uma ou mais sequências de aminoácidos são inseridas em um ou mais sítios, especialmente sítios permissivos.

Para a presente invenção, a “sítio permissivo” é um sítio da sequência da proteína CyaA onde um polipeptídeo pode ser inserido sem afetar substancialmente as propriedades funcionais desejadas da proteína CyaA especialmente sem afetar substancialmente o alvejamento de células, particularmente o alvejamento de células que apresentam antígeno (APC) por CyaA, incluindo sem afetar substancialmente a ligação específica no receptor CDIIb/CDI8 e vantajosamente sem afetar substancialmente os domínios da proteína envolvidos no processo de translocação de domínio N terminal de CyaA em uma célula alvo.

Métodos de selecionar sítios permissivos são apresentados, por exemplo, em WO93/21324, em Ladant et al., 1992, e em Osicka et al., 2000

(Infection and Immunity, 2000, 68(1):247-256). Em particular, uma metodologia usando uma seleção dupla (resistência a um antibiótico e teste - colorimétrico nos discos por á-complementação) permite identificar 2 facilmente inserções de oligonucleotídeos (que preservam o quadro de leitura) na porção do gene que codifica para o domínio catalítico N terminal da toxina.

As consequências funcionais dessas mutações na atividade catalítica da toxina pode ser facilmente analisadas, tanto geneticamente Y (complementação funcional! de uma cepa E coli cya) quanto . bioquimicamente (caracterização da estabilidade da adenilciclase modificada, de sua atividade enzimática, de sua interação com caM, etc.). Esta metodologia tem permitido que um grande número de mutações seja classificado a fim de identificar os sítios que são potencialmente vantajosos para a inserção de determinantes antigênicos.

Sítios permissivos da adenilato ciclase Bordetella Pertussis que permitem translocação de domínio catalítica CyaA e consequentemente translocação de sequências de aminoácidos inseridas em tais sítios permissivos incluem, mas sem limitações, 137-138 resíduos (Val-Ala), 224- 225 resíduos (Arg-Ala), 228-229 resíduos (Glu-Ala), 235-236 resíduos (Arg- Glu), e 317-318 resíduos (Ser-Ala) (Sebo et al., 1995). Os seguintes sítios —permissivos adicionais são também incluídos nas modalidades da invenção: 107-108 resíduos (Gly-His), 132-133 resíduos (Met-Ala), 232-233 (Gly-Leu), e 335-336 (Gly-Gln) e 336-337 resíduos.

Entretanto, outros sítios permissivos podem ser usados na presente invenção, que podem ser identificados, por exemplo, pelo uso da metodologia indicada anteriormente, especialmente — sítios entre 400 e 1.700 resíduos da proteína CyaA.

Para outra espécie Bordetella sítios —permissivos correspondentes podem ser definidos por comparação de sequências e determinação de resíduos correspondentes.

De acordo com uma outra modalidade, o um ou mais polipeptíideos da sequência de aminoácidos podem também ou alternativamente ser inseridos em a e/ou na outra extremidades - (extremidades) do polipeptídeo da invenção, preferivelmente na extremidade : N terminal do polipeptídeo de CyaA mutante que não tem todo ou parte do — domínio catalítico N terminal da proteína CyaA de Bordetella Pertussis, e : mais particularmente que não tem 1-373 resíduos.

De acordo com uma modalidade específica, a uma ou mais ' sequências de aminoácidos adequadas para elicitar uma resposta imune, são - enxertadas em um resíduo de aminoácido do dito polipeptídeo.

De acordo com a invenção, a “combinação” (ou inserção) de uma sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de CyaA mutante para fornecer um assim chamado derivado de polipeptídeo, também referido como uma “proteína recombinante” ou um “proteína híbrida”, engloba inserção genética — especialmente por tecnologia de DNA. Alternativamente, “combinação” também engloba inserção não genética, incluindo inserção química, por exemplo, acoplamento covalente realizado especialmente em uma extremidade da sequência de aminoácidos, ou acoplamento não covalente. Inserção não genética pode especialmente ser de interesse quando a sequência de aminoácidos a ser inserida for sintética ou semi-sintética.

Métodos para acoplar um medicamento em um polipeptídeo são bem conhecidos na tecnologia e compreendem, por exemplo, ligação de dissulfeto usando sulfidrila ativada por N-piridil sulfonila.

Em particular, é possível enxertar moléculas nos polipeptídeos da invenção por um ligação química ou por inserção genética para — alvejamento in vivo nas Células alvos CyaA, tal como APC, por exemplo, células positivas CDI 16/CD18 e particularmente no citosol das ditas células. Certamente, durante o acoplamento uma molécula correspondente a um dado epítopo da célula T CD8* no domínio catalítico de CyaA destoxificada, tanto por meio de uma ligação de dissulfeto ou por inserção genética, observou-se que a molécula produzida por engenharia pode elicitar resposta CTL específicas in vivo, mostrando por meio disso que o dito epítopo da célula T - CD” é translocado no citosol de células que expressam CD11b. . Em uma modalidade preferida da invenção, o polipeptídeo de CyaA mutante é usado na fabricação de um vetor proteináceo ou na : preparação de uma composição especificamente projetada para iniciar resposta da célula T citotóxica CD8* (resposta CTL) quando a dito resposta À seguir o alvejamento do polipeptíideo de CyaA mutante modificado . (especialmente recombinado ou conjugado) com uma molécula de interesse para células que expressam CD11b, seguido pela translocação da molécula de interesse para o citosol das ditas células que expressam CDI11b, e em particular para células dendríticas mielóides. Neste contexto, a molécula de interesse é ou compreende preferivelmente um epítopo ou um antígeno.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, o polipeptídeo de CyaA mutante é usado na fabricação do vetor proteináceo ou na preparação de uma composição especificamente projetada para iniciar resposta de células CD4* quando a dita resposta seguir o alvejamento da adenilciclase modificada (especialmente recombinada ou conjugada) com uma molécula de interesse nas células que expressam CDI 1b, em particular células dendríticas mielóides. Neste contexto, a molécula de interesse é ou compreende preferivelmente um epítopo ou um antígeno.

Os polipeptídeos mutantes podem também ser usados na fabricação de um vetor proteináceo para alvejamento de um composto profilático ou um terapêutico nas células que expressam CDI11b. Neste contexto, em uma modalidade específica da invenção, a assim chamada molécula de interesse tem um valor profilático ou terapêutico e em particular é um medicamento. O dito composto profilático ou terapêutico e em particular o dito medicamento podem ser quimicamente ou geneticamente acoplados nos polipeptídeo mutante. Método para acoplar um composto a um polipeptídeo são bem conhecidos na tecnologia e compreendem, por exemplo, ligação de dissulfeto usando sulfidrila ativada por N-piridil sulfonila. Em uma - modalidade, uma molécula de interesse é um composto anti-inflamatório que : quando acoplado no polipeptídeo mutante, é especificamente alvejado na — superfície das células envolvidas na resposta inflamatória, tais como células É dendríticas ou neutrófilos. Mais especificamente, apresentação de antígeno para iniciação O de células citotóxicas CD8* seletivas é principalmente realizada por células : dendríticas mielóides.

Dessa maneira, em uma modalidade específica, o polipeptídeo de CyaA mutante usado para a fabricação de vetor proteináceo é uma adenilciclase geneticamente modificada contendo um ou mais molécula(s) quimicamente acoplada(s) por meio de uma ligação de dissulfeto para inserir geneticamente resíduo(s) de cisteína localizado(s) no domínio catalítico do —polipeptídeo de CyaÃ mutante. Certamente, múltiplas moléculas podem ser quimicamente acopladas no polipeptídeo de CyaA mutante por meio de uma ligação de dissulfeto para diferentes resíduos de cisteína localizados em diferentes sítios permissivos no domínio catalítico.

Os polipeptídeos mutantes ou derivados de polipeptídeo de — acordo com a invenção são adequados para uso em terapia ou profilaxia.

Por terapia ou efeito terapêutico entende-se qualquer efeito que seja benéfico par a condição de um paciente, seja ele curativo ou suficiente para limitar os sintomas ou as consequências de uma condição patológica, incluindo limitar a progressão de uma condição patológica. Por — terapia ou efeito terapêutico é também incluída a prevenção do início de ação da condição patológica.

Os polipeptídeos mutantes ou derivados de polipeptídeo de acordo com a invenção são em particular adequados para elicitar uma resposta imune mediada por célula tal como uma resposta imune da célula T ou uma resposta imune da célula B em um hospedeiro que necessita desta. Isto inclui resposta CTL e Th, especialmente Th1, incluindo resposta da célula T CD4* - e/ou resposta da célula T CD8*. . A capacidade de um derivado de polipeptídeos de proteína —CyaA de elicitar uma resposta imune mediada por célula pode ser suficiente õ para prevenir crescimento do tumor in vivo ou ainda para permitir regressão de tumor em um animal. Pode-se também ser aumentada por ativação de " componente inato da resposta imune através de ativação TLR e infra-ativando - o componente regulatório da resposta imune através do o uso de agentes —quimioterapêuticos. A invenção fornece meios que podem permitir que tais resultados sejam obtidos em melhores condições de segurança em decorrência das mutações combinadas E570Q e K860R, que foram selecionadas. A presente invenção é assim também direcionada a métodos terapêuticos compreendendo administração a um paciente animal ou humano

15. do polipeptídeo mutante ou derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção a um paciente a elicitar uma resposta imune da célula T ou uma resposta imune da célula B em um hospedeiro que necessita desta. Os polipeptídeos mutantes ou derivados de polipeptídeo de acordo com a invenção podem em particular ser usados para a prevenção ou o tratamento de uma doença selecionada de neoplasia, cânceres e doenças infecciosas selecionada de doenças induzidas virais, retrovirais, bacterianas ou fúngicas. Em particular, os derivados de polipeptídeo podem ser usados para o tratamento de infecção de HIV em um paciente. É especialmente considerado que em uma modalidade — particular da invenção, o polipeptídeo de CyaA mutante ou derivado de polipeptídeo é adequado para o tratamento de infiltração ou tumores vascularizados versus tumores superficiais ou para o tratamento de tumores metastáticos versus tumores primários, de acordo com o critério clínico aprovado para a classificação de tumores.

Tumores sólidos são especialmente um alvo para o tratamento através do o uso do derivado de polipeptídeo da invenção.

- Entre tumores que podem ser candidatos para o tratamento : com o derivado de polipeptídeo da invenção, os seguintes, para os quais antígenos associados a tumor foram caracterizados, são descritos como ' exemplos: Melanoma, especialmente melanoma metastática; carcinoma : do pulmão; carcinoma da cabeça e pescoço; carcinoma cervical, carcinoma - esofageal; carcinoma da bexiga, especialmente carcinoma infiltrativo da bexiga; carcinoma de próstata; carcinoma de mama; carcinoma colorretal; carcinoma de célula renal; sarcoma; leucemia; mieloma. Para esses vários tipos histológicos de cânceres, mostrou-se que peptídeos antigênicos são especificamente expressos nas amostras de tumor e são reconhecidos por células T, especialmente por células T CD8* ou células T cpa", 1s A invenção diz respeito adicionalmente ao uso de um derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção, para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento de uma doença selecionada de neoplasia, cânceres e doenças infecciosas selecionada de doenças induzidas virais ou retrovirais.

Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo ou derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser administrado ao paciente em combinação com um adjuvante e/ou em combinação com uma outra molécula ou agente terapeuticamente ativo.

No contexto da presente invenção a dita “uma outra molécula ou agente terapeuticamente ativo” é uma que pode ser benéfica para a condição de um paciente a quem é administrada. Ela é especialmente um princípio ativo adequado para uso na fabricação de um medicamento. Ela pode ser um composto adequado tanto para potencializar, aumentar quanto modular o efeito de um terapeuticamente princípio ativo.

O polipeptideo CyaA mutante ou o polipeptídeo derivado deste pode ser administrado com uma molécula terapeuticamente ativa ou . agente, em particular um adequado para elicitar uma resposta imune em um . paciente. ! 5 Em particular, polipeptídeo CyaA mutante ou o polipeptídeo : derivado deste pode ser administrado com um agente terapeuticamente ativo adequado para modular uma resposta celular em um paciente, em particular diminuindo ou bloqueando capacidade imunossupressiva de células T . regulatórias De acordo com uma modalidade particular da invenção, um efeito como esse em uma resposta de célula regulatória pode ser obtido com um agente que modula uma célula T regulatória e/ou que modula uma outra resposta supressiva celular, tal como a resposta celular supressiva de mielóide, o dito agente alvejando as ditas células regulatórias, especialmente células T, esgotando ou inativando essas células (tal como com anticorpo específico de CD25, ou ciclofosfamida), alterando o tráfego das ditas células, especialmente células T regulatórias (tal como anticorpo específicos de CCL22) ou alterando diferenciação e sinalização das ditas células (tal como bloqueando sinal FOXP3 (forkhead box P3)).

De acordo com uma modalidade particular da invenção, o agente que modula uma resposta de célula regulatória alveja moléculas supressivas, especialmente tais moléculas presentes no APCs (tal como B7- HI, B7-H4, IDO (indoleamina 2,3-dioxigenase) ou arginase) ou nas células T (tal como CTLAA (antígeno associado a linfócito T citotóxico 4) ou PDI (morte celular programada 1)), ou alveja moléculas imunosupressivas solúveis (tal como beta TGF (fator de crescimento de transformação), IL-10, VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), COX2 (ciclo-oxigenase 2)).

Como exemplos de agentes tendo um efeito em uma resposta de célula regulatória, agentes citotóxicos são propostos, que podem matar células T regulatórias ou outras células imunosupressivas, ou que podem bloquear sua atividade e/ou desenvolvimento e/ou acúmulo. - Em uma modalidade particular da invenção, o agente que : modula a resposta de célula regulatória, especialmente uma resposta da célula T regulatória é um agente quimioterapêutico.

Especialmente ele é | selecionado entre agentes quimioterapêuticos conhecidos como agentes anticancerígenos e usados em quimioterapia.

Tais agentes incluem aqueles que ajudam a reduzir a carga do tumor, aqueles que agem aumentando a . sensibilidade de células do tumor para tratamento ou aqueles que permitem matança ou inativação células regulatórias imunes.

Os agentes quimioterapêuticos usados no quadro da invenção aumentam por meio disso a imunidade antitumor.

Em uma modalidade particular da invenção, o agente quimioterapêutico é um agente alquilante.

Especialmente, é ciclofosfamida 15º (CTX) (Sigma, Steinheim, Germany). Ciclofosfamida é capaz de esgotar ou inativar células T regulatórias.

Em uma outra modalidade particular da invenção, o agente quimioterapêutico é um agente intercalante.

Em uma modalidade particular, o agente quimioterapêutico é —Doxorubicina (DOX) (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). O agente quimioterapêutico é vantajosamente administrado por doses baixas.

O polipeptídeo CyaA mutante ou o polipeptídeo derivado deste pode também ser administrado com um componente adjuvante, — adequado para ativar a resposta imune inata iniciada por um tumor em um paciente.

Em uma modalidade particular da invenção, o componente adjuvante é selecionado no grupo de componentes que consiste em ácidos nucléicos, peptidoglicanos, carboidratos, peptídeos, citocinas, hormônios e moléculas pequenas, em que o dito componente adjuvante é capaz de sinalizar através de receptores de reconhecimento padrão (PRRs). - PRRs são conhecidos para mediar a resposta imune inata para - patógenos, e para tumores, por reconhecimento das assim chamadas assinaturas evolucionariamente conservadas dos patógenos (padrão de ' molécula associada a patógeno, PAMPs). PRRs são presentes em uma variedade de células imune incluindo células dendríticas, células matadoras ' naturais, células B, e também em algumas células não imunes tais como - células epiteliais ou células endoteliais. PRRs e seu envolvimento na resposta imune inata são descritos em Pashine A. et al (Nature medicine supplement volume 11, Nº 4, April 2005).

Em particular, um componente adjuvante para a ativação da resposta imune inata pode alvejar PRRs e portanto ativar sinalização através de PRRs, em que os ditos PRRs englobam receptores tipo Toll ou domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeo (NOD) ou lectina tipo C.

Em uma modalidade particular da invenção, o componente adjuvante é um agonista do receptor tipo Toll (TLR). O agonista do receptor tipo Toll é especialmente formulado para ativar eficientemente o sistema imune inato de um paciente. O dito agonista do TLR é capaz de ligar o TLR, isto é,é um ligante do TLR e é além disso, capaz de aumentar a resposta imune elicitada sob controle do dito TLR.

Para ilustração, agonistas do TLR são selecionados do grupo de agonistas TLR-9, TLR-8, TLR-3 e TLR-7. Entretanto, agonistas de outros receptores do TLR podem ser usados para realizar a invenção, tal como — agonistas dos receptores do TLR2, TLRA4, TLRS5.

O agonista do TLR usado na invenção pode ser um agonista natural ou um sintético. Ele pode ser uma combinação de diferentes agonistas do mesmo ou de diferente receptores tipo toll.

De acordo com uma modalidade particular da invenção, o agonista do TLR é um sequência de nucleotídeo imunoestimulatória, especialmente um sequência de nucleotídeo estabilizada, por exemplo, ' estabilizada em decorrência de modificação da estrutura tal como modificação : de fosforoticato.

A sequência de nucleotídeo pode também ser protegida — contra degradação por formulação específica.

Especialmente formulação de | lipossomo desses, por exemplo, suspensão de lipossomo, pode ser vantajosa para a administração eficiente da sequência de nucleotídeo imunoestimulatória. . Em uma modalidade particular da invenção, a sequência de ácido nucléico imunoestimulatória é um RNA de fita única.

Em uma modalidade particular da invenção, a sequência de nucleotídeo imunoestimulatória compreende um motivo CpG e especialmente é um oligonucleotideo CpG (CpG ODNs). Como um exemplo de oligonucleotídeos CpG adequados, a invenção diz respeito a ligantes TLR-9 tal como CpG ODN Tipo A, isto é, CpG 2216 tendo a sequência de nucleotídeo 5*-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3"' ou CpG ODN Tipo B, isto é, CpG 1826 tendo a sequência de nucleotideo 5*- TCCATGACGOTTCOTGACGOTT=3", Oligonucleotíideo CpG pode ser usado depois de ser —complexado com DOTAP (Roche Manheim, Germany), a fim de protegê-lo contra degradação e facilitar sua captação.

De acordo com uma outra modalidade particular da invenção, o agonista do TLR é uma molécula pequena.

Moléculas pequenas adequadas como agonistas de TLR, por exemplo, são derivados de imidazoquinolina amina, tal como o um chamado R848 (resiquimod), isto é, 4-amino-2- etoximetil-a,a, dimetil-1-H-imidazo[4,5c]quinolina -1-etanol disponível pela Invivogen, como ligante de TLR-7, ou o um chamado R837 (imigimod) disponível pela Aldara como agonista de TLR-7. Outras moléculas adequadas como agonistas de TLR são poliuridina (pU) como ligante de TLR-3, ou ácido policitidílico (PIC) como ligante de TLR-7. - Essas moléculas podem ser formuladas para facilitar sua 2 captação e/ou protegê-la da degradação. Essas moléculas podem também ser — preparadas como uma formulação de lipossomo, especialmente como uma ' suspensão de lipossomo, para administração a um paciente. De acordo com uma outra modalidade particular da invenção, : o componente adjuvante pode ser um componente adjuvante a base de célula. .: Um exemplo desse são células dendríticas que são conhecidas para ser capaz de iniciar resposta linfócitas, tais células dendríticas sendo possivelmente condicionadas ex vivo antes de sua administração, a fim de aumentar sua atividade de estimulação da resposta da célula T. Células dendríticas podem consequentemente ser estimuladas com adjuvantes que interagem com os PRRs, incluindo ligantes ou agonistas de TLR (Pashine A. et al Nature

15. Medicine Supplement Volume 11, Nº4, April 2005 p S63-S68). Alternativamente, o polipeptídeo ou derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser administrado ao paciente sem um adjuvante. Certamente os inventores previamente mostraram que CTL específico para o antígeno vetorizado pode ser iniciado in vivo depois de uma injeção intravenosa única da toxina recombinante, especialmente sem necessidade de fornecer um adjuvante heterólogo. Esses resultados e em particular o alvejamento específico do epítopo para células dendríticas mielóides permitem desviar a exigência de adjuvante e ajuda a célula T CDS. Portanto, a invenção também diz respeito ao uso de um polipeptideo de CyaA mutante recombinado com uma molécula e especialmente um peptídeo de interesse para a preparação de uma composição formulada para administração intravenosa e permite uma resposta imune da célula T CD8* in vivo, a dita composição sendo livre de um adjuvante heterólogo. A invenção também diz respeito a esta composição como tal. A presente invenção é adicionalmente direcionada aos . métodos terapêuticos compreendendo administração do polipeptídeo mutante : ou derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção a um paciente animal ou humano que sofre de uma doença selecionada de neoplasia, cânceres e : doenças infecciosas selecionadas de doenças induzidas virais, retrovirais, bacterianas ou fúngicas.

Í O polipeptídeo mutante ou derivado de polipeptídeo pode em - particular ser administrado com uma molécula terapeuticamente ativa e/ou um adjuvante.

O polipeptídto de CyaA mutante ou o derivado de polipeptídeo, a molécula terapeuticamente ativa e/ou um adjuvante podem ser administrados juntos como parte de uma composição farmacêutica que adicionalmente compreende um carreador ou excipiente(s) farmaceuticamente —aceitável(s).

Alternativamente, os vários tipos de moléculas descritas aqui para realizar a invenção usada, podem ser administrados separadamente tanto simultaneamente no momento (especialmente para o polipeptídeo de CyaA mutante ou o derivado de polipeptídeo e o adjuvante) quanto separadamente —nomomento (especialmente para o polipeptídeo de CyaA mutante).

A administração da molécula terapeuticamente ativa pode alternativamente ser realizada antes e depois da administração do polipeptídeo de CyaA mutante ou o derivado de polipeptídeo e/ou o adjuvante. Ela pode também ser sequencial no momento.

Um regime particular que pode ser adotado é um protocolo de administração repetida, especialmente em um protocolo que engloba duas rodadas ou mais de administração de pelo menos um dos compostos selecionados do polipeptídeo de CyaA mutante ou o derivado de polipeptídeo, o agente e/ou o adjuvante terapeuticamente ativo.

A invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo de CyaA mutante ou um T derivado de polipeptídeo de acordo com a invenção, um carreador ou : excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(s), e opcionalmente um adjuvante —e/ouuma outra molécula terapeuticamente ativa.

A invenção também diz respeito a um estojo de partes compreendendo o polipeptideco de CyaA mutante ou o derivado de É polipeptídeo, uma molécula e/ou um adjuvante terapeuticamente ativo. - Os compostos do estojo de partes ou a composição da invenção podem especialmente ser dados ao paciente através de administração intravenosa, administração intratumoral ou administração subcutânea.

O estojo de partes da invenção ou a composição tem a capacidade de alvejar (1) o resposta imune adaptativa, através do polipeptídeo deCyaÃ mutante ou o derivado de polipeptídeo revelado no presente pedido, (ii) infrarregular a resposta imune regulatória através do agente terapeuticamente ativo, e se o adjuvante estiver presente, alvejar (iii) o componente inato da resposta imune, ativando a dita resposta inata através do adjuvante.

A invenção também diz respeito a um método de tratamento de um paciente que necessita deste, tanto um paciente humano quanto um animal, compreendendo a etapa de administrar os componentes do estojo de partes ou da composição aqui revelada.

A invenção em particular também diz respeito a uma composição imunogênica inédita formulada para administração, especialmente administração intravenosa, em um hospedeiro animal ou humano, caracterizado em que ela compreende um CyaA recombinante derivada de polipeptídeo que compreende um antígeno inserido no domínio catalítico.

A invenção diz respeito adicionalmente a uma composição farmacêutica formulada para administração em um humano ou um animal para alvejar uma molécula de interesse especificamente para células que : expressam CDI11b caracterizado em que a dita molécula de interesse é —acopladaa um polipeptídeo de CyaA mutante da maneira descrita aqui.

| Em uma outra modalidade específica, a composição farmacêutica ou imunogênica compreende uma construção de ácido nucléico : que codifica a CyaA recombinante derivada de polipeptídeo compreendendo r um polipeptídeo de CyaA mutante da maneira definida aqui acoplado a uma molécula de interesse.

Além disso, a invenção também diz respeito ao uso da composição imunogênica da maneira definida anteriormente para a preparação de uma vacina ou uma composição imunoterapêutica, para administração a um hospedeiro animal ou humano.

Da maneira usada, o termo “composição imunoterapêutica” diz respeito a uma composição que leva a uma resposta imunológica e que é associada com tratamentos terapêuticos, tais como tratamento contra neoplasia, cânceres, infecção viral, infecção fúngica, infecção por parasitas ou infecção bacteriana.

A invenção diz respeito adicionalmente a um método para imunizar um hospedeiro animal ou humano, em que o dito método compreende as etapas de: a) fornecer uma composição imunogênica da maneira definida anteriormente; b) administar a ditit composição imunogênica, preferivelmente por meio da via intravenosa, ao dito hospedeiro a fim de promover uma resposta imune.

Em particular, as composições imunogênicas da invenção são capazes de induzir ou estimular, in vivo ou in vitro uma resposta celular imune que envolve especificamente células dendríticas. As composições imunogênicas da invenção podem em particular ser usadas para vacinação ' preventiva ou terapêutica de um paciente. : Em decorrência disso, em uma modalidade específica, a composição imunogênica ou farmacêutica é vantajosamente isenta de adjuvantes de iniciação comumente usados na tecnologia, tal como hidróxido de alumínio.

A invenção diz respeito adicionalmente a um método para a : preparação de um vetor proteináceo adequado para a dispensação de uma molécula de interesse em uma célula compreendendo ligar a molécula de interesse a um polipeptídeo de CyaA mutante da maneira definida aqui.

A invenção diz respeito adicionalmente a moléculas de ácido nucléico, em particular moléculas de DNA ou RNA, que codificam um polipeptídeo ou derivado de polipeptídeo da maneira definida anteriormente.

ss A invenção também diz respeito a células eucarióticas ou procarióticas que compreendem as moléculas de ácido nucléico da maneira definida anteriormente.

A invenção também diz respeito a células eucarióticas, preferivelmente células de mamífero, que compreendem um polipeptídeo de CyaA mutante ou derivado de polipeptideo da maneira definida anteriormente. Em uma modalidade preferida, as células são células humanas.

A invenção diz respeito adicionalmente a células eucarióticas, preferivelmente células de mamífero, transformadas com o vetor proteináceo da maneira definida anteriormente.

Figuras Figura 1. Substituições nos domínios formadora de poros e acilação sinergizam na diminuição da atividade hemolítica específica de CyaA. (A) Eritrócitos de ovelha (S6x10ºmL) em tampão TNC foram incubados com 5 ug/mL de proteínas CyaA enzimaticamente ativas a 37 ºC.

Depois de 30 minutos, alíquotas de suspensões de células foram lavadas repetidamente para remover CyaA não ligada e usadas para determinar a ' quantidade de atividade AC invasiva da célula e associada a célula.

Atividade ; hemolítica foi medida depois de 5 horas de incubação como a quantidade de — hemoglobina liberada por determinação fotométrica (Asa). Atividade de S CyaA intacta foi 100 %. (B) Eritrócitos foram incubados como anteriormente com as concentrações indicadas de o proteínas derivadas de CyaÃ À enzimaticamente ativas por 30 minutos, lavados, e a quantidade de atividade r de enzima AC associada a célula foi determinada. (C) A atividade de ligação celular reduzida de proteínas com as substituições K860R foi compensada para aumentar sua concentração de 5 ug/mL para 25 ug/mL.

Atividades na presença de CyaA/2330VA (CyaA/OVA) foram consideradas 100 % do valor.

Os resultados representam valores médios de pelo menos três experimentos independentes realizados em duplicatas.

Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (**, p< 0,001) das atividades de

CyaA (Figura 1A) ou CyaA/OVA (Figura 1C). Figura 2. CyaA/OVA/ESTOQ+K860R liga e transloca nos monócitos CDI1b*. (A) Células J774A.1 (10º/mL) foram incubadas em D- MEM por 30 minutos a 4 ºC com 2,5 ug/mL de CyaA, lavadas repetidamente, ea quantidade de atividade AC associada a célula foi determinada em lisatos celulares.

Para bloquear o receptor CD11b/CD18, células foram incubadas por 30 minutos com o anticorpo específico de CD! 1b M1/70 (Exbio, Czech Republic) a uma concentração final de 10 ug/mL antes da adição de CyaA (**, p< 0,001). (B) A capacidade de translocação do domínio AC de — construtos foi avaliada como a capacidade de penetrar células e converter ATP citosólico em cAMP.

Células J774A.1 foram incubadas com construtos CyaA por 30 minutos a 37 ºC e as quantidades de CAMP acumuladas em lisatos celulares foram determinadas (41). Como um controle, o receptor CDI1b/CDI8 foi bloqueado com o anticorpo anti-CD11b M1/70 conforme anteriormente. Penetração da membrana de ligação de CD11b/CD18 e toxina endocitosada foi controlada usando a variante CyaA/ESTO0K+ES81P duplamente mutada, que é intacta para ligação do receptor mas não consegue . translocar o domínio AC através da membrana celular e eleva as — concentrações de cAMP citosólico (Vojtova-Vodolanova et al., 2009). (C) ' Células 1774A.1 foram carregadas com a sonda fluorescente sensível K* PBFI/AM a concentração externa final 9,5 uM e 25 ºC por 45 minutos na | presença de Pluronic F-127 [0,05 % (peso/peso)]. As células foram lavadas - em HBSS antes de 3 ug mL ' das toxinas indicadas serem adicionados. Razão da intensidade de fluorescência de PBFI (comprimento de onda de excitação 340, comprimento de ondas de emissão 450 e 510 nm) que reflete a concentração K* intracelular foi registrada a cada 15 segundos. A escala da direita mostra valores intracelulares [K'] derivados de experimentos de calibração (ver Experimental procedures). Nenhuma lise celular, avaliada como liberação de lactato deidrogenase, foi observada no intervalo de tempo do ensaio. Resultados representativos de três determinações independentes realizadas em duplicatas são mostrados. Figura 3. Toxóide ES7TOQ+K860R não permeabiliza células J774A.1. (A) Lise de células J774A.1 foi determinado como a quantidade de lactato deidrogenase liberada das células 10º por 3 horas de incubação com 3, 10 e 30 ug mL” da proteína indicada a 37 % em DMEM sem soro. Os resultados representam a média de valores obtidos em dois experimentos realizados em duplicatas. (B) Medições de clampeamento de canais iônicos da célula total foram realizadas nas células J774A.1 únicas à temperatura —ambiente expostas a 1 ou 10 ug/ mL de proteínas CyaA/2330VA/AC' ou CyaA/2330VA/ESTOQ+K860R/AC' da maneira descrita em Materiais e Métodos. As curvas mostradas são representativas de seis determinações em 3 experimentos independentes.

Figura 4. Toxóide com substituições ES70Q+K860R distribui o epítopo da célula T OVA para apresentação por moléculas MHC classe I e indução de CD8* CTLs. (A) BMDC (3 x 10 células/poço) - usadas como APCs foram incubadas na presença de concentrações indicadas : (0 a 60 nM) dos toxóides que hospedam o epítopo OVA ou com CyaA/AC falso. Mediante co-cultura por 24 horas com células T B3Z (1 x 10 ! células/poço), secreção IL-2 pelas células B3Z estimuladas foi determinada pelo método de proliferação de CTLL. Resultados são expressos como Acpm ' de [ºH]Jtimidina incorporada (cpm na presença de toxóide - cpm na ausência - de toxóide) +SD e são representativos de cinco experimentos independentes. (B) Análise da indução de resposta CTL específica de OVA (SIINFEKL)- por ensaio de matança in vivo. No dia 0, camundongos receberam 50 ug i.v. de toxóides AC- ou OVA/AC falsos e no dia 7, eles foram injetados i.v. com um mistura (1:1) de esplenócitos CFSE""º carregados e CFSE”** não carregados de peptídeo OVA (SIINFEKL). O número de células positivas CFSE restantes no baço depois de 20 horas foi determinado por análise FACS, como documentado para um ensaio de matança in vivo representativo na montagem do painel superior de gráficos, onde porcentagens de células nas portas são indicadas. O painel menor mostra resultados agrupados de ensaios de matança in vivo para três experimentos independentes. Significância estatística foi determinada pelo teste t Student (p= 0,75 para OVA/AC vs.

OVA/ESTOQ+K860R/AC).

Figura 5. Modelo de ação de CyaA na membrana. (A) O modelo prediz um equilíbrio entre dois conformadores de CyaA em solução, cada qual deles inserindo na membrana celular em uma conformação — diferente. Um produziria um precursor de translocação de CyaA monomérico, dispensação do domínio AC no citosol e influxo concomitante de íons de cálcio nas células. O conformador seria inserido como precursor do poro que oligomeriza em um poro de CyaA. (B) O feito sinérgico das substituições ESTOQ e K860R bloquearia seletivamente a capacidade de precursores do poro de CyaA de oligomerizar em um poro, enquanto a capacidade de precursores de translocação de dispensar o domínio AC através da membrana ' permaneceria não afetada. : Figura 6. Sequência de aminoácidos da toxina CyaA de —BordetellaPertussis (SEQID Nº1) : Figura 7. Sequência de aminoácidos do CyaÃ mutante/E570Q+K860R de Bordetella Pertussis (SEQ ID Nº2) | Figunra 8 Sequência de aminoácidos do CyaÃ t mutante/ES70Q+K860R/AC' de Bordetella Pertussis (SEQ ID Nº 3) Figura 9. Sequência de aminoácidos do CyaÃ mutante/233O0VA/ESTOQ+K860R/AC' de Bordetella Pertussis (SEQ ID Nº 4) Figura 10. Plasmídeo que codifica o CyaÃ mutante/ES70Q+K860R/AC (QR-AC). Figura 11. Sequência de DNA do plasmídeo QR-AC' que codifica o CyaA mutante/ES70Q+K860R/AC' (SEQID Nº 5) Figunra 12. Plasmídeo que codifica o CyaÃ mutante/233OVA/ES70Q+K860R/AC' (OVA-QR-AC). Figura 13. sequência de DNA de plasmídeo OVA-QR-AC' que —codificaoCyaA mutante/2330VA/ES70Q+K860R/AC' (SEQ ID Nº 6) Figura 14. Sequência de aminoácidos da toxina CyaA de Bordetella parapertussis (número de acesso CAB76450, SEQ ID Nº) Figura 15. Sequência de aminoácidos de toxina CyaA de Bordetella hinzii (número de acesso AAY57201, SEQ ID Nº8) Figura 16. Sequência de aminoácidos da toxina CyaA de Bordetella bronchiseptica (número de acesso CAASS481, SEQ ID Nº9) Exemplos Toxina da Adenilato Ciclase Transloca Através da Membrana Celular Alvo sem Formar um Poro

Materiais e Métodos Construção, Produção e Purificação de Proteínas CyaA. As modificações que levam construtos CyaA/AC', CyaA/2330VA, CyaA/ES570Q . e CyaA/K860R foram previamente descritas (13, 20, 21) e foram introduzidas ' 5 em CyaA/233OVA/AC individualmente ou em combinação. As proteínas ' derivadas de CyaÃ foram produzidas em E. coli XL-1 Blue e purificadas até quase a homogeneidade como previamente descrito (29). Durante a P cromatografia hidrofóbica, a resina com toxina ligada foi repetidamente ' lavada com 60 % de isopropanol (30) para reduzir o teor de endotoxina de amostras de CyaA abaixo de 100 IU/mg de proteína, conforme determinado pelo ensaio LAL QCL-1.000 (Cambrex).

Uma cepa de Escherichia coli XLI-Blue (Stratagene) contendo o plasmídeo QR-AC' (figura 10) que codifia o CyaÃ mutante/ES70Q+K860R/AC' foi depositada em 18 de março de 2009 no CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, França) com o número de acesso CNCM 1-4136 (figura 10). A sequência de DNA do plasmídeo QR-AC- (SEQ ID Nº5) é revelada na figura 11. Uma cepa de Escherichia coli XLI-Blue (Stratagene) contendo o plasmídeo OVA-QR-AC- (figura 12) que codifica o CyaA —mutante/2330VA/ESTOQ+K860R/AC foi depositada em 18 de março de 2009 no CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, França) com o número de acesso CNCM 1-4137. A sequência de DNA do plasmídeo OVA-QR-AC- (SEQ ID Nº 6) é revelada na figura 13. Ligação Celular e Atividades Hemolíticas nos Eritrócitos — de Ovelha. Eritrócitos de ovelha lavadas 5x10º em Tris 50 MM pH 7,4, NaCl 150 mM e CaCl,; 2 mM (tampão TNC) foram incubados a 37 ºC com 5 ug/mL de proteínas de CyaA e ligação celular, AC invasiva da célula e atividades hemolíticas de CyaA foram determinados da maneira descrita com detalhes previamente (13). Significância de diferenças em valores de atividade foi analisada usando uma análise de variância a um fator (ANOVA) com pós-teste Bonferroni (SigmaStat v. 3.11, Systat, San Jose, CA). ' Capacidades de Ligação de Macrófago, Elevação de CAMP : e Lise Celular de CyaA. Monócitos/macrófagos de murino J774.Al (ATCC, —número TIB-67) foram cultivados a 37 ºC em uma atmosfera de ar/CO, (19:1) j umidificada em meio RPM! suplementado com soro bovino fetal inativado termicamente 10 % (v/v), penicilina (100 TU mL”), estreptomicina (100 ug mL”) e anfotericina B (250 ne mL”). Antes dos ensaios, RPMI foi substituído com meio de Eagle modificado pela Dulbecco (DMEM) (1,9 mM Ca2”) sem ECSeas células descansaram naturalmente em DMEM por 1 hora a 37 ºCem uma atmosfera de CO, umidificada 5 % (8). Macrófagos J774A.1 (105) foram incubados em D-MEM com 2,5 ug/mL de variantes de CyaA por 30 minutos a 4 ºC, antes da remoção de toxina não ligada por três lavagens em D-MEM. Células foram lisadas com 0,1 % de Triton X-100 para determinação de atividade AC ligada na célula. Para ensaios intracelulares de cAMP, células 10º foram incubadas com CyaA por 30 minutos em D-MEM com 100 uM de IBMX (3-isobutil-1 -metilxantina), a reação foi interrompida por adição de 0,2 % de Tween-20 em HCl 100 mM, as amostras foram fervidas por 15 minutos a 100 ºC, neutralizadas por adição de 150 mM de imidazol não tamponado e cAMP foi medido da maneira descrita (29). Para bloquear o receptor CDI 1L/CDI8, células foram pré-incubadas por 30 minutos no gelo com o bloqueio específico de CD11b MAb M1/70 (Exbio, Czech Republic) a uma concentração final de 10 ug/mL antes da adição de CyaA. Lise induzida por toxina de células J774A.1 foi determinado usando o ensaio do estojo CytoTox — 96 (Promega) como a quantidade de lactato deidrogenase liberada de células 10º em 3 horas de incubação com 10 ug/mL da proteína apropriada a 37 ºC em D-MEM da maneira descrita (8). Significância de diferenças em valores de atividade foi analisada conforme anteriormente.

Medições de Clampeamento de Canais Iônicos. Medições de clampeamento de canais iônicos da célula total foram realizadas nas células J774A.1 banhando em HBSS (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl,2 x mM, MgCl;33 mM, Hepes-Na 10 mM, glicose 50 mM; pH 7,4), Pipeta de ? vidro polida com chama com diâmetro externo de cerca de 3 um foram cheios —com uma solução de gliconato de potássio 125 MM, KCl 15 mM, CaCl, 0,5 ' mM, MgCLl1 EGTA mM, 5 mM, HEPES-KOH 10 mM pH 7,2. As resistências resultantes dos microeletrodos foram 3 a 5 MO. As células foram ] clampeadas a -40 mV, os dados foram filtrados a 1 kHz e digitalizados a 2 ' kHz usando amplificador Axopatch 200A, digitador Digidata 1320A e pacote desofiwarePClamp-9 (Axon Instruments, Foster City, CA). Determinação de diminuição de concentração de xK citosólico. Células crescidas nas lamínulas de vidro foram lavadas em HBSS e carregadas com 9,5 uM de éster acetoximetílico PFBI (PBFIAM, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) por 30 minutos a 25 ºC na presença de 0,05% (peso/peso) de Pluronic F-127 (Sigma, St.Louis, MO), no escuro. Medição racionétria foi realizada a 25 ºC usando um espectrofluorímetro FluoroMax-3 (Jobin Yvon Horriba, França) equipado com software DataMax. A intensidade de fluorescência de PBFI (comprimento de onda de excitação 340, comprimento de ondas de emissão 450 e 510 nm) foi registrada a cada 15 segundos e o tempo de integração para cada comprimento de onda foi 3 segundos. A razão de comprimento de ondas 450/510 nm é mostrada. A área observada de cobertura montada na cubeta de 1 cm foi cerca de 10 mm, correspondente a aproximadamente 10º células. Experimentos de calibração foram realizados em HEPES 50 mM, pH 7,2, com concentrações variadas de — Acetato de Potássio (10, 30, 60 ou 140 mM) e Acetato de Sódio (135, 115, 85 ou 5 mM), respectivamente, nas células permeabilizadas por 30 minutos com valinomicina 3 pM ou nigericina. A razão de intensidade final (450/510 nm) é mostrada no eixo vertical a direita dos gráficos.

Camundongos e Linhagens Celulares. Fêmeas C57BL/6 obtidas de Charles River Laboratories foram mantidas em condições sem patógeno específicas e manipuladas de acordo com diretrizes institucionais. - Células CTLL-2 foram obtidas pela ATCC.

B3Z, um hibridoma de célula T . específica de CD8* específico para o epítopo Kº? OVA (SIINFEKL) restrito, ' 5 — foiprovido por N.

Shastri (University of California, Berkeley) e mantido na : presença de G418 1 mg/mL e higromicina B 400 ug/mL em meio RPMI 1640 completo (Invitrogen Life Tecnologias) com FCS termicamente inativado 10

: %, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 ug/mL, e 5x 10º M 2-ME. - Estudos de Apresentação de Antígeno.

Células dendríticas da medula óssea (BMDC, 3 x 10º por poço) usadas como APCs foram incubadas na presença de várias concentrações (0 a 60 nM) de CyaA/OVA/AC' recombinante que carregam o epítopo OVA (SIINFEKL) ou CyaA/AC' falso e cocultivadas por 24 horas com células T B3Z (1 x 10º por poço), reconhecendo seletivamente os complexos MHC classe I de OVA 15º SIINFEKL/H-2K". Depois de 18 horas de cultura, sobrenadantes foram congelados por pelo menos 2 horas a -80 ºC.

A quantidade de IL-2 produzida pelas células B3Z estimulada foi então determinada pelo método de proliferação CTLL.

Resumidamente, 10º células da linhagem CTLL dependente de IL.-2 por poço foram cultivadas com 100 ul de sobrenadante em7200 ul de volume final.

Vinte e quatro horas depois, [H]-timidina (50 unCi/poço) foi adicionada e as células foram colidas 6 horas depois com um colhedor de célula automatizado. [ºH]-timidina incorporado foi detectada por contagem de cintilação.

Cada ponto foi feito em duplicata e o experimento foi repetido cinco vezes.

Resultados são expressos em Acpm de [H]-timidina

— incorporada (cpm na presença de toxóide - cpm na ausência de toxóide). Ensaio de Matança In vivo.

Para iniciação de CTL, camundongos foram imunizados por injeção iv. com 50 ug de CyaA/OVA/AC' recombinante que carrega o epítopo OVA (SIINFEKL) ou CyaA/AC' falso.

Sete dias depois da imunização, esplenócitos singênicos naive foram pulsados com peptídeo OVA (SIINFEKL) (10 ugmL) (30 minutos, 37 ºC), lavados extensivamente e marcados com uma alta : concentração (1,25 uM) de carboxifluorosceína éster succinimidílico (CFSE; : Molecular Probes, Eugene, OU). A população controle não pulsada foi marcada com uma baixa concentração (0,125 uM) de CFSE. Células : CFSE“º.e CFSEM**. marcadas foram misturadas em uma razão 1:1 (5x 10º células de cada população) e injetadas i.v. em camundongos. Células do baço i foram oras 20 h depois, lavadas e ressuspensas em tampão FACS (PBS . suplementado com BSA 1 % e NaN30,1 %). O número de células CFSE- positivas que permaneceu no baço depois de 20 horas foi determinado por FACS. A porcentagem de lise específica foi calculada como a seguir: porcentagem de lise específico = 100 — [100 x (% de camundongos imunizados CFSE*"*/% camundongos imunizados CFSE”**)/(% camundongo naive CESE** /&camundongo naive CFSE”*].

Análise Estatística: Significância de diferenças em valores foi analisada usando uma análise de variância a um fator (ANOVA) com pós- teste Bonferroni (SigmaStat v. 3.11, Systat, San Jose, CA).

Resultados Eliminação Combinada de Glutamato 570 Carregado Negativamente e de Lisina Acilada 860 Ablate a Capacidade de Permeabilização da Célula de CyaA. O modelo de operação de ação CyaA de prediz que CyaA pode ser modificada para perder sua atividade formadora de poros (hemolítica) preservando ao mesmo tempo a capacidade de dispensar o domínio AC no citosol de células alvos. Para testar esta hipótese, os — inventores pensaram produzir construtos de CyaA que exibem atividades hemolíticas e citolítica tão baixas quanto possível, baseados na observação prévia de que a capacidade de toxóides CyaA/AC' de lisar células pode ser modulada tanto para cima quanto para baixo por substituições no domínio formadora de poros (8, 12-14, 18). Para permitir avaliação de penetração de célula alvo também para os toxóides CyaA/AC', os inventores derivaram tais mutantes de uma toxina de CyaA/233OVA que foi previamente marcada por ' inserção do peptídeo SIINFEKL de ovalbumina (OVA). Esta variante CyaA : foi escolhida uma vez que a inserção de epítopo da célula T CD8* repórter — restrito a Kº nos 233 resíduos não afeta a atividade AC e permite quantificar : translocação da enzima OVA/AC nas células como elevação de cAMP citosólico.

Mais notadamente, presença do epítopo OVA permite avaliar também a capacidade de toxóides CyaA/2330VA/AC' inativos dispensar : enzimaticamente seu domínio OVA/AC' no citosol de células que apresentam antígeno CDIIb* (APC), uma vez que isto permite processamento de proteossomo e apresentação da superfície celular do epítopo OVA nas glicoproteínas MHC Classe I que podem ser determinadas como estimulação de células T CD8'* específicas de OVA, tanto in vitro quanto in vivo (20). Para gerar toxóides CyaA/AC' que possivelmente não têm a atividade citolítica, os inventores combinaram as substituições ES70Q e K&60R previamente mostradas para reduzir a atividade hemolítica específica de CyaA nos eritrócitos de ovelha, com as substituições ES570Q sendo observadas para reduzir também a atividade citolítica de CyaA/AC' nos monócitos J774A.1 de CDI1b” (8, 13). Essas substituições foram produzidas por engenharia em CyaA/2330VA/AC' individualmente e em combinação e as atividades hemolíticas e citolíticas específicas de toxóides resultante foram comparadas usando eritrócitos de ovelha como CDI11b modelo alvo e J774A.1 como CD11b* modelo alvo em paralelo (Tabela 1). De acordo com resultados obtidos previamente com toxóides que não têm o epítopo OVA (4, 813,21), nas condições usadas os toxóides OVA/AC' que carregam individualmente as substituições ES70Q e K860R exibiram respectivamente uma atividade hemolítica relativa duas vezes reduzidas (55 + 8) e nada (1 + 1) nos eritrócitos e a atividade citolítica relativa dos toxóide ES70Q com relação às células J774A.1 que expressam CD11b foi também reduzida (37 + 10),

comparada com OVA/AC”. Por sua vez, como esperado a partir dos resultados obtidos com um construto K860R enzimaticamente ativo, apesar da baixa atividade hemolítica nos eritrócitos CD11b-, o toxóide K860R exibiu somente . um atividade citolítica relativa ligeiramente reduzida nas células J774A.1 de CDIIb”(72+22%), confirmando que o defeito estrutural causado pelas substituições de K860R foi salvo por interação com o receptor CD11b5/CD18 (4). Apesar disso, quando combinados com E570Q, as substituições de K860R exibiram um feito sinérgico claro em reduzir a atividade citolítica . relativa do construto ES70Q+K860R com relação às células J774A.1 abaixo del4t+7%. Tabela I: Atividades citolíticas de OVA/AC' e derivadas nos eritrócitos de ovelha e macrófagos de J774A.1. í Tise de eritrócitos Tise de Células 1774A.1 Proteína (% de ACY (6 de AC)” AC 100 5 100 10 OVA/AC 93+4 93412 OVA/ESTOQ/AC 55488 37 410% OVA/K860R/AC" 141% T2222*+ OVA-L247Q-AC 9743 41+9 OVA/ESTOQ+K860R/AC" 141 1278 OVA-ESTOQ-L2470-AC sor12 40+11 OVA-K860R-L247Q-AC" 121 52 OVA-ESTOQ-K860R-L247Q-AC 0+1 16+10 Legenda da Tabela Lise” de eritrócitos de ovelha foi determinado depois de 4,5 horas como a quantidade de hemoglobina liberada mediante incubação de Sx10º RBC a 37 ºC na presença de Ca?” 2 mM com 5 ng/ml da dada proteína (31). A atividade hemolítica de CyaA/AC' foi considerada 100 % de atividade.

Os resultados representam a média de valores obtidos em quatro experimentos independentes realizados em duplicatas + S.D com duas diferentes preparações de proteína.

Lise” de células J774A.1 foi determinado como a quantidade de lactato deidrogenase liberada das 10 células por 3 horas de incubação da célula com 10 ug/mL da proteína apropriado a 37 ºC em D-MEM.

Lise celular de J774A.1 por CyaA/AC foi considerado 100 %. Os resultados representam a média de valores obtidos em quatro experimentos separados realizados em duplicatas + S.D com duas diferentes preparações de proteína (*, p < 0,05; **, p < 0,001). Para permitir quantificação de capacidade do construto ESTOQ+K860R de dispensar o domínio AC no citosol das células, as substituições ESZOQ e K860R foram transferidas nos construtos ativos derivados de CyaA/233OVA (CyaA/OVA). Esses foram produzidos e purificados da mesma maneira dos toxóides AC (não mostrados) e caracterizados para capacidades de ligação celular, hemolítica e translocação

So de AC nos eritrócitos de ovelha. Conforme mostrado na Figura 1A e esperado dos resultados com toxinas que não têm o epítopo OVA (4, 13, 21), as õ substituições de E570Q não tiveram nenhum impacto na ligação de eritrócito : ou na capacidade de CyaA/OVA de dispensar o domínio AC no citosol do —eritrócito e reduziu seletivamente somente sua atividade hemolítica relativa. Conforme adicionalmente esperado (4), as substituições de K860R reduziram significantemente a capacidade de CyaA/OVA ligar e penetrar eritrócitos, causando uma redução brusca da atividade hemolítica e AC invasiva da célula relativa dos mutantes E570Q e ES70Q+K860R nos eritrócitos.

Deve-se notar que a atividade hemolítica de CyaA é uma função muito cooperativa da quantidade de CyaA associada a célula (número de Hill >3), sugerindo que oligomerização de CyaA é um pré-requisito para formação de poro (22). Portanto, para avaliar o impacto de substituições de E570Q+K860R combinadas na atividade hemolítica, a perda de capacidade de ligação eritrócito dos construtos K860R teve de ser compensada aumentando sua concentração no ensaio para 25 ug/mL (5 ug/mL para toxina intacta), a fim de obter ligação de quantidades iguais de todas as proteínas nos eritrócitos, conforme mostrado na Figura 1C. Nessas condições a combinação de substituições de ES70Q e K860R exibiu uma clara sinergia em reduzir adicionalmente por um fator de dois as atividades hemolíticas já prejudicadas de construtos que carregam substituições as ES70Q (50 %) e K860R (30 %) individualmente, conforme mostrado na figura 2C. Isto sugere que combinação das substituições afeta a capacidade de permeabilização da célula específica de CyaA.

Atividade formadora de poros de CyaA é Dispensável para Translocação da Membrana do Domínio AC. Ao contrário do impacto das substituições de K860R na atividade de toxina nos eritrócitos, observou-se que tanto as substituições ES70Q quanto K860R foram previamente não têm nenhum efeito na capacidade de CyaA de ligar e penetrar monócitos J774A.1 que expressa o receptor CDI1b/CDI8 (4, 8). Além do mais, conforme documentado na Figura 2, quando as duas substituições foram combinadas na - mesma molécula de toxina, o construto CyaA/OVA/ES70Q+K860R exibiu : um capacidade igual de ligar células J774A.1 (Figura 2A) e de dispensar o : 5 — domínio AC no seu citosol para elevar concentrações citosólicas de CAMP (Figura 2B), tal coma CyaA intacta. Ao mesmo tempo, entretanto, o toxóide ES70Q+K860R duplamente mutado exibiu uma citolítica capacidade relativa cerca de sete vezes reduzida (14 + 7 %) nessas células (cf. Tabela D. : Conforme mostrado na Figura 2C, quando comparado com CyaA intacta, o —construto ES70Q mutado simplesmente e o ES70Q+K860R duplamente mutado foram notadamente prejudicados na capacidade de elicitar diminuição de concentração intracelular de íons de potássio ([K]i) em células J774A.1 tratadas com toxina. Embora nenhuma lise celular tenha sido detectada por 20 minutos pelo ensaio para liberação de lactato deidrogenase, o [K"]i das

15. células J774A.1 expostas a 3 ug mL” de CyaA intacta diminuíram de 140 mM para bem abaixo de 30 mM já em 10 minutos mediante adição de toxina. Por sua vez, quando as mesmas quantidades dos construtos ERS70QIK860R foram usadas (3 ug mL”), os níveis de [K"]í nas células não diminuiu abaixo de 100 mM (Figura 2C). Certamente, efluxo de potássio das células foi previamente mostrado ser a marca registrada de inserção dos precursores de poro de CyaA na membrana celular (32). Isto sugere que a combinação de substituições ES70Q e K860R seletivamente prejudicou somente a capacidade do toxóide de permeabilizar as células J774A.1 e não sua capacidade de translocar o domínio AC através da membrana celular.

Esta conclusão foi adicionalmente sustentada por uma atividade citolítica relativa notadamente reduzida dos toxóides ES7O0Q/AC' e ESTOQ+K860R/AC' correspondentes, conforme discutido anteriormente (Tabela 1) e documentado com detalhes na Figura 3A. O toxóide ESTOQH+K860R duplamente mutado a 3 ug mL” foi de forma essencial

S7 incapaz de provocar qualquer liberação detectável de lactato deidrogenase das Células J774A.1 em 3 horas de incubação, enquanto 20 % de células lisaram

: na presença de quantidades iguais de toxóide intacto. : Para testar isto, os inventores analisaram a capacidade de — permeabilização da célula do construto ESZOQ+K860R em experimento de clampeamento de canais iônicos célula total única.

Aqui, novamente o Toxóides AC- tiveram de ser usados, a fim de evitar o desarranjo massivo das i células J774A.1 provocado por cAMP gerado por toxina (23). Conforme ' mostrado na Figura 3A por um registro representativo de correntes iônicas através das células J774A.1 únicas submetidas a clampeamento de canais iônico expostas a 1 ug/ mL de CyaA/OVA/AC', mediante um atraso inicial de cerca de 3 minutos as células J774A.1 foram progressivamente e de forma massiva permeabilizadas por CyaA/OVA/AC' e as correntes através da membrana celular atingiram -3.000 pA em 10 minutos.

Ao contrário, conforme mostrado na Figura 3B, exposição a CyaA/OVA/ESTOQ+K860R/AC'" — reprodutível causou somente uma permeabilização transiente e mínima inicial das células, com correntes através da membrana celular não excedendo -200 pA e retornando até quase zero em 10 minutos depois da adição de toxóide.

Ilustração bastante similar foi — observada quando concentrações de toxóide foram elevadas a 10 ug mL", que foi a concentração usada para comparações de atividade citolítica relativa de toxóides sumarizadas na Tabela I.

O aumento dez vezes de concentração de 1 a 10 ug mL” resultou em cerca de aumento duas vezes das correntes produzidas através da membrana celular por OVA/AC', embora de forma — essencial nenhuma melhoria de permeabilização da célula tenha sido observada mesma na concentração maior de OVA/ESTO0Q+K860R/AC ' (note a escala expandida de eixo y para medições a 10 ug mL"). Os registros mostrados foram representativos de pelo menos seis determinações de 3 experimentos independentes e demonstraram que a combinação das substituições ES70Q e K860R tiveram um maior impacto na capacidade do toxóide de permeabilizar a membrana das células J774A.1. Dado que a versão . enzimaticamente ativa do mesmo construto foi completamente capaz de . translocar o domínio AC nas células J774A.1 (cf.

Figura 2B), esses resultados E 5 — sugerem fortemente que a atividade de permeabilização da célula (formação de poro) de CyaA não foi exigida para translocação do domínio AC através da membrana celular. ' Atividade de Permeabilização da Membrana de CyaA é - Dispensável para Distribuição de Antígenos Passageiros no Caminho MHC Classe Citosólico.

Uma vez que o ensaio para cAMP citosólico não deve ser usado para avaliação de capacidade de penetração da célula dos Toxóides AC-, o ensaio substituto para sua capacidade de dispensar o epítopo OVA repórter no sítio de processamento citosólico do caminho de apresentação de antígeno MHC classe I foi usado (7, 24). Com esta finalidade, os inventores determinaram a capacidade de células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongo C57BL/6 (BMDCSs), carregadas com o toxóides, estimular a liberação de IL-2 por células T B3Z que reconhecem seletivamente o complexo de moléculas MHC classe I Kº com o peptídeo SIINFEKL (OVA) no APCs.

Certamente, foi previamente mostrado —quea capacidade de toxóides CyaA/AC' de translocar o domínio AC através da membrana citoplásmica no citosol de BMDCs é essencial para a capacidade de toxóides promover apresentação do epítopo OVA distribuído no complexo com as moléculas MHC classe I H-2Kb.

Isto, por sua vez, é essencial para ocorrer estimulação in vitro específica de células T citotóxicas — (29). Apesar disso, foi importante confirmar aqui que dispensação do epítopo OVA para processamento de proteassomo e apresentação subsequente foi devido a translocação do domínio AC no citosol de BMDCs através da sua membrana citoplásmica, e não foi devido a amostragem do antígeno adicionado por captação de fase fluida, ou endocitose.

Com este propósito, foi usada uma variante de toxóide OVA/ESTOK+E581 P/AC' de não translocação duplamente mutado, que leva uma combinação de substituições de reversão : de carga e uma quebra de hélice de glutamatos 570 e 581 no domínio de : transmembrana de CyaA (33). Observou-se que este construto exibiu previamente uma capacidade total de ligar células que expressam CDIIL/CDI8 (cf. Figura 2A), enquanto sua capacidade de translocar o domínio AC através da membrana da célula alvo foi ablada pela combinação ! de substituições E570K e ESS1P (cf. Figura 2B).

Conforme mostrado na Figura 4A, as células de hibridoma B3Z foram efetivamente estimuladas mediante co-incubação com BMDCs carregadas com os toxóides OVAES70Q/AC' e OVA/ESTOQ+K860R/AC.

Ao contrário, não foi observada nenhuma estimulação de B3Z mediante co- incubação com BMDCs carregadas com o toxóide OVA/ESTOK+ES81P/AC defeituoso na translocação do domínio AC através da membrana celular.

15. Além do mais, o toxóides OVA/ES70Q/AC' e OVA/ESTOQ+K860R/AC" induziram estimulação dos linfócitos de B3Z por APCs in vitro toxóide OVA/AC' tanto com alta eficiência quanto intacto. Esses resultados confirmam que o mutante ES70Q+K860R duplo foi completamente capaz de translocar seu domínio AC no citosol de BMDC para processamento e apresentação do epítopo OVA por moléculas MHC classe 1 K”, sendo ao mesmo tempo de forma essencial incapaz de permeabilizar as células J774A.1. Esses resultados sugerem que a atividade de permeabilização da célula (formação de poro) de CyaA nem foi exigida para translocação de domínio AC através da membrana celular, nem desempenhou nenhum papel — nacapacidade de CyaÃ de dispensar epítopos passageiros no citosol de APC.

Para corroborar a capacidade de dispensação de antígeno in vitro observada dos toxóides não citolíticos, os inventores avaliaram sua capacidade in vivo de iniciar linfócitos CD8' T citotóxicos específicos de OVA (CTL). 50 ug dos vários toxóides de OVA foram injetados intravenosamente nos camundongos C57BL/6 e uma semana depois as respostas CTL específicas de OVA foram avaliadas em camundongos " imunizados por um ensaio de matança in vivo. Camundongos C57BL/6 : receberam injeção i.v. de uma mistura (1:1) de esplenócitos CFSE*º — carregados CFSE”*** não carregados, de peptídeo OVA (SIINFEKL) e Í seguido um dia depois por análise FACS de células marcadas por CFSE. Conforme mostrado na Figura 4B, imunização de camundongos com o i toxóide falso não induz nenhuma atividade CTL in vivo específica de : SIINFEKL. Por sua vez, imunização com o toxóide ES70Q+K860R induziu a mesma resposta a matança de CTL in vivo específico de OVA como o toxóide não mutado usado como controle positivo, com a leve diferença nos valores de resposta média aos toxóides intactos e duplamente mutados não sendo estatisticamente significante (p=0,065). Esses resultados mostram que a atividade de permeabilização da célula de CyaA foi dispensável para a capacidade in vivo de os toxóides CyaA/2330VA/AC dispensar um antígeno passageiro inserido com AC no citosol de APCs.

Discussão Os inventores demonstraram aqui que translocação do domínio AC de CyaA através da membrana de receptor de células alvos mielóide que expressam CDI1b/CDI8 não depende de a capacidade da toxina formar poros e permeabilizar a membrana celular.

Conforme sumarizado no modelo proposto na Figura 5, os inventores reportaram previamente que o equilíbrio entre as duas atividades de CyaA pode ser deslocado por mutações ou acilação alternativa de CyaA.

— Melhoria da atividade formadora de poros (hemolítica) a custa da capacidade de dispensar AC nas células foi, certamente, observada mediante substituições de lisina de glutamatos 509, 516 e 581 (13, 18), ou mediante bloqueio de translocação AC pelo anticorpo monoclonal 3D1 (MAb) (25). Por sua vez, foi observado um deslocamento na direção oposta para o r-Ec-CyaÃ recombinante, acilada em E. coli por resíduos de palmitoleíla (C16:1), comparado com a B-CyaA palmitilada nativa (C16:0) produzida por B.

pertussis. Observou-se que r-Ec-CyaA exibe atividade hemolítica cerca de quatro vezes reduzida e atividade formadora de poros cerca de dez vezes —menorem bicamadas de lipídio planar do que B-CyaA (12), embora ambas formas CyaA tenham sido igualmente ativas em penetrar a membrana celular e translocar o domínio AC nos eritrócitos (17, 26). Além do mais, recentemente observou-se que construto CyaA/E570Q exibe uma capacidade | total de dispensar o domínio AC tanto em eritrócitos quanto macrófagos J774Al, exibindo ao mesmo tempo atividade hemolítica reduzida e capacidade de menor formação de poro específica em bicamadas de lipídio planar do que CyaA intacta, com o toxóide CyaA/ES70Q/AC' que exibe uma atividade citolítica duas vezes reduzida nas células J1774A.1 (8, 13).

Apesar do mencionado anteriormente e das muitas CyaAs mutantes que os inventores caracterizaram, permaneceu a questão se a formação de um poro da membrana por CyaA é exigida para translocação do domínio AC através da membrana de células que expressam CD11b. É digno de ser mencionado que, com base em comparações anteriores de potência hemolítica da r-Ec-CyaA intacta com aquela da Bp-CyaA nativa purificada pela B. pertussis, a atividade hemolítica específica do toxóide r-Ec- CyaA/OVA/ES7TOQ+K860R/AC' aqui descrito nos eritrócitos de ovelha seria reduzida por cerca de três ordens de magnitude. A atividade citolítica específica residual de r-Ec-CyaA/OVA/ESTOQ+K860R/AC' nas células que expressam CD1 1b seria então estimadas a ser cerca de 50 vezes menor do que ade Bp-CyaÃ, enquanto a capacidade específica de ambas proteínas de dispensar o domínio AC nessas células seria a mesma (usando r-Ec-CyaA intacta como 100 % de padrão atividade AC invasiva para comparações). O CyaA mutante/233O0VA/ES70Q+K860R aqui descrito é o primeiro construto com uma capacidade notadamente reduzida de permeabilizar células que permanecem completamente capazes de translocar o domínio AC através da membrana celular.

Isto mostra que no caminho para citosol da célula domínio ' AC de translocação pode desviar o poro seletivo de cátion formado por CyaA. : O modo e caminho de translocação do domínio AC através da Ss membrana celular, entretanto, devem ser definidos ainda com mais detalhes.

Dados os efeitos de diferenciação de substituições de glutamatos 509, 516, 570 e 581 nas atividades formadora de poros e dispensação AC de CyaA (8, 13, 18), onde o equilíbrio entre as duas atividades pode ser quase totalmente r deslocadas em qualquer direção por substituições específicas, as hélices —anfifáticas que abrigam esses resíduos de glutamato parecem estar envolvidas em ambas atividades de CyaA de uma maneira alternativa.

Isto é suportado pelo efeito de substituições de ESO9K+ES16K combinadas, que produzem uma CyaA hiper-hemolítica incapaz de dispensar o domínio AC nas células (8, 18), enquanto a combinação de ES7TOQ+K860R aqui descrita produz o oposto, uma CyaA de forma essencial não citolítica que é completamente competente para translocar o domínio AC nas células J774A.1 (CD1 1b)). Essas observações adicionalmente corroboram o modelo proposto que as duas atividades da membrana de CyaA dependeriam de diferentes conformadores inserindo na membrana, um que leva a translocação — do domínio AC por monômeros de toxina e o outro que leva a formação de poros de CyaÃ oligoméricos (13, 18). É proposto que os segmentos da transmembrana que hospedam os 509, 516, 570 e 581 resíduos de glutamato críticos podem participar na formação de um poro citolítico oligomérico e seletivo de cátion somente se o conformador do precursor de poro inserido na — membrana tiver o domínio AC localizado for a da célula.

No conformador de translocação AC, os mesmos segmentos da transmembrana adotariam uma diferente conformação na membrana, sendo potencialmente obstruídos e impedidos de entrar nos oligômeros de CyaA pelo polipeptídeo que liga a extremidade C terminal do domínio AC aos segmentos da transmembrana.

Suporte para esta interpretação pode ser deduzido dos resultados obtidos por Gray e equipe (25). Esses autores mostraram que deleção do domínio AC ' junto com o segmento que o liga no domínio formadora de poros (até 489 À resíduos), ou ligação do anticorpo 3D1 que bloqueia a translocação da — membrana do segmento do domínio AC do terminal localizado entre 373 e ' 399 resíduos, notadamente aumenta a atividade formadora de poros (hemolítica) da toxina.

Isto é provavelmente devido a impor uma | conformação nos segmentos da transmembrana de CyaA que é favorável para - formação dos poros oligoméricos.

Deve-se definir ainda quais segmentos de —CyaA forado domínio formadora de poros são envolvidos em translocação do domínio AC através da membrana.

Dado a exigência para sua integridade estrutural (27), o grande domínio de repetição de RTX (1.006 a 1.706 resíduos) provavelmente deve fazer parte da translocação de AC nas células.

Isto seria dimensionado o bastante (700 resíduos) para formar uma interface de translocação hidrofílica na membrana celular que pode permitir passagem de um domínio AC desdobrado através da membrana, sem uma formação concomitante de um poro de permeabilização da célula real.

Alternativamente, CyaA pode promover formação de estruturas de lipídio invertido não lamelar (fase hexagonal invertida) (28), que pode potencialmente fazer parte de uma interface proteína-lipídio bem selada através da qual o domínio AC poderia deslizar para o citosol da célula.

CyaA, certamente, mostrou previamente promover formação de estruturas lipídio invertidas não lamelares (fase hexagonal invertida) (28). Essas podem potencialmente fazer parte da formação de uma interface — proteína-lipídio bem selada, permitindo assim translocação do domínio AC através da membrana na ausência de permeabilização da célula.

Formação de estruturas de lipídio não lamelares é favorável em balsas lipídicas e CyaA ricos em colesterol, certamente, observou-se recentemente que mobilizam nas balsas em complexo com seu receptor CDI1b/CDI8. Além do mais, os inventores mostraram recentemente que translocação do domínio AC através da membrana é realizada somente mediante relocação de CyaA nas balsas (L., : Bumba, J., Masin, R., Fiser, and P., Sebo, submetido). De maneira intrigante, : translocação da subunidade catalítica de toxina de difteria (DT) através da —membrana celular citoplásmica foi também observada previamente ocorrer sem permeabilização da célula detectável, quando DT foi pulsado nas células por pH baixo mediante ligação em um receptor DT ancorado em GPI | truncado (34). Os autores não examinam se o receptor DT ancorado em GPI localizou no lipídio balsas, mas isto é altamente provável. É, consequentemente, tentador especular que a composição do lipídio específico da membrana da balsa pode suportar translocação de diferentes toxinas de proteína nas células alvos sem a necessidade de formação de uma proteína verdadeira conduzindo permeabilização do poro da célula. Por último, uma descoberta prática reportada aqui é que o toxóide CyaA/ESTOQ+K860R/AC com a atividade de permeabilização da célula muito reduzida (citolítica)) permanece completamente ativo na dispensação de antígeno no APCs CDI 16”. Isto é de importância sob a luz de seu uso potencial como ferramenta de melhor perfil de segurança para dispensação de antígenos específicos de tumor na segunda geração de vacina —derivadade CyaA/AC”- para imunoterapia de câncer. Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES À 1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreesende ou consiste em um fragmento de adenilciclase como definida na SEQ ID NO: 1,7,8 ou 9, selecionado do grupo consistindo em: (1) um fragmento de pelo menos 350 resíduos de aminoácidos de uma adenilciclase como definida na SEQ ID NO: 1,7 ou 8, no qual (a) o Ns resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 570 na sequencia — CyaA nativa de Borderella Portussis, Borderella paraperiussis ou Borderella ——— hinzii como definido respectivamente na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, é substituído — por um resíuduo de glutamina ou um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile e Asp, (b) o resíduo de lisina, correspondendo a posição 860 na sequencia CyaA nativa de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii como definido respectivamente na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, é substituído por um resíduo de arginina ou por um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys e Ile; e (c) de O a 50 substituições, deleções e/ou inserções foram realizadas, e (2) um fragmento de pelo menos 350 resíduos de aminoácidos de uma adenilciclase como definida na SEQ ID NO: 9, no qual (a) o resíduo —deácido glutâmico, correspondendo a posição 569 na sequencia CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica como definido na SEQ ID NO: 9, é substituído por um resíuduo de glutamina ou um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile e Asp, (b) o resíduo de lisina, correspondendo a posição 859 na sequencia = . 25 —CyaA nativade Bordetella bronchiseptica como definido na SEQ ID NO: 9, é substituído por um resíduo de arginina ou por um resíduo conservativo | selecionado do grupo consistindo em Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys e Ile; e (c) de 0 a 50 substituições, deleções e/ou inserções foram ce realizadas MT. bs mN 99 -

nm 2/7 ' em que o dito polipeptídeo tem a capacidade da proteína CyaA . de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii ou Bordetella bronchiseptica de se ligar a um receptor CDI 1b/CD18 de células expressendo o mesmo.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a capacidade de translocar seu domínio da enzima — = —— adenilato ciclase N terminal ou parte do mesmo em células expressando CDI 15/CDI8. Tr me ——
3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: () o resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 570 na sequencia como definida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, ou correspondendo a posição 569 na sequencia como definida na SEQ ID NO: 9, é substituído por um resíduo de glutamina; e (ii) o resíduo de lisina, correspondendo a posição 860 na sequencia como definida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, ou correspondendo a posição 859 na sequencia como definida na SEQ ID NO: 9, é substituído pelo resíduo de arginina.
4. Polipeptidco de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 3, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento é pelo menos 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ou 1600 resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 7,8 ou 9, em tamanho.
5. Polipeptidco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequencia de : 25 — aminoácido é selecionada do grupo consistindo em: (1) a sequencia como definida na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, em que as seguintes mutações foram realizadas: (a) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 570 na sequencia CyaA nativa de “soc += - Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii como Aura". CA OOZMh ss $2 , : on * 2) . mao .

' definido respectivamente na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, por um resíuduo de : glutamina ou um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile e Asp; e (bh a substituição do resíduo de lisina, correspondendo a posição 860 na sequencia —CyaA nativa de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii como definido respectivamente na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, por um resíduo de arginina ou por um resíduo conservativo selecionado do grupo “ consistindoem Asn, Gin, Met, Thr, Ser, GIy, Val, Leu, CyS E IlEÇOEM Mm (2) a sequencia como definida na SEQ ID NO: 9, em que as — seguintes mutações foram realizadas: (a) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 569 na sequencia CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica como definido na SEQ ID NO: 9, por um resíuduo de glutamina ou um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile e Asp, e (bj a substituição do resíduo de lisina, correspondendo a posição 859 na sequencia CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica como definido na SEQ ID NO: 9, por um resíduo de arginina ou por um resíduo conservativo selecionado do grupo consistindo em Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys e Ile.
6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequencia de aminoácido é selecionada do grupo consistindo em: (1) a sequencia como definida na SEQ ID NO: 1,7 ou 8, em que as seguintes mutações foram realizadas: (a) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 570 na sequencia CyaA nativa de ' 25 —Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis ou Bordetella hinzii como definido respectivamente na SEQ ID NO: 1, 7 ou 8, por um resíuduo de glutamina, e (b) a substituição do resíduo de lisina, correspondendo a posição 860 na sequencia CyaA nativa de Bordetella Pertussis, Bordetella o... parapertussisou Bordetella hinzii como definido respectivamente na SEQ ID

SS

. NO: 1, 7 ou 8, por um resíduo de arginina; ou , (2) a sequencia como definida na SEQ ID NO: 9, em que as seguintes mutações foram realizadas: (a) a substituição do resíduo de ácido glutâmico, correspondendo a posição 569 na sequencia CyaA nativa de — Bordetella bronchiseptica como definido na SEQ ID NO: 9, por um resíuduo de glutamina e (b) a substituição do resíduo de lisina, correspondendo a posição 859 na sequencia CyaA nativa de Bordetella bronchiseptica como TT definido na SEQ ID NO:9; por um resíduo de arginina —— ——————õ—õ——————
7. Polipeptidco de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 6, caracterizado pelo fato de que é um mutante de um toxóide de adenilato ciclase cuja atividade da adenilato ciclase em células é parcialmente ou totalmente suprimida comparada com aquela da toxina CyaA de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii ou Bordetella bronchiseptica.
8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita supressão parcial ou total de atividade da adenilato ciclase é obtida por inserção de um dipeptídeo entre os resíduos de aminoácidos correspondendo as posições 188 e 189 da adenilato ciclase de Bordetella Pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella hinziil ou Bordetella bronchiseptica, especialmente da SEQ ID Nº1, 7, 8 ou 9, respectivamente.
9. Derivado de polipeptídeo compreendendo ou consistindo no polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser combinado ainda com uma ou mais moléculas ' 25 —deinteresse.
F 10. Derivado de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que cada uma da dita uma ou mais moléculas de interesse consiste em uma sequência de aminoácidos adequada para elicitar uma resposta imune.
E 517 : 11. Derivado de polipeptídeo de acordo com a reivindicação ,: 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos de cada uma da(s) dita(s) molécula(s) adequada(s) para elicitar uma resposta imune consiste em 5 a 800 especialmente 300 a 600, ou 400 a 500 resíduos de aminoácido.
12. Derivado de polipeptídeo de acordo com a reivindicação ou 11, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos de cada "uma da(s) dita(s) molécula(s) adêquada(s) para elicitar-uma-resposta-imune—Õ—— compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de um antígeno 10 —poliovírus, um antígeno do vírus de HIV, um antígeno do vírus influenza, um sequência do vírus coriomeningite, um antígeno do tumor, ou compreende ou consiste em uma parte de uma sequência de aminoácidos de qualquer um desses antígenos que compreendem pelo menos um epítopo.
13. Derivado de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que é um polipeptídeo recombinante em que a sequência de aminoácidos de cada uma da(s) dita(s) molécula(s) adequada(s) para elicitar uma resposta imune é(são) inserida(s) em um sítio permissivo do dito polipeptídeo contanto que a capacidade do dito polipeptídeo de translocar seu domínio da enzima adenilato ciclase N terminal nas células expressando CD11b/CDI18 seja preservada.
14. Derivado de polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que cada uma das ditas sequências de aminoácidos adequadas para elicitar uma resposta imune é enxertada, especialmente enxertada quimicamente, em um resíduo de aminoácido do dito . 25 — polipeptídeo.

15. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou de um derivado de polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento.

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7EOCCC”C"EºECCECECºCºEºCENCNVCNCOÉNC——r————---—-——-—-—-—-—-—---------.-A—nn———-—-o-ouououuouououououoocococccaa 6/7 f" 16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo À fato de ser para a preparação de um medicamento para elicitar uma resposta imune da célula T e/ou para elicitar uma resposta imune da célula B em um hospedeiro que necessita da mesma.

17. Uso de um derivado de polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de de ser para = a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma sã doença selecionada dentre neoplasia, cânceres e doenças infecciosas-————— selecionadas de doenças induzidas virais, retrovirais, bacterianas, parasitas ou fúngicas.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o medicamento deve ser administrado em combinação com um adjuvante e/ou em combinação com uma outra molécula terapeuticamente ativa.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento não deve ser administrado em combinação com um adjuvante.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptíideo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou um derivado de polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, um veículo farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente um adjuvante e/ou uma molécula terapeuticamente ativa.

21. Uso de uma composição farmacêutica como definida na . 25 reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento.

22. Uso de um derivado de polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de ser para a o... Preparação de uma composição terapêutica para o tratamento de uma doença uau wa neo ro=a='A ai" ““âi) P“)»e a 9“AG TI. -LÁO“jAÁ TES! ôNOÊA** ó O . é

A AE A ARA A AO MAO A A NA AAA AAA 717 - selecionada dentre neoplasia, cânceres e doenças infecciosas selecionadas . dentre doenças induzidas virais, retrovirais, bacterianas, parasitas ou fúngicas.

23. Método para a preparação de um vetor proteináceo | adequado para a dispensação de uma molécula em uma célula expressando —CDIILD/CDI8, caracterizado pelo fato de que compreende ligar a dita molécula a um polipeptídeo como definido em qualquer uma das o... reivindicações1a7.

34. Mólecula de DNA, caracierizada-pelo-fato-de-que-codifica-— um polipeptídeo de adenilciclase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou um derivado de polipeptídeo de adenilciclase como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 14. FF nnçBl , E. U-—""d la r8º SA"/22""“90)«mM/P A“) O NôÊÃÔÕÕO