JP4976853B2 - ボルデテラ(Bordetella)の組換えアデニル酸シクラーゼ毒素は腫瘍抗原に対するT細胞応答を誘発する - Google Patents

ボルデテラ(Bordetella)の組換えアデニル酸シクラーゼ毒素は腫瘍抗原に対するT細胞応答を誘発する Download PDF

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Description

本発明は、腫瘍抗原に対するT細胞応答を誘発するボルデテラ(Bordetella)の組換えアデニル酸シクラーゼ毒素に関する。
発明の背景
本発明は、がんを処置するための組成物及び方法に関する。
多くの動物腫瘍モデルにおいて、T細胞は、腫瘍拒絶において重要な役割を演じる。CD4及びCD8腫瘍反応性T細胞により認識される種々の腫瘍抗原は、マウス及びヒト腫瘍の両方に関して同定された(1)。CD8細胞傷害性リンパ球(CTL)は特に興味深い。何故ならば、これらの細胞は腫瘍細胞を特異的に認識しそしてそれらを殺すからである。がん免疫治療における重要な目標は、腫瘍特異的CTLを活性化することである。
ヒトメラノーマ上のCD8T細胞により認識される抗原の研究により、種々の自己タンパク質に由来する突然変異していないペプチド又は突然変異したペプチドに対応するいくつかのMHC拘束性腫瘍エピトープが同定された(2)。これらのペプチドのいくつかは、突然変異していない鑑別タンパク質(nonmutated differentiation proteins)、例えば、チロシナーゼ、MelanA/Mart−1及びgp100に由来する。これらのタンパク質は、特に、大抵のメラノサイト/メラノーマにおいて特異的に発現されており、かくしてHLA拘束性エピトープは、関連した(relevant)HLA分子を発現する患者からの大抵のメラノーマ細胞により提示される。故に、これらの抗原は、腫瘍エピトープに対する免疫感作に基づいている免疫治療ストラテジーの標的であることができる。
腫瘍細胞上に発現された他の抗原、例えば、N−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼV(GnT−V)をコードする遺伝子のイントロン配列に由来するペプチド、も挙げられている(3)。このイントロンは、メラノーマ細胞に特異的に発現されそしてメラノーマ細胞の約50%に存在する。
IFA(4)における遊離ペプチド、組換えウイルスベクター(5〜7)又は樹上細胞(8〜11)を使用するプロトコールを含む、これらのエピトープに対する特異的抗腫瘍CTL応答を誘発するようにデザインされた種々のワクチン接種プロトコールが開発された。ヒトワクチン接種へのこれらのアプローチの適用は、アジュバントの潜在的毒性により、ベクター由来のエピトープペプチドに対する応答に向けてのバイアスにより、又はそれらが労力を要する(インビトロ(in vitro)操作されるDC)故に限定されている。
以前に、組換えプラスミドが、ボルデテラ属の種(Bordetella sp.)のアデニル酸シクラーゼ(cyaA)及びCyaAの許容される部位(permissive sites)に挿入された異種DNAの発現のために使用された。これらのプラスミド及び得られる組換えタンパク質は、免疫応答を誘発するために有用であった。誘発された免疫応答は、クラスI主要組織適合複合体(class I major histocompatibility complexes)を伴なうCD8T細胞において並びにクラスII主要組織適合複合体を伴なうCD4T細胞においてであった。(U.S.Patent Nos.5,503,829, 5,679,784及び5,935,580参照)。更に詳しくは、組換えタンパク質は、CD11b発現細胞、例えば、樹状細胞に送達されうる。(European Patent Application EP1 188446 A1,"Proteinaceous vectors for molecule delivery to CD11b expressing cells"及びU.S.Patent Application 387,486に対応するWO/2122169A2"Vectors for Molecule Delivery to CD11b Expressing Cells"及びEuropean Patent Application No.03291486.3,"Modified Bordetella Adenylate Cyclase Comprising or Lacking CD11b/CD18 Interaction Domain and Uses theirof".) EI-Azami-EI-Idrissi et al.,, 2003, Interaction of ボルデテラ ペルトゥッシス Adenylate Cyclase with CD11b/CD18, J.Biol.Chem., vol.278, pp.38514-21参照。
免疫細胞及びT細胞応答に対する特異的標的化を可能とする新規な抗腫瘍処置に対する当該技術分野における要求がある。これらの新規なストラテジーは、腫瘍抗原に対する免疫応答の特異的増幅をもたらすべきである。
本発明の簡単な要約
本発明は、免疫応答を誘発する組換えCyaAタンパク質を提供することにより当該技術分野における要求を達成するのを助ける。これらの応答は腫瘍抗原に向けて指向されうる。
本発明は、がんを処置及び免疫監視する新規な方法を提供する。
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ アデニル酸シクラーゼ(CyaA)及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含む、免疫原性組成物を提供する。
本発明の態様は、(1)組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を患者に投与し、該組換えタンパク質は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、(2)患者において免疫応答、例えばT細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法である。
本発明の態様は、(1)組換えタンパク質を発現するベクター含む免疫原性組成物を患者に投与し、該組換えタンパク質は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及び腫瘍抗原に相当するペプチドを含み、(2)患者においてT細胞応答を誘発させることを含む、がんを有する患者を処置する方法である。
T細胞応答は、CTL応答又はTヘルパー応答又はCTL及びTヘルパー応答である。
本発明の態様では、腫瘍はメラノーマである。
本発明の他の態様では、腫瘍抗原はHLA−A*0201エピトープである。
本発明に包含されるのは、組換えタンパク質であり、この組換えタンパク質はCyaA−E5−Tyr又はCyaA−E5−GnT−Vである。
本発明の更なる態様では、組換えタンパク質は、1つより多くの腫瘍抗原を含む。特定の態様では、少なくとも1つの腫瘍抗原は他とは異なる。
腫瘍抗原は、CyaAのいかなる許容される部位(permissive sites)にも局在化される。
本発明の態様では、CyaAは、ボルデテラ ペルトゥッシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ パラペルトゥッシス(Bordetella parapertussis)、又はボルデテラ ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)である。好ましい態様では、CyaAはボルデテラ ペルトゥッシス(Bordetella pertussis)由来のものである。
本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、ヒト及び動物細胞上のリガンドとして認識されるアデニル酸シクラーゼタンパク質の少なくとも1つの特異的断片、及び腫瘍抗原に対して特異的な少なくとも1つのエピトープを含む、免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物の組換えタンパク質において、CyaA及び腫瘍抗原は、遺伝子的に融合され又は化学的に結合されることができる(PCT/EPO/11315)。
更に、本発明は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びGnTVエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。抗原は、CyaAタンパク質又はその特異的断片に融合されているか又は化学的に結合されている。
本発明は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、該融合タンパク質は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びGnTVエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、核酸配列も提供する。特定の態様では、該配列は、受託番号I−3111の下で2003年10月16日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたプラスミドに含まれる。
組換えタンパク質を発現するベクターであって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びGnTVエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、ベクターも本発明に含まれる。特定の態様では、該ベクターは、受託番号I−3111の下で2003年10月16日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託された。
本発明は、組換えタンパク質を発現する宿主細胞であって、該組換えタンパク質は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びGnTVエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、宿主細胞を更に包含する。特定の態様では、宿主細胞は、受託番号I−3111の下で2003年10月16日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたベクターを発現する。
本発明は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、該融合タンパク質が、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びTyrエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、核酸配列も提供する。特定の態様では、該配列は、受託番号I−2679の下で2001年5月31日に、C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたプラスミドに含まれる。
本発明の他の態様は、組換えタンパク質を発現するベクターであって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びTyrエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、ベクターである。特定の態様では、該ベクターは、受託番号I−2679の下で2001年5月31日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託された。
本発明は、更に、組換えタンパク質を発現する宿主細胞であって、該組換えタンパク質が、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片、及びTyrエピトープを含む抗原に相当するペプチドを含む、宿主細胞である。特定の態様では、宿主細胞は、受託番号I−2679の下で2001年5月31日C.N.C.M., Paris, Franceに寄託されたベクターを発現する。
好ましい態様の詳しい説明
形質細胞膜を横切って細胞質ゾル(そこで適当なプロセッシング及びMHCクラスI分子との相互作用が起こりうる)中に抗原性エピトープを送達することができるバクテリア毒素に基づいて、CTL活性化のための新規なアプローチが最近開発された。ボルデテラ ペルトゥッシスのアデニル酸シクラーゼ毒素(CyaA)(Glasser, P., et al. 1988 ボルデテラ ペルトゥッシス adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J.Exp.Clin.Med., 13 Supp.: 239)は、その触媒ドメインを真核細胞の細胞質ゾルに送達する能力を有する(12)。CyaAの触媒ドメインに挿入されたCD8T細胞エピトープの送達は、細胞内プロセッシング及び抗原提示細胞(13)の表面におけるMHCクラスI分子によるエピトープの提示をもたらす。更に、CyaAは、αMβ2インテグリン(CD11b/CD18)に特異的に結合し(14)、かくして、CD11bDC亜集団を標的化し、これは一次免疫応答(15)を非常に有効に誘発する(15)。故に、ウイルスエピトープを有する組換えCyaA毒素によるマウスの免疫感作は、強いCTL応答の誘発及び致死的ウイルスチャレンジ(lethal viral challenge)に対する完全な保護をもたらす(16)。
更に、単一のCTLエピトープを有するCyaA毒素は、マウスにおける有効な保護及び治療抗腫瘍免疫も刺戟することができる(17)。重要なことに、遺伝子的に脱毒素化されたCyaAトキソイドは、保護抗ウイルス又は抗腫瘍免疫を誘発する性質を保持する(17、18)。かくして、CyaAは、マウスにおいて特異的免疫応答を誘発するのに安全で有効な非複製性ベクターであると思われる。しかしながら、CyaAを使用するがん免疫治療を精巧にするという観点で、CyaAに挿入されたヒト腫瘍エピトープが有効にプロセッシングされそしてヒトMHC分子と会合して提示されることを証明することは特に重要である。
本発明の1つの態様では、チロシナーゼ又はGnT−Vに由来するHLA−A*0201拘束性メラノーマエピトープを有する2つの組換えCyaAを構築した。挿入されたエピトープに対するインビボ(in vivo)HLA−A*0201拘束性CTL応答を誘発するためのこれらの組換えCyaAの効力及びヒト抗原提示細胞にこれらのエピトープを送達する能力は、下記の実施例で証明される。
ボルデテラ ペルトゥッシスのCyaAは、αMβ2インテグリン(CD11b/CD18)とのその特異的相互作用に続いてCD11b樹状細胞の細胞質ゾルにCD8T細胞エピトープを送達することができることが発見された。この送達は、CyaAに挿入されたCD8T細胞エピトープの細胞内プロセッシング及びMHCクラスI分子による提示をもたらす。実際に、単一CTLエピトープを有するCyaA毒素は、マウスにおいて有効な保護及び治療抗腫瘍免疫を誘発することができる。
これらの組換えCyaAタンパク質は、アジュバントの一回の静脈内免疫感作の後ですら、HLA−A*0201−トランスジェニックマウスにおける強い抗メラノーマCTL応答を誘発することが更に発見された。応答は、長く持続し、最後の注射の5ヶ月後という長い間検出される。
最後に、組換えCyaAで処理されたヒト樹状細胞は、メラノーマエピトープをプロセッシングしそしてヒトCTLクローンに有効に提示することが発見された。本発明の組換えCyaAタンパク質は、CyaAに挿入された腫瘍エピトープが有効にプロセッシングされそしてヒトMHC分子と会合して提示されることを証明する。故に、CyaAは、ヒトにおいて抗腫瘍CTLを活性化させることができ、そしてがん免疫治療のための新規なファクターである。
本明細書で使用された、「免疫原性組成物」という用語は、免疫学的応答をもたらしそして治療処置、例えば、がんに対する処置と関連している組成物に関する。
本明細書で使用した「ボルデテラ CyaA」又は「ボルデテラ アデニル酸シクラーゼ」という用語は、修飾されているか又はされていないCyaA又はその断片を包含する。修飾は、いくらかの内部アミノ酸の欠失を含むことができる。例えば、CyaAは、触媒活性を持たなくてもよいが、CD11b/CD18受容体への特異的結合及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスは影響を受けない。「ボルデテラ」という用語は、ボルデテラ属の種の病原体のアデニル酸シクラーゼタンパク質を指す。該病原体は、ボルデテラ ペルトゥッシス、ボルデテラ パラペルトゥッシス又はボルデテラ ブロンキセプチカであることができる。
本明細書で使用された、「抗原」又は「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができるタンパク質を含むペプチドを指す。「異種」という用語は、CyaAタンパク質の免疫応答とは異なる免疫応答を誘発する、CyaAタンパク質に結合した抗原の性質を指す。異種抗原又はエピトープは、例えば、CyaAに融合されているか又はCyaAに化学的に結合されていることができる。
本明細書で使用された「免疫原性」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける免疫応答を誘発することができるというタンパク質の特徴を指す。「免疫応答」という用語は、例えばCTL応答及び/又はTヘルパー応答の如き免疫系の細胞により引起される多くの効果を指し、そして本発明に関しては、腫瘍特異的細胞傷害性リンパ球の活性化を含むが、それらに限定はされない。本明細書で使用された、「免疫治療」という用語は、免疫応答に頼る疾患の治療を指す。
本発明の組換えタンパク質又はベクターの他に、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答の増加及びモジュレーションを可能とするためのアジュバント及び賦形剤を含むことができる。これらのアジュバントは性質において多様である。それらは、例えば、リポソーム、油相、例えば、フロイント型のアジュバントを含むことができ、このフロイント型のアジュバントは、一般に水性相とのエマルションの形態で一般に使用され、又はより普通には、水に不溶性無機塩を含むことができる。これらの無機塩は、例えば、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムを含むことができる。水酸化アルミニウム(Al(OH)3)は、最も普通に使用されるアジュバントである。
本発明は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片及びペプチドpTyr(YMDGTMSQV)を含む組換えタンパク質も包含する。該ペプチドは、延長されたフランキング配列を含むことができる。pTyrペプチドは、チロシナーゼの369〜377領域からのメラノーマHLA−A*0201拘束性エピトープに相当する。ヒトチロシナーゼのアミノ酸369〜377はYMNGTMSQVであることに留意されたい。しかしながら、チロシナーゼの位置371(N)におけるAsn残基は、生きている細胞においてこのエピトープのAsp(D)に自然に脱アミド化され、その結果インビボでのCTLクローンにより認識された真のエピトープは認識配列YMGTMSQVである。
更に、ヒトチロシナーゼのアミノ酸360〜385の延長されたフランキング配列を有するエピトープは、SSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPI(N371はDに転換された)である。
ヒトN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子に由来するエピトープは、VLPDVFIRCである(Y Guilloux, et al. A peptide recognized by human cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanoma is encoded by an intron sequence of the N-acetylglucosaminyltransferase V gene, J.Exp.Med.1996 183: 1173-1183)。Gnt−Vエピトープは、74アミノ酸長さのポリペプチドをコードすることができるイントロン配列によりコードされる(H. sapiens DNA for exon encoding for N-acetylglucosaminyltransferase V; Accession #X91652)。更に、ヒトN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼVからの延長されたフランキング配列を有するエピトープは、MVLPDVFIRCVVFCLである。
本発明は、ボルデテラ CyaA又はその特異的断片及びペプチドpGnT−V(VLPDVFIRC)を含む組換え融合タンパク質も包含する。前記ペプチドは、延長されたフランキング配列を含むことができる。ペプチドpGnT−Vは、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子のイントロンに由来するHLA−A*0201拘束性エピトープNA17−Aに相当する。
本発明の1つの好ましい態様では、組換えタンパク質は、CyaA−Tyrである。「CyaA−Tyr」という用語は、実施例1に記載のとおりに調製することができるHLA−A*0201のチロシナーゼメラノーマエピトープ及びボルデテラ ペルトゥッシス CyaAを含む融合タンパク質を意味する。「CyaA−E5−Tyr」という用語は、CyaAの触媒活性が遺伝子的に不活性化されたCyaA−Tyrタンパク質を指す。例えば、実施例1参照。
本発明の他の好ましい態様では、組換えタンパク質は、CyaA−E5−GnT−Vである。「CyaA−E5−GnT−V」という用語は、実施例1に記載のとおりに調製することができるN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子のイントロンに由来するHLA−A*0201のNA17−Aメラノーマエピトープ及びボルデテラ ペルトゥッシス CyaAを含む融合タンパク質を意味する。「CyaA−E5−GnT−V」という用語は、CyaAの触媒活性が遺伝子的に不活性化されたCyaA−GnT−Vタンパク質を指す。例えば、実施例1参照。
本発明の更に他の態様では、CyaAとpTyr又はpGnT−Vとの組換えタンパク質は、CyaA−Tyr、CyaA−GnT−V、CyaA−E5−Tyr又はCyaA−E5−GnT−Vの構造から修飾される。これらの態様の修飾は、組換えタンパク質を含むペプチドを取り囲むアミノ酸の配列でありそして上記したフランキング領域の付加を含むことができる。これらのフランキング配列はプロセッシングを高めることができる。フランキング配列は、抗原を天然には取り囲んでいないが、抗原阻止細胞による抗原プロセッシングを特異的に高める配列であることもできる。
更に他の態様では、組換えタンパク質は、多重同一異種エピトープ(multiple identical heterologous epitopes)を含むことにより修飾されうる。例えば、上記したTyr又はGnT−Vエピトープ又は他のメラノーマエピトープ。
本発明の更なる態様では、組換えタンパク質は、アデニル酸シクラーゼタンパク質の少なくとも1つの特異的断片、例えば、ヒト及び動物細胞、例えば樹状細胞上のリガンドとして認識されるCyaA373〜1706領域又は1166〜1281領域(これらに限定はされない)及びがん抗原に対して特異的な少なくとも1つのエピトープ、例えば、pTy又はGnT−V(これらに限定はされない)を含むことができる。
本発明の他の態様では、組換えタンパク質は、1つ以上の腫瘍抗原からの多重エピトープを含むことができる。
本発明の他の態様は、実施例に与えられたCyaAの許容される部位とは異なるCyaAの許容される部位を含む。本発明の試験で使用される組換えタンパク質の抗原部分は、CyaAアデニル酸シクラーゼタンパク質WO93/21324のいかなる許容される部位にも局在化されうる。更に、本発明は、組換えタンパク質におけるCyaAアデニル酸シクラーゼの断片のみを利用する試験及び免疫原性組成物を包含する。(EPO13/291486.3参照)。
本明細書で使用された、「許容される部位」という用語はアデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質に実質的に影響を与えることなく、即ち、CD11b/CD18受容体に対する特異的結合に必要なドメインに影響を与えることなく、そして触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスに影響を与えることなく異種ペプチドを有利に挿入することができる部位に関する。
ボルデテラ ペルトゥッシス アデニル酸シクラーゼの許容される部位は、残基137〜138(Val−Ala)、残基224〜225(Arg〜Ala)、残基(228〜229(Glu〜Ala)、残基(235〜236(Arg〜Glu)、及び残基(317〜318(Ser〜Ala)を含むが、それらに限定はされない。(Sebo et al., 1985参照)。下記の追加の許容される部位も本発明の態様に含まれる:残基107〜108(Gly〜His)、残基132〜133(Met〜Ala)、残基232〜233(Gly〜Leu)及び335〜336(Gly〜Gln)及び336〜337。(一般に、Glaser et al., 1988 ボルデテラ ペルトゥッシス adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai J. Exp. Clin. Med., 13 Suppl.: 239-52参照)。
本明細書で使用された、「アデニル酸シクラーゼタンパク質の特異的領域」又は「CyaAアデニル酸シクラーゼの断片」という用語は、タンパク質の腫瘍部分ではないところにあるいくらかのアミノ酸が欠失しており、そしてアデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質が実質的に影響を受けていない、即ち、CD11b/CD18受容体に対する特異的結合に必要なドメイン及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスが影響を受けていない、タンパク質を含む前記タンパク質の断片に関する。
「腫瘍抗原」又は「がん抗原」という用語は、免疫応答を誘発しそして抗体又はT細胞と特異的に反応する腫瘍からのいかなる物質も指す。該物質は、細胞を形質転換して腫瘍を形成する自然発生的な又はウイルス由来のいかなる起源に由来していてもよい。このようなウイルスの例は、HHV8、HCV及びHBVである。抗原又はエピトープは腫瘍細胞の表面に存在しなければならない。
本明細書で使用された、「抗原に対応するペプチド」という用語は、抗原、エピトープ又は、抗原提示細胞による抗原プロセッシングを特異的に高める天然に存在するか又は非天然に存在するフランキング領域によりフランキングされた(flanked)抗原若しくはエピトープを包含する。
「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができる抗原の最小ペプチド配列を指す。
「ペプチド」という用語は、少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは少なくとも6個のアミノ酸を含むアミド結合により連結された一連のアミノ酸を指す。
本発明の免疫原性組成物は、溶液中で、例えばPBS中で使用されうるがそれらに限定はされず又はアジュバント、例えば明礬と共に使用されうるが、それらに限定はされない。免疫原性組成物は、筋肉内に、皮下に、静脈内に又は皮内に投与することができる。免疫原性組成物は、0.5〜10mg、好ましくは1〜5mg、1.5〜3mg又は更に好ましくは1.50mgの量で投与することができる。これらの処置の効果は、ELISPOT、ELISA又はCTL活性化アッセイ又は他の適切なイムノアッセイによりIFN−γのレベルをアッセイすることにより監視することができる。
刊行物、即ち、Vordermeier H.Martin et al(Infectin and Immunity, November 2004, p. 6255-2261) 及び Schlecht G, et al(The Journal of Immunology 2004, p.6089-6097)は、診断及び免疫監視のためのボルデテラ属の種(Bordetella sp)の組換えアデニル酸シクラーゼの使用を説明する。
ボルデテラ属の種のアデニル酸シクラーゼは、マウスにおいてCD8Tリンパ球を特異的に刺戟して保護抗ウイルス及び抗腫瘍免疫をもたらすことができる新規な送達システムを代表する(16,17)。CyaAは、適応免疫(adaptive immunity)の誘発のための強力な非複製性のベクターでありそしてワクチンにおいて有用である。挿入されたエピトープをプロセッシングしそしてヒトMHC分子と会合させて提示することができるという、本発明に従う証明は、ヒトにおけるこのベクターの使用のための必須の先要件である。
ヒトHLA−A*0201クラスI分子を発現するヒトメラノーマエピトープが存在する組換えCyaAを使用することにより、強い持続するメラノーマ特異的CTL応答をHLAトランスジェニックマウスにおいて誘発させることができる。同様な結果が、アデニル酸シクラーゼ活性を欠いた組み換え脱毒素化CyaAで得られた。CyaAは、インビボで特異的CTL応答を誘発するのに有効なベクターを表す。何故ならば、アジュバントなしで1回の注射の後に、80%より多くの免疫感作されたHHDマウスがCyaAに挿入されたチロシナーゼエピトープに応答したが、IFAの存在下にペプチド100μgの1回の注射の後に、HHDマウスの26%のみがこのエピトープに応答するからである(部分的に26において)。更に、ヒトDCは、ヒトCTLへの抗原性ペプチド提示のためのこれらの組換え分子を有効にプロセッシングすることが、驚くべきことに本発明に従って観察された。際立っていることに、組換えCyaA−Tyrは、チロシナーゼエピトープをDCに送達することにおいて合成ペプチドよりもはるかに有効であった。
組換えウイルスに基づく別の抗原送達システムは、通常、合成ペプチドよりも低いインビトロ提示有効性をもたらす。本発明に従うインビボ及びインビトロ実験からの驚くべき結果は、送達システムとしてのCyaAのパワーを強調し、そして組換えCyaAによる免疫感作後にヒトにおいてCTL応答が得られうること、かくしてこのベクターにより有効な免疫治療が達成されうることを示す。しかしながら、この研究で試験された2つの組換えCyaAの免疫原性が全く異なっていた。実際に、HHDマウスにおける強いCTL応答は、アジュバントの不存在下にCyaA−Tyrの1回のみの腹腔内注射により誘発されたが、明礬の存在下で、特異的CTL応答を発生させるのに、CyaA−GnT−Vの3回の腹腔内注射が必要であった。GnT−Vメラノーマエピトープを送達するためのCyaA−GnT−Vの弱い有効性がインビトロでも証明された。何故ならば、このベクターと共にインキュベーションされたヒトDCは、特異的抗チロシナーゼCTLクローンを有効に刺戟したCyaA−Tyrと比較して抗GnT−V−CTLクローンを不十分に刺激したからである。
この差は、CyaA−GnT−VにグラフトされたGnT−VペプチドがCyaA−Tyrに挿入されたチロシナーゼペプチドと比較して、不十分にプロセッシングされたということにより説明することができる。実際に、与えられたエピトープのフランキング領域は、成熟ペプチドのタンパク質分解による発生に影響を与えることが知られており(27〜29)、特にサブドミナント(subdominant)及び/又はクリプティック(cryptic)エピトープについて知られている(30)。ゆえに、CyaAへのGnT−Vエピトープの分子関連の修飾はAPCによるこのエピトープのプロセッシングの有効性を高めることができるということが予想される。反対に、CyaA−Tyrにおけるチロシナーゼエピトープをフランキングする配列は、その有効なプロセッシングを可能とすると思われる。
更に、CyaA−Tyrは、インビボでのHLA−A*0201拘束性CD8T細胞を活性化するのに非常に有効である。何故ならば、アジュバントなしの1回の静脈内免疫感作又は2回の腹腔内注射は、強い特異的CTL応答を発生させるのに十分であったからである。これは、CyaAがCD11bDC、一次応答を誘発するのに最も強力なAPCを、これらの細胞により発現されるαMβ2インテグリンとのその相互作用の結果として、特異的に標的化するという事実により説明することができる(14)。かくして、CyaAは、専門的APCの細胞質ゾルAgクラスI提示経路に抗原を特異的に送達するという各別の性質を有する。
CyaA組換えストラテジーの更なる改良も可能である。第一に、同じ組換え分子へのCD8T細胞エピトープの多重挿入は、既に成功的に達成されている。実際に、LCMVエピトープを含む三つの異なるエピトープを有する組換えCyaAによるマウスの免疫感作は、3つのエピトープの各々に対する特異的CTL応答の誘発並びに致死的LCMVチャレンジに対する保護をもたらす(31)。多重メラノーマエピトープを有する脱毒素化されたCyaAは、多重特異的CTL応答を誘発するのに良好な代替手段を構成する。更に、CD4T細胞エピトープペプチドの追加の挿入も可能である。確立された腫瘍の撲滅におけるCD8T細胞の関与は明らかに証明されたけれども(32)、有効な抗腫瘍応答を誘発するのにTヘルパー細胞も必要でありうる(33〜35)。組換えCyaAは、MHCクラスIIプロセッシング経路にエピトープを送達することができ(36)、そしてインビボで、特異的Th1及びCTL応答の両方を誘発することができる(37)。この特徴は、両方の種類のT細胞応答が、がん免疫治療に関して顕著に誘発されなければならないワクチン接種ストラテジーのために非常に興味深い。
プラスミドpTRACE5−GnTVは、λファージPrプロモーターの制御下にボルデテラ ペルトゥッシスからのcyaC及びcyaA遺伝子を発現する発現ベクターpTRACGの誘導体である(pTRCAGもまたアンピシリン抵抗選択性マーカー及び感熱性λリプレッサーCl857を有する)。pTRACE5−GnTVにおいて、cyaA遺伝子は、野生型CyaAのコドン188と189との間にジペプチドLeu−Glnの挿入(アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす)及びCyaAのコドン224と240との間に挿入された下記のペプチド配列PASVLPDVFIRCGTをコードするDNA配列の挿入により修飾される。下線を付したペプチド(VLPDVFIRC)は、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子に由来するHLA−A2拘束性メラノーマエピトープNA17−Aに相当する(G. Dadaglio, et al. (2003) Recombinant adenylate cyclse of ボルデテラ ペルトゥッシス induces CTL responses against HLA-A2-restricted melanoma epitope.Int.Immuno.)。プラスミドXL1/pTRACE5−GnTVは、受託番号I−3111で2003年10月16日にC.N.C.M.に寄託された。
プラスミドpTRACE−5−Tyros369は、λファージPrプロモーターの制御下にボルデテラ ペルトゥッシスからのcyaC及びcyaA遺伝子を発現する発現ベクターpTRACGの誘導体である(pTRCAGもまたアンピシリン抵抗選択性マーカー及び感熱性λリプレッサーCl857も有する)。pTRACE5−Tyros369において、cyaA遺伝子は、野生型CyaAのコドン188と189との間にジペプチドLeu−Glnの挿入(アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす)及びCyaAのコドン224と240との間に挿入された下記のペプチド配列PASYMDGTMSQVGTRARLKをコードするDNA配列の挿入により修飾される。下線を付したペプチドYMDGTMSQVは、チロシナーゼのアミノ酸配列369〜377に対応する。プラスミドXL1/pTRACE5−Tyros369は、受託番号I−2679で2001年5月31日にC.N.C.M.に寄託された。
使用された略号は下記のとおりである:CTL:細胞傷害性Tリンパ球;DC:樹状細胞;PBMC:末梢血単核細胞;CyaA:ボルデテラ spのアデニル酸シクラーゼ;Tyr:チロシナーゼ;GnT−V;N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV;GM−CSF:顆粒球マクロファージコロニー刺激因子;IFN:インターフェロン;i.p:腹腔内;i.v:静脈内。
本発明は下記の実施例において更に詳細に説明されるであろう。
実施例1
物質及び方法
マウス。HHDマウスは、H−2Db(D)のα3膜貫通及び細胞質ドメインに連結されたHLA−A*0201のα1(H)及びα2(H)ドメインを含むHHD導入遺伝子(該α1ドメインはβ2ミクログロブリンに連結されている)を発現するH−2D-/-β2m-/-ダブルノックアウトマウスである。かくして、HHDマウスにより発現されたMHCクラスI分子のみが、修飾されたHLA−A*0201分子である(19)。HHDマウスを繁殖させそしてInstitute Pasteurの動物施設に収容した。
ペプチド。チロシナーゼの369〜377領域からのメラノーマHLA−A*0201拘束性エピトープに対応する合成ペプチドpTyr(YMDGTMSQV)(20、21)及びN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子のイントロンに由来するHLA−A*0201拘束性エピトープNA17−Aに対応するpGnT−V(VLPDVFIRC)(3)をNeosystem(Strasbourg, France)から購入した。
メラノーマエピトープを有する組換えボルデテラ ペルトゥッシス アデニル酸シクラーゼ毒素及びトキソイドの構築。組換えCyaA毒素、CyaA−Tyrは、CyaAの残基224と225との間に遺伝子的に挿入された14アミノ酸長さのポリペプチド配列(PASYMDGTMSQVGT、アミノ酸に対する一文字コード)を有する。この配列は、チロシナーゼに由来するHLA−A*0201拘束性メラノーマエピトープ(アミノ酸369〜377、上記した下線を付した配列)の単一コピーを含有する。組換えCyaA毒素CyaA−GnT−Vは、同じ位置に14アミノ酸長さの(PASVLPDVFIRCGT)インサートを有しそしてN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV遺伝子に由来するHLA−A*0201拘束性メラノーマエピトープNA17−A(上記した下線を付した)の単一コピーを含有する。
これらの組換え毒素は、指示されたポリペプチド配列をコードする適切な合成二本鎖オリゴヌクレオチドのNheI及びKpnI制限部位間の挿入により修飾された、pTRACGプラスミド(22)の誘導体である発現ベクターを使用することによりE.coli株BLR(Novagen)において産生された。標準プロトコールに従って行われたすべてのDNA操作のためにE.coli株XL1−Blue(Stratagene)を使用した。以前に記載された通り(23)、DEAE−セファロース及びフェニルセファロースクロマトグラフィーを含む2段階手順により封入体から均一性となるように組換えタンパク質を精製した。
組換え毒素CyaA−Tyr及びCyaA−GnT−Vは酵素的に活性であり、したがつて細胞傷害性である。それぞれ、CyaA−Tyr及びCyaA−GnT−Vの脱毒素化された変異体である、組換えトキソイドCyaA−E5−Tyr及びCyaA−E5−GnT−Vは酵素的に不活性である。それらは、触媒部位の重要な領域内にジペプチドの挿入の結果としてcAMPを合成することができない(23)。CyaA−E5−Tyr及びCyaA−E5−GnT−Vトキソイドは、pTRACE5プラスミドの誘導体である発現ベクターを使用することによりE.coliにより産生された:このプラスミドは、cyaA DNA配列の5‘部分に位置したEcoRV部位におけるヘキサヌクレオチドCTGCAGの挿入により得られた。これは、CyaAのAsp188とIle189との間にジペプチドLeu−Glnのインフレーム挿入(in-frame insertion)をもたらす。上記した同じ合成二本鎖オリゴヌクレオチドを、pTRACE5のNheI及びKpnI部位間に挿入して、プラスミドpTRAC−E5−Tyr及びpTRAC−E5−GnT−Vを創生した。組換えCyaA−E5−Tyr及びCyaA−E5−GnT−Vトキソイドを述べられたとおり(23)均一となるように精製した。
すべての精製された組換え毒素及びトキソイドは、SDSゲル分析により判定して90%より高い純度であった。毒素濃度は、142,000M-1cm-1の分子吸光計数を使用して280nmでの吸収から分光法により決定した。
オリゴヌクレオチド合成及びDNA配列決定は、Genaxis(France)により行った。醗酵層での培養は、Institut Pasteurからの醗酵サービス施設(Service des Fermentations)により行った。
マウス免疫感作。6〜10週齢の雌のHHDを、明礬1mgの存在下又は不存在下にCyaA又はメラノーマエピトープを有する組換えCyaA50μgの21日間隔での2又は3回腹腔内注射により免疫感作させた。いくらかの実験では、マウスをPBS中の組換えCyaA50μgの1回の静脈内注射により免疫感作させた。同じ条件で脱毒素化された組換えCyaA−E5を使用した。最後の注射の3又は5ヶ月後に脾臓を取り出す長く続く応答の分析を除いては、最後の注射の7日後に脾臓を外科的に取り出した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ。免疫感作されたマウスからの脾臓細胞を、完全培地(10%ウシ胎仔血清、5×10-5M2−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び20mMHepesを補充されたL−アラニル−L−グルタミンジペプチドを含有するRPMI1640倍地)中で同系の照射されたナイーブ脾臓細胞(syngeneic irradiated naive spleen cells)の存在下にプライミングエピトープに対応するpTyr又はGnT−Vペプチド10μg/mlとインビトロで5日間刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞として関連したペプチド(relevant peptides)をロードされたHHDトランスフェクションされたTAP-/-RMA−S細胞(RAM−S−HHD)に関する4−h51Cr放出アッセイで試験した。51Cr標識は下記のようになされた:細胞傷害性試験の1日前に、RMA−S−HHD細胞を、20mMHepesを補充された、7%CO2平衡化されたRPMI1640倍地中で室温で一夜インキュベーションした。次いで、細胞を関連したペプチド20μg/mlを伴い又は伴わずに室温で3時間インキュベーションし、1回洗浄し、そして100μCiの51Crで37℃で1時間放射性標識した。
種々のエフェクター対標的比を使用しそしてすべてのアッセイを二重に(in duplicate)行った。各ウエルの上清中に放出された放射能を測定した。特異的溶解の百分率は、100×(実験放出−自然に起こる放出)/(最大放出−自然に起こる放出)として計算した。10%トリトンX−100を標的細胞に加えることにより最大放出を発生させ、そして自然に起こる放出は培地のみの中でインキュベーションされた標的細胞で得られた。マウスは、少なくとも20%の特異的溶解が最も高いE/T比で観察されるとき応答者であると考えられた。結果を、グループ当たり応答者マウスの平均値±SDとして表現する。無関係なペプチドでインビトロで刺激された免疫感作されたマウスからの脾臓細胞では、特異的CTL活性は得られなかった。
ヒト樹状細胞。ヒト樹状細胞は下記のとおり接着性単球に由来した:末梢血単核細胞を、予めLymphoprep(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)15mlと2200rpmで30秒間遠心されたLeucosep管(Greiner, Frickenhausen, Germany)での遠心によりHLA−A*0201ヘモクロマトーシス患者LB2050から得られたバフィーコート(buffy coat)から単離した。これらの管を室温で20分間2,200rpmで遠心しそして血漿を含有する上部を捨てた。PBMCを含有する中間相を回収しそして1mMEDTAを有する冷リン酸塩緩衝剤中で少なくとも3回洗浄して残りの血小板を除去した。次いでPBMCを、アミノ酸(L−アルギニン116μg/ml、L−アスパラギン36μg/ml、L−グルタミン216μg/ml)、抗生物質及び10%ウシ胎仔血清で補充されたRPMI1640(以後培養培地と呼ぶ)中に2×106細胞/cm2の濃度で培養フラスコ中で1時間放置し接着させた。非接着性細胞をすて、接着性細胞を培地20mlで注意深く2回洗浄しそして200U/mlのヒトIL−4及び70ng/mlヒトGM−CSFと共に培養培地中でインキュベーションした。2日目及び4日目に、培地5mlを除去しそしてGM−CSF700ngを含有する10mlを加えた。IL−4も、フラスコの全容積について200U/mlで補充された。細胞を5日と7日の間に使用した。
ヒトCTLクローン。チロシナーゼのHLA−A*0201拘束性Tyrエピトープ(位置369〜377)に対して指向されたCTLクローンIVS−Bは以前に記載された(24)。このクローンを、50U/mlのヒトIL−2、2μg/mlのpTyrペプチドでパルスされた、照射されたHLA−A*0201トランスフェクションされたMZ2−MELメラノーマ細胞及びフィーダー細胞としての照射されたLG2−EBV細胞、により毎週刺激した。GnT−Vに由来するHLA−A*0201拘束性エピトープに対して特異的なCTLクローンCMU579 6/3を、最近記載された方法(25)に従って健常なドナーの血液から得た。簡単に言えば、PBMCを、抗原性ペプチドpGnT−V、ヒトIL−2、IL−4及びIL−7で2週間刺激した。13日目に、PBMCを、pGnT−Vペプチドと共に折りたたまれたHLA−A*0201テトラマーで染色した。フローサイトメトリーを使用してテトラマーポジティブリンパ球をクローニングした。それらを、前記ペプチドでパルスされた、照射された同種HLA−A*0201ポジティブEBV−形質転換されたB細胞、照射された同種PBL、IL−2、IL−4及びIL−7で2週間刺激し、次いで照射されたHLA−A*0201ポジティブペプチド−パルスされた同種腫瘍細胞及び照射された同種EBV−B細胞による毎週の刺激により維持した。両CTLクローンを、ヒト血清10%、アミノ酸及び抗生物質を補充されたIscoveの培地(iscove's medium)中に維持した。
ヒトCTLクローンのインビトロ刺激アッセイ。刺激アッセイのために、10,000未熟樹状細胞をX−Vivo10培地(Whittaker Bioproducts, Walkersville,USA)
25μl中でU底部マイクロプレート中に播種した。種々の濃度でX−Vivo10培地中に希釈されたCyaA調製物25μlをウエルに加えた。30分のインキュベーションの後に、対応するCTLクローンを、これらの細胞(104抗チロシナーゼCTLクローンIVS−B又は104抗GnT−V CTLクローンCMU5796/3を含有するX−vivo培地75μl)及びIL−2(25U/mlの最終濃度で)と共にインキュベーションした。上清を20時間後に集めそしてそれらのIFN−γ含有率をELISA(Biosource International, Carmarillo, CA)により決定した。種々の脱毒素化された組換えトキソイドとインキュベーションされたDCのCTLクローンを刺激する能力を制御するために、それらは、関連した抗原ペプチドを外因的にロードされ、関連したCTLクローンと共にインキュベーションされそしてIFN−γの産生を同様に評価された(データは示されていない)。
実施例2
HLA−A*0201拘束性メラノーマエピトープを有する組換えCyaAによるHHDトランスジェニックマウスの免疫感作によるメラノーマ特異的CTL応答の誘発
CyaA毒素がヒト腫瘍抗原に対する特異的CTL応答を誘発することができるかどうかを決定するために、HLA−A*0201拘束性ヒトメラノーマエピトープを有する2つの組換えCyaAを構築した。第1の組換えCyaAは、チロシナーゼ抗原からのエピトープ369〜377を発現し(CyaA−Tyr)、そして第2の組換えCyaAは、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼVのイントロンに由来するエピトープNA17−Aを発現する(CyaA−GnT−V)。インビボでこれらの2つのエピトープに対するCTLを誘発する組換えCyaAの能力をHHDマウスで評価したが、このHHDマウスは、ヒトMHCクラスI分子HLA−A*0201に対してトランスジェニックでありそして腫瘍ペプチドに対してHLA−A*0201拘束性CTL応答を発生することが示された(26)。HHDマウスは、明礬を伴う組換えCyaA50μgの3回の腹腔内注射により免疫感作された。相当するペプチドによる脾臓細胞のインビトロ刺激の後に、HHD―マウスと同じ導入遺伝子を発現する、ペプチド−パルスされたRMA−S−HHD細胞を標的として使用する、クロム放出アッセイにおいてCTL応答を試験した。図1に示されたとおり、Tyr又はGnT−Vエピトープを有する両組換え毒素は、関連したペプチドをロードされた標的細胞に対する強いCTL応答を誘発する。これらのCTL応答は、抗原特異的であった。何故ならば、ペプチドで感作された標的細胞のみが殺され、そして無関係のペプチドをロードされた標的細胞に対するCTL活性は検出されなかったからである(データは示されていない)。予想されるとおり、野生型CyaAで免疫感作されたマウスで有意なCTL活性は観察されなかったが、これは、特異的CTL応答の誘発は、組換えCyaAに挿入されたエピトープによるインビボプライミング(in vivo priming)を必要とすることを示す。
次いで、アジュバントとして明礬を伴うか又は伴わない種々の免疫感作プロトコール使用して、CyaA−TyrによるCTL応答の誘発を分析した。図2A及びBに示されたとおり、CyaA−Tyrの2回の腹腔内注射は、明礬の不存在下ですらチロシナーゼエピトープに対する特異的CTL応答を誘発させるのに十分であった。静脈内経路を使用するアジュバントなしのCyaA−Tyr50μgの1回の注射の後にも、強い特異的CyaA−Tyr応答の誘発が観察された(図2C)。予想されるとおり、組換えCyaA−Tyrで免疫感作されたマウスからのペプチドパルスされた標的細胞及び脾臓細胞を使用するときにのみ、これらのCTL応答が観察されたが、これはこの応答の特異性を示している。これらの結果は、チロシナーゼメラノーマエピトープに対する特異的CTL応答を誘発させるためのCyaA−Tyrの高い有効性を証明する。しかしながら、免疫感作の同様な条件(明礬を伴うか又は伴わないで2又は1回腹腔内注射)を使用して、組換え毒素CyaA−GnT−Vでは特異的CTL応答は観察されなかったが、これは、この毒素がCyaA−Tyrよりも特異的CTL応答を発生させるのに有効より少ないことを示す(データは示されていない)。しかしながら、静脈内経路により、CyaA−GnT−Vの1回の注射は強いCTL応答を誘発するのに十分であった(図2E)。
最後に、触媒部位へのジペプチドの挿入の後アデニル酸シクラーゼ活性を欠いたチロシナーゼ又はGnTVエピトープを有するCyaAの遺伝子的に脱毒素化された突然変異体により誘発されたCTL応答を分析した。これらの脱毒素化された分子で免疫感作されたHHDマウスは、対応するエピトープを有するCyaAの毒性形態で免疫感作されたマウスの応答に匹敵しうる、チロシナーゼ及びGnT−Vエピトープの両方に対する特異的CTL応答を発生させた(図2D、2F)。これらの結果は、HLA−A*0201拘束性CTL誘発は、触媒活性とは独立であることを示す。何故ならば、それはBALB/CにおけるLCMVからのウイルスエピトープについて明らかに証明されたからである(18)。
実施例3
組換えCyaA−Tyrは長く続く記憶CTL応答を誘発する
メラノーマエピトープを有する組換えCyaAにより誘発されたCTL応答の持続を分析するために、HHDマウスは、明礬の存在下にCyaA−Tyr50μgの2回の腹腔内注射を受け取った。最後の注射の3ヶ月及び5ヶ月後に、免疫感作されたマウスからの脾臓細胞をペプチドpTyrで5日間にわたりインビトロで刺激し、次いでペプチドパルスされたRMA−S−HHD標的細胞に対するそれらの細胞傷害性活性を試験した。図3に示されたとおり、CyaA−Tyrは、長く続く特異的CTL応答を誘発した。何故ならば、特異的細胞傷害性活性は、すべてのマウスにおいて、最後の注射の3ヶ月後に検出されることができ、そして1つの動物においては5ヶ月後ですら検出されることができたからである。
実施例4
CyaAに挿入されたHLA−A*0201拘束性ペプチドは、HLA−A*0201ヒトDCによりプロセッシングされそして提示される
組換えCyaAによる特異的CTL応答のインビボ誘発は、挿入されたエピトープがマウスAPCにより有効にプロセッシングされそして提示されることを示す。しかしながら、ヒトAPCもまたCyaAに挿入されたこれらのHLA−A*0201拘束性エピトープをプロセッシングしそして提示することができることを証明することは重要である。DCは一次T細胞応答を誘発させるのに最も重要なAPCであるので、組換えCyaAとインキュベーションされたHLA−A*0201DCの、組換えCyaAに挿入されたエピトープに対して特異的なヒトCTLクローンを刺激する能力を決定した。これらの実験では、ヒトDCを、GM−CSF及びIL−4の存在下にHLA−A*0201接着性PBMCからインビトロで発生させた。次いで増加する用量のCyaA−E5−Tyr、CyaA−E5−GnT−V又はコントロールCyaA−E5を加えそして抗原性ペプチドの提示を、処理されたDCの関連したCTLを刺激する能力をIFN−γ産生アッセイにおいて測定することにより、評価した。
図4Aに示されたとおり、CyaA−E5−TyrとインキュベーションされたヒトDCは、チロシナーゼ特異的CTLクローンによるIFN−γの高い産生を誘発したが、これは、チロシナーゼエピトープが有効にプロセッシングされそしてHLA−A*0201分子と会合して提示されることを示す。この認識の特異性は、2つの無関係なCTLクローンの刺激の欠如(データは示されていない)により及びコントロールのトキソイドCyaA−E5で処理されたDCによるチロシナーゼ特異的クローンの刺激の欠如(図4A)により確証された。チロシナーゼエピトープの提示は、30nMまでのCyaA−Tyrの用量に比例していた。これらの条件下に、処理されたDCの低い認識により及び外因的にロードされた合成ペプチドを提示するそれらの減少した能力(データは示されていない)により示されたとおり、より高い用量はDCに対して毒性であると思われた。
送達システムとしてCyaAを使用する抗原提示の相対的有効性を評価するために、同様なDCに対してパルスされたチロシナーゼ合成ペプチドの滴定曲線も実行された。図4Aに示されたとおり、CyaA−Tyrは、DCによるエピトープの提示を誘発するのに合成ペプチドよりも10倍までより高く有効であった。
CyaA−E5−GnT−VとインキュベーションされたヒトDCは、ペプチドpGnT−VとインキュベーションされたDCと比較して、GnT−V特異的CTLクローンによるIFN−γの弱いが再現性のある産生を誘発した(図4B)。この結果は、ヒトDCが中程度の有効性ではあるとしても、CyaAに挿入されたGnT−Vエピトープを提示することができることを示す。
要約すると、これらの結果は、ヒトDCの、CyaAに挿入されたヒトエピトープをプロセッシングしそして提示する能力を明らかに証明する。
実施例5
応答を誘発しないCyaA毒素構築
エピトープgp100〜280を含みそしてGP100メラノーマ関連腫瘍抗原を形成した挿入された配列YLEPGTVTAを含むCyaA−Mel21は、CTL応答を含まない。同様に、エピトープCEA571〜579を含みそしてがん胎児性抗原からの挿入されたYLSGANLNLを有するCyaA−CEA13は、CTL応答を誘発しない。これらの毒素のいずれもHHDマウスにおける挿入されたエピトープに特異的なCTL応答を誘発しない。更に、いくらかのヒト樹状細胞は、挿入されたエピトープCyaA−Mel21(エピトープgp100〜280)をヒトCTLクローンに提示することができない。ゆえに、この毒素は、多分ヒトにおいても有効ではない。これらの2つの毒素、CyaA−Mel21及びCyaA−CEA13は、CyaA−Tyr及びCyaA−GnTVと同一であるが、挿入された配列においてのみ異なる。故に、エピトープのみが異なりそしてそれ故CyaA−Tyr及びCyaA−GNTVに対する応答はエピトープ特異的である。
最後に、メラノーマタンパク質Mage10からの挿入された配列GLYDGMEHLを有するMage A10/A2エピトープを含むCyaA−Mage毒素は、HHDマウスにおいて非常に良好なCTL応答を誘発するが、上記したプロトコールの下でヒトにおいて有効ではない。故に、マウスにおけるポジティブ応答は、必ずしもヒトにおけるポジティブな応答を示さない。一般に、ヒト応答はエピトープ及び種特異的である。
参考文献
下記の参考文献が本明細書で引用される。各参考文献の全体の開示は、本明細書で頼りとされそして本明細書に引用により組み込まれる。
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HLA−A*0201拘束性メラノーマエピトープを有する組換えCyaAによるCTL応答のインビボ(in vivo)誘発を示す。HHDマウスは0、21及び42日目に1mg明礬の存在下に50μgのコントロールCyaA毒素(●、○)又はメラノーマエピトープを有する組換えCyaA毒素(■、□)(A、CyaA−Tyr;B,CyaA−GnT−V)の腹腔内注射を受け取った。最後の注射の7日後に、免疫マウスからの脾臓細胞を、照射された同系脾臓細胞の存在下に、プライミングペプチドpTyr(A)又はpGnT−V(B)でインビトロ(in vitro)で刺激した。これらのエフェクター細胞の細胞傷害性活性をそれぞれのペプチドでパルスされ(●、■)又は培地のみとインキュベーションされた(○、□)51Cr標識されたRMA−S−HHD標的細胞で測定した。データは二重(duplicates)の平均値を表す(SD<10%)。象限(quadrants)は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表し、そして曲線は3つの実験からのグループ当たりの応答者マウスの平均値±SDを表す。 免疫感作の種々の経路を使用するメラノーマエピトープを有する組換えCyaAによるメラノーマ特異的CTL応答の誘発を示す。パネルA及びB:HHDマウスを、1mg明礬の存在下に(A)又は不存在下に(B)50μgの野生型CyaA(●、○)又は組換えCyaA−Tyr(■、□)により0及び21日目に腹腔内に2回免疫感作させた。パネルC及びE:HHDマウスをアジュバントの不存在下に50μgのコントロール野生型CyaA(●、○)又は組換えCyaA−Tyr(■、□)又は組換えCyaA−GnT−V(■、□)(E)により1回の静脈内注射により免疫感作させた。パネルD及びF:HHDマウスをアジュバントの不存在下に50μgの脱毒素化されたCyaA−E5(●、○)又は脱毒素化された組換えCyaA−E5−Tyr(■、□)(D)又は組換えCyaA−E−GnTV(■、□)(F)により1回の静脈内注射により免疫感作させた。最後の注射の7日後に、免疫マウスからの脾臓細胞を、照射された同系脾臓細胞の存在下に、プライミングペプチドでインビトロで刺激した。細胞傷害性活性を、プライミングペプチドでパルスされた(●、■)又は培地のみとインキュベーションされた(○、□)51Cr標識されたRMA−S−HHD標的細胞で測定した。結果は2〜4実験からの累積データを示す。象限は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表し、そして曲線はグループ当たりの応答者マウスの平均値±SDを表す。毒素及び脱毒素化されたCyaAによる免疫感作後に得られた結果は、t検定を使用して統計的に異ならない。 CyaA−Tyrによるマウスの免疫感作は長く続く特異的記憶CTL活性を誘発することを証明する。HHDマウスを、1mg明礬の存在下に50μgの野生型CyaA(●、○)又は組換えCyaA−Tyr(■、□)により0及び21日目に腹腔内に2回免疫感作させた。最後の注射の3ヶ月後(A)又は5ヵ月後(B)に、脾臓を取り出し、そして特異的CTL活性を、ペプチドpTyrでパルスされた(●、■)又は培地のみとインキュベーションされた(○、□)51Cr標識されたRMA−S−HHD標的細胞で、図1に記載のとおりにインビトロ刺激した後に測定した。象限は、試験したマウスの数に対するポジティブマウスの数を表す。曲線は、1つの実験からのグループ当たりの応答者マウスの平均値±SDを表す。 組換えCyaA−E5−Tyr又はCyaA−E5−GnT−Vとインキュベーションされたヒト樹状(DC)細胞によるヒト特異的CTLクローンの刺激を示す。CyaAの細胞傷害性により、脱毒素化された組換えCyaAのみをインビトロで試験した。ヒト単球由来の未熟HLA−A*0201DCを、CyaA−E5(O)、組換えCyaA−E5−Tyr(●)(A)、CyaA−E5−GnT−V(●)(B)又は関連した抗原性ペプチド(▲)とインキュベーションし、そしてAPC(抗原提示細胞)として使用して抗チロシナーゼCTLクローンIVS−B(A)又は抗GnT−V CTLクローンCMU579 6/3(B)を刺激した。CTLクローンによるIFN−γの分泌を、ELISAにより評価した。結果は、二重ウエル(duplicate wells)からの上清中に放出されたIFN−γの平均濃度として表されそして3つの独立した実験を代表する。平均の標準誤差を示す。

Claims (27)

  1. 組換えタンパク質を含む免疫原性組成物であって、該組換えタンパク質は、
    (a)ボルデテラ種のCyaAタンパク質、又はCD11b/CD18レセプターに特異的に結合し、触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスに影響されない、その断片、及び
    (b)配列がYMDGTMSQVであるチロシナーゼに由来するHLA−A*0201エピトープを含むか又はそれからなるか、又は配列がVLPDVFIRCであるN−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼVに由来するHLA−A*0201エピトープを含むか又はそれからなるペプチド
    を含む、免疫原性組成物。
  2. ボルデテラ CyaA又はその断片と前記ペプチドが、化学的に互いに結合している、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  3. ボルデテラ CyaA又はその断片と前記ペプチドが、遺伝子的に融合されている、請求項1に記載の免疫原性組成物。
  4. ボルデテラ CyaAが脱毒素化されている、請求項1又は2に記載の免疫原性組成物。
  5. 上記ペプチドが、YMDGTMSQVからなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  6. 上記ペプチドが、SSMHNALHIYMDGTMSQVQGSANDPIからなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  7. 上記ペプチドが、VLPDVFIRCからなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  8. 上記ペプチドが、MVLPDVFIRCVVFCLからなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  9. ボルデテラ CyaAが、B.ペルトゥッシス、B.パラペルトゥッシス又はB.ブロンキセプチカに由来する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  10. 組換えタンパク質が、1つより多くのペプチドを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  11. ペプチドが同じであるか、又は少なくとも1つが他とは異なる、請求項10に記載の免疫原性組成物。
  12. 該ペプチドが、CyaAのいかなる許容される部位に挿入される、請求項1及び3〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  13. 該許容される部位が、B.ペルトゥッシス CyaAの残基107−108(Gly−His)、残基132−133(Met−Ala)、残基137−138(Val−Ala)、残基224−225(Arg−Ala)、残基228−229(Glu−Ala)、残基232−233(Gly−Leu)、残基235−236(Arg−Glu)、残基317−318(Ser−Ala)、残基335−336(Gly−Gln)及び残基336−337からなる群より選択される、請求項12に記載の免疫原性組成物。
  14. (1)残基188と189との間のジペプチドLeu−Glnの挿入によって及びコドン224と240の間のペプチドPASVLPDVFIRCGTの挿入によって改変された、ボルデテラ ペルトゥッシスCysA、及び
    (2)残基188と189との間のジペプチドLeu−Glnの挿入及びコドン224と240の間のペプチドPASYMDGTMSQVGTRARLKの挿入によって改変された、ボルデテラ ペルトゥッシスCysA
    からなる群より選択される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物。
  15. アジュバント及び/又は賦形剤を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  16. 該組成物が、免疫療法において用いられる、請求項1〜15のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  17. 請求項1及び3〜14のいずれか1項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸。
  18. 請求項1及び3〜14のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を発現するベクター。
  19. 受託番号I−3111の下に、2003年10月13日にC.N.C.Mに寄託された宿主細胞に含まれるプラスミド。
  20. 受託番号I−2679の下に、2001年5月31日にC.N.C.Mに寄託された宿主細胞に含まれるプラスミド。
  21. 請求項18〜20のいずれか1項に記載のベクター又はプラスミドを含む免疫原性組成物。
  22. 癌を有する患者の処置において用い、該患者にT細胞応答を誘導するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  23. 癌を有する患者の処置において用い、該患者にT細胞応答を誘導するための、請求項21に記載の免疫原性組成物。
  24. T細胞応答がCTL応答である、請求項22又は23に記載の免疫原性組成物。
  25. がんの処置用の薬物の製造のための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の使用。
  26. がんの処置のための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
  27. メラノーマの処置のための、請求項26に記載の免疫原性組成物。
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