PT1576967E - Proteína recombinante que transporta epitopos do virús do papilloma humano inseridos numa proteína adenilato ciclase, ou no seu fragmento, e seus usos terapêuticos - Google Patents

Description

Descrição "Proteína recombinante que transporta epitopos do vírus do papilloma humano inseridos numa proteína adenilato ciclase, ou no seu fragmento, e seus usos terapêuticos" 0 presente documento diz respeito a uma proteína recombinante que transporta epitopos do vírus do papilloma inseridos numa proteína adenilato ciclase, ou num seu fragmento.

Neste contexto a invenção diz respeito a proteínas recombinantes em que a proteína adenilato ciclase (CyaA) actua como um vector proteico para provocar uma resposta imunitária contra epitopos derivados de antigénios do vírus do papilloma em particular de antigénios do vírus do papilloma humano. A invenção diz respeito especialmente a utilização de um vector proteináceo obtido deste modo para fornecer epitopos a células eucarióticas, preferencialmente a células de mamíferos, e especialmente a células humanas. A invenção diz também respeito a polinucleótidos que codificam para a proteína recombinante da invenção conjuntamente com vectores contendo os ditos polinucieótidos, assim como células hospedeiras contendo os ditos polinucleótidos ou vectores. A invenção também diz respeito a aplicações da proteína recombinante acima ou polinucleótidos para o tratamento, ou de infecção pelo vírus do papilloma humano num hospedeiro, assim como para o tratamento ou prevenção de efeitos malignos resultantes de irrfscçâo pelos vírus do guph 1 ledoa humano num hospedeiro, particuiarmente num mamífero hospedeiro. Numa concretização particular, a . para o desenho de compostos adequados a imunoterapia, em particular imunoterapia contra antigénios específicos de tumores ou vírus do papilloma.

Entre os numerosos tipo de vírus do papilloma humano (HPV), os designados como HPVs de alto risco estão ligados ao desenvolvimento de malignidades epíteliais por persistência de infecção do hospedeiro (1) . 0 carcinoma cervical, o segundo cancro ginecológico mais espalhado em todo o mundo 1 , encontra-se associado ' ·Λ'· com a detecção na maior parte das vezes de ADN de HPV 16 e HPV18 (2) . 0 potencial oncogénico destes vírus & atribuído aos produtos expressos pelos genes precoces, i.e., genes E6 e Ξ7, cuja expressão é detectada através do ciclo de replicação do vírus e e necessário para o início e manutenção da transformação maligna. Contudo, a frequência elevada de infecção anogenital com estes tipos HPV oncogéniccs de alto risco (3) contrasta com a baixa proporção de indivíduos que irão eventualmente desenvolver malignidades associadas a HPV, sugerindo um controlo de infecções por HPV de alto risco através de respostas imunitárias. Varias observações reforçaram esta afirmação, tal como a regressão espontânea da maioria das lesões pré-malignas (1), a infiltração de verrugas genitais em regressão, através de células T CD4+ e macrófagos ΠΗ assim como o número elevado de sujeitos infectados encontrado em doentes imunossuprimidos ou imunodeficientes ílj v Além disso, foram detectadas respostas de CD4+ e CD8+ de células T ocntra epitopos de HPV16-E6 e/ ou E7 no sangue dos doentes diagnosticados com malignidades associadas a HPV16 (4-8), assim como no sangue de indivíduos saudáveis (9,10). Em conjunto estas considerações constituem uma razão dv peso para o desenvolvimento de imunoterapia dirigidas para as proteínas alvos E6 e/ ms E7 de HPV16.

Foram desenvolvidas muitas estratégias para vacinas para evitar o crescimento de tumores das linhas celulares tumorigénicas positivas de HPV-16 ........E6 e -E7 em ratinhos C57BU6, através da geração de respostas imunitárias ao epitopo restringido M-fif '·.<·;> Estas estratégias de vacinação incluíram vectores de ADN plasmídíco, virai, ou bacteriano, partículas quiméricas semelhantes a vírus, péptidos sintéticos e proteínas recornbinantes (11) . Infelizmente estas estratégias deram origem a resultados moderadamente satisfatórios em termos de regressão clinica (3) .

Assim, permanece interessante avaliar novos instrumentos para atingir os epitopos de HPV alvo para o sistema imunitário para indução de respostas mediadas por células.

Existe assim uma necessidade de novos vectores adequados para fornecer antigenios de epitopos de HPV para atingir células alvo em condições que permitem provocar uma resposta imunitária humoral e/ ou mediada por células num hospedeiro contra os ditos antigénios. Os inventores constataram que a proteína adenilato ciclase pode ter interesse para desenhar um tal vector. Foram efectuadas várias observações utilizando a proteína adenilato ciclase de Bordetella pertussis, que conduziu a conclusão de que esta proteína pode representar uma base adequada para o desenho de um tal vector eficiente. A adenilato ciclase (CyaA) de Bordetella pertussis possui a capacidade de fornecer o seu domínio catalítico para o citosol de células eucarióticas (12). Assim, os epitopos de células T, CD4+ e CD8+ inseridos no local catalítico da CyaA são processados e apresentados por moléculas MHC de classe IX e I, respectivamente, à superfície das células apresentadoras de antigénios (APC-do inglês antigen presenting cells) (13) Além disso, foi demonstrado recentemente que a CyaA se liga especificamente X XíU:«trina fp, íVC-ii/Xi U-Ç: áv. c modo se direccionar para os epitopos alvo das células T para o Cllllb' da subpopuiação das células dendriticas (15) . Imunização dos ratinhos com uma CyaA recombinante que possuem epitopos adequados conduziu à indução de forte respostas CTL, protecção ccmpleta contra uma provocação virai letal e uma imunidade anti-tumoral profiláctica e terapêutica eficientes (16, 17). A proteína adenilato ciclase (CyaA)foi caracterizada e revelada na que respeita à sua preparação por tecnologia de ADN recombinante especialmente na W093/21324 ou WO02/22169. Na WO WO02/22169 foi descrito que fragmentos de CyaA que compreendem os resíduos 373 a 1706 contêm a estrutura essencialmente requerida para a interacção com o receptor CDXlh/€í)4J.

Mais especificamente, foi descrito mais tarde que a sequência de aminoácidos que se estende a partir do resíduo 1166 até ao resíduo de aminoácido 1281 compreende um determinante para interacção com o receptor CDllb/CD18, e mais particularmente aquela sequência de aminoácidos que se estende do resíduo 1208 ao resíduo 1243 são críticas para a interacção da toxina com COlXb/COM (EP 03291486.3 e 45) .

Os inventores determinaram agora e avaliaram as condições para a construção de uma proteína CyaA recombinante, suportando, i.e. compreendendo epitopos dos antigénios de HPV que podem fornecer os ditos epitopos nas células alvo, especialmente em Células Apresentadoras de Antigénios (APC) de um hospedeiro, incluindo hospedeiros que sofrem de infecção por HPV e das suas transformações malignas.

Neste contexto, a invenção diz especificamente respeito a usís proteína recombinante compreendendo um ou villo.s polípéptidos que suportam um ou vários epitopos um ou tihloís antigénios de HPV, sendo os ditos polípéptidos inseridos no mesmo ou em diferentes Locais permissivos de uma proteína adenilato ciclase (CyaA), ou de um seu fragmento em que o dito fragmento de CyaA retém a propriedades da dita proteína adenilato ciclase para tomar como alvo as células alvo da CyaA, tais como APC, especialmente as células ClHlfc/GIÍIJ * tais como as células dendríticas. Numa concretização particular este fragmento também retém a propriedade de CyaA para permitir a translocação do epitopo inserido no citosol de uma célula alvo. A translocação do epitopo para o citosol da célula alvo pode ser permitida se o fragmento de CyaA retiver o domínio da proteína que permite a translocação do seu domínio catalítico. A capacidade da proteína recombinante para tomar como alvo as células CDllb/CD18 pode ser testada especialmente de acordo com os métodos revelados na EP 03291486.3 e (45) ou na WO02/22169. Além disso, a capacidade da proteína recombinante para translocar o epitopo para o citosol da célula alvo pode ser testada aplicando o método descrito na WO02/22169.

Numa concretização preferida, o fragmento da CyaA pode ser constituído por duas porções diferentes de CyaA que não são naturalmente contíguas em CyaA. Como exemplo, pode-se citar o domínio catalítico de CyaA, e , os 400 resíduos de aminoacidos da parte N terminal de CyaA e um fragmento compreendendo os resíduos de amínoácidos 1208 a 1243 necessários para atingirem as células alvo CDllb/CDl8. cerca

Na definição acima, a expressão "polipéptido" descreve quaisquer sequências de aminoácidos incluindo oequéuc::o;:.: de aminoácido que sofrem modificações pós- tradução, especialmente sequências de aminoácidos possuindo pelo menos seis resíduos de aminoácidos, e incluindo sequências de aminoácidos possuindo especíalmente 5 a 500 resíduos oo de cerca de 500 a cerva de 100, cu de cerca de 10 a de li resíduos desde que a stAptecuís de compreenda pelo menos um epitopo, i.e. uma sequência de aminoácidos contra a qual uma resposta imunitária possa ser obtida após a sua administração a umo célula alvo, vantajosamente num hospedeiro, especialmente num hospedeiro mamífero. Polipéptidos de acordo com esta definição podem por isso ser restringidos a epitopos, mesmo a um epitopo único, ou podem compreender vários epitopos diferentes ou idênticos, ou podem também abranger antigénios de comprimento completo de um patogénio, i.e. de epitopos de vírus do papilloma humano. Na presente invenção os epitopos abrangem sequências de aminoacidos que estão envolvidas na resposta imunitária humoral e/ ou na resposta imunitária mediada por células, especialmente na resposta imunitária de células T. Neste contexto, os epitopos nos polipéptidos das moléculas recombinantes da invenção incluem aqueles que são processadas por APC (células apresentadoras de antigénios) num hospedeiro, especialmente aqueles reconhecidas na associação com moléculas MHC de classe I (complexo principal de histocompatibilidade, MHC do inglês Major Histocompatibility Complex) tais como epitopos, cujas células alvo são linfócitos T CD8+ ou epitopos reconhecidos em associação com moléculas MHC de classe II tais como aquelas cujas células alvo são linfócitos T CD4+.

De acordo com a presente invenção, antigénios HPV a partir dos quais polipéptidos que suportam um ou vários epitopos podem ser desenhados, são preferencialmente aqueles derivados de proteínas envolvidos especialmente no inicio ç/ ou na manutenção de efeitos malignos a seguir a uma infecção por HPV e abrangem os chamados antigénios tumoraís, i.e. antigénios associados com o desenvolvimento do tumor relacionado com infecção por HPV, que pode prctmçgsr uma resposta imunitária num hospedeiro e reagir especificamente com anticorpos ou células T num hospedeiro,

Os polipéptidos que suportam epitopos de acordo com a invenção podem ser derivados de antigénios nativos ou maduros de HPV incluindo a utilização do antigénio completo ou incluindo a selecção de fragmentos, especialmente fragmentos antigénicos, especialmente epitopoç dos ditos antigénios, em vez da proteína completa ou por modificação do dito antigénio ou das suas partes antigénicas seieccionadas ou epitopos, especialmente para melhorar a sua capacidade de induzir ou provocar uma resposta imunitária num hospedeiro quando combinado com uma proteína CyaA na molécula recombinante. Neste contexto, para ilustrar as varias modificações possíveis de tais epitopos, estes polipéptidos abrangem epitopos que são flanqueados por sequências flanqueadoras naturais, ou não naturais do antigénio do qual são derivados e também abrangem epitopos ou sequências de aminoácidos contendo epitopos que foram modificados quimicamente para melhorar as propriedades imunitárias. Estas modificações podem ser vantajosas para melhorar a eficiência dos polipéptidos obtidos em associação com a proteína CyaA.

Algumas modificações particulares são reveladas como exemplos a seguir, incluindo modificações que abrangem alterações na carga dos polipéptidos, especialmente por inserção de resíduos de aminoacidos carregados positivamente.

Neste contexto os polipéptidos da invenção abrangem também polipéptidos semí-sintétícos ou sintéticos.

De acordo oom uma concretização particular, os polipéptidos derivados de antigénios HPV contêm cerca de 5 a cerca de 500 ou cerca de 5 a cerca de 100, por exemplo cerca de 10 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos.

De acordo com a invenção, a adenilato cíclase (CyaA) ê utilizada corno uma proteína de comprimento completo, ou como um «m; fragmento como revelado acima.

Vantajosamente, a proteína CyaA, ou um seu fragmento é uma proteína, ou um seu fragmento que é o resultado da co--expressão numa célula, especialmente numa célula recombinante, de ambos os genes cyaA e cyaC. Foi de facto mostrado que para ter propriedades invasivas para as células alvo, a CyaA tem que sofrer modificações pós-tradução que são conseguidas pela expressão dos genes cyaA e cyaC (W093/21324).

Numa concretização particular da Invenção, os fragmentos da proteína CyaA são fragmentos que possuem pelo menos 30 resíduos de aminoácidos e podem ter até cerca de 1300, em particular até cerca de VOO resíduos de aminoácidos, preferencialmente de cerca de 50 a cerca de 150 resíduos de aminoácidos; os ditos fragmentos compreendem numa concretização particular, resíduos de aminoácidos de 1166 a 1281 de CyaA ou resíduos de aminoácidos de 1208 a 1243 da proteína CyaA para interacção com as células alvo CDllb/Cdl8. Assim, um fragmento particular abrange todo ou parte do terminal C da proteína nativa que é responsável pela ligação da proteína a membrana da célula alvo e/ ou ao receptor CÍDlIb/tiDiiS * e para a administração subsequente do(s) epitopo(s) contidos nos polipéptido(s) no citosol da célula (12). Um fragmento particular da proteína CyaA de acordo com a invenção contém resíduos de aminoácidos 372 a 1706 da proteína CyaA. Outro fragmento particular é um que corresponde à proteína CyaA em que os resíduos de aminoácidos 225 a 234 foram suprimidos, fornecendo assim um fragmento de CyaA contendo os resíduos l a 224 e 235 a 1706.

Numa concretização particular da i r , a proteína adenílato ciclase é uma prote · a . Numa preferida, a prcfííl1 - , da espécie

Bordetellla.

Entre as espécies de interesse da Bordetella de acordo com a invenção, uma delas é Bordetella pertussis. Outras estirpes de Bordetella de interesse são aquelas de Bordetella parapertussis ou Bordetella bronchiseptica. As sequências da proteína CyaA da B. parapertussis foi revelada especialmente sob c número de acesso NC 002923.3 (como uma sequência de 1740 aminoácidos) e em Parkhill J. et «I (Nat. Genet. DOI, 10 (2003) e para B. bronchiseptica em Betsou F. et al (Gene 1995, Agosto 30; 162(1): 165-6!. A Bordetella pertussis é o agente causador da tosse convulsa e secreta entre outras, varias toxinas Incluindo a toxina pertussis bem conhecida (PT) e a toxina da adenilato ciclase (CyaA), que é um factor de virulência crítico da bactéria e é um dos antigénios protectores contra a infecção B. pertussis. A proteína adenilato ciclase de Bordetella pertussis é uma toxina que foi descrita como uma proteína bifuncional de 1706 resíduos, compreendendo um domínio catalítico N-terminal de 400 resíduos de aminoácidos e uma parte C-terminal de 1306 resíduos que é responsável pela ligação da toxina a membrana da célula alvo e subsequente administração do resíduo catalítico para o citosol da célula (12) . A proteína CyaA é sintetizada como uma protoxina inactiva que é convertida numa tcxina activa por palmitoilação pós-tradução de dois resíduos de lisina internos (lisinas 860 e 983). Esta modificação pós-tradução necessita a expressão do gene de cyaA de um gene acessório, i.e., cyaC que se encontra localizado perto de cyaA no cromossoma 1', pertussis. C cyaA de Bordetella pertussis foi descrito como sequência de aminoácidos e uma sequência micleétl&iè-a por Glaser, P. et ai, 1988, Molecular Microbiology 2ít} t 19-36. Neste contexto, quando resíduos de aminoácidos ou sequências, ou sequências nucleótidicas da proteína CyaA de B. pertussis, são citadas na presente invenção as suas posições são dadas em relação as sequências reveladas na dita publicação de Glasser et al. 1988.

Na proteína recombinante de acordo com a invenção, os polipéptidos que suportam um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de HPV são inseridos num ou vários locais permissivos da proteína CyaA.

Para a presente invenção um "local permissivo" é um local da sequência da proteína CyaA, em que um polipéptido pode ser inserido sem afectar substancialmente as propriedades funcionais da proteína CyaA, especialmente sem afectar substancialmente o processo de atingir as células alvos, particularmente o processo de atingir as células APC pela CyaA, incluindo sem substancialmente afectar a ligação específica ao receptor CD11 b-CD18 e vantajosamente sem afectar substancialmente os domínios da proteína envolvidos no processo de translocação do(s) epitopo(s) para a célula alvo.

Locais permissivos da adenilato ciclase da Bordetella pertussis que permitem a translocação do domínio catalítico de CyaA e assim, a translocação dos epitopos inseridos em tais locais permissivos incluem, mas não estão limitados a resíduos 137-138 (Val-Ala) , resíduos 224-225 (Arg-Ala), resíduos 228-229 (Glu-Ala), resíduos 235-236 (Arg-Glu), e resíduos 317-318 (Ser-Ala) í (44) Sebo et a , 1995). Os locais adicionais seguintes permissivos também estão incluídos nas concretizações da invenção: resíduos 107-108 (Gly-His}, resíduos 132-133 (Met-Ala), resíduos 232-233 (Gly-Leu), e 335-336 (Gly-Gln) e 336-337. (43)

Para outras espécies de Bordetella os Locais permissivos correspondentes podem ser definidos por comparação de sequências e determinação dos resíduos correspondentes,

De acordo com outra concretização, o polipéptido pode também ser inserido alternativamente numa e/ ou noutras extremidades da proteína de CyaA ou de seu fragmento.

Fragmentos particulares de prcteínas de CyaA para utilização para o fim da invenção são aqueles compreendendo até 1300 aminoácidos ou de cerca de 30 a cerca de 500 resíduos de aminoácidos, vantajosamente cerca de 50 a cerca de 150 resíduos de aminoácidos em particular os fragmentos que abrangem os resíduos de aminoácidos 1166 a 1281 da proteína CyaA nativa, vantajosamente 1208 a 1243 da proteína CyaA nativa.

Assim, de acordo com a invenção, a "inserção" de um polipéptido na proteína CyaA para fornecer uma proteína designada como recombinante também referida como uma "proteína híbrida", abrange a inserção genética especialmente através de tecnologia de ADN disponível. Alternativamente, a "inserção" também abrange uma inserção não genética, incluindo inserção química por exemplo acoplamento covalente efectuado numa extremidade da CyaA ou do seu fragmento, ou acoplamento não covalente. A inserção não genética pode ser especialmente de interesse, quando o polipéptido a ser inserido é sintético ou semi-sintético. Métodos para acoplar um fármaco a um polipéptido são bem conhecidos do estado da técnica e compreendem por exemplo ligação dissulfídica, através da utilização de N-pirídil sulfonil -sulfidrilo activado.

Em particular é possível enxertar moléculas compreendendo especialmente polipéptidos da invenção a CyaA através de uma iihvçlo química, ou através de uma inserção genética para stihgif alvos in vivo de áéiuli-s àlvú de CyaA, tais como ACP, por exemplo CD1XWCD1S e em particular para o citosol das ditas células. De facto, quando se acopla uma molécula correspondente a um dado r5cpo de uma ciluxs T CD8T ao domínio catalítico da CyaA 0*v:tos: vt;< ou através de uma ligação dissulfidica, ou através de inserção genética, constatou-se que a ísoLéculd submetida a engenharia pode provocar uma resposta GTL ín vivo especifica, mostrando deste modo que o epitopc da célula T £Uff é translocado para o citosol de células que expressam CDllb.

Numa concretização especifica, a adenilciciase recombinante utilizada para o fabrico de um vector proteinaceo é uma CyaA ou seu fragmenta modificado especialmente, através da inserção de resíduos de cisteína contendo uma ou várias molécula(s), compreendendo especialmente polipéptidos da invenção, acoplados quimicamente, através de uma ligação dissulfidica a resíduo(s) de cisteína inseridos geneticamente localizaaos no domínio catalítico da dita adenilato ciclase.

De facto, moléculas múltiplas compreendendo especialmente polipéptidos da invenção podem ser acoplados quimicamente a adenilato ciclases através de uma ligação dissulfidica a diferentes resíduos de cisteína localizados em diferentes locais permissivos no domínio catalítico.

Com vista a propor uma proteína recombinante adequada para o desenho de produtos que possuem a capacidade de provocar uma resposta imunitária, especialmente uma resposta imunitária mediada pela célula num hospedeiro e em particular para desenhar tais produtos capazes de provocarem uma resposta imunitária contra efeitos malignos observados num hospedeiro infectado com HPV, os inventores propuseram construir péptidos que suportam epítopos de estirpes HPV altamente oncogénicas e especialmente de antigénios de estirpes seieccíonadas entre HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 ou HPV58.

Entre estas estirpes, a HPV 18 e a Euvoii mio de interesse particular. u s e vsguoçl-sl/ssivtsi um alvo particular para o tratamento de um hospedeiro infectado com HPV, devido a sua associação com o desenvolvimento de cancro cervical num hospedeiro mamífero especialmente num ser humano, A partir destas estirpes de HPV os inventores propõem construir poiipéptidos que suportam epitopos a partir de antigénics seleccionados entre as proteínas Ll, L2, El, E?, E4 e E5.

Alternativamente ou em combinação, os inventores também propõem construir tais poiipéptidos que suportam epitopos a partir de proteínas E6 ou E7 de HPV.

Numa concretização particular da presente invenção as proteínas E6 ou E7 de HPV16 ou as proteínas E6 ou E7 de HPV18 são utilizadas para o desenho de poiipéptidos que suportam epitopos.

Estas proteínas de HPV e os seus aminoácidos e sequências nucleótidicas foram reveladas em Seedorf, K. et ai (Human papillovirus type 16 DNA sequence. Virology, 145: 181-185, 1985) para HPV16, Cole S.T. Danos 0. (Nucleotide sequence and comparative analysis of the human papillomavirus type 18 genome. Phylogeny of papillomavirus and repeated structure of the E6 and E7 gene products. J. Mol. Biol. 193:599-606 (1987)) ou em Fernando G. J. et al (T-heiper epitopes of the E7 transforming protein of cervical câncer associated human papillomavirus type 18 (HPV18) Virus Res. 1995 Apr. 36(1): 1-13).

As proteínas E6 e E7 são oncoproteínas expressas especialmente por HPV16 ou HPV 18 através do ciclo replicativo do vírus e mostrou-se serem necessárias para o início e manutenção da transformação maligna das células hospedeiras, a seguir à ínfecção com & estirpe de HPV. Por isso, ambos estes antígénios específicos de tumores são considerados como alvos potenciais para a ímunoterapia adoptiva mediada por CTL.

De acordo com uma concretização particular da presente invenção, a proteína recombinante compreende polipéptidos múltiplos cada um deles suportando um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de HPV.

Por exemplo, tais polipéptidos múltiplos podem ser construídos a partir das proteínas E6 e E7 de uma estirpe de HPV, especialmente de HPV16 ou HPV18. De acordo com outro exemplo, estes polipéptidos múltiplos podem abranger epitopos derivados de proteínas E6 ou E7 tanto de HPV16 e HPV18.

Polipéptidos múltiplos podem também consistir em diferentes epitopos que suportam fragmentos de uma proteína por exemplo uma proteína E7 ou E6 que são inseridos em diferentes locais permissivos de interesse da proteína CyaA.

Outra proteína recombinante particular de acordo com as definições acima é uma CyaA recombinante em que polipéptidos múltiplos que suportam epitopos abrangem um fragmento que compreende os resíduos 1 a 29 ou um fragmento que consiste nos resíduos 1 a 29 ou um fragmento compreendendo os resíduos 42 a 98 ou um fragmento que consiste nos resíduos 42 a 98 da proteína E7 de HPV16, ou polipéptidos múltiplos compreendendo ou consistindo em ambos os fragmentos inseridos em diferentes locais permissivos da proteína CyaA.

Outra proteína recombinante de acordo com a invenção é uma proteína em que polipéptidos múltiplos abrangem um fragmento possuindo a sequência de aminoácidos RAHYNIVTF (S7s:;..rd e/ ou GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTΗVDIR .

Observou-se que o número de resíduos de aminoácidos dos polipéptidos inseridos nos locais permissivos da proteína CyaA é tal que permite polipéptidos constituídos por antigénios de comprimento total, especialmente proteínas de comprimento total líê ou E7 de HPV sejam inseridas na proteína CyaA ou nos seus fragmentos.

De acordo com uma concretização particular da invenção, o polipéptido incluído na CyaA recombinante é a proteína E7, especialmente a proteína E7 do HPV16, inserida entre os codces 224 e 235 de CyaA.

Numa outra concretização, a proteína recombinante da invenção compreende polipéptidos múltiplos alguns dos quais são poiipéptidos que suportam um epitopo ou vários epitopos de um ou vários HPV, e outros polipéptidos que suportam epitopos de outros patogéneos.

Numa outra concretização particular, a proteína recombinante da invenção compreende ainda um ou vários epitopos originados a partir de um agente patogénico diferente. Associação de epitopos originários de Chlâmydia ou do retrovlrus de HIV ou HPV, HBV, HCV, adenovirus EBV, vírus de herpes, vírus HTLV.l e CMV, com os epitopos originários de HPV podem ser especialmente de interesse.

De acordo com outra concretização particular da invenção, os polipéptidos que suportam epitopos foram modificados no que diz respeito a sua sequência de aminoácidos nativa, por exemplo para diminuir o número de resíduos de aminoacidos negativamente carregados na sequência, Uma tal modificação pode ser obtida removendo alguns destes resíduos de aminoácidos carregados negativamente ou também adicionando alguns resíduos de aminoácidos carregados positivamente, especialmente como reçiduos flanqueadores dos epitopos, Polipéptidos compreendendo assim resíduos de aminoácidos menos carregados negativamente poderiam f a vrfC·; ·:' a translocação do domínio catalítico da proteína de CyaA no citosol das células alvc.

Os polipéptidos que suportam os epitopos podem também ser desenhados de modo çpf; estejam desdobrados Expressão inglesa unfolded), quando são inseridos na CyaA o que melhora a eficiência da internalização da proteína CyaA recombinante nas células alvo. Um tal desdobramento dos polipéptidos que sofrem dobragem (expressão inglesa fclding) como consequência do seu conteúdo em amínoácidos, podem ser obtidos, por exemplo, removendo ou substituindo resíduos de cisteína de modo a evitar a formação de ligações dissulfídicas que podem estar envolvidas na dobragem de polipéptidos. Nalguns casos é possível evitar a dobragem dos polipéptidos preparando-os na presença de agentes redutores para se conseguir evitar uma nova dobragem in vivo.

Vantajosamente para se preparar a proteína recombinante da invenção, a actividade enzimatica da proteína CyaA, i.e., a sua capacidade de converter ATP em cAMP, foi inactivada. Uma tal inactivação pode ser obtida como resultado de inactivação genética. A título de exemplo, a inactivação genética pode ser obtida como resultado da introdução de um dipéptido num local da sequência de aminoácido de CyaA que è parte do local catalítico (por exemplo entre 188 e 189) . Tais proteínas CyaA inactivadas são ilustradas nos exemplos seguintes. A proteína recombinante da invenção e vantajosamente capaz de provocar uma resposta imunitária mediada pela célula. Inclui CTL e Th, especialmente resposta Thl, incluindo a resposta a célula T CD4" e/ ou a resposta à célula T Í/Mv A capacidade da proteína recombinante para provocar esta resposta imunitária mediada pelt célula foi mostrada ser suficiente para evitar o crescimento do tumor in vixm ou mesmo para permitir a regressão do tumor num animal. A invenção também diz respeito a um polínucleótido que codifica uma proteína recombinante definida acima.

Um polinucleótido da invenção pode ser inserido num vector de expressão para fornecer um vector de expressão recombinante adequado para a expressão da proteína recombinante da invenção. Tais vectores de expressão incluem plasmíaeos, cosmídeos fagemídeos, vectores virais.

Um vector recombinante pode ser um que é adequado para a expressão em células prorarióticas, especialmente em bactérias ou pode ser um vector de expressão adequado para expressão em células eucarióticas especialmente em células de mamíferos, e vantajosamente em células humanas. A invenção diz especialmente respeito a vectores que consistem em plasmídeos que codificam para uma proteína recombinante de acordo com a invenção, tal como: PTRACE5-HPV1GE7r:;íí.: (também designada como CyaAES- t depositada na CNCM (Paris, França) em 18 de Março, 2004 sob o número CNCM 1-3191; (também designada como CyaAE5-, depositada na CNCM (Paris, Françaj em 18 de Março, 2004 sob o número CNCM 1-3190, ou construção pTRACE5-HPVlS17.^:.iíT, A invenção também compreende uma célula hospedeira, especialmente células procarióticas, ou células eucarióticas, por exemplo células de mamíferos, incluindo células humanas, transformadas com um polinucleótido ou um vector de acordo com a invenção. A invenção diz especialmente respeito a células hospedeiras depositadas na CNCM sob o número de acesso N° CNCM 1-3190 e Na de acesso CNCM 1-3191. A invenção também diz respeito a uma composição imunogénica que compreende como principio activo, uma proteína recombinante como definido acima ou um polinucleótido ou um vector de expressão como definido acima. O dito principia Mvbòo da composição imunogénica pode ser formulado em associação com um veículo fisiologicamente aceitável, excipiente, suporte, ou diluente ou uma combinação destes para administração a um hospedeiro.

Uma composição imunogénica de acordo com a invenção e vantajosamente desenhada para induzir uma resposta imunitária mediada peia célula, em particular uma resposta imunitária mediada por uma célula T num mamífero hospedeiro. Preferencialmente è capaz de induzir uma resposta citolítica imunitária CTL mediada por uma célula especialmente CD8+.

Outra composição imunogénica de acordo com a invenção é uma que pode induzir uma resposta imunitária humoral.

De modo a melhorar a capacidade da composição imunitária da invenção para induzir uma resposta imunitária pode ser interessante combinar o princípio activo com um adjuvante e/ ou um agente tensioactivo e/ ou substâncias imunomoduladoras (tais como citocinas ou quimocinas).

Adjuvante inclui por exemplo, lipossomas, fases oleosas, tais como adjuvantes do tipo de Freund, geralmente utilizadas na forma de uma emulsão com uma fase aquosa, ou pode compreender sais inorgânicos insolúveis em água, tais como hidróxido de alumínio, sulfato de zinco, hidróxido de ferro coloidal, fosfato de cálcio, ou cloreto de cálcio. A composição imunogénica de acordo com a invenção é utilizada vantajosamente para induzir uma resposta imunitária num hospedeiro, ou por iniciação e/ ou por reforçar a dita resposta, especialmente para imune-terapia. Especialmente uma composição imunogénica da invenção pcae ser de interesse para a prevenção do inicio, ou manutenção de uma transformação maligna, devida a uma mfecção por HPV num hospedeiro, ou para c tratamento de um doente que sofre de transformação maligna devido a infecção por HPV, especialmente HPV-16, ou HPV-18.

Uma tal composição imunoterapêutíca pode ser de interesse partrcular para a terapia de proliferação celular não controlada num hospedeiro resultando num estado tumorigénico, especialmente para a imunoterapia do cancro em particular para a imunoterapia do cancro cervical associado com infeccão por HPV. Disponibilíza por isso meios para o desenho de vacinas terapêuticas especialmente adequadas para o tratamento de estados malignos devido a infecções por oncovírus, incluindo estados tumorais.

Quando utilizado na presente invenção as expressões "tratamento", ou "tratamento terapêutico" abrangem os efeitos dos compostos revelados no presente documento, de que resulta um efeito benéfico para o doente submetido a tratamento, sendo os ditos efeitos observados a um nível celular ou a um nível clínico, incluindo como resultado do tratamento uma melhoria da condição do doente ou um estado de remissão, ou a recuperação de um estado saudável. Quando o estado maligno tratado é proliferação celular não controlada, ou desenvolvimento de tumor ou persistência, o efeito benéfico pode compreender a estabilização, ou preferencialmente a prevenção, paragem, ou inversão de proliferação não controlada ou a regressão do tumor.

Uma composição destinada ao tratamento de um estado maligno descrito acima pode compreender vantajosamente uma dose de principio activo que pode ir ae cerca de 1 a cerca de 1000 μρ de proteína recombinante preferencialmente de cerca de 10 a cerca de 500 μρ de uma proteína recombinante. Quando uma composição compreende como princípio activo uma proteína recombinante da invenção a dcse pode compreender cerca de 0,05 a cerca de 10 μς de proteína recombinante, preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 1 de proteína.

Dependendo do estado a ser tratado a pcvit ser administrada localmente as nível da lesão, ama ou várias vezes, por exemplo em intervalos regulares de vários dias, por exemplo, de 5 a 10 dias. Também pode ser administrada sistemicamente. A invenção também áíz respeito a uma composição para vacina, especialmente uma composição formulada para administração a um hospedeiro mamífero, preferencialmente um ser humano compreendendo uma proteína recombinante de acordo com a definição acima, ou um polinucleótido como definido acima, ou um vector contendo tal polinucleótido, preferencialmente num ser humano hospedeiro e se adequado um veículo farmaceuticamente aceitável para provocar uma resposta imunitária, incluindo uma resposta imunitária mediada pela célula, e/ ou uma resposta humoral. A invenção diz também respeito a uma composição de um fármaco compreendendo uma proteína recombinante, ou um polinucleótido, ou um vector da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável, para evitar ou tratar infecções por HIV.

De acordo com outra concretização, uma composição de um fármaco compreende uma proteína recombinante, polinucleótido ou um vector de acordo com a invenção com um veículo farmaceuticamente aceitável, para a prevenção ou tratamento do início, ou manutenção de uma transformação maligna devido a uma infecção por HIV num hospedeiro.

Uma composição de um fármaco compreendendo uma proteína recombinante ou um vector e um veiculo farmaceuticamente aceitável para a imunoterapia do cancro. A invenção também diz respeito à utilização num doente de proteínas recombinantes compreendendo uma proteína bacteriana especialmente uma toxina bacteriana (preferencialmente na sua forma toxoide), ou um seu fragmento, adequado para ser ut:i 1 it&fc como um vecmor para provocar uma resposta imunitária, í.e. uma resposta imunitária humoral ti ou mediada por uma célula num hospedeiro, cuja proteína, ou o seu fragmento é modificado por inserção de um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de um ou vários oncovírus para o tratamento de uma infecção por oncovhrus. É proposta uma tal proteína recombinante em particular para o tratamento de efeitos malignos, especialmente tumores provocados por infecção por tais oncovírus.

Exemplos de proteínas bacterianas adequadas como vectores para transportar epitopos de antigénios de oncovírus são OmpA da klebsiella ou as seguintes toxinas, toxina Shiga incluindo a sua subunidade p (Haicher N. et al. J Immunol. 2000, 165:3301-8) toxina do Antrax (Goletz TJ et al., PNAS USA 1997, 94: 12059-64), toxina da difteria (Stenmark H. et al., J. Cell. Biol. 1991, 113: 1028-32), ou Pseudomonas Exotoxin A (Donnelly JJ. Et al, PNAS USA 1993, 90:9530-4). Os oncovírus cujos antigénios podem fornecer epitopos para preparar polipéptidos para inserção na proteína bacteriana inclui HPV, HBV, HCV, adenovírus EBV, vírus de herpes, HTLV.l vírus e CMV. A descrição que é disponibilizada acima para a proteína recombinante CyaA, utilizada como um princípio activo, poderia ser adaptada para outras proteínas bacterianas e antigénios de oncovírus. A invenção também diz respeito a um kit para o diagnóstico de uma infecção com HPV ou para a vigilância imunológica de tal infecção que compreende uma proteína recombinante, um polinucleótido, ou um vector de expressão de acordo com a invenção. A invenção também diz respeito à utilização da proteína recombinante acima, polinucleótido, ou vector da para a preparação de medicamentos para a tratamento ou para a prvvÇíibiò de infecção por HPV num doente, A invenção diz também respeito à utilização da proteína recombinante acima, polinucleótido, ou vector da invenção para a preparação de medicamentos para imunoterapia contra o início e manutenção de uma transformação maligna devido a infecção por HIV num doente. A invenção também diz respeito a om método para o diagnóstico in vitro ou para a vigilância ímunológíca de uma infecção por HPV, compreendendo: - a exposição de células T obtidas a partir de um mamífero, especialmente a partir de um ser humano a uma proteína recombinante da invenção, - detecção de uma modificação na activação de células T.

Numa concretização particular a proteína recombinante pode ser utilizada na preparação de medicamentos para a prevenção de infecção por HPV ou para o tratamento de hospedeiros que sofrem de infecção por HPV, incluindo hospedeiros que albergam um tumor devido a tal infecção.

Outros detalhes que caracterizam a invenção são revelados e ilustrados nos exemplos seguintes e nas figuras.

Legenda das Figuras

Figura 1. Construção e purificação de CyaAs recombinantes de (A) Mapa esquemático de pTRACE5 em que locais de restrição reievantes e sequências inseridas são indicadas. (81 Representação esquemática de CyaA mostrando o local de inversão do dipéptído LQ para inibir o sua actividade enzímátíca. São também indicadas as inserções da proteína HPV16-E7. Está sublinhado o epitopo restringido de HPV16-E7 !H(-d:::í'd (C (80:S.11 to SDS-Page do CyaAs recombinantes de HPV16-E7. Cinco mícrogramas das proteínas purificadas foram separadas num gel de SDS poliacrilamida 4-15% e coradas com azul de Coomassie. Banda 1: tipo selvagem: CyaA; banda 2; Cy-sA·· EÍA?. > v banda 3: C'y-1:7Γ;: =; ^ banda 4: Cy-tiv-f . (D) Análise de transferência de Western de

CyaAs recombinantes de HPV16-E7. A seguir a SDS-PAGE as proteínas purificadas foram electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose que foi posteriormente sondada com um anticorpo anti-HPV16-E7 monoclonal de ratinho. Banda 1,2: CyaA de tipo selvagem (2 e 8*4 yg, respectivamente) Banda 3, 4 e 5: , " e Ry-\ % ; respectivamente, 0,4 pg de cada proteína.

Figura 2. Indução de respostas da célula T por CyaAs recombinantes de HPV16-E7. (A) C57BU6 (a, b, c) , (d), MHC classe (e) e CDRO'1^ (f) ratinhos foram imunizados i. v. no dia 0 com 50 μg de (b) > ou CyaA-E7â30^42; (c, d, e e f) . Sete dias mais tarde os animais foram sacrificados os esplenócitos foram novamente estimulados in vitro durante 5 dias com 1 pg/ml de péptido H8V18····Κ'Α·: ·:·. na presença de esplenócitos isogénicos irradiados, e utilizados como efectores contra células alvo TC-1 (quadrados a cheio) ou EL4 (quadrados em branco) . Esplenócitos de ratinhos tratados com CyaAES-cysOVA transportando o epitopo não relevante e novamente estimulados in vitro durante 5 dias com 1 pg/ml de péptido lyÇlíA-E/íj./rf na presença de esplenócitos isogénicos irradiados também se encontram representados (a, triângulos a cheio). foi avaliada a lise alvo por libertação de 51Cr. Os dados representam a percentagem média dos valores da lise especifica (n= número de animais é indicado em cada gráfico), assim como as gamas interquartis. (B) de cèialas produtoras de IFN-γ específicas de MFCiáedC? após imunização com a CyaAs recombinante de HPV16-E7. Ratinhos C57BU6 foram imunizados como em A com CyaAES-cysOVA (círculos) . (quadrados), CyaÃ-E'??%!·:; (triângulos), ou (losangos) . Sete dias ma is tarde células de baço Isoladas de ratinhos imunizados foram cultivadas in vitro durante 36 h sem estsmulação : ; .o. sem péptido, símbolos a cheio) ou com I μg/ml de péptido E7Í::...:.·. (símbolos a cheio) na presença de esplenócitos isogénicos irradiados. Os dados são expressos como o número de SFC por baço e o resultado de ratinhos individuais de três experiências independentes são representados para cada grupo. As barras horizontais representam a resposta média de cada grupo.

Figura 3. CyaAs recombinantes de HPV16-E7 induzem uma resposta Thl específica de HPV1617. (A) Ratinhos C57BU6 ou foram deixados por tratar, ou foram iniciados i. v. com 50 μς de CyaAES-cysOVA (círculos), (triângulos), (Triângulos ihViibtidriut), ou (losangos). Sete dias mais tarde, células de baço foram estimuladas in vitro com 10 μg/ml de proteína His-Tag-HPV16-E7 e os sobrenadantes foram testados quanto ao teor de IFN-γ 72 horas mais tarde. Resultados de ratinhos individuais de 4 experiências independentes encontram-se representados e expressos como a concentração de libertação de XFN-γ no sobrenadante a partir de poços em duplicado. Linhas de base obtidas com esplenócitoç não estimulados novamente são subtraídas. Inserção: estimulação in vitro com i de péptido 1¾... n. Barras horizontais representam a resposta média de cada grripo:., (B) Mesmo que em ÍA) com excepção de que os sobrenadantes foram testados qúábto ao teor em IL-5. liaiUi liados de ratinhos ihdilvl duais: de duas experiências independentes encontrara-se representados e expressas como a concentração de IL-5 libertada no sobrenadante a partir de poços em duplicado.

Figura 4. Vacinação terapêutica com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 irradica tumores estabelecidos.

Ratinhos foram enxertados no dia 0 com 5x10" células tumorais TC-1. No dia 10 os ratinhos foram tratados com uma injecção i.v. de (C s, ÚféA-W?mi (D)» ou ΟνχΟ'··?:0ίΛ.;.::;···::; (E) . Os ratinhos que não foram tratados (A), ou injectados com uma CvaAES-cysOVA (B) foram tomados como controlos. Os ratinhos foram mortos, quando o tamanho do tumor atingiu 1000 rnirl, ou quando o estado sanitario dos animais o ordenou (tumor em necrose, perda de peso rápida > 20%) de modo a evitar sofrimento desnecessário. Dois ratinhos tratados com CvàA-ldà·.:·;: que mais tarde desenvolveram tumores progressivos (*) foram sacrificados para continuação da investigação (ver Fig. 6).

Figura 5. Vacinação terapêutica com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 resultam numa sobrevivência prolongada.

Foi efectuada a vacinação terapêutica como descrito na Fig. 4. Após injecção com células tumorais TC-1, ratinhos (5 a 10 por grupo) foram imunizados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 no dia +1, +5 ou ilO como indicado nos gráficos. Foram deixados ratinhos por tratar (quadrados a cheio, linha a cheio), ratinhos tratados com placebo, com CyaÃE5-cysOVA (quadrados vazios, linha a tracejado), ou tratados com (triângulos abertos), Oamlvddl r-rn tapara$; j ou Cyãâ·''a tu;:i:is·····:·!: (aaaarysaa vazios t . varra 100 --00 que no dia +5 de experiência terapêutica, as curvas de sobrevivência ae animais tratados com Cytll-ltlq,;., e CyaA- lllq:encontram-se assente Em todos os casos a sobrevivência de animais tratados; 0¾¾ CpAa de HPV16-E7 aumentou significativamente quando comparada com os animais não tratados, ou com os animais tratados com placebo :p<0,Oi; .

Figura 6. Explantes de células tumorais TC-1 obtidos a partir de tumores de crescimento tardio perdem a expressão da molécula de Í^2D"b

Em experiências de rejeição de tumor, nalguns animais vacinados com ·. houve crescimento de tumores mais tarde durante as experiências (Fig. 4, *5. Foram sacrificados dois animais para obter explantes dos tumores. Estas células tumorais, TC1-A1 e A2, assim como células TC1 nativas e A2 e também as células TC-1 nativas foram analisadas por FACS® para o nivel de expressão da molécula H-2Db (linha a cneio) . São indicadas as médias das intensidades da fluorescência (MedFi). Resultados obtidos com controlo de isotipo são indicados (sombreado a cinzento) .

Figura 7. Persistência de células T CD8+ especificas de em ratinhos tratados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7.

Ratinhos C57BU6 imunizados com (A) , (B) , ou (C ) e que sobreviveram a enxertos de TC-1 no conjunto de experiências terapêuticas foram sacrificados e os esplenócitos foram novamente estimulados in vitro durante 5 dias com 1 μ$/%1 do péptido UM-l na presença de esplenócitos isogénicos irradiados. A lise cie alvos t TC-I, quadrados a cheio, EL4, quadrados vicídísO foi ·%φ&1ί&άα através da .libertação de Os dados representam a percentagem t aos talores de lise específica (n=6 para cada grupo), assim como a gama interquartil. É indicado o número de tmimata que responderam que foi determinado, através de uma lise especifica > 20% para a razão máxima de efector alvo na parte superior direita da figura.

Figura 8. Protecção de longo termo contra o crescimento de tumores TC-1 induzida por CyaAs recombinantes de HPV16-E7.

Os ratinhos C57BU6 sobreviventes de enxertos com TC-1 no conjunto de experiências terapêuticas fcram novamente enxertados s.c. no dia 100 com 5xlG4 células TC-I. Ratinhos não tratados de idade equivalente foram tomados como controios (A) . O crescimento de tumores em ratinhos imunizados inicialmente com e CyaA- encontram-se representados 5¾ C e D, respectivamente). Os ratinhos foram mortos quando o tamanho do tumor atingiu 1000 mm3, ou quando o estado sanitário dos animais o exigia. (E) Curvas de sobrevivência dos animais (não tratados, quadrados vazios; ou imunizados com, CyaA-Εί·ΐΐ··:·:; triângulos vazios; CyáA---E'q,.::;.· círculos vazios, ou (losangos abertos) e novamente enxertados com células TC-I (dia do enxerto tomado como 0) . Em cada caso, a sobrevivência de animais tratados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 e aumentada significativamente quando comparada com a dos ratinhos não tratados ou com os ratinhos tratados com placebo (£>0,2)5 5 .

Exemplos

Aqui construímos CyaA recombinante contendo a sequência completa da proteína E7 a partir ae HPV16 ou subfragmentos deste polípéptidc (em particular um péptido que abrange os resíduos 49-57 de E7 que corresponde ao epitopo E-2~" restringido e resíduos HPV16-E7 13-95 mais 1-29). Mostrámos que quando injectados em ratinhos C57BU6, estas CyaAs recomomantes de HPV16-E7 são capazes de induzir respostas CTL e Thl específicas caracterizadas pela secreção de IFN-γ. Além disso, quando testados terapeuticamente estas construções foram capazes de fornecer até 100% de protecção contra o enxerto subcutâneo de células TC-1. Cste estudo representa a primeira demonstração da actividade terapêutica in viva anti-tumural mediada por CyaA contra antígénios específicos de tumores humanos.

Materiais e Métodos

Ratinhos e linhas celulares. Ratinhos C57BU6 fêmeas de 6-10 semanas de idade isentos de patogénios específicos foram obtidos a partir de CER Janvier (Le Gesnet St-Isle, França) ou de Charles Ri ver (I/Arbresle, França). Foram também utilizados neste estudo 18} , MHC classe II"7" (19) e CDoD”" 8H0; criados numa base de C57BU6. Os animais foram mantidos nas instalações para animais do Instituto Pasteur em condições isentas de patogénios com água e comida ad libítum. As experiências envolvendo os animais foram efectuadas de acordo com as orientações institucionais para cuidar de animais. Células TC-1 que expressam as proteínas HPV16 E6 e E7 (21) e células EL4 do timoma do ratinho (17) foram obtidas a partir da ATGC. As células foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com Glutamax com FCS inactivado por calor suplementado a 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 estreptomicina, 0,4 mg/rtil de geneticina (apenas para células TC-1) e M de 2-mercaptoetanol (Gibco BRL,

Cergy-Pontoise, França). Péptidos. Oi péptdUk ae uma letra para o restringido WfHf’ i ·: t. -bb b ttb A H t h a 'V1 (· ·· Çlb sintéticos bÇ:<u..SÍ (RAHYNIVTF, Mdíft Otinoémlbob correspondente ao epitopo de HPV16-E7 (22! * &7*S:.T; correspondendo ao epitopo ίλ :'5·;: y= CTL com a sua sequência flanqueadora natural e um epitopo Th (a cheio) (23) foram adquiridos a Neosystem (Estrasburqo, França).

Construção e purificação de adenilato ciclase recombinante de B. pertussis que transporta epitopos de HPV16-E7.

Adenilato ciclase recumbinante utilizada neste artigo foi expressa em E. çqií utilizando derivados de plasmídeo pTRACES (Fig. llv: que codifica para uma CyaA enzimaticamente inactiva (24) (25). 0 plasmídeo pTRACES é um vector de expressão para uma CyaA enzimaticamente inactiva, e por isso citotóxica de uma variante de E. pertussis. Também expressa a proteína CyaA de B. pertussis que é necessária para a acilação pós-tradução de CyaA. Este plasmídeo é um derivado do plasmídeo anteriormente descrito pTRACG (Gmira et al., 2001, Res. Mic. 152:889). Foi obtido por inserção do hexanucleótido CTGCAG no local EcoRV localizado na parte 5' da sequência de ADN de cyaA. Isto resulta numa inserção na grelha do dipéptido Leu-Gln entre Aspl88 e Ilel89 de CyaA dentro de uma parte essencial do local catalítico (Guermonprez et al. 2000, Meth. Enzymol. 326:527) . O plasmídeo pTRACES alberga uma origem de replicação ColEl e um marcador resistente a Ampicilina. Neste plasmídeo, a cyaA e os genes de cyaA modificados são colocados na mesma unidade transcricional sob o controlo do promotor Pr do fago h. O plasmídeo pTRCAG também codifica para o repressor h sensível à temperatura Cif*' que reprime fortemente a transcrição do gene ao promotor Pr de h a temperaturas inferiores a 32°C. A estirpe de E. coii XLl-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) foi utilizada para todas as de ADN que foram realizadas de acordo com os protocolos padrão CCGvCClÍS et a 1. ) , C:^aâ'''i74.s..i;:.·;: contém uma sequência com 9 arninoácidos de comprimento (RAHYNIVTF) inserida entre os codões 224 e 235 de CyaA. 0 plasmídeo de expressão de foi

construído coro se segue. Dois oligonucleótidos sintéticos (MWG, Courtaboeuf, Franca), BTP1 (5'-CTA GCC GTC CGC ATT ACA ATA TTG TAA CCT TTG GTA C-3' região de codificação) e BTP2 (5' -CAA AGG TTA CAA SAT TGS MT GGG CAC GG-3' região não codificante foram sujeitos a um tratamento térmico e ligadas no pTRACE5 digerido com Nhel e Kpnl. .yr-: contem a sequência completa da proteína de HPV16-E7, i.e. 98 arninoácidos inseridos na mesma posição 224 da CyaA enzimaticamente inactiva. A sequência de ADN que codifica para a proteína E7 foi amplificada a partir do ADN de HPV16 (Seedorf K et al. acima) utilizando os iniciadores específicos BTP3, (5'-GGG CGC TAG CAT GCA TGG AGA TAC ACC TAC-3'), e BTP4 (5'-GGG CGG TAC CTG GTT TCT GAG AAC AGA TGG G-3'). 0 produto PCR resultante foi digerido por Nhel e Kpnl e ligado a pTRACES cindido por Nhel e Kpnl. 0 local SspI presente no oligonucleótido sujeito a tratamento térmico, assim como na sequência completa de HPV16-E7 permitiu uma rápida identificação de mutantes de inserção. contém os primeiros 29 resíduos de arninoácidos de HPV16-E7 inseridos entre os codões 319 e 320 de CyaA, assim como os resíduos 43 a 98 de HPV16-E7 inserido entre os codões 224 e 235 de CyaA. O plasmídeo de expressão para foi construído em dois passos. Cm primeiro fragmento de ADN (resíduos de arninoácidos 1 a 29)que codifica para HPV16-E7 foi amplificado por PCR utilizando como alvo ADN de um gene de HPV16-E7 sintético (optimizado para a em iii molis. designado por GTP Technology,

Labège, França), e iniciadores BP5 (5'-GGG CAC CGG TAA A CG TA1 GCA CGG CGA TAC TCC G-3'), e RTP6 (5'-CGT GAG CAT CSG GCT TTC. ACT AGT ACG TTT GTT CAG CTG CTC GTA GCA-3' ) . U;s segundo fragmento de ADN que codifica para os codões 320 a 372 de CyaA foi amplificado por PCR utilizando pTRACE5 como ADN alvo e iniciadores BTP7 (5'-GGG CAC TAG SGA AAG CCA GAS GCT CAC GCG CGG G-3'), e BTP8 (5'-AGT ACA TCC GGC GAG AAC-3'. Estes dois fragmentos de ADN (que se sobrepõem parcialmente) foram purificados e combinados com iniciadores BTP5 e BTP8 numa terceira PCR para amplificar uma fragmento de ADN com 294 pb de comprimento. Este fragmento foi digerido por Agel e BstBI e inserido entre os locais correspondentes de pTRACES para dar origem ao plasmideo

Depois um fragmento de ADN que codifica para os resíduos de arninoácidos 43 a 98 de HPV16-E7 foi amplificado por PCR utilizando o gene de HPV16-E sintético como ADN alvo e iniciadores BTP9 (5’-GGG CGC TAG CGG TGA AGC AGA ACC GGA C-3') e BTP10 (5'-GGG CGG TAC CAG GTT TTT GAG AGC AAA TCG GAC AAA CAA TCC CCA GAG TAC CCA TC-3'). 0 fragmento de PCR purificado foi digerido por Nhel e Kpnl e ligado ao plasmideo digerido pelas mesmas enzimas de restrição.

Toda a adenilato ciclase recombinante foi produzida em estirpe de Escherichia coli BLR (Novagen, Madison, WI) como descrito anteriormente (26). As proteínas recombinantes foram purificadas perto da homogeneidade (Fig 1B) a partir de corpos de inclusão, através de um procedimento em dois passos que inclui cromatografia com Sepharose DEAE e fenil Sepharose como descrito anteriormente (26). Um passo de lavagem adicional com 60% de isopropanol em 20 mM de Hepes-Na, pfTÇS foi adicionado à cromatograf ia com fênil Sepharose de modo a eliminar a maior parte do LPS contaminanto. Proteínas recombinantes purificadas foram atalis-sias por análise em gel SDS. Foram deçemiiaádííi as concentrações de proteína espectrofotometricamente a partir da absorção a 280 nm utilizando um coeficiente de extinção molar de 142,000

Construção e purificação de proteína HPV16-E7 recombinante. A codificação de cADN optimizada de E. coli para a proteína HPV16-E7 (tecnologia GTP) sequência ADN disponível por pedido foi subclonada no vector pIVEX2.4b (Roche Molecular Biochemicals Meylan, França) entre os locais de restrição Ncol e Xhol. 0 plasmídeo resultante foi então transformado na estirpe de E. coli EL21ÂDS3 (Novagen) . A proteína His-Tag-HPV16-E7 foi expressa por indução com isopropil-p-D-tiogalactopiranosidc 0,5 mM (Euromedex, Souffelweyersheim, França) e purificado em Ni-NTA agarose (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Foram utilizadas soluções de lavagem com isopropanol como descrito em (27) para remover contaminação por LPS.

Imunotransferência. Proteínas foram separadas por SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose (0,45 μ, BioRad, Marnes la Coquette, França) que foi sondada com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-HPV16 E7 (Zymed, San Francisco, CA). Complexos imunitários foram detectados com imunoglobulinas de cabra anti-ratinho conjugadas com fosfatase alcalina (Chemicon, Temecula, CA) e reveladas com 5-bromo -4-cloro -3-indolilfosfato/ azul de nitro tetrazclio ÍBCIF/llB:T) (Sigma, St. Louis, MO).

Experiências de imunização de ratinhos e de rejeição de tumores. Os animais foram imunizados com uma injecção intravenosa de 50 pg de controlo ou CyaAs recombinantes de HPV16-E7 diluídas em PBS (Gibco BRL) . Para uma análise tn animais eutanizados (CP:;;) foram esplenectomizados 7 dias após a irrjB-cçêO com excepção aa análise de respostas duradouras, para as quais este procedimento foi efectuado 3 meses após a li vovoCo. Para experiências de í::e; ta:iicih<> de tumores os ratinhos receoeram por via subcutânea 5x10“ células TC1 e foram tratados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 nos dias 1, 5 ou 10 após inoculação do tumor.

Ensaio de citotoxicidade in vitro. Esplenócitos de ratinhos imunizados foram estimulados in vio com 1 μο 'ivl de péptidos ou E;Ί$na presença de células de baço virgens isogénicas irradiadas em meio completo (RPMI 1640 suplementado com Glutamax com FCS inactivado por calor a 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e 2-mercaptoetanol 5x1 0-h ) durante 5 dias. A actividade citotóxica destas células efectoras foi testada num ensaio de libertação de 51Cr de 5 h em células TC-1. A marcação radioactiva foi efectuada como se segue: células TC-1 em crescimento exponencial cultivadas numa atmosfera de 7,5% de CO2 a 37°C foram rapidamente triptinizadas (Tripsin- EDTA, GibcoBRL) e incubadas com 100 μΟί de durante 1 h a 37°C. Foram utilizadas várias razões E:T e todos os ensaios foram efectuados em duplicado. A radioactividade libertada no sobrenadante de cada poço foi medida. A percentagem de lise especifica foi calculada como lOOx(libertação experimental - libertação espontânea)/ (libertação máxima - libertação espontânea). A libertação máxima foi obtida adicionando 10% de Triton X-405 a células alvo e a libertação espontânea foi obtida com células alvo incubadas apenas em meio completo. Considerou-se que os ratinhos deram resposta quando foi observado pelo menos 20% de lise especifica para a maior razão E:T. Os resultados sio exçressos como gamas, médias .f interquartil de ratinhos que respondem de cada grupo.

Ensaio de imunomanchas ligadas a enzima para célula única produtora de IFN-γ para secretar células (designação Inglesa do ensaio s enzyme-linked-iimnunospot assay)

Placas de filtração de multifiltros (96 poços; Millípore, Nolshein, França) foram revestidas com 4 μς anticorpo de gama interferão (IFN-γ) de rato anti-ratinho (clone R4-6A2; Pharmingen, San Diego, ç&i por ml de um dia para o outro a temperatura ambiente. Depois as placas foram lavados e bloqueadas com meio completo. Duas diluições em série de células de baço de ratinhos imunizados foram adicionadas a poços conjuntamente com 5xl03 células de alimentação isogénicas irradiadas (2500 rads). As células foram incubadas durante 36 horas com ou sem péptido a 1 μμ/ιηΐ. Após lavagens prolongadas as placas foram reveladas por incubação com 5 μς de anticorpo JFNdf biotinilado de rato anti-ratinho (clone XMG 1.2; PharMingen) por ml seguido de incubação com estreptavidina- fosfatase alcalina (Pharmingen). Finalmente as manchas foram reveladas utilizando BCIP/NBT como substracto. O número de células produtores de foi determinado contando o numero de células formadoras de manchas (SFC -do inglês spot-forming cells) em cada poço (Bioreader, Karben, Alemanha), e os resultados foram expressos como o número total de SFC por baço (17).

Produção de citocina. Células de baço de ratinhos imunizados foram estimuladas in vitro com 10 μ9/πύ de proteína HisTag-HPVl6-E7 ou I μρ/ml de péptido EAuav em meio completo durante 72 horas. A produção de IFN-y e IL-5 foi determinada em sobrenadantes de cultura através de um ensaio em sandwich imunoadsorvente de enzima ligada (ELISA -do íagiêts enzyme-linked immunosorbent assay; como descrito (28), Todos os ensaios foram padronizados com as citocinas recombinantes de mirim correspondentes (Pharmingen).

Análise FACS®. Células TC-1 foram processadas como descrito noutro lugar (29) para análise por citometria de fluxo do nivel de expressão da molécula MHC de classe L H-SC" utilizando um anticorpo especifico monoclonal FITC conjugado (clone KH95, Pharmingen, Le Pont de Claix, França).

Análise estatística. Considerando o pequeno tamanho de diferentes amostras, testes estatísticos não paramétricos (30) foram aplicados utilizando o software StatXact 4 (Cytel Corporation, Cambridge, MA) . Curvas de sobrevivência foram representadas graficamente utilizando o software

Prism (GraphPad Software Inc., CA) e comparadas com o teste de ordenação logarítmica incorporado no software. Os dados foram considerados significativamente diferentes para p< 0,05.

Resultados

Construção e caracterização de adenilato ciclases recombinantes suportando epitopos de HPV16-E7. Para estudar a capacidade de CyaA de induzir respostas de células T específicas para HPV16-E7, construímos 3 moléculas recombinantes diferentes. contem uma sequência polipéptidica de 9 aminoácidos de comprimento JRAHYNIVTF) correspondendo ao epitopo CTL restringido anteriormente descrito (22) que foi inserido entre os codões 224 e 235 de uma CyaA enzimaticamente inactiva (e assim não tóxica). contém a sequência completa (98 aminoácidos) da proteína HPV16-E7 inserida na mesma posição 224 da enzimaticamente inactiva CyaA. contém os primeiros 29 resíduos de aminoácidos de HPV16-E7 inseridos entre os codões 319 e 32C da CyaA enzimaticamente inactiva, assim como os resíduos 43 a 98 de M £?!£·· £ó inserido entre os codões 224 e 235. Para permitir os ensaios in vitro e in vivo, && construções de CyaA foram produzidas e purificadas perto da homogeneidade (Fig. 1B). Um procedimento de eliminação LPS foi introduzido nc protocolo de purificação (26) para obter proteínas recombinantes contendo menos do que 100 unidades de endotoxin por 50 pg. A presença da proteína E7 em CyaA-e ? :¾.¾¾ -foi confirmada por transferência de

Western utilizando um anticorpo monoclonal específico (Zymed) (Fig. 1C) . Em contraste, contendo apenas o epitopo restringido não foi reconhecido pelo anticorpo anti-HPV16-E7. As propriedades bioquímicas globais das 3 CyaAs recombinantes não foram modificadas e estas moléculas apresentaram uma actividade hemolítica semelhante a adenilato ciclase do tipo selvagem (17).

Imunização com CyaAs recombinantes de HPV16 induz respostas CTL específicas de E7. Para testar se a CyaA pode induzir respostas de CTL contra epitopos HPV16-E7, ratinhos C57BU6 foram imunizados uma vez por via intravenosa com 50 das diferentes CyaAs recombinantes de HPV16-E7. Os esplenócitos foram recolhidos e estimulados in vitro com 1 μρ/ιηΐ do péptido BTiswt?, A sua capacidade para lisar células TC-1 foi determinada 5 dias mais tarde utilizando o ensaio de libertação de siCr. Como indicado na figura 2A, uma imunização i.v. única de ratinhos C57BU6 com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 induziu respostas CTL fortes e específicas para células TC-1. A .isr&wii tmp&ú com CyaA contendo a proteína completa (Fíg. 2A, b) , c<a a forma de supressão, CyúA"-E7.:^':;;:,,:^ (fig', 2A, rg resultou em actividades CTL mlcMíáij mais elevadas, quando comparadas som as induzidas por C:y:aà“£7.íí;,í:.-í que contém apenas o epitopo restringido oinimo: idoídr ('Fig, 2A, a,, apesar cte não podermos demonstrar significado estatístico dos nossos dados. Foram obtidos resultados semelhantes quando o péptido E749-57 foi utilizado para nova estimulação in vítro (dados não apresentados). Esplenócitos de ratinhos vacinados com uma CyaA recombinante que transporta um epitopo não relevante e novamente estimulado in vitro com I pg/ml de péptido deu origem apenas a uma lise fraca não especifica da célula TCI (Fig. 2A, a). Foi previamente demonstrado que a administração do epitopo da célula DVA CD8* (SIINFEKL) a molécula MHC de classe I pela CyaA in vivo encontrava-se dependente da função TAPI (15). Testámos se isto também acontecia quando se utiliza CyaA-Como indicado na figura 2 A, d, esplenócitos estimulados in vitro a partir de ratinhos T&M vacinados i.v. não foram capazes de lisar células TC-1. Também testados a necessidade do auxílio da célula CD4+ T na iniciação in vivo da resposta de CTL pelo HPV16E7 contendo CyaA recombinante. De acordo com observações anteriores (15), observámos que a vacinação i. v. de ratinhos MHC de classe II-/“ utilizando resultou na indução de respostas específicas de CTL de alto nível as células TC-1 (Fig. 2A, e). Em contraste observámos neste modelo alguma dependência em relação I sinalização para CD40, uma vez que se observou um baixo nível de resposta CTL a células TC-L em ratinhos CDiO"·"' (Fig. 2A, f) .

Para estimar as frequências ex vivo de esplenócitos específicos de em ratinhos imunizados cam CyaAs recombinantes, o número de células que produzem IFN-γ em resposta a uma estimulação in vitro com péptido HFVl 57 foi quantificada por imunomanchas ligadas pqx enzima (ELISPOT- do inglês enzyme-linked imunospots). A figura 2E mostra que houve apenas uma ligeira diferença no número dt com CyaE5 IFN-γ obtidos a partir de ratinhos

CysOVA, quando comparados com aqueles imunizados com CyaA-174^4·» Em contraste, o numero de esplenocitos que produzem IFN-γ obtido foi muito mais elevado (p<0,05) em ratinhos vacinados com CyaAs recornbinantes de HPV16-S7 contendo a proteína ccmpleta HPV16-E7 ou a sua forma de supressão. As respostas observadas eram específicas do epitoço, uma vez que muito poucas células de baço destes ratinhos produziram IFN-γ na ausência de estimulação pelo péptido (Figura 2B) . Os resultados mostram que CyaA é capaz de fornecer i o vivo o epitopo da célula T restringido imunodominante CD8+ da proteína HPV16-E7 para o cítosol de células imunocompetentes para o processamento e apresentação no metabolismo da MHC classe I para provocar respostas CTL fortes. De acordo com observações prévias (25, 31), confirmamos que a CyaA é tolerante a inserção de grandes fragmentos polipéptidicos como CyaAs que transportam a proteína HPV16-E7 completa ou a sua forma de supressão e invertida eram também capazes de induzir respostas CTL fortes. Os nossos dados também demonstram que estas últimas moléculas Induziram significativamente frequências mais elevadas de respostas específicas de em ratinhos.

Imunização com CyaAs recornbinantes induz respostas Thl HPV16-E7 específicas. As respostas de Thl desempenham um papel importante na protecção contra patogénics intracelulares e desenvolvimento de tumores (32, 33) . Por isso caracterízámos o tipo de respostas de células T induzidas por CyaAs recornbinantes de HPV16-E7. Ratinhos foram imunizados i.v com 50 \xq êm três CyaAs recornbinantes de HPV16-E7 diferentes e a síntese de cítocina foi determinada, após estimulação in vitro de células de baço com 10 μο</ml da proteína purificada His-Tag HéVi Como indicado na figura 3, imunização com CyaAs que transporta a proteína completa HPV16-E7, ou a sua forma de supressão resultou num perfil semelhante a Thl caracterizado pela produção de elevados níveis de IFN-γ e a falta de níveis detectáveis de IL-5. Esta resposta era específica, uma vez que os níveis de IFN-γ específicos obtidos após imunização com CyaA-F A-.. ·:ou foram significativamente mais elevados do que os obtidos em ratinhos imunizados ~com placebo com CyaAE5-CysOVA íp<0f ílSi . Contudo isto não foi o caso com esplenócitos de ratinhos imunizados com i'yxk-3": u Foram obtidos resultados semelhantes quando a nova estimulação foi efectuada com 1 μg/ml de péptido (Fig. 3A, inserção). Tomados em conjunto estes resultados indicam que nas nossas condições células T CD4+ desempenham um papel importante na secreção de IFN-γ, uma vez que níveis obtidos com CyaAs que transportam a proteína completa HPV16-E7 que contêm epitopos de células T de classe Π H-2b restringidos são muito mais elevados dos que os obtidos com Cfãh'--£7 que contêm apenas o epitopo de classe I restringido.

Imunização com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 induz regressão de tumores estabelecidos que expressam HPV16.

Considerando as respostas ímunológicas robustas obtidas, avaliamos então in vivo a actividade terapêutica de CyaAs de HPV16-E7 num modelo pré-clínico que consiste numa linha celular tumorigénica que expressa HPV16-E6 e proteínas E7 (células TC-I) que e injectada por via subcutânea em ratinhos C57BU6. Neste modelo foi mostrado previamente que o rejeição de tumores é mediada exclusivamente por células T CD8T âspbvillioAs para Ε'Αο-·-:.·; (21, 22, 34,35). Assim, 5xl04 C-MuM-S TC1 foram injectadas s.c. no flanco direito ae ratinhos C57BU6 e 50 μς de ~EFull, cu -

Elásç····:;:;; foram injectadas por via som Eof IrCçoa nos dias 1, 5 ou 10 a seguir. A Figura 4 representa o crescimento do tumor em ratinhos tratados terapeuticamente 10 dias após o enxerto do tumor. De notar, que nestas condições 100% dos animais desenvolveram tumores palpáveis na altura em que foi administrada a vacinação.

Para evitar sofrimento desnecessário os animais sacrificados, quando os tamanhos dos tumores atingiram 1000 mirá. Todos os animais não tratados, assim como os animais que foram tratados com um CyaAE5-cysOVA placebo desenvolveram tumores daquele tamanho (> 1000 mm3) num máximo de 49 dias. Em grande contraste a maioria dos animais tratados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 permaneceu livre de tumores durante a experiência (Fig. 4, C, D, E) . A Figura 5 apresenta o gráfico da sobrevivência de animais enxertados com células TC-1 e submetidos a três protocolos terapêuticos diferentes em que as CyaAs recombinantes foram injectadas no dia 1, dia 5 ou dia 10 após o enxerto de TC-1. Os tempos de sobrevivência médios de animais não tratados ou tratados com placebo estiveram compreendidos entre 31 a 40 dias. Em contraste, a sobrevivência de ratinhos vacinados com CyaAs que transportam os antigénios HPV16-E7 foi significativamente superior a dos animais de controlo (p<0,05). Diferenças nas actividades protectoras das varias construções poderiam ser estabelecidas apesar da significância estatística não poder ser, devido a pequena dimensão das diferentes amostras. Se a taxa de regressão tumoral conferida por CyuAr-E e EIW· não poude ser distintamente diferenciada, CyeA.··E‘A: era claramente superior em termos da regressão do tumor e inibição do crescimento, uma ¥«; que em todos os três esquemas terspêutioCA, a taxa de protecção foi sempre superior a 90%.

Nalguns dos animais vacinados com e

CyaMCAí;,:;; parecia que cresciam tma.is tarde no decurso da experiência (Fig. 4 (*) e dados não apresentados). Considerando que este fenómeno poderia reflectir mecanismos de fuga de tumores, nós obtivémos explantes dos tumcres em crescimento destes animais e analisámos estas Linhas celulares designadas per TC-1 Ai e TC-1 AS por analise FACS para expressão de H-2Db. Como indicado na figura 6, quando comparado com a sua parte correspondente nativa os explantes das células TC-1 AI e M obtidos a partir dos tumores que cresceram mais tarde tinham perdido a expressão de H-2Db tornando-os mais provavelmente indetectáveis para células T CD8V especificas para r.. Uma vez que as células TC-1 cresceram in vivo num ambiente sem pressão antibiótica para a selecção, também verificámos por transferência de Western a expressão de HPV16-E7 em células TC-1 Al e AS. Não pudemos encontrar nenhuma diferença na expressão desta proteína entre TC1 e TC-1 Al e células A2 (dados não apresentados).

Tomados em conjunto estes resultados demonstram a eficiência do vector adenilato cíelase como uma vacina terapêutica adequada para induzir a regressão de tumores que expressam HPV16 num modelo pré-clínico.

Persistência a longo termo de células T Õ&S* especificas de induzidas pela imunização de CyaA. Para avaliar a persistência da resposta imunitária induzida por CyaAs recombinantes de HPV16-E7, os ratinhos que sobrevivem às experiências terapêuticas após 3 meses foram sacrificados e os seus esplenócitos foram sujeitos a estimulação in vitro durante cinco dias com 1 μα/ιηΐ cte péptide C ::t.:, A sua capacidade para lisar Cililts TC-1 foi então determinada por us ensaio de Libíírt&qSó ds " Cr, Como indicado na Figura 7, respostas CTL específicas ao péptido HPV16 £7:$;?-··?-? foram ainda demostradas a partir ae íhíulsuíâhittr de animais imunizados três meses atiM, Com base na percentagem máxima de lise específica para uma razão efector: alvo de 30:1, a resposta imunclógica parecia ser mais robusta em animais tratados com 5νΛΛ.--ρ.7ν.?·.νί apesar de não poder ter sido demonstrada significância estatística a partir destes dados. Para avaliar a relevância fisiológica de uma tal imunogenicidade de longa duração, os animais restantes foram novamente provocados & c. com 5xlQ4 de células TU-1 no dia 100. Sob tais condições todos os animais normais de controlo de idade equivalente desenvolveram tumores e apresentaram um tempo médio de sobrevivência de 37,5 dias (Fig. 8). Em contraste, ratinhos imunizados três meses atrás com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 encontravam-se protegidos de forma muitc significativa do desenvolvimento de tumores. Como observado acima, os animais vacinados com CyaAE5-HPV16-E7 apresentaram um elevado nível de protecção. Contudo, em contraste com os resultados obtidos na primeira série de experiências terapêuticas existe agora uma diferença marcante na protecção entre animais tratados com s; e aqueles tratados com em favor do último, apesar do pequeno tamanho das amostras não permitir demonstrar inequivocamente uma significância estatística. Estas observações sugerem que neste modelo, o auxílio da célula T fornecido pela CyaA que transporta a proteína HPV16-E7 é importante para respostas eficientes duradouras contra células TC1.

Tomados em conjunto os nossos resultados demonstram que uma injecção i« v de 50 μρ de CyaAs que suportam o epitopo auxiliar da proteína !!P¥i E-E"? (DRAHYNIVTF) é suficiente para induzir células T €D8T específicas de 11 que são capazes de conferir p:;:td;õ€çid contra provocações de cilulãM tumorais TC-1 num período de tempo cte pelo menos 6

Discussão

Estudos prévios demonstraram que a adenilato ciclase de Bordetella pertussis é um Instrumento poderoso para administrar ín vivo os epitopos de células T CD4+ e CD8 + aos metabolismos de apresentação de células dendriticas MHC-classe 11 e I. Em modelos experimentais de murino este sistema foi utilizado para desencadear respostas eficientes Thl e CTL fornecendo protecção anti-viral e anti-turnoral (36) . Como avaliação da aplicação potencial de CyaA em seres humanos para o tratamento de malignidades cervicais associadas a HPV16 prosseguimos com a demonstração de que este vector fornece de forma eficiente in vivo epitopos da proteína E7 de HPV16.

Construímos vários CyaAs recombinantes de HPV16 contendo a proteína E7 completa de HPV16, ou subfragmentos destes polipeptido incluindo em particular o epitopo CTL mínimo restringido correspondendo aos resíduos 49-57.

Mostrámos que estas proteínas recombinantes diferentes eram capazes de iniciar respostas CTL específicas e respostas CTL fortes, quando injectadas em ratinhos C57BU6. Os nossos dados confirmaram que o fornecimento de epitopos CTL por CyaA necessita de uma apresentação de via metabólica de classe I completamente funcional, uma vez que não era possível iniciar CTL por injecção de em ratinhos 2AP;.'':v (15). A iniciação de CTL mediada por CyaA era independente da presença de células T CIM' como indicado pela eficiência de respostas CTL obtidas em ratinhos de Classe H":" de acordo com os resultados anteriores (15). Esta característica de CyaA como um vector vacina é de grande importância, quando se considera a vacinação de doentes imunodeprimidos, mi. imunodeficientes que apresentam um número alterado de células T CL-ÇC Contudo foram obtidas respostas CTL baixas em ratinhos indicando que a iniciação CTL se encontrava parcialmente dependente da sinalização de CD40. Estas observações sugerem que as CyaAs recombinantes de HPV1.6-E7 provocam CTL MHC Classe I restrita directamente, através da estimulação directa de APC profissional. No entanto a interacção CD40-CD40L é necessária para obter iR'&e&a&âô Óptima de respostas CTL.

Comparámos a imunogeni cidade do epitopo CTL Η~2ίΤ restringido de HPV16-E7 com o da proteína E7 completa ou o da proteína Δ30-42Ε7 que contem provavelmente entre outros o epitopo auxiliar descrito DRAHYNIVTF (37). A iniciação CTL, assim como as frequências dos esplenócitos específicos de HPV16-E7 induzidos por Cya?i"E e CyíiAEeram superiores as induzidas por TysA.·--E?*que transportam apenas os epitopos CTL Εν:>··&ν Estas observações indicam que o fornecimento simultâneo dos epitopos CTL e Th pela CyaA resultam numa resposta CTL mais robusta. Isto encontra-se de acordo com dados previamente publicados de outros modelos a nível pré-clínico (37) e clínico (38). A administração de epitopos de HPV16-E7 Th pelas CyaAs recombinantes foi ainda evidenciada, através da análise das citocinas produzidas pelos esplenócitos específicos de HPV16-E7 novamente estimulados ín vitro com proteína recombinante HísTag-HPV16-E7 ou o péptído - De facto observámos uma síntese específica de IFN-γ apenas em ratinhos vacinados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 contendo o epitopo Th. 0 perfil Thl típico caracterizado por um nível eMv&dd de IFN-γ e sem secreção de IL-5 que observámos após uma imunização i. v. cíví; e CyaAE- faz sobressair o interesse potencial deste vector para a ímunoterapia tumoral.

Isto foi testado num modelo de re; **. ~ amoral baseado em células TC-1 t.h:liS<rrii|áíi5liás estabeleci .o- por via s. c, (21) . De acordo cosa os nossos dados df r'' t - ndo a imunogenicidade de CyaAs recombinantes de HPV16-E7, observámos que estas proteínas recombinantes eram capazes de induzir a regressão de tumores TC-1 estabelecidos. era superior a e CyaA-E5-HPV16- em termos de sobrevivência ao longo de um período de 90 dias. Como os CyaAs que transportam a proteína completa e a proteína Δ30-42Ε7 deram resultados comparáveis em termos de capacidade de iniciação CTL, frequências de esplenócitos específicos de KfVl v..;. :· e produção de IFN-γ, esperámos que Cyvnfosse superior a 0yiÀ---í7m>. em termos de sobrevivência. Um número mais elevado de animais testados teria muito provavelmente ajudado a eliminar esta aparente discrepância. Porém dois aspectos no que diz respeito à bioquímica da CyaA deverão ser aqui discutidos. Primeiro, a presença de aminoácidos carregados negativamente na região 224-235 de CyaA foi mostrado que inibe a translocação do domínio catalítico de CyaA no cítosol de células eucarióticas (39) . Neste contexto a proteína E7 acídica (pKi=4,17) poderia ter evitado uma translocação eficiente do domínio N-terminal de CyaA para o cítosol de DC. 0γ«ΑΗ;Γ7^.ί'ίί'-'·^ί foi desenhada especificamente para remover a extensão de aminoácidos negativamente carregados localizados entre os resíduos 30 a 42 (DSSEEEDEIDGPA) para favorecer a sua administração a DC (e ainda a dois aminoácidos positivamente carregados (KR) foram introduzidos de cada lado do terminal N inserido de HPV16-E7. Segundo, Gmira et al (25) demonstraram que a desdobragem da proteína heteróloga inserida na CyaA é obrigatória para permitir a ínternalízação da proteína recombínante nas sèluI-M alvo. A inserção de dois fragmentos diferentes do E? em boia locais q pode evitar nova dobragem de E7 e fa&í-iitfe· deste modo a sua translocação para células alvo.

No decurso das experiências de rejeição do tumor, nalguns ratinhos começaram a crescer tumores mais tarde HPV16 positivos após terem rejeitado previamente tumores TC1 estabelecidos. Análise FACS® revelou que células destes tumores não expressavam moléculas Η-20β. Esta observação conduziu a considerar a possibilidade de um reforço homólogo de uma vacinação por CyaA recombinante para erradicar de forma mais marcante células tumorais e para evitar a recidiva de tumores através mecanismos de escape. Considerando os dados de outras equipas no campo (37, 40,41), seria relevante reforçar a vacinação por CyaA em ratinhos aumentando a quantidade total de CyaA recombinante de HPV16-E7 injectada para 100 \ig, i.e. 0,56 nmoles. Experiências destinadas a testar esta última observação, assim como outras para testar diferentes formas de administração de CyaAs estão a ser conduzidas.

Após nova provocação com células TC-1, os ratinhos sobreviventes imunizados com CyaAs recombinantes de HPV16-E7 foram protegidos selectivamente. Isto correlacionou-se entre os com a presença de células T CDtT de esplenócitos destes animais. Esta observação reforçou o facto que as recidivas observadas na figura 4 eram devidas a mecanismos de escape de tumores e não a uma diminuição da imunidade em relação à proteína E?. A melhcr taxa de sobrevivência de ratinhos imunizados com CyaAs recombinantes contendo epitopos Th indicaram que fornecendc auxílio de células T contra o mesmo antigénio também resulta numa chamada eficiente de células T CD8+ 11¾

Neste aspecto propôs-se que células T f através de CD40L podem imprimir :sma assinatura molecular i mi oucbâmuluí; efectoras T C0»% dotando-as o ou; â sua capacidade de tíal)haa;'ií:í do funcionamento celular (42) . itas modelo validado para o teste de novas terapias imunitárias para o tratamento de neoplasias associadas com HPV (21) demonstramos que CyaA ê um vector eficiente para induzir a regressão de tumores estabelecidos, assim como de fornecer protecção contra provocação tumorígénica ao longo de um longo período de tempo. Em contraste cor. outras estratégias que estão correntemente em desenvolvimento (11), a imunoterapia â base de CyaA exclui a necessidade de seleccionar epitopos HLA restringidos na medida em que podem ser inseridas proteínas completas e evita a utilização do uso de vectores virais e/ ou sequências de ADN de HPV potencialmente oncogénicas. Além disso obtivemos os melhores resultados com uma CyaA que contém dois subfragmentos de HPV-E7 inseridos em dois locais permissivos diferentes de CyaA. 0 facto de que esta Última construção incluir todos os epitopos de HPV16-E7 HLA de classe I e classe II descritos na literatura (8, 46) reforça a selecção de em aplicações em vacinas.

Baseados nos dados apresentados aqui planeamos testar a eficácia de CyaA contendo HPV16-E7 em ensaios clínicos que têm como alvo displasias cervicais e anais associadas a infecção por HPV.

Referências Bibliográficas 1. zur Hausen, H. Papillomaviruses and câncer: from basíc studieç to clinicai application. Nat Rev Câncer, 2: 342— 350, 2002. 2 .Clifford, G. M., Smith, J. S., Plummer, M., Munoz, e

Franceschi, S. Human papillomavirus types in invasive cervical câncer worldwide: a meta analysis. Br J Câncer, 88: 61-73, 2003. 3. Frazer, I. H. Orc-svíVitldA of vertics:! câncer ív onq;·. papillomavirus vaccination, Nat Rev Amuçç!, 4: 36-55, 2004 .. 4. de Gruijil, T. D., Bontkes, H. J., Walboomers, J. M., Stukart, M. J., Doekhie, F. S., Remmink, A. J., Helrnerhorçt, T. J., Verheijen, R. H., Duggan-Keen, M. F., Stern, P. L., Meijer, C. J., e Scheper, R. . Differentíai T helper cell responses to human papillornavirus type 16 E? related to víral clearance or persístence in patients with cervical neoplasia: a longitudinal study. Câncer $$$, 58: 1700-1706, 1998. 5. Evans, E.M., Man, S., Evans, A. S., e Borysiewicz, L. K. Infiltration of cervical câncer tissue with hurnan papillomavirus-specific cytotoxic T-lymphocytes. Gancer Res., 57: 2943-2950, 1997. §'ΛΙΜ&0'ϊ M., Eiander, A. N., Wilkinson, G. W., Borysiewicz, L. K., e Man, S. Human papillomavirus-specific cytotoxic T lymphocytes in patients with cervical intraepithelial neoplasia grade III. Câncer Res, 57:4855— 4861, 1997. 7. Ressing, Μ. E., van Driel, W. J., Celis, E., Sette, A., Brandt, Μ. P., Hartman, M. Anholts, J. D., Schreuder, G. M., ter Harmsel, W. B., Fleuren, G. J., Trimbos, B. J., Kast, W. M., e Melief, C. J. Occasional memory cytotoxic T-cell responses of patients with human papillornavirus type 16 positive cervical lesions against a human leucocyte antigen-A *0201-restricted E7-encoded epitope. Câncer Res., 56: 582-588, 1996. 8. van der Burg, S. H., Ressing, Μ. E., Kwappenberg, K. M., de Jong, A., Straathof, K., de Jong, J., Geluk, A., van Mei jgaarden, K. E., Frankeri, K. L., Ottenhof, T. H., Fleuren, G. J., Kenter, G., Melief, C. J., e Offringa, fu Natural T-helper immuníty against human papillornavirus type i6 (HPV16) E7-derived peptide epitopes in patients with HPV16-posítive cervical lesions: Identification of 3 hurnan leukocyte antígen class II-restricted epitopes. Int. J. Câncer, 91: 612-618, 2001. 9.Schreurs, M. W., Scholten, K. B., Kueter, E. W., Ruizendaal, J. J., Meijer, C. J., e Hooijberg, E. In vitro generation and life span extension of human papillomavirus type 16-specific, healthy donor-derived CTL ciones. J. Immunol, 171: 2912-2921, 2003. 10. Welters, ÈG. J. d® Jong, A., vàn den Eeden, S. J., van der Hulst, J. M., Kwappenberg, K. M., Hassane, S., Franken, K. L., Drij fhout, J. W., Fleuren, G. J., Keater, G., Melief, C. J., Offringa, R., e van der Burg, S. H. Frequent display of human papillomavirus type 16 G6-specific memory T-Helper cells in the healthy population as witness of previous virai encounter. Câncer Res. 63: 636-641, 2003. 11. Roden, R. e Wu, T. C. Preventative and therapeutic vaccines for cervical câncer. Expert Rev Vaccines, 2:495-516, 2003. 12. Ladant, D. and Ullmann, A. Bordetella pertussis adenylate cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Microbiol. 7: 172-176, 1999. 13. Morón, G., Dadaglio, G., e Leclerc, C. New tools for antigen delivery to the MHC class I pathway. Trends in Immunology, 25: 92-97, 2004. 14. p., Khlef, N., Blouin, E., Rieu, P., Ricciardi-Castagnoli, P., Guiso, N., Ladant, D., e Leclerc, C. The adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis binds to target cells via the alpha(M)beta(2) integrin ÇCinlbGShJj j . J Exp Med, 193:1035-1044, 2001. 15. Guermonprez, P., Fayolle, C., Rojas, M. J., Rescigno,

M., Ladant, D., e Leclerc, C. In vivo receptor- mediated delivery of a recombinant invasive bacterial toxoid to CDllc - Cvíí? alpha-CDll high dendritica cells. J 32:3071-3081, 2002. 16. Fayolle, C., Ladant, D., Karimova, G., Ullmann, A** e

Leclerc, C. Therapy of murine tumors with recombinant

Bordetella pertussis adenylate cyclase carrying a cytotoxic T cell epitope, J. Immunol., 162:4157-4162, 1999. 17. Fayolle, C., Osickova, A., Osicka, R., Henry, T., Rojas, M. J., Saron, . F., Sebo, P., e Leclerc, C. Delivery of multiple epitopes by recombinant detoxified adenylate cyclase of Bordetella pertussis induces protective antiviral immunity. J. Virol, 75: 7330-7338, 2001. 18. Van Kaer, L., Ashton-Rickardt, P. G., Ploegh, H. L., e Tonegawa, S. TAPl mutant mice are deficient antigem presentation, surface class I molecules, and CD8+ T cells. Cell, 71: 1205-1214, 1992. 19. Nadsen, L., Labrecque, N., Engberg, J., Dierich, A., Svejgaard, A., Benoist, C., Mathis, D., and Fugger, L. Mice lacking all conventional MHC class II genes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 10338-10343, 1999. 20. Kawabe, T., Naka, T., Yoshida, K., Tanaka, T., Fujiwara, H., Suematsu, S., Yoshida, N., Kishimoto, T., and Kikutani, H. The iiranune responses in CD40-deficient mice: impaired immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity, 1: 167-178, 1994. 21. Lin, K. Y., Guarnieri, F. G., Staveley-O'Carroll, K.. F., Levitsky, Η. I., August, J. T., Pardoll, D. M., e Wu, T. C. Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Câncer Res. 56: 21-26, 1996. 22. Feltkamp, M. C., Smits, H. L., Vierboom, Μ. P., Minnaar, R. P., de Jongh, B. M., Drijfhout, J, J., ter Schegget, J., Melief, C. J., e Kast, W. M. Vaccination with e 23. Tindie, R. , Fernando, G. J., Sterling, J. FC Frazer, I, Η. A T«*h«.lpè* epitope of the transforming protein of human papillomavirus 16 provides cognate help for several E7 B-cell epitopes from cervical cancer-assocíated human papillomavirus genotypes. Proc.

Natl. Acad Sei USA, 88: 5887-5891, 19S >1. 24. Dadaglio, G., Morei, S., Bauche, C., Moukrim, Z., Lemonnier, F. A., Van Den Eynde, B. J., Ladant, D. , e Leclerc, C. Recombinant adenylate cyclase toxin of

Bordetella pertussis induces cytotoxic T lyrnphocyte responses against HLA*0201-restricted melanoma epitopes. Int Inumano 1, 15: 1423-1430, 2003. 25. Gmira, S., Karimova, . e Ladant, D. Characterizatíon of recombinant Bordetella pertussis adenylate cyclase toxins carrying passenger proteins. Res Microbiol, 152:889-900, 2001. 26. Guermonprez, P., Fayolle, C., Karimova, G., Ullmann, A., Leclerc, C., e Ladant, D. Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin: a vehicle to deliver CD8-positive T cell epitopes into antigen-presenting cells. Methods Enzymol, 326: 527-542, 2000. 27 Franken, K. L., Hiemstra, H. S., van Meijgaarden, K. Subronto, Y., den Hertigh, J., Ottenhof, T. H., Drijfhout, J. W. Purification of histagged proteins immobilized chelate affinity chromatography: the benefits from the use of organic solvent. Protein Expr Purif, 18: 95-99, 2000. 28. Dadaglio, G., Moukrim, Z., Lo-Man, R., Shesko, V., Sebo, P., e Leclerc, C. Induction of a polarized Thl response by insertion of multiple copies of a virai T-cell epitope into adenylate cyclase of Bordetella pertussis.

Infect Immun, 68: 3867-3872, 2000. 29. Michallet, II :< V., Preville, X., Flacher, M., Fourmel, S., Genestier, L,, e Revillard, J. r, Functional antibodies to leukocyte adnesion molecules in anthymocyte globulins. Transplantation, 75: 657:662, 2003. 30. Siegel, S. e Castellan, N. J. Non parametric statistics for the behavioral Sciences. New York: McGraw-Hill, 1988. 31 Sebo, P., Moukrim, Z., Kalhous, M., Schaft, N., Dadaglio, G., Sheshke, V., Fayolle, C, , e Leclerc, C. In vivo induction of CTL responses by recombinant adenylate cyclase of Bordetella pertussis carrying multiple copies of a virai CD8 (+) T-cell epítope. FEMS Immunol Med Microbiol, 26: 167-173, 1999. 32. Matsui, S., Ahlers, J. D., Vortmeyer, A. O., Terabe, M., Tsukui, T., Carbone, D. P., Liotta, L. A., e Berzofsky, J. A A model for CD8+ CTL tumor immunosurveillance and regulation of tumor escape by CD4 T cells through an effect on quality of CTL. J Immunol, 163: 184-193, 1999. 33. Romagnani, S. Thl and Th2 in human diseases. Clin Immunol Immunopathol, 80: 225-235, 1996. 34. Greenstone, H. L., Nieland, J. D., de Visser, K. E., De Bruijn, M. L. Kirnbauer, R., Roden, R. B., Lowy, D. R.., Kast, W. M., e Schiller, J. T. Chimeric papillomavirus virus like particles elicit antitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV tumor model. Proc. Natl Acad Sei USA, 95: 1800-1805, 1998. 35. De Bruijn, M. L., Schuurhuis, D. H., Vierboom, Μ. P., Vermeulen, H. de Cock, K. A., Ooms, Μ. E., Ressing, Μ. E., Toebes, M., Franken, K. L. Drij f-hout, J. W., Ottenhoff, T. H., Offringa, R., e Melief, C. J. Immunization with human papillomavirus type 16 (HPVl6) oncoproteinloaded dendritic cells as well as protein in adjuvant induces MHC class I-restricted protection to HPVl6-induced tumor cclle, Câncer Res, 58: 724-731, 1998. 36 EI Azami Ei Idrissi, M., Ladant, D., e Leclerc, C. The adenylate cyclase of Bordetella pertussis: a vector to target antigen presenting cells. Toxicin, 40: 1661-1665, 2002, 37. Zwaveling, S., Ferreira Mota, S. C., Nouta, J., Johnson, M., Lipford, G. E., Offringa, R., van der Burg, S. H. , e Melief, C. J. Established human papillomavirus type 16-expressing tumors are effectively eradicated following vaccination Plth long peptides. J Immunol, 169: 350-358, 2002. 38. Knutson, K. L., Schiffman, K., e Disís, M. L. Imunization with a HER-2/neu helper peptíde vaccine generates HER-2/neu C08 T-cell immunity in câncer patients. J. Clin Invest, 107: 477-484, 2001. 39. Karimova, G., Fayolle, C., Gmira, S., Ullmann, A.,

Leclerc, C., e Ladant, D. Charge-dependent translocation of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin into eukaryotic cells: implication for the in vivo delivery of CD8(+) T cell epitopes into antigen-presenting cells. Proc. Natl. Acad Sei USA, 95: 12532-12537, 1998. 40. van der Burg, S. H., Kwappenberg, K. M., 0'Neill, T., Brandt, R. M., Melief, C. J., Hickling, J. K., e Offringa, R. Pre-clinical safety and efficacy of TACIN, a recombinant HPV16L2E6E7 fusion protein vaccine, in homologous and heterologous primeboost regimens. Vaccine, 19: 3652-3660, 2001. 41. Chu, N. R., Wu, Η. B., Wu, T. Boux, L. J., Siegel, M. I. , e Mizzen, L. A. Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 e HPV16 E7. Clin Exp Immunol, 121: 216-225, 2000. 42. Bourgeoís, C., Rocha, B., e Tanchot, C. A role for CD40 expression on CD8+ T cells in the generation of CD8+ T cell memory. Science, 297: 2060-2063, 2002. 43. Gaiser, p. et al., 1988, The calmodulin-sensítive adenylate cyclase of Bordetella pertussis: cloning and expression in E. colí Molecular Microbiology 2(1), 19-30. 44. Sebo P. et al., 1995, Cell-invasive activity of epitope-tagged adenylate cyciase of Bordeteiia pertussis allows in vitro presentation of a foreign epitope to CD8+ cytotoxir T cells. Infectíon and Immunity, p. 3851-3857. 45. El-Azami-El-Idrí ssi M. et al, 2003 October 3, Interaction of Bordeteiia pertussis adenyhate cyciase with CDllb/CD18: Role of toxin acylat.ion and Identification of the main integrin interaction domain. J. Biol. Chem. 278(40): 38514-21. 46. Kast, W. M. et al, 1994, Role of HLA-A mot.ifs in Identification of potentiai GTL epitopes in human papillomavirus type 16 E6 e E7 proteins, J. Immunol, 152:3904-3912.

Lisboa, 22 de Novembro de 2007

Claims (50)

1. Reivindicações 1. Proteína recombinante compreendendo pelo menos um polipéptído que suporta pelo menos um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de HPV, pelo menos um dos ditos polipéptidos encontra-se inserido em locais permissivos idênticos , ou diferentes de uma proteína adenilato ciclase (CyaA) da Bordetella sp., ou de um fragmento desta, na qual o dito fragmento de CyaA retém a propriedade da dita proteína adenilato ciclase de tomar como alvo as células apresentadoras de antigénios, nas quais um polipéptído que possui um ou vários epitopos deriva de uma proteína E6 ou E7 de HPV.
2. 2. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a dita proteína E6 ou E7 provir de HPV16 e/ ou HPV18.
3. 3 . Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por pelo menos um dos ditos polipéptidos possuindo um ou vários epitopos serem derivados da proteína E7 de HPV16.
4. 4. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por pelo menos um dos ditos polipéptidos possuindo um ou vários epitopos serem derivados da proteína E7 de HPV18.
5. 5. Proteína recombinante de acordo com qualquer ama das reivindicações 1 a 4, caracterizada por peio menos um dos ditos póirMptidds ser uma proteína E6 ou E7 completa.
6. 6. Proteína recombinante de acordo not a rtlvIMie&çfd .1, caracterizada por o fragmento de proteína CyaA reter a propriedade da dita proteína de adenilato ciclase de tomar como alvo as APC CDllb/CD18.
7. 7. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o fragmento de proteína CyaA reter a propriedade da CyaA de permitir a translscação de epitopo(s) do(s) dito(s) polipeptido(s).
8. 8. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por o dito fragmento compreender entre 30 a cerca de 1300 resíduos de aminoácidos, englobando o dito fragmento os resíduos dos aminoácidos 1208 a 1243 da proteína CyaA de Bordetella pertussis ou os resíduos de aminoácidos 1166 a 1281 da proteína CyaA.
9. 9. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por compreender polipéptidos múltiplos que possuem um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de HPV.
10. 10. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por um polipéptido que possui um ou vários epitopos derivar de um oncogénio, HPV, tal como HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52, ou HPV58.
11. 11. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 9, ou 10, caracterizada por um polipéptido que possui um mi vários epitopos derivar de um antigénio de HPV escolhido entre as proteínas 1,1 f L2, El, ES, E4 e E5.
12. 12. Proteína recombinante ae acorao oors qualquer uma das reivindicações 1 a li, por um polipéptido conter entre 5 e 500 ou entre cerca de 5 a cerca de 200 ou entre cerca de 10 a cerca de b0 resíduos de aminoácidos.
13. 13. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a E?, caracterizada por compreender polipéptidos múltiplos sendo alguns dentre eles polipéptidos que possuem um ou vários epitopos de um ou vários antigénios de HPV e outros polipéptidos que possuem epitopos de outros patogénios.
14. 14. Protei na recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada por compreender polipéptidos múltiplos inseridos em locais permissivos diferentes da sequência de CyaA ou de um seu fragmento, na qual o dito fragmento de CyaA retém a propriedade da dita proteína adenilato ciclase de tomar como alvo Células Apresentadoras de Antigénios.
15. 15. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por os polipéptidos múltiplos englobarem um fragmento compreendendo resíduos 1 a 29 ou um fragmento compreendendo os resíduos 42 a 98 da proteína E7 de HPV16, ou ambos os fragmentos dos ditos polipéptidos, estando os ditos polipéptidos inseridos em locais permissivos diferentes da proteína CyaA ou de um seu fragmento.
16. 16. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por um polipéptido englobar um fragmento compreendendo a sequência de aminoácidos RAHYNIVTF §/ cu GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR .
17. 17. Proteína recombinante de acorde com íiotlqÍPtt 0.:00 das reivindicações I a 16, caracterizada por os ditos polipéptidos que possuem um ou vários epitopos terem sido modificados em relação à sua sequência de aminoácidos nativa, seja por adição de sequências flanqueadoras naturais, ou não naturais do antigénio, seja por modificação química destes, por exemplo para alterar a carga do polipéptído.
18. 18. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 17, caracterizada por a proteína CyaA derivar de Bordetella pertussís.
19. 19. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pela actividade enzimática da proteína CyaA ter sido inactivada.
20. 20. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 19, caracterizada por a actividade enzimática da proteína CyaA ter sido inactivada geneticamente.
21. 21. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por a actividade enzimática da proteína CyaA ter sido inactivada como resultado de um dipéptido inserido num local da sequência de aminoácidos de CyaA implicada na actividade ciclase.
22. 22. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada por compreender vários polipéptidos que possuem um ou vários epitopos de diferentes antigénios de HPV inseridos em locais permissivos idênticos ou diferentes da proteína CyaA ou de um seu fragmento.
23. 23. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por os polipéptidos serem polipéptidos Et inteiros derivados respectivamente de HPV16 e HPV18, estando os ditos polipéptidos inseridos em locais permissivos diferentes da proteína CyaA ou de um seu fragmento.
24. 24. Proteína recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser codificada pela inserção contida num plasmídeo escolhido entre pTRACEõ- (CNCM 1-3191) m (CNCM I- 3190) .
25. 25. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 24 para ser utilizada na provocação de uma resposta imunitária mediada por célula num mamífero hospedeiro.
26. 26. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 para ser utilizada na provocação de uma resposta imunitária bumoral num hospedeiro mamífero.
27. 27. Polinucleótido que codifica para uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
28. 28. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o dito polinucleótido encontrar-se compreendido no vector pTRACE6-HPV16E7¾¾¾ 5 (CNCM 1-3191) ou llláiMlES . ' ' m (CNCM 1-3190) .
29. 29. iásstsr de expressão recombinante compreendendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27.
30. 30. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 29 adequado para a expressão numa bactéria,
31. 31. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 29 adequado para a expressão em células eucarióticas, particularmente nas células de mamíferos.
32. 32. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 29 que é escolhido entre piPt-.CP3-!·?P v 1S P {CNCM 1-3191) :-:.í (CNCM 1-3190).
33. 33. Célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleótido de acordo com a reivindicação 28, ou o vector de expressão recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32.
34. 34. Célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 33, caracterizada por a dita célula hospedeira recombinante ser uma célula de E. colí depositada na CNCM sob o número de acesso 1-3190 ou 1-3191.
35. 35. Composição imunogenia caracterizada por compreender uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, em associação com um veículo, um excipiente, um suporte e/ ou um diluente fisiologicamente aceitável(eis).
36. 36. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 35, caracterizada por compreender entre outros um adjuvante e/ ou agente tensioactivo e/ ou substâncias imunomoduladoras.
37. 37. Cttspotlpêó imunogénica de acordo com a it i vitd.U -r lo ou 36 para utilizar na indução de uma resposta imunitária mediada por célula num hospedeiro de mamífero.
38. 38. Composição imunogenica de acordo com a reivindicação 35, ou 36 para utilizar na indução de uma resposta imunitária citolítica mediada por célula.
39. 39. Composição imunogenicã de acordo com a reivindicação 35, ou 36 para ser utilizada na induçãc de uma resposta imunitária humoral.
40. 40. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 35 ou 36 para ser utilizada na prevenção ou no tratamento ae infecções por HPV.
41. 41. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 35 ou 36 para ser utilizada na imunoterapia do cancro.
42. 42. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 35 ou 36 para ser utilizada na prevenção ou no tratamento do aparecimento ou na manutenção de uma transformação maligna devido a uma infecção por HPV num hospedeiro.
43. 43. Proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32 para utilizar no tratamento ou prevenção de uma infecção por HPV num doente.
44. 44. Proteína recombinante ou polinucleótido cu vector de acordo com a reivindicação 43 para utilizar numa imunoterapia contra a aparecimento ou mssutchoèo de urna transformação malignu devido a uma infecção por HPV com doente.
45. 45. Composição para vacina compreendendo uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28, ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32 adequada para provocar uma resposta imunitária mediada por célula e/ ou uma resposta imunitária humoral num hospedeiro.
46. 46. Composição medicamentosa compreendendo uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32 para utilizar na prevenção ou no tratamento de infecções por HPV.
47. 47. Composição medicamentosa compreendendo uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32 para utilizar na prevenção ou no tratamento do aparecimento ou na manutenção de uma transformação maligna devido a uma infecção por HPV num hospedeiro.
48. 48. Composição medicamentosa compreendendo uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24 ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32 para utilizar na imunoterapia do cancro,
49. 49. Kit de diagnóstico ou kit para uma vlíjilâhcis imunológica de uma luréziqàú por HIV, compreendendo uma proteína recombinante de acordo com queXqcsr uma das reivindicações 1 a 24, cu um polipéptido de acordo com a reivindicação 27 ou 28 ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32.
50. 50. Processo para um diagnóstico in vitro ou para uma vigilância imunológica de uma infecção por HPV compreenaendo: - a exposição das células T obtidas a partir de um mamífero, em particular de um doente humano a uma proteína recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e - detecção de uma modificação na activação das células T. Lisboa, 22 de Novembro de 2007