ES2670095T3

ES2670095T3 - Vacunas contra Chlamydia

Info

Publication number: ES2670095T3
Application number: ES12731345.0T
Authority: ES
Inventors: Daisy Vanrompay
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: US9308248B2; PL2729158T3; EP2729158B1; US20140242105A1; WO2012172042A1; EP2729158A1

Abstract

Una composición que comprende uno o más péptidos, comprendiendo cada uno de dichos péptidos uno o más epítopos seleccionados a partir de la lista constituida por un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL; donde dicha composición comprende al menos un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL; donde los epítopos están ubicados en la proteína principal de la membrana externa (MOMP) de Chlamydia psittaci; donde la composición no comprende la proteína MOMP de Chlamydia psittaci de longitud total, y donde el epítopo de linfocitos B está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por: GTASATT (SEQ ID NO 92), GTDFNN (SEQ ID NO 93) y NPTLLGKA (SEQ ID NO 94), o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad, y donde el epítopo de linfocitos Th2 CD4+, el epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y el epítopo de CTL están constituidos independientemente por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO 20 y 101-117, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad.

Description

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DESCRIPCION

Vacunas contra Chlamydia Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a medios y métodos para proteger contra la enfermedad provocada por bacterias que pertenecen al género Chlamydia. En particular, la presente solicitud se refiere a epítopos de linfocitos B y T aislados obtenidos a partir de la proteína principal de la membrana externa de Chlamydia psittaci que se pueden utilizar contra una infección por una especie del género Chlamydia. Más en particular, la solicitud proporciona una vacuna que se puede utilizar contra la clamidiasis provocada por Chlamydia psittaci en aves y seres humanos. Además, la solicitud se refiere a un método diagnóstico para diagnosticar estas últimas infecciones.

Técnica anterior

El género Chlamydia comprende las especies Chlamydia abortus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pecorum, Chlamydia felis y Chlamydia caviae. Las enfermedades provocadas por bacterias que pertenecen al género Chlamydia son las siguientes. Chlamydia pneumoniae provoca neumonía y bronquitis aguda o crónica en seres humanos y en algunos casos otitis media, enfermedad pulmonar obstructiva y la exacerbación pulmonar de la fibrosis quística. También se ha asociado con la enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, asma, eritema nudoso, enfermedad reactiva de las vías respiratorias, síndrome de Reiter y sarcoidosis en seres humanos. Además, Chlamydia pneumoniae provoca enfermedad respiratoria en koalas. Las cepas de Chlamydia pecorum caracterizadas hasta la fecha han estado limitadas a seres humanos, pero no a una familia hospedadora específica. Son diversas desde un punto de vista serológico y patológico. El organismo se ha aislado a partir de rumiantes, un marsupial y un cerdo. En los koalas, C. pecorum provoca enfermedad reproductiva, infertilidad y enfermedad en las vías urinarias. Ha supuesto una amenaza importante para la población de koalas australianos. En otros animales C. pecorum provoca abortos, conjuntivitis, encefalomielitis, enteritis, neumonía y poliartritis. Chlamydia felis es endémica entre los gatos domésticos en todo el mundo. Provoca principalmente conjuntivitis y rinitis. Chlamydia caviae comprende cinco aislados conocidos, todos aislados de cobayas. El sitio de infección natural es el epitelio mucoso de la conjuntiva donde se establece una infección no invasiva. Sin embargo, resulta posible infectar el tracto genital de las cobayas y dar lugar a una enfermedad que es muy similar a la infección de los genitales en seres humanos. Las cepas de Chlamydia abortus son endémicas entre los rumiantes y colonizan eficazmente la placenta. Chlamydia abortus es la causa infecciosa más común de abortos en ovejas, donde la enfermedad se conoce como aborto enzoótico ovino (OEA, por sus siglas en inglés) o aborto enzoótico de ovejas (EAE, por sus siglas en inglés) en países de Europa occidental, central y septentrional. El aborto enzoótico en cabras tiene una gravedad similar a la producida en ovejas, aunque el alcance e impacto económico en toda Europa es menos claro debido a la ausencia de datos epidemiológicos. La enfermedad también puede afectar al ganado, cerdos y caballos pero se cree que se produce en un grado mucho menor. Se ha confirmado el aborto zoonótico esporádico debido a C. abortus mediante el análisis de aislados de mujeres que trabajan con ovejas y cabras. Chlamydia psittaci produce infecciones respiratorias aviares y constituye una seria amenaza para la producción industrial de aves de corral. Además, provoca brotes epizoóticos en mamíferos y psitacosis respiratoria o fiebre del loro en seres humanos.

Se cree que la inmunidad protectora frente a Chlamydiaceae (incluido el género Chlamydia) que se observa en los animales expuestos previamente al patógeno se produce principalmente mediante la acción de los linfocitos T auxiliares CD4+ de tipo 1 (Th1), linfocitos T CD8+, fagocitos mononucleares y citocinas secretadas por estas células (Cotter et al., 1995; Su y Caldwell, 1995; Beatty et al., 1997; Cotter et al., 1997; Johansson et al., 1997; Su et al., 1997; Wiliams et al., 1997; revisión por Kelly et al., 2003).

Los primeros intentos de desarrollar una vacuna eficaz para controlar las infecciones por Chlamydia tanto en animales como en seres humanos comenzaron con el uso de preparados de organismos intactos inactivados o vivos en la década de 1950, por ejemplo, para C. abortus en ovejas. En general, tales preparados ofrecieron un nivel razonable de protección aunque han tenido más éxito en la protección de infecciones en animales que de infecciones en seres humanos (Vanrompay et al., 2005).

Durante la década de 1960 se realizaron intentos infructuosos de desarrollar vacunas inactivadas y vivas contra C. Trachomatis utilizando tanto primates no humanos como humanos. Estas vacunas redujeron la enfermedad en algunos individuos pero potenciaron la enfermedad en otros como resultado de la estimulación de una respuesta más acusada por hipersensibilidad retardada (DTH, por sus siglas en inglés). Así pues, prácticamente se abandonó el uso de organismos intactos para desarrollar vacunas contra Chlamydia en seres humanos.

A principios de la década de 1980 se desarrolló una cepa atenuada de C. Abortus como una vacuna viva y es una de las 5 vacunas comercializadas en Europa y EE. UU., siendo las otras cuatro vacunas con organismos intactos inactivados (Longbottom y Livingstone, 2006). Estas vacunas comercializadas inactivadas y atenuadas vivas ofrecen una buena protección contra OEA y reducen significativamente la diseminación de organismos infectivos, un factor importante para limitar la propagación de la infección a otros animales. Sin embargo, sigue habiendo dudas respecto a la seguridad de utilizar vacunas atenuadas vivas. También puede existir un riesgo de que la cepa atenuada recupere la virulencia, y de que tenga, de esta manera, el potencial de provocar la enfermedad y abortos en el

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animal vacunado. Además, la vacuna no se puede administrar durante el embarazo o a animales que están siendo tratados con antibióticos lo que limita su uso. Por el contrario, las vacunas inactivas se pueden administrar a ovejas preñadas, aunque se ha de tener cuidado en la manipulación y administración de estas vacunas ya que tienen como adyuvantes aceites minerales, los cuales tienen el potencial de provocar necrosis tisular si se produce una autoinyección por accidente. Las únicas otras vacunas contra Chlamydia en animales que están comercializadas son las de la infección por C. felis en gatos (Longbottom y Livingstone, 2006). Aunque la vacuna tiene éxito para reducir la enfermedad aguda, no previene, sin embargo, la diseminación del organismo y, por lo tanto, la propagación de Chlamydia en la población ni previene la reinfección. Tras la identificación de la proteína principal de la membrana externa (MOMP, por sus siglas en inglés) como una proteína dominante desde un punto de vista estructural e inmunológico, la investigación sobre vacunas se ha centrado principalmente en esta proteína. Se ha conseguido un cierto nivel de protección con preparados de COMC (complejo de la membrana externa de Chlamydia), en los cuales MOMP constituye un 90% o más del contenido proteico, utilizando modelos en cobayas y ratones para la infección del tracto genital por C. trachomatis y en una prueba de toxicidad en ratones para la infección por C. felis (Sandbulte et al., 1996; Pal et al., 1997). Los estudios de MOMP de C. psittaci fueron realizados, por ejemplo, por Tan et al., 1990, Sandbulte et al., 1996 y Verminnen et al., 2005.

La vacuna con ADN, que imita una vacuna viva, crea respuestas protectoras por CD4+ y por CD8+ pero las respuestas por anticuerpos son bajas (Verminnen et al., 2010). Además, las vacunas con ADN son todavía demasiado caras (especialmente para aves de corral) y el público (aún) no está preparado para consumir productos procedentes de animales vacunados con ADN (en el caso de C. psittaci huevo/carne).

A día de hoy, aún no se dispone de vacunas contra Chlamydia completamente seguras y eficaces.

La presente solicitud comprende una vacuna innovadora que crea tanto respuestas inmunitarias humorales como celulares óptimas combinando epítopos de linfocitos B y linfocitos Th2 CD4 (humorales) y epítopos de linfocitos Th1 CD4 y linfocitos T citotóxicos CD8+ (celulares) en una vacuna. Por el contrario, los estudios previos y presentes sobre el desarrollo de la vacuna contra Chlamydia se centran únicamente en las respuestas celulares (Th1 CD4 y CD8), ya que se cree que son cruciales para proteger contra este patógeno intracelular obligado (Su y Caldwell, 1995; Morrison et al., 2000). Otros, como, por ejemplo, en el caso de Chlamydia trachomatis se centran únicamente en la inducción de una respuesta protectora por linfocitos B (WO94/06827). Además, debido al paradigma Th1/Th2 (ambos responsables de tipos diferentes de respuestas protectoras) el desarrollo de vacunas contra agentes infecciosos se centra en crear una respuesta por Th1 o Th2 (vacunas polarizadas Th1 o Th2). Así pues, la construcción de una vacuna no polarizada, al insertar deliberadamente epítopos tanto de Th1 como de Th2 es sumamente inusual y nueva ya que los linfocitos Th1 y Th2 actúan de manera diferente e incluso opuesta.

La presente solicitud se refiere a epítopos de linfocitos B y T (Th1 y Th2) protectores seleccionados de una proteína inmunodominante (la proteína principal de la membrana externa o MOMP). Tales vacunas con proteínas se pueden utilizar contra una infección por una especie del género Chlamydia. Estas secuencias peptídicas no provocan reacciones inmunopatológicas ni respuestas por linfocitos T inmunosupresores. No es relevante la recuperación de la virulencia, lo que mejora la seguridad tanto para animales como seres humanos. Los epítopos se pueden utilizar en cualquier vector adecuado, preferentemente un vector que: a) se pueda utilizar en presencia de anticuerpos maternos específicos de la especie y b) permita una producción masiva de la vacuna fácil y rentable. Además, y sorprendentemente, la presente solicitud demuestra que son necesarias tanto la respuesta inmunitaria celular como humoral para proteger contra una infección de una especie del género Chlamydia.

Leyendas de las figuras

Figura 1: estructura de la MOMP ubicada en la membrana bacteriana.

Figura 2: estructura detallada de la MOMP. Línea continua, cadena peptídica de MOMP integrada en la membrana; línea continua, 5 secuencias conservadas; cuadrados punteados, residuos que comprenden las secuencias variables (VS, por sus siglas en inglés) I, II, III y IV; cuadrados en blanco, cisteínas conservadas. La presencia de lipopolisacáridos (LPS, por sus siglas en inglés) (bloques negros) se indica por encima de la membrana externa (OM, por sus siglas en inglés). Los epítopos de linfocitos B reivindicados están en VSI (inmunodominante), VS2 (serovar) y VS4 (inmunodominante). Los epítopos de linfocitos T reivindicados están en CS1, CS4 y VS4.

Figura 3: (A.) Resultados del cartografiado de epítopos de linfocitos B para MOMP de la cepa 92/1293, serovar D de C. psittaci utilizando el MAb NJ1 (1/100) específico del serovar D; (B.) Resultados del cartografiado de epítopos de linfocitos B para MOMP de la cepa 92/1293, serovar D de Copsittaci utilizando suero de pavos SPF inmunizados con MOMP recombinante. VSI: péptidos 1 a 20, VSII: péptidos 21 a 32, VSIII: péptidos 33-40, VSIV: péptidos 41 a 67.

Figura 4: Alineación de las secuencias de nucleótidos de ompA y secuencias de aminoácidos de MOMP de Chlamydia y C. psittaci.

Líneas: 1) Chlamydia trachomatis (Ctra), 2) Chlamydia muridarum (Cmur), 3) Chlamydia pneumoniae (Cpn), 4) Chlamydia felis (Cfel), 5) Chlamydia caviae (Ccav), 6) Chlamydia abortus (Cabo). Líneas 7 a 18: Cepas 84/2334, 6BC, CP3, GD, NJ1, 92/1293, Ca110, VS225, WSRTE30, M56 y WC de Chlamydia psittaci. La secuencia de ompA y MOMP de la cepa de referencia 92/1293 utilizada para el diseño de las vacunas está subrayada.

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Figura 5: Patología macroscópica.

Figura 6: Títulos de anticuerpos séricos medios contra una proteína (MOMP) recombinante de C. psittaci. Las placas de ELISA se recubrieron con MOMP recombinante de C. psittaci.

Figura 7: Títulos de anticuerpos en mucosa medios contra una proteína (MOMP) recombinante de C. psittaci. Las placas de ELISA se recubrieron con MOMP recombinante de C. psittaci.

Descripción de la invención

La presente solicitud se refiere al uso de péptidos aislados que comprenden epítopos de linfocitos B y T para producir una vacuna contra especies del género Chlamydia y, más en particular, para inducir una respuesta inmunoprotectora contra una infección por una especie del género Chlamydia.

La presente solicitud se refiere una composición que comprende al menos un péptido aislado que comprende un epítopo de linfocitos B ubicado en una región variable de aminoácidos de la proteína principal de la membrana externa (MOMP) de Chlamydia psittaci y al menos un péptido aislado que comprende un epítopo de linfocitos T ubicado en una región conservada o variable de aminoácidos de la MOMp de Chlamydia psittaci. En particular, la solicitud se refiere a una composición que comprende uno o más péptidos, comprendiendo cada uno de dichos péptidos uno o más epítopos seleccionados a partir de la lista constituida por un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL; donde dicha composición comprende al menos un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL, y donde los epítopos están ubicados en la proteína principal de la membrana externa (MOMP) de Chlamydia psittaci y donde la composición no comprende la proteína MOMP de Chlamydia de longitud total.

La composición está diseñada específicamente para inducir una respuesta inmunoprotectora contra una infección por una especie del género Chlamydia. En particular, la combinación de péptidos que contienen el epítopo de linfocitos B y T no es igual a la proteína MOMP completa o de longitud total, en particular la proteína MoMp de Chlamydia psittaci. Más en particular, el epítopo de linfocitos B está ubicado en la región variable I, II o IV y el epítopo de linfocitos T (incluidos los epítopos de linfocitos Th1 CD8+, CD4+ y Th2 CD4+) está ubicado en la región conservada I o IV o en la región variable IV. La proteína MOMP de Chlamydia psittaci es descrita por Vanrompay et al., 1998 (p5496 figura 1, se indican los dominios variables).

La expresión «epítopo de linfocitos B» se refiere a parte de un antígeno que induce la producción de anticuerpos tras el reconocimiento por parte del sistema inmunitario del hospedador.

Un «epítopo de linfocitos T» es una parte de un antígeno que induce una respuesta de linfocitos Th1 (T auxiliares, HTL, por sus siglas en inglés) CD4+, Th2 (T auxiliares, HTL) CD4+ o CD8+ (citotóxicos, CTL, por sus siglas en inglés) tras el reconocimiento por parte del sistema inmunitario del hospedador. Los linfocitos T auxiliares (Th) se consideran componentes importantes en la respuesta contra los organismos infecciosos. Para llevar a cabo su función en toda su extensión, los linfocitos Th secretan una variedad de citocinas, que definen sus acciones distintivas en la inmunidad. Los linfocitos Th se pueden subdividir en tres tipos diferentes en función de sus citocinas características, los linfocitos Th1, Th2 y Th17. Los «linfocitos Th1» secretan IFN-gamma (citocina proinflamatoria), que es la principal citocina activadora de macrófagos y TNF-p, que también activa los macrófagos, inhibe linfocitos B y es directamente citotóxico para algunas células. Los linfocitos Th1 permiten la producción de anticuerpos IgG2a en ratones y de anticuerpos IgM, IgA, IgGi, IgG2 e IgG3 en seres humanos. Los «linfocitos Th2» secretan IL-4, IL-5, IL-

6, IL-9 e IL-13 todos los cuales activan los linfocitos B, e IL10 (citocina antiinflamatoria importante) que inhibe la activación de los macrófagos. Los linfocitos Th2 inducen anticuerpos IgG1 e IgE en ratones e IgM, IgG4 e IgE en seres humanos. Los linfocitos Th17 secretan la citocina proinflamatoria IL-17 (Murphy et al., 2008; Annunziato y Romagnani, 2009).

Un péptido que comprende un epítopo de CTL (CD8+) está constituido normalmente por una longitud de 13 o menos residuos aminoacídicos, una longitud de 12 o menos aminoácidos o una longitud de 11 o menos aminoácidos, preferentemente una longitud de 8 a 13 aminoácidos, de la manera más preferida una longitud de 8 a 11 aminoácidos (es decir, 8, 9, 10 u 11). Un péptido que comprende un epítopo de HTL (CD4+) está constituido por una longitud de 50 o menos residuos aminoacídicos y normalmente de 6 a 30 residuos, más normalmente de 12 a 25 y, preferentemente, está constituido por una longitud de 12 a 20 (es decir, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) aminoácidos. Los péptidos que comprenden epítopos de linfocitos B no tienen una longitud definida y pueden variar entre una longitud de 5 a 30 aminoácidos, preferentemente una longitud de entre 5 y 15 aminoácidos, es decir, 5, 6,

7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos.

En una realización específica, un péptido que comprende un epítopo de linfocitos T tiene una longitud de 6 a 50 aminoácidos y un péptido que comprende un epítopo de linfocitos B tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos.

Así pues, se ha de entender que péptidos con una longitud definida y que comprenden los epítopos especificados en la presente son parte de la presente solicitud y se pueden utilizar en las composiciones y métodos tal como se describen en la presente. En una realización específica, los péptidos son péptidos inmunógenos, es decir, péptidos

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capaces de suscitar una respuesta inmunitaria en un organismo, incluida una respuesta celular y/o humoral. Más en particular, la presente solicitud comprende una vacuna innovadora que crea tanto respuestas inmunitarias humorales como celulares combinando epítopos de linfocitos B y linfocitos Th2 CD4 (humorales) y epítopos de linfocitos Th1 CD4 y linfocitos T citotóxicos CD8+ (celulares) en una composición.

El término «aislado» se utiliza para indicar que una célula, péptido o ácido nucleico está separado de su entorno natural. Los péptidos y ácidos nucleicos aislados pueden ser sustancialmente puros, es decir, esencialmente exentos de otras sustancias con las cuales puedan estar asociados en la naturaleza.

La expresión «inducción de una respuesta inmunoprotectora» se refiere a una respuesta inmunitaria (humoral y/o celular) que reduce o elimina uno o más de los síntomas de la enfermedad, es decir, señales clínicas, lesiones, excreción bacteriana y replicación bacteriana en tejidos en el sujeto infectado en comparación con un control sano. Preferentemente, dicha reducción de los síntomas es estadísticamente significativa cuando se compara con un control.

Las infecciones con una especie del género Chlamydia son infecciones con una o más de las especies seleccionadas a partir del grupo constituido por: Chlamydia abortus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia pecorum, Chlamydia felis y Chlamydia caviae.

En una realización particular, la presente solicitud proporciona péptidos adecuados para el diseño de vacunas. Los péptidos adecuados que comprenden epítopos de linfocitos T corresponden a la SEQ ID NO 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 35, 41, 42, 43, 44, 46, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87 y 91. Como se puede obtener a partir de los datos en la Tabla 1, dichos péptidos se caracterizan de la siguiente manera:

- Los péptidos que comprenden un epítopo de CTL (CD8+) corresponden a la SEQ ID NO 20, 26, 27, 42, 43, 61, 73, 75 y 80.

- Los péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos Th1 (CD4+) corresponden a la SEQ ID NO 1, 10-13, 18, 20, 25, 27, 29, 31-32, 35, 42, 46, 51, 53-56, 61,64-67, 69-73, 75, 79-81 y 87.

- Los péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos Th2 (CD4+) corresponden a la SEQ ID NO 7, 8, 43, 76, 77, 85 y 91.

Además, los péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos B corresponden a la SEQ ID NO 32-33, 45-46 y 9096.

La composición de la presente solicitud comprende preferentemente combinaciones específicas de dichos péptidos y, de esta manera, induce una respuesta inmunitaria humoral así como también celular. Por lo tanto, la composición comprende uno o más péptidos que comprenden al menos un epítopo de linfocitos B, al menos un epítopo de linfocitos Th2 CD4, al menos un epítopo de linfocitos Th1 CD4 y al menos un epítopo de linfocitos T citotóxicos CD8+.

Más específicamente, la presente solicitud se refiere a la composición tal como se ha indicado anteriormente, donde dicho epítopo de linfocitos B aislado está constituido por la secuencia de aminoácidos GTASATT (SEQ ID NO 92), GTDFNN (SeQ ID NO 93) o NPTLLGKA (SEQ ID nO 94), o variantes de estas, que están ubicadas en el dominio variable (VS) I, II y IV, respectivamente, de la MOMP de la cepa 921/1293, serovar D de Chlamydia psittaci y donde dicho epítopo de linfocitos T aislado está constituido por la secuencia de aminoácidos

seleccionada a partir del grupo constituido por:

DGTMWEGAS (SEQ ID NO 101; Th2 CD4);

ASGDPCDPC (SEQ ID NO 102; Th1 CD4);

ATDTKSATLKYHE (SEQ ID NO 103; Th1 CD4);

SATLKYHEWQVGL (SEQ ID NO 104; Th1 CD4);

SATLKYHEWQVGLAL (SEQ ID NO 105; Th1 CD4);

TLKYHEWQVGLAL (SEQ ID NO 106; Th1 CD4 y CD8 (CTL));

KYHEWQVGLALSY (SEQ ID NO 107; Th1 CD4 y CD8 (CTL));

YHEWQVGLALSYR (SEQ ID NO 108; Th2 CD4);

HEWQVGLALSYRL (SEQ ID NO 109; Th2 CD4);

QVGLALSYRLNM (SEQ ID NO 110; Th2 CD4);

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RLNMLVPYIGVNW (SEQ ID NO 111; Th1 CD4);

RLNMLVPYIGVNWS (SEQ ID NO 112; Th1 CD4 y CD8 (CTL));

NMLVPYIGVNWSR (SEQ ID NO 113; Th1 CD4);

MLVPYIGVNWSRA (SEQ ID NO 114; Th1 CD4);

YIGVNWSRAT (SEQ ID NO 115; Th1 CD4);

TAVLDLTTW (SEQ ID NO 116; Th2 CD4);

TTVDGTNTYSDFL (SEQ ID NO 117; Th2 CD4); y TWCDAISIRAGYYGD (SEQ ID NO 20; Th1 CD4y CD8 (CTL));

o variantes de estas, que están ubicadas en la región conservada I o IV o en el dominio variable IV de la MOMP de la cepa 921/1293, serovar D de Chlamydia psittaci. Opcionalmente, los aminoácidos o regiones flanqueantes de los epítopos de linfocitos B y T especificados pueden ser parte de las secuencias peptídicas que se van a incluir en la composición.

En una realización específica, la solicitud se refiere a la composición y uso tal como se ha indicado anteriormente, donde el péptido que comprende un epítopo de linfocitos B se selecciona a partir del grupo constituido por: TGTASATT (SEQ ID NO 95), KGTDFNNQ (SEQ ID NO 96) y NPTLLGKA (SEQ ID NO 94), o una variante de estas, y donde el péptido que comprende un epítopo de linfocitos T comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por: SEQ iD NO 1, 7-13, 18, 20-22, 24-27, 29-32, 35, 41-44, 46, 49, 50, 51, 53-56, 60, 61, 63-82, 84-87 y 91, o una variante de estas. En una realización particular, el péptido que comprende el epítopo de linfocitos B NPTLLGKA (SEQ ID NO 94) y los epítopos de linfocitos Th2 CD4 tAvLDLTTW (SEQ ID NO 116) y TTVDGTNTYSDFL (SEQ ID NO 117) es AQPKLATAVLDLTTWNPTLLGKATTVDGTNTYSDFL (SEQ ID NO 98).

En una realización preferida, el péptido que comprende un epítopo de linfocitos T se selecciona a partir del grupo constituido por los aminoácidos en la posición:

30-44, 35-49, 36-50, 37-51, 257-271, 262-276, 263-278, 264-279, 266-280, 267-281, 268-282, 269-283, 279-293, 280-294, 281-295, 282-296, 287-302 y 326-340 de la MOMP de 356 aminoácidos de la cepa 921/1293, serovar D de Chlamydia psittaci, o variantes de estos. La cepa 921/1293, serovar D de Chlamydia psittaci se describe en Vanrompay et al., 1998 y en la Figura 4.

Las composiciones y métodos de la presente solicitud también engloban variantes de los péptidos especificados anteriormente que comprenden los epítopos. Las «variantes» de los epítopos de linfocitos B y T en las secuencias peptídicas correspondientes de las diferentes cepas o especies también son parte de la solicitud, es decir, aquellas secuencias peptídicas en las posiciones de aminoácidos correspondientes cuando se alinean con una secuencia de referencia (por ejemplo, Figura 4 para diferentes especies de Chlamydia y para diferentes cepas de Cp. Psittaci siendo la cepa 92/1293 la secuencia de referencia). Además, una «variante», tal como se utiliza en la presente, es un péptido que difiere del antígeno natural únicamente en sustituciones y/o modificaciones conservadoras, de manera que se mantiene la capacidad del péptido de inducir una respuesta inmunitaria. Las variantes de péptidos muestran preferentemente al menos aproximadamente un 70%, preferentemente al menos aproximadamente un 80%, más preferentemente al menos aproximadamente un 90% y de la manera más preferida al menos aproximadamente un 95% de identidad con los péptidos identificados. Como alternativa, se pueden identificar tales variantes modificando una de las secuencias peptídicas anteriores y evaluando las propiedades inmunógenas del péptido modificado utilizando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente. Una «sustitución conservadora» es una en la cual se sustituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la naturaleza del péptido permanezca sustancialmente invariante. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Las variantes también (o como alternativa) pueden ser péptidos tal como los descritos en la presente modificados, por ejemplo, por la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre las propiedades inmunógenas, estructura secundaria y naturaleza hidropática del péptido.

La solicitud se refiere más específicamente a la composición y uso tal como se indica anteriormente, donde dichos epítopos de linfocitos B y epítopos de linfocitos T (Th2) aislados son parte de un fragmento de la MOMP de 356 aminoácidos de la cepa 92/1293, serovar D de Chlamydia psittaci que está codificado por la secuencia de ácido nucleico GCT AGC GAA CCA AGT TTA TTA ATC GAT GGC ACT ATG TGG GAA GGT GCT TCA GGA GAT CCT TGC GAT CCT TGC ACA GGA ACA GCA AGT GCT ACT ACT AAA GGA ACT GAT TTC AAT AAT CAA GCT CAG CCT AAA TTA GCC ACT GCT GTT TTA GAT TTA ACC ACT TGG AAC CCA ACA CTT TTA GGA AAG GCC ACA

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ACT GTC GAC GGC ACC AAT ACT TAC TCT GAC TTC TTA GGT ACC (SEQ ID NO 100), y/o donde dichos epítopos de linfocitos T (Th1) son parte de la secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 257-301 de la MOMP de 356 aminoácidos de la cepa 92/1293, serovar D de Chlamydia psittaci.

La presente solicitud se refiere, aún más específicamente, a la composición o uso tal como se ha indicado anteriormente donde dicha especie del género Chlamydia es Chlamydia psittaci. Como tal, la presente solicitud se refiere a la prevención de la morbilidad o mortalidad, o al tratamiento de la morbilidad debida a la infección por Chlamydia psittaci en sujetos. Los sujetos son seres humanos o animales, pero preferentemente son aves y más preferentemente aves de corral incluidos, sin carácter limitante, pollos, patos, gansos y pavos.

Un medio de administración de los péptidos de la presente solicitud preferido es el suministro a la mucosa, más preferentemente la administración por aerosol o inhalación. Otros medios de administración son todas las demás vías de administración sistémicas y a la mucosa así como también los métodos de administración a huevos, muy conocidos por el experto.

La composición de la presente solicitud puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable convencional en la técnica. Los ejemplos no limitantes de excipientes adecuados incluyen el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.

En la composición, también denominados vacuna con poliepítopos, los péptidos pueden estar presentes como una mezcla de péptidos individuales y/o (parte de) los péptidos pueden estar unidos entre sí y/o ser parte de un constructo vector/portador. En una realización específica, la composición comprende un constructo con poliepítopos. La expresión «vacuna con poliepítopos», tal como se utiliza en la presente, denota una composición que no se presenta tal cual en la naturaleza. Así pues, la «vacuna con poliepítopos» de la presente solicitud no engloba una proteína natural de longitud completa sino que incluye dos o más epítopos aislados de la presente solicitud, no necesariamente en el mismo orden secuencial o número (se pueden utilizar repeticiones) que en la naturaleza. La vacuna con poliepítopos de la presente solicitud comprende preferentemente 2 o más, 5 o más, 10 o más, 13 o más, 15 o más, 20 o más o 25 o más epítopos de la presente solicitud. Más específicamente, la vacuna con poliepítopos comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más epítopos. Los epítopos de la vacuna con poliepítopos se pueden preparar como péptidos sintéticos o péptidos recombinantes. Estos péptidos sintéticos o péptidos recombinantes se pueden utilizar individualmente o unidos entre sí directa o indirectamente. Opcionalmente, se pueden unir dos o más de los epítopos (ya sean epítopos de linfocitos B y/o linfocitos T) en un constructo, denominado en la presente constructo con poliepítopos, y estos son contiguos o están separados por un conector o uno o más aminoácidos espaciadores. El término «conectar» o «unir» se refiere a cualquier método conocido en la técnica para enlazar funcionalmente epítopos. Más particularmente, la vacuna con poliepítopos de la presente solicitud es una hebra sintética o recombinante de dos o más péptidos que aloja (parte de) los epítopos tal como se han descrito en la presente. Los métodos para preparar un polipéptido, que puede comprender un poliepítopo (vacuna/constructo con poliepítopos) son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, el libro Molecular Cloning; a laboratory manual de Joseph Sambrook y David William Russell - 2001.

De acuerdo con una realización específica, la composición o vacuna con poliepítopos de la presente solicitud comprende los siguientes epítopos de linfocitos B: GTASATT (SEQ ID nO 92), GTDFNN (SEQ ID NO 93) y NPTLLGKA (SEQ ID NO 94), o una variante de estos, y los siguientes epítopos de linfocitos T: SEQ ID NO 20 y 101117, o una variante de estos. En una realización particular, dichos epítopos de linfocitos B están comprendidos en las siguientes secuencias peptídicas: SEQ ID NO 94-96, y dichos epítopos de linfocitos T en la composición están comprendidos en las siguientes secuencias peptídicas: SEQ ID NO 7-8, 70, 71, 73, 75-77, 79-81 y 91, o una variante de estas.

En una realización preferida, la composición o vacuna con poliepítopos de la presente solicitud comprende las siguientes secuencias peptídicas:

secuencia de AA 30-51 (EPSLLIDGTMWEGASGDPCDPC, epítopo de Th2 CD4 en CS1; SEQ ID NO 97), secuencia de AA 93-100 (TGTASATT, epítopo de linfocitos B inmunodominante en VS1; SEQ ID NO 95), secuencia de AA 163170 (KGTDFNNQ, epítopo de linfocitos B, serovar D en VS2; SEQ ID NO 96), secuencia de AA 305-340 (AQPKLATAVLDLTTWNPTLLGKATTVDGTNTYSDFL, epítopo de Th2 CD4 y de linfocitos B inmunodominante en Vs4; SEQ ID NO 98) (la agrupación de Th2 Cd4 - linfocito B), y la secuencia de AA 257-301 (AATDTKSATLKYHEWQVGLALSYRLNMLVPYIGVNWSRATFDADT) (agrupación de Th1 CD4 - CD8 en CS4; SEQ ID NO 99), o variantes de estas.

En una realización preferida adicional, la composición o vacuna con poliepítopos de la presente solicitud comprende las siguientes secuencias peptídicas: secuencia de AA 53-67 (TWCDAiSirAgYYGD, epítopo de Th1 CD4 y CD8; SEQ ID NO 20), AA221-235 (EMLNVTSSPAQFVIH, epítopo de Th2 CD4; SEQ ID NO 62), y AA163-170 KGTDFNNQ, epítopo de linfocitos B; SEQ ID NO 96).

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La presente solicitud incluye además un ácido nucleico aislado que codifica los epítopos, péptidos o constructo con poliepítopos tal como se describen en la presente. Los siguientes son ácidos nucleicos particulares que codifican los péptidos de la solicitud.

- Correspondiente a los AA 30-51: epítopo de Th2 CD4:

5’GAACCAAGTTTATTAATCGATCtGCACTATGTGGCtAAGGTGCTTCACtCtAGATCCTTGCGA TCCTTGC-3’ (SEQ ID NO 118)

- Correspondiente a los AA 93-100: epítopo de Th1 CD4 y linfocitos B inmunodominante: 5'-ACAGGAACAGCAAGTGCTACTACT-3' (SEQ ID NO 119)

- Correspondiente a los AA 163-170: epítopo de linfocitos B específico del serovar: 5'-AAAGGAACTGATTTCAATAATCAA-3' (SEQ ID NO 120)

- Correspondiente a los AA 257-301: Agrupación de epítopos de Th1 CD4 + linfocitos T CD8:

5’GCTGCTACAGATACTAAGTCTGCAACACTCAAATATCATGAATGGCAAGTTGGTCTAGC ACTCTCTTACAGATTGAACATGCTTGTTCCTTACATTGGCGTAAACTGGTCAAGAGCAACT TTTG A TG C T G AC AC T- 3' (SEQ ID Nü 122)

- Correspondiente a los AA 305-340: epítopo de Th2 CD4 + epítopo de linfocitos B inmunodominante:

5 'GCTCAGCCT A A ATTAGCC ACTGCTGTTTT AGATTT AACC ACTTGGA ACCC AAC ACTTTT A GGAAAGGCCACAACTGTCGACGGTACCAATACTTACTCTGACTTCTTA-3’ (SEQ ID NO 121)

Son realizaciones adicionales de la presente solicitud un vector que comprende un ácido nucleico que codifica al menos la vacuna o constructo con poliepítopos tal como se describe en la presente, y que es capaz de expresar los péptidos respectivos. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión y un método para producir y purificar los péptidos descritos en la presente también son parte de la solicitud. Los vectores adecuados que se pueden utilizar en la presente solicitud son conocidos por el experto en la técnica e incluyen un vector plasmídico, bacteriano, vírico o un vector de levaduras. Son ejemplos de vectores bacterianos Salmonella typhi, BCG (bacilo de Calmette Guerin) y Listeria. Son ejemplos de vectores víricos poxvirus, alfavirus ( virus del bosque Semliki, virus Sindbis, virus venezolano de la encefalitis equina (VEE, por sus siglas en inglés), virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), virus Kunjin, virus de la estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) cepas deficientes en la replicación de adenovirus (humano o de simios), vectores de polioma (tales como vectores de SV40, polioma bovino), vectores de CMV, vectores del virus del papiloma, virus de la gripe, virus del sarampión y vectores derivados del virus de Epstein Barr. Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica, por ejemplo, vectores lentivíricos, vectores retrovíricos y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica. Son ejemplos de vectores de levaduras una célula de Hansenula o una célula de Saccharomyces cerevisiae. La composición de acuerdo con la presente solicitud puede comprender además un sistema de suministro de antígenos, que optimice la presentación del antígeno. En una realización específica, el sistema de suministro de antígenos es una adenilato-ciclasa recombinante inactiva enzimáticamente (CyaA) que se origina a partir de Bordetella pertussis (el agente causante de la tos ferina) (Ladant et al., 1999; y en el documento EP1576967).

La composición de la presente solicitud puede comprender además un adyuvante. Son adyuvantes adecuados 1) los adyuvantes (mucosos) específicos del receptor tales como, por ejemplo, los adyuvantes que se unen a receptores de reconocimiento de patógenos (PRR, por sus siglas en inglés) y toxinas que se unen al receptor gangliosídico, 2) adyuvantes (musosos) que tienen como diana células presentadoras de antígenos tales como, por ejemplo, los descritos por Gerdts et al., (2006). Los ejemplos adicionales de adyuvantes incluyen, sin carácter limitante, compuestos tensioactivos (tales como Quil A), sales minerales (tales como hidróxido de aluminio), adyuvantes derivados de microorganismos (tales como el dipéptido de muramilo), emulsiones de aceite en agua y agua en aceite (tales como el adyuvante incompleto de Freund), sistemas de suministro de antígenos particulados (tales como liposomas, atmósferas poliméricas, nanoesferas, ISCOMATRIX), polisacáridos (tales como la inulina microparticulada), adyuvantes basados en ácidos nucleicos (tales como motivos de CpG), citocinas (tales como interleucinas e interferones), activadores de los receptores de tipo Toll y Eurocine L3 en N3 adyuvantia. En una realización específica, el adyuvante es un ISCOM™ (ISCOTEC aB, Uppsala, Suecia).

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La composición de la presente solicitud se puede utilizar como un medicamento y más específicamente contra una infección por una especie del género Chlamydia, preferentemente cuando dicha especie del género Chlamydia es Chlamydia psittaci. En una realización adicional, la composición es una vacuna. El término «vacuna» se refiere a un preparado biológico que suscita una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto al cual se ha administrado la vacuna. Preferentemente, la respuesta inmunitaria confiere un cierto efecto protector, beneficioso al sujeto frente a una exposición posterior al agente infeccioso. Más preferentemente, la respuesta inmunitaria previene la aparición de al menos un síntoma de la enfermedad asociada con el agente infeccioso o lo mejora o reduce la gravedad de al menos un síntoma de una enfermedad asociada con el agente infeccioso tras una exposición al antígeno posterior.

Los péptidos individuales y aislados que comprenden epítopos de linfocitos B y/o T y que comprenden la secuencia de aminoácidos tal como se describen en la presente (resp. caracterizados por la SEQ ID NO 89, 90, 92-96 y 98; y por la SEQ ID NO 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 35, 41, 42, 43, 44, 46, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 60, 61,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 91, 97, y 99) también son parte de la presente solicitud, así como también los ácidos nucleicos que los codifican. Tal como se ha demostrado, dichos péptidos son especialmente útiles para el desarrollo de una vacuna contra una especie del género Chlamydia y más específicamente C. psittaci. Así pues, cualquier combinación de dos o más de estos péptidos para producir una vacuna con poliepítopos y para su uso en el desarrollo de una composición o vacuna es parte de la presente solicitud. En una realización específica, la vacuna con poliepítopos comprende o está constituida por una combinación de dos o más péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos T tal como se ha descrito en la presente. En una realización adicional, la vacuna con poliepítopos comprende o está constituida por una combinación de dos o más péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos B de la presente solicitud.

En un aspecto adicional de la presente solicitud, la administración de la composición tal como se ha descrito en la presente, y en particular un vector que comprende los péptidos o ácidos nucleicos de la solicitud, puede superar los efectos inactivadores (es decir, neutralizantes) de los anticuerpos maternos. Es algo muy conocido en la técnica que los anticuerpos trasmitidos por la madre interfieren con la eficacia de programas tempranos de vacunación en sujetos jóvenes. En consecuencia, la presente solicitud proporciona una composición y el uso de esta para vacunar de manera eficaz a un sujeto infectado por una especie del género Chlamydia que tiene anticuerpos maternos contra dicha especie. En el caso de las aves, la composición se puede administrar de acuerdo con la presente solicitud a huevos y a polluelos recién eclosionados. En los embriones de aves, los anticuerpos maternos se depositan en la yema y son captados por el embrión según se resorbe la yema. Normalmente, se pueden detectar anticuerpos maternos en el embrión en el día embrionario 15. En consecuencia, la presente solicitud es útil para aumentar la eficacia de las vacunas administradas después del día embrionario 15, más preferentemente después del día embrionario 17, a aves en huevos.

Adicionalmente, los métodos divulgados en la presente se pueden llevar a cabo para vacunar a un ave joven poco después de la eclosión. En pollos jóvenes, los anticuerpos maternos desaparecen por lo general en las tres semanas posteriores a la eclosión. En consecuencia, en aves jóvenes, la composición de la presente solicitud se administra en aproximadamente las cuatro semanas posteriores a la eclosión, preferentemente, en aproximadamente las tres semanas después de la eclosión, más preferentemente en aproximadamente las dos semanas después de la eclosión, aún más preferentemente, en aproximadamente una semana después de la eclosión y de la manera más preferida en aproximadamente los primeros tres días después de la eclosión. Normalmente, la vacunación se llevará a cabo en el momento en el que las aves se retiran de la incubadora (normalmente uno o dos días después de la eclosión).

En una realización adicional más, la solicitud incluye una inmunización o vacunación de cebado-refuerzo contra una especie del género Chlamydia. El cebado se puede realizar con la composición, péptidos o ácidos nucleicos tal como se describen en la presente. Igualmente, el refuerzo se puede realizar con la composición, péptidos o ácidos nucleicos tal como se describen en la presente.

Por lo tanto, la solicitud también se refiere a un método para inmunizar a un sujeto contra una especie del género Chlamydia, más específicamente C. psittaci, que comprende administrar al sujeto la composición tal como se ha descrito en la presente en un régimen de cebado-refuerzo. En su sentido más amplio, la expresión «cebado- refuerzo» se refiere a la administración sucesiva de dos tipos diferentes de vacuna o tipos de composición inmunógena que tienen al menos un epítopo o inmunógeno en común. La administración de cebado es la administración de un primer tipo de vacuna o composición y puede comprender una, dos o más administraciones. La administración de refuerzo es la administración de un segundo tipo de vacuna o composición y puede comprender una, dos o más administraciones y, por ejemplo, puede comprender administraciones anuales o estar constituida esencialmente por ellas. El «refuerzo» se puede administrar desde aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente 6 meses después del «cebado», tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 semanas después del cebado y convenientemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 semanas después del cebado y más convenientemente aproximadamente 2, 3 o 4 semanas después del cebado. En una realización específica, las composiciones de cebado y refuerzo son idénticas y, en particular, la misma composición peptídica según se ha descrito en la presente.

La presente solicitud se refiere además a un método in vitro para diagnosticar una infección por Chlamydia psittaci en un sujeto que comprende:

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- poner en contacto una muestra de dicho sujeto con al menos un péptido que comprende un epítopo de linfocitos B de la presente solicitud, y

- determinar la presencia de anticuerpos en dicha muestra que se unen a dicho(s) péptido(s).

Tales métodos son muy conocidos por el experto y se pueden realizar mediante varios procedimientos estándar, tales como la detección de radiactividad, fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia o por microscopía, obtención de imágenes, etc.

La presente solicitud engloba además un kit diagnóstico que comprende al menos un péptido que comprende un epítopo de linfocitos B tal como se ha descrito en la presente. Los ejemplos de kits diagnósticos incluyen, sin carácter limitante, inmunoensayos incluidos los inmunohistoquímicos, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), inmunoelectrotransferencia, ensayo inmunorradiométrico (IRMA), flujo lateral, pruebas con tiras reactivas, inmunohisto/citoquímicos y otros ensayos conocidos por el experto en la técnica. Se pueden utilizar inmunoensayos para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo en una muestra así como también la cantidad de un anticuerpo en una muestra.

Una «muestra» puede incluir un líquido (por ejemplo, sangre, suero, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, líquido de la carne, esputo y semen), sólido (por ejemplo, heces) o cortes tisulares (por ejemplo, tejido cervicouterino) extraídos (aislados) a partir de un sujeto.

En una realización particular, los péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos B utilizados en el método diagnóstico y kit comprenden o están constituidos por la siguiente secuencia de aminoácidos: 1) TGTASATT (SEQ ID NO 95; epítopo de linfocitos B inmnodominante en VS1), 2) KGTDFNNQ (SEQ ID NO 96; epítopo del serovar D en VS2) y/o 3) NPTLLGKA (SEQ ID NO 94; epítopo de linfocitos B inmunodominante en VS4), o una variante de estas. Aún más particularmente, el péptido tiene una longitud de 5 a 30 aminoácidos.

La presente solicitud se ilustra mediante los siguientes Ejemplos, y no se debe considerar que estos limitan el alcance de la solicitud a las realizaciones específicas que aparecen en ellos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Experimento de vacunación con una subunidad de C. psittaci

Los autores realizaron un cartografiado del epítopo de linfocitos B y T de la «proteína principal de la membrana externa» (MOMP) de C. psittaci y utilizaron los epítopos de linfocitos B y T para crear una vacuna (con poliepítopos) de una subunidad de C. psittaci, la cual se validó en un ensayo preclínico en pollos exentos de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés). Se utilizó la cepa 92/1293 de C. psittaci, aislada a partir de un brote grave de enfermedad respiratoria en una granja de pavos de engorde comerciales en los Países Bajos (Vanrompay et al., 1993). La cepa se aisló a partir de un homogeneizado combinado de los pulmones, cloacas y vasos de los pavos enfermos y se caracterizó como serovar D y genotipo D (Geens et al., 2005). Las bacterias se cultivaron en células de mono verde Buffalo (BGM, por sus siglas en inglés) tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1992) y la titulación se realizó según el método de Spearman y Kaerber (Mayr et al., 1974).

1. Cartografiado del epítopo de linfocitos B

Para la identificación del epítopo de linfocitos B, se acoplaron péptidos sintéticos solapantes de 8 aminoácidos (con un solapamiento de 7 aminoácidos) de los dominios variables I a IV de la secuencia de MOMP en alfileres mediante una cisteína C-terminal extra (Pin-peptides, Pepscan Systems, Lelystad, Países Bajos). Se acopló una cantidad total de 100 nmol de péptido a cada alfiler.

Los resultados de los ELISA con péptidos en alfiler para el cartografiado del epítopo de linfocitos B de MOMP de la cepa 92/1293, serovar D de C. psittaci, una cepa con genotipo D sumamente virulento que infecta aves de corral se presentan en la Figura 3. Cuando se utilizó el MAb específico para el serovar D con una dilución de 1/100 (Figura 3A), el péptido 23 proporcionó la señal más elevada. Con una dilución de MAb de 1/600 el péptido 23 siguió proporcionando la señal más elevada a la vez que la señal creada por los otros péptidos se debilitó significativamente. El péptido en alfiler 23 (KGTDFNNQ) es muy probablemente el epítopo específico del serovar D del genotipo D de C. psittaci y se puede detectar en la región 2 de la secuencia variable (VS2) de MOMP.

Cuando se utiliza suero de pavos SPF inmunizados con MOMP recombinante de la cepa 92/1293, el péptido 23 proporcionó una señal débil (Figura 3B), lo que indica que el péptido 23 no es reconocido predominantemente por los animales inmunizados. Sin embargo, se pudo obtener una señal muy fuerte para el péptido 12 (TGTASATT) ubicado en VS1 y el péptido 43 (NPTLLGKA) ubicado en VS4. También se obtuvo el mismo patrón de señales cuando se utilizó suero de pavos infectados de manera natural. En consecuencia, los péptidos TGTASATT, NPTLLGKA y KGTDFNNQ son los epítopos de linfocitos B inmunodominantes (reconocidos de manera importante por el sistema inmunitario tal como se muestra en la Figura 3) y son útiles para el desarrollo de vacunas.

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Además, los epítopos 12 y 43 de linfocitos B inducen anticuerpos seroneutralizantes al inmunizar pollos SPF con el péptido 12 o 43 acoplado a la proteína portadora KLH (siglas en inglés de hemocianina de la lapa californiana).

Los epítopos de linfocitos B identificados TGTASATT y NPTLLGKA se pueden utilizar en un ELISA con anticuerpos para detectar anticuerpos contra C. psittaci tanto en seres humanos como animales. Los epítopos de linfocitos B inmunodominantes se pueden utilizar como péptidos en alfiler en un ELISA con anticuerpos sumamente sensible. El epítopo específico del serovar KGTDFNNQ se puede utilizar como péptido en alfiler en un ELISA con anticuerpos específicos del serovar D.

2. Cartografiado del epítopo de linfocitos T

Para la identificación del epítopo de linfocitos T, se produjeron péptidos sintéticos solapantes de 15 aminoácidos (solapamiento de 14 aminoácidos) de la secuencia de MOMP completa (Pep-T-Topes, Pepscan Systems) en placas de cultivo tisular de fondo plano con 96 pocillos (Greiner Bio-one, Wemmel, Bélgica) con una cantidad de 1-2 mg de péptido por pocillo.

Se utilizaron los Pep-T-Topes para identificar los epítopos de linfocitos T de la MOMP de la cepa 92/1293, serovar D de C. psittaci. El cartografiado de epítopos de linfocitos T se basó en: a) ensayos de proliferación de linfocitos, b) citometría de flujo en células proliferantes utilizando marcadores de la superficie celular CD4 y CD8, c) un ELISA con IFN-y en el sobrenadante de células proliferantes y d) un bioensayo de IL-6 en el sobrenadante de células proliferantes (Lynagh et al., 2000; Zubiaga et al., 1990). La Tabla 1 contiene los resultados completos del cartografiado de epítopos B y T.

Los péptidos que suscitan una o más de las siguientes características se clasifican como adecuados para el diseño de vacunas:

a) Cuentas por minuto (Cpm) en el ensayo de proliferación > 10 000,

b) %CD4 > 17,5,

c) %CD8 > 14,2,

d) IFN-y > 9 pg/mL, y

e) IL-6 > 1,9 pg/mL.

Los péptidos que comprenden epítopos de linfocitos T adecuados para el diseño de vacunas corresponden a la SEQ ID NO 1, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 35, 41, 42, 43, 44, 46, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 60, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87 y 91. Entre estos, los péptidos especialmente útiles para incluir en la composición de la presente solicitud son los siguientes:

- Los péptidos que comprenden un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ corresponden a la SEQ ID NO 1, 10-13, 18, 20, 25, 27, 29, 31-32, 35, 42, 46, 51, 53-56, 61,64-67, 69-71, 73, 75, 79-81 y 87.

Entre estos péptidos, se realizó una primera selección para diseñar una vacuna con poliepítopos.

Muchos epítopos de Th1 CD4 estuvieron presentes en la MOMP y se detectaron combinados con epítopos de CD8. Especialmente, el péptido 281-295 contiene un epítopo de Th1 CD4-CD8 muy fuerte (108 088 cpm). Además, estos epítopos están ubicados en una agrupación grande de múltiples epítopos de Th1 CD4, un epítopo de CD8 adicional y dos epítopos de Th2 CD4 presentes en un péptido, que cubren los aminoácidos 257 a 296.

Tabla 1. Péptidos que alojan epítopos de linfocitos B y T de la cepa 92/1293, genotipo D de Chlamydia psittaci

SEQ ID NO: posición Secuencia TC (cpm)1 % CD4 00 IFN-y (pg/mL) IL-6 (pg/mL) Epítopo

1: 17-31 ALSLQALPVGNPAEP 11093 13,6 0,4 9 0 Th1 CD4

2: 18-32 LSLQALPVGNPAEPS 6393 1,7 0,8 9 0 Th1 CD4

3: 25-39 VGNPAEPSLLIDGTM 4545 9,4 0,7 9 0 /

4: 26-40 GNPAEPSLLIDGTMW 2027 4,9 1,0 0 0 /

5: 29-43 AEPSLLIDGTMWEGA 4851 10,8 2,1 0 1,9 /

6: 30-44 EPSLLIDGTMWEGAS 7421 6,6 1,6 0 1,9 Th2 CD4

7: 35-49 IDGTMWEGASGDPCD 14032 20,5 3,8 0 3,9 Th2 CD4

8: 36-50 DGTMWEGASGDPCDP 9462 1,8 1,0 0 3,9 Th2 CD4

9: 37-51 GTMWEGASGDPCDPC 15074 3,6 0,9 0 0 /

10: 40-54 WEGASGDPCDPCATW 14332 1,6 1,0 9 0 Th1 CD4

11: 41-55 EGASGDPCDPCATWC 13289 1,4 1,0 9 0 Th1 CD4

12: 42-56 GASGDPCDPCATWCD 14731 1,6 1,0 9 0 Th1 CD4

13: 43-57 ASGDPCDPCATWCDA 16929 4,0 1,2 9 0 Th1 CD4

14: 44-58 SGDPCDPCATWCDAI 3385 0,6 0,2 0 0 /

15: 56-60 DPCDPCATWCDAISI 5042 2,6 1,3 0 1,9 Th2 CD4

16: 47-61 PCDPCATWCDAISIR 5856 5,9 1,0 0 0

17: 48-62 CDPCATWCDAISIRA 2252 2,2 1,0 0 0 /

18: 49-63 DPCATWCDAISIRAG 14852 8,4 0,8 9 0 Th1 CD4

19: 50-64 PCATWCDAISIRAGY 8720 6,9 1,8 0 0 /

20: 53-67 TWCDAISIRAGYYGD 35485 13,6 6,9 9 0 Th1 CD4 CD8

21: 54-68 WCDAISIRAGYYGDY 30171 17,3 1,5 0 0 CD4

22: 55-69 CDAISIRAGYYGDYV 3668 37,0 7,0 0 0 /

23: 58-72 ISIRAGYYGDYVFDR 3684 16,4 1,9 0 0 /

24: 59-73 SIRAGYYGDYVFDRV 11032 21,5 2,1 0 0 CD4

25: 60-74 IRAGYYGDYVFDRVL 18411 12,1 0,9 9 0 Th1 CD4

26: 61-75 RAGYYGDYVFDRVLK 12444 21,4 4,6 0 0 CD4+CD8

27: 66-80 GDYVFDRVLKVDVNK 5363 24,0 7,8 9 0 Th1 CD4 CD8

28: 67-81 DYVFDRVLKVDVNKT 5366 4,1 1,2 9 0 Th1 CD4

29: 71-85 DRVLKVDVNKTFSGM 9311 5,7 0,9 18 0 Th1 CD4

30: 72-86 RVLKVDVNKTFSGMA 4741 19,4 2,1 0 0 /

31: 73-87 VLKVDVNKTFSGMAK 27420 8,0 1,1 9 0 Th1 CD4

32: 85-99 MAKSPTEATGTASAT2 80 468 25,1 2,0 32 0 Th1 CD4 Epítopo de linfocitos B

33: 91-105 EATGTASATTTAVDR 3433 1,7 0,8 9 0 Epítopo de linfocitos B

34: 95-109 TASATTTAVDRTNLA 8278 2,6 0,7 0 0 CD4

35: 97-111 SATTTAVDRTNLAYG 60 941 16,4 2,9 18 0 Th1 CD4

36: 98-112 ATTTAVDRTNLAYGK 2241 2,7 1,2 9 0 /

37: 107-121 NLAYGKHLQDAEWFT 2532 2,6 0,6 0 0 /

38: 109-123 AYGKHLQDAEWFTNA 6018 3,9 1,2 9 0 Th1 CD4

39: 111-125 GKHLQDAEWFTNAAF 3621 12,2 3,4 9 0 /

40: 112-126 KHLQDAEWFTNAAFL 2513 4,1 1,1 0 0 /

41: 113-127 HLQDAEWFTNAAFLA 2546 19,7 5,8 9 0 /

42: 119-133 WFTNAAFLALNIWDR 25 067 18,7 12,1 9 0 Th1 CD4 CD8

43: 131-145 WDRFDIFCTLGASNG 5775 58,7 14,9 0 1,9 Th2 CD4 CD8

44: 142-156 ASNGYFKASSAAFNL 2009 18,7 4,0 0 0 /

45: 154-168 FNLGVLIGLKGTDFN3 1129 10,6 2,1 0 0 Epítopo de linfocitos B

46: 166-180 DFNNQLPNVAITQGV 5683 18,3 2,3 9 0 Th1 CD4 Epítopo de linfocitos B

47: 167-181 FNNQLPNVAITQGVV 1321 2,3 0,9 9 0 /

48: 168-182 NNQLPNVAITQGVVE 1262 15,9 6,1 9 0 /

49: 184-198 YTDTTFSWSVGARGA 2811 44,1 18,3 9 0 /

50: 195-209 ARGALWECGCATLGA 7924 18,3 6,1 0 0 CD4

51: 196-210 RGALWECGCATLGAE 21 981 7,5 2,6 9 0 Th1 CD4

52: 197-211 GALWECGCATLGAEF 4416 5,3 0,1 0 0 /

53: 201-215 ECGCATLGAEFQYAQ 15 883 1,6 0,9 9 0 Th1 CD4

54: 202-216 CGCATLGAEFQYAQS 23 344 2,1 0,4 18 0 Th1 CD4

55: 203-217 GCATLGAEFQYAQSN 10 217 4,5 2,8 18 0 Th1 CD4

56: 204-218 CATLGAEFQYAQSNP 6924 21,9 4,3 18 0 Th1 CD4

57: 205-219 ATLGAEFQYAQSNPK 6533 7,1 1,3 9 0 Th1 CD4

58: 206-220 TLGAEFQYAQSNPKI 4225 12,4 1,7 9 0 /

59: 207-221 LGAEFQYAQSNPKIE 1218 10,7 3,6 9 0 /

60: 208-222 GAEFQYAQSNPKIEM 2142 3,1 1,1 18 0 /

61: 214-228 AQSNPKIEMLNVTSS 21 643 28,9 7,3 18 0 Th1 CD4 CD8

62: 221-235 EMLNVTSSPAQFVIH 7037 16,0 4,4 0 1,9 Th2 CD4

63: 222-236 MLNVTSSPAQFVIHK 2178 24,2 5,8 18 0 /

64: 233-247 VIHKPRGYKGTGSNF 44 429 23,3 0,8 9 0 Th1 CD4

65: 244-258 GSNFPLPIDAGTEAA 25 253 4,8 0,6 9 0 Th1 CD4

66: 245-259 SNFPLPIDAGTEAAT 39 106 5,4 0,6 9 0 Th1 CD4

67: 246-260 NFPLPIDAGTEAATD 13 698 17,5 0,5 9 0 Th1 CD4

68: 251-265 IDAGTEAATDTKSAT 15 894 8,1 1,2 0 0 CD4

69: 252-266 DAGTEAATDTKSATL 10 513 77,7 5,7 9 0 Th1 CD4

70: 257-271 AATDTKSATLKYHEW 39 489 8,3 0,4 9 0 Th1 CD4

71: 262-276 KSATLKYHEWQVGLA 19 151 13,2 3,0 32 0 Th1 CD4

72: 263-278 SATLKYHEWQVGLAL 2841 5,4 0,9 18 0 Th1 CD4

73: 264-279 ATLKYHEWQVGLALS 20 815 48,8 7,1 18 0 Th1 CD4 CD8

74: 266-280 LKYHEWQVGLALSYR 3013 61,0 14,2 9 0 /

75: 267-281 KYHEWQVGLALSYRL 13 516 43,5 20,4 9 0 Th1 CD4 CD8

76: 268-282 YHEWQVGLALSYRLN 20 591 20,6 1,4 0 1,9 Th2 CD4

77: 269-283 HEWQVGLALSYRLNM 62 709 39,4 5,8 0 3,9 Th2 CD4

78: 279-293 YRLNMLVPYIGVNWS 5510 61,7 5,4 0 1,9 CD4

79: 280-294 RLNMLVPYIGVNWSR 41 321 60,4 3,6 9 0 Th1 CD4

80: 281-295 LNMLVPYIGVNWSRA 108 088 65,8 20,2 9 0 Th1 CD4 CD8

81: 282-296 NMLVPYIGVNWSRAT 28 136 30,9 0,9 9 0 Th1 CD4

82: 287-302 YIGVNWSRATFDADT 14 406 6,8 0,6 0 0 CD4

83: 291-305 NWSRATFDADTIRIA 2483 16,0 2,8 0 0 /

84: 291-306 WSRATFDADTIRIAQ 21 434 26,4 3,9 0 0 CD4

85: 293-307 SRATFDADTIRIAQP 41 778 8,6 1,2 0 1,9 Th2 CD4

86: 295-309 ATFDADTIRIAQPKL 2539 18,5 1,7 0 0 /

87: 299-313 ADTIRIAQPKLATAV 10 759 12,0 2,2 9 0 Th1 CD4

5

10

15

20

25

30

88: 304-318 IAQPKLATAVLDLTT 1829 10,8 3,1 0 0 /

89: 305-319 AQPKLATAVLDLTTW 6541 7,7 0,5 0 0 Flanquea el epítopo de linfocitos B NPTLLGKA

90: 311-325 TAVLDLTTWNPTLLG4 5087 6,4 0,6 0 1,9 Parte del epítopo de linfocitos B NPTLLGKA + Th2 CD4

91: 326-340 KATTVDGTNTYSDFL 5259 17,5 1,2 0 1,9 Parte del epítopo de linfocitos B inmunodominante NPTLLGKA + Th2 CD4

□ Ubicación de los dominios variables de MOMP

1TC (cpm): ensayo de proliferación de linfocitos T (cuentas por minuto)

2GTASATT: el epítopo de linfocitos B inmunodominante identificado 3GTDFNN: el epítopo de linfocitos B específico del serovar D 4NPTLLGKA: el epítopo de linfocitos B inmunodominante identificado

3. Vacuna contra C. psittaci

Se diseñaron por medios sintéticos péptidos que incluyen los epítopos identificados de linfocitos B y T de la MOMP de la cepa 92/1293 de C. psittaci.

4. Ensayo de vacunación 1: vacunación de pollos SPF

Se realizaron los experimentos en cámaras aislantes de presión negativa (IM 1500, Montair Sevenum, los Países Bajos). El diseño experimental fue evaluado y aprobado por el Comité Ético de Experimentos en Animales de la Universidad de Ghent. Para evaluar la vacuna con poliepítopos, se dividieron 42 pollos exentos de patógenos específicos (SPF) (Lohman, Alemania) en 6 grupos de 7 animales cada uno. El programa de vacunación y la configuración experimental se presentan en la Tabla 3 y 4. Los animales se vacunaron mediante un aerosol (nebulizador Cirrus™; tamaño de partícula del aerosol de 5 pm; Laméris, Aartselaar, Bélgica) que proporcionó una dosis de vacuna de 500 pg de cada péptido sintético/animal. Cada uno de los animales de control recibió 60 pg de ISCOMS mediante aerosol. Se realizó la primovacunación en pollos de 7 días de edad de los grupos 1 a 6 (Tabla 3). A la edad de 4 semanas, los animales de los grupos 1 a 4 se infectaron aerogénicamente utilizando el nebulizador Cirrus™, mientras que los de los grupos 5 y 6 recibieron la vacunación de refuerzo. A la edad de 7 semanas, se sacrificaron todos los animales de los grupos 1 a 4, mientras que los de los grupos 5 y (edad 6 semanas) se infectaron aerogénicamente utilizando el nebulizador Cirrus™. La dosis de infección experimental en cada cámara aislante fue de 106 TCID50 de la cepa 92/1293 de C. psittaci. Los animales de los grupos 5 y 6 se sacrificaron 21 días después de la infección (d.i.).

Péptido 1: EPSLLIDGTMWEGASGDPCDPC (SEQ ID NO 97)

Péptido 2: TGTASATT (SEQ ID NO 95)

Péptido 3: KGTDFNNQ (SEQ ID NO 96)

Péptido 4: AQPKLATAVLDLTTWNPTLLGKATTVDGTNTYSDFL (SEQ ID NO 98)

Péptido 5: AATDTKSATLKYHEWQVGLALSYRLNMLVPYIGVNWSRATFDADT (SEQ ID NO 99)

Tabla 3. Programa de vacunación.

Grupo (n) Nombre Primovacunación (día 7) Dosis (pg) Vacunación de refuerzo (día 21) Dosis (pg)

1 (7) Iscoms (1 x) Iscoms

60 ninguna

60

5

10

15

20

25

Grupo (n): Nombre Primovacunación (día 7) Dosis (pg) Vacunación de refuerzo (día 21) Dosis (pg)

2 (7): B (1 x) Péptidos 1, 2, 3 y 4 500 ninguna 500

3 (7): T (1 x) Péptido 5 500 ninguna 500

4 (7): B + T (1 x) Péptidos 1, 2, 3, 4 y 5 500 ninguna 500

5 (7): Iscoms (2 x) Iscoms 60 Iscoms 60

6 (8): B + T (2 x) Péptidos 1, 2, 3, 4 y 5 500 Péptidos 1, 2, 3, 4 y 5 500

Tabla 4. Programación de la vacunación, exposición al antígeno y sacrificio en los grupos 1 a 6.

Grupo Primovacunación (edad en Vacunación de refuerzo Exposición al antígeno Sacrificio (edad en semanas) (edad en semanas) (edad en semanas) semanas)

1
1: / 4 7

2: 1 / 4 7

3: 1 / 4 7

4: 1 / 4 7

5: 1 4 6 9

6: 1 4 6 9

4.1. Monitorización y muestreo

Se calificaron las señales clínicas a diario hasta la necropsia. Se monitorizó la excreción faríngea y cloacal de C. Psittaci en el día 1 del experimento y en días alternos comenzando 4 días después de la infección (d.i.) hasta la necropsia 21 días d.i., utilizando hisopos con una varilla de aluminio y punta de rayón (Colpan; Fiers, Kuurne, Bélgica) provistos con medio de transporte para C. psittaci (74,6 g/L de sacarosa (Acros Organics, Geel, Bélgica); 5,1 g/L de KH2PO4 y 1,2 g/L de K2HPO4 (Sigma); 0,9 g/L de la sal monopotásica del ácido L-glutámico (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica) y 10% v/v de suero bovino fetal (Greiner, Wemmel, Bélgica); 50 pg/mL de gentamicina (Invitrogen); 100 pg/mL de vancomicina y 100 pg/mL de estreptomicina (Soenen, Merelbeke, Bélgica); 25 000 U/mL de nistatina (Sigma) pH 7). Los hisopos se almacenaron a -80 °C hasta que se procesaron.

Se recogieron muestras sanguíneas para la detección de títulos de anticuerpos séricos específicos para MOMP antes de cada vacunación, justo antes de la infección experimental y en el momento del sacrificio a los 21 días d.i.

Las muestras se almacenaron durante toda la noche a temperatura ambiente, se centrifugaron (300 * g, 10 min, 4 °C) y después se recogió el suero. El suero se pretrató con caolín para eliminar la actividad de fondo (Novak et al., 1993) y se almacenó a -80 °C.

En el momento del sacrificio, 21 días d.i., se determinaron las respuestas proliferativas de los linfocitos de la sangre periférica y los linfocitos del bazo utilizando un ensayo de proliferación de linfocitos T. Además, se determinó la cantidad de células inmunitarias en la sangre y bazo mediante citometría de flujo. En el momento del sacrificio, se examinaron todos los pollos para identificar lesiones macroscópicas. El sistema de calificación de la patología macroscópica se presenta en la Tabla 5. Se prepararon cortes tisulares con criostato de las conchas, la conjuntiva, la tráquea, los pulmones, los sacos aéreos torácicos y abdominales, el pericardio, hígado y bazo para determinar la presencia del antígeno de Chlamydia.

Tabla 5. Sistema de calificación para la patología macroscópica de C. psittaci presente en pollos sacrificados.

5

10

15

20

25

Tejido: Calificación 1* Calificación 2 Calificación 3

Conjuntiva: Ligeramente congestionada Gravemente congestionada Petequias

Conchas: Ligeramente congestionada Gravemente congestionada Necrosis

Tráquea: Ligeramente congestionada Moderadamente congestionada Gravemente congestionada

Pulmones: Ligeramente congestionados Gravemente congestionados Gravemente congestionados + focos inflam. grises

Sacos torácicos: aéreos Opacidad difusa Depósitos de fibrina focales Aerosaculitis fibrinosa grave

Sacos abdominales: aéreos Opacidad difusa Pocos depósitos de fibrina Aerosaculitis fibrinosa grave

Pericardio: Pericarditis serosa Pericarditis serofibrinosa Pericarditis adhesiva fibrinosa

Bazo: Ligeramente dilatado Moderadamente dilatado Gravemente dilatado y petequias

Hígado: Ligeramente dilatado Moderadamente dilatado Gravemente dilatado

*calificación 0 = sin patología macroscópica.

4.2. Señales clínicas

Se pudieron observar señales clínicas en todos los animales de los grupos de control (grupo 1 y 5) desde el día 4 d.i. hasta al final del experimento en el día 21 d.i. Todos los pollos de control estuvieron aletargados y mostraron anorexia, conjuntivitis, rinitis, dificultad respiratoria y diarrea. Al principio, los principales síntomas fueron letargia, anorexia y conjuntivitis en todas. A veces, 6 de 7 (85%) animales también presentaron deposiciones acuosas. Desde el día 8 d.i. hasta el día 10 d.i. apareció rinitis en todos y desde el día 11 d.i. hasta el día 21 d.i. todos los animales mostraron de manera intermitente disnea. En el momento del sacrificio, 4 de 7 (57%) tuvieron grandes cantidades de moco en su pico.

Las señales clínicas en el grupo 2 aparecieron por primera vez en el día 4 d.i., mostrando 3 de 7 (43%) animales rinitis y conjuntivitis. A partir del día 9 d.i. se observó conjuntivitis y rinitis en todos. El número de animales con conjuntivitis y rinitis descendió gradualmente hasta el día 17 d.i. En ese momento, todos los pollos del grupo 2 parecieron estar sanos.

En el día 4 d.i., 4 animales (67%) de los grupos 3 y 4 mostraron conjuntivitis. Un día después, la conjuntivitis comenzó a remitir en esos cuatro animales pero 3 de ellos (50%) presentaron rinitis durante los siguientes cuatro (grupo 3) o dos (grupo 4) días. En el día 10 y 8 d.i., los pollos de los grupos 3 y 4, respectivamente, se mostraron sanos.

Todos los animales vacunados del grupo 6 siguieron estando muy activos después de la infección experimental y todos comieron bien. No mostraron ningún síntoma clínico.

Por lo tanto, respecto a las señales clínicas, la mejor protección fue la del grupo 6 y después la del grupo 4, 3 y 2, respectivamente.

4.3. Lesiones macroscópicas

Los resultados del examen patológico en el momento del sacrificio se presentan en la Figura 5. Se presentan las calificaciones media por grupo ±SD. Los grupos 2, 3 y 4 se compararon estadísticamente al grupo de control 1. El grupo 6 se comparó estadísticamente al grupo de control 5.

En primer lugar, es necesario analizar las observaciones del bazo ya que no se presentan en la Figura 5. El bazo de todos los pollos de control estuvo moderadamente congestionado y 2 bazos de los pollos del grupo 1 y un bazo de un pollo del grupo 5 mostraron petequias. También se observó una congestión de ligera a moderada en los bazos de los pollos de los grupos 2 y 3. El bazo de un pollo en cada uno de los últimos grupos también mostró petequias. El

5

10

15

20

25

30

35

40

bazo de los pollos del grupo 4 a 6 estuvo de moderada a gravemente dilatado, pero en lugar de estar congestionados, los bazos presentaron hinchazón con pulpa blanca visible macroscópicamente, lo que indica inmunoestimulación. Esto último fue más prominente en los pollos del grupo 6 en comparación con el grupo 4.

Los pollos de control del grupo 1 mostraron patología macroscópica en todos los tejidos examinados excepto en uno, concretamente la tráquea. En el grupo 2, se observó patología macroscópica en 6 de 10 (60%) tejidos examinados. En el grupo 3, se observó patología macroscópica en 9 de 10 (90%) tejidos examinados. Sin embargo, las lesiones en la tráquea de algunos pollos fueron muy probablemente debidas al sacrificio. Por lo tanto, en el grupo 3, se observó patología macroscópica en 8 de 10 (90%) tejidos examinados.

En conjunto, el grupo 4 estuvo significativamente mejor protegido que el grupo de control 1. La protección en el grupo 4 también fue mejor que en los grupos 2 y 3, ya que únicamente se observó patología macroscópica en 1 de 10 (10%) tejidos examinados, concretamente los pulmones. Se observó patología macroscópica en el pulmón de 2 de 7 animales del grupo 4.

Los pollos de control del grupo 5 mostraron patología macroscópica en todos los tejidos examinados excepto en uno, concretamente la tráquea. En el grupo 6, únicamente se observó patología macroscópica en el pulmón de 1 de 8 animales.

Únicamente se observaron lesiones hepáticas en los grupos 1, 2, 3 y 5, lo que indica septicemia en el momento del sacrificio.

Por lo tanto, respecto a los resultados de la autopsia, la mejor protección fue la de los grupos 6 y 4.

4.4. Replicación y excreción de Chlamydia

Se examinaron los cortes tisulares con criostato (5 pm) de las conchas, la conjuntiva, la tráquea, los pulmones, los sacos aéreos torácicos y abdominales, el pericardio, hígado y bazo para detectar replicación de C. psittaci mediante la tinción de inmunofluorescencia IMAGEN™ (IMAGEN™ CHLAMYDIA, Oxoid, Drongen, Bélgica) tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1994a). Se enumeraron las células positivas para C. psittaci en cinco campos microscópicos seleccionados al azar (600x, Nikon Eclipse TE2000-E, Japón) y calificados entre 0 y 5: calificación 0 indicó que no había C. psittaci presente; se adjudicó la calificación 1 cuando estuvieron presentes una media de 1-5 cuerpos elementales (forma morfológica no metabólica, infecciosa); se adjudicaron las calificaciones 2, 3, 4 y 5 cuando estuvieron presentes una media de 1-5, 6-10, 10-20 y >20 células positivas para inclusiones (organismos en replicación activa).

Se examinaron los hisopos para detectar excreción de C. psittaci por parte del cultivo bacteriano en células de mono verde Buffalo (BGM) (Vanrompay et al., 1992) y para la identificación posterior de Chlamydia utilizando el ensayo de inmunofluorescencia directa IMAGEN™ (Vanrompay et al., 1994b). Se calificó la presencia de C. psittaci como para la replicación bacteriana en diferentes tejidos. Los hisopados obtenidos en el día 1 del experimento fueron negativos para C. psittaci. Los resultados de los cultivos de los hisopados obtenidos 21 días después de la infección (sacrificio) se presentan en la Tabla 6. Los resultados de los hisopados restantes se presentan en la Tabla 22.

Tabla 6. Excreción de C. psittaci faríngea y cloacal en el momento del sacrificio, 21 días d.i.

Excreción faríngea

: Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6

Día 21 d.i.: 1,71 ± 0,39 1,0 ± 0,40 0,5 ± 0 0,5 ± 0 1,78 ± 0,26 0,5 ± 0

Excreción cloacal

Día 21 d.i.: 2,0 ± 0 0,71 ± 0,39 0,5 ± 0 0,5 ± 0 1,92 ± 1,01 0,5 ± 0

En el momento del sacrificio, la excreción faríngea de C. psittaci fue significativamente superior en los grupos 1 y 2, en comparación con los grupos 3 y 4. En el momento del sacrificio, la excreción faríngea de C. psittaci fue significativamente superior para el grupo 5 que para el grupo 6. Lo mismo sucedió con la excreción cloacal. Por lo tanto, respecto a la excreción de C. psittaci21 días d.i., la mejor protección fue, por igual, la de los grupos 3, 4 y 6.

4.5. Respuestas de anticuerpos

Se analizaron muestras de suero (Figura 6) e hisopados de las mucosas (Figura 7) de los pollos mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Se determinaron los títulos totales de anticuerpos IgG(H+L) tal como se ha

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descrito previamente, utilizando el antígeno de MOMP recombinante, denominada en lo sucesivo en la presente rMOMP, para recubrir las placas (Verminnen et al., 2006). Las diluciones a la mitad, comenzando en 1/40 para el suero y 1/20 para los hisopados de mucosas y teniendo en cuenta la dilución hecha por el tratamiento con caolín, se incubaron en los pocillos para que reaccionaran con el recubrimiento de rMOMP. La detección de los isotipos específicos para MOMP aún ha de hacerse con diluciones 1/500 de anticuerpos policlonales conjugados con peroxidasa específicos anti-IgG, -IgM e -IgA de pollo con reactividad cruzada (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, EE. UU.). Después de la adición del sustrato H2O2 y el cromógeno ABTS, se pudo determinar la absorbancia máxima a 405 nm. Las muestras se consideraron positivas si la absorbancia excedió el valor de corte, calculado como la media de las absorbancias del control negativo más dos veces la desviación estándar. Se presentaron los títulos como el recíproco de la dilución de suero más elevada con una absorbancia por encima del valor de corte. Como control positivo, se utilizó el suero obtenido de experimentos de vacunación previos.

En primer lugar, la comparación de los grupos 1 a 4. En el día -14, el título medio de anticuerpos del grupo 1 fue significativamente menor que los títulos medios de anticuerpos de los grupos 3 y 4. En ese momento, el título medio de anticuerpos del grupo 1 fue estadísticamente el mismo que para el grupo 2. Sin embargo, la primoinmunización mucosa no dio como resultado títulos de anticuerpos séricos significativamente superiores en el día de la infección (día -1). En el día -1, los títulos medios de anticuerpos séricos en los grupos 2, 3 y 4 fueron estadísticamente los mismos que para ambos grupos de control 1. La infección de los grupos 1,2, 3 y 4 dio como resultado un aumento de los títulos de anticuerpos séricos en el grupo de control 1 y en el grupo con una protección mejor 4. 22 días después de la infección, el título medio de anticuerpos séricos para el grupo 4 fue significativamente superior al del grupo de control 1 y al de los grupos 2 y 3.

En segundo lugar, la comparación de los grupos 5 y 6. De nuevo, en el día -14, el título medio de anticuerpos séricos del grupo 5 fue significativamente menor que los títulos medios de anticuerpos del grupo 6. De nuevo, la primoinmunización mucosa no dio como resultado títulos de anticuerpos séricos significativamente superiores en el día de la infección (día -1). En el día -1, el título medio de anticuerpos séricos en el grupo 6 fue estadísticamente el mismo que para el grupo de control 5. Sin embargo, una semana antes de la infección, el título medio de anticuerpos séricos en el grupo 6 fue significativamente superior al del grupo de control 5. Lo mismo fue cierto dos días y una semana después de la infección experimental. Posteriormente, los anticuerpos séricos en el grupo con la mejor protección 6 disminuyeron rápidamente mientras que los del grupo de control 5 no protegido aumentaron rápidamente hasta 14 días después de la infección.

La información más relevante es el incremento significativo de los títulos medios de anticuerpos mucosos tras la primovacunación mucosa en los grupos con una mejor protección 4 y 6 (día -1), en comparación con los grupos de control 1 y 5 y los grupos inmunizados 2 y 3. Los pollos de los grupos 4 y 6 recibieron la misma vacuna. La infección de los grupos 1, 2, 3 y 4 en el día -1 dio como resultado un aumento de los títulos medios de anticuerpos mucosos en el grupo 1 no protegido y los grupos con una menor protección 2 y 3. Los títulos medios de anticuerpos mucosos en el grupo con una mejor protección 4 disminuyeron por lo general tras la infección. La vacunación del refuerzo del grupo 6 no tuvo un efecto visible en el título medio de anticuerpos mucosos. La infección de los grupos 5 y 6 dio como resultado en primer lugar un aumento rápido y una disminución rápida del título medio de anticuerpos mucosos en el grupo 5 no protegido y en el grupo con la mejor protección 6, respectivamente. A partir del día 7 d.i., los títulos medios de anticuerpos mucosos en el grupo con la mejor protección 6 siguió elevándose hasta el día 21 d.i., mientras que los del grupo 5 no protegido disminuyeron e incluso desaparecieron 14 días d.i.

4. 6. Respuestas proliferativas de linfocitos

Se aislaron leucocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés) a partir de muestras de sangre con heparina obtenidas mediante venopuntura (V. Ulnaris) y del bazo de cada pollo, 21 días d.i. en el momento del sacrificio. Las pruebas proliferativas de linfocitos se realizaron tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1999b). Resumiendo, se cultivaron células no adherentes por duplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 106 células en 150 pL de DMEM (Invitrogen) complementado con un 20% de suero bovino fetal inactivado térmicamente (Greiner), 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio, 1% de L-glutamina, 1% de gentamicina y 0,0001% de p-mercaptoetanol (todo de Invitrogen). Para la proliferación por antígenos, se añadieron 20 pg de MOMP recombinante a los pocillos individuales. Los controles negativos y positivos incluyeron células estimuladas con simple medio o con 10 pg de concanavalina A (Con A), respectivamente. Las células se incubaron a 39,5 °C en un incubador humidificado con un 5% de CO2. La proliferación inducida por Con A o antígenos se midió por la incorporación de 3H-timidina (1 pCi/pocillo) durante al menos 16 h de cultivo, en los días 2 (Con A) y 6, respectivamente. Los cultivos se recolectaron en bandas de filtro de fibra de vidrio con un recolectador de células (Skatron, Liers, Noruega). La radiactividad incorporada en el ADN se midió con un contador de centelleo p (Perkin- Elmer, Bruselas, Bélgica). El índice de estimulación (IE) se definió como la relación entre las cuentas por minuto (cpm) de los cultivos estimulados y las de los cultivos solo con medio. Los resultados se presentan en la Tabla 7.

4.7. Análisis estadístico

Se emplearon las pruebas no paramétricas de Krukal Wallis y Mann-Whiteny para los análisis estadísticos. Se consideró que los resultados eran significativamente diferentes en el nivel de p < 0,05.

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Tabla 7. Índice de estimulación medio ± error estándar de la media.

: Linfocitos sanguíneos Linfocitos del bazo

: Bacterias inactivadas MOMP recombinante de C. psittaci Bacterias inactivadas MOMP recombinante de C. psittaci

Grupo 1: 1,48 ± 0,24 1,72 ± 0,27 1,02 ± 0,10 1,54 ± 0,46

Grupo 2: 3,92 ± 1,66 1,58 ± 0,38 1,76 ± 0,09 1,17 ± 0,70

Grupo 3: 4,2 ± 2,19 2,09 ± 0,97 1,67 ± 0,98 1,34 ± 0,13

Grupo 4: 7,9 ± 0,0 8,37 ± 2,74 NE 3,85 ± 0,56

Grupo 5: 1,22 ± 0,19 1,76 ± 0,25 1,32 ± 0,41 0,92 ± 0,25

Grupo 6: 5,03 ± 1,41 3,13 ± 0,74 17,6 ± 6,41 17,9 ± 6,89

Para los grupos primovacunados 1 a 4, la protección se correlacionó con un índice de estimulación significativamente mayor para la reestimulación in vitro de los linfocitos sanguíneos con organismos intactos de C. psittaci inactivados así como también con MOMP recombinante de C. psittaci. Para los grupos primovacunados 1 a

4, la protección se correlacionó con un índice de estimulación significativamente mayor para la reestimulación in vitro de los linfocitos del bazo con MOMP recombinante de C. psittaci. Desafortunadamente, los autores no pudieron analizar bacterias inactivadas con el grupo 4.

Para los grupos 5 y 6, la protección se correlacionó con un índice de estimulación significativamente mayor para la reestimulación in vitro de los linfocitos sanguíneos y del bazo con organismos intactos de C. psittaci inactivados así como también con MOMP recombinante de C. psittaci.

La protección se correlacionó con relaciones CD4/CD8 mayores para los linfocitos de la sangre periférica en cualquier momento después de la infección.

Conclusión del ensayo de vacunación 1

Los grupos 4 y 6 que recibieron una combinación de epítopos de linfocitos B y T estuvieron significativamente mejor protegidos contra las señales clínicas, patología macroscópica y excreción bacteriana. Respecto a las señales clínicas, el grupo 6 estuvo mejor protegido que el grupo 4. La protección se correlacionó con respuestas de linfocitos B superiores tras la inmunización (títulos de anticuerpos mucosos superiores después de la primovacunación y títulos de anticuerpos séricos superiores tras la vacunación de refuerzo), con respuestas proliferativas elevadas de linfocitos T en el momento del sacrificio y con una relación CD4/CD8 superior para los linfocitos de la sangre periférica en cualquier momento después de la infección.

5. Ensayo de vacunación 2: vacunación de pollos SPF

A partir de los péptidos descritos en la presente, se realizó una segunda selección de epítopos de linfocitos B, linfocitos T Th1 CD4+, Th2 CD4+ y CD8 para diseñar una vacuna con poliepítopos.

Tabla 8. Péptidos utilizados en el segundo experimento de vacunación

ID del péptido: SEQ ID NO posición Secuencia Epítopos

X: 20 53-67 TWCDAISIRAGYYGD Th1 CD4 + CD8

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ID del péptido: SEQ ID NO posición Secuencia Epítopos

Y: 62 221-235 EMLNVTSSPAQFVIH Th2 CD4

Z: 96 163-170 KGTDFNNQ Linfocito B

Se realizaron los experimentos en cámaras aislantes de presión negativa (IM 1500, Montair Sevenum, los Países Bajos). El diseño experimental fue evaluado y aprobado por el Comité Ético de Experimentos en Animales de la Universidad de Ghent. Para evaluar la vacuna, se dividieron 18 pollos exentos de patógenos específicos (SPF) (Lohman, Cuxhaven, Alemania) en tres grupos de 6 animales. El programa de vacunación se presenta en la Tabla 9. El grupo 1 recibió 500 |jg de cada péptido X, Y y Z por animal. En el grupo 2, 3 pollos recibieron 500 |jg del péptido X (subgrupo 2a), mientras que los otros 3 pollos recibieron 500 jg del péptido Y y 500 jg del péptido Z (subgrupo 2b). La vacuna se administró como un aerosol utilizando el nebulizador Cirrus™ (tamaño de partícula del aerosol de 2-5 jm; Laméris, Aartselaar, Bélgica). Los animales de control del grupo 3 no recibieron vacuna. La vacunación se realizó a la edad de 6 semanas. A la edad de 8 semanas, todos los animales fueron infectados aerógenamente utilizando un nebulizador Cirrus™ (tamaño de partícula del aerosol de 2-5 jm; Laméris, Aartselaar, Bélgica). La dosis de infección experimental en cada cámara aislante fue de 106 TCID50. Los animales se sacrificaron 10 días después de la infección (ddi).

Tabla 9. Programa de vacunación.

Grupo: n Vacunación (semana 6) Epítopo Dosis

1: 6 Péptidos X, Y y Z B + Th2 CD4 500 jg/péptido/animal



: CD8 + Th1 CD4

2a: 3 Péptido X CD8 + Th1 CD4 500 jg/animal

2b: 3 Péptidos Y + Z B + Th2 CD4 500 jg/péptido/animal

3: 6 Control no vacunado / /

5.1. Monitorización y muestreo

Las señales clínicas se monitorizaron a diario hasta la necropsia 10 ddi.

Se recogieron muestras sanguíneas para la detección de títulos de anticuerpos séricos específicos para MOMP antes de cada vacunación, en el día de la exposición al antígeno y en el momento del sacrificio a 10 ddi. Las muestras de sangre se almacenaron durante toda la noche a temperatura ambiente, se centrifugaron (325 * g, 10 min, 4 °C) y después se recogió el suero y se almacenó a -20 °C.

En el momento de la eutanasia, 10 días d.i., se examinaron todos los pavos para identificar lesiones macroscópicas. Se examinaron los frotis por impresión (citología) de los pulmones y bazo para determinar la presencia del antígeno de Chlamydia.

Todos los animales del grupo de control 3 mostraron conjuntivitis, rinitis y una disnea moderada. Los síntomas más graves se produjeron entre 8 y 10 ddi. No se observaron señales clínicas en los grupos vacunados 1 o 2.

Los animales de control mostraron una congestión grave de la conjuntiva, en ocasiones únicamente unilateral, congestión grave de las conchas, congestión moderada de la tráquea, congestión bilateral de los pulmones con desarrollo de unos pocos focos rodeados por una zona hiperémica (neumonía), opacidad de los sacos aéreos y unos pocos coágulos de fibrina en el saco aéreo abdominal, principalmente unilateral y hepatosplenomegalia. El grupo 1, inmunizado con los péptidos X, Y y Z, no mostró lesiones macroscópicas. El grupo 2a, inmunizado con el péptido X, mostró una congestión de ligera (2 de 3 pollos) a moderada (1 de 3 pollos) en los pulmones, congestión ligera en la serosa del intestino delgado (especialmente el duodeno) y en uno de 3 pollos se observó pericarditis serosa. Los animales del grupo 2b, inmunizados con péptidos Y y Z únicamente mostraron una congestión de ligera (1 de 3 pollos) a notable (2 de 3 pollos) en los pulmones. No se observaron otras lesiones.

5.2. Replicación de Chlamydia en los pulmones y bazo

Se examinaron los frotis por impresión (citología) de los pulmones y bazo para detectar replicación de C. psittaci mediante la tinción de inmunofluorescencia IMAGEN™ (IMAGEN™ CHLAMYDIA, Oxoid, Drongen, Bélgica), tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1992). Se enumeraron las células positivas para C. psittaci en cinco campos microscópicos seleccionados al azar (400x, Nikon Eclipse TE2000-E, Japón) y calificados entre 0 y 5: 5 calificación 0 indicó que no había C. psittaci presente; se adjudicó la calificación 1 cuando estuvieron presentes una media de 1-5 cuerpos elementales (forma morfológica no metabólica, infecciosa); se adjudicaron las calificaciones 2, 3, 4 y 5 cuando estuvieron presentes una media de 1-5, 6-10, 10-20 y > 20 células positivas para inclusiones (organismos en replicación activa).

Los resultados para la replicación de C. psittaci en los pulmones y el bazo, 10 ddi, se muestran en la Tabla 10.

10 Tabla 10. Calificaciones para la replicación de Chlamydia en los pulmones y el bazo 10 ddi.

Grupo: Número de pollos Pulmones Bazo Prom calificación/ave

1
1: 2 1

: 2 0 0

: 3 1 1

: 4 1 0

: 5 0 0

: 6 1 1 8

2a: 1 2 2

: 2 2 2

: 3 1 1

2b: 1 2 2

: 2 1 1

: 3 1 1 18

3: 1 3 3

: 2 3 2

: 3 3 3

: 4 2 3

: 5 2 3

: 6 3 2 32

5.3. Respuestas de anticuerpos

Se realizaron ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) en muestras de suero que se pretrataron primero con caolín para eliminar la actividad de fondo (Novak et al., 1993). Se determinaron los títulos de anticuerpos 15 utilizando protocolos estándar con rMOMP como antígeno que recubría las placas (Verminnen et al., 2006). Se produjo MOMP recombinante en células COS-7, transfectadas de manera transitoria con pcDNA1::MOMP, tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1998). Se utilizaron diluciones (1/1000) de anticuerpo anti-IgG de pollo/pavo, anti-IgM de pollo/pavo y anti-IgA de pollo/pavo (Betyl Lab Inc, Montgomery, EE. UU.) Los títulos de inmunoglobulinas anti-MOMP se presentaron como el recíproco de la dilución sérica más elevada que proporcionó

una densidad óptica (DO405) superior al valor de corte (DO media de pavos SPF seronegativos ± dos veces la D.E. (desviación estándar)). Asimismo, se utilizó suero de control positivo y negativo, obtenido de experimentos de vacunación previos. La dilución de partida fue 1/32.

Los títulos de anticuerpos séricos IgA, IgM, IgG específicos para MOMP se determinaron mediante ELISA con 5 MOMP recombinante (Verminnen et al., 2006) (Tabla 11). Todos los pollos SPF resultaron ser seronegativos en las pruebas a la edad de 6 semanas, al comienzo del experimento.

Tabla 11. Títulos de IgM, IgG e IgA séricas

Grupo: Número de pollos Exposición al antígeno Sacrificio


: IgA IgM IgG IgA IgM IgG

1
1: 32 32 64 64 128 256

: 2 0 32 64 32 64 256

: 3 0 32 0 32 32 128

: 4 32 32 64 64 64 256

: 5 0 0 0 32 32 64

: 6 0 32 0 32 64 128

2a: 1 0 32 32 32 128 256

: 2 0 0 0 32 64 32

: 3 0 0 0 0 64 32

2b: 1 32 64 32 64 64 128

: 2 32 32 0 64 128 256

: 3 0 32 0 32 128 64

3: 1 0 0 0 32 128 128

: 2 0 0 0 0 128 64

: 3 0 0 0 32 256 64

: 4 0 0 0 0 128 64

: 5 0 0 0 0 128 128

: 6 0 0 0 32 256 128

Conclusión del ensayo de vacunación 2

10 Los pollos inmunizados con una combinación de epítopos de linfocitos B + Th2 CD4 de MOMP junto con una combinación de epítopos de CD8 + Th1 CD4 de MOMP (grupo 1) estuvieron mejor protegidos que los controles no inmunizados (grupo 3). El grupo 1 también estuvo mejor protegido que los pollos inmunizados con una combinación de únicamente epítopos de linfocitos B + Th2 CD4 (grupo 2b) o una combinación de únicamente epítopos de CD8 + Th1 CD4 (grupo 2a).

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Ejemplo 2: Experimento de vacunación con MOMP recombinante de C. psittaci Materiales y métodos

Cepa de Chlamydia psittaci

Se utilizó la cepa 92/1293 de C. psittaci, aislada a partir de un brote grave de enfermedad respiratoria en una granja de pavos de engorde comerciales en los Países Bajos (Vanrompay et al., 1993). La cepa se aisló a partir de un homogeneizado combinado de los pulmones, cloacas y vasos de los pavos enfermos y se caracterizó como serovar D y genotipo D (Geens et al., 2005). Las bacterias se cultivaron en células de mono verde Buffalo (BGM, por sus siglas en inglés) tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1992) y la titulación se realizó según el método de Spearman y Kaerber (Mayr et al., 1974).

Vacuna con MOMP recombinante

Se produjo MOMP recombinante en células COS-7, transfectadas con el plásmido pcDNA1::MOMP, tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1998). El plásmido contuvo el gen ompA de longitud completa de la cepa 92/1293 de C. psittaci. Después de recolectar la MOMP recombinante (rMOMP), se determinó la concentración proteica utilizando el ensayo proteico con ácido bicinconínico (Sigma).

Ensayo clínico

Se realizaron los experimentos en cámaras aislantes de presión negativa (IM 1500, Montair Sevenum, los Países Bajos). El diseño experimental fue evaluado y aprobado por el Comité Ético de Experimentos en Animales de la Universidad de Ghent. Para evaluar la vacuna con rMOMP de C. psittaci, se dividieron 10 pavos exentos de patógenos específicos (SPF) (CNEVA, Ploufragan, Francia) en dos grupos. El programa de vacunación se presenta en la Tabla 12. El grupo vacunado recibió 500 |jg de rMOMP por animal. La vacuna se administró como un aerosol utilizando el nebulizador Cirrus™ (tamaño de partícula del aerosol de 2-5 jm; Laméris, Aartselaar, Bélgica). Los animales de control no recibieron vacuna. La vacunación se realizó en el día 1 y a la edad de 3 semanas. A la edad de 5 semanas, todos los animales fueron infectados aerógenamente utilizando un nebulizador Cirrus™ (tamaño de partícula del aerosol de 2-5 jm; Laméris, Aartselaar, Bélgica). La dosis de infección experimental en cada cámara aislante fue de 106 TCID50.

Tabla 12. Programa de vacunación

Grupo: n Primovacunación (día 1) y vacunación de refuerzo (semana 3) Dosis

1: 5 aerosol de rMOMP 500 jg/animal

2: 5 Control no vacunado /

Monitorización y muestreo

Se calificaron las señales clínicas a diario hasta la necropsia. La calificación clínica 0 indicó ausencia de señales clínicas; calificación 1: conjuntivitis; calificación 2: rinitis; calificación 3: disnea; calificación 4: conjuntivitis y rinitis; calificación 5: conjuntivitis y disnea; calificación 6: rinitis y disnea; calificación 7: conjuntivitis, rinitis y disnea.

Se monitorizó la excreción faríngea y cloacal de C. Psittaci en el día 1 y en días alternos comenzando 5 días después de la infección (d.i.) hasta la necropsia 21 días d.i., utilizando hisopos con una varilla de aluminio y punta de rayón (Colpan; Fiers, Kuurne, Bélgica) provistos con medio de transporte para C. psittaci (74,6 g/L de sacarosa (Acros Organics, Geel, Bélgica); 5,1 g/L de KH2PO4 y 1,2 g/L de K2HPO4 (Sigma); 0,9 g/L de la sal monopotásica del ácido L-glutámico (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica) y 10% v/v de suero bovino fetal (Greiner, Wemmel, Bélgica); 50 jg/mL de gentamicina (Invitrogen); 100 jg/mL de vancomicina y 100 jg/mL de estreptomicina (Soenen, Merelbeke, Bélgica); 25 000 U/mL de nistatina (Sigma) pH 7). Los hisopos se almacenaron a -80 °C hasta que se procesaron.

Se recogieron muestras sanguíneas para la detección de títulos de anticuerpos séricos específicos para MOMP antes de cada vacunación, 7 días después de la vacunación de refuerzo, justo antes de la infección experimental y 14 y 21 días d.i. Las muestras de sangre se almacenaron durante toda la noche a temperatura ambiente, se centrifugaron (325 * g, 10 min, 4 °C) y después se recogió el suero y se almacenó a -20 °C.

En el momento del sacrificio, 21 días d.i., se examinaron y caracterizaron las respuestas proliferativas en linfocitos de la sangre periférica. Se examinaron todos los pavos para identificar lesiones macroscópicas. El sistema de calificación se presenta en la Tabla 13. Se examinaron cortes tisulares con criostato de los pulmones, los sacos aéreos torácicos y abdominales, el pericardio, hígado y bazo para determinar la presencia del antígeno de Chlamydia.

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15

20

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Tabla 13. Calificaciones para las lesiones macroscópicas debidas a C. psittaci en pavos

Tejido: Calificación 1 Calificación 2 Calificación 3

Pulmones: Ligeramente Gravemente Focos grises

: congestionados congestionados

Sacos aéreos torácicos Opacidad difusa: Depósitos de fibrina focales Aerosaculitis fibrinosa grave

Bazo: Ligeramente dilatado Moderadamente dilatado Gravemente dilatado

Hígado: Ligeramente dilatado Moderadamente dilatado Gravemente dilatado

Replicación de Chlamydia en tejidos y excreción bacteriana

Se examinaron los cortes tisulares con criostato (5 |jm) de las conchas, la conjuntiva, la tráquea, los pulmones, los sacos aéreos torácicos y abdominales, el pericardio, hígado y bazo para detectar replicación de C. psittaci mediante la tinción de inmunofluorescencia IMAGEN™ (IMAGEN™ CHLAMYDIA, Oxoid, Drongen, Bélgica) tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1994). Se enumeraron las células positivas para C. psittaci en 5 campos microscópicos seleccionados al azar (400x, Nikon Eclipse TE2000-E, Japón) y calificados entre 0 y 5: la calificación 0 indicó ausencia de C. psittaci; se adjudicó la calificación 1 cuando estuvieron presentes una media de 1-5 cuerpos elementales (forma morfológica no metabólica, infecciosa); se adjudicaron calificaciones de 2, 3, 4 y 5 cuando estuvieron presentes una media de 1-5, 6-10, 10-20 y > 20 células positivas para inclusiones (organismos en replicación activa).

Se examinaron todos los hisopos para detectar excreción de C. psittaci por parte del cultivo bacteriano en células de mono verde Buffalo (BGM) (Vanrompay et al., 1992) y para la identificación posterior de Chlamydia utilizando el ensayo de inmunoflouorescencia directa IMAGEN™ (Vanrompay et al., 1992). Se calificó la presencia de C. psittaci como para la replicación bacteriana en diferentes tejidos.

Respuestas de anticuerpos

Se realizaron ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) en muestras de suero que se pretrataron primero con caolín para eliminar la actividad de fondo (Novak et al., 1993). Se determinaron los títulos de anticuerpos utilizando protocolos estándar con rMOMP como antígeno que recubría las placas (Verminnen et al., 2006). Se produjo MOMP recombinante en células COS-7, transfectadas de manera transitoria con pcDNA1::MOMP, tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1998). Se utilizaron diluciones de 1/2000 y 1/4000, respectivamente, de anticuerpo anti-IgG (H + L) de pollo/pavo biotinilado y estreptavidina conjugada con peroxidasa. Los títulos de inmunoglobulinas anti-MOMP se presentaron como el recíproco de la dilución sérica más elevada que proporcionó una densidad óptica (DO405) superior al valor de corte (DO media de pavos SPF seronegativos ± dos veces la D.E.). Asimismo, se utilizó suero de control positivo y negativo, obtenido de experimentos de vacunación previos. La dilución de partida fue 1/32.

Los isotipos específicos para MOMP en hisopados faríngeos se determinaron utilizando anticuerpos policlonales conjugados con peroxidasa específicos anti-IgG, -IgM e -IgA de pollo con reactividad cruzada (Bethyl Laboratories, Inc.). Asimismo, se utilizó suero de control positivo y negativo, obtenido de experimentos de vacunación previos. La dilución de partida para los hisopados mucosos fue de 1/32.

Respuestas proliferativas de linfocitos y caracterización de linfocitos T

Se aislaron leucocitos de sangre periférica (PBL) a partir de muestras de sangre con heparina obtenidas mediante venopuntura (V. Ulnaris)) de cada pavo, 21 días d.i. Las pruebas proliferativas de linfocitos se realizaron tal como se ha descrito previamente (Vanrompay et al., 1999). Resumiendo, se cultivaron células no adherentes por duplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos con 1x106 células en 150 jL de DMEM (Invitrogen) complementado con un 20% de suero bovino fetal inactivado térmicamente (Greiner), 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de piruvato de sodio, 1% de L-glutamina, 1% de gentamicina y 0,1% de p-mercaptoetanol (todo de Invitrogen). Para la proliferación por antígenos, se añadieron 10 jg de MOMP recombinante a los pocillos individuales. Los controles negativos y positivos incluyeron células estimuladas con simple medio o con 10 jg de concanavalina A (Con A),

respectivamente. Las células se incubaron a 39,5 °C en un incubador humidificado con un 5% de CO2. La proliferación inducida por Con A o antígenos se midió por la incorporación de 3H-timidina (1 pCi/pocillo) durante al menos 16 h de cultivo, en los días 2 (Con A) y 5, respectivamente. Los cultivos se recolectaron en bandas de filtro de fibra de vidrio con un recolectador de células (Skatron, Liers, Noruega). Los filtros se contaron en un contador de 5 centelleo p de Beckman (Beckman, Gent, Bélgica). El índice de estimulación se definió como la relación entre las cuentas por minuto (cpm) de los cultivos estimulados y las de los cultivos solo con medio.

Las células proliferantes también se caracterizaron mediante citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal anti- CD4 de pollo con reactividad cruzada y un anticuerpo monoclonal anti-CD8 de pavo.

Análisis estadístico

10 Se utilizará la prueba de Mann-Whitney para análisis estadísticos. Se considerará que los resultados son significativamente diferentes en el nivel de p < 0,05.

Resultados

Señales clínicas

Las señales clínicas en el grupo vacunado con rMOMP y el grupo de control se presentan en la Tabla 14.

15 Tabla 14. Señales clínicas en diferentes días después de la infección (d.i.)

Días d.i.: vacuna con rMOMP (n = 5) Controles (n = 5)

4: Conjuntivitis (2)* Letargia, anorexia, conjuntivitis (5)

7: Conjuntivitis (2), rinitis (2) Conjuntivitis (5), rinitis (5)

9: Conjuntivitis (2), rinitis (2), deposiciones acuosas (3) Conjuntivitis (5) + rinitis (5) + disnea moderada (3)

11: Conjuntivitis (2), rinitis (3), deposiciones acuosas (3) Conjuntivitis (5) + rinitis (5) + disnea grave (5), deposiciones acuosas (3)

13: Conjuntivitis (2), disnea moderada (1) Conjuntivitis (5) + rinitis (5) + disnea moderada (3), disnea grave (2), deposiciones acuosas (5)

15: Conjuntivitis (2), disnea moderada (2) Conjuntivitis (5) + rinitis (5) + disnea moderada (5), deposiciones acuosas(4)

17: Disnea moderada (2) Conjuntivitis (5), rinitis (3), disnea moderada (2), deposiciones acuosas (5)

19: / Conjuntivitis (5), rinitis (3), disnea moderada (3), deposiciones acuosas(4)

21: / Conjuntivitis (5), rinitis (3), deposiciones acuosas (2), disnea moderada (3)

*El número de animales con síntomas clínicos

Hallazgos macroscópicos

Se evaluaron las lesiones macroscópicas en todos los animales en la necropsia (Tabla 15). De manera global, los animales de control mostraron una congestión grave en los pulmones con sitios inflamatorios y los sacos aéreos 20 mostraron una opacidad difusa con depósitos grandes de fibrina. Se pudo observar congestión en las conchas y conjuntiva en estos animales y algunos de ellos también mostraron congestión en la tráquea. Además, se observó una pericarditis serosa en los animales de control y también se pudo visualizar congestión en el hígado y el bazo.

Los animales vacunados mostraron los síntomas más graves en los sacos aéreos abdominales.

Replicación y excreción de Chlamydia

Los resultados para la replicación de C. psittaci en los diferentes tejidos, 21 días d.i., se muestran en la Tabla 16. Los resultados de los hisopados faríngeos y cloacales que se analizaron para detectar excreción de C. psittaci se muestran en la Tabla 17. Todos los hisopados que se obtuvieron con los pavos de un día de edad fueron negativos.

Respuestas de anticuerpos

5 Se determinaron los títulos de anticuerpos séricos IgG (H + L) para MOMP utilizando el ELISA con MOMP recombinante de los autores (Verminnen et al., 2006). El log-iü de los valores medios de los títulos de anticuerpos en función de la edad de los pavos se presenta en la Tabla 18.

Los hisopados mucosos (faríngeos) que se tomaron el día de la vacunación de refuerzo, el día de la exposición a la infección y en el momento del sacrificio se estudiaron para detectar la presencia de anticuerpos IgG, IgM e IgA. Los 10 resultados se presentan en la Tabla 19.

Tabla 15. Calificaciones medias por grupo ± D.E. (% de pavos positivos) para lesiones macroscópicas debidas a C. psittaci el día 21 d.i.

Grupo: Conchas Conjuntiva Tráquea Pulmones Sacos aéreos abdominales

rMOMP: 1±0 (100) 0 ± 0 (0) 0 ± 0 (0) O ' O 1+ o 00 co 0,60 ± 0,55 (60)

Controles: 1,90 ± 0,55 (80) 0,50 ± 0,71 (60) 0,14 ± 0,38 (20) 00 - O (O ' o 1+ o en en 2,20 ± 1,10 (100)

Grupo: Sacos aéreos torácicos Pericardio Hígado Bazo Calificación total

rMOMP: 0,20 ± 0,45 (20) 1 ± 0 (50) 0 ± 0 (0) 0,20 ± 0,45 (20) 3,4

Controles: 1,90 ± 0,55 (100) 1,80 ± 0,84 (100) 0,60 ± 0,55 (80) 00 - O (O ' o 1+ o en en 12,84

Tabla 16. Calificación media por grupo ± D.E. (% de pavos positivos) para la presencia de C. psittaci.

Grupo: Conchas Conjuntiva Tráquea Pulmones Sacos aéreos abdominales

rMOMP: 0,60 ± 0,55 (100) 1,80 ± 0,84 (20) 1,0 ± 0 (20) o en ' o i+ o en en 1,90 ± 0 (100)

Controles: 2,20 ± 1,10 (100) 2,20 ± 1,10 (100) 2,20 ± 1,10 (100) 2,20 ± 0 (100) 3,00 ± 1,22 (100)

Grupo: Sacos aéreos torácicos Pericardio Hígado Bazo Calificación total

rMOMP: 1,0 ± 0 1,00 ± 0 0,20 ± 0,45 1,00 ± 0,71 9,1

: (80) (60) (20) (80)

Controles: 2,20 ± 0 (100) 2,20 ± 0 (100) 1,0 ± 0 (80) 1,0 ± 0 (80) 18,2

Tabla 17. Calificación media por grupo ± D.E. (% de pavos positivos) para la diseminación faríngea y cloacal

15 de C. psittaci.

Excreción faríngea Excreción cloacal

Días PI: rMOMP Control rMOMP Control

5: 0,75 ± 0,50 (80) 1,60 ± 0,0 (100) 0,00 ± 0,00 (100) 0,75 ± 0,50 (20)

7: 1,60 ± 0,89 (80) 1,80 ± 0,84 (100) 1,80 ± 0,80 (100) 1,60 ± 0,89 (40)

9: 2,0 ± 1,00 (100) 2,20 ± 1,10 (80) 2,6 ± 0,9 (100) 3,0 ± 0 (80)

11: 2,20 ± 1,10 (100) 3,00 ± 1,22 (100) 2,6 ± 0,9 (100) 2,20 ± 1,10 (100)

13: 0,80 ± 1,3 (100) 3,00 ± 1,22 (100) 1,2 ± 1,1 (100) 3,00 ± 0,00 (100)

15: 1,4 ± 0,90 (80) 3,00 ± 0,00 (100) 1,2 ± 1,1 (80) 3,00 ± 0,00 (100)

17: 1,4 ± 0,90 (80) 2,20 ± 1,10 (100) 2,2 ± 1,10 (80) 3,00 ± 0,00 (100)

19: 1,00 ± 0,71 (80) 1,80 ± 0,84 (80) 1,4 ± 0,9 (60) 3,00 ± 1,22 (80)

21: 1,20 ± 1,10 (60) 2,20 ± 1,10 (100) 0,80 ± 1,3 (60) 2,20 ± 1,10 (100)

Tabla 18. Logio de títulos medios de anticuerpos séricos

Grupo: Presuero re a: > Una semana DVRb Exposición al antígeno 2 semanas DExpc Sacrificio

rMOMP: 0 1,34 2,61 2,60 2,10 2,03

Controles: 0 0 0 0 1,86 2,08

a VR, vacunación de refuerzo b DVR, después de la vacunación de refuerzo c DExp, después de la exposición al antígeno

5 Tabla 19. Valor de DO medio por grupo de IgA, IgM e IgG en hisopados faríngeos

Grupo: VRa Exposición al antígeno Sacrificio

rMOMP

IgA: 0 0 0,100

IgM: 0,124 0,111 0,152

IgG: 0,110 0,107 0,122

Controles

IgA: 0 0 0,166

IgM: 0 0 0,197

IgG: 0 0 0,185

a VR, vacunación de refuerzo

Proliferación de linfocitos específica del antígeno y caracterización de linfocitos T

Se determinó la respuesta proliferativa de los linfocitos de la sangre periférica después de la estimulación con MOMP recombinante de todos los animales vacunados y de control el día 21 d.i. (Tabla 20).

10 Los linfocitos del grupo vacunado con rMOMP mostraron una respuesta proliferativa significativamente superior en comparación con el grupo de control.

Tabla 20. Respuesta proliferativa de los linfocitos de la sangre periférica el día 21 d.i.

5

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20

25

30

35

40

Grupo: Índice de estimulación (I.E.) medio ± D.E.

rMOMP: 4, ± 0,00

Control: 1,30 ± 0,21

Las células proliferantes también se caracterizaron mediante citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal anti- CD4 de pollo con reactividad cruzada y un anticuerpo monoclonal anti-CD8 de pavo. Los resultados se muestran en la Tabla 21.

Tabla 21. Caracterización de CD4/CD8 de linfocitos en el día 21 d.i.

Grupo: Calificación CD4/CD8 media ± D.E.

rMOMP: 1,15 ± 0,31

Control: 0,74 ± 0,29

CONCLUSION

La vacunación con la MOMP recombinante completa fue significativamente menos protectora que el uso de una combinación de epítopos de linfocitos B y T de la MOMP (grupos 4 y 6 del ensayo de vacunación 1 y grupo 1 del ensayo de vacunación 2 (vac.2) de los experimentos en el ejemplo 1) ya que:

1) Las señales clínicas en animales vacunados con rMOMP fueron significativamente más graves que en los animales de los grupos 4, 6 y 1 (vac.2). Los animales vacunados con rMOMP mostraron conjuntivitis, rinitis, deposiciones acuosas y disnea moderada durante el experimento. Los animales del grupo 4 mostraron únicamente conjuntivitis y rinitis mientras que los animales del grupo 6 y 1 (vac.2) permanecieron sanos. Los animales vacunados con rMOMP recuperaron la salud 19 días d.i., mientras que las señales clínicas en el grupo 4 ya habían desaparecido 8 días d.i.

2) Se observaron lesiones macroscópicas en un 60% de los animales inmunizados con rMOMP y en 6 de 9 (67%) tejidos examinados. Las lesiones más graves fueron las de los sacos aéreos abdominales. Para el grupo 4, la patología macroscópica estuvo presente únicamente en 2 de 7 (28%) animales y en 1 de 10 (10%) tejidos examinados, concretamente el pulmón. Para el grupo 6, la patología macroscópica estuvo presente únicamente en 1 de 8 (12,5%) animales, similar a la del grupo 4 con 1 de 10 (10%) tejidos examinados, concretamente el pulmón. El grupo 1 (vac.2) no mostró lesiones macroscópicas.

3) Excreción bacteriana. La excreción faríngea y cloacal en animales vacunados con rMOMP fue superior a la de los grupos 4 y 6.

4) Replicación de C. psittaci en los órganos internos. (remítase a la Tabla 22)

Los animales que recibieron rMOMP dos veces estuvieron menos protegidos que los que recibieron las combinaciones de péptidos una vez (grupo 4) o dos veces (grupo 6). El número máximo de animales con un tejido positivo para C. psittaci fue de, respectivamente, un 50%, 57% y 100% para los grupos 6, 4 y el grupo vacunado con rMOMP. La calificación máxima para la replicación de C. psittaci en los tejidos fue de, respectivamente, 0,38, 0,57 y 1,90 para los grupos 6, 4 y el grupo vacunado con rMOMP. Para vac 2, el grupo 1 fue el que estuvo mejor protegido tal como lo demuestra la tinción de inmunofluorescencia en frotis por impresión de los pulmones y el bazo.

El nivel de protección más elevada (conseguida en el grupo 6) se correlacionó con un título de IgA mucoso significativamente más elevado en el día de la exposición al antígeno y una respuesta proliferativa de linfocitos más elevada de especialmente linfocitos del bazo 21 días después de la infección.

La vacunación con rMOMP no proporcionó una diferencia significativa para la relación CD4/CD8 en la sangre periférica en comparación con los controles, mientras que la combinación de péptidos (grupo 4 y 6) proporcionó una relación CD4/CD8 significativamente más elevada que los controles en cualquier momento después de la infección. Para el grupo 1 (vac. 2), la protección se correlacionó con un número más elevado de animales que mostraron anticuerpos séricos IgG el día de la exposición al antígeno.

Tabla 22. Calificaciones medias por grupo ± desviación estándar (% de animales positivos) para detectar la presencia de C. psittaci en varios órganos en el día 21 d.i.

Tejido Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 rMOMP

(dos

veces)

Conjuntiva: 1,07 ± 0,19 0,50 ± 0,29 o en o ± 0,41 0,29 ± O 4^ CD 0,86 ± 0,24 0,13 ± 0,35 o b) o i+ o en en

: (100) (86) (71) (29) (100) (13) (100)

Conchas: 1,00 ± 0,29 0,29 ± 0,39 0,86 ± 0,99 0,50 ± O en o 0,93 ± 0,19 0,06 ± 0,18 00 o i+ o 00 4^

: (100) (43) (86) (57) (100) (13) (20)

Senos: 0,79 ± O CD 0,57 ± 0,53 0,36 ± O CO 00 0,36 ± o 4^ 00 0,79 ± 0,27 0,25 ± 0,27 /

: (86) (57) (57) (43) (100) (50)

Tráquea: 1,14 ± O CO 00 0,43 ± 0,35 0,50 ± 0,29 0,29 ± o 4^ CD 1,14 ± 0,24 0,25 ± 0,38 1,00 ± 0

: (100) (71) (86) (29) (100) (38) (20)

Pulmones: 1,36 ± 0,38 0,57 ± 0,35 0,50 ± 0,41 0,43 ± 0,73 1,57 ± 0,79 0,38 ± 0,44 O b> o 1+ o en en

: (100) (86) (71) (43) (100) (50) (40)

Sacos: aéreos 0,93 ± 0,35 0,14 ± 0,24 0,21 ± 0,27 0,29 ± o 4^ CD 1,21 ± O b> 4^ 0,13 ± 0,23 1,00 ± 0

torácicos: (100) (29) (43) (29) (100) (25) (80)

Sacos: aéreos 1,14 ± o 00 0,64 ± 1,11 0,64 ± o CO 00 0,07 ± 0,19 1,21 ± 0,39 0,13 ± 0,35 1,90 ± 0

abdominales: (100) (43) (86) (14) (100) (13) (100)

Pericardio: 0,64 ± 0,24 0,36 ± o CO 00 0,43 ± 0,19 0,14 ± O CO 00 0,50 ± o en o O o o ± O o o 1,00 ± 0

: (100) (57) (86) (14) (57) (0) (60)

Bazo: 1,71 ± 0,95 0,14 ± 0,37 1,57 ± 1,17 0,57 ± 0,98 1,71 ± 0,76 0,38 ± o b> CD 1,00 ± 0,71

: (86) (14) (86) (29) (100) (38) (80)

Hígado: 0,29 ± o en -vi o o o ± 0,00 0,14 ± 0,24 0,21 ± 0,39 0,36 ± o 4^ 00 0,13 ± 0,35 O To o i+ o b» en

: (29) (0) (29) (29) (43) (13) (20)

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Claims

5

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25

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50

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende uno o más péptidos, comprendiendo cada uno de dichos péptidos uno o más epítopos seleccionados a partir de la lista constituida por un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL; donde dicha composición comprende al menos un epítopo de linfocitos B, un epítopo de linfocitos Th2 CD4+, un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y un epítopo de CTL; donde los epítopos están ubicados en la proteína principal de la membrana externa (MOMP) de Chlamydia psittaci; donde la composición no comprende la proteína MOMP de Chlamydia psittaci de longitud total, y donde el epítopo de linfocitos B está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por: GTASATT (SEQ ID NO 92), GTDFNN (SEQ ID NO 93) y NPTLLGKA (SEQ ID NO 94), o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad, y donde el epítopo de linfocitos Th2 CD4+, el epítopo de linfocitos Th1 CD4+ y el epítopo de CTL están constituidos independientemente por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO 20 y 101-117, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde

- el epítopo de linfocitos B está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada partir del grupo constituido por: GTASATT (SEQ ID NO 92), GTDFNN (SEQ ID NO 93) y NPTLLGKA (SEQ ID NO 94), o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad;

- el péptido que comprende un epítopo de linfocitos Th2 CD4+ se selecciona a partir del grupo constituido por: la SEQ ID NO 7, 8, 43, 76, 77, 85 y 91, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad;

- el péptido que comprende un epítopo de CTL (CD8+) se selecciona a partir del grupo constituido por: la SEQ ID NO 20, 26, 27, 42, 43, 61, 73, 75 y 80, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad; y

- el péptido que comprende un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ se selecciona a partir del grupo constituido por: la SEQ ID NO 1, 10-13, 18, 20, 25, 27, 29, 31-32, 35, 42, 46, 51, 53-56, 61, 64, 65-67, 69-73, 75, 79-81 y 87, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, donde el péptido que comprende un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos Th2 CD4+ se selecciona a partir del grupo constituido por: la SEQ ID No 7, 8, 76, 77, 91 y 94-98, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad, donde el péptido que comprende un epítopo de linfocitos CTL se selecciona a partir del grupo constituido por: la SEQ ID NO 73, 75, 80 y 99, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad, y donde el péptido que comprende un epítopo de linfocitos Th1 CD4+ se selecciona a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO 70, 71, 73, 75, 79, 80, 81 y 99, o una variante de estas que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad
4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende o está constituida por los siguientes péptidos: EPSLLIDGTMWEGASGDPCDPC (SEQ ID NO 97), TGTASATT (SEQ ID NO 95), KGTDFNNQ (SEQ ID NO 96), AQPKLATAVLDLTTWNPTLLGKATTVDGTNTYSDFL (SEQ ID NO 98), y AATDTKSATLKYHEWQVGLALSYRLNMLVPYIGVNWSRATFDADT (SEQ ID NO 99), o variantes de estos que tienen al menos aproximadamente un 80% de identidad; o que comprende o está constituida por los siguientes péptidos: TWCDAISIRAGYYGD (SEQ ID NO 20), EMLNVTSSPAQFVIH (SEQ ID NO 62), y KGTDFNNQ (SEQ ID NO 96), o variantes de estos que tienen al menos aproximadamente un 80% de identidad.
5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde parte de los péptidos o todos ellos están presentes como una mezcla o son parte de un constructo con poliepítopos.
6. Una composición que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido tal como se proporciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un sistema de suministro de antígenos.
8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además un adyuvante.
9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso como un medicamento.
10. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en la inducción de una respuesta inmunoprotectora en un sujeto contra una infección por Chlamydia psittaci.
11. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso como una vacuna contra una infección por Chlamydia psittaci.
12. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico tal como se proporciona en la reivindicación 6.
13. Una célula que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 12.
14. Un método in vitro para diagnosticar una infección por Chlamydia psittaci en un sujeto que comprende:

- poner en contacto una muestra de dicho sujeto con al menos un péptido constituido por un epítopo de linfocitos B tal como se proporciona en la reivindicación 1 o 2, y

5 - determinar la presencia de anticuerpos en dicha muestra que se unen a dicho(s) péptido(s).
15. Un kit diagnóstico que comprende uno o más péptidos constituidos por un epítopo de linfocitos B tal como se proporcionan en la reivindicación 1 o 2.