ES2293178T3 - Proteina recombinante que contiene epitopos del papilomavirus humano insertados en un proteina adenilato ciclasa o un fragmento de la misma y usos terapeuticos de la misma. - Google Patents

Abstract

Una proteína recombinante que comprende al menos un polipéptido que tiene uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de HPV, insertándose dicho al menos un polipéptido en el misrno o en diferentes sitios permisivos de una proteína adenilato ciclasa de Bordetella sp. (CyaA) o un fragmento de la misma, en la que dicho fragmento de CyaA conserva la propiedad de dicha proteína adenilato ciclasa para dirigirse a células presentadoras de antígeno, en la que un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de una proteína E6 o E7 de HPV.

Description

Proteína recombinante que contiene epítopos del papilomavirus humano insertados en una proteína adenilato ciclasa o un fragmento de la misma y usos terapéuticos de la misma.

La presente solicitud se refiere a una proteína recombinante que contiene epítopos de papilomavirus insertados en una proteína adenilato ciclasa o un fragmento de la misma.

Por consiguiente, la invención se refiere a proteínas recombinantes en las que la proteína adenilato ciclasa (CyaA) actúa como un vector proteico para producir una respuesta inmune contra epítopos obtenidos de antígenos de papilomavirus, especialmente antígenos de papilomavirus humano.

La invención se refiere especialmente al uso del vector proteico obtenido de este modo para suministrar epítopos a células eucariotas, preferentemente a células de mamífero y especialmente células de ser humano.

La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican la proteína recombinante de la invención, junto con vectores que contienen dichos polinucleótidos así como células huéspedes que contienen dichos polinucleótidos o vectores.

La invención también se refiere a aplicaciones de la proteína recombinante anterior o de polinucleótidos para el tratamiento o prevención de infección por papilomavirus humano en un huésped así como para el tratamiento o prevención de efectos malignos resultantes de la infección, por papilomavirus humanos en un huésped, particularmente en un huésped mamífero. En una realización particular, la invención proporciona medios útiles para el diseño de compuestos adecuados para inmunoterapia, especialmente inmunoterapia contra antígenos específicos de tumores de papilomavirus.

Entre los muchos tipos de papilomavirus humano (HPV), los denominados HPV de alto riesgo están vinculados con el desarrollo de malignidades epiteliales debido a la persistencia de la infección en el huésped (1). El carcinoma de cuello uterino, el segundo cáncer ginecológico más extendido en el mundo (1) se asocia (> 99%) con la detención principalmente de ADN de HPV16 y HPV18 (2). El potencial oncogénico de estos virus se atribuye a los productos expresados por genes tempranos, es decir genes E6 y E7 cuya expresión se detecta durante todo el ciclo de replicación del virus y es necesaria para la aparición y el mantenimiento de la transformación maligna. Sin embargo, la frecuencia de riesgo de infección anogenital con estos tipos de HPV oncogénico de alto riesgo (3) contrasta con la baja proporción de individuos que desarrollarán eventualmente malignidades asociadas con HPV, lo que sugiere un control de infecciones por HPV de alto riesgo mediante respuestas inmunes. Varias observaciones reforzaron esta afirmación, tales como la regresión espontánea de la mayoría de lesiones premalignas (1), la infiltración de verrugas genitales en regresión mediante células T CD4^{+} y macrófagos (1) así como el gran número de sujetos infectados descubierto en pacientes inmunosuprimidos o inmunodeficientes (1). Además, se detectaron respuestas de células T CD4^{+} y CD8^{+} contra epítopos de HPV16-E6 y/o E7 en la sangre de pacientes a los que se diagnosticó malignidades asociadas con HPV16 (4-8), así como en la sangre de individuos sanos (9, 10). Conjuntamente, estas consideraciones constituían una buena base para el desarrollo de inmunoterapia dirigida a las proteínas E6 y/o E7 de
HPV16.

Se han desarrollado muchas estrategias de vacunación para prevenir el crecimiento tumoral de líneas celulares tumorigénicas positivas para E6 y E7 de HPV16 en ratones C57BU6 generando respuestas inmunes al epítopo H-2D^{b} restringido a HPV16-E7_{49-57}. Estos enfoques de vacunación han incluido ADN del plásmido, vectores virales o bacterianos, partículas similares a virus quiméricas, péptidos sintéticos y proteínas recombinantes (11). Desafortunadamente, estos enfoques produjeron resultados escasamente satisfactorios en términos de regresión clínica (3). De hecho, sigue existiendo un interés para evaluar nuevas herramientas para dirigirse a epítopos de HPV al sistema inmune para la inducción de respuestas mediadas por células.

Existe por lo tanto la necesidad de nuevos vectores adecuados para desarrollar epítopos de antígenos de HPV para dirigirse a células, en condiciones que permitan la producción de una respuesta inmune humoral y/o mediada por células en un huésped contra dichos antígenos. Los inventores han descubierto que la proteína adenilato ciclasa puede ser de interés para diseñar dicho vector. Se han realizado diversas observaciones, usando proteína adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, que conducen a la conclusión de que esta proteína puede representar una base adecuada para el diseño de dicho vector eficaz.

La adenilato ciclasa (CyaA) de Bordetella pertussis tiene la capacidad de suministrar su dominio catalítico en el citosol de células eucariotas (12). Por lo tanto, los epítopos de células T CD4^{+} y CD8^{+} insertados en el sitio catalítico de CyaA se procesan y se presentan mediante moléculas MHC de clase II y I, respectivamente, en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC) (13). Además, se ha demostrado recientemente que CyaA se une específicamente a la integrina \alpha_{M}\beta_{2} (CD11b/CD18) (14, WO 02/22169) y de este modo dirige a estos epítopos de células T a la subpoblación de células dendríticas CD11b^{+} (15). La inmunización de ratones con una CyaA recombinante que tenía epítopos apropiados condujo a la inducción de fuertes respuestas CTL, protección completa contra una exposición al virus letal y una inmunidad antitumoral profiláctica y terapéutica eficaz (16, 17). La proteína adenilato ciclasa (CyaA) se ha caracterizado y se ha descrito para su preparación mediante tecnología de ADN recombinante especialmente en los documentos WO 93/21324 o WO 02/22169. En el documento WO 02/22169 se ha descrito que fragmentos de CyaA que abarcan los restos 373 a 1706 contienen la estructura requerida esencialmente para la interacción con el receptor CD11b/CD18.

Más específicamente, se ha descrito a continuación que las secuencias de aminoácidos que se prolongan desde el resto 1166 al resto de aminoácido 1281 comprenden un determinante de la interacción con el receptor CD11b/CD18 y más particularmente que la secuencia de aminoácidos que se prolonga desde el resto 1208 al resto 1243 es crítica para la interacción de la toxina con CD11b/CD18 (EP 03291486.3 y 45).

Los inventores han determinado y evaluado actualmente condiciones para la construcción de una proteína CyaA recombinante que tiene, es decir comprende, epítopos de antígenos de HPV, que puede suministrar dichos epítopos a células diana, especialmente a células presentadoras de antígeno (APC), de un huésped, incluyendo huéspedes que padecen infecciones por HPV y sus transformaciones malignas.

Por consiguiente, la invención se refiere especialmente a una proteína recombinante que comprende uno o varios polipéptidos que tienen uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de HPV, insertándose dichos polipéptidos en el mismo o en diferentes sitios permisivos de una proteína adenilato ciclasa (CyaA) o de un fragmento de la misma, en la que dicho fragmento de CyaA conserva la propiedad de dicha proteína adenilato ciclasa de dirigirse a las células diana de CyaA tales como APC, especialmente células CD11b/CD18, tales como células dendríticas. En una realización particular, este fragmento también conserva la propiedad de CyaA de permitir la translocación del epítopo insertado en su interior al cilosol de una célula diana. La translocación del epítopo al citosol de célula diana puede permitirse si el fragmento de CyaA conserva el dominio de la proteína que permite la translocación de su dominio catalítico.

La capacidad de la proteína recombinante de dirigirse a células CD11b/CD18 puede evaluarse específicamente de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento EP 03291486.3 y (45) o en el documento WO 02/22169. Además, la capacidad de la proteína recombinante para translocar el epítopo al citosol de la célula diana puede ensayarse aplicando el procedimiento descrito en el documento WO 02/22169.

En una realización particular, el fragmento de CyaA puede estar constituido por dos porciones diferentes de CyaA que no son contiguas en la naturaleza en CyaA. Como ejemplo, puede mencionarse el dominio catalítico de CyaA, es decir los 400 restos de aminoácidos de la parte N-terminal de CyaA y un fragmento que comprende los restos de aminoácidos 1208 a 1243 requeridos para dirigirse a células CD11b/CD18.

En la definición anterior, la expresión "polipéptido" describe una secuencia de aminoácidos, incluyendo secuencias de aminoácidos que experimentan modificaciones post-traduccionales, especialmente una secuencia de aminoácidos que tiene al menos seis restos de aminoácidos, e incluyen secuencias de aminoácidos que tienen especialmente de 5 a 500 restos o de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 restos, siempre que dicha secuencia de aminoácidos comprenda al menos un epítopo, es decir una secuencia de aminoácidos contra la cual puede obtenerse una respuesta inmune después de su suministro a una célula diana, ventajosamente en un huésped, especialmente en un huésped mamífero. Los polipéptidos de acuerdo con esta definición pueden restringirse por tanto a epítopos, incluso a un único epítopo o pueden comprender varios epítopos diferentes o iguales o también pueden abarcar antígenos de longitud completa a partir de un patógeno, es decir de papilomavirus humano. Los epítopos dentro de la presente invención abarcan secuencias de aminoácidos que están implicadas en la respuesta inmune humoral y/o en la respuesta inmune mediada por células, especialmente en la respuesta inmune de células T. Por consiguiente, los epítopos en los polipéptidos de las moléculas recombinantes de la invención incluyen aquellos procesados por APC (Células Presentadoras de Antígenos) en un huésped, especialmente aquellas reconocidas junto con moléculas MHC de clase I (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) tales como epítopos cuyas células diana son linfocitos T CD8^{+} o epítopos reconocidos junto con moléculas MHC de clase II tales como aquellos cuyas células diana son células de linfocitos T CD4^{+}.

De acuerdo con la presente invención, los antígenos de HPV a partir de los cuales pueden diseñarse los polipéptidos que tienen uno o varios epítopos, son preferentemente los obtenidos de proteínas implicadas especialmente en la aparición y/o mantenimiento de efectos malignos después de la infección por HPV y abarcan los llamados antígenos tumorales, es decir antígenos asociados con el desarrollo del tumor relacionado con la infección por HPV, que pueden provocar una respuesta inmune en un huésped y reaccionan específicamente con anticuerpos o con células T en un huésped.

Los polipéptidos que tienen epítopos de acuerdo con la invención pueden obtenerse de antígenos nativos o maduros de HPV incluyendo mediante el uso del antígeno completo o incluyendo seleccionando fragmentos, especialmente fragmentos antigénicos, especialmente epítopos de dichos antígenos, en lugar de la proteína completa o modificando dicho antígeno o sus partes antigénicas o epítopos seleccionados, especialmente para mejorar su capacidad para inducir o provocar una respuesta inmune en un huésped cuando se combinan con una proteína CyaA en la molécula recombinante. Por consiguiente, para ilustrar las diversas modificaciones posibles de dichos epítopos, estos polipéptidos abarcan epítopos que están flanqueados por secuencias de flanqueo de origen natural o no natural del antígeno del que se obtienen, y también abarcan epítopos o secuencias de aminoácidos que contienen epítopos que se han modificado químicamente para mejorar sus propiedades inmunes. Estas modificaciones pueden ser ventajosas para mejorar la eficacia de los polipéptidos obtenidos junto con la proteína CyaA.

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Algunas modificaciones particulares se describen como ejemplos en lo sucesivo, incluyendo modificaciones que abarcan cambios en la carga del polipéptido, especialmente mediante la inserción de restos de aminoácidos adicionales cargados positivamente.

Por consiguiente, el polipéptido de la invención también abarca polipéptidos semi-sintéticos o sintéticos.

De acuerdo con una realización particular, los polipéptidos obtenidos de antígenos de HPV contienen entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, por ejemplo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos.

De acuerdo con la invención, se usa adenilato ciclasa (CyaA) como una proteína de longitud completa o un fragmento de la misma, como se ha descrito anteriormente.

Ventajosamente, la proteína CyaA o un fragmento de la misma es una proteína o fragmento de la misma, que es el resultado de la co-expresión en una célula, especialmente en una célula recombinante, de genes cyaA y cyaC. Se ha demostrado de hecho que para tener propiedades invasivas para células diana, la CyaA tiene que experimentar modificaciones post-traduccionales que están posibilitadas por la expresión de genes cyaA y cyaC (WO 93/21324).

En una realización particular de la invención, los fragmentos de la proteína CyaA son fragmentos que tienen al menos 30 restos de aminoácidos y pueden tener hasta aproximadamente 1300, en particular hasta aproximadamente 500 restos de aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 restos de aminoácidos; dichos fragmentos comprenden, en una realización particular, los restos de aminoácidos 1166 a 1281 de CyaA o los restos de aminoácidos 1208 a 1243 de la proteína CyaA para interacción con las células diana CD11b/CD18. Por lo tanto, un fragmento particular abarca todo o parte de la parte C-terminal de la proteína nativa cuya parte es responsable de la unión de la proteína a la membrana de la célula diana y/o al receptor CD11b/CD18 y del suministro posterior de los epítopos contenidos en los polipéptidos al citosol celular (12). Un fragmento particular de proteína CyaA de acuerdo con la invención contiene los restos de aminoácidos 372 a 1706 de la proteína CyaA. Otro fragmento particular es uno que corresponde a la proteína CyaA en el que los restos de aminoácidos 225 a 234 se han eliminado, proporcionando de este modo un fragmento de CyaA que contiene los restos 1 a 224 y 235 a 1706.

En una realización particular de la invención, la proteína adenilato ciclasa es una proteína bacteriana. En una realización preferida, la proteína CyaA se obtiene a partir de una especie de Bordetella.

Entre las especies de Bordetella de interés, de acuerdo con la invención, una de ellas es Bordetella pertussis. Otras cepas de Bordetella de interés son las de Bordetella parapertussis o Bordetella bronchiseptica. Las secuencias de la proteína CyaA de B. parapertussis se han descrito especialmente con el número de acceso NC 002928.3 (como una secuencia de 1740 aminoácidos) y en el documento Parkhill J. y col (Nat. Gener. DOI, 10 (2003) y para B. bronchiseptica en Betsou F. y col (Gene 1995, 30 de agosto; 162(1): 165-6).

Bordetella pertussis es el agente causante de la tos ferina y secreta entre otras varias toxinas incluyendo la bien conocida toxina pertussis (PT) y la toxina de adenilato ciclasa (CyaA), que es un factor de virulencia crítico para la bacteria y es uno de los antígenos protectores contra la infección por B. pertussis.

La proteína adenilato ciclasa de Bordetella pertussis es una toxina que se ha descrito como una proteína bifuncional de 1706 restos, que comprende un dominio catalítico N-terminal de 400 restos de aminoácidos y una parte C-terminal de 1306 restos que es responsable de la unión de la toxina a la membrana de la célula diana y el posterior suministro del resto catalítico al citosol celular (12).

La proteína CyaA se sintetiza como una protoxina inactiva que se convierte en una toxina activa mediante palmitoilación traduccional de dos restos de lisina internos (lisina 860 y 983). Esta modificación post-traduccional requiere la expresión con el gen cyaA de un gen accesorio, es decir cyaC que se sitúa próximo a cyaA en el cromosoma de B. pertussis.

El cyaA de Bordetella pertussis se ha descrito como una secuencia de aminoácidos y una secuencia de nucleótidos por Glasser, P y col, 1988, Molecular Microbiology 2(1), 19-30. Por consiguiente, cuando se mencionan en la presente invención restos de aminoácidos o secuencias o nucleótidos o secuencias de nucleótidos de la proteína CyaA de B. pertussis, sus posiciones se dan con respecto a las secuencias descritas en dicha publicación de Glasser y col. 1988.

En la proteína recombinante de acuerdo con la invención, los polipéptidos que tienen uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de HPV, se insertan en uno o en varios sitios permisivos de la proteína CyaA.

Para la presente invención, un "sitio permisivo" es un sitio de la secuencia de la proteína CyaA donde puede insertarse un polipéptido sin afectar de forma sustancial a las propiedades funcionales de la proteína CyaA especialmente sin afectar de forma sustancial a la fijación de células como objetivo, particularmente la fijación de APC como objetivo por la CyaA, incluyendo sin afectar de forma sustancial a la unión específica al receptor CD11b/CD18 y ventajosamente sin afectar de forma sustancial a los dominios de la proteína implicados en el proceso de translocación de los epítopos en una célula diana.

Los sitios permisivos de la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis que permiten la translocación del dominio catalítico de CyaA y de hecho la translocación de epítopos insertados en dichos sitios permisivos incluyen, aunque sin limitación los restos 137-138 (Val-Ala), restos 224-225 (Arg-Ala), restos 228-229 (Glu-Ala), restos 235-236 (Arg-Glu), y restos 317-318 (Ser-Ala) ((44) Sebo y col., 1995). También se incluyen en realizaciones de la invención los siguientes sitios permisivos adicionales: restos 107-233 (Gly-His), restos 132-133 (Met-Ala), restos 232-233 (Gly-Leu), y 335-336 (Gly-Gln) y 336-337. (43).

Para otras especies de Bordetella pueden definirse sitios permisivos correspondientes mediante la comparación de secuencias y la determinación de restos correspondientes.

De acuerdo con otra realización, el polipéptido puede también o como alternativa insertarse en uno y/u otros extremos de la proteína CyaA o de su fragmento.

Los fragmentos particulares de proteínas CyaA para su uso para los fines de la invención son los que comprenden hasta 1300 aminoácidos o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 500 restos de aminoácidos, ventajosamente aproximadamente 50 y aproximadamente 150 restos de aminoácidos en particular dichos fragmentos que comprenden restos de aminoácidos 1166 a 1281 de la proteína CyaA nativa, ventajosamente de 1208 a 1243 de la proteína CyaA nativa.

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la "inserción" de un polipéptido en la proteína CyaA para proporcionar una proteína llamada recombinante también denominada "proteína híbrida", abarca la inserción genética especialmente mediante tecnología de ADN disponible. Como alternativa, la "inserción" también abarca la inserción no genética, incluyendo inserción química por ejemplo acoplamiento covalente realizado en un extremo de la CyaA o de un fragmento de la misma o acoplamiento no covalente. La inserción no genética puede ser de interés especialmente cuando el polipéptido a insertar es sintético o semi-sintético. Los procedimientos para acoplar un fármaco a un polipéptido se conocen bien en la técnica y comprenden por ejemplo la unión mediante puentes disulfuro usando N-piridilo y sulfhidrilo activado con sulfonilo.

En particular, es posible injertar moléculas que comprenden específicamente polipéptidos de la invención en CyaA mediante un enlace químico o mediante inserción genética para dirigirse in vivo a células diana de CyaA, tales como ACP, por ejemplo células CD11b/CD18 y particularmente al citosol de dichas células. De hecho, cuando se acopla una molécula correspondiente a un epítopo de célula T CD8^{+} dado, con el dominio catalítico de CyaA detoxificado, por medio de un puente disulfuro o mediante inserción genética, se ha descubierto que la molécula manipulada puede provocar una respuesta CTL específica in vivo mostrando de este modo que dicho epítopo de células T CD8^{+} se transloca al citosol de las células que expresan CD11b.

En una realización específica, la adenililciclasa recombinante usada para la fabricación del vector proteico es una CyaA o un fragmento de la misma especialmente modificado mediante la inserción de restos cisteína que contienen una o más molécula(s), especialmente que comprenden polipéptidos de la invención, acoplados químicamente por medio de un puente disulfuro a resto(s) de cisteína insertados genéticamente situados dentro del dominio catalítico de dicha adenilciclasa.

De hecho, pueden acoplarse múltiples moléculas que comprenden especialmente polipéptidos de la invención, a la adenilciclasa por medio de un puente disulfuro a diferentes restos de cisteína situados ,en diferentes sitios permisivos dentro del dominio catalítico.

Con vistas a proponer una proteína recombinante adecuada para el diseño de productos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmune, especialmente una respuesta inmune mediada por células en un huésped, y en particular para diseñar aquellos productos capaces de provocar una respuesta inmune contra los efectos malignos observados en un huésped infectado con HPV, los inventores han propuesto obtener polipéptidos que tengan epítopos de cepas de HPV altamente oncogénicas y especialmente a partir de antígenos de cepas seleccionadas entre HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 o HPV58.

Entre estas cepas, HPV 18 y HPV 16 son de particular interés. HPV 16 es especialmente una diana particular para el tratamiento de un huésped infectado con HPV, por causa de su asociación con el desarrollo de cáncer de cuello uterino en un huésped mamífero especialmente en un ser humano.

Partiendo de estas cepas de HPV, los inventores proponen obtener polipéptidos que tengan epítopos de antígenos seleccionados entre proteínas L1, L2, E1, E2, E4 y E5.

Como alternativa o en combinación, los inventores proponen también obtener aquellos polipéptidos que tienen epítopos de proteínas E6 o E7 de HPV.

En una realización particular de la invención, se usan proteínas E6 o E7 de HPV 16 o proteínas E6 o E7 de HPV18 para el diseño de polipéptidos que tienen epítopos.

Estas proteínas de HPV y sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos se han descrito en Seedorf, K. y col (Human papillomavirus type 16 DNA sequence. Virology, 145: 181-185, 1985) para HPV16, Cole S.T., Danos O. (Nucleotide sequence and comparative analysis of the human papillomavirus type 18 genome. Phylogeny of papillomaviruses and repeated structure of the E6 and E7 gene products. J. Mol. Biol. 193: 599-606 (1987)) o en Fernando GJ. y col (T-helper epitopes of the E7 transforming protein of cervical cancer associated human papillomavirus type 18 (HPV18) Virus Res. abril de 1995 36(1): 1-13).

Las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas expresadas especialmente por HPV16 o HPV18 durante todo el ciclo de replicación del virus y han demostrado ser necesarias para la aparición y el mantenimiento de la transformación maligna de las células huésped, después de la infección con cepas de HPV. Por lo tanto, ambos antígenos específicos tumorales se consideran dianas potenciales para inmunoterapia adoptiva mediada por CTL.

De acuerdo con una realización particular de la invención, la proteína recombinante comprende múltiples polipéptidos, cada uno de los cuales tiene uno o varios epítopos para uno o varios antígenos de HPV.

Por ejemplo, dichos múltiples polipéptidos pueden obtenerse de proteínas E6 y E7 de una cepa de HPV, especialmente de HPV16 o HPV18. De acuerdo con otro ejemplo, estos múltiples polipéptidos pueden abarcar epítopos obtenidos de proteínas E6 o E7, tanto de HPV16 como de HPV18.

Múltiples polipéptidos también pueden estar constituidos por diferentes epítopos que tienen fragmentos de una o más proteínas, por ejemplo de una proteína E7 o E6 que se insertan en diferentes sitios permisivos de la proteína CyaA de interés.

Otra proteína recombinante particular de acuerdo con las definiciones anteriores es una proteína CyaA recombinante en la que los múltiples polipéptidos que tienen epítopos abarcan un fragmento que comprende los restos 1 a 29 o un fragmento constituido por los restos 1 a 29 o un fragmento que comprende los restos 42 a 98 o un fragmento constituido por los restos 42 a 98 de la proteína E7 de HPV16 o múltiples polipéptidos que comprenden o están constituidos por ambos fragmentos, insertados en diferentes sitios permisivos de la proteína CyaA.

Otra proteína recombinante de acuerdo con la invención es una proteína en la que los múltiples polipéptidos abarcan un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos RAHYNIVTF (E7_{49-57}) y/o GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDS
TLRLCVQSTHVDIR (E7_{43-77}).

Se ha observado que el número de restos de aminoácidos en el polipéptido insertado en sitios permisivos de la proteína CyaA es tal que permite polipéptidos constituidos por antígenos de longitud completa, especialmente proteínas E6 o E7 de longitud completa de HPV insertadas en la proteína CyaA o en fragmentos de la misma.

De acuerdo con una realización particular de la invención, el polipéptido incluido en la CyaA recombinante es la proteína E7 especialmente la proteína E7 de HPV16, insertada entre los codones 224 y 235 de CyaA.

En otra realización, la proteína recombinante de la invención comprende múltiples polipéptidos, siendo algunos de los cuales polipéptidos que tienen un epítopo o varios epítopos de uno o varios HPV y otros polipéptidos que tienen epítopos de otros patógenos.

En otra realización particular, la proteína recombinante de la invención comprende además uno o varios epítopos que se originan a partir de un agente patógeno diferente. La asociación de epítopos que se originan de Chlamydia o de retrovirus VIH o HPV, HBV, HCV, adenovirus EBV, herpesvirus, virus HTLV.1 y CMV, con epítopos originarios de HPV puede ser de especial interés.

De acuerdo con otra realización particular la invención, los polipéptidos que tienen epítopos se han modificado con respecto a su secuencia de aminoácidos nativa, por ejemplo para disminuir la cantidad de restos de aminoácidos cargados negativamente dentro de la secuencia. Dicha modificación puede obtenerse retirando parte de estos restos de aminoácidos cargados negativamente o también añadiendo algunos restos de aminoácidos cargados positivamente, especialmente como restos de flanqueo de los epítopos. De este modo los polipéptidos que comprenden menos restos cargados negativamente pueden favorecer la translocación del dominio catalítico de la proteína CyaA en el citosol de las células diana.

Los polipéptidos que tienen epítopos también pueden diseñarse de tal manera que se desplieguen cuando se insertan en un CyaA, lo que mejora la eficacia de la internalización de la proteína CyaA recombinante en las células diana. Dicho desplegamiento en polipéptidos que experimentan plegamiento como consecuencia de su contenido de aminoácidos puede obtenerse por ejemplo, retirando o sustituyendo restos de cisteína para evitar la formación de puentes disulfuro que pueden estar implicados en el plegamiento de los polipéptidos. En algunos casos, es posible prevenir el plegamiento de los polipéptidos preparándolos en presencia de agentes reductores para evitar el replegamiento in vivo.

Ventajosamente, para preparar la proteína recombinante de la invención, la actividad enzimática de la proteína CyaA, es decir, su capacidad de convertir ATP en AMPc, se ha inactivado. Dicha inactivación puede obtenerse como resultado de la inactivación genética. Como ejemplo, puede obtenerse inactivación genética como resultado de la introducción de un dipéptido en un sitio de la secuencia de aminoácidos de CyaA que es parte del sitio catalítico (por ejemplo entre 188 y 189). Dichas proteínas de CyaA inactivadas se ilustran en los siguientes ejemplos.

La proteína recombinante de la invención es capaz ventajosamente de provocar una respuesta inmune mediada por células. Esta incluye una respuesta de CTL y Th, especialmente Th1, incluyendo una respuesta de células T CD4^{+} y/o una respuesta de células T CD8^{+}.

La capacidad de la proteína recombinante para producir esta respuesta inmune mediada por células se ha mostrado especialmente suficiente para prevenir el crecimiento tumoral in vivo o incluso para permitir la regresión tumoral en un animal.

La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína recombinante como se ha descrito anteriormente.

Puede insertarse un polinucleótido de la invención en un vector de expresión para proporcionar un vector de expresión recombinante adecuado para la expresión de la proteína recombinante de la invención. Dichos vectores de expresión incluyen plásmidos, cósmidos, fagémidos, y vectores virales.

Un vector recombinante puede ser uno que es adecuado para la expresión en células procariotas, especialmente en bacterias, o puede ser un vector de expresión adecuado para la expresión en células eucariotas especialmente en células de mamífero, y ventajosamente en células humanas.

La invención se refiere especialmente a vectores constituidos por plásmidos que codifican una proteína recombinante de acuerdo con la invención tal como:

pTRACE5-HPV16E7_{Full} (también denominada CyaAE5-HPV16E7_{Full}), depositada en la CNCM (París, Francia) el 18 de marzo de 2004 con el número CNCM I-3191;

pTRACE5-HPV16E7_{\Delta 30-42}, (también denominada CyaAE5-HPV16E7_{\Delta 30-42}), depositada en la CNCM (París, Francia) el 18 de marzo de 2004 con el número CNCM I-3190, o construcción pTRACE5-HPV16E7_{49-57}.

La invención también comprende una célula huésped, especialmente células procariotas o células eucariotas, por ejemplo células de mamífero, incluyendo células humanas, transformadas con un polinucleótido o un vector de acuerdo con la invención.

La invención se refiere especialmente a las células huéspedes depositadas en la CNCM con el número de acceso CNCM I-3190 y número de acceso CNCM I-3191.

La invención también se refiere a una composición inmunogénica que comprende como principio activo, una proteína recombinante como se ha definido anteriormente o un polinucleótido o un vector de expresión como se ha definido anteriormente. Dicho principio activo de la composición inmunogénica puede formularse junto con un vehículo, soporte o diluyente o una combinación de los mismos, fisiológicamente aceptable, adecuada para la administración a un huésped.

Una composición inmunogénica se diseña ventajosamente para inducir una respuesta inmune mediada por células, en particular una respuesta inmune mediada por células T, en un huésped mamífero. Preferentemente, ésta es capaz de inducir una respuesta inmune CTL citolítica mediada por células especialmente CD8^{+}.

Otra composición inmunogénica de acuerdo con la invención es una que puede inducir una respuesta inmune humoral.

Para mejorar la capacidad de la composición inmune de la invención para inducir una respuesta inmune, puede ser interesante combinar el principio activo con una sustancia adyuvante y/o tensioactiva y/o inmunomoduladora (tales como las citocinas o quimiocinas).

Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, liposomas, fases oleosas, tales como adyuvantes de tipo Freund, que se usan generalmente en forma de una emulsión con una fase acuosa o pueden comprender sales inorgánicas insolubles en agua, tales como hidróxido de aluminio, sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio.

La composición inmunogénica de acuerdo con la invención se usa ventajosamente para inducir una respuesta inmune en un huésped, iniciando y/o potenciando dicha respuesta, especialmente para inmunoterapia. Especialmente, una composición inmunogénica de la invención puede ser de interés para la prevención de la aparición o mantenimiento de la transformación maligna debida a la infección por HPV en un huésped o para el tratamiento de un paciente que padece transformación maligna debida a infección por HPV, especialmente infección por HPV-16 o
HIPV-18.

Dicha composición inmunoterapéutica puede ser de particular interés para terapia de proliferación celular incontrolada en un huésped que da como resultado un estado tumorigénico, especialmente para inmunoterapia de cáncer en particular para inmunoterapia de cáncer de cuello uterino asociada con infección por HPV. Por lo tanto proporciona medios para el diseño de vacunas terapéuticas especialmente adecuadas para el tratamiento de estados malignos debidos a infección por oncovirus, incluyendo estados tumorales.

Cuando se usa en la presente invención, las expresiones "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" abarcan los efectos de los compuestos descritos en la presente solicitud, que dan como resultado un efecto beneficioso para el paciente que experimenta el tratamiento, estando dichos efectos observados a nivel celular o a nivel clínico, incluyendo y abarcando, como resultado del tratamiento, una mejoría del estado del paciente o un estado de remisión, o una recuperación del estado de salud. Cuando el estado maligno tratado es la proliferación celular incontrolada o desarrollo o persistencia del tumor, el efecto beneficioso puede comprender la estabilización o preferentemente la prevención, detención o inversión de la proliferación incontrolada o la regresión del tumor.

Una composición concebida para el tratamiento de un estado maligno como se ha descrito anteriormente puede comprender ventajosamente una dosis de un principio activo que puede suponer entre aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 \mug de proteína recombinante, preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 \mug de una proteína recombinante. Cuando la composición comprende como principio activo una proteína recombinante de la invención la dosis puede comprender entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 10 \mug de proteína recombinante, preferentemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 \mug de proteína.

Dependiendo del estado a tratar, la composición puede administrarse de forma local a nivel de la lesión, una o varias veces, por ejemplo a intervalos regulares de varios días, por ejemplo, entre 5 y 10 días. También puede administrarse de forma sistémica.

La invención también se refiere a una composición de vacuna, especialmente una composición formulada para la administración a un huésped mamífero, preferentemente a un ser humano, que comprende una proteína recombinante de acuerdo con la definición anterior o un polipéptido como se ha definido anteriormente en este documento o un vector que contiene dicho polinucleótido, preferentemente en un huésped humano y si fuera apropiado un vehículo farmacéuticamente aceptable, para provocar una respuesta inmune, incluyendo una respuesta inmune mediada por células y/o una respuesta humoral.

La invención también se refiere a una composición de fármaco que comprende una proteína recombinante o un polinucleótido o un vector de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para prevenir o tratar infecciones por HPV.

De acuerdo con otra realización, una composición de fármaco comprende una proteína recombinante de acuerdo con o un polinucleótido o un vector de la invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la prevención o tratamiento de la aparición o mantenimiento de la transformación maligna debida a la infección por HPV en un huésped.

Una composición de fármaco que comprende una proteína recombinante o un polinucleótido, o un vector y un vehículo farmacéuticamente aceptable para inmunoterapia de cáncer.

La invención también se refiere al uso en un paciente de proteínas recombinantes que comprenden una proteína bacteriana especialmente la toxina bacteriana (preferentemente en su forma de toxoide) o un fragmento de la misma, adecuada para su uso como vector para provocar una respuesta inmune, es decir, una respuesta inmune humoral y/o mediada por células en un huésped, proteína o fragmento de la misma que se modifica mediante inserción de uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de uno o varios oncovirus para el tratamiento de una infección por oncovirus. Dicha proteína recombinante se propone en particular para el tratamiento de efectos malignos, especialmente tumores causados por la infección por dicho oncovirus.

Son ejemplos de proteínas bacterianas adecuadas como vectores para transportar epítopos de antígenos de oncovirus OmpA de klebsiella o la siguientes toxinas, toxina Shiga incluyendo su subunidad \beta (Haicher N. y col J. Immunol 2000, 165:3301-8) toxina del Ántrax (Goletz TJ y col, PNAS USA 1997, 94: 12059-64), toxina de difteria (Stenmark H. y col, J. Cell. Biol. 1991, 113: 1028-32) o la exotoxina A de pseudomonas (Donelly JJ. y col, PNAS USA 1993, 90: 9530-4). Los oncovirus cuyos antígenos pueden proporcionar epítopos para preparar polipéptidos para inserción en la proteína bacteriana incluyen HPV, HBV, HCV, adenovirus EBV, herpesvirus, virus HTPLV.1 y CMV.

La descripción que se proporciona a continuación en este documento que usa como principio activo la proteína recombinante CyaA, podría adaptarse para otras proteínas bacterianas y antígenos de oncovirus.

La invención también se refiere a un kit para el diagnóstico de una infección por un HPV o para controlar dicha infección, que comprende una proteína recombinante, un polinucleótido o un vector de expresión de acuerdo con la invención.

La invención también se refiere al uso de la proteína recombinante, polinucleótido o vector anteriores de la invención, para la preparación de medicamentos para el tratamiento o para la prevención de infección por HPV en un paciente.

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La invención también se refiere al uso de los anteriores, proteína recombinante, polinucleótido o vector de la invención, para la preparación de medicamentos para inmunoterapia contra la aparición o mantenimiento de transformación maligna debida a la infección por HPV en un paciente.

La invención también se refiere a un procedimiento para el diagnóstico in vitro o para el inmunocontrol de una infección por HPV, que comprende:

-

exponer células T obtenidas de un mamífero especialmente de un paciente ser humano, a una proteína recombinante de la invención,

-

detectar una modificación en la activación de células T.

En una realización particular, la proteína recombinante puede usarse para la preparación de medicamentos para la prevención de infección por HPV o para el tratamiento de huéspedes que padecen infección por HPV, incluyendo huéspedes que alojan tumores debidos a dicha infección.

Elementos adicionales que caracterizan la invención se describen y se ilustran en los ejemplos a continuación y en las figuras.

Leyendas de las figuras

Figura 1

Construcción y purificación de CyaA de HPV16-E7 recombinantes

(A) Mapa esquemático de pTRACE5 en el que se indican sitios de restricción relevantes y secuencias insertadas. (B) Representación esquemática de CyaA que muestra el sitio de inserción del dipéptido LQ para inhibir su actividad enzimática. También se muestran las posiciones de los insertos en la proteína HPV16-E7. El epítopo restringido HPV16 E7 H-2^{b} se subraya. (C) Análisis de SDS-Page de los CyaA de HPV16-E7 recombinantes. Se separaron cinco microgramos de proteínas purificadas en un gel de poliacrilamida SDS al 4-15% y se tiñeron con azul de Coomassie. Pista 1: CyaA de tipo silvestre; pista 2: CyaA E7_{49-57}; pista 3: CyaA-E7_{Full}; pista 4: CyaA-E7_{\Delta 30-42}. (D) Análisis de inmunotransferencia de Western de las CyaA de HPV16-E7 recombinantes. Después del SDS-PAGE, las proteínas purificadas se electrotransfirieron a un membrana de nitrocelulosa que se sondeó posteriormente con un anticuerpo anti HPV16-E7 monoclonal de ratón. Pista 1,2: CyaA de tipo silvestre (2 y 0,4 \mug, respectivamente); pista 3, 4 y 5: CyaA-E7_{49-57}, CyaA_{Full}, y CyaA-E7_{\Delta 30-42}, respectivamente, 0,4 \mug de cada proteína.

Figura 2

Inducción de respuestas de células T mediante CyaA de HPV16-E7 recombinantes

(A) Se inmunizaron ratones C57BU6 (a, b, c), TAP1^{-/-} (d), MHC clase II^{-/-} (e) y CD40^{-/-} (f) i.v. en el día 0 con 50 \mug de CyaA-E7_{49-57} (a), CyaA-E7_{Full}, o CyaA-E7_{\Delta 30-42}. (c, d, e y f). Siete días después, se sacrificaron los animales, los esplenocitos se reestimularon in vitro durante 5 días con 1 \mug/ml del péptido HPV16-E7_{43-77} en presencia de esplenocitos singénicos irradiados y se usaron como efectores contra células diana TC-1 (cuadros lisos) o EL4 (cuadros abiertos). También se representan los esplenocitos de ratones tratados con CyaAE5-cysOVA que tienen el epítopo no relevante OVA_{257-264} y reestimulados in vitro durante 5 días con 1 \mug/ml del péptido HPV16-E7_{43-77} en presencia de esplenocitos singénicos irradiados (a, triángulos lisos). La lisis diana se evaluó mediante liberación de ^{51}Cr. Los datos representan el porcentaje medio de los valores de lisis específicos (n = número de animales indicado en cada gráfico) así como los intervalos intercuartílicos. (B) Detección de células que producen IFN-\gamma-específico de HPv16-E7 después de la inmunización con las CyaA de HPV16-E7 recombinantes. Se inmunizaron ratones C57BU6 como en A con CyaAE5-cysOVA (círculos), CyaA-E7_{49-57} (cuadrados), CyaA-E7_{Full} (triángulos), o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (rombos). Siete días después, se cultivaron in vitro células del bazo aisladas a partir de ratones inmunizados durante 36 horas sin estimulación (es decir, sin péptido, símbolos abiertos) o con 1 g/ml del péptido E7_{49-57} (símbolos lisos) en presencia de esplenocitos singénicos irradiados. Los datos se expresan como la cantidad de SFC por bazo y se representa el resultado de los ratones individuales de tres experimentos independientes para cada grupo. Las barras horizontales representan la respuesta media de cada grupo.

Figura 3

Los CyaA de HPV16-E7 recombinantes inducen una respuesta de Th1 específica para HPV16-E7

(A) Los ratones C57BU6 se dejaron sin tratar (cuadros) o se sensibilizaron i.v. con 50 \mug de CyaAE5-cysOVA (círculos), CyaA-E7_{49-57} (triángulos), CyaA-E7_{Full} (triángulos invertidos), o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (rombos). Siete días después, las células del bazo se estimularon in vitro con 10 \mug/ml de la proteína His-Tag-HPV16-E7 y se ensayó el contenido de IFN-\gamma en los sobrenadantes 72 horas después. Los resultados de ratones individuales de los 4 experimentos independientes se representan y se expresan como la concentración de IFN-\gamma liberada en el sobrenadante a partir de pocillos por duplicado. Los trasfondos obtenidos con esplenocitos sin reestimular se restaron. Recuadro: estimulación in vitro con 1 \mug/ml de péptido E7_{43-77}. Las barras horizontales representan la respuesta media de cada grupo. (B) Lo mismo que en (A) excepto que se ensayó el contenido de IL-5 en los sobrenadantes. Los resultados de ratones individuales de dos experimentos independientes se representan y se expresan como la concentración de IL-5 liberado en el sobrenadante a partir de pocillos por duplicado.

Figura 4

La vacunación terapéutica con CyaA de HPV16-E7 recombinantes erradica los tumores establecidos

En el día 0 se injertó a ratones C57BL/6 con 5 x 10^{4} células tumorales TC-1. El día 10, los ratones se trataron con una inyección i.v. de CyaA-E7_{49-57} (C), CyaA-E7_{Full} (D), o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (E). Se tomaron también ratones sin tratar (A) o a los que se inyectó CyaAE5-cysOVA (B) como controles. Los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor alcanzó 1000 m^{3} o cuando el estatus sanitario de los animales lo exigía (tumor necrosado, una pérdida de peso rápida hasta > 20%) para evitar sufrimientos innecesarios. Dos ratones tratados con CyaA-E7_{Full} que más tarde desarrollaron tumores progresivos (*) se sacrificaron para investigaciones adicionales (véase la fig. 6).

Figura 5

La vacunación terapéutica con CyaA de HPV16-E7 recombinantes da como resultado supervivencia prolongada

Se realizó vacunación terapéutica como se ha descrito en la figura 4. Después de la inyección con células tumorales TC-1, los ratones (de 5 a 10 por grupo) se inmunizaron con CyaA de HPV16-E7 recombinantes en el día +1, +5, o +10 como se indica en los gráficos. Se dejaron ratones sin tratar (cuadros lisos, línea sólida), se trataron con simulacro con CyaAE5-cysOVA (cuadros abiertos, línea de rayas), o se trataron con CyaA-E7_{49-57} (triángulos abiertos), CyaA-E7_{Full} (círculos abiertos), o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (rombos abiertos). Se observa que en día +5 del experimento terapéutico, las curvas de supervivencia de los animales tratados con CyaA-E7_{Full} y CyaA-E7_{\Delta 30-42} se superponen completamente. En cada caso, la supervivencia de animales tratados con CyaA de HPV16-E7 recombinantes aumenta significativamente en comparación con la de animales no tratados o tratados con simulacro (p < 0,05).

Figura 6

Las células tumorales TC-1 explantadas de tumores de crecimiento reciente pierden la expresión de la molécula H-2D^{b}

En experimentos de rechazo tumoral, algunos animales vacunados con CyaA-E7_{Full} desarrollaron tumores en la etapa final de la evolución temporal de los experimentos (Fig. 4, *). Se sacrificaron dos animales para explantar los tumores. Estas células tumorales, TC-1 Al y A2 así como las células TC-1 nativas se analizaron mediante FACS® para el nivel de expresión de la molécula H-2D^{b} (línea en negrita). Se indican las medianas de las intensidades de fluorescencia (MedFi). Se muestran los resultados obtenidos con isotipo de control (sombreados en gris).

Figura 7

Persistencia de células T CD8^{+} específicas de HPV16-E7_{49-57} en ratones tratados con CyaA de HPV16-E7 recombinantes

Se sacrificaron ratones C57BU6 inmunizados con CyaA-E7_{49-57} (A), CyaA-E7Full (B), o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (C) y los que sobrevivían de injertos de TC-1 en el conjunto terapéutico de los experimentos y los esplenocitos se reestimularon in vitro durante 5 días con 1 \mug/ml del péptido HPV16-E7_{43-77} en presencia de esplenocitos singénicos irradiados. La lisis de la diana (TC-1, cuadros lisos; EL4, cuadros abiertos), se evaluó mediante liberación de ^{51}Cr. Los datos representan el porcentaje medio de los valores de lisis específicos (n = 6 para cada grupo) así como el intervalo intercuartílico. El número de animales que responden, de acuerdo con lo determinado con una lisis específica \geq 20% en la proporción máxima de efector con respecto a la diana, se indica en la parte superior derecha de los cuadrantes.

Figura 8

Protección a largo plazo contra el crecimiento de tumor TC-1 inducida por CyaA de HPV16-E7 recombinantes

Los ratones C57BU6 que sobrevivieron a los injertos de TC-1 en el conjunto terapéutico de experimentos se sometieron de nuevo a injertos s.c. en el día 100 con 5 x 10^{4} células TC-1. Se tomaron también ratones sin tratar de la misma edad como controles (A). Los crecimientos tumorales en ratones inmunizados inicialmente con CyaA-E7_{49-57}, CyaA-E7_{Full}, y CyaA-E7_{\Delta 30-42} se representan (B, C y D, respectivamente). Los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor alcanzó 1000 mm^{3} o cuando el estatus sanitario de los animales lo exigía. (E) curvas de supervivencia de animales (sin tratar, cuadros abiertos; o inmunizados con CyaA-E7_{49-57}, triángulos abiertos; CyaA-E7_{Full}, círculos abiertos; o CyaA-E7_{\Delta 30-42} (rombos abiertos) e injertados de nuevo con células TC-1 (día del injerto tomado como 0). En cada caso, la supervivencia de animales tratados con CyaA de HPV16-E7 recombinantes aumenta significativamente en comparación con la de los ratones no, tratados o tratados con simulacro (p < 0,05).

Ejemplos

En esta invención, se construyó CyaA recombinante que contenía la secuencia de longitud completa de la proteína E7 de HPV16 o sub-fragmentos de este polipéptido (en particular, un péptido que abarca restos 49-57 de E7 que corresponde a un epítopo H-2D^{b} restringido y a 43-98 más 1-29 de HPV16-E7). Se demostró que cuando se inyectan a ratones C57BU6, estas CyaA recombinantes de HPV16-E7 son capaces de inducir respuestas de CTL y Th1 específicas caracterizadas por la secreción de IFN-\gamma. Además, cuando se ensayaban de forma terapéutica, estas construcciones eran capaces de proporcionar hasta el 100% de protección contra el injerto subcutáneo de células TC-1. Este estudio representa la primera demostración de la actividad terapéutica antitumoral in vivo mediada por CyaA contra antígenos específicos tumorales humanos.

Materiales y procedimientos

Ratones y líneas celulares. Se obtuvieron ratones C57BU6 hembras de 6-10 semanas de edad libres de patógenos específicos, de CER Janvier (Le Gesnet St-Isle, Francia) o Charles River (L'Arbresle, Francia). También se usaron en este estudio TAP1^{-/-} (18), MHC Clase II^{-/-} (19) y CD40^{-/-} (20) criados en un trasfondo de C57BU6. Los animales se mantuvieron en las instalaciones del instituto Pasteur en condiciones libres de patógenos con agua y alimento ad libitum. Los experimentos que implicaban a animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado animal.

Las células TC-1 que expresaban proteínas E6 y E7 de HPv16 (21) y las células EL4 del timoma de ratón (17) se obtuvieron de la ATCC. Las células se mantuvieron en RPMI 1640 con Glutamax suplementado con FCS inactivado por calor al 10%, 100 \mul/ml de penicilina, 100 \mul/ml de estreptomicina, 0,4 mg/ml de geneticina (solamente para células TC-1) y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M (Gibco BRL, Cergy-Pontoise, Francia).

Péptidos. Los péptidos sintéticos E7_{49-57} (RAHYNIVTF, código de una letra para los aminoácidos) correspondientes al epítopo restringido HPV16-E7 H2-D^{b} (22) y E7_{43-77} (GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR) correspondiente al epítopo CTL E7_{49-57} con su secuencia de flanqueo natural y un epítopo Th (en negrita) (23) se adquirieron de Neosystem (Strasbourg, Francia).

Construcción y purificación de adenilato ciclasa de B. pertussis recombinante que tiene epítopos HPV16-E7. La adenilato ciclasa recombinante usada en este artículo se expresó en E. coli usando derivados del plásmido pTRACE5 (Figura 1A) que codifica una CyaA enzimáticamente inactiva (24) (25). El plásmido pTRACE5 es un vector de expresión para una variante de CyaA de B. pertussis enzimáticamente inactiva y por lo tanto citotóxica. También expresa la proteína CyaC de B. pertussis que se necesita para la acilación postraduccional de CyaA. Este plásmido es un derivado del plásmido pTRACG descrito anteriormente (Gmira y col., 2001, res. Mic. 152:889). Se obtuvo mediante la inserción del hexanucleótido CTGCAG en el sitio de EcoRV situado en la parte 5' de la secuencia de ADN de cyaA. Esto da como resultado una inserción en marco del dipéptido Leu-Gln entre Asp188 e Ile189 de CyaA dentro de una parte esencial del sitio catalítico (Guermonprez y col. 2000, Meth. Enzymol. 326: 527).

El plásmido pTRACE5 aloja un origen de replicación ColE1 y un marcador de resistencia a ampicilina. En este plásmido el gen cyaC y cyaA modificado se sitúan en la misma unidad transcripcional bajo el control del promotor Pr del fago \lambda. El plásmido pTRCAG también codifica el represor \lambda termosensible cl^{857} que reprime fuertemente la transcripción génica en el promotor Pr \lambda a temperaturas por debajo de 32ºC.

La cepa de E. coli XL1-Blue (Stratafene, La Jolla, CA) se usó para todas las manipulaciones del ADN que se realizaron de acuerdo con protocolos convencionales (Maniatis y col.).

CyaA-E7_{49-57} contiene una secuencia polipeptídica de 9 aminoácidos de longitud (RAHYNIVTF) insertada entre los codones 224 y 235 de CyaA. El plásmido de expresión para CyaA-E7_{49-57} se construyó de la siguiente manera. Dos oligonucleótidos sintéticos (MWG, Courtaboeuf, Francia), BTP1 (5'-CTA GCC GTG CCC ATT ACA ATA TTG TAA CCT TTG GTA C-3' hebra codificante) y BTP2 (5'-CAA AGG TTA CAA TAT TGT AAT GGG CAC GG-3' hebra no codificante) se hibridaron y se ligaron en el pTR.ACE5 digerido con NheI y KpnI. CyaA-E7_{Full} contiene toda la secuencia de la proteína HPV16-E7, es decir 98 amino ácidos, insertada en la misma posición 224 de la CyaA enzimáticamente inactiva. La secuencia de ADN que codifica la proteína E7 se amplificó a partir del ADN de HPV16 (Seedorf K y col anteriormente) usando los cebadores específicos BTP3, (5'-GGG CGC TAG CAT GCA TGG AGA TAC ACC TAC-3'), y BTP4 (5'-GGG CGG TAC CTG GTT TCT GAG AAC AGA TGG G-3'). El producto de PCR resultante se digirió con NheI y KpnI y se ligó en pTRACE5 escindido mediante NheI y KpnI. El sitio SspI presente en el oligonucleótido hibridado así como en la secuencia completa de HPV16-E7 permitió la identificación rápida de los mutantes de inserción. CyaA-E7_{\Delta 30-42} contiene los primeros 29 restos de aminoácidos de HPV16-E7 insertados entre los codones 319 y 320 de CyaA así como los restos 43 a 98 de HPv16-E7 insertados entre los codones 224 y 235 de CyaA. El plásmido de expresión para CyaA-E7_{\Delta 30-42} se construyó en dos etapas. Un primer fragmento de ADN que codifica (restos de aminoácidos 1 a 29) de HPv16-E7 se amplificó por PCR usando como ADN diana un gen de HPV16-E7 sintético (optimizado para la producción en E. coli, diseñado por GTP Technology, Labége, Francia), y cebador BP5 (5'-GGG CAC CGG TAA ACG TAT GCA CGG CGA TAC TCC G-3'), y BTP6 (5'-CGT GAG CAT CTG GCT TTC ACT AGT ACG TTT GTT CAG CTG CTC GTA GCA-3'). Un segundo fragmento de ADN que codifica los codones 320 a 372 de CyaA se amplificó por PCR usando pTRACE5 como ADN diana y los cebadores BTP7 (5'-GGG CAC TAG TGA AAG CCA GAT GCT CAC GCG CGG G-3'), Y BTP8 (5'-AGT ACA TCC GGC GAG AAC-3'). Estos dos fragmentos de ADN (que se solapan parcialmente) se purificaron y se combinaron con los cebadores BTP5 y BTP8 en una tercera PCR para amplificar un fragmento de ADN de 294 pb de longitud. Este fragmento se digirió mediante AgeI y BstBI y se insertó entre los sitios correspondientes de pTRACE5 para dar el plásmido pTRACE5-E71.29. Después, un fragmento de ADN que codificaba los restos de aminoácidos 43 a 98 de HPV16-E7 se amplificó por PCR usando el gen HPv16-E7 sintético como ADN diana y los cebadores BTP9 (5'-GGG CGC TAG CGG TCA AGC AGA ACC GGA C-3') y BTP10 (5'-GGG CGG TAC CAG GTT TTT GAG AGC AAA TCG GAC AAA CAA TCC CCA GAG TAC CCA TC-3'). El fragmento de PCR purificado se digirió mediante NheI y KpnI y se ligó en el plásmido pTRACE5-E7_{1-29} digerido mediante las mismas enzimas de restricción.

Todas las adenilato ciclasas recombinantes se produjeron en la cepa de Escherichia coli BLR (Novagen, Madison, WI) como se ha descrito anteriormente (26). Las proteínas recombinantes se purificaron hasta casi la homogeneidad (Figura 1B) a partir de cuerpos de inclusión mediante un procedimiento de dos etapas que incluye DEAE-sefarosa y cromatografía en fenil sefarosa, como se ha descrito anteriormente (26). Se añadió una etapa adicional de lavado con isopropanol al 60% en Hepes-Na 20 mM, pH 7,5 a la cromatografía en fenil sefarosa para eliminar la mayor parte del LPS contaminante. Las proteínas recombinantes purificadas se analizaron mediante análisis de SDS-gel. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante especrofotrometría a partir de la absorción a 280 nm usando un coeficiente de extinción molecular de 142.000 M^{-1} x cm^{-1}.

Construcción y purificación de proteína HPV16-E7 recornbinante. El ADNc optimizado con E. coli que codifica la proteína HPV16-E7 (tecnología GTP) secuencia de ADN disponible bajo petición se subclonó en el vector pIVEX2.4b (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, Francia) entre los sitios de restricción de NcoI y XhoI. El plásmido resultante se transformó después en la cepa de E. coli BL21\lambdaDE3 (Novagen). La proteína His-Tag-HPV16-E7 se expresó después de la inducción con isopropil \beta-d-tiogalactopiranósido 0,5 mM (Euromedex, Souffellweyersheim, Francia) y se purificó en Ni-NTA agarosa (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se usaron lavados con isopropanol como se ha descrito en (27) para eliminar la contaminación por LPS.

Inmunotransferencia. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (0,45 \mu, BioRad, Mrnes la Coquette, Francia) que se había sondeado con un anticuerpo anti HPV16 E7 monoclonal de ratón (Zymed, San Francisco, CA). Los complejos inmunes se detectaron con inmunoglobulinas anti ratón de cabra conjugadas con fosfatasa alcalina (Chemicon, Temecula, CA) y se mostraron con 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/azul de tetrazolio (BCIP/NBT) (Sigma, St. Louis, MO).

Experimentos de inmunización y de rechazo de tumores en ratones. Los animales se inmunizaron con una inyección intravenosa de 50 \mug de control o de CyaA recombinantes de HPV16-E7 diluidos en PBS (Gibco BRL). Para los análisis in vitro, los animales sacrificados (CO_{2}) se sometieron a esplenectomía 7 días después de la inyección excepto para el análisis de respuestas de larga duración, para lo que este procedimiento se realizó 3 meses después de la inyección. Para los experimentos de rechazo del tumor, los ratones recibieron 5 x 10^{-4} células TC-1 por vía subcutánea y se trataron mediante CyaA recombinantes de HPV16-E7 1 día, 5 días o 10 días después de la inoculación del
tumor.

Ensayo de citotoxicidad in vitro . Los esplenocitos de ratones inmunizados se estimulan in vitro con 1 \mug/ml de péptidos E7_{49-57} o E7_{43-77} en presencia de células del bazo sin tratamiento previo irradiadas y singénicas en medio completo (RPMI 1640 con Glutamax suplementado con FCS inactivado con calor al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M) durante 5 días. La actividad citotóxica de estas células efectoras se ensayó en un ensayo de 5 horas de liberación de ^{51}Cr en células TC-1. El radiomarcado se realizó de la siguiente manera: las células TC-1 en crecimiento exponencial cultivadas en una atmósfera de CO_{2} al 7,5% a 37ºC se tripsinizaron rápidamente (Trypsin-EDTA, GibcoBRL) y se incubaron con 100 \muCi de ^{51}Cr durante 1 hora a 37ºC. Se usaron diversas proporciones de E:T y todos los ensayos se realizaron por duplicado. La radioactividad liberada en el sobrenadante de cada pocillo se midió. El porcentaje de lisis específica se calculó como 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). La liberación máxima se obtuvo añadiendo Triton X-405 al 10% a las células diana y la liberación espontánea se obtuvo con las células diana incubadas en medio completo en solitario. Los ratones se consideran sensibles cuando se observó al menos el 20% de lisis específica a la proporción E:T más alta. Los resultados se expresan como medianas \pm los intervalos intercuartílicos de ratones sensibles por grupo.

Ensayo inmunospot ligado a enzimas de células que producen IFN-\gamma sencillo para células secretoras. Se revistieron placas de filtración Multiscreen (96 pocillos; Millipore, Molshein, Francia) con 4 \mug de anticuerpo interferón gama anti-ratón de rata (IFN-\gamma) (clon R4-6A2; PharMingen, San Diego, CA) por mililitro, durante una noche a temperatura ambiente. Después las placas se lavaron y se bloquearon con medio completo. Se añadieron diluciones de dos veces seriadas de células del bazo de ratones inmunizados junto con 5 x 10^{5} células singénicas \gamma-irradiadas (2.500 rad). Las células se incubaron durante 36 horas con o sin péptido E7_{49-57} a 1 \mug/ml. Después de lavados exhaustivos las placas se revelaron mediante incubación con 5 \mug de anticuerpo contra IFN-\gamma anti ratón de rata (clon XMG 1.2; PharMingen) por mililitro seguido de una incubación con estreptavidina-fosfatasa alcalina (PharMingen). Finalmente, los puntos se mostraron usando BCIP/NTB como sustrato. La cantidad de células que producían IFN-\gamma se determinó contando el número de células formadoras de puntos (SFC) en cada pocillo (Bioreader, Karben, Alemania) y los resultados se expresaron como el número total de SFC por bazo (17).

Producción de citocinas. Las células del bazo de ratones inmunizados se estimularon in vitro con 10 \mug/ml de proteína HisTag-HPV16-E7 o 1 \mug/ml de péptido E7_{43-77} en medio completo durante 72 horas. La producción de IFN-\gamma e IL-5 se determinó en los sobrenadantes del cultivo mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado enzima (ELISA) tipo sándwich como se ha descrito anteriormente (28). Todos los ensayos se estandarizaron con las citocinas de ratón recombinantes correspondientes (Pharmingen).

Análisis FACS®. Las células TC-1 se procesaron como se ha descrito en cualquier otro punto (29) para el análisis mediante citrometría de flujo del nivel de expresión de la molécula H-2D^{b} de MHC de clase I usando un anticuerpo monoclonal conjugado a FITC específico (clon KH95, Pharrningen, Le Pont de Claix, Francia).

Análisis estadístico. Considerando el pequeño tamaño de las diferentes muestras, se aplicaron ensayos estadísticos no paramétricos (30) usando el software StatXact 4 (Cytel corporation, Cambridge, MA). Las curvas de supervivencia se trazaron usando el software Prism (GraphPad Software Inc., CA) y se compararon con el ensayo de logrank dentro del software. Los datos se consideraron significativamente diferentes a p < 0,05.

Resultados

Construcción y caracterización de adenilato ciclasas recombinantes que tienen epítopos de HPV16-E7. Para estudiar la capacidad de CyaA para inducir respuestas de células T específicas para HPV16-E7, se construyeron 3 moléculas recombinantes diferentes. CyaA-E7_{49-57} contiene una secuencia polipeptídica de 9 amino ácidos de longitud (RAHYNIVTF) correspondiente al epítopo de CTL restringido para H-2D^{b} descrito anteriormente (22), que se insertó entre los codones 224 y 235 de una CyaA enzimáticamente inactiva (por lo tanto no tóxica). CyaA-E7_{Full} contiene toda la secuencia (98 aminoácidos) de la proteína HPV16-E7 insertada en la misma posición 224 de la CyaA enzimáticamente inactiva. CyaA-E7_{\Delta 30-42} contiene los primeros 29 restos de aminoácidos de HPV16-E7 insertados entre los codones 319 y 320 del CyaA enzimáticamente inactiva así como los restos 43 a 98 de HPV16-E7 insertados entre los codones 224 y 235. Para permitir los ensayos in vitro e in vivo, las construcciones de CyaA se produjeron y se purificaron hasta casi la homogeneidad (Figura 1B). Se introdujo un procedimiento de eliminación de LPS en el protocolo de purificación (26) para obtener proteínas recombinantes que contenían menos de 100 unidades de endotoxina por 50 \mug. La presencia de la proteína E7 en CyaA-E7_{Full} y en CyaA-E7_{\Delta 30-42} se confirmó mediante inmunotransferencia de western usando un anticuerpo monoclonal específico (Zymed) (Figura 1C). Por el contrario CyaA-E7_{49-57}, que contenía solamente el epítopo restringido H-2D^{b}, no era reconocido por el anticuerpo anti HPV16-E7. Las propiedades bioquímicas globales de las 3 CyaA recombinantes no se modificaron y estas moléculas presentaban una actividad hemolítica similar a la de la adenilato ciclasa de tipo silvestre (17).

La inmunización con CyaA recombinantes de HPV16-E7 induce respuestas de CTL específicas para E7. Para ensayar si CyaA puede inducir respuestas de CTL contra epítopos HPV16-E7, se inmunizaron una vez ratones C57BU6, por vía intravenosa con 50 \mug de los diferentes CyaA recombinantes de HPV16-E7. Se recogieron los esplenocitos y se estimularon in vitro con 1 \mug/ml del péptido E7_{43-77}. Su capacidad para lisar células TC-1 se determinó 5 días después usando un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Como se muestra en la figura 2A, una única inmunización i.v. de ratones C57BU6 con CyaA recombinantes de HPV16-E7 indujo respuestas CTL fuertes y específicas para células TC-1. La inmunización con CyaA que contenía la proteína HPV16-E7 completa (figura 2A, b) o su forma delecionada CyaA-E7_{\Delta 30-42} (Fig. 2A, c), dio como resultado unas actividades, de CTL máximas superiores en comparación con las inducidas por CyaA-E7_{\Delta 49-57} que contiene solamente el mínimo epítopo restringido H-2D^{b} (Fig. 2A, a), aunque no se pudo demostrar que estos datos fueran significativos estadísticamente. Se obtuvieron resultados similares cuando se usaba el péptido E7_{49-57} para reestimulación in vitro (no se muestran los datos). Los esplenocitos de ratones vacunados con un CyaA recombinante que tiene un epítopo no relevante (OVA_{257-264}) y reestimulados in vitro con 1 \mug/ml de péptido E7_{43-77} produjeron solamente una lisis de células TC-1 no específica muy débil (Fig. 2A, a). Se ha demostrado anteriormente que el suministro del epítopo celular OVA CD8^{+} (SIINFEKL) a la molécula MHC de clase I mediante CyaA in vivo dependía de la función TAP1 (15). Se ensayó si este era el caso cuando se usaba CyaA-E7_{\Delta 30-42}. Como se muestra en la figura 2A, d, los esplenocitos estimulados in vitro de ratones TAP1^{-/-} vacunados, eran incapaces de lisar las células TC-1. También se ensayo la necesidad de ayuda de células T CD4^{+} en la sensibilización in vivo de la respuesta CTL mediante CyaA recombinantes que contienen HPV16-E7. De acuerdo con las observaciones anteriores (15), se observó que la vacunación i.v de ratones MHA clase II^{-/-} usando CyaA-E7_{\Delta 30-42}, dio como resultado la inducción de un alto nivel de respuestas CTL específicas para células TC-1 (Fig. 2A, e). Por el contrario, se observó en este modelo alguna dependencia hacía la señalización de CD40, así como un bajo nivel de respuesta CTL a las células TC-1 en ratones CD40^{-/-} (Fig. 2A,f).

Para estimar ex vivo las frecuencias de esplenocitos específicos para HPV16-E7 en ratones inmunizados con CyaA recombinantes, se cuantificó el número de células que producen IFN-\gamma en respuesta a la estimulación in vitro con HPv16-E7_{49-57} mediante inmunospot ligados a enzima (ELISPOT). La figura 2B muestra que solamente existía una ligera diferencia en el número de esplenocitos que producen IFN-\gamma que producen específicamente IFN-\gamma obtenidos de ratones inmunizados con CyaE5-CysOVA en comparación con los inmunizados con CyaA-E7_{49-57}. Por el contrario, el número de esplenocitos que producen IFN-\gamma obtenido era mucho mayor (p < 0,05) en ratones vacunados con CyaA recombinantes de HPV16-E7 que contienen la proteína HPV16-E7 completa o su forma delecionada. Las respuestas observadas eran específicas para epítopo ya que muy pocas células del bazo de estos ratones producían IFN-\gamma en ausencia de estimulación por el péptido HPV16-E7_{49-57} (Figura 2B). Estos resultados demuestran que CyaA es capaz de suministrar in vivo el epítopo de células T restringido para H-2D^{b} CD8^{+} inmunodominante de la proteína HPV16-E7 en el citosol de células inmunocompetentes para procesamiento y presentación en la ruta de MHC de clase I, para provocar respuestas CTL fuertes. De acuerdo con observaciones previas (25, 31), se confirma que CyaA es tolerante a la inserción de grandes fragmentos polipeptídicos como CyaA que tienen la proteína de HPV16-E7 completa o su forma delecionada e invertida, también eran capaces de inducir fuertes respuestas CTL. Estos datos también demuestran que estas últimas moléculas indujeron frecuencias significativamente más altas de respuestas específicas para HPV16-E7_{49-57} en ratones.

La Inmunización con CyaA recombinantes de HPV16-E7 induce respuestas Th1 específicas de HPV16-E7. Las respuestas Th1 juegan un papel importante en la protección contra patógenos intracelulares y el desarrollo de tumores (32, 33). Se caracterizaron por lo tanto el tipo de respuestas de células T inducidas por CyaA recombinantes de HPV16-E7. Los ratones C57BU6 se inmunizaron una vez i.v. con 50 \mug de tres CyaA recombinantes de HPV16-E7, y se determinó la síntesis de citocinas después de la estimulación in vitro de células del bazo con 10 \mug/ml de la proteína His-Tag HPV16-E7 purificada. Como se muestra en la figura 3, la inmunización con CyaA que tienen la proteína HPV16-E7 completa o su forma delecionada dio como resultado un perfil similar a Th1 caracterizado por la producción de altos niveles de IFN-\gamma y la falta de niveles detectables de IL-5. Esta respuesta era específica ya que los niveles de IFN-\gamma obtenidos después de la inmunización con CyaA-E7_{Full} o CyaA-E7_{\Delta 30-42} eran significativamente mayores que los obtenidos en ratones inmunizados con simulacro con CyaAE5-CysOVA (p < 0,05). Sin embargo, este no era el caso con esplenocitos de ratones inmunizados con CyaA-E7_{49-57}. Se consiguieron resultados similares cuando la reestimulación se realizó con 1 \mug/ml de péptido E7_{43-77} (Fig. 3A, recuadro).

Tomados en conjunto, estos resultados indican que, en estas condiciones, las células T CD4^{+} juegan un papel importante en la secreción de IFN-\gamma, ya que los niveles obtenidos con CyaA que tienen la proteína HPV16-E7 de longitud completa que contiene epítopos de célula T restringidos H-2^{b} de clase II, son mucho mayores que los obtenidos con CyaA-E7_{49-57} que contiene solamente el epítopo restringido H-2D^{b} de clase I.

La inmunización con CyaA recombinantes de HPV16-E7 induce regresión de tumores que expresan HPV16 establecidos. Considerando las respuestas inmunológicas robustas obtenidas, se evaluaron después in vivo la actividad terapéutica de CyaA de HPV16-E7 en un modelo preclínico constituido por una línea celular tumorigénica H-2^{b} que expresaba proteínas HPV16-E6 y E7 (células TC-1) que se inyecta por vía subcutánea en ratones C57BU6. En este modelo, se ha demostrado previamente que el rechazo del tumor está mediado exclusivamente por células T CD8^{+} específicas de E7_{49-57} (21, 22, 34, 35). Por lo tanto, se inyectaron 5 x 10^{4} células TC-1 s.c. en el flanco derecho de ratones C57BU6 y 50 \mug de CyaAE5-HPV16-E7_{49-57}, E7_{Full} o E7_{\Delta 30-42} se inyectaron por vía intravenosa a ratones 1, 5 ó 10 días después. La figura 4 representa el crecimiento tumoral en ratones tratados terapéuticamente 10 días después del injerto del tumor. Debe observarse que, en estas condiciones, el 100% de los animales desarrollaron tumores palpables mientras se les administraba la vacunación. Para evitar sufrimientos innecesario, los animales se sacrificaron cuando los tamaños del tumor alcanzaron 1000 mm^{3}. Todos los animales sin tratamiento, así como los ratones que se trataron con un simulacro de CyaAE5-cysOVA desarrollaron tumores de este tamaño (> 1000 mm^{3}) en un máximo de 49 días. Por el contrario, la mayoría de los animales tratados con CyaA recombinante de HPV16-E7 siguieron sin desarrollar el tumor durante toda la duración del experimento (Fig. 4, C, D, E). La figura 5 muestra el diagrama de supervivencia de los animales a los que se injertaron células TC-1 y se sometieron a tres protocolos terapéuticos diferentes, en los cuales se inyectaron las CyaA recombinantes en el día 1, día 5 o día 10 después del injerto de TC-1. Los tiempos de supervivencia medios de animales no tratados y tratados con el simulacro estaban comprendidos entre 31 y 40 días. Por el contrario, la supervivencia de los ratones vacunados con CyaA que llevaban antígenos HPV16-E7 eran significativamente superiores a la de los animales de control (p < 0,05). Las diferencias en las actividades protectoras de las diversas construcciones podían establecerse aunque la significación estadística no pudo establecerse, por causa del pequeño tamaños de las diferentes muestras. Si el intervalo de regresión tumoral otorgado por CyaA-E7_{49-57} y E7_{Full} podía diferenciarse de forma clara, CyaA-E7_{\Delta 30-42} era claramente superior en términos de regresión tumoral e inhi-
bición del crecimiento, ya que en los tres esquemas terapéuticos, el índice de protección era siempre superior al 90%.

Algunos animales vacunados con CyaA-E7_{49-57} y CyaA-E7_{Full} parecían desarrollar tumores en las fases tardías en la evolución temporal del experimento (Fig. 4 (*) y no se muestran los datos). Teniendo en cuenta que este fenómeno podría reflejar mecanismos de escape tumorales, se explantaron los tumores en desarrollo de estos animales y se analizaron estas líneas celulares llamadas TC-1 Al y TC-1 A2 mediante análisis FACS para la expresión de H-2D^{b}. Como se muestra en la figura 6, en comparación con su contrapartida nativa, las células TC-1 Al y A2 explantadas de tumores de crecimiento tardío habían perdido la expresión de H-2D^{b}, lo que probablemente les hacía indetectable a células T CD8^{+} específicas de E7_{49-57}. Puesto que las células TC-1 crecían in vivo en un entorno sin presión antibiótica de selección, se comprobó mediante inmunotransferencia de western la expresión de HPV16-E7 en células TC-1 Al y A2. No se pudo descubrir ninguna diferencia en la expresión de esta proteína entre las células TC-1 y TC-1 Al y A2 (no se muestran los datos).

Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran la eficacia del vector adenilato ciclasa como una vacuna terapéutica adecuada para inducir la regresión de tumores que expresan HPV16 en un modelo preclínico.

Persistencia a largo plazo de células T CD8^{+} específicas de HPV16-E7_{49-57} inducidas mediante inmunización con CyaA. Para evaluar la persistencia de la respuesta inmune inducida por CyaA recombinantes de HPV16-E7, después de 3 meses se sacrificaron ratones que habían sobrevivido a los experimentos terapéuticos y sus esplenocitos se sometieron a estimulación in vitro durante cinco días con 1 \mug/ml de péptido E7_{43-77}. Su capacidad de lisar células TC-1 se determinó después mediante un ensayo de liberación de ^{51}Cr. Como se muestra en la figura 7, las respuestas CTL específicas al péptido HPV16-E7_{43-77} se demostraron a partir de esplenocitos de animales inmunizados tres meses antes. Basándose en el máximo porcentaje de lisis específica a una proporción 30:1 de efectorldiana, la respuesta inmunológica parecía ser más robusta en animales tratados con CyaA-E7_{\Delta 30-42}, aunque no pudo demostrarse que estos datos fueran estadísticamente significativos. Para evaluar la relevancia fisiológica de dicha inmunogenicidad de larga duración, los animales restantes se volvieron a estimular s.c. con 5 x 10^{4} células TC-1 en el día 100. En tales condiciones, todos los animales de control de la misma edad sin tratamiento previo desarrollaron tumores y mostraban un tiempo de supervivencia medio de 37,5 días (Fig. 8). Por el contrario, los ratones inmunizados tres meses antes con CyaA recombinantes de HPV16-E7 estaban protegidos muy significativamente contra el desarrollo tumoral. Como se ha observado anteriormente, los animales vacunados con CyaAE5-HPV16-E7_{\Delta 30-42} presentaron un alto nivel de protección. Sin embargo, corno variante de los resultados obtenidos en el primer conjunto de experimentos terapéuticos, actualmente existe una gran diferencia de protección entre animales tratados con CyaA-E7_{49-57} y aquellos tratados con CyaA-E7_{Full} en favor de estos últimos, aunque el pequeño tamaño de las muestras no permitió demostrar de forma inequívoca una significación estadística. Estas observaciones sugieren que en este modelo, la ayuda de las células T proporcionada por CyaA que tiene la proteína HPV16-E7 de longitud completa es importante para respuestas de larga duración eficaces contra las células TC-1.

Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran que una inyección i.v. de 50 \mug de CyaA recombinantes que tienen el epítopo ayudante de la proteína HPV16-E7 (DRAHYNIVTF) es suficiente para inducir células T CD8^{+} específicas de E7_{49-57} de larga duración que son capaces de otorgar protección contra dos estimulaciones con células tumorales TC-1 durante una período de tiempo de al menos 6 meses.

Discusión

Los estudios previos han demostrado que la aclenilato ciclasa de Bordetella pertussis es una herramienta poderosa para suministrar in vivo epítopos de células T CD4^{+} y CD8^{+} a las vías de presentación de MHC de clase I y clase II de las células dendítricas. En modelos experimentales de ratón, este sistema se ha usado para desencadenar respuestas Th1 y CTL eficaces proporcionando protección antiviral y antitumoral (36). Como una evaluación de la aplicación potencial de CyaA en seres humanos para el tratamiento de malignidades de cuello uterino asociadas con HPV16, se continúa con la demostración de que este vector suministra de forma eficaz epítopos in vivo de la proteína E7 de HPV16.

Se construyeron diversas CyaA de HPV16 recombinantes que contenían la proteína E7 completa de HPV16 o sub-fragmentos de este polipéptido, incluyendo en particular el epítopo CTL mínimo restringido para H-2D^{b} correspondiente a los restos 49-57. Se demostró que estas proteínas recombinantes diferentes eran capaces de sensibilizar respuestas CTL específicas y fuertes cuando se inyectaban en ratones C57BU6. Estos datos confirmaron que el suministro de epítopos CTL mediante CyaA requiere una vía de presentación de clase I totalmente funcional ya que no se pudo sensibilizar CTL después de la inyección de CyaA-E7_{\Delta30-42} en ratones TAP1^{-/-} (15). La sensibilización de CTL mediada por CyaA era independiente de la presencia de células T CD4^{+}, como se indica por las respuestas CTL eficaces obtenidas en ratones MHC de Clase II^{-/-} de acuerdo con los resultados anteriores (15). Esta característica de CyaA como un vector de vacuna es de gran importancia cuando se considera la vacunación de pacientes inmunosuprimidos o inmunodeficientes que presentan un número alterado de células T CD4^{+}. Sin embargo, se obtuvieron respuestas CTL bajas en ratones CD40^{-/-} que indicaban que la sensibilización de CTL era parcialmente dependiente de la señalización de CD40. Estas observaciones sugieren que las CyaA recombinantes de HPV16-E7 provocan CTL restringidas para MHC de clase I mediante estimulación directa de APC profesionales. Sin embargo no se requiere la interacción CD40-CD40L para obtener sensibilización óptima de respuestas CTL.

Se comparó la inmunogenicidad del epítopo CTL restringido para H-2D^{b} mínimo de HPV16-E7 con la del total de la proteína 30-42 E7 que contiene probablemente entre otros, el epítopo ayudante descrito DRAHYNIVTF (37). La sensibilización de CTL así como las frecuencias de esplenocitos específicos para HPV16-E7 inducidos por CyaA-E7_{Full} y CyaA-E7_{\Delta 30-42} eran superiores a las de los inducidos por CyaA-E7_{49-57} que tenían solamente los epítopos de CTL E_{49-57}. Estas observaciones indican que el suministro simultáneo de CTL y epítopos Th por CyaA da como resultado una respuesta CTL más robusta. Esto está de acuerdo con los datos publicados anteriormente en otros modelos a nivel preclínico (37) y clínico (38). El suministro de epítopos Th para HPV16-E7 mediante CyaA recombinantes se demostró adicionalmente mediante el análisis de las citocinas producidas por esplenocitos específicos para HPV16-E7 reestimulados in vitro con proteína HisTag-HPv16-E7 recombinante o péptido E7_{43-77}. De hecho, se observó síntesis específica de IFN-\gamma solamente en ratones vacunados con CyaA de HPV16-E7 que contenía el epítopo Th. El perfil típico de Th1 caracterizado por un alto nivel de IFN-\gamma y ninguna secreción de IL5, que se observó después de una inmunización i.v. con CyaA-E7_{Full} y CyaA-E7_{\Delta 30-42}, destaca el potencia interés de este vector para inmunoterapia tumoral.

Esto se ensayó en un modelo de rechazo del tumor basado en células TC-1 tumorigénicas establecidas s.c. (21). De acuerdo coro estos datos que demostraban la inmunogenicidad de CyaA recombinantes de HPV16-E7, se observó que estas proteínas recombinantes eran capaces de inducir la regresión de tumores TC-1 establecidos. CyaA-E7_{\Delta 30-42} era superior a CyaA-E7_{49-57} y CyaAE5-HPV16-E7_{Full} en términos de supervivencia durante un período de 90 días. Como las CyaA que tienen las proteínas E7 completas y \Delta30-42 producían resultados comparables en términos de capacidad de sensibilización de CTL, frecuencia de esplenocitos específicos para HPV16-E7_{49-57} y producción de IFN-\gamma, se esperaba que CyaA-E7_{Full} fuera superior a CyaA-E7_{49-57} en términos de supervivencia. Probablemente un mayor número de animales ensayados podría haber ayudado más a esclarecer esta aparente discrepancia. Sin embargo aún deben discutirse en este documento dos aspectos con respecto a la bioquímica de CyaA. En primer lugar, la presencia de aminoácidos cargados negativamente en la región 224-235 de CyaA demostró inhibir la translocación del dominio catalítico de CyaA al citosol de células eucariotas (39). A este respecto, la proteína ácida E7 (pki = 4,17) podría haber impedido una translocación eficaz del dominio N-terminal de CyaA al citosol de DC. CyaA-E7_{\Delta 30-42} se ha diseñado específicamente para eliminar un tramo de aminoácidos cargados negativamente situados entre los restos 30 y 42 (DSSEEEDEIDGPA) para favorecer su suministro a DC (y además, se introdujeron dos aminoácidos cargados positivamente (KR) en cada extremo del dominio N-terminal insertado de HPv16-E7. En segundo lugar, Gmira y col (25) han demostrado que el desplegamiento de la proteína heteróloga insertada dentro de CyaA es imprescindible para permitir la internalización de la proteína recombinante en las células diana. La inserción de dos fragmentos diferentes del polipéptido E7 en los dos sitios permisivos diferentes en CyaA-E7_{\Delta 30-42} puede prevenir el replegamiento de E7 y de este modo debe facilitar su translocación en células diana.

En la evolución temporal de los experimentos de rechazo del tumor, algunos ratones comenzaron a desarrollar de forma tardía tumores positivos para HPV16 después de haber rechazado anteriormente tumores TC-1 establecidos. Los análisis FACS® mostraron que las células de estos tumores no expresaban moléculas H-2D^{b}. Estas observaciones conducen a considerar la posibilidad de un refuerzo homólogo de la vacunación de CyaA recombinante para erradicar de forma más radical células, tumorales y para prevenir la reaparición del tumor mediante mecanismos de escape. Teniendo en cuenta los datos de otros equipos de expertos en la materia (37, 40, 41), será relevante reforzar la vacunación con CyaA en ratones elevando la cantidad total de CyaA de HPV16-E7 recombinante inyectados a 100 \mug, es decir, 0,56 nmoles. Los experimentos que pretendían ensayar esta última observación, así como otras para ensayar diferentes vías de administración de CyaA se están realizando.

Después de la reestimulación con células TC-1, los ratones supervivientes inmunizados con CyaA recombinantes de HPV16-E7 se protegieron de forma selectiva. Esto se correlaciona con la presencia de células T CD8^{+} de HPV16-E7_{49-57} entre los esplenocitos de estos animales. Esta observación reforzaba el hecho de que las reapariciones tardías observadas en la figura 4, se debían a mecanismos de escape del tumor y no a inmunidad decreciente hacía la proteína E7. La mejor tasa de supervivencia de los ratones inmunizados con CyaA recombinantes que contenían epítopos Th indicaban que proporcionar células T ayudantes contra el mismo antígeno también da como resultado un recordatorio eficaz de células T CD8^{+} HPv16-E7_{49-57}. A este respecto, se ha propuesto que las células T CD4^{+}, a través de CD40L pueden grabar una única firma molecular en las células T CD8^{+} efectoras otorgándoles su capacidad para una mejor función celular (42).

En un modelo validado para el ensayo de nuevos compuestos inmunoterapéuticos para el tratamiento de neoplasia asociada con HPV (21), se ha demostrado que CyaA es un vector eficaz para inducir la regresión de tumores establecidos así como para proporcionar protección contra estimulación tumorigénica durante un largo período de tiempo. A diferencia de otros enfoques que se desarrollan actualmente (11), la inmunoterapia basada en CyaA excluye la necesidad de seleccionar epítopos restringidos para HAL como proteínas completas que puedan insertarse y evita el uso de vectores virales y/o secuencias de ADN de HPV potencialmente oncogénicas. Además, se obtuvieron mejores resultados con una CyaA que contiene dos sub-fragmentos de HPV-E7 insertados en dos sitios permisivos diferentes de CyaA.

El hecho de que esta última construcción incluya todos los epítopos de clase I y clase II de HLA de HPV16-E7 descritos en la bibliografía (8, 46) refuerza la selección de CyaA-E7_{\Delta 30-42} en aplicaciones de vacuna.

Basándose en los datos presentados en este documento, se pretende ensayar la eficacia de CyaA que contienen HPV16-E7 en ensayos clínicos dirigidos a displasias de cuello uterino y anales asociadas con infección por HPV.

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Claims (50)

1. Una proteína recombinante que comprende al menos un polipéptido que tiene uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de HPV, insertándose dicho al menos un polipéptido en el misrno o en diferentes sitios permisivos de una proteína adenilato ciclasa de Bordetella sp. (CyaA) o un fragmento de la misma, en la que dicho fragmento de CyaA conserva la propiedad de dicha proteína adenilato ciclasa para dirigirse a células presentadoras de antígeno, en la que un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de una proteína E6 o E7 de HPV.

2. Una proteína recombinante según la reivindicación 1, en la que dicha proteína E6 o E7 es de HPV16 y/o HPV18.

3. Una proteína recombinante según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho al menos un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de la proteína E7 de HPV16.

4. Una proteína recombinante según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho al menos un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de la proteína E7 de HPV18.

5. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que al menos un polipéptido es una proteína E6 o E7 de longitud completa.

6. Una proteína recombinante según la reivindicación 1, en la que el fragmento de proteína CyaA conserva la propiedad de dicha proteína adenilato ciclasa para dirigirse a CD11b/CD18APC.

7. Una proteína recombinante según la reivindicación 1, en la que el fragmento de proteína CyaA conserva la propiedad de CyaA para permitir la translocación de lo(s) epítopo(s) de dicho(s) polipéptido(s).

8. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho fragmento comprende entre aproximadamente 30 y aproximadamente 1300 restos de aminoácidos, abarcando dicho fragmento los restos de aminoácidos 1208 a 1243 de la proteína CyaA de Bordetella pertussis o los restos de aminoácidos 1166 a 1281 de la proteína CyaA.

9. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende múltiples polipéptidos que tienen de uno a varios epítopos o uno o varios antígenos de HPV.

10. Una proteína recombinante según la reivindicación 9, en la que un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de un HPV oncogénico, tal como HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 o HPV58.

11. Una proteína recombinante según la reivindicación 9 ó 10, en la que un polipéptido que tiene uno o varios epítopos se obtiene de un antígeno de HPV seleccionado entre proteínas L1, L2, E1, E2, E4 y E5.

12. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que un polipéptido contiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 restos de aminoácidos.

13. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende múltiples polipéptidos, siendo algunos de los cuales, polipéptidos que tienen uno o varios epítopos de uno o varios antígenos de HPV, y teniendo otros polipéptidos, epítopos de otros patógenos.

14. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende múltiples polipéptidos insertados en diferentes sitios permisivos de la secuencia de CyaA o fragmento de la misma, en la que dicho fragmento de CyaA conserva la propiedad de dicha proteína adenilato ciclasa para dirigirse a Células Presentadoras de Antígeno.

15. Una proteína recombinante según la reivindicación 14, en la que los polipéptidos múltiples abarcan un fragmento que comprende los restos 1 a 29 o un fragmento que comprende los restos 42 a 98 de la proteína E7 de HPV16, o los dos fragmentos, insertándose dichos polipéptidos en diferentes sitios permisivos de la proteína CyaA, o fragmento de la misma.

16. Una proteína recombinante según la reivindicación 3, en la que un polipéptido abarca un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos RAHYNIVTF (E7_{49-57}) y/o GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR (E7_{43-77}).

17. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que los polipéptidos que tienen uno o varios epítopos se han modificado con respecto a su secuencia de aminoácidos nativa mediante la adición de secuencias de flanqueo naturales o no naturales del antígeno, o modificándolos químicamente, por ejemplo para cambiar la carga del polipéptido.

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18. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que la proteína CyaA se obtiene de Bordetella pertussis.

19. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que se ha inactivado la actividad enzimática de la proteína CyaA.

20. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que la actividad enzimática de la proteína CyaA se ha inactivado genéticamente.

21. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que la actividad enzimática de la proteína CyaA se ha inactivado como resultado de un dipépticlo insertado en un sitio de la secuencia de aminoácidos de CyaA implicado en la actividad ciclasa.

22. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende varios polipéptidos que tienen uno o varios epítopos de diferentes antígenos de HPV, insertados en el mismo o en diferentes sitios permisivos de la proteína CyaA o fragmento de la misma.

23. Una proteína recombinante según la reivindicación 22, en la que los polipéptidos son los polipéptidos E7 de longitud completa obtenidos de, respectivamente HPV16 y HPV18, insertándose dichos polipéptidos en diferentes sitios permisivos de la proteína CyaA o fragmento de la misma.

24. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está codificada por el inserto contenido en un plásmido seleccionado entre pTRACE5-HPV16E7_{FULL} (CNCM I-3191) o pTRACE5-HPV16E7_{\Delta 30-42} (CNCM I-3190).

25. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para su uso para provocar una respuesta inmune mediada por células en un huésped mamífero.

26. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para su uso para provocar una respuesta inmune humoral en un huésped mamífero.

27. Un polinucleótido que codifica una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

28. Un polinucleótido según la reivindicación 27, en el que dicho polinucleótido está comprendido en el vector pTRACE6-HPV16E7_{FULL} (CNCM I-3191) o pTRACE5-HPV16E7_{\Delta 30-42} (CNCM I-3190).

29. Un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 27.

30. Un vector de expresión recombinante según la reivindicación 29 adecuado para la expresión en bacterias.

31. Un vector de expresión recombinante según la reivindicación 29 adecuado para la expresión en células eucariotas, especialmente en células de mamífero.

32. Un vector de expresión recombinante según la reivindicación 29 que se selecciona entre pTRACE5-
HPV16E7_{FULL} (CNCM I-3191) o pTRACE5-HPV16E7_{\Delta 30-42} (CNCM I-3190).

33. Una célula huésped recombinante que comprende el polinucleótido según la reivindicación 28 o el vector de expresión irecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

34. La célula huésped recombinante según la reivindicación 33, en la que dicha célula huésped recombinante es una célula de E. coli depositada en la CNCM con el número I-3190 o I-3191.

35. Una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, junto con un vehículo, excipiente, soporte, y/o diluyente fisiológicamente aceptable.

36. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35, que comprende además un adyuvante y/o un tensioactivo y/o sustancias inmunomoduladoras.

37. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35 ó 36, para su uso para inducir una respuesta inmune mediada por células en un huésped mamífero.

38. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35 ó 36, para su uso para inducir una respuesta inmune citolítica mediada por células.

39. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35 ó 36, para su uso para inducir una respuesta inmune humoral.

40. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35 ó 36, para su uso para prevenir o tratar infecciones por HPV.

41. Una composición inmunogénica según la reivindicación 35 ó 36 para su uso en inmunoterapia de cáncer.

42. Una composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 35 ó 36 para su uso en la prevención o tratamiento de la aparición o el mantenimiento de transformación maligna debido a la infección por HPV en un huésped.

43. Una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, para su uso en el tratamiento o la prevención de infección por HPV en un paciente.

44. Una proteína recombinante de un polinucleótido o un vector según la reivindicación 43, para su uso en inmunoterapia contra la aparición o mantenimiento de transformación maligna debida a infección por HPV en un paciente.

45. Una composición de vacuna que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 adecuado para provocar una respuesta inmune mediada por células y/o humoral en un huésped.

46. Una composición de fármaco que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 para su uso para la prevención o el tratamiento de infecciones por HPV.

47. Una composición de fármaco que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 para su uso para la prevención o el tratamiento de la aparición o mantenimiento de transformación maligna debida a infección por HPV en un huésped.

48. Una composición de fármaco que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 para su uso en inmunoterapia de cáncer.

49. Un kit de diagnóstico o un kit para inmunocontrolar una infección con HPV, que comprende una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o un polinucleótido según la reivindicación 27 ó 28 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

50. Procedimiento para el diagnóstico in vitro o para el inmunocontrol de una infección con HPV, que comprende:

-

exponer células T obtenidas de un mamífero, especialmente de un paciente ser humano, a una proteína recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, y

-

detectar una modificación en la activación de células T.