CN1956730A - 携带被插入到腺苷酸环化酶蛋白或其片段内的人乳头瘤病毒表位的重组蛋白及其治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的一种或数种多肽的重组蛋白，所述多肽被插入到腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点，其中所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白的导向抗原呈递细胞的性能。本发明也涉及编码相同多肽的多核苷酸。重组蛋白或多核苷酸可以被用于设计针对HPV感染或针对其恶变效应的治疗工具。

Description

携带被插入到腺苷酸环化酶蛋白或其片段内的人乳头瘤 病毒表位的重组蛋白及其治疗用途

本申请涉及携带被插入到腺苷酸环化酶蛋白或其片段内的乳头瘤病毒表位的重组蛋白。

因此，本发明涉及重组蛋白，其中腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白的作用为引发针对源自乳头瘤病毒抗原(特别是人乳头瘤病毒抗原)的表位的免疫应答的蛋白载体。

本发明特别涉及所获得的蛋白质载体将表位转运到真核细胞内、优选地转运到哺乳动物细胞内以及特别优选地转运到人类细胞内的用途。

本发明也涉及编码本发明的重组蛋白的多核苷酸、和含有所述多核苷酸的载体以及含有所述多核苷酸或载体的宿主细胞。

本发明也涉及上面的重组蛋白或多核苷酸用于治疗或预防宿主体内的人乳头瘤病毒感染的用途，以及用于治疗或预防人乳头瘤病毒在宿主体内(特别是哺乳动物宿主体内)的感染所引起的恶变效应的用途。在具体的实施方式中，本发明提供了用于设计适用于免疫治疗，特别是针对于乳头瘤病毒的肿瘤特异性抗原的免疫治疗的化合物的手段。

在多种人乳头瘤病毒(HPV)类型中，那些被称作高危HPV的乳头瘤病毒类型与其在宿主体内持续感染后的上皮性恶性肿瘤的发生有关(1)。在宫颈癌(全世界第二广泛的妇科癌症)中，有＞99％的患者体内可检测到HPV16和HPV18DNA(2)。这些病毒的致癌能力在于早期基因(即E6和E7基因)所表达的产物，在病毒的整个复制周期内都可检测到所述基因的表达，这对于恶性转化的发生和维持都是必需的。但是，与这些高危致癌性HPV类型的高频率的肛门生殖器的感染相反的是，只有较小比例的个体最终出现了HPV相关性恶性肿瘤(3)，这说明免疫应答控制了高危HPV感染。一些观察强化了这种说法，例如绝大多数癌前病变的自发消退(1)、CD4+T细胞和巨噬细胞发生消退的生殖器疣中的浸润(1)以及在免疫抑制或免疫缺陷患者中所发现的更多数目的受感染的对象(1)。此外，在被诊断为HPV16相关性恶性肿瘤(4-8)的患者的血液中以及在健康个体的血液中(9，10)都检测到了针对HPV16-E6和/或E7表位的CD4+和CD8+T细胞应答。总而言之，这些理由构成了用于研发导向HPV16的E6和E7蛋白的免疫治疗的有力的理论基础。

已经研制出多种通过产生针对H-2D^b HPV16-E7_49-57限制性表位的免疫应答而预防HPV16-E6和-E7阳性的致瘤性细胞系在C57BL/6小鼠中的肿瘤生长的疫苗策略。这些疫苗方案包括质粒DNA、病毒或细菌的载体、嵌合的病毒样颗粒、合成肽和重组蛋白(11)。不过，对于临床消退而言，这些方案都只产生了勉强令人满意的结果(3)。因此，评价将HPV表位导向免疫系统以诱导细胞介导的应答的新工具仍是令人感兴趣的。

因此需要适用于将HPV抗原的表位输送给靶细胞的新载体，这容许在宿主体内引发针对所述抗原的体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。本发明人已经发现腺苷酸环化酶蛋白可以被用于设计这样的载体。利用百日咳伯德特氏菌的腺苷酸环化酶蛋白已经进行了各种观察，得出了这种蛋白可以代表用于设计这种有效载体的合适的主要成分的结论。

百日咳伯德特氏菌的腺苷酸环化酶(CyaA)具有将其催化区转运到真核细胞的胞质溶胶内的能力(12)。因此，分别用II和I型MHC分子加工处理被插入到CyaA的催化位点的CD4+和CD8+T细胞表位，并将其呈递在抗原呈递细胞(APC)的表面上(13)。此外，已经证实CyaA与α_Mβ₂整联蛋白(CD11b/CD18)(14，WO 02/22169)特异性结合，并将这些T细胞表位导向CD11b+的树突状细胞亚群(15)。用具有合适表位的重组CyaA对小鼠的免疫接种造成了强CTL应答的诱导、对致死性病毒攻击的完全保护、有效的预防性和治疗性的抗肿瘤免疫力(16，17)。具体地，在WO 93/21324或WO 02/22169中已经表征了腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白并阐述了通过重组DNA技术对其的制备。在WO02/22169中，已经描述了包括第373到1706位残基的CyaA片段含有与CD11b/CD18受体相互作用所必需的结构。

更具体地，后来已经描述了从1166位残基延伸至1281位氨基酸残基的氨基酸序列包括用于与CD11b/CD18受体相互作用的决定簇，以及更具体地，从1208位残基延伸到1243位残基的氨基酸序列对于毒素与CD11b/CD18的相互作用是关键的(EP 03291486.3和45)。

本发明人已经确定并评价了用于构建具有即包括HPV抗原的表位的重组CyaA蛋白的条件，所述重组CyaA蛋白能将所述表位转运到靶细胞内，特别是宿主体内的抗原呈递细胞(APC)，所述宿主包括患有HPV感染和其恶性转化的宿主。

因此，本发明特别涉及包括一种或数种携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的多肽的重组蛋白，所述多肽被插入到腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点，其中所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白导向CyaA的靶细胞例如APC(特别是CD11b/CD18细胞例如树突状细胞)的能力。在具体的实施方式中，该片段也保留了CyaA容许插入其中的表位或含有所述表位的多肽被转运到靶细胞的胞质溶胶内的能力。如果CyaA的片段保留容许其催化区转运的蛋白区域，就可以容许表位或含有所述表位的多肽被转运到靶细胞的胞质溶胶内。

依赖于重组技术，可以制备本发明的重组蛋白。通过合成，特别是化学合成也可以获得本发明的重组蛋白。因此，术语“重组蛋白”指的是所述蛋白的嵌合形式。

特别是根据在EP 03291486.3和(45)或WO 02/22169中所述的方法，可以检测重组蛋白导向CD11b/CD18细胞的能力。此外，通过采用在WO 02/22169中所述的方法可以检测重组蛋白将表位或含有所述表位的多肽转运到靶细胞的胞质溶胶内的能力。

在具体的实施方式中，CyaA的片段可以包括CyaA的两个不同的部分，这两部分在CyaA中并非是天然连续的。作为一个实例，可以提到的是CyaA的催化区，即CyaA的N末端部分的400个氨基残基以及包括导向CD11b/CD18抗原呈递细胞所需的第1208位到1243位氨基酸残基的片段。

在上面的定义中，术语“多肽”描述的是任何氨基酸序列，包括进行翻译后修饰的氨基酸序列，特别是至少具有6个氨基酸残基的氨基酸序列，并包括具体地具有从5个到500个残基或大约5个到大约100个、或大约5个到大约200个或大约10个到大约50个、或大约30个或约50个到大约200个、或大约100个到大约210个或大约100个到大约200个残基的氨基酸序列，条件是所述的氨基酸包括至少一个表位，即在将其转运到靶细胞、优选地是宿主(特别是哺乳动物宿主)之后可以获得针对其的免疫应答的氨基酸序列。根据该定义的多肽因此可以被限定于表位，甚至被限定于独特表位，或者可以包括一些不同的或相同的表位，或者也可以包括来自病原体即人乳头瘤病毒的全长抗原。本发明的表位包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答(特别是T细胞免疫应答)所涉及到的氨基酸序列。因此，本发明的重组分子的多肽中的表位包括宿主中的APC(抗原呈递细胞)所处理的那些表位、特别是联合I型MHC(主要组织相容性复合物)分子所识别的那些表位(例如其靶细胞为CD8+T淋巴细胞的表位)或联合II型MHC分子所识别的表位(例如其靶细胞为CD4+T淋巴细胞的那些表位)。

在具体的实施方式中，携带表位的多肽包括一些源自不同抗原的表位，特别是源自不同HPV株的一种类型的抗原或源自不同HPV株的数种类型的抗原。因此，源自HPV抗原的多肽可以是多价的，特别是双价或三价，即能引发针对数种抗原的免疫应答。

根据本发明，可以设计出HPV抗原，来自所述抗原的多肽携带一种或数种表位，所述HPV抗原优选地是那些源自HPV感染后的恶变效应的发生和/或维持所特别涉及到的蛋白的抗原，并包括所谓的肿瘤抗原，即与HPV感染相关性肿瘤发生所相关的抗原，它们能引发宿主体内的免疫应答，并与宿主体内的抗原或T细胞特异地反应。

本发明的携带表位的多肽可以源自HPV的天然的或成熟的抗原，包括通过使用整个抗原或包括通过选择片段(特别是抗原性片段、特别是所述抗原的表位)而不是整个蛋白，或通过修饰所述抗原或它的所选的抗原性部分或表位，特别是为了提高它们联合重组分子中的CyaA蛋白一起诱导或引发宿主体内的免疫应答的能力。因此，为了举例说明这些表位的各种可能的修饰，这些多肽包括的表位的侧翼具有所述表位所起源的抗原的天然的或非天然的侧向序列，这些多肽也包括含有表位或含有已经被化学修饰以提高它们的免疫性能的表位的氨基酸序列。这些修饰对于联合CyaA蛋白提高所获得的多肽的效能是有益的。

在下面的实施例中阐述了一些具体的修饰，包括涵盖多肽的电荷变化的修饰，特别是通过插入附加的带正电荷的氨基酸残基所进行的修饰。

因此，本发明的多肽也包括半合成的或合成的多肽。

根据具体的实施方式，源自HPV抗原的多肽(各自或总共)含有大约5个到大约500个、或大约5个到大约100个、或大约5个到大约200个例如大约10个到大约50个氨基酸残基或大约30个或50个到大约200个氨基酸残基或大约100个到大约210个或大约100个到大约200个氨基酸残基。

当重组于本发明的重组蛋白中时，所选的多肽特别地能引发抗原特异性应答。

本发明的重组蛋白被特别地设计成包括存在于中断的天然HPV抗原中的多肽，其中所述中断由在所述抗原的酸性区域内缺失一或数个氨基酸残基和/或在所述腺苷酸环化酶的至少两个许可位点插入所述HPV抗原的至少两个多肽片段组成。

通过在腺苷酸环化酶的至少两个许可位点插入天然HPV抗原的至少两个片段可以获得被涵盖在本定义范围内的特殊的中断，其中所述的至少两个片段逆向地对应于它们在天然抗原中的天然定位，即当被插入于CyaA蛋白或其片段内时，在天然抗原中为更靠近N末端的片段变成了C末端，反之亦然。

已经观察到氨基末端和羧基末端的片段的倒位在诱导强的和长期的保护性免疫力方面(特别是癌症的免疫治疗方面)是更为有效的，如以E7_Δ片段(即E7抗原的片段)所举例说明的那样。

根据本发明，如上面所述的，使用腺苷酸环化酶(CyaA)的全长蛋白或其片段。

优选地，CyaA蛋白或其片段是作为cyaA和cyaC基因在细胞内，特别是在重组细胞内的共表达的结果的蛋白或其片段。事实上，已经显示出，为了具有针对靶细胞的侵入性能，CyaA必须进行翻译后修饰，通过cyaA和cyaC基因的表达可以实现这一点(WO93/21324)。

在本发明的具体的实施方式中，CyaA蛋白的片段是具有至少约30个氨基酸的片段，并且可以最大具有约1300个氨基酸残基，特别是具有约500个氨基酸残基，优选地具有大约50个到大约150个氨基酸残基；在具体的实施方式中，所述片段包括用于与CD11b/CD18靶细胞相互作用的CyaA蛋白的第1166到1281位氨基酸残基或第1208到1243位氨基酸残基。具体的片段因此包括天然蛋白的所有的C末端部分或其一部分，该部分负责蛋白与靶细胞膜和/或CD11b/CD18受体的结合，或者负责多肽中所含的表位向细胞胞质溶胶内的转运(12)。本发明的CyaA蛋白的具体片段含有CyaA蛋白的第372到1706位氨基酸残基。另一种具体片段是对应于其中已经删除了第225到234位氨基酸残基的CyaA蛋白的片段，因此提供了含有第1到224位残基及第235到1706位残基的CyaA片段。

在本发明的具体的实施方式中，腺苷酸环化酶蛋白是细菌蛋白。在优选的实施方式中，CyaA蛋白源自伯德特氏菌属。

在与本发明相关的伯德特氏菌属中，其中一种是百日咳伯德特氏菌。相关的其他的伯德特氏菌株是副百日咳伯德特氏菌或支气管败血性伯德特氏菌的菌株。在登录号为NC002928.3的序列中以及在Parkhill J.et al(Nat.Genet.DOI，10(2003))中都已经阐述了副百日咳伯德特氏菌的CyaA蛋白的序列(1740个氨基酸的序列)，以及在Betsou F.et al(Gene 1995，August 30；162(1)：165-6)中阐述了支气管败血性伯德特氏菌的CyaA蛋白的序列。

百日咳伯德特氏菌是百日咳的致病性病原体，并分泌一些毒素，包括已知的百日咳毒素和腺苷酸环化酶毒素(CyaA)，CyaA是细菌的一种重要的致病因子，并且是其中一种抗百日咳伯德特氏菌感染的保护性抗原。

百日咳伯德特氏菌的腺苷酸环化酶是一种毒素，它已经被描述为1706个残基的双官能蛋白，其包括400个氨基酸残基的N末端的催化区以及1306个残基的C末端部分，该部分造成了毒素与靶细胞膜的结合以及随后的催化部分向细胞胞质溶胶内的转运(12)。

CyaA蛋白被合成为一种无活性的原毒素，通过对两个内在赖氨酸残基(860位和983位赖氨酸)的翻译后的软脂酰化可以将其转化成为活化的毒素。该翻译后修饰需要CyaA基因的附属基因即cyaC的表达，所述cyaC基因在百日咳伯德特氏菌染色体中位于cyaA基因的附近。

Glaser，P.et al，1988，Molecular Microbiology 2(1)，19-30已经描述了百日咳伯德特氏菌的氨基酸序列和核苷酸序列。因此，当在本发明中引用百日咳伯德特氏菌的CyaA蛋白的氨基酸残基或序列或核苷酸或核苷酸序列时，它们的所给出的位置对应于在所述的文献Glaser etal.1988中所述的序列。

在本发明的重组蛋白中，携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的多肽被插入到了CyaA蛋白的一个或数个许可位点。

对于本发明而言，“许可位点”是CyaA蛋白的序列的位点，在其中可以插入多肽而基本上不影响CyaA蛋白的功能性，特别是基本上不影响CyaA对细胞的导向作用，特别是对APC的导向作用，这包括基本上不影响与CD11b-CD18受体的特异性结合以及优选地基本上不影响在将表位转运到靶细胞内的过程中所涉及的蛋白区域。

容许转运CyaA催化区并因此转运所插入到这些许可位点的表位的百日咳伯德特氏菌腺苷酸环化酶的许可位点包括，但不限定于第137-138位残基(Val-Ala)、第224-225位残基(Arg-Ala)、第228-229位残基(Glu-Ala)、第235-236位残基(Arg-Glu)、和第317-318位残基(Ser-Ala)((44)Sebo et al.，1995)。在本发明的实施方式中也包括下面的附加的许可位点：第107-108位残基(Gly-His)、第132-133位残基(Met-Ala)、第232-233位残基(Gly-Leu)、和第335-336位残基(Gly-Gln)和第336-337位残基。(43)

对于其他的伯德特氏菌而言，通过比较序列以及确定相应的残基可以确定相应的许可位点。

根据另一个实施方式，多肽也可以或同样地被插入到CyaA蛋白或其片段的一个或另一个末端。

用于本发明目的的CyaA蛋白的具体片段是那些包括最多1300个氨基酸或大约30个到大约500个氨基酸残基、优选地大约50个到大约150个氨基酸残基的片段，特别是这些包括天然CyaA蛋白的第1166到1281位氨基酸残基、优选地包括天然CyaA蛋白的第1208到1243位氨基酸残基的片段。

因此，根据本发明，多肽在CyaA蛋白内的为提供所谓的重组蛋白(也称作“杂合”蛋白)的“插入”包括遗传学插入，特别是通过已有的DNA技术而进行的遗传学插入。同样地，“插入”也包括非遗传学插入，包括化学插入，例如在CyaA或其片段的一个末端上所进行的共价结合或非共价结合。当所插入的多肽是合成的或半合成的多肽时，非遗传学插入可能是特别相关的插入。用于药物与多肽结合的方法在本领域是公知的，并包括例如通过利用N-吡啶磺基活化的巯基的二硫键。

具体地，为了在体内导向Cya的靶细胞(例如ACP，例如CD11b/CD18细胞)，以及具体地导向所述细胞的细胞质溶胶，通过化学连接或通过遗传学插入将含有本发明的多肽的分子特异地移植到CyaA蛋白内是有可能的。事实上，当通过二硫键或通过遗传学插入的方式结合对应于给定的CD8+T细胞表位的分子与无毒的CyaA的催化区时，已经发现所遗传加工的分子可以在体内引发特异的CTL应答，其中显示出所述的CD8+T细胞表位被转运到了表达CD11b的细胞的细胞质溶胶内。

在具体的实施方式中，用于生产蛋白载体的重组腺苷酸环化酶是经半胱氨酸残基插入所修饰的CyaA或其片段，其含有一种或多种经二硫键的方式与位于所述腺苷酸环化酶的催化区内的遗传学插入的半胱氨酸残基化学结合的分子(具体地包括本发明的多肽)。

事实上，通过与位于催化区内的不同的许可位点的不同的半胱氨酸残基的二硫键的方式可以将多个分子(具体地包括本发明的多肽)与腺苷酸环化酶化学结合。

为了提出适用于设计具有引发免疫应答(特别是宿主体内的细胞介导的免疫应答)的能力的产物的重组蛋白，特别是为了设计这些能够引发在受HPV感染的宿主体内所观察到的抗恶变效应的免疫应答的产物，本发明人已经提出获得具有来自高度致癌性HPV株，特别是来自选自HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58中的抗原的表位的多肽。

在这些病毒株中，HPV18和HPV16是特别相关的。HPV16特别地是一种用于治疗受HPV感染的患者的特殊靶点，因为它与在哺乳动物宿主特别是人类中发生宫颈癌的相关性。

从这些HPV株开始，本发明人提出获得具有来自选自L1、L2、E1、E2、E4和E5蛋白中的抗原的表位的多肽。

选一地或组合地，本发明人已经提出自HPV的E6或E7蛋白获得这些携带表位的多肽。

在本发明的具体实施方式中，HPV的E6或E7蛋白或HPV18的E6或E7蛋白被用于设计携带表位的多肽。

可以被用于设计源自HPV抗原的多肽的具体HPV蛋白是HPV(特别是HPV16或HPV18)的E7蛋白。根据本发明的实施方式，多肽源自不同HPV株(特别是HPV16和HPV18)的数种E7蛋白。例如，多肽是HPV16和HPV18的全长的E7蛋白或HPV16或HPV18的每种E7蛋白的一个或数个片段，包括所述片段的多聚体，特别是所述片段的二聚体。

已经描述了这些HPV蛋白的氨基酸及核苷酸序列，如在Seedorf，K.et al(Humanpapillomavirus type 16 DNA sequence.Virology，145：181-185，1985)中描述了HPV16，在Cole S.T.，Danos O.(Nucleotidesequence and comparative analysis of the humanpapillomavirus type 18genome.Phylogeny ofpapillomaviruses and repeated structure of the E6 andE7 gene products.J.Mol.Biol.193：599-606(1987))或在Fernando GJ.et al(T-helper epitopes of the E7 transforming protein of cervical cancerassociated humanpapillomavirus type 18(HPV 18)Virus Res.1995 Apr.36(1)：1-13)中描述了HPV18。

E6和E7蛋白是HPV16或HPV18在病毒整个复制周期过程中所特异表达的癌蛋白，并且它们已经显示出对于在HPV株感染之后的宿主细胞的恶性转化的发生和维持是必需的。因此，这两种肿瘤特异性抗原都被认为是所采用的CTL介导的免疫治疗的潜在靶点。

根据本发明的具体实施方式，重组蛋白包括多个多肽，每个多肽都携带一种或多种HPV抗原的一种或数种表位。

例如，这样的多个多肽可以源自一个HPV株(特别是HPV16或HPV18)的E6和E7蛋白。根据另一个实施例，这些多个多肽可以包括源自来自HPV16和HPV18的E6或E7蛋白的表位。

多个多肽也可以包括不同的携带一个蛋白(例如E7或E6蛋白)的片段的表位，其被插入到相关的CyaA蛋白的不同的许可位点。

根据上面定义的另一种特殊的重组蛋白是蛋白CyaA重组体，其中多个携带表位的多肽涵盖包括HPV16的E7蛋白的第1到29位残基的片段或由第1到29位残基构成的片段组成、或涵盖包括HPV16的E7蛋白的第42到98位残基的片段或由第42到98位残基构成的片段组成，或者多个多肽包括被插入到CyaA蛋白的不同的许可位点的这两个片段或由被插入到CyaA蛋白的不同的许可位点的这两个片段构成。

本发明的另一个重组蛋白是一种蛋白，其中多个多肽包括具有氨基酸序列RAHYNIVTF(E7_49-57)和/或GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(E7_43-77)的片段。

已经观察到被插入到CyaA蛋白的许可位点的氨基酸残基的数目是容许由全长抗原(特别是HPV的全长E6或E7蛋白)构成的多肽被插入到CyaA蛋白或其片段内的数目。

根据本发明的具体实施方式，在重组CyaA中所含的多肽是E7蛋白，特别是HPV16的E7蛋白，其被插入到CyaA的第224和235密码子之间，或被插入到CyaA的第319和320密码子之间。

在另一个实施方式中，本发明的重组蛋白包括多个多肽，其中一些多肽是携带一种或数种HPV的一种表位或数种表位的多肽，而其他的多肽具有其他病原体的表位。

在另一个具体实施方式中，本发明的重组蛋白还包括源自不同病原体的一种或数种表位。源自衣原体或源自HIV逆转录病毒或HPV、HBV、HCV、腺病毒EBV、疱疹病毒、HTLV1病毒和CMV的表位与源自HPV的表位的相关性可能是特别相关的。

根据本发明的另一个具体的实施方式，例如为了序列内的带负电荷的氨基酸残基的数目，已经修饰了携带表位的多肽的天然的氨基酸序列。通过去除带负电荷的氨基酸残基中的一些残基或者也通过增加一些带正电荷的氨基酸残基(特别是作为表位的侧向残基)可以获得这样的修饰。因此包括更少的带负电荷的残基的多肽可以有助于CyaA蛋白的催化区在靶细胞的胞质溶胶内的转运。

也可以设计携带表位的多肽，使得它们被插入到CyaA内时是未折叠的，这提高了重组CyaA蛋白被内吞到靶细胞内的效率。例如通过去除或取代半胱氨酸残基以避免在多肽的折叠过程中所涉及到的二硫键的形成，这就可以获得未折叠的多肽，所述多肽本身因为其氨基酸成分将进行折叠。在一些情况中，通过在存在还原剂时制备多肽使得避免多肽在体内的折叠来预防多肽的折叠是有可能的。

在具体实施方式中，携带表位的多肽可以是隐蔽性表位。

在本发明的特殊部分，发明人打算确定由(i)根据上面所述定义的腺苷酸环化酶(CyaA)或其片段和(ii)携带一种或多种抗原的一种或多种抗原片段的多肽构成的重组蛋白构成的嵌合蛋白构建体能因为所述抗原的隐蔽性表位在重组构建体中的存在而使得所述隐蔽性表位变成为免疫原性的。具体地，包括如本发明所定义的CyaA或其片段以及源自特别用于治疗目的(包括疫苗接种目的)的相关抗原的多肽的所述嵌合构建体可以包括抗原的隐蔽性表位，其被容许成为免疫原性的，特别是能激发宿主体内的T细胞应答，特别是CTL应答。

本发明因此涉及包括携带一种或数种抗原的一种或数种表位的一种或数种多肽的重组蛋白，所述多肽被插入到腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点，所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白导向抗原呈递细胞的性能，其中至少一种所述表位是亚优势的隐蔽性的T细胞表位，其中所述重组蛋白能够引发针对所述多肽的抗原特异性应答。

具体地，隐蔽性表位被包含HPV抗原之内，特别是在HPV16和/或HPV18抗原内，特别是在E7抗原内。

因此特别定义的重组蛋白包括源自HPV18 E7蛋白的多肽，即具有氨基酸序列IDGVNHQHL的多肽。

根据具体的实施方式，可以修饰隐蔽性表位，例如其可以在头两个位点具有取代，以及例如可以具有序列ASGVNHQHL。

本发明特别涉及肽IDGVNHQHL。

本发明也涉及在这个序列上具有取代的肽，特别是在位点1和/或2上的取代，特别是具有序列ASGVNHQHL的肽。

本发明也包括所述肽的变体，只要它们具有致免疫的性能，特别是能引发T细胞应答(特别是CTL应答)。

优选地，为了制备本发明的重组蛋白，已经灭活了CyaA蛋白的酶活性，即它们将ATP转化成cAMP的能力。通过遗传学灭活可以实现这种灭活。例如，通过在作为催化位点一部分的CyaA的氨基酸序列的位点引入二肽(例如在188位和189位之间)可以实现遗传学灭活。在下面的实施例中举例说明了这样灭活的CyaA蛋白。

本发明的重组蛋白优选地能引发细胞介导的免疫应答。它包括CTL和Th，特别是Th1应答，包括CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。

重组蛋白引发这种细胞介导的免疫应答的能力已经特别地表现出足以预防体内的肿瘤生长或者甚至能造成动物体内的肿瘤消退。

本发明也涉及编码如上定义的重组蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以被插入到表达载体内，以便提供适用于表达本发明的重组蛋白的重组表达载体。这些表达载体包括质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体。

重组载体可以是一种适用于在原核细胞特别是在细菌内表达的载体，或者可以是一种适用于在真核细胞特别是在哺乳动物细胞以及优选地是在人类细胞内表达的载体。

本发明特别涉及由编码本发明的重组蛋白的质粒构成的载体，例如pTRACE5-HPV16E7_Full(也称作CyaAE5-HPV16E7_Full)，2004年3月18日保藏于CNCM(法国巴黎)，保藏号为CNCM I-3191；pTRACE5-HPV16E7_Δ30-42(也称作CyaAE5-HPV16E7_Δ30-42)，2004年3月18日保藏于CNCM(法国巴黎)，保藏号为CNCM I-3190；或构建体pTRACE5-HPV16E7_49-57。

本发明也包括经本发明的多核苷酸或载体转化的宿主细胞，特别是原核细胞，或真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括人类细胞。

本发明特别涉及保藏于CNCM的保藏号为N°CNCM I-3190和N°CNCM I-3191的宿主细胞。

本发明也涉及免疫原性组合物，其包括作为活性成分的如上定义的重组蛋白或如上定义的多核苷酸或表达载体。可以联合适合于施用给宿主的生理学可接受的媒介、赋形剂、载体或稀释剂或其组合物一起制剂所述的免疫原性组合物的活性组分。

免疫原性组合物被优选地设计成能诱导哺乳动物宿主体内的细胞介导的免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。优选地，它能诱导细胞介导的细胞溶解性免疫应答CTL，特别是CD8+CTL。

本发明的另一种免疫原性组合物是能诱导体液免疫应答的免疫原性组合物。

为了提高本发明的免疫组合物诱导免疫应答的能力，组合活性组分与佐剂和/或表面活性物质和/或免疫调剂物(例如细胞因子或化学因子)可能是有用的。

佐剂包括例如通常以水相的乳剂形式施用的脂质体、油相、例如弗氏型佐剂，或者可以包括水不溶性无机盐例如氢氧化铝、硫酸锌、胶体氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙。

本发明的免疫原性组合物被优选地用于或者通过触发和/或者通过强化所述应答而诱导宿主体内的免疫应答，特别是对于免疫治疗而言。具体地，本发明的免疫原性组合物可以被用于预防宿主体内的HPV感染所造成的恶性转化的发生或维持，或用于治疗患有因HPV感染(特别是HPV-16或HPV-18感染)所造成的恶性转化的患者。

这样一种免疫原性组合物可以被特别地用于治疗宿主体内的不受控制的细胞增殖所造成的癌变状态，特别是用于癌症的免疫治疗，特别是用于HPV感染相关性宫颈癌的免疫治疗。因此，它提供了用于设计特别适用于治疗致癌病毒感染所造成的恶性病变(包括肿瘤状态)的治疗性疫苗的方法。

术语“治疗”或“治疗性治疗”在本发明中包括了在本申请书中所阐述的化合物的效果，它能给进行治疗的患者带来了有益的效果，可以在细胞水平或在临床水平上观察到有益的效果，治疗的结果包括患者的状态或缓解状态的改善、或健康状态的恢复。当所治疗的恶性病变是不受控制的细胞增殖或肿瘤的发生或维持时，有益的效果可以包括稳定或优选地阻止、终止或逆转不受控制的增殖或消退肿瘤。

被打算用于如上所述的恶性病变的组合物可以优选地包括一个剂量的活性组分，其剂量可以总计大约1到大约1000μg重组蛋白，优选地大约10到大约500μg重组蛋白。当组合物包括作为活性组分的本发明的重组蛋白时，剂量可以包括大约0.05到大约10μg重组蛋白，优选地大约0.1到大约1μg蛋白。

根据所治疗的病变，可以在病灶的水平局部地施用组合物一次或数次，例如在数天的规律间隔内，例如从5到10天。也可以全身施用组合物。

本发明也涉及用于引发了免疫应答，包括细胞介导的免疫应答、和/或体液应答的疫苗组合物，特别是制剂成施用给哺乳动物宿主(优选地是人)的组合物，其包括如上定义的重组蛋白或如上定义的多核苷酸或含有所述多核苷酸的载体，优选地是在人类宿主体内，并包括合适的药用可接受的媒介。

本发明也涉及包括用于预防或治疗HPV感染的药物组合物，其包括本发明的重组蛋白或多核苷酸或载体、以及药用可接受的媒介。

根据另一个实施方式，用于预防或治疗宿主体内的HPV感染所引起的恶性转化的发生或维持的药物组合物包括本发明的重组蛋白或多核苷酸或载体以及药用可接受的载体。

用于癌症免疫治疗的药物组合物包括重组蛋白或多核苷酸、或载体或药用可接受的媒介。

本发明也涉及重组蛋白在治疗被一种致癌病毒感染的患者中的用途，所述重组蛋白包括细菌蛋白特别是细菌毒素(优选地是它们的类毒素形式)或其片段，其适合于用作引发免疫应答的载体，即宿主体内的体液和/或细胞介导的免疫应答，其中通过插入一种或数种致癌病毒的一种或数种抗原的一种或数种表位而修饰了所述蛋白或其片段。这样一种重组蛋白被特别计划用于治疗恶变效应，特别是这些致癌病毒的感染所引起的肿瘤。

适合作为携带致癌病毒的抗原的表位的细菌蛋白的实例是克雷伯菌的OmpA或下面的毒素：志贺菌毒素及其β亚基(Haicher N.et al J.Immunol.2000，165：3301-8)、炭疽毒素(Goletz TJ et al，PNAS USA 1997，94：12059-64)、白喉毒素(Stenmark H.et al，J.Cell.Biol.1991，113：1028-32)、或假单胞菌外毒素(Donnelly JJ.et al，PNAS USA 1993，90：9530-4)。其抗原可以为制备用于插入到细菌蛋白内的多肽提供表位的致癌病毒包括HPV、HBV、HCV、腺病毒EBV、疱疹病毒、HTLV1病毒和CMV。

上面所提供的对用作活性组分的CyaA重组蛋白的描述可以适用于其他的细菌蛋白和致癌病毒抗原。

本发明也涉及用于诊断HPV感染或用于免疫监测这种感染的试剂盒，其包括本发明的重组蛋白、多核苷酸或表达载体。

本发明也涉及上面的本发明的重组蛋白、多核苷酸或载体用于治疗或用于预防患者体内的HPV感染的用途。

本发明也涉及上面的本发明的重组蛋白、多核苷酸或载体用于针对患者体内的HPV感染所造成的恶性转化的发生或维持的免疫治疗的用途。

本发明也涉及用于体外诊断或免疫监测HPV感染的方法，其包括：

-将从哺乳动物特别是人类患者中获得的T细胞暴露于本发明的重组蛋白；

-检测T细胞活化的改变。

在具体实施方式中，重组蛋白可以被用于预防HPV感染或用于治疗患有HPV感染的宿主，包括患有因这种感染所造成的肿瘤的患者。

本发明也涉及用于筛选在嵌合的CyaA-多肽蛋白中所含的多肽的未知的或亚优势的隐蔽性T细胞表位的方法，其中CyaA是如上所述的腺苷酸环化酶或其片段，其包括：

-给动物宿主施用所述的嵌合蛋白；

-确定所述宿主的T细胞应答，特别是CTL应答。

本发明特别地涉及用于筛选在本发明的定义范围内的重组蛋白中所含的HPV抗原的多肽的未知的或亚优势的或隐蔽性的T细胞表位(特别是CD8+T细胞表位)的方法，该方法包括：

-给动物宿主(非人类宿主)施用所述重组蛋白；

-确定所述宿主的T细胞应答，特别是CTL应答。

通过下面的实施例以及附图阐述并举例说明了表征本发明的更多的特征。

附图说明

图1：HPV16-E7重组CyaA的构建和纯化。

(A)pTRACE5的示意图，其中指示出了相关的限制性位点和所插入的序列。(B)CyaA的图示显示出了抑制其酶活性的二肽LQ所插入的位点。也显示了HPV16-E7蛋白插入的位置。用下划线显示了HPV16-E7-H2^b限制性表位。(C)对HPV16-E7重组CyaA的SDS-PAGE分析。在4-15％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离5μg纯化的蛋白，并用考马斯蓝染色。列1：野生型CyaA；列2：CyaA-E7_49-57；列3：CyaA-E7_Full；列4：CyaA-E7_Δ30-42。(D)对HPV16-E7重组CyaA的Western印迹分析。在SDS-PAGE之后，将纯化的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，随后用小鼠单克隆的抗HPV16-E7抗体进行探针检测。列1、2：野生型CyaA(分别为2和0.4μg)；列3、4和5：分别为CyaA-E7_49-57、CyaA-E7_Full、CyaA-E7_Δ30-42，每种蛋白均为0.4μg。

图2：重组HPV16-E7CyaAs对T细胞应答的诱导

(A)在第0天用50μg CyaA-E7_49-57(a)、CyaA-E7_Full(b)、CyaA-E7_Δ30-42(c、d、e和f)静脉内接种C57BL/6(a、b、c)、TAP1^-/-(d)、II型MHC^-/-(e)和CD40^-/-(f)。7天后处死动物，在存在经照射的同基因型脾细胞时，用1μg/ml CyaA-E7_43-77肽在体外重新刺激脾细胞5天，并将其用作抗TC-1靶细胞(实心方块)或EL4(空心方块)的效应物。用携带由非相关表位OVA_257-264的CyaAE5-cysOVA处理小鼠的脾细胞，并在重新具有经照射的同基因型的脾细胞时，用1μg/mlCyaA-E7_43-77肽在体外再刺激脾细胞5天(a，实心三角)。用⁵¹Cr释放评价导向裂解。数据代表特异性裂解值的中位百分比(n＝在每个图中所示的动物数目)以及四位分数范围。(B)对经重组HPV16-E7 CyaAs免疫接种后的产HPV16-E7特异性IFN-γ的检测。如在A中一样，用OVA_257-264(圆圈)、CyaA-E7_49-57(方块)、CyaA-E7_Full(三角)、CyaA-E7_Δ30-42(菱形)免疫接种C57BL/6小鼠。7天后，在存在经照射的同基因型的脾细胞时，将从免疫小鼠中分离到的脾细胞在没有刺激(即没有肽，空心标记)或1μg/mlCyaA-E7_43-77肽(实心标记)下体外培养36个小时。数据被表示为每个脾的SFC数目，并显示了每个组的三个独立试验的单个小鼠的结果。水平栏表示每组的中位应答。

图3：重组HPV16-E7 CyaAs诱导了HPV16 E7特异性Th1应答。

(A)不处理(方块)小鼠或用50μgOVA_257-264(圆圈)、CyaA-E7_49-57(三角)、CyaA-E7_Full(倒三角)、或CyaA-E7_Δ30-42(菱形)静脉内预处理C57BL/6小鼠。7天后，用10μg/ml His-Tag-HPV16-E7蛋白在体外刺激脾细胞，并在72小时后测试悬浮液中的IFN-γ含量。显示了4个独立试验的单个小鼠的结果，并表示为复孔中的悬浮液所释放的IFN-γ的浓度。减去用未重新刺激的脾细胞所获得的背景值。插图：1μg/ml E7_43-77肽的体外刺激。水平栏表示每组的中位应答。(B)与(A)相同，除了测试悬浮液的IL-5含量。显示了2个独立试验的单个小鼠的结果，并表示为复孔中的悬浮液所释放的IL-5的浓度。

图4：用重组HPV16-E7 CyaAs的治疗性疫苗接种根除了已建立的肿瘤。

(试验A)在第0天给C57BL/6小鼠移植5×10⁴个TC-1肿瘤细胞。在第10天，静脉内注射CyaA-E7_49-57(C)、CyaA-E7_Full(D)、或CyaA-E7_Δ30-42(E)处理小鼠。未处理的小鼠(A)或经CyaAE5-cysOVA(B)注射处理的小鼠一起作为对照。当肿瘤大小达到1000mm3或每当动物健康状态指示(坏死性肿瘤，体重快速减轻＞20％)时，处死小鼠以避免不必要的痛苦。处死两只晚期发生进展性肿瘤(^*)的经CyaA-E7_Full处理的小鼠进行进一步的研究(见图6)。

(试验B)试验设定与(试验A)相同。在第+10和+17天，用10μgCyaAE5-cysOVA(a，实线)、或10μg CyaA-E7_Δ30-42(b)在耳部真皮下进行治疗性疫苗接种。每个曲线表示单个动物内的肿瘤生长。包括两只未处理的动物(a，虚线)。在每个象限的右上方(a，b)显示出了所处死的动物的数目对所含的动物的总数。显示了这些小鼠的生存曲线(c)。未处理(空心三角)、CyaAE5-CysOVA模拟处理(实心三角)、CyaA-E7_Δ30-42处理(圆圈)。

图5：重组HPV16-E7 CyaAs的治疗性疫苗接种造成了生存期延长。如图4所示的进行治疗性疫苗接种。在注射TC-1肿瘤细胞之后，如图所示的，用HPV16-E7重组CyaA在第+1、+5、或+10天免疫接种小鼠(每组5到10只)。不处理(实心方块，实线)小鼠或用CyaAE5-cysOVA模拟处理(空心方块，虚线)、或用CyaA-E7_49-57(空心三角)、CyaA-E7_Full(空心圆圈)、或CyaA-E7_Δ30-42(空心菱形)处理小鼠。注意到，在第+5天的治疗性试验中，经CyaA-E7_Full和CyaA-E7_Δ30-42处理的动物的生存曲线是完全重叠的。在每种情况中，与未处理的或模拟处理的小鼠比较，显著地增加了重组HPV16-E7 CyaAs处理过的动物的生存期(p＜0.05)。

图6：从晚期生长的肿瘤中所移出的TC-1肿瘤细胞丢失了H-2D^b分子的表达。

在肿瘤排斥试验中，一些经CyaA-E7_Full疫苗接种的动物在试验阶段的晚期生长出了肿瘤(图4，^*)。处死两只动物以移出肿瘤。用FACS分析这些肿瘤细胞(TC-1A1和A2)以及天然TC-1细胞的H-2Db分子的表达水平(黑线)。显示了荧光强度的中位值(MedFi)。显示了用同型物所获得的结果(灰影)。

图7：HPV16-E7_49-57特异性CD8+T细胞在经重组HPV16-E7 CyaAs处理的小鼠体内的存留时间。

处死经CyaA-E7_49-57(A)、CyaA-E7_Full(B)、或CyaA-E7_Δ30-42(C)免疫接种并在试验治疗组的TC-1移植中幸存下来的C57BL/6小鼠，并在存在经照射的同基因的脾细胞时，用1μg/mlCyaA-E7_43-77肽体外再刺激脾细胞5天。用⁵¹Cr释放评价导向裂解(TC-1，实心方块；EL4，空心方块)。数据表示特异性裂解值的中位百分比(每组n＝6)以及四位分数范围。在象限的右上部分显示了用特异性裂解≥20％最大值的效应物与靶细胞的比值所确定的相应动物的数目。

图8：重组HPV16-E7 CyaAs诱导的长期的抗TC-1肿瘤生长的保护作用。

在第100天，给在试验治疗组的TC-1移植中幸存的C57BL/6小鼠重新皮下移植5×10⁴个TC-1细胞。年龄匹配的未处理的小鼠作为对照(A)。显示了最初用CyaA-E7_49-57、CyaA-E7_Full、或CyaA-E7_Δ30-42免疫接种的小鼠中的肿瘤生长(分别为B、C和D)。当肿瘤大小达到1000mm3或每当动物健康状态指示时，处死小鼠。(E)动物的生存曲线(未处理的小鼠，空心方块；或经CyaA-E7_49-57(空心三角)、CyaA-E7_Full(空心圆圈)、或CyaA-E7_Δ30-42(空心菱形)免疫接种并用TC-1细胞再移植的小鼠(移植的日子作为第0天))。在每种情况中，重组HPV16-E7 CyaAs处理过的小鼠的生存时间都比未处理的或模拟处理的小鼠的生存时间明显更长(p＜0.05)。

图9：CyaA-E7_Δ30-42的治疗活性与CpGODN1826佐剂化的CyaA-E7_43-77的治疗活性的比较。

在第0天给C57BL/6小鼠移植5×10⁴个TC-1肿瘤细胞。在第+10和+17天，给小鼠皮内注射10μg HPV16-E7_43-77(n＝5，三角)、1μgCpG-ODN1826(n＝5，方块)、10μg HPV16-E7_43-77+1μg CpG-ODN1826(n＝5、菱形)、10μg CyaA-CysOVA(n＝3，倒三角)、或10μg CyaA-E7_Δ30-42(n＝7，圆圈)处理小鼠。当肿瘤大小达到1000mm3或每当动物健康状态指示时，处死小鼠。

图10：分析CyaA的预先免疫对CyaA-E7_Δ30-42诱导TC-1肿瘤排斥的能力的作用。

(A)不处理C57BL/6小鼠或在第-90或-30天分别给C57BL/6小鼠皮内注射10μg CyaAE5各两次(7天的间隔内)。在第-1天，给动物取血，并用ELISA单个地评价血清中的抗CyaAE5 IgG的存在。结果表示为用绘制对A₂₉₄的稀释度的线性回归分析所计算出的单个抗体的滴度。水平栏表示每组的中位应答。(B)在第0天给未处理的(a、b)、第-30天经CyaAE5免疫接种的(c、d)和第-90天经CyaAE5免疫接种的(e、f)动物皮下移植5×10⁴个TC-1肿瘤细胞，并在第+10和+17天分别用10μgCyaA-cysOVA(a、c、e)或10μg CyaA-E7_Δ30-42(b、d、f)皮内注射各处理1次。插图(b、d、f)是在第0到35天内的严密随诊，以显示出在给予疫苗接种时具有可触及肿瘤的所有动物。每个曲线表示单个动物内的肿瘤生长。当肿瘤大小达到1000mm3或每当动物健康状态指示时，处死小鼠。在每个象限的右上方显示了所处死的动物的数目对所含的动物的总数。

图11：CyaA-HPV16E7_Δ30-42诱导了HHD小鼠体内的CTL应答。

在每个图的上方都显示了对EL4-HHD细胞的肽充填。在下面的表中显示了所注射的CyaA的类型(与HPV16E7或HPV18E7相关)(栏目名为Vacc)和用于体外再刺激的肽(栏目名为Stim)。可以看到，在CyaA-HPV16E7_Δ30-42免疫接种之后，我们能诱导仅仅特异于肽#253的CTL(右侧)。该CTL活性是特异性的，因为经肽#255体外再刺激的脾细胞对肽#253涂层的EL4-HHD细胞没有细胞毒作用(右侧)。针对两种其他的HLA-A2限制性肽的CTL特异性应答的缺乏可能是因为不同的现象：(i)肽#253的免疫显性；(ii)EL4-HHD细胞的蛋白体不能处理肽#255和#258；(ii)#肽258的溶解性差，对此我们必须使用可能对细胞有毒性的乙腈(50％)。最有趣的是，CyaA-HPV18E7_Δ32-42的共注射不会干扰CyaA-HPV16E7_Δ30-42诱导CTL的能力(右侧)。

图12：CyaA-HPV18E7_Δ32-42诱导了HHD小鼠体内的CTL应答。

在每个图的上方都显示了对EL4-HHD细胞的肽充填(peptideloading)。在下面的表中显示了所注射的CyaA的类型(与HPV16E7或HPV18E7相关)(栏目名为Vacc)和用于体外再刺激的肽(栏目名为Stim)。可以看到，在CyaA-HPV18E7_Δ32-42免疫接种之后，我们能诱导仅仅特异于肽#251的CTL(左侧)。该CTL活性是特异性的，因为经肽#257体外再刺激的脾细胞对肽#251涂层的EL4-HHD细胞没有细胞毒作用(左侧)。与HPV16 E7 HLA-A2限制性肽一样，针对HPV-18E7#HLA-A2限制性肽的CTL特异性应答的缺乏可能是因为不同的现象：(i)肽#251的免疫显性；(ii)EL4-HHD细胞的蛋白体不能处理肽#257；(ii)#肽257的溶解性差，对此我们必须使用可能对细胞有毒性的乙腈(50％)。最有趣的是，CyaA-HPV16E7_Δ30-42的共注射不会干扰CyaA-HPV18E7_Δ32-42诱导CTL的能力(左侧)。

图13：pTRACE5-E7HPV18的构建。

图14：pTRACE5-E7ΔHPV16+18的构建。

阐述了质粒制备的3个步骤。

图15：编码下面蛋白的多核苷酸的图示：

CyaA-HPV18E7_Full

CyaA-HPV18E7_Δ32-42

CyaA-HPV16+18E7_Full

CyaA-HPV16+18E7_Δ

图16：携带HPV18E7的重组CyaA诱导了C57BL/6小鼠体内的CTL。

图17：携带HPV18E7的重组CyaA诱导了C57BL/6小鼠体内的CTL。

保藏材料(I-3190和I-3191)包含在大肠杆菌菌株BLR内，其可以生长在Luria Broth(LB)培养基上，并被种植在具有100μg/ml氨苄西林的LB上，以及可以在175rpm的摇晃和照明下、30℃和空气中被孵育。可以在具有7-10％DMSO的LB中保存过夜。

实施例

实施例1

在此我们构建了含有HPV16的E7蛋白的全长序列或该多肽的亚片段(特别是，包括对应于H-2Db限制性表位的残基49-57和HPV16-E7的残基43-98加上1-29的肽)的重组CyaA。我们显示当注射给C57BL/6小鼠时，这些HPV16-E7重组CyaA能诱导特异的CTL和Th1应答，其特点是IFN-γ的分泌。此外，当治疗性测试时，这些构建体能提供最大到100％的抗TC-1细胞的皮下移植物的保护租用。这个研究显示其第一次证实了抗人肿瘤特异性抗原的CyaA所介导的体内的抗肿瘤的治疗活性。

材料和方法

小鼠和细胞系

从CER Janvier(Le Gesnet St-Isle，法国)或Charles River(L′Arbresle，法国)得到无特殊病原体的6到10周大的雌性C57BL/6小鼠。本研究也使用基于C57BL/6背景所繁育的TAP1^-/-(18)、II型MHC^-/-(19)和CD40^-/-(20)。在供应不限量的水和食物的无病原体的条件下，将动物饲养在巴斯德研究所的动物房内。根据研究所的动物处理指南进行涉及动物的试验。

从ATCC获得了表达HPV16 E6和E7蛋白的TC-1细胞(21)和小鼠胸腺瘤EL4细胞(17)。将细胞保持在加有10％热灭活FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.4mg/ml庆大霉素(仅用于TC-1细胞)和5×10^-5M 2-巯基乙醇(Gibco BRL，Cergy-Pontoise，France)的具有谷氨酰胺的RPMI1640中。

肽：对应于HPV16-E7H2D^b限制性表位的合成肽E7_49-57(RAHYNIVTF，氨基酸的单字母密码子)(22)以及对应于具有天然侧向序列的E7_49-57CTL表位和Th表位(黑体)的E7_43-77(GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR)(23)都购自Neosystem(Strasbourg，France)。CpG ODN1826购自PROLIGO(Paris，法国)。

携带有HPV16-E7表位的重组百日咳伯德特氏菌腺苷酸环化酶的构建及纯化。

通过使用编码无酶活性的CyaA的质粒pTRACE5(图1A)的衍生物，在大肠杆菌中表达本文所用的重组腺苷酸环化酶(24)(25)。质粒pTRACE5是百日咳伯德特氏菌CyaA的无酶活性的及细胞毒性的变体的表达载体。它也表达CyaA的翻译后酰化所需的百日咳伯德特氏菌CyaC蛋白。该质粒是以往所述的pTRACG质粒(Gmira et al.，2001，Res.Mic.152：889)的衍生物。通过在位于cyaA DNA序列的5’部分内的EcoRV位点插入六核苷酸CTGCAG获得了该质粒。这造成了在CyaA的催化位点的必需部分内的Asp188和Ile189之间骨架内插入了二肽Leu-Gln(Guermonprez et al.2000，Meth.Enzymol.326：527)。

质粒pTRACE5具有ColE1复制起点以及氨苄西林耐药标记。在该质粒中，cyaC和修饰的cyaA基因都被放置在受λ噬菌体Pr启动子控制下的相同的转录单位内。pTRACE5质粒也编码热敏感的λ抑制子cl⁸⁵⁷，它在低于32℃的温度下强烈地抑制了λPr启动子控制下的基因转录。

将大肠杆菌菌株XL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)用于所有的DNA操作，根据标准方案(Maniatis et al.)进行DNA操作。

CyaA-E7_49-57含有9个氨基酸长的插入于CyaA的密码子224和235之间的多肽序列(RAHYNIVTF)。如下构建CyaA-E7_49-57的表达质粒。两个合成的寡核苷酸(MWG，Courtabceuf，France)：BTP1(5’-CTA GCCGTG CCC ATT ACA ATA TTG TAA CCT TTG GTA C-3’编码链)和BTP2(5’-CAA AGG TTA CAA TAT TGT AAT GGG CAC GG-3’非编码链)被退火并连接到经NheI和KpnI消化过的pTRACE5内。CyaA-E7_Full含有插入到无酶活性的CyaA的相同的224位置中的CyaAHPV16-E7蛋白的全部序列即98个氨基酸的序列。利用特异的引物BTP3(5’-GGG CGC TAGCAT GCA TGG AGA TAC ACC TAC-3’)和BTP4(5’-GGG CGG TACCTG GTT TCT GAGAAC AGA TGG G-3’)从HPV16 DNA中扩增出编码E7蛋白的DNA序列(上面的SeedorfK et al)。用NheI和KpnI消化所形成的PCR产物，并将其连接到经NheI和KpnI解离的pTRACE5内。位于退火寡核苷酸和HPV16-E7的全部序列内的SspI位点容许快速地确定插入突变体。CyaA-E7_Δ30-42含有插入于CyaA的密码子319和320之间的HPV16-E7的头29个氨基酸残基以及插入于CyaA的密码子224和235之间的HPV16-E7的第43到98位残基。两步构建出CyaA-E7_Δ30-42的表达载体。利用合成HPV16-E7基因(最适化用于在大肠杆菌中产生的基因，GTP Technology，Lab ge，France设计)作为靶DNA以及引物PCRBTP5(5’-GGG CAC CGG TAA ACG TAT GCA CGG CGA TAC TCC G-3’)和BTP6(5’-CGT GAG CAT CTG GCT TTC ACT AGT ACG TTT GTTCAG CTG CTC GTA GCA-3’)，扩增出HPV16-E7的第一个DNA编码片段(第1到29位氨基酸残基)。利用pTRACE5作为靶DNA以及引物BTP7(5’-GGG CAC TAG TGA AAG CCA GAT GCT CAC GCG CGG G-3’)和BTP8(5’-AGT ACA TCC GGC GAG AAC-3’)PCR扩增出编码CyaA的密码子320到372的第二个DNA片段。纯化这两个DNA片段(部分重叠的)，并与引物BTP5和BTP8一起在第三个PCR反应中扩增出294bp长的DNA片段。用AgeI和BstBI消化该片段，并将其插入到pTRACE5的相应位点之间，以产生质粒pTRACE5-E7_1-29。然后，利用合成HPV16-E7基因作为靶DNA以及引物BTP9(5’-GGG CGC TAG CGG TCA AGCAGA ACC GGA C-3’)和BTP10(5’-GGG CGG TAC CAG GTT TTT GAGAGC AAA TCG GACAAA CAA TCC CCA GAG TAC CCA TC-3’)PCR扩增出编码HPV16-E7的第43到98位氨基酸残基的DNA片段。用NheI和KpnI消化所纯化的PCR片段，并将其连接到经相同限制性酶消化的质粒pTRACE5-E7_1-29内。

如先前所述的在大肠杆菌菌株BLR(Novagen，Madison，WI)中产生所有的重组腺苷酸环化酶(26)。通过两步方法(包括先前所述的DEAE-琼脂糖和苯基-琼脂糖色谱法)从包涵体中将重组蛋白纯化到接近同质性(图1B)。给苯基-琼脂糖色谱法添加附加的60％异丙醇(20mM Hepes-Na，pH值7.5)的洗涤步骤，以便清除绝大多数的污染的LPS。用试剂盒QCL-1000(Biowhittaker，Walkersville，MD)确定LPS含量。用SDS-gel分析分析纯化的重组蛋白。利用142,000M^-1.cm^-1的分子消光系数从280nm处的吸光度中分光光度计地确定蛋白浓度。

重组HPV16-E7蛋白的构建和纯化。将编码HPV16-E7蛋白的大肠杆菌优化的cDNA(GTP技术)(符合要求的已有的DNA序列)亚克隆到pIVEX2.4b载体(Roche Molecular Biochemicals，Meylan，France)中的NcoI和XhoI限制性位点之间。然后，将所形成的质粒转化到大肠杆菌菌株BL21λDE3(Novagen)内。在0.5mM异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(Euromedex，Souffelweyersheim，France)的诱导下表达His-Tag-HPV16-E7蛋白，并根据产品说明书在Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，Germany)上进行纯化。如上所述的进行异丙醇洗涤(27)以去除LPS污染。

免疫印迹。用SDS-PAGE分离蛋白，并将其电转移到硝酸纤维素膜上(0.45μ，BioRad，Marnes la Coquette，France)，用小鼠单克隆的抗HPV16E7抗体(Zymed，San Francisco，CA)或用在C57BL/6小鼠中所制备的多克隆的抗大肠杆菌BLR血清探针标记硝酸纤维素膜。用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Chemicon，Temecula，CA)检测免疫复合物，并用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/四唑氮蓝(BCIP/NBT)(Sigma，St.Louis，MO)显像。

小鼠免疫接种和肿瘤排斥试验。经静脉内注射50μg稀释在PBS(Gibco BRL)中的对照或HPV16-E7重组CyaA一次、或皮内注射(每种10μg)两次对动物进行免疫接种。在耳部真皮处进行皮内注射(47)。对于体外分析，在注射后7天，对经戊巴比妥化的动物(CO₂)进行脾切除术，除了分析长期持续应答外，其中在注射后3个月进行该操作。对于肿瘤排斥试验，小鼠皮下接受了5×10⁴个TC-1细胞，并在肿瘤接种后1天、5天或10天接受HPV16-E7重组CyaA的处理。用测径器监测TC-1肿瘤生长，并用公式V＝(L×w²)/2(L为长径；w为宽径)(48)进行计算，单位为立方毫米。

体外细胞毒性检测。在存在同基因的经照射的纯真

脾细胞时，在5天内用1μg/ml E7_49-57或E7_43-77肽在完全培养基(加有10％热灭活FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、和5×10^-5M 2-巯基乙醇(GibcoBRL，Cergy-Pontoise，France)的具有谷氨酰胺的RPMI1640)中体外刺激来自免疫小鼠的脾细胞。在5-h⁵¹Cr释放检测中，用TC-1细胞测试这些效应细胞的细胞毒活性。如下进行放射性标记：用胰蛋白酶快速地处理培养在7.5％CO₂气体和37℃下的指数生长的TC-1细胞，并在37℃下与100μCi⁵¹Cr一起孵育1h。使用不同的E∶T比值，所有的检测都进行两次。测定每个孔的上清液中所释放处的放射性。特异裂解的百分比被计算为100x(试验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。通过往靶细胞内添加10％TritonX-405获得了最大释放，通过将靶细胞单独地孵育在完全培养基中获得了自发释放。当在最高E∶T比值时观察到了至少20％特异释放时，认为小鼠是应答者。结果表示为每组的应答小鼠的中位的四位分数范围。

分泌细胞的单个产IFN-γ细胞酶联免疫斑检测。用每ml 4μg兔抗小鼠伽马干扰素(IFN-γ)抗体(克隆R4-6A2；PharMingen，San Diego，CA)室温下涂层多栅极过滤板(96孔，Millipore，Molshein，France)过夜。然后用完全培养基洗涤并封闭板。往孔内与5×10⁵个经γ射线照射的(2,500rads)同基因的喂养细胞一起加入序列的两倍稀释的免疫小鼠的脾细胞。将细胞与1μg/ml E7_49-57肽或不与1μg/ml E7_49-57肽一起孵育36个小时。在充分洗涤之后，通过与每1ml 5μg生物素化的兔抗小鼠IFN-γ抗体(克隆XMG1.2；PharMingen)孵育，以及随后的与抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(PharMingen)的孵育将板显像。最后用BCIP/NBT作为底物，将斑点显像。通过计数每孔内的斑点形成细胞(SFC)的数目确定产IFN-γ细胞的数目(Bioreader，Karben，Germany)，并且结果被表示为每脾的总的SFC数(17)。

酶联免疫吸附检测(ELISA)。在30天或90天后，给经空载体CyaAE5皮内免疫接种的小鼠放血，并用ELISA测定单只小鼠血清的抗体应答。用PBS中的空载体CyaAE5(3μg/ml)涂层微量板(Nunc，Roskilde，Denmark)过夜。在PBS-tween 20(0.1％)中洗涤之后，往孔内加入稀释血清，并在37℃下孵育1小时。在PBS-tween 20中洗涤之后，将板与山羊抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma)在37℃下一起孵育1个小时。用o-邻苯二胺和过氧化氢(Sigma)显像板。用硫酸终止反应，并用ELISA读数器(Dynatech，Marnes la Coquette，France)在492nm处分析板。结果被表示为经绘制稀释度对A492的线性回归分析所计算出的抗体滴度。滴度被计算为给出两倍于稀释1/100的对照血清的吸光度的最大稀释度的log10值。

细胞因子产生。在完全培养基中，用10μg/ml His-Tag-HPV16-E7蛋白或1μg/ml E7_43-77肽在体外刺激来自免疫小鼠的脾细胞72个小时。如先前所述的(28)通过三明治酶联免疫吸附检测法(ELISA)确定培养上清液中的IFN-γ和IL-5产量。用相应的重组小鼠细胞因子(Pharmingen)将所有检测标准化。

FACS分析。如其他地方所述的(29)处理TC-1细胞，利用特异的FITC缀合的单克隆抗体(克隆KH95，Pharmingen，Le Pont de Claix，France)用流式细胞术分析TC-1细胞的I型MHC分子H-2D^b的表达。

统计学分析。考虑到不同样品的小样本量，利用软件StatXact4(Cytelcorporation，Cambridge，MA)施用了非参数的统计学检验(30)。用Prism软件(GraphPad SoftwareInc.，CA)绘制出了生存曲线，并用软件中的built-in logrank检验进行比较。p＜0.05认为数据具有显著差异。

结果

具有HPV16-E7表位的重组腺苷酸环化酶的构建和表征。为了研究CyaA诱导HPV16-E7特异性T细胞应答的能力，我们构建了3种不同的重组分子。CyaA-E7_49-57含有9个氨基酸长的对应于先前所述的插入于无酶活性的(因此无毒的)CyaA的密码子224和235之间的H-2D^b限制性CTL表位(22)的多肽序列(RAHYNIVTF)。CyaA-E7_Full含有插入到无酶活性的CyaA的相同的224位置中的CyaAHPV16-E7蛋白的全部序列(98个氨基酸)。CyaA-E7_Δ30-42含有插入于CyaA的密码子319和320之间的HPV16-E7的头29个氨基酸残基以及插入于CyaA的密码子224和235之间的HPV16-E7的第43到98位残基。为了容许体外和体内检测，产生CyaA构建体并将其纯化到同质性(图1B)。在纯化方案(26)中引入LPS清除步骤以便获得含有每50μg小于100单位的内毒素的重组蛋白。通过利用特异性单克隆抗体(Zymed)的Western印迹法验证E7蛋白在CyaA-E7_Full和CyaA-E7_Δ30-42中的存在(图1C)。相反地，抗HPV16-E7抗体不能识别近含有H-2Db限制性表位的CyaA-E7_49-57。3种重组CyaA的总体生化性能没有被修改，这些分子显示出与野生型腺苷酸环化酶相似的溶血活性(17)。

HPV16-E7重组CyaA的免疫接种诱导了E7特异性CTL应答。为了测试CyaA是否能诱导抗HPV16-E7表位的CTL应答，用50μg不同的HPV16-E7重组CyaA静脉内免疫接种C57BL/6小鼠一次。收集脾细胞，并在体外用1μg/ml E7_43-77肽刺激脾细胞。在5天后，用⁵¹Cr释放检测法确定脾细胞裂解TC-1细胞的能力。如图2A所示，用HPV16-E7重组CyaA单次静脉内免疫接种C57BL/6小鼠诱导出了强烈的及特异的抗TC-1细胞的CTL应答。与仅含有最小的H-2Db限制性位点(图2A，a)的CyaA-E7_49-57所诱导的CTL活性比较，含有全长HPV16-E7蛋白的CyaA(图2A，b)或其缺失形式CyaA-E7_Δ30-42(图2A，c)的免疫接种造成了更高的最大CTL活性，尽管从我们的数据中，我们无法证实统计学显著性。当肽E7_49-57被用于体外再刺激时，也获得了相似的结果(数据没有显示)。来自经携带有无关表位(OVA_257-264)的重组CyaA免疫接种的小鼠并在体外经1μg/ml E7_43-77肽再刺激的脾细胞只产生了弱的非特异性的TC-1细胞裂解(图2A，a)。先前已经显示出，CyaA在体内将OVA CD8+细胞表位(SIINFEKL)转运到I型MHC分子是依赖于TAP1功能(15)。我们测试了应用CyaA-E7_Δ30-42是否也是如此。如图2A，d所示的，来自静脉内疫苗接种的TAP^-/-小鼠的体外刺激的脾细胞不能裂解TC-1细胞。我们也测试了含HPV16E7的重组CyaA在体内引发CTL应答是否需要CD4+T细胞的辅助。与早期观察(15)一致，我们观察到利用CyaA-E7_Δ30-42对II型MHC^-/-小鼠的静脉内疫苗接种诱导了高水平的特异的针对TC-1细胞的CTL应答(图2A，e)。相反地，我们在这个模型中观察到了与CD40信号传导的一些依赖性，因为我们在CD40^-/-小鼠中观察到了低水平的针对TC-1细胞的CTL应答(图2A，f)。

为了在体外评估经重组CyaA免疫接种的小鼠中的HPV16-E7特异性脾细胞的频率，用酶联免疫斑点法(ELISPOT)定量出了应答于HPV16-E7_49-57的体外刺激的产IFN-γ的细胞数目。图2B显示了从经CyaE5-CyaOVA免疫接种的小鼠和从那些经CyaA-E7_49-57免疫接种的小鼠中获得的特异地产IFN-γ的脾细胞数目只有很小的差异。相反地，在经含有全长HPV16-E7蛋白或其缺失形式的HPV16-E7重组CyaA疫苗接种的小鼠中获得的产IFN-γ的脾细胞的数目明显更多(p＜0.05)。所观察到的应答是表位特异的，因为在没有HPV16-E7_49-57肽刺激时，这些小鼠中只有很少的脾细胞产IFN-γ(图2B)。这些结果说明CyaA在体内能将HPV16-E7蛋白免疫线性的CD8+H-2Db限制性T细胞表位转运到免疫活性细胞的细胞胞质溶胶内，进行加工并呈递到I型MHC途径中，以便引发强烈的CTL应答。根据先前的观察(25、31)，我们确信CyaA能耐受大的多肽片段的插入，因为携带有全长HPV16-E7蛋白或其缺失和倒位形式的CyaA也能诱导强烈的CTL应答。我们的数据证实这些后面的分子在小鼠中诱导出了显著更高频率的HPV16-E7_49-57特异性应答。

HPV16-E7重组CyaA的免疫接种诱导了HPV16-E7特异的Th1应答。Th1应答在抗细胞内病原体和肿瘤发生方面发挥着重要作用(32、33)。我们因此表征了HPV16-E7重组CyaA所诱导的T细胞应答的类型。用50μg的三种不同的HPV16-E7重组CyaA静脉内免疫接种C57BL/6小鼠1次，在用10μg/ml纯化的His-Tag HIV16-E7蛋白在体外刺激脾细胞之后，确定细胞因子的合成。如图3所示，用携带有全长HPV16-E7蛋白的CyaA或其缺失形式的免疫接种造成了Th1样特征谱，其特点是高水平IFN-γ的产生以及缺乏可检测到水平的IL-5。这个应答是特异的，因为在CyaA-E7_Full或CyaA-E7_Δ30-42免疫接种后所获得的IFN-γ水平比那些在用CyaAE5-CysOVA模拟免疫接种的小鼠中所获得的IFN-γ明显更高(p＜0.05)。但是，从用CyaA-E7_49-57免疫接种的小鼠中获得的脾细胞却没有出现这种情况。当用1μg/ml E7_43-77肽进行再刺激时得到了相似的结果(图3A，插图)。

综上所述，这些结果表明，在我们的条件下，CD4+T细胞在分泌IFN-γ方面起到了重要作用，因为用携带有含有II型H-2b限制性T细胞表型的全长HPV16-E7蛋白的CyaA所获得的IFN-γ水平药明显高于用仅含有I型H-2Db限制性表位的CyaA-E7_49-57所获得的水平。

HPV16-E7重组CyaA的免疫接种诱导了已建立的表达HPV16的肿瘤的消退。考虑到所获得的强烈的免疫应答，我们然后在临床前模型中体外评价了HPV16-E7 CyaA的治疗活性，所述治疗前模型包括表达HPV16-E6和E7蛋白的H-2b致癌性细胞系(TC-1细胞)，给C57BL/6小鼠皮下注射所述细胞系。在这个模型中，先前已经显示肿瘤排斥是由E7_49-57特异性CD8+T细胞所专一地介导的(21、22、34、35)。因此，在C57BL/6小鼠的右侧腹上皮下注射5×10⁴个TC-1细胞，并在1、5、或10天后给小鼠静脉内注射50μg CyaAE5-HPV16-E7_49-57、-E7_Full、或-E7_Δ30-42。图4表示在肿瘤移植10天之后的治疗性处理后的小鼠体内的肿瘤生长。值得注意的是，在这样的条件中，到给予疫苗接种时，100％的动物都发生了可触及的肿瘤。为了避免不必要的痛苦，当肿瘤大小达到1000mm³时，处死动物。所有未处理的动物以及用模拟CyaAE5-CysOVA处理的动物都在最大49天内发生了这样大小(＞1000mm³)的肿瘤。极为相反的是，绝大多数经HPV16-E7重组CyaA处理过的动物在整个试验期间仍是无肿瘤的(图4C、D、E)。图5显示了经TC-1细胞移植的动物的生存的曲线，并代表三种不同的治疗方案，其中在TC-1移植后的第1、5或10天注射重组CyaA。未处理的或模拟处理的动物的中位的生存时间是在31到40天之间。相反地，经携带有HPV16-E7抗原的CyaA疫苗接种的小鼠的生存时间要显著地优于对照动物的生存时间(p＜0.05)。可以建立不同构建体的保护活性的差异，尽管没有统计学显著性，因为不同样品的小样本量。尽管CyaA-E7_49-57和-E7_Full所实现的肿瘤消退的速度没有显著差异，但是CyaA-E7_Δ30-42在肿瘤消退和生长抑制方面都要明显地更为优越，因为在所有的三种治疗方案中，保护率移植都高于90％。

一些经CyaA-E7_49-57和CyaA-E7_Full疫苗接种的动物表现出在试验阶段的晚期生长肿瘤(图4(^*)以及数据没有显示)。要记住，这种现象反映出了肿瘤逃逸的机制，我们从这些动物中移出所生长的肿瘤，并用FACS分析这些名为TC-1 A1和TC-1 A2的细胞系的H-2D^b表达。如图6所示，与它们的天然副本比较，来自晚期生长肿瘤的TC-1 A1和A2细胞已经丢失了H-2D^b的表达，因此最可能的是使得它们不能检测到E7_49-57特异性CD8+T细胞。因为，TC-1细胞在体内生长在没有抗生素选择压力的环境中，我们也用Western印迹法检查了TC-1 A1和A2细胞中的HPV16-E7的表达。我们没有发现TC-1和TC-1 A1和A2细胞之间表达这种蛋白没有任何差异(数据没有显示)。

综上所述，这些结果证实了腺苷酸环化酶载体作为用于诱导临床前模型中的表达HPV16的肿瘤的消退的合适的治疗疫苗的效力。

我们测试了另一种临床相关的注射途径。因此，从TC-1移植10天后开始，在7天间隔内给小鼠皮内注射10μg CyaA-E7_Δ30-42两次。有趣的是，与所有未处理的和模拟处理的动物发生肿瘤一样，我们在所有经CyaA-E7_Δ30-42处理过的动物中都观察到了肿瘤消退(图4B，a、b)。这种治疗性免疫接种造成了CyaA-E7_Δ30-42处理过的小鼠在90天时100％生存，其中未处理的和模拟处理的动物的中位生存时间分别时30和32天(图4c)。

CyaA免疫接种所诱导的HPV16-E7_49-57特异性CD8+T细胞的长期存留。为了评价HPV16-E7重组CyaA诱导的免疫应答的存留时间，处死在3个月后仍存活的来自治疗试验组的小鼠，并用1μg/ml E7_43-77肽在体外刺激脾细胞5天。然后用⁵¹Cr释放检测法确定脾细胞裂解TC-1细胞的能力。如图7所示，证实了3个月前免疫接种的动物的脾细胞仍具有针对HPV16-E7_43-77肽的特异性CTL应答。根据效应细胞∶靶细胞比值为30∶1时的特异裂解的最大百分比，经CyaA-E7_Δ30-42处理过的动物体内的免疫应答表现得更为强烈，尽管从这些数据中没有证实具有统计学显著。为了评价这些长期免疫原性的生理学相关性，用5×10⁴个TC-1细胞在第100天重新攻击所剩余的动物。在这些条件下，所有纯真的年龄匹配的对照动物都发生了肿瘤并显示出了37.5天的中位生存时间(图8)。相反地，3个月前经HPV16-E7重组CyaA免疫接种的小鼠被非常明显地保护避免了肿瘤发生。如上面所观察到的那样，经CyaAE5-HPV16-CyaA-E7_Δ30-42疫苗接种的动物表现出高水平的保护作用。但是，与在第一组治疗试验中所获得的结果不同的是，现在在用CyaA-E7_49-57处理过的动物和CyaA-E7_Full处理过的动物的保护作用之间有着显著的差异，并有利于后者，尽管样品的小样本量不容许明确地证实具有统计学显著性。这些观察说明在这个模型中，携带有全长HPV16-E7蛋白的CyaA所提供的T细胞辅助对于有效的长期持续存在的抗TC-1细胞的应答是重要的。

综上所述，我们的结果证实单次静脉内注射50μg具有HPV16-E7蛋白的辅助表位(DRAHYNIVTF)的重组CyaA足以诱导长期的E7_49-57特异性CD8+T细胞，它们能在至少6个月内的时间段内赋予抗两种TC-1肿瘤细胞攻击的保护作用。

CyaA-E7_Δ30-42的治疗效果与经CpG-ODN1826施用的肽的治疗效果的有利比较。为了更好的评价CyaA作为抗原转运系统的能力，我们比较了CyaA-E7_Δ30-42的治疗效果和补充CpG-ODN1826(37)的HPV16-E7_43-77肽的治疗效果。给小鼠皮下注射5×10⁴个TC-1细胞，并在10天和17天后经皮内途径注射10μg CyaA-E7_Δ30-42或10μg HPV16-E7_43-77肽和施用1μg CpG-ODN1826治疗性处理小鼠。两组中的生存率相似(图9)，尽管用CyaA-E7_Δ30-42所获得的结果稍微更好，但是与用HPV16-E7_43-77肽联合CpG-ODN1826所获得的结果没有统计学显著性。值得注意的是，这个结果是用比CyaA-E7_Δ30-4250倍更多的HPV16-E7_43-77肽所获得的结果(基于摩尔值而言)。当单独使用时，肽HPV-E7_43-77肽对TC-1肿瘤生长没有作用。

先前的对CyaA载体的免疫力边缘地影响了CyaA-E7_Δ30-42的治疗效果。在临床情况中，可能必须给予具有病灶的患者多次强化免疫，以便获得足够多的细胞免疫应答。因此证实对CyaA的预先免疫力不会损害其触发肿瘤排斥的能力是必要的。为了达到这个目的，我们在给小鼠皮下注射5×10⁴个TC-1细胞前90天或30天，在7天的间隔内给免疫小鼠皮内注射10μg空载体CyaAE5两次。在第10天，在7天的间隔内两次皮内注射10μg CyaA-E7_Δ30-42进行治疗性处理。对抗体应答的分析显示经空载体免疫接种的小鼠在注射TC-1注射时对于CyaA是有免疫力的(图10A)。我们然后比较了CyaA-E7_Δ30-42诱导年龄匹配的纯真动物和CyaA免疫动物中的肿瘤排斥的能力。无论它们对CyaA的免疫状态如何，经CyaA-E7_Δ30-42处理过的大多数小鼠在整个试验中仍是无肿瘤的(图10B)。在第-30天免疫小鼠组中仅有1只动物以及在第-90天免疫小组中仅有2只动物发生了肿瘤(图10Bb、d、f)。相反地，100％模拟处理的动物都发生了肿瘤，并将其处死(图10B，a、c、e)。我们没有观察到抗CyaA抗体滴度水平与TC-1肿瘤的发生之间的任何相关性(数据没有显示)。此外，CyaA-E7_Δ30-42处理的小鼠的生存曲线(图10B，b、d、f)没有统计学差异(p＝0.324)。

这些数据因此说明原有的对CyaA的免疫力对该载体随后诱导有效的抗外来的给予抗原的应答的能力上只有非常有限的作用。

讨论

先前的研究已经证实了来自百日咳伯德特氏菌的腺苷酸环化酶是在体内将CD4+和CD8+T细胞表位转运到树突状细胞的II型和I型MHC呈递途径的有力工具。在试验的小鼠模型中，已经用这个系统触发了有效的Th1和CTL应答，这提供了抗病毒的和抗肿瘤的保护作用(36)。作为对CyaA在人类中用于治疗HPV16相关性宫颈癌的潜在应用的评价，我们持续地证实了该载体在体内有效地转运来自HPV16的E7蛋白的表位。

我们构建了各种HPV16重组CyaA，其含有HPV16的全长E7蛋白或该多肽的亚片段，具体地包括对应于第49到57残基的H-2D^b限制性最小CTL表位。我们表明当给C57BL/6小鼠注射这些不同的重组蛋白时，它们能触发特异的和强的CTL应答。我们的数据验证了CyaA对CTL表位的转运要求完整功能的I型呈递途径，因为我们在给TAP^-/-小鼠(15)注射CyaA-E7_Δ30-42后不能触发CTL。CyaA所介导的CTL触发不依赖于CD4+T细胞的存在，因为在II型MHC^-/-小鼠中所获得的有效的CTL应答与先前的结果(15)相同。当考虑到对表现为变更了CD4+T细胞数目的免疫抑制或免疫缺陷的患者的疫苗接种时，CyaA作为疫苗载体的这个特点是非常重要的。但是，在CD40^-/-小鼠中所获得的低CTL应答说明了CTL触发部分地依赖于CD40信号传导。这些观察说明HPV16-E7重组CyaA通过对专职APC的直接刺激直接引发了I型MHC限制性CTL。但是，需要CD40-CD40L相互作用以便获得最佳的CTL应答的触发。

我们比较了HPV16-E7的最小H-2Db限制性CTL表位与可能含有所述的辅助表位DRAHYNIVTF(37)等的全长或Δ30-42的E7蛋白的免疫原性。CyaA-E7_Full和CyaA-E7_Δ30-42所诱导的CTL触发以及HPV16-E7-特异性脾细胞的频率都要优于仅携带有CTL表位E_49-57的CyaA-E7_49-57所诱导的。这些观察说明CyaA对CTL和Th表位的同时转运造成了更为强烈的CTL应答。这与先前发表的在其他模型的临床前(37)和临床水平(38)的数据一致。通过分析经重组His-Tag-HPV16-E7蛋白或E7_43-77肽在体外再刺激的HPV16-E7特异性脾细胞所产生的细胞因子再次验证了重组CyaA对HPV16-E7 Th表位的转运。事实上，我们仅仅在经含有Th表位的重组HPV16-E7 CyaA疫苗接种的小鼠中观察到了IFN-γ的特异合成。在用CyaA-E7_Full和CyaA-E7_Δ30-42静脉内免疫接x种一次后我们所观察到的高水平的IFN-γ和未分泌IL-5所表征的常见的Th1特征谱揭示了该载体用于肿瘤免疫治疗的可能作用。

在于皮下建立的致癌TC-1细胞(21)的肿瘤排斥模型中检验了这一点。根据我们的证实了HPV16-E7重组CyaA的免疫原性的数据，我们观察到这些重组蛋白能诱导已建立的TC-1肿瘤的消退。在90天内的生存率上，CyaA-E7_Δ30-42要优于CyaA-E7_49-57和CyaA-HPV16-E7_Full。当携带有全长和Δ30-42 E7蛋白的CyaA在CTL触发能力、HPV-E7_49-57特异性脾细胞的频率和IFN-γ的产量方面产生了相当的结果，我们预计CyaA-E7_Full在生存率方面要优于CyaA-E7_49-57。最可能的，更多数目的试验动物有助于除外这种表观偏差。然而，在此将讨论关于CyaA的生化化学的两个方面。首先，CyaA的224-235区域内的带负电荷的氨基酸的存在表现出抑制了CyaA的催化区在真核细胞的胞质溶胶内的转运(39)。在这个方面，酸性的E7蛋白(pKi＝4.17)可能妨碍了CyaA的N末端区向DC的细胞质溶胶内的有效转运。已经特异地设计出CyaA-E7_Δ30-42以去除一段位于第30到42位残基(DSSEEEDEIDGPA)之间的带负电荷的氨基酸，以便有助于其被转运到DC内，此外在所插入的HPV16-E7的N末端区的每一侧都引入两个带正电荷的氨基酸(KR)。其次，Gmira et al.(25)已经证实被插入到CyaA内的异源蛋白的未折叠对于容许重组蛋白被内吞到靶细胞内是必需的。将E7多肽的两种不同的片段插入到CyaA-E7_Δ30-42的两个不同的许可位点可以阻止E7折叠，并因此有助于它们被转运到靶细胞内。

在肿瘤排斥试验的过程中，一些小鼠在先前已经排斥了已建立的TC-1肿瘤之后晚期开始生长HPV16阳性的肿瘤。FACS分析发现来自这些肿瘤的细胞不表达H-2D^b分子。这个观察形成了看法，即重组CyaA疫苗接种的同源强化能更显著地清除肿瘤细胞并经逃逸机制阻止肿瘤复发。根据本领域其他团队的数据(37、40、41)，将所注射的重组HPV16-E7CyaA的总量提高到100μg(即0.56纳摩尔)与小鼠中的强化CyaA疫苗接种有关。进行了打算检验后一观察的试验以及其他的检验不同的CyaA使用的方式的试验。

在用TC-1细胞再次攻击之后，选择性保护了经HPV16-E7重组CyaAs免疫接种的幸存小鼠。这与这些动物的脾细胞中的HPV16-E7_49-57CD8+T细胞的存在有关。这个观察强化了一个事实，即在图4中所观察到的晚期复发是因为肿瘤逃逸机制而不是针对E7蛋白的免疫力减弱。经含有Th表位的重组CyaA免疫接种的小鼠的更好的生存率说明提供抗相同抗原的T细胞辅助也造成了HPV16-E7_49-57CD8+T细胞的有效召回。在这个方面，已经提出CD4+T细胞通过CD40L可以在效应CD8+T细胞上印迹上独特的分子信号，赋予了它们提高细胞功能的能力(42)。

在用于测试用于治疗HPV相关性肿瘤的新的免疫治疗的验证模型(21)中，我们已经证实了CyaA是诱导已建立肿瘤消退的有效载体，并提供了很长一段时间的抗致癌性攻击的保护作用。与其他现在研发的方法(11)不同，基于CyaA的免疫治疗排除了选择HLA限制性表位作为所插入的全长蛋白的需要，并避免了病毒载体和/或潜在致癌的HPVDNA序列的应用。此外，我们利用含有被插入到CyaA的两个不同许可位点的HPV-E7的两个亚片段的CyaA获得了最佳的结果。

后者构建体包括在文献(8、46)中所述的所有HPV16-E7 I型和II型HLA表位的事实强化了CyaA-E7_Δ30-42在疫苗应用中的选择性。

根据在此所示的数据，我们计划在导向与HPV感染相关的宫颈和肛门不典型增生的临床试验中检验含有HPV16-E7的CyaA的效力。

实施例2

本实施例的目的是制备导向HPV16和HPV18 E7蛋白的二价治疗性疫苗，以便治疗人体中的HPV16和HPV18相关性恶性肿瘤。因此已经设计、构建、产生并纯化了名为CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42和CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42的疫苗侯选物。HHD小鼠是H-2D-/-β2m-/-双敲除小鼠，其表达包括与H-2D^b(D)的α3跨膜区和细胞质溶胶区相连接的HLA^*0201的α1(H)和α2(H)区的HHD转基因，其中α1区与人β2微球蛋白相连接。因此，HHD小鼠所表达的唯一的I型MHC分子是修饰的HLA^*0201分子(Pascolo et Lemonnier)。本试验的目的是验证：

1.重组CyaA能转运HPV16和HPV18 E7蛋白的HLA-A2限制性表位。

2.一种HPV重组cyaA对另一种cyaA没有免疫显性的现象。

为了达到这一点，用50μg CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42(3只小鼠)、CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42(3只小鼠)静脉内免疫接种HHD小鼠、或用CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42+CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42(5只小鼠)的相同的(眶后的)注射液(50μg，200μl)进行免疫接种。7天后，用在文献中所述的或从SYFPEITHI软件中所估计到的来自HPV16E7或HPV18E7的HLA-A2肽在体外再刺激所收集的脾细胞。

在5天后用⁵¹Cr释放检测CTL活性。靶细胞是装备或没有装备不同的相关肽的HHD-EL4细胞。

结果显示，在自体肽的体外再刺激之后，用CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42或CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42诱导了装备有HPV16E7或HPV18E7肽的EL-HHD细胞的特异性裂解。

这个结果也证实，CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42和CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42一起的共注射不会减弱任一HPV重组CyaA的免疫原性，如所观察到的对相关肽的相似的应答一样。

这个结果证实，CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42和CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42能在体内诱导针对相应E7蛋白的人HLA-A2限制性表位的细胞毒性应答。

小鼠

将无特异病原体的HHD小鼠饲养在巴斯德研究所。11只6到10周大的雄性小鼠被用于本试验。

试剂和生物学材料

试剂和缓冲液

RPMI 1640培养基-谷氨酰胺(invitrogen GIBCO，编号6187010)

70度乙醇(Prolabo，编号MC311631)

青霉素-链霉素(invitrogenGIBCO，编号15140122)

胎牛血清(FBS)(PERBIO，编号CH30160.03)

β巯基乙醇(BIO-RAD，编号161-0710)

热解水

台盼兰(SIGMA，T-8154)

⁵¹Cr

Trilux Scintillant(Wallac)

肽

在⁵¹Cr释放检测之前，用5种合成肽(Neosystem，Strasbourg，France)进行对脾细胞的体外刺激：

-E7_11-20(YMLDLQPETT，氨基酸的单字母密码子，#253)，对应于HPV16-E7 HLA-A2限制性表位(1)

-E7_82-90(LLMGTLGIV，#258)，对应于HPV16-E7 HLA-A2限制性表位(1)

-E7_86-93(TLGIVCPI，#255)，对应于HPV16-E7 HLA-A2限制性表位(1)

-E_77-15(TLQDIVLHL，#251)，对应于SYFPEITHI软件所预测的HPV18-E7 HLA-A2限制性位点

-E_78-64(FQQLFLNTL，#257)，对应于HPV18-E7 HLA-A2限制性表位(2)。

肽已经被按1mg/ml溶解在无菌的、无致热原的水(#253、255、251)中，或者溶解在无致热原的水、0.1M NaHCO₃、a乙腈(50/50)(#257和258)中。

重组腺苷酸环化酶(CyaA)

在这个试验中测试了两种CyaA：

-CyaAE5-HPV 16-E7_Δ30-42

-CyaAE5-HPV 18-E7_Δ30-42

通过利用编码无酶活性的CyaA(CyaAE5)的质粒pTRACE5的衍生物可以在大肠杆菌中表达这些CyaA。如在实施例中所述的关于携带有HPV16-E7表位的百日咳伯德特氏菌腺苷酸环化酶的构建和纯化一样，进行质粒构建、所有重组蛋白的生产和纯化，但是所述重组蛋白具有用于被试验的表位。

在静脉内施用给小时之前，将分别含有1.22mg/ml和1.33mg/ml CyaA的8M尿素溶液的储备溶液(储存在-20℃)融化并用PBS(Gibco BRL)稀释为250μg/ml。尿素的终浓度因此分别为1.6和1.5M。

细胞系

在⁵¹Cr CTL检测中，用细胞系EL4-HHD细胞作为靶细胞。

这些细胞被保持在完全培养基中：加有10％热灭活的FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、和5×10^-5Mβ2-巯基乙醇(Gibco BRL，Cergy-Pontoise，France)的RPMI 1640以及谷氨酰胺。

方法

小鼠免疫接种

通过0.3ml胰岛素注射器(Terumo)，用CyaAE5-HPV16-E7_Δ30-42或CyaAE5-HPV18-E7_Δ30-42的单次静脉内(眶后)注射液(50μg，200μl)免疫接种清醒动物。

试验计划

表1显示了施用给每组小鼠的疫苗侯选物和治疗。

表1.试验组定义：CTL诱导

CTL的诱导(CTL检测)
			小鼠数目	CyaAE5	免疫剂量/体积/尿素浓度
3	CyaAE5-HPV16-E7Δ30-42	50μg/200μl/1.6M
			3	CyaAE5-HPV18-E7Δ30-42	50μg/200μl/1.5M
5	CyaAE5-HPV16-E7Δ30-42和CyaAE5-HPV 16-E7Δ30-42	每种50μg/200μl/3.1M

CTL检测

为了在体外评价免疫接种所诱导的细胞免疫应答，在免疫接种7天后，对被麻醉的小鼠(CO₂)进行了脾切除术。在CTL检测之前，收集每组的脾细胞。

-CTL的刺激(每脾制备2瓶T25)

从脾中取样，并将其在RPMI1640-Glutama x1％Ab中压碎。

倒出

1200rpm下离心10分钟

将细胞重悬在2ml RPMI1640-Glutamax-1％Ab-10％FCS-5×10^-5Mβ2巯基乙醇(完全培养基，CM)

在每个瓶内，放入：

10ml CM；

5×10⁷个效应细胞；

终浓度为10μg/ml的相关肽

在不移动瓶的条件下，孵育5天。

细胞毒性检测

1/靶细胞：

在此之前，将靶细胞稀释1/3或1/2，以便收集指数生长的靶细胞将其转移到15ml试管内；

1200rpm下离心10分钟

将其重悬在1ml RPMI1640-1％Ab中

计数

制备两管：一管具有肽，而另一管没有肽

将其重悬在150μl：

其中一管中的肽(50μmol)

每3×10⁶个细胞具有100μCi⁵¹Cr

培养基最多到150μl

在37℃的水箱中孵育1个小时，每15分钟轻轻地摇晃一次。

2/效应细胞

用巴斯德吸管去除5ml上清液

通过吸液充分地重悬细胞

1200rpm下离心10分钟

重悬于1ml CM中，计数

调整为10⁷个细胞/ml

稀释以便获得下面的效应物/靶细胞比值：200/1、100/1、50/1、25/1、12/1、6/1

按每孔100μl分配到U型底微量板内

在37℃、5％CO₂下孵育，同时完成靶细胞的制备

3/检测

用10ml RPMI1640-1％Ab洗涤靶细胞

用10ml CM再次洗涤

将其重悬在2ml CM中

计数

调整为10⁵个细胞/ml

按每孔100μl分配

制备6个孔，用于自发性释放(调整为100μl CM)

制备6个孔，用于最大释放(加入100μl 20％Triton X-405)

在37℃、5％CO₂下孵育4到5个小时。

4/计数

在2000rpm下离心5到10分钟

将100μl Trilux scintillant放入到松软的P96微量板内

取样50μl上清液，并将其转移到松软板中

用塑料薄膜胶带密封微量板

在后面的日子里，用wallac计数器进行计数

HPV16E7CTL特异性应答

图11显示了CyaA-HPV16E7_Δ30-42所诱导的CTL应答。

HPV18E7 CTL特异性应答

图12显示了CyaA-HPV18E7_Δ32-42所诱导的CTL应答。

结论

CyaA-HPV16E7_Δ30-42和CyaA-HPV18E7_Δ32-42都能在该嵌合的HHD模型中诱导出特异的针对相应的HLA-A2限制性肽的CTL。

共注射CyaA-HPV16E7_Δ30-42和CyaA-HPV18E7_Δ32-42不会干扰每种CyaA诱导抗相应的特异的HLA-A2限制性肽的CTL的能力。这说明一种构建体对于另一种构建体没有免疫线性的现象。这构成了关于制备二价疫苗的策略的关键性的观察。

实施例3

对含有来自HPV18的E7蛋白和来自HPV16及HPV18的E7蛋白的重组腺苷酸环化酶的构建及免疫学评价

肛门生殖道的癌症占所有女性癌症的近12％，这使得宫颈癌(CxCa)成为全世界范围内的第二常见的妇科癌症。通过流行病学研究随后确认了人乳头瘤病毒(HPV)感染可能是CxCa的致病因素的重要发现。于CxCa相关的最为显著的HPV类型是HPV16和HPV18(分别是55％和12％的发生率)(Clifford，2003)。为了覆盖更大的人群，决定构建代谢有来自HPV16和HPV18的二价的治疗性疫苗。已经测试了两种可能的策略：(i)第一种是混和等摩尔量的两种一种携带有来自HPV16的E7以及另一种携带有来自HPV18的E7的重组CyaA；(ii)第二种方法是构建携带有来自HPV16和HPV18的两种E7蛋白的重组CyaA。本报告描述了携带有来自HPV18的E7或来自两种病毒的E7的重组CyaA的构建。在CTL检测中测试了构建体的免疫原性。

表位鉴定

HPV18E7的氨基酸序列被缩减成SYFPEITHI(www.syfpeithi.De)，同时搜索H-2D^b表位。该软件使用算法预测可能与给定的MHC分子结合的表位。软件回归到H-2Db分子所限制的推定表位，积分为25分。通常当它们的积分达到22分以上时，我们就认为是表位。因此用Neosystem合成了推定表位IDGVNHQHL。

重组CYAAs的构建

图13和14显示了代表用于构建产生CyaA-HPV18E7、CyaA-HPV18E7_Δ32-42、CyaA-HPV16+18E7、CyaA-HPV16+18ΔE7的质粒的图示。

CTL检测

本试验的目的是验证携带有HPV18E7蛋白的片段或全长蛋白以及HPV16和HPV18 E7蛋白的重组CyaA在体内对CTL的诱导作用。所导向的H-2Db表位是从计算机预测软件中获得的HPV18E7_41-49(IDGVNHQHL)和HPV16E7_49-57。用50μg CyaA-CysOVA、CyaA-HPV18E7、CyaA-HPV18E7_Δ32-42、CyaA-HPV16+18E7或CyaA-HPV16+18ΔE7静脉内疫苗接种C57BL/6小鼠(每组2只)。7天后，在体外用肽HPV18E7_41-49(10μg/ml)、OVA_257-264(1μg/ml)、或HPV16E7_43-77(1μg/ml)再刺激所收集的脾细胞。5天后，用⁵¹Cr释放检测CTL活性。靶细胞是装备或没有装备HPV18E7_41-49肽(8nmol)的EL4细胞或TC-1细胞。图中的图例表示：疫苗接种/再刺激。实例为：OVA/OVA指的是经CyaAE5-CysOVA疫苗接种并经OVA肽再刺激的小鼠。

这些结果(图16)显示，与CyaA-HPV18E7_Full不同的是，CyaA-HPV18E7_Δ32-42能在体内将计算机预测的HPV18-E7蛋白的CD8+H-2Db限制性T细胞表位转运到免疫活性的细胞的胞质溶胶内，进行加工处理并呈递到I型MHC途径内，以便引发强烈的CTL应答。奇怪的是，CyaA-HPV18E7_Δ32-42能触发抗HPV18E7_41-49的CTL应答，因为该重组CyaA缺乏肽HPV18E7_41-49的头两个氨基酸。但是，在HPV18E7片段43到105的插入位点，有着一个丙氨酸和一个丝氨酸，所以推定肽现在是ASGVNHQHL，而不是IDGVNHQHL。当进行SYFPEITHI时，该肽的积分为29分(天然肽的积分是25分)。因此，通过我们进行的克隆，对该肽的前2个肽进行取代，有可能我们已经使得该肽从隐蔽性的肽变成为免疫原性的肽。这首次描述了H-2Db背景下的HPV18E7蛋白的表位。

尽管有着高水平的非特异的背景，这些结果也显示CyaA-HPV18E7_Full和CyaA-HPV18E7_Δ能在体内将HPV16-E7蛋白的H-2Db限制性的T细胞表位转运到免疫活性细胞的胞质溶胶内，进行加工处理并呈递到I型MHC途径内，以便引发强烈的CTL应答。在这个方面，CyaA-HPV18E7_Δ比CyaA-HPV18E7_Full表现出了更强的能力。这些数据也首次显示携带有大的多肽性片段(最大到203个氨基酸)的CyaA仍是免疫原性的。

进行了进一步的试验，以便确认在图16中所述的结果。每组中的两只剩余的小鼠接受了不同于前几只小鼠的处理。试验设定是相似的。结论与图16中的结论相同，除了来自CyaA-HPV18E7_Δ32-42疫苗接种的小鼠的CTL对EL4细胞的高水平的非特异的裂解可能是因为烧瓶中剩余的过量的HPV18E7_41-49肽。

来自经CyaA-HPV16+18ΔE7疫苗接种的小鼠的脾细胞也裂解了TC-1细胞，但是经CyaA-HPV16+18E7疫苗接种的小鼠的脾细胞却不能裂解。在这个试验中，非特异的背景高峰达到了40％。虽然如此，从图17中所得到的结论确认了从图16中所得到的结论，即：

CyaA-HPV18E7_Δ32-42能体内将HPV18-E7蛋白的计算机预测的CD8+H-2Db限制性的T细胞表位转运到免疫活性细胞的胞质溶胶内，进行加工处理并呈递到I型MHC途径内，以便引发强烈的CTL应答。这首次描述了H-2Db背景下的HPV18E7蛋白的表位。

携带有大的多肽性片段(最大到203个氨基酸)的重组CyaA仍是免疫原性的。

结论

决定构建携带来自HPV16和HPV18的E7的二价治疗性疫苗。已经考虑了两种可能的策略：(i)第一种是混和等摩尔量的两种一种携带有来自HPV16的E7以及另一种携带有来自HPV18的E7的重组CyaA；(ii)第二种方法是构建携带有来自HPV16和HPV18的两种E7蛋白的重组CyaA。本结果描述了携带有来自HPV18的E7或来自两种病毒的E7的重组CyaA的构建。在CTL检测中测试了构建体的免疫原性。

从这个研究中得到的主要结论是两种所考虑的策略都是可行的，因为携带有HPV18E7亚片段的重组CyaA是有功能的，因为它首次发现了HPV18E7序列内的隐蔽性的H-2Db限制性表位。此外，携带来自HPV16和18病毒的E7蛋白(或亚片段)的重组CyaA仍是最令人感兴趣的免疫原性的，因为它们能触发抗TC-1细胞所自然呈递的H-2Db限制性HPV16E7表位的CTL应答。

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Claims (61)

1.一种重组蛋白，其包含携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的一种或数种多肽，所述多肽被插入到腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点，其中所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白的导向抗原呈递细胞的性能。

2.权利要求1的重组蛋白，其中CyaA蛋白的片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白的导向CD11b/CD18抗原呈递细胞的性能。

3.权利要求1或2的重组蛋白，其中CyaA蛋白的片段保留所述CyaA的容许所述多肽的表位转运到靶细胞的胞质溶胶内或者容许所述多肽转运到靶细胞的胞质溶胶内的性能。

4.权利要求1到3中任一项的重组蛋白，其包含携带被插入到CyaA蛋白的片段的相同的或不同的许可位点的一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的多肽，其中所述片段包含大约30到大约1300个氨基酸残基，所述片段涵盖CyaA蛋白的第1208到1243位氨基酸残基或CyaA蛋白的第1166到1281位氨基酸残基。

5.权利要求1到4中任一项的重组蛋白，其中所述多肽含有和/或所述数种多肽一起含有大约5个到大约500个或大约5个到大约200个或大约10个到大约50个氨基酸残基或大约30或50个到200个氨基酸残基。

6.权利要求5的重组蛋白，其能引发针对所述多肽的抗原特异性应答。

7.权利要求1到6中任一项的重组蛋白，其中至少一种携带一种或数种表位的多肽源自致癌性HPV。

8.权利要求1到7中任一项的重组蛋白，其中携带一种或数种表位的多肽源自HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52或HPV58。

9.权利要求1到8中任一项的重组蛋白，其中携带一种或数种表位的多肽源自选自L1、L2、E1、E2、E4和E5蛋白中的HPV抗原。

10.权利要求1到9中任一项的重组蛋白，其中携带一种或数种表位的多肽源自HPV16和/或HPV18的E6或E7蛋白。

11.权利要求1到10中任一项的重组蛋白，其包含多个携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的多肽。

12.权利要求9或11的重组蛋白，其中携带一种或数种表位的多肽源自HPV16的E7蛋白。

13.权利要求9或11的重组蛋白，其中携带一种或数种表位的多肽源自HPV18的E7蛋白。

14.权利要求9或11的重组蛋白，其中多肽是全长的E6或E7蛋白。

15.权利要求11到14中任一项的重组蛋白，其包含多个插入到CyaA序列或其片段的不同的许可位点的多肽。

16.权利要求15的重组蛋白，其中所述多个多肽涵盖包含HPV16的E7蛋白的第1到29位残基的片段或包含HPV16的E7蛋白的第42到98位残基的片段或这两个片段，所述多肽被插入到CyaA蛋白的不同的许可位点。

17.权利要求12的重组蛋白，其中多肽涵盖具有氨基酸序列RAHYNIVTF(E7_49-57)和/或GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(E7_43-77)的片段。

18.权利要求1到16中任一项的重组蛋白，其中所述多肽存在于中断的天然HPV抗原内，其中所述中断由在所述HPV抗原的酸性区域内缺失一或数个氨基酸残基和/或在所述腺苷酸环化酶的至少两个许可位点插入所述HPV抗原的至少两个多肽片段组成。

19.权利要求1到13或18中任一项的重组蛋白，其中携带一种或数种HPV抗原的一种或数种表位的多肽被修饰，以提高所形成的重组蛋白的免疫原性。

20.权利要求1到19中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白是细菌蛋白。

21.权利要求1到19中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白源自伯德特氏菌。

22.权利要求1到21中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白源自百日咳伯德特氏菌。

23.权利要求1到22中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白的酶活性已经被灭活。

24.权利要求1到22中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白的酶活性已经被遗传学灭活。

25.权利要求1到22中任一项的重组蛋白，其中CyaA蛋白的酶活性是由在CyaA的氨基酸序列中的涉及环化酶活性的位点插入二肽而灭活。

26.权利要求1到25中任一项的重组蛋白，其能在哺乳动物宿主中引发细胞介导的免疫应答。

27.权利要求1到25中任一项的重组蛋白，其能在哺乳动物宿主中引发体液免疫应答。

28.权利要求1到27中任一项的重组蛋白，其包含数个被插入到CyaA蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点的、携带不同HPV抗原的一种或数种表位的多肽。

29.权利要求28的重组蛋白，其中所述多肽是分别源自HPV16和HPV18的全长的E7多肽，所述多肽被插入到CyaA蛋白的不同的许可位点。

30.权利要求1到9中任一项的重组蛋白，其由选自pTRACE5-HPV16E7_FULL(CNCM I-3191)或pTRACE5-HPV16E7_Δ30-42(CNCM I-3190)的质粒中所含有的插入物所编码。

31.一种重组蛋白，其包含携带一种或数种抗原的一种或数种表位的一种或数种多肽，所述多肽被插入到腺苷酸环化酶(CyaA)蛋白或其片段的相同的或不同的许可位点，所述CyaA片段保留所述腺苷酸环化酶蛋白的导向抗原呈递细胞的性能，其中至少一种所述表位是亚优势的隐蔽性T细胞表位，并且其中所述重组蛋白能引发针对所述多肽的抗原特异性应答。

32.权利要求31的重组蛋白，其中隐蔽性表位是HPV的表位，特别是HPV的E7蛋白的表位。

33.权利要求32的重组蛋白，其中隐蔽性表位是HPV18E7蛋白的表位，特别是具有序列IDGVNHQHL的表位。

34.编码权利要求12到33中任一项的重组蛋白的多核苷酸。

35.权利要求34的多核苷酸，其中所述多核苷酸被包含在载体pTRACE5-HPV16E7_FULL(CNCM I-3191)、或pTRACE5-HPV16E7_Δ30-42(CNCM I-3190)内。

36.包含权利要求34的多核苷酸的重组表达载体。

37.权利要求36的重组表达载体，其适于在细菌内表达。

38.权利要求36的重组表达载体，其适于在真核细胞内表达，特别是在哺乳动物细胞内表达。

39.权利要求36的重组载体，其选自于pTRACE5-HPV16E7_FULL(CNCM I-3191)或pTRACE5-HPV 16E7_Δ30-42(CNCM I-3190)。

40.一种重组宿主细胞，其包含权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的重组表达载体。

41.权利要求40的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是保藏于CNCM的保藏号为I-3190或I-3191的大肠杆菌细胞。

42.一种免疫原性组合物，其包含与生理学可接受的媒介、赋形剂、载体和/或稀释剂相结合的权利要求1到33中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体。

43.权利要求42的免疫原性组合物，其在哺乳动物宿主中诱导细胞介导的免疫应答。

44.权利要求43的免疫原性组合物，其诱导细胞介导的细胞溶解性免疫应答。

45.权利要求42到44中任一项的免疫原性组合物，其中免疫应答包括体液免疫应答。

46.权利要求42到45中任一项的免疫原性组合物，其还包括佐剂和/或表面活性剂和/或免疫调节物。

47.权利要求42到46中任一项的免疫原性组合物，用于预防或治疗HPV感染。

48.权利要求42到47中任一项的免疫原性组合物，用于癌症免疫治疗。

49.权利要求42到46中任一项的免疫原性组合物，用于预防或治疗宿主体内由HPV感染所造成的恶性转化的发生或维持。

50.权利要求1到30中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体用于治疗或预防患者体内的HPV感染的用途。

51.权利要求50的用途，用于对患者体内的HPV感染所造成的恶性转化的发生或维持进行免疫治疗。

52.一种疫苗组合物，其包含权利要求1到30中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体，其适于引发宿主体内的细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。

53.一种用于预防或治疗HPV感染的药物组合物，其包含权利要求1到33中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体。

54.一种用于预防或治疗宿主体内由HPV感染所造成的恶性转化的发生或维持的药物组合物，其包含权利要求1到33中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体。

55.一种用于癌症免疫治疗的药物组合物，其包含权利要求1到33中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体。

56.HPV感染的诊断试剂盒或用于免疫监视HPV感染的试剂盒，其包含权利要求1到30中任一项的重组蛋白或权利要求34的多核苷酸或权利要求36到39中任一项的载体。

57.用于体外诊断HPV感染或用于免疫监视HPV感染的方法，其包括：

-将从哺乳动物(特别是人类患者)中获得的T细胞暴露于权利要求1到33中任一项的重组蛋白；

-检测T细胞活化的改变。

58.包含通过插入一种或数种致癌性病毒的一种或数种抗原的一种或数种表位而修饰的细菌蛋白或其片段的重组蛋白用于治疗或预防致癌性病毒感染、或用于治疗或预防由致癌性病毒感染所造成的恶变效应的用途。

59.权利要求58的重组蛋白的用途，其中细菌蛋白是毒素或类毒素。

60.用于筛选嵌合的CyaA-多肽蛋白中所含的多肽中的未知的或亚优势的隐蔽性T细胞表位的方法，其中CyaA是如权利要求1到30中任一项所述的腺苷酸环化酶或其片段，该方法包括：

-给动物宿主施用所述嵌合蛋白；

-确定所述宿主的T细胞应答，特别是CTL应答。

61.权利要求60的方法，其中所述多肽源自HPV抗原，特别是源自HPV16E7蛋白和/或HPV18E7蛋白。

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