CN104039833B - 针对hpv的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗化合物，诸如针对人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗，特别是针对HPV16或HPV18的DNA疫苗。本发明还涉及编码同型二聚体肽的蛋白构建体，所述肽可以由DNA疫苗释放或单独使用。本申请还描述了药物制剂、用于产生所述疫苗的宿主细胞和方法以及用于治疗各种HPV诱发的疾病(诸如癌症和传染病)的方法。
Description
发明领域
本发明涉及治疗化合物，诸如针对人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的疫苗，特别是针对HPV16和/或HPV18的DNA疫苗。本发明还涉及编码同型二聚体肽的蛋白构建体，所述肽可以由DNA疫苗释放或单独使用。本申请还描述了药物制剂、用于产生所述疫苗的宿主细胞和方法以及用于治疗各种HPV诱发的疾病(诸如癌症和传染病)的方法。
发明背景
现在充分确定人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌(cervical cancer)和其他HPV-相关的恶性病的病因，所述其他HPV-相关的恶性病诸如肛门生殖器癌(anogenital cancers)(肛门癌、外阴癌、阴道癌和阴茎癌)和头颈癌(head and neck cancers)的子集。具体地，HPV16和HPV18是造成全世界全部宫颈癌中的大约70％的原因。
迄今为止，有两种预防性HPV疫苗在售(嘉德西尔(Gardasil)和人乳头瘤病毒疫苗(Cervarix))。所述预防性疫苗的目的在于通过刺激对HPV病毒衣壳蛋白L1和L2特异性的中和抗体的产生而诱导体液免疫应答。尽管预防性疫苗是控制HPV诱发的宫颈癌以及可能的其他HPV相关的恶性病的重要的里程碑，但是这些疫苗的作用将不会被明显观察到持续20-40年(Ma B等人，Current Cancer Therapy Reviews(当代癌症治疗综述)，2010)。并且，由于除了全世界已经感染HPV的大量人群之外，关于预防性疫苗的大量接种的覆盖目前还是有限的，因此HPV相关的恶性病持续发展。因此，为了减少HPV相关的恶性病及其前体病变的死亡率和发病率，开发HPV特异性的治疗性疫苗是重要的(Ma B等人，Current CancerTherapy Reviews(当代癌症治疗综述)，2010)。
在最近的二十年间，多种癌症疫苗和癌症免疫治疗策略的开发已经扩大。然而，目前只有一种称为Provenge(Dendreon INC)的治疗性癌症疫苗被核准用作前列腺癌(prostate cancer)的标准治疗。特别地，由于伦理原因，大部分治疗性癌症疫苗是在携带晚期肿瘤的患者组中进行检测的。该患者组基本上是免疫抑制的，意指肿瘤细胞已经长期避开免疫系统并且在癌症发生过程中有助于诱导对肿瘤的免疫耐受性。另外，为了在患者中诱导肿瘤特异性免疫应答并避免可能导致严重不利事件的对健康细胞的杀伤，用作疫苗的抗原的选择(肿瘤特异性的相对于肿瘤相关的)是至关重要的。因此，癌症免疫治疗的主要挑战是破坏所述免疫耐受性并激活肿瘤特异性效应子功能以识别并杀死肿瘤细胞。尽管一些病例报告显示了在晚期肿瘤患者中对治疗性癌症疫苗的临床反应，但是最常见的初级终点是与常规治疗法(手术、化疗和放疗)相比观察对整体存活的影响。然而，大部分研究要么不是决定性的，要么它们完全没有表明此。阴性结果的一个原因首先在于携带被刺激进行治疗的终末期肿瘤的患者组。可能的策略是在治疗性疫苗试验中包括患有早期肿瘤的患者。
一种策略是靶向癌前病变。该策略的挑战主要在于缺少由癌前病变特异性表达的针对多种组织的可靠的生物标记和差的医学筛查(不存在或者现有方法缺乏灵敏性)。例外的是，对于HPV诱发的恶性病不是这样的情形。例如，大部分西方国家具有良好的通过进行巴帕尼科拉乌试验(Pap涂片试验)进行的宫颈发育异常(cervical dysplasia)和宫颈癌(cervical cancer)的筛查项目。如果Pap涂片试验的结果不清楚或异常，则进行阴道镜检查(国家宫颈癌联合会(National Cervical Cancer Coalition))。还可以将HPV-检测推荐给一些患者，以检测癌前病变中存在的“高危险性”HPV-类型。因此，HPV代表一种潜在的针对HPV相关的癌前病变的生物标记，特别是针对宫颈上皮发育异常(cervicalintraepithelial dysplasia，CIN)的生物标记。
DNA疫苗已经显示出日益增加的用于治疗人类疾病、特别是癌症的希望。DNA疫苗诱导强抗原-特异性免疫应答并且可以重复施用以维持靶标-特异性的免疫应答。与其他癌症治疗形式相比，此类疫苗被认为是安全的、简单的和便宜的，从而能够大规模制备。许多免疫治疗性干预不能诱导免疫记忆。例外地，DNA接种确保疫苗产品在体内持续释放，这增强抗原-特异性免疫记忆。将抗原直接递送至专门的抗原呈递细胞(APCs)在体内刺激CD4+和CD8+T细胞免疫应答二者。已经证明此类强细胞免疫应答在体外和体内都特异性识别并有效地杀伤抗原-阳性恶性细胞。
本领域中对于用于诱导针对造成传染病和癌症的HPV的强而特异性的免疫应答的改善的疫苗仍然存在需求。
发明目的
本发明实施方案的目的是提供特异性且高度有效的治疗化合物，诸如针对由HPV引起的疾病和病症的DNA疫苗。
发明概述
本发明人已经发现，通过组合HPV(诸如HPV16和/或HPV18)的早期基因产物E6和E7的抗原与hMIP-1α的靶向模块，提供治疗性疫苗，其中HPV基因产物的强免疫原性表位被高效地呈递至APCs，从而诱导特异性且强烈的免疫反应。本发明所述的产品主要考虑为治疗性核酸疫苗，诸如DNA疫苗，其中编码疫苗体(vaccibody)构建体的核酸构建体用作在接受该疫苗的人中引起在体内产生蛋白产物的治疗化合物。然而，作为一种备选方案，所述蛋白产物本身可以被直接配制并且用在疫苗中。
因此，在第一方面，本发明涉及两个相同氨基酸链的同型二聚体蛋白，每个氨基酸链包含：(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元包含与SEQID NO：1的氨基酸序列24-93具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，诸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元。
在第二方面，本发明涉及包含下述的氨基酸链：(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，诸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元，所述氨基酸链能够形成本发明所述的同型二聚体蛋白。
在第三方面，本发明涉及编码氨基酸链的核酸分子，诸如DNA，所述氨基酸链包含：(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，诸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元，所述氨基酸链能够形成本发明所述的同型二聚体蛋白。
在另一方面，本发明涉及本发明所述的同型二聚体蛋白，或本发明所述的氨基酸链，或本发明所述的核酸分子，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及包含本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及包含本发明所述的核酸分子的宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及用于制备本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明的氨基酸链的方法，所述方法包括：a)将本发明所述的核酸分子转染到细胞群中；b)培养所述细胞群；c)收集并且纯化由所述细胞群表达的所述同型二聚体蛋白或氨基酸链。
在另一方面，本发明涉及用于制备包含免疫有效量的本发明所述的核酸分子的疫苗如DNA疫苗的方法，所述方法包括：a)制备本发明所述的核酸分子；b)将步骤a)中获得的所述核酸分子溶解在药用载体、稀释剂或缓冲剂中。
在另一方面，本发明涉及针对HPV的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子如DNA，其中所述疫苗能够引发T细胞-和B细胞免疫应答。
在另一方面，本发明涉及治疗或预防患者中HPV诱发的疾病或病症(如由HPV引起的癌症或传染病)的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明所述的同型二聚体蛋白或本发明所述的氨基酸链或本发明所述的核酸分子，如DNA。
附图图例
图1：具有E7/E6融合抗原的疫苗体疫苗的整体结构。显示的是DNA和蛋白两种形式。所述疫苗体由三个功能模块组成；在靶向模块中的趋化因子人MIP-1α(LD78β)，在二聚化模块中的来自人IgG3的铰链和CH3序列和在疫苗模块中的全长E7和/或E6融合体。
图2：关于针对HPV-诱发的恶性病的疫苗体DNA疫苗的提议的作用模式。皮内注射编码疫苗体的裸DNA质粒，然后电穿孔。所述质粒被局部细胞摄入，并且产生和分泌疫苗体蛋白。趋化靶向模块吸引CCR1和CCR5表达抗原呈递细胞(APC)并且确保结合并摄入至树突细胞(DC)中。所述DC将抗原肽呈递至CD4+和CD8+T细胞，并且CD8+T细胞将杀死宫颈中感染和转化HPV的细胞。
图3：显示作为施用的不同量的疫苗的函数的E7和E6特异性T细胞反应数目的ELISPOT结果。在第0天和第7天，C57BL/6小鼠皮内注射编码VB1009和VB1016的裸DNA质粒及其相对应的对照，然后电穿孔(Cellectis，法国)在第21天收集脾细胞，并用I类MHC-限制型E7或E6肽刺激24小时。通过ELISPOT计算分泌IFNγ的脾细胞的数目。(A)用25μg VB1009、对照1(单独的抗原)和pUMVC4a(空载体)皮内接种后的E7-特异性反应。(B)用12.5和1.4μgVB1016、对照2(单独的抗原)和pUMVC4a(空载体)皮内接种后的E7-特异性反应。(C)用12.5和1.4μg VB1016、对照2(单独的抗原)和pUMVC4a(空载体)皮内接种后的E6-特异性反应。
图4：通过测量肿瘤体积显示的VB1016的治疗作用。C57BL/6小鼠在第0天皮下注射5x105个TC-1细胞。在第3天和第10天，小鼠皮内注射12.5μg编码VB1016的裸DNA质粒、对照2或空载体，然后电穿孔(Cellectis，法国)。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次，并且计算肿瘤体积。
图5：通过测量肿瘤体积显示的VB1016的治疗作用。C57BL/6小鼠在第0天在颈部区域皮下注射5x104个TC-1细胞。在第3、7天和第10天，小鼠皮内注射20μg或2μg编码VB1016的裸DNA质粒、对照2或空载体，然后电穿孔(Cellectis，法国)。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次，并且计算肿瘤体积。
图6：通过测量肿瘤体积显示的VB1020和VB1021的治疗作用。C57BL/6小鼠在第0天在大腿皮下注射5x104个TC-1细胞。在第3天和第10天，小鼠皮内注射10μg编码VB1016、VB1020、VB1021的裸DNA质粒或空载体，然后电穿孔(Cellectis，法国)。每周用卡钳测量肿瘤尺寸二至三次，并且计算肿瘤体积。
发明详述
由本发明的发明人在本文中所述的构建体和DNA疫苗技术(也称为“疫苗体”分子/疫苗/构建体)代表一种新颖的诱导针对传染病和癌症的强烈且特异性的免疫应答的疫苗策略。本文所述的HPV E6/E7，诸如HPV16或HPV18E6/E7疫苗，可以作为DNA疫苗通过皮内注射而施用，优选接着进行电穿孔。这导致编码疫苗体-HPV16和/或HPV18E6/E7疫苗的DNA-构建体摄入到注射部位(真皮)的细胞中，包括树突细胞(朗格汉斯细胞)，导致在体内产生所述疫苗体-E6/E7分子。
来自“高危险性”HPV类型如HPV16和18的早期基因产物E6和E7可能负责基细胞-上皮细胞(basal-eithelium cells)的转化和癌前病变的诱导。这两种蛋白由高度免疫原性的表位组成，并且在本文中显示出诱导导致“高危险性”HPV阳性肿瘤细胞在体外和体内的特异性清除的强免疫应答。
本文所述的疫苗体分子是由三个模块组成的同型二聚体：靶向模块，二聚化模块和疫苗模块(图1)。编码这三个模块的基因被遗传改造作为一个基因被表达。当在体内表达时，所述疫苗体分子靶向抗原呈递细胞(APCs)，与相同的非靶向性的抗原相比，这导致增强的抗原效力。趋化因子人巨噬细胞炎性蛋白1α(hMIP-1α/LD78β)的体内表达导致将DCs、嗜中性粒细胞和其他携带CCR1和CCR5受体的免疫细胞吸引至表达位点。由此，由hMIP-1α作为靶向模块组成的疫苗体分子不仅使抗原靶向特定的细胞，而且另外通过将特定的免疫细胞招募至注射部位而提供反应-放大作用(佐剂作用(adjuvant effect))。这种特有的机制在其中由于疫苗本身提供佐剂作用而使患者可能接受不含任何另外的佐剂的疫苗的临床设置中是非常重要的。
本发明的发明人在本文中描述了疫苗构建体，其中抗原模块由与来源于HPV16或HPV18亚型的E6全长序列融合的E7全长遗传序列组成。这种形式的优点在于E6和E7存在于一种构建体中，并且由此可以在体内同等地表达。故而，由多个抗原单元组成的一种疫苗体分子可以代表用于免疫系统的相等水平的E6和E7。HPV16E6和E7基因产物以其天然形式是致癌的。为了中和它们的致癌特性，在E6和E7遗传序列中可以引入在特定位点的突变。
可以在特定位点引入突变，包括缺失，已知所述位点抑制E6和E7的致癌特性，诸如在Dalal S等人，J Virol(病毒学杂志)，1996；Münger K等人，EMBO，1989；Nakagawa S等人，Virology(病毒学)，1995；CrookT等人，Cell(细胞)，1991；MüngerK等人，HPVCompendiumOnline(在线HPV目录)，1997(http.//www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf)；Nguyen，M等人，J Virol(病毒学杂志)，2002；NominéY等人，Molecular Cell(分子细胞)，2006；Moody C等人，NatRev Cancer(自然癌症综述)，2010，Polakova I等人，Vaccine(疫苗)，2010；Xie Q，Virologica Sinica，2011；Mesplède T等人，J Virol(病毒学杂志)，2012；US2008/0102084和US6306397任一篇参考文献中所述的任意一个位点，所述参考文献通过引用结合于此。因此，在本发明的一些方面中，本发明所述的构建体包含在HPV16E6、E7任一种或二者的已知抑制致癌特性的位置具有一个或多个突变的HPV16E6、E7或HPV16E6/E7嵌合构建体，所述位置如Dalal S等人，J Virol(病毒学杂志)，1996；MüngerK等人，EMBO，1989；Nakagawa S等人，Virology(病毒学)，1995；Crook T等人，Cell(细胞)，1991；Münger K等人，HPV Compendium Online(在线HPV目录)，1997(http：//www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf)；Nguyen，M等人，J Virol(病毒学杂志)，2002；NominéY等，Molecular Cell(分子细胞)，2006；Moody C等人，Nat RevCancer(自然癌症综述)，2010，Polakova I等人，Vaccine(疫苗)，2010；Xie Q，VirologicaSinica，2011；Mesplède T等人，J Virol(病毒学杂志)，2012；US2008/0102084或US6306397中所述。在本发明的另一方面，本发明所述的构建体包含在HPV18E6、E7任一种或二者的已知抑制致癌特性的位置具有一个或多个突变的HPV18E6、E7或HPV18E6/E7嵌合构建体，所述位置如Dalal S等人，J Virol(病毒学杂志)，1996；Münger K等人，EMBO，1989；Nakagawa S等人，Virology(病毒学)，1995；Crook T等人，Cell(细胞)，1991；Münger K等人，HPVCompendium Online(在线HPV目录)，1997(http：//www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf)；Moody C等人，Nat Rev Cancer(自然癌症综述)，2010，US2008/0102084或US6306397中所述。
存在这样的可能性，即，疫苗体-结构部分(靶向和二聚化模块)在最终融合蛋白中可以根除E6和E7野生型蛋白的致癌特性。因此，本发明的另一方面是野生型全长E6和/或E7序列在所述疫苗体构建中的应用。
本发明描述了疫苗体HPV治疗性DNA疫苗的几种变体，其全部是基于图1所述的整体形式，所述治疗性疫苗体-HPV DNA疫苗编码在人中天然表达的基因；靶向模块基因编码趋化因子hMIP-1α，其与其在APCs细胞表面上表达的相关受体CCR1和CCR5结合。二聚化模块基因可以编码铰链区和恒定重链3，诸如来自人IgG3的铰链区和恒定重链3，其连接两个疫苗体单体，产生同型二聚体分子。用于所述策略的编码疫苗模块的基因由HPV组成，诸如HPV16和/或HPV18E7和E6抗原，诸如全长HPV16E7和E6抗原，任选地包含一个或多个突变以抑制致癌特性。一旦通过皮内注射进行体内施用接着进行电穿孔，摄入所述疫苗构建体的真皮细胞将表达所述疫苗体-HPV分子。该体内产生的疫苗体疫苗靶向皮肤中在APCs、特别是DCs表面上表达的CCR1和CCR5。所述疫苗体分子与其相关受体的结合导致该复合物在APC中的内在化，蛋白降解成小肽，所述小肽负载在MHC分子上并且呈递至CD4+和CD8+T细胞上，从而诱导HPV16E6和E7特异性免疫应答。当被刺激时并且在激活的CD4+T细胞的帮助下，CD8+T细胞将靶向并且杀死表达HPV16E6和E7的细胞(图2)。此类针对具有“内置”佐剂作用的疫苗的增强的免疫应答可以通过破坏免疫耐受性而有力地克服肿瘤-逃逸(肿瘤免疫监视)并且有效地杀死恶性细胞。hMIP-1α靶向单元可以通过二聚化基序(如铰链区)与抗原单元连接，其中后者在COOH-末端或在NH2-末端。本发明不仅涉及编码该重组蛋白的DNA序列，还涉及包含这些DNA序列的表达载体，包含所述表达载体的细胞系，涉及优先通过疫苗体DNA、疫苗体RNA或疫苗体蛋白免疫治疗哺乳动物，并且最后涉及包含所述分子的药物和试剂盒。
在本发明所述的蛋白中的二聚化基序可以构建成包含铰链区和免疫球蛋白结构域(例如，Cγ3结构域)，例如，羧基端C结构域(CH3结构域)，或与所述C结构域基本上相同的序列。所述铰链区可以是Ig来源的，并且有助于通过形成链间共价键(例如，二硫键)而二聚化。另外，其作用为在各结构域之间的灵活的间隔臂，允许两个靶向单元同时结合在APC上表达的具有可变距离的两个靶分子。免疫球蛋白结构域有助于通过非共价相互作用(例如疏水相互作用)而同型二聚化。在优选的实施方案中，CH3结构域来源于IgG。这些二聚化基序可以与其他多聚体化结构部分(例如，来自其他Ig同种型/亚类)交换。优选地，所述二聚化基序来源于天然人蛋白，诸如人IgG。
应该理解，关于抗原单元和靶向单元，所述二聚化基序可以具有任意的方向。在一个实施方案中，所述抗原单元在所述二聚化基序的COOH-末端，而所述靶向单元在所述二聚化基序的N-末端。在另一个实施方案中，所述抗原单元在所述二聚化基序的N-末端，而所述靶向单元在所述二聚化基序的COOH-末端。
国际申请WO2004/076489(其通过引用结合于此)公开了可以按照本发明使用的核酸序列和载体。
本发明所述的蛋白包括来源于HPV的抗原单元，诸如HPV16E7和E6抗原，诸如全长HPV16E7和E6抗原，及其免疫原性片段或变体。抗原序列应该是充分长度的。所述抗原单元的最小长度可以大约是9个氨基酸。因此，在一些实施方案中，来源于HPV的抗原单元包含与编码所述抗原单元的核酸序列中的至少约27个核苷酸相对应的至少9个氨基酸的氨基酸序列。优选地，来源于HPV的抗原单元是相当长的，诸如全长HPV16E7和E6抗原。通过在编码区(以＜2％的频率)和非编码区(以＜5％的频率)的有限的核苷酸改变在给定的HPV基因型中产生多样性(Bemard，HU等人，Iht J Cancer(国际癌症杂志)，2006)。此类变体在系统发生上基于其地理起源而分离，并且因此是标记的欧洲、非洲、亚洲、亚洲-美洲和北美变体。此类序列插入到疫苗体形式中可能导致两个臂的免疫应答的激活。
通过疫苗体蛋白、疫苗体DNA或疫苗体RNA的免疫都是本发明所述的可能的方法，例如，后面两种通过肌内或皮内注射用或不用随后的电穿孔执行。
如上文所讨论的，本发明涉及针对由HPV引起的癌症或传染病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含免疫有效量的编码本发明的分子的核酸或其简并变体。所述疫苗能够引发T细胞-和B细胞免疫应答。本发明还涉及用于诊断、医学或科学目的的包含疫苗体DNA、RNA或蛋白的试剂盒。
本发明还涉及制备本发明的重组分子的方法，所述方法包括：将包含本发明的分子的载体转染到细胞群中；培养所述细胞群；收集由所述细胞群表达的重组蛋白；并且纯化所表达的蛋白。
上述核苷酸序列可以插入到适用于基因治疗的载体中，例如，在特定启动子的控制下，并且引入到细胞中。在一些实施方案中，包含所述DNA序列的载体是病毒，例如，腺病毒(adenovirus)，痘苗病毒(vaccinia virus)或腺伴随病毒(adeno-associated virus)。在一些实施方案中，使用反转录病毒作为载体。适当的反转录病毒的实例例如MoMuLV或HaMuSV。为了基因治疗的目的，本发明所述的DNA/RNA序列还可以以胶体分散液形式被转运到靶细胞中。例如，其包含脂质体或lipoplexes。
本发明包括与本文限定的氨基酸序列或与具有本文限定的特定特性的多肽具有最小程度的序列同一性或序列同源性的靶向单元以及抗原单元的应用。具体地，本发明包括用于本发明所述的构建体的肽变体或肽单元的应用，所述肽变体或肽单元与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34中的任一种具有一定程度的序列同一性。此处，术语“变体”意指与主题氨基酸序列或主题核苷酸序列具有特定程度的序列同一性的实体，其中所述主题氨基酸序列优选为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33或SEQID NO：34。
在一个方面，变体或片段氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留下述序列的多肽的功能活性和/或增强下述序列的多肽的活性的多肽：SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34。
在本发明的情形中，变体序列视为包括可能与主题序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。典型地，按照本发明使用的变体包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以被认为是相似性(即，具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)，但是在本发明的情形中，优选用序列同一性来表示同源性。
序列同一性比较可以通过眼睛进行，或者更为通常地，用容易获得的序列比较计算机程序辅助进行。这些商购的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两种以上的序列，最好地反映可能导致所述两种以上的序列之间的差异的进化事件。因此，这些算法用评分系统进行操作，所述评分系统给相同或相似氨基酸的比对得分(rewarding)，并给缺口插入、缺口延伸和不相似氨基酸比对罚分(penalising)。所述比较算法的评分系统包括：
i)当每次插入缺口时给予罚分(缺口罚分)，
ii)当每次现有的缺口延伸额外位置时给予罚分(延伸罚分)，
iii)当比对相同的氨基酸时给予高得分，和
iv)每当比对不相同的氨基酸时分配可变的得分(variable scores)。
大部分比对程序允许修改缺口罚分。然而，当使用此类软件用于序列比较时，优选使用默认值。
关于不相同氨基酸的比对给出的得分按照也称为置换矩阵(substitutionmatrix)的评分矩阵进行分配。以所述置换矩阵提供的得分反映以下事实：进化过程中一种氨基酸被另一种氨基酸置换的可能性是变化的并且取决于要被置换的氨基酸的物理/化学性质。例如，极性氨基酸被另一个极性氨基酸置换的可能性高于被疏水氨基酸置换的可能性。因此，所述评分矩阵为相同的氨基酸分配最高得分，为不相同但是相似的氨基酸分配较低的得分，并且为不相同不相似的氨基酸分配甚至更低的得分。最经常使用的评分矩阵是PAM矩阵(Dayhoff等人(1978)，Jones等人(1992))，BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff(1992))以及Gonnet矩阵(Gonnet等人(1992))。
适于进行所述比对的计算机程序包括但不限于，Vector NTI(Invitrogen Corp.)和ClustalV、ClustalW和ClustalW2程序(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Higgins等(1992)，Thompson等(1994)，Larkin等(2007))。不同比对工具的选择可以从ExPASy蛋白质组学服务器(www.expasy.org)获得。可以进行序列比对的软件的另一个实例是BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))，该软件可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的网页上找到(目前可以在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/处找到)，并且该软件首先描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)215；403-410。
在所述软件生成比对后，可能的是计算％相似性和％序列同一性。所述软件通常将此作为序列比较的部分进行并且产生数值结果。
在一个实施方案中，优选的是使用ClustalW软件用于进行序列比对。优选地，利用ClustalW的比对以下述参数用于成对比对：
例如，欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)使ClustalW2在因特网上可获得：在EMBL-EBI的网页www.ebi.ac.uk，在工具-序列分析-ClustalW2下。目前，ClustalW2工具的准确地址是www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2。
在另一个实施方案中，优选的是使用Vector NTI(Invitrogen)中用于进行序列比对的程序Align X。在一个实施方案中，使用具有下述默认设定的Exp10：
缺口开启罚分：10
缺口延伸罚分：0.05
缺口分离罚分范围(Gapseparation penalty range)：8
评分矩阵：blosum62mt2
因此，本发明还包括如本文所定义的蛋白、多肽、基序或结构域的任何氨基酸序列的变体、片段和衍生物的用途，所述氨基酸序列特别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SFQ IDNO：32或SFQ ID NO：34中的那些序列。
所述序列，尤其是SFQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SFQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的变体、片段和衍生物的序列，也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，其产生沉默的变化并导致在功能上等效的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸置换，只要保持该物质的二级结合活性。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有相似亲水性值的、具有不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还包括可以发生的保守置换(在本文中，置换和替换都用以表示现有氨基酸残基与备选残基的交换)，即同等对同等(like-for-like)的置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非保守置换也可以发生，即从一类残基置换为另一类残基，或备选地涉及包含非天然氨基酸如鸟氨酸(下文中，称为Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(下文中，称为B)，正亮氨酸鸟氨酸(下文中，称为O)，吡啶基丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
可以进行的保守置换，例如在碱性氨基酸的组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)内，酸性氨基酸的组(谷氨酸和天冬氨酸)内，脂肪族氨基酸的组(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)内，极性氨基酸的组(谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸)内，芳香族氨基酸的组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)内，羟基氨基酸的组(丝氨酸、苏氨酸)内，大氨基酸的组(苯丙氨酸和色氨酸)内和小氨基酸的组(甘氨酸、丙氨酸)内。
替换也可以通过非天然氨基酸进行，包括；α*和α-二取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤素衍生物如三氟酪氨酸*，p-Cl-苯丙氨酸*，p-Br-苯丙氨酸*，p-I-苯丙氨酸*，L-烯丙基-甘氨酸*，β-丙氨酸*，L-α-氨基丁酸*，L-γ-氨基丁酸*，L-α-氨基异丁酸*，L-ε-氨基己酸#，7-氨基庚酸*，L-甲硫氨酸砜#*，L-正亮氨酸*，L-正缬氨酸*，对-硝基-L-苯丙氨酸*，L-羟基脯氨酸#，L-硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*，五甲基-Phe*，L-Phe(4-氨基)#，L-Tyr(甲基)*，L-Phe(4-异丙基)*，L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为以上讨论(涉及同源或非保守置换)的目的使用记号*，以表示衍生物的疏水性质，而#用以表示衍生物的亲水性质，#*表示两性性质。
除了氨基酸间隔区如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，变体氨基酸序列还可以包括合适的间隔基团(所述间隔基团可以被插入在所述序列的任意两个氨基酸残基之间)，包括烷基如甲基、乙基或丙基。另一种形式的变化涉及存在拟肽形式的一个或多个氨基酸残基，这将被本领域技术人员很好的理解。为避免疑问，“拟肽形式”用于表示变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在该残基的氮原子上而不是在α-碳上。制备拟肽形式的肽的方法是本领域中已知的，例如Simon RJ等人(1992)，Horwell DC.(1995)。
在一个实施方案中，用于本发明所述的同型二聚体蛋白的变体靶向单元是这样的变体，所述变体具有与其具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一方面，优选地，用于本发明的蛋白或序列是纯化形式的。术语“纯化的”是指给定的组分以高水平存在。所述组分理想地是存在于组合物中的最主要的活性组分。
“变体(“variant”或“variants”)”是指蛋白、多肽、单元、基序、结构域或核酸。术语“变体”可以与术语“突变体”互换使用。变体分别包括在氨基酸或核苷酸序列中一个或多个位置处的插入、置换、颠换、平截和/或倒位。短语“变体多肽”、“多肽”、“变体”和“变体酶”是指具有从SEQ ID NO：1的氨基酸序列修饰而来的氨基酸序列的多肽/蛋白质。变体多肽包括这样的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有一定百分比，例如，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
“变体核酸”可以包括与能够杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列。例如，变体序列与能够在严格条件下杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补，所述严格条件例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)。更具体地，术语变体包括与能够在高度严格条件下杂交到本文所示的核苷酸序列的序列互补的序列，所述高度严格条件例如，65℃和0.1X SSC。变体核酸的解链温度(Tm)可以比野生型核酸的Tm低约1、2或3℃。变体核酸包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的核酸、编码可以形成本发明所述的同型二聚体蛋白的单体蛋白的核酸具有一定百分比，例如，80％，85％，90％，95％或99％的序列同一性。
特别类别的突变是在E6和E7中的突变。
E6蛋白可以通过使p53结合变得不可能而被解毒。全长HPV16E6蛋白中的五个位置是用于使E6功能性失活的突变位点：F47，L50，C63，C106和I128。在这些位置中的任意氨基酸置换可以导致E6的失活，并且诱发肿瘤抑制。可以潜在地利用用任意一种不同的氨基酸置换这些位置中的任一个。用于潜在的突变的位点显示在SEQ ID NO：22中。
在E7蛋白中，存在与致癌特性相关的保守区域(参见，Phelps等人，J.Virol.(病毒学杂志)1992年4月，vol.66，no.42418-242；Gulliver等人，J Virol.(病毒学杂志)1997年8月；71(8))，包括N端Rb(视网膜母细胞瘤结合蛋白)结合位点基序(LXCXE)和两个具有Zn-结合基序(CXXC)的保守区域3(上游和下游)。LXCXE-基序中优选的突变位点是C24和E26。两个CXXC基序中优选的位点是C58，C61，C91和C94。然而，可以考虑在这些区域中的任意突变用于被置换以减少结合功能，并且由此消除E7的致癌作用。用于潜在的突变的位点显示在SEQID NO：23中。
信号肽：
在转运到高尔基复合体中之前，在新生多肽N-末端的信号肽引导该分子进行ER。当其完成其将蛋白靶向并且运输到ER中的目的时，信号肽被信号肽酶切割下来。这些信号肽通常为15-30个氨基酸，但是也可以具有多于50个残基(Martoglio，B.等人，Trends inCell Biology(细胞生物学趋势)，1998，Knappskog，S.等人，J Biotechnol(生物技术杂志)，2007)。天然的信号肽可以被来自任意哺乳动物、原核或海洋来源的信号肽替代。例如，常用的信号肽是人IL-2和人白蛋白，原因在于其天然的分泌大量的蛋白的能力。信号肽的选择可能对合成和分泌的蛋白的量具有相当大的影响。
在一些实施方案中，用于本发明所述的蛋白构建体的信号肽来源于趋化因子蛋白，诸如LD78β的信号序列。
在一些实施方案中，信号肽不是来源于国际申请号PCT/EP201I/060628的国际申请中公开的pLNOH2(B1-8可变免疫球蛋白前导序列)。
在一些实施方案中，信号肽不是来源于免疫球蛋白基因。
当用于本文时，术语“同型二聚体蛋白”是指这样的蛋白，所述蛋白包含两个单独的相同的氨基酸链或亚基，所述两个单独的相同的氨基酸链或亚基通过氢键键合、离子(电荷)相互作用、实际共价二硫键键合或这些相互作用的一些组合保持在一起作为单个的、二体蛋白。
当用于本文时，术语“二聚化基序”是指抗原单元和靶向单元之间的氨基酸的序列，其包含铰链区和任选的可以有助于二聚化的第二结构域。该第二结构域可以是免疫球蛋白结构域，并且任选地，所述铰链区与所述第二结构域通过接头相连。因此，二聚化基序起连接抗原单元和靶向单元的作用，而且还包含促使两个单体蛋白二聚化为本发明所述的同型二聚体蛋白的铰链区。
当用于本文时，术语“靶向单元”是指这样的单元，所述单元将蛋白与其抗原一起递送到小鼠或人APC，以用于MHC II类限制性的向CD4+T细胞的递呈，或者用于通过MHC I类限制性提供向CD8+T细胞的交叉递呈。用于本发明所述的构建体的靶向单元来源于成熟的LD78-β或与成熟的LD78-β相同。
当用于本文时，术语“抗原单元”是指能够被抗体或免疫系统的其他组分如T细胞上的表面受体特异地识别的任何分子，如肽。包含在该定义中的还有能够诱发免疫应答的免疫原。术语“表位”或“抗原表位”用来表示独特的分子表面，如由抗原单元内的短肽序列提供的分子表面。在一些实施方案中，抗原单元包含两个以上的抗原表位。用于本发明所述的构建体中的抗原单元来源于HPV(如HPV16或HPV18)的早期基因产物E6和E7或与其相同。
术语“铰链区”是指如通过形成链间共价键，例如二硫键而促使二聚化的同型二聚体蛋白的肽序列。所述铰链区可以是Ig来源的，如Ig(如IgG3)的铰链外显子h1+h4。
本发明的具体实施方案：
如上文所述，本发明涉及两个相同的氨基酸链的同型二聚体蛋白，每个氨基酸链包含：(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元包含与SEQID NO：1的氨基酸序列24-93具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，并且抗原单元包含人乳头瘤病毒(HPV)的氨基酸序列，诸如包含HPV16和/或HPV18的氨基酸序列的抗原单元，诸如来源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元。在本发明所述的一些实施方案中，所述氨基酸链中的所述靶向单元、二聚化基序和抗原单元从N-端至C-端的顺序为靶向单元，二聚化基序和抗原单元。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV16，诸如来源于早期蛋白E6和/或E7。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV16的E6。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV16的E7。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV18，诸如来源于早期蛋白E6和/或E7。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV18的E6。
在一些实施方案中，用于本发明所述的构建体的抗原单元来源于HPV18的E7。
在本发明所述的一些实施方案中，所述信号肽由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列1-23具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述信号肽由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列1-23具有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述靶向单元由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93具有至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化基序包含铰链区和任选地促进二聚化的另一个结构域，诸如免疫球蛋白结构域，二者任选地通过接头连接。
在本发明所述的一些实施方案中，所述铰链区是Ig来源的，诸如来源于IgG3。
在本发明所述的一些实施方案中，所述铰链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力。在本发明所述的一些实施方案中，所述共价键是二硫键。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域，或是与所述C结构域基本上相同的序列或其变体。
在本发明所述的一些实施方案中，所述羧基端C结构域来源于IgG。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。
在本发明所述的一些实施方案中，所述免疫球蛋白结构域具有通过非共价相互作用同型二聚化的能力。在本发明所述的一些实施方案中，所述非共价相互作用是疏水相互作用。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化结构域不包含CH2结构域。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化基序由通过接头与人IgG3的CH3结构域连接的铰链外显子h1和h4组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述二聚化基序由与SEQ ID NO：3的氨基酸序列94-237具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述接头是G3S2G3SG接头。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元和所述二聚化基序通过接头如GLGGL接头或GLSGL接头连接。
在本发明所述的一些实施方案中，所述靶向单元由SEQ ID NO：1的氨基酸24-93或其变体组成。
在本发明所述的一些实施方案中，与具有由SEQ ID NO：1的氨基酸24-93或其变体组成的靶向单元的相同的同型二聚体蛋白的亲和力相比，所述同型二聚体蛋白具有增加的针对选自CCR1、CCR3和CCR5的任一种趋化因子受体的亲和力。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列243-293具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由与SEQ ID NO：3的氨基酸序列243-293具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含在选自由SEQ ID NO：22的F47、L50、C63、C106和I128组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置换，或涉及选自由SEQ ID NO：22的Y43-L50组成的列表的一个或多个氨基酸的缺失。
在本发明所述的一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：22，所述抗原单元包含不超过1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18或20个氨基酸置换和/或缺失。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的氨基酸序列243-293，或其变体或抗原片段。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的氨基酸序列243-293或其变体或抗原片段组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列243-340具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列243-340具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含在选自由SEQ ID NO：23的C24、E26、C58、C61、C91和C94组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置换，或涉及选自由SEQ ID NO：23的L22-E26和/或C58-C61和/或C91-S95组成的列表的一个或多个氨基酸的缺失。
在本发明所述的一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：23，所述抗原单元包含不超过1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18或20个氨基酸置换和/或缺失。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的氨基酸序列243-340，或其变体或抗原片段。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的氨基酸序列243-340或其变体或抗原片段组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含与SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列243-501具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由与SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列243-501具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含人乳头瘤病毒16(HPV16)来源于早期蛋白E6和E7的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含人乳头瘤病毒18(HPV18)来源于早期蛋白E6和E7的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元包含在选自由SEQ ID NO：22的F47、L50G、C63、C106、I128T和SEQ ID NO：23的C24、E26、C58、C61、C91、C94组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置换。
在本发明所述的一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，所述抗原单元包含不超过1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18或20个氨基酸置换和/或缺失。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列243-501或其变体或抗原片段组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述氨基酸链由选自由SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34组成的列表的氨基酸序列或其变体或抗原片段组成。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原片段包含与选自SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的任一种氨基酸序列具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
在本发明所述的一些实施方案中，所述抗原单元由与选自SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的任一种氨基酸序列具有至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％的序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明所述的同型二聚体蛋白以其成熟形式存在，不带有任何信号肽序列。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子是人密码子优化的。
应该理解，与野生型序列相比较，本发明所述的人密码子优化的核酸分子包含一个或多个核酸置换，所述置换提供在人编码区中使用率较高的密码子。在智人(homosapiens)中的密码子使用频率可见于http：//biowiki.edu-wiki.org/en/codon_table。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子包含选自由SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：33组成的列表的任一种核苷酸序列或其变体。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子被包含在载体中。
在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子被配制用于施用给患者，以在所述患者中诱导所述同型二聚体蛋白的产生。
在一些实施方案中，本发明所述的疫苗还包含药用载体和/或佐剂。
在一些实施方案中，本发明所述的治疗或预防患者中HPV诱发的疾病或病症如由HPV引起的癌症或传染病的方法包括给有此需要的患者施用本发明所述的核酸分子，如DNA，随后有电穿孔步骤。在一些实施方案中，所述施用通过皮内或肌内进行。
实施例1
疫苗的构建和表达
按照下述结构设计基因序列：1：用于人LD78b的天然前导序列，2：全长LD78b序列，3：来自IgG3的人铰链区1，4：来自IgG3的人铰链区4，5：甘氨酸-丝氨酸接头，6：来自IgG3的人CH3结构域，7：甘氨酸-亮氨酸接头，8：野生型和突变体人乳头瘤病毒癌基因E6、E7以及通过甘氨酸-丝氨酸接头分开的E6和E7的融合蛋白。构建体依据其E6和或E7组成指定如下：
VB1001：疫苗体-E6野生型；
VB1005：疫苗体-E7野生型；
突变体依据在相对应的天然E6或E7序列中的氨基酸位置指定如下：
VB1002：疫苗体-E6C63R；
VB1003：疫苗体-E6C106R；
VB1004：疫苗体-E6F47R，C63R，C106R；
VB1006：疫苗体-E7C24G，E26G；
VB1007：疫苗体-E7C24G，E26G，C58G，C61G；
VB1008：疫苗体-E7C24G，E26G，C91G，C94G；
VB1009：疫苗体-E7C24G，E26G/E6F47R，C63R，C106R；
VB1016：疫苗体-E7C24G，E26G/E6C63R，C106R；
VB1020：疫苗体-E7C24G，E26G/E6F47R，C63R，C106R人密码子优化的；
VB1021：疫苗体-E7C24G，E26G/E6F47R，L50G，C106R，I128T人密码子优化的。
仅由抗原组成的对照疫苗包括：
对照1：E7C24G，E26G/E6F47R，C63R，C106R；
对照2：E7C24G，E26G/E6C63R，C106R。
所有基因序列定购自Aldevron(Fargo ND，USA)或Eurofins MWG GmbH，并且克隆在表达载体pUMVC4a中。
将所有构建体转染到293E细胞中，并且通过斑点印迹和ELISA进行完整的疫苗体蛋白的证实的表达(数据未显示)。除对照1和2外的所有氨基酸序列显示为SEQ IDs。
实施例2
免疫应答研究
选择VB1009、VB1016、VB1020和VB1021作为疫苗候选物，分别使用其相对应的对照1和2。空pUMVC4a载体用作阴性对照。
将25、12.5和1.4μg每种候选物的质粒DNA皮内注射到C57B1/6小鼠的后背，接着进行电穿孔，Dermavax，Cellectis(巴黎，法国)。7天后，所述小鼠用相似量的疫苗和对照质粒加强。在第21天，杀死小鼠并收集脾脏。
通过ELISPOT计算T细胞应答。(图3a，b和c)
实施例3
治疗效果
选择VB1016、VB1020和VB1021与相对应的对照1和2一起作为疫苗候选物用于治疗性疫苗研究。
将5x104或5x105个TC-1细胞(约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)，Baltimore，美国，Lin KY等人，Cancer Res(癌症研究)，1996)注射到C57B1/6小鼠的颈部或大腿区。在3天和10天后或第3、7和10天后，所述小鼠接种2μg、10μg、12.5μg或20μg的质粒DNA，然后进行电穿孔，Dermavax，Cellectis法国。肿瘤尺寸每周测量二至三次，直到TC-1细胞注射后第49天(图4，5和6)。
实施例4
要用的治疗性DNA疫苗可以按照管理机构的指导方针通过质粒疫苗的GMP制备方法来制备，包括GMP细胞库，药物物质和药物产品的GMP制备，ICH稳定性研究和DNA疫苗的填充与制成(Fill&Finish)。所述DNA疫苗可以通过以2-5mg/ml的浓度溶解在盐水溶液(如10nM Tris，1mM EDTA)中而配制。所述疫苗可以皮内或肌内施用，用或不用后续的电穿孔。
序列：
包含信号肽(粗体表示的aa1-23)和成熟肽(LD78-β)aa24-93的C-C基序趋化因子3-样1前体(SEQ ID NO：1)：
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA
疫苗体HPV构建体的具体的DNA及相对应的氨基酸序列：
E6或E7单一构建体：
仅是出于举例说明的目的，该构建体的不同结构域由“|”隔开，所述结构域以下述顺序排列：信号肽|人MIP-1α|铰链h1|铰链h4|Gly-Ser接头或Gly-Leu接头|hCH3IgG3|Gly-Ser接头或Gly-Leu接头|野生型或突变体全长E6或E7。粗体的氨基酸或核苷酸表示突变位点。
VB1001的DNA序列(SEQ ID NO：2)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1001的蛋白序列(本发明所述的具有E6的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：3)：氨基酸序列，393个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
VB1002的DNA序列(SEQ ID NO：4)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1002的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：5)：氨基酸序列，393个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
VB1003的DNA序列(SEQ ID NO：6)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1003的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：7)：氨基酸序列，393个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
VB1004的DNA序列(SEQ ID NO：8)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTCGACGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1004的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：9)：氨基酸序列，393个氨基酸
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VB1005的DNA序列(SEQ ID NO：10)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
VB1005的蛋白序列(本发明所述的具有E7的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：11)：氨基酸序列，340个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
VB1006的DNA序列(SEQ ID NO：12)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGATATGG ACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
VB1006的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：13)：氨基酸序列，340个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
VB1007的DNA序列(SEQ ID NO：14)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGATATGG ACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTGGATGCAAGGGAGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
VB1007的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：15)：氨基酸序列，340个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFGCKGDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
VB1008的DNA序列(SEQ ID NO：16)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGATATGG ACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGGGACCCATCGGATCTCAGAAACCATAA
VB1008的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：17)：氨基酸序列，340个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPIGSQKP*
具有E6和E7的构建体：
仅是出于举例说明的目的，该构建体的不同结构域由“|”隔开，所述结构域以下述顺序排列：信号肽|人MIP-1α|铰链h1|铰链h4|Gly-Ser接头或Gly-Leu接头|hCH3IgG3|Gly-Ser接头或Gly-Leu接头|E7突变体|Gly-Ser接头或Gly-Leu接头|E6突变体。粗体的氨基酸或核苷酸表示突变位点。
VB1009的DNA序列(SEQ ID NO：18)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGATATGG ACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTCGACGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1009的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：19)：氨基酸序列，501个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
VB1016的DNA序列(SEQ ID NO：20)：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACGGATATGG ACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
VB1016的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体，SEQ ID NO：21)：氨基酸序列，501个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGGGSSGGGSGMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
SEQ ID NO：22：
>tr|Q778I6|Q778I6_HPV16E6蛋白OS＝16型人乳头瘤病毒GN＝E6PE＝4SV＝1；(下划线氨基酸表示可以缺失的氨基酸；可以突变的潜在的氨基酸突出显示)
MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
SEQ ID NO：23：
>sp|P03129|VE7_HPV16蛋白E7OS＝16型人乳头瘤病毒GN＝E7PE＝1SV＝1；(下划线氨基酸表示可以缺失的氨基酸；可以突变的潜在的氨基酸突出显示)
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
SEQ ID NO：24：
>sp|P06463|VE6_HPV18蛋白E6OS＝18型人乳头瘤病毒GN＝E6PE＝1SV＝1
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV
SEQ ID NO：25：
>sp|P06788|VE7_HPV18蛋白E7OS＝18型人乳头瘤病毒GN＝E7PE＝3SV＝2
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO：26：
铰链区(IgG3UH铰链)，12个氨基酸：ELKTPLGDTTHT
SEQ ID NO：27：
铰链区(IgG3，MH铰链，15个氨基酸)：EPKSCDTPPPCPRCP
SEQ ID NO：28：
Gly-Ser接头：GGGSSGGGSG
SEQ ID NO：29：hCH3IgG3：
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：30：接头：GLGGL
SEQ ID NO：31：VB1020的DNA序列：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG/ATGCATGGCGATACCCCAACACTCCATGAGTACATGCTGGACCTTCAGCCCGAGACTACGGATCTGTATGGCTATGGGCAGTTGAATGACTCATCTGAGGAGGAGGACGAAATAGACGGCCCAGCTGGTCAAGCCGAACCGGATAGAGCCCACTACAACATTGTGACCTTTTGCTGTAAGTGTGACAGCACTCTGAGACTGTGTGTTCAGTCCACTCATGTCGACATACGCACATTGGAGGATCTCCTGATGGGAACACTGGGAATTGTGTGTCCCATCTGTTCCCAAAAGCCT/GGAGGTGGAAGCAGTGGAGGCGGTTCAGGC/ATGTTCCAAGATCCTCAAGAACGTCCTCGTAAGCTGCCACAGCTGTGTACCGAGCTTCAGACCACCATTCACGACATCATCCTGGAGTGCGTCTATTGCAAACAGCAGCTCCTTAGAAGGGAAGTGTACGATTTTGCACGGAGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAATCCCTATGCGGTACGGGATAAATGCCTGAAGTTCTACAGCAAAATCTCCGAGTACCGGCACTACTGCTACTCTCTCTATGGGACGACTCTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCTTGTGCGATCTGCTGATTCGCTGCATTAATCGCCAGAAACCTCTGTGCCCAGAAGAGAAGCAAAGACACCTGGACAAGAAACAGCGATTCCACAACATCCGAGGGAGATGGACAGGGAGGTGTATGAGCTGCTGTCGGAGTTCTAGGACAAGGCGCGAAACCCAGCTTTGA
SEQ ID NO：32：VB1020的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体)，氨基酸序列，501个氨基酸
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
SEQ ID NO：33：VB1021的DNA序列：
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA/GGCCTCGGTGGCCTG/ATGCATGGTGACACACCAACCCTGCACGAATACATGCTCGATCTGCAGCCAGAGACTACCGACCTTTACGGCTATGGGCAGTTGAACGACAGCTCTGAGGAGGAGGACGAGATCGATGGTCCTGCTGGACAAGCAGAACCAGACAGAGCCCACTACAACATCGTAACCTTTTGCTGCAAGTGTGACAGTACCCTTCGTTTGTGCGTTCAGAGCACGCATGTCGACATTCGGACACTGGAGGATCTGCTCATGGGGACTCTGGGGATTGTGTGTCCTATTTGCAGCCAGAAACCA/GGCGGAGGATCTTCAGGAGGCGGGAGTGGC/ATGTTCCAAGACCCTCAGGAACGCCCTCGGAAACTGCCCCAATTGTGTACTGAGCTCCAGACAACGATACACGACATAATCCTGGAGTGCGTGTATTGCAAGCAGCAGCTTCTGAGGAGGGAAGTGTACGATTTTGCCAGGAGAGATGGCTGCATTGTCTACCGAGATGGCAATCCCTATGCGGTGTGTGATAAGTGTCTGAAGTTCTATTCCAAAATCAGCGAATATCGGCATTATTGCTACTCACTGTACGGAACTACCCTCGAACAGCAGTACAACAAACCGCTCTGTGATCTGCTGATCAGATGCATCAATCGGCAGAAACCCCTTTGTCCCGAAGAGAAGCAAAGACACCTGGACAAGAAGCAGAGGTTCCACAATACCCGAGGTCGTTGGACTGGGCGCTGCATGTCCTGTTGTCGCTCCTCTCGCACAAGGAGAGAGACACAACTGTGA
SEQ ID NO：34：VB1021的蛋白序列(本发明所述的同型二聚体构建体)，氨基酸序列，501个氨基酸：
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLGDTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG|MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDGCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNTRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
Claims (53)
1.编码氨基酸链的核酸分子，所述氨基酸链包含：(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元由SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93组成，其中所述抗原单元包含两种来自人乳头瘤病毒(HPV)的不同抗原，其中一种抗原是来源于早期蛋白E6的氨基酸序列，和另一种抗原是来源于早期蛋白E7的氨基酸序列，其中所述二聚化基序包含铰链区和促进二聚化的另一个结构域，其中所述促进二聚化的另一个结构域是免疫球蛋白结构域。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子是DNA分子。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗原单元是来源于HPV16和/或HPV18的早期蛋白E6和/或E7的抗原单元。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中在所述氨基酸链中的所述靶向单元、二聚化基序和抗原单元从N-端至C-端的顺序为靶向单元、二聚化基序和抗原单元。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸分子，其中所述信号肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列1-23组成。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述靶向单元由SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93组成。
7.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述促进二聚化的另一个结构域通过接头与所述铰链区连接。
8.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述铰链区是Ig来源的。
9.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述铰链区来源于IgG3。
10.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述铰链区具有形成一个、两个或数个共价键的能力。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述共价键是二硫键。
12.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域是羧基端C结构域，或是与所述C结构域相同的序列。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中所述羧基端C结构域来源于IgG。
14.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述二聚化基序的免疫球蛋白结构域具有同型二聚化的能力。
15.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述免疫球蛋白结构域具有通过非共价相互作用同型二聚化的能力。
16.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述非共价相互作用是疏水相互作用。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述二聚化结构域不包含CH2结构域。
18.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述二聚化基序由通过接头与人IgG3的CH3结构域连接的铰链外显子h1和h4组成。
19.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述二聚化基序由SEQ ID NO：3的氨基酸序列94-237组成。
20.根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述接头是G3S2G3SG接头。
21.根据权利要求18所述的核酸分子，其中所述接头是G3S2G3SG接头。
22.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元和所述二聚化基序通过接头连接。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述靶向单元由SEQ ID NO：1的氨基酸24-93组成。
24.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元由SEQ ID NO：3的氨基酸序列243-293组成。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含一个或多个氨基酸置换，所述置换位于选自由SEQ ID NO：22的F47R、L50G、C63R、C106R和I128T组成的列表的位置处。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的氨基酸序列243-293。
27.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述抗原单元由SEQ ID NO：11的氨基酸序列243-340组成。
28.根据权利要求27所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含在选自由SEQ ID NO：23的C24G和E26G组成的列表的位置处的一个或多个氨基酸置换。
29.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17的氨基酸序列243-340。
30.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列243-501组成。
31.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含来源于早期蛋白E6和E7的人乳头瘤病毒16(HPV16)的氨基酸序列。
32.根据权利要求30所述的核酸分子，其中所述抗原单元包含在选自由SEQ ID NO：22的F47R、L50G、C63G、C106G和I128T和SEQ ID NO：23的C24G和E26G组成的列表的位置处的一个或多个置换。
33.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列243-501组成。
34.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元由选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25中的氨基酸序列组成。
35.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸分子，其中所述抗原单元由选自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25中的氨基酸序列组成。
36.根据权利要求1所述的核酸分子，所述核酸分子是经过人密码子优化的。
37.根据权利要求1所述的核酸分子，其包含在载体中。
38.根据权利要求1所述的核酸分子，其配制用于施用给患者以在所述患者中诱导同型二聚体蛋白的产生。
39.由根据权利要求1-38任一项所述的核酸分子编码的同型二聚体蛋白。
40.根据权利要求39的同型二聚体蛋白，其为不具有任何信号肽序列的成熟形式。
41.氨基酸链，其包含(1)信号肽，(2)靶向单元，(3)二聚化基序和(4)抗原单元，所述靶向单元由SEQ ID NO：1的氨基酸序列24-93组成，和包含来自人乳头瘤病毒(HPV)的两种不同抗原的抗原单元，其中一种抗原是来源于早期蛋白E6的氨基酸序列，和另一种抗原是来源于早期蛋白E7的氨基酸序列，所述氨基酸链能够形成根据权利要求39或40所述的同型二聚体蛋白，其中所述二聚化基序包含铰链区和促进二聚化的另一个结构域，其中所述促进二聚化的另一个结构域是免疫球蛋白结构域。
42.一种药物组合物，其包含权利要求39或40所述的同型二聚体蛋白，或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求1-38中任一项所述的核酸分子。
43.包含权利要求1-38中任一项所述的核酸分子的宿主细胞。
44.一种用于制备权利要求39或40所述的同型二聚体蛋白或权利要求41的氨基酸链的方法，所述方法包括：
a)将权利要求1-38中任一项所述的核酸分子转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的所述同型二聚体蛋白或氨基酸链。
45.一种制备疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的权利要求1-38任一项所述的核酸分子，所述方法包括：
a)制备权利要求1-38中任一项所述的核酸分子；
b)将在步骤a)中得到的核酸分子溶解在药用载体、稀释剂或缓冲剂中。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述疫苗是DNA疫苗。
47.一种针对HPV的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的权利要求39所述的同型二聚体蛋白，或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求1-38中任一项所述的核酸分子，其中所述疫苗能够引发T细胞-和B细胞免疫应答。
48.根据权利要求47所述的疫苗，所述疫苗还包含药用载体和/或佐剂。
49.权利要求39所述的同型二聚体蛋白，或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求1-38中任一项所述的核酸分子在制备用于治疗或预防患者中HPV诱发的疾病或病症的药物中的用途。
50.权利要求39所述的同型二聚体蛋白，或权利要求41所述的氨基酸链，或权利要求1-38任一项所述的核酸分子在制备用于治疗或预防患者中HPV引起的传染病的药物中的用途。
51.根据权利要求49所述的用途，其中所述HPV诱发的疾病或病症是癌症。
52.根据权利要求49或50所述的用途，其中所述核酸分子是DNA。
53.根据权利要求49-52任一项所述的用途，其中所述药物为适于皮内或肌内施用的形式。
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