BR112014015016B1 - Proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticas,cadeia de aminoácido, molécula de ácido nucléico, composição farmacêutica,célula hospedeira, método de preparação de uma proteína homodimérica, método de preparação de uma vacina e vacina - Google Patents

Proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticas,cadeia de aminoácido, molécula de ácido nucléico, composição farmacêutica,célula hospedeira, método de preparação de uma proteína homodimérica, método de preparação de uma vacina e vacina Download PDF

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Abstract

PROTEÍNA HOMODIMÉRICA DE DUAS CADEIAS DE AMINOÁCIDOS IDÊNTICAS, CADEIA DE AMINOÁCIDO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UMA VACINA, VACINA E MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO, por a presente invenção relacionar-se a compostos terapêuticos, como vacinas contra o papilomavírus humano (HPV) e, em particular, a vacinas de DNA contra HPV16 ou HPV18. A invenção ainda relaciona-se à construção de proteína codificando peptídeos homodiméricos, cujos peptídeos podem ser liberados a partir de uma vacina de DNA ou usados separadamente. São descritos ainda formulações farmacêuticas, células hospedeiras e métodos para produção das vacinas, bem como métodos para o tratamento de várias doenças induzidas por HPV, como cânceres e doenças infecciosas por aplicação.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção relaciona-se a compostos terapêuticos, como vacinas contra o papilomavírus humano (HPV) e, em particular, a vacinas de DNA contra HPV16 e/ou HPV18. A invenção ainda relaciona-se à construção de proteína codificando peptídeos homodiméricos, cujos peptídeos podem ser liberados a partir de uma vacina de DNA ou usados separadamente. São descritas ainda formulações farmacêuticas, células hospedeiras e métodos para produção das vacinas, bem como métodos para o tratamento de várias doenças induzidas por HPV, como cânceres e doenças infecciosas por aplicação.
BASE DA INVENÇÃO
[002] Estabelece-se agora que o papilomavírus humano (HPV) é a causa do câncer cervical e outras malignidades associadas ao HPV, como cânceres anogenitais (ânus, vulvar, vaginal e peniano) e um subconjunto de cânceres de cabeça e pescoço. Em particular, o HPV16 e o HPV18 são responsáveis por aproximadamente 70% de todos os cânceres cervicais mundialmente.
[003] Até o momento, duas vacinas contra HPV profiláticas estão no mercado (Gardasil e Cervarix). O objetivo das vacinas profiláticas é induzir respostas imunes humorais através do estímulo da produção de anticorpos neutralizantes, específicos com relação às proteínas capsidiais do vírus do HPV, L1 e L2. Embora as vacinas preventivas sejam um marco importante para o controle do câncer cervical induzido pelo HPV e possivelmente outras malignidades associadas ao HPV, o efeito dessas vacinas não será significativamente observado durante 20-40 anos (Ma B et al., Current Cancer Therapy Reviews, 2010). Além disso, já que a cobertura da vacinação em massa das vacinas profiláticas é, até o momento, limitada além de uma população substancial mundial que já está infectada pelo HPV, as malignidades associadas ao HPV continuarão a progredir. Dessa forma, será importante desenvolver vacinas terapêuticas específicas de HPV a fim de reduzir a mortalidade e a morbidade de malignidades associadas com HPV e suas lesões precursoras (Ma B et al., Current Cancer Therapy Reviews, 2010).
[004] O desenvolvimento de várias vacinas contra câncer e estratégias de imunoterapia contra o câncer se expandiu completamente nas últimas duas décadas. Ainda, apenas uma vacina terapêutica contra câncer, chamada Provenge (Dendreon INC) foi aprovada até o momento para ser aplicada como terapia padrão para câncer de próstata. Notavelmente, devido a razões éticas, a maioria das vacinas terapêuticas contra câncer é testada em um grupo de paciente portando um tumor de estágio final. Esse grupo de paciente é substancialmente imunossuprimido, significando que as células tumorais escaparam, há muito tempo, do sistema imune e contribuíram para induzir a tolerância imunológica ao tumor junto à carcinogênese. Além disso, a escolha dos antígenos (específicos ao tumor vs. associados ao tumor) aplicada como vacinas é crítica a fim de induzir as respostas imunes específicas ao tumor e evitar a eliminação de células saudáveis nos pacientes que podem levar a eventos adversos sérios. Dessa forma, os principais desafios na imunoterapia do câncer são quebrar a tolerância imunológica e ativar as funções efetoras específicas do tumor para reconhecer e eliminar as células tumorais. Embora alguns relatos de caso mostrem uma resposta clínica às vacinas terapêuticas contra câncer em pacientes com tumor em estágio final, o endpoint primário mais comum é observar o impacto na sobrevida geral, em comparação com a terapia convencional (cirurgia, quimioterapia e terapia com radiação). Entretanto, muitos estudos não são conclusivos ou falham completamente em mostrar isso. Uma razão para os resultados negativos está no grupo de pacientes que carregam tumores em estágio final que são desafiadores em tratar em primeiro lugar. Uma possível estratégia poderia ser incluir pacientes com tumores em estágio inicial em estudos de vacina terapêutica.
[005] Uma estratégia é objetivar as lesões pré-cancerosas. Os desafios dessa estratégia são principalmente a falta de biomarcadores confiáveis que são especificamente expressados por lesões pré-cancerosas com relação a muitos tecidos e triagem médica fraca (não-existente ou que o método existente sofre pela falta de sensibilidade). Excepcionalmente, este não é o caso das malignidades induzidas por HPV. Por exemplo, a maioria dos países ocidentais possuem bons programas de triagem para displasia cervical e câncer cervical através da realização do teste de Papanicolau (teste de Papanicolau com esfregaço). Se houver resultados incertos ou anormais a partir do teste de Papanicolau, colposcopia será realizada (Aliança Nacional do Câncer Cervical). O teste de HPV pode também ser recomendado para alguns pacientes para detectar a presença de tipo de HPV de “altor risco” na lesão pré-cancerosa. Dessa forma, o HPV representa um biomarcador potencial para lesões pré- cancerosas associadas com HPV, em particular, displasia intraepitelial cervical (CIN).
[006] Vacinas de DNA mostraram promessa crescente com relação ao tratamento de doenças humanas, em particular, os cânceres. As vacinas de DNA induzem fortes respostas imunes específicas ao antígeno e podem ser repetidamente administradas para manter as respostas imunes alvo- específicas. Essas vacinas são consideradas como sendo seguras e simples e baratas para produzir em larga escala, em comparação com outros formatos terapêuticos contra câncer. Diversas intervenções imunoterapêuticas falham em induzir memória imunológica. Excepcionalmente, a vacinação de DNA garante a liberação sustentada do produto da vacina in vivo, que potencializa a memória imunológica específica ao antígeno. A distribuição direta dos antígenos às células que apresentam antígenos profissionais (APCs) estimula as respostas imunes de célula T CD4+ e CD8+ in vivo. Essas respostas imunes celulares fortes foram demonstradas a fim de especificamente reconhecer e eliminar eficientemente as células malignas, antígeno-positivas tanto in vitro quanto in vivo.
[007] Há ainda uma necessidade na técnica de vacinas melhoradas para induzir respostas imunes fortes e específicas contra HPV, responsável por doenças infecciosas e cânceres.
OBJETO DA INVENÇÃO
[008] É um objeto das configurações da invenção fornecer compostos terapêuticos específicos e altamente eficazes, como vacinas de DNA contra doenças e condições causadas por HPV.
RESUMO DA INVENÇÃO
[009] Descobriu-se pelos inventores da presente que através da combinação dos antígenos dos produtos genéticos iniciais E6 e E7 a partir do HPV, assim como a partir de HPV16 e/ou HPV18 com o ancer de seleção de alvo de hMIP-1α, vacinas terapêuticas são fornecidas, em que os ancer r imunogênicos fortes dos produtos genéticos de HPV estão ancer r com alta eficiência aos APCs para induzir uma resposta ancer específica e forte. Os produtos, de acordo com a presente invenção, são primariamente elaborados como vacinas terapêuticas de ácido nucléico, como vacinas de DNA, em que uma construção de ácido nucléico que codifica a construção de vaccibody [vacina que injeta anticorpos no corpo] é usada como o composto terapêutico que leva à produção in vivo do produto protéico dentro da pessoa que recebe a vacina. Entretanto, como uma ancer r vi, o próprio produto protéico pode ser formulado e usado diretamente na vacina.
[010] Conformemente, em um primeiro ancer, a presente invenção relaciona-se a uma proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticas, cada cadeia de aminoácido compreendendo (1) um ancer de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) uma unidade antigênica, a referida unidade de seleção de alvo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 80% de identificação de sequência com a sequência de aminoácido 24-93 de SEQ ID NO:1, e uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de ancer r virus humano (HPV), como uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de HPV16 e/ou HPV18, como uma unidade antigênica derivada de proteínas iniciais E6 e/ou E7 de HPV16 e/ou HPV18.
[011] Em um segundo ancer, a presente invenção relaciona-se a uma cadeia de aminoácido compreendendo (1) um ancer de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) uma unidade antigênica, a referida unidade de seleção de alvo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 80% de identificação de sequência com a sequência de aminoácido 24-93 de SEQ ID NO:1, e uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de ancer r virus humano (HPV), como uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de HPV16 e/ou HPV18, cuja cadeia de aminoácido é capaz de formar uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção.
[012] Em um terceiro ancer, a presente invenção relaciona-se a uma molécula de ácido nucléico, como um DNA, codificando uma cadeia de aminoácido compreendendo (1) um ancer de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) uma unidade antigênica, a referida unidade de seleção de alvo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 80% de identificação de sequência com a sequência de aminoácido 24-93 de SEQ ID NO:1, e uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de ancer r virus humano (HPV), como uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de HPV16 e/ou HPV18, como uma unidade antigênica derivada de proteínas iniciais E6 e/ou E7 de HPV16 e/ou HPV18, cuja cadeia de aminoácido é capaz de formar uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção.
[013] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção, ou uma cadeia de aminoácido, de acordo com a invenção, ou a molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção, para uso como um medicamento.
[014] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção, ou uma cadeia de aminoácido, de acordo com a invenção, ou a molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção.
[015] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção.
[016] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a um método para preparação de uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção, ou uma cadeia de aminoácido da invenção, o método compreendendo a) a transfecção da molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção, para uma população ancer r; b) cultivo da população ancer r; c) coleta e purificação da proteína homodimérica, ou cadeia de aminoácido, expressada a partir da população ancer r.
[017] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a um método para preparação de uma vacina, como uma vacina de DNA, compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção, o método compreendendo a) a preparação de uma molécula de ácido nucléico, de acordo com a invenção; b) a dissolução da molécula de ácido nucléico obtida na etapa a) em um transportador, diluente ou tampão farmaceuticamente aceitável.
[018] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a uma vacina contra HPV compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção, ou uma cadeia de aminoácido, de acordo com a invenção, ou molécula de ácido nucléico, como um DNA, de acordo com a invenção, em que a referida vacina é capaz de estimular uma resposta ancer de célula T e célula B.
[019] Em um ancer adicional, a presente invenção relaciona-se a um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição induzida por HPV, como um ancer ou uma doença infecciosa, causada por HPV em um paciente, o método compreendendo a administração ao paciente em necessidade deste, de uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção, ou uma cadeia de aminoácido, de acordo com a invenção, ou a molécula de ácido nucléico, como um DNA, de acordo com a invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[020] Figura 1: A estrutura geral das vacinas de vaccibody com antígeno de fusão de E7/E6. São mostrados formatos de DNA e de proteína. A vaccibody consiste de três módulos funcionais; a quimiocina humana MIP-1α (LD78β) no módulo de seleção de alvo, sequências de articulação e CH3 da IgG3 humana no módulo de dimerização e fusão completa de E7 e/ou E6 no módulo de vacina.
[021] Figura 2: O modo de ação sugerido para uma vacina de DNA Vaccibody contra malignidades induzidas por HPV. Plasmídeo de DNA puro que codifica vaccibody é injetado intradermicamente, seguido por eletroporação. O plasmídeo é absorvido pelas células locais e proteínas de vaccibody são produzidas e secretadas. As moléculas de seleção de alvo, quimiotáticas atraem CCR1 e CCR5 que expressam células apresentadoras de antígeno (APC) e garantem a ligação e a captação nas células dendríticas (DC). As DC apresentarão peptídeos antigênicos às células T CD4+ e CD8+ e as células T CD8+ eliminarão as células infectadas e transformadas por HPV no colo do útero.
[022] Figura 3: Resultados de ELISPOT mostrando a quantidade de respostas de célula T específicas a E7 e E6 como uma função de diferentes quantidades de vacina administradas. Camundongos C57BL/6 receberam injeção i.d. com plasmídeos de DNA puro que codificam VB1009 e VB1016 e seus controles correspondentes, seguidos por eletroporação (Cellectis, França) no dia 0 e dia 7. Esplenócitos foram coletados no dia 21 e estimulados com peptídeo E7 ou E6 com restrição de MHC de classe I durante 24h. A quantidade de esplenócitos que secretam IFNY foi calculada por ELISPOT. (A) Respostas E7-específicas após a vacinação i.d. com 25μg de VB1009, controle 1 (antígeno isolado) e pUMVC4a (vetor vazio). (B) Respostas E7-específicas após vacinação i.d. com 12,5 e 1,4μg de VB1016, controle 2 (antígeno isolado) e pUMVC4a (vetor vazio). (C) Respostas E6-específicas após a vacinação i.d. com 12,5 e 1,4μg de VB1016, controle 2 (antígeno isolado) e pUMVC4a (vetor vazio).
[023] Figura 4. Efeito terapêutico de VB1016 mostrado pelo volume tumoral medido. Camundongos C57BL/6 receberam injeção s.c. com 5x105 de células TC-1 no dia 0. No dia 3 e dia 10, os camundongos receberam injeção i.d. com 12,5μg de plasmídeos de DNA puro que codificam VB1016, controle 2 ou vetor vazio, seguidos por eletroporação (Cellectis, França). Os tamanhos de tumor foram medidos por calibrador, duas a três vezes por semana e o volume tumoral calculado.
[024] Figura 5. Efeito terapêutico de VB1016 mostrado pelo volume tumoral medido. Camundongos C57BL/6 receberam injeção s.c. na área do pescoço com 5x104 de células TC-1 no dia 0. No dia 3, 7 e dia 10, os camundongos receberam injeção i.d. com 20μg ou 2μg de plasmídeos de DNA puro que codificam VB1016, controle 2 ou vetor vazio, seguidos por eletroporação (Cellectis, França). Os tamanhos de tumor foram medidos por calibrador, duas a três vezes por semana e o volume tumoral calculado.
[025] Figura 6. Efeito terapêutico de VB1020 e VB1021 mostrado pelo volume tumoral medido. Camundongos C57BL/6 receberam injeção s.c. na coxa com 5x104 de células TC-1 no dia 0. No dia 3 e dia 10, os camundongos receberam injeção i.d. com 10μg de plasmídeos de DNA puro que codificam VB1016, VB1020, VB1021 ou vetor vazio, seguidos por eletroporação (Cellectis, França). Os tamanhos de tumor foram medidos por calibrador, duas a três vezes por semana e o volume tumoral calculado.
DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[026] A tecnologia de construções e de vacina de DNA descrita no presente pelos inventores da presente invenção (também referida como moléculas/vacinas/construções "vaccibody") representa uma nova estratégia de vacina para induzir respostas imunes fortes e específicas com relação a doenças infecciosas e câncer. A HPV E6/E7, como vacina contra HPV16 ou HPV18 E6/E7 descrita no presente, pode ser administrada como uma vacina de DNA por injeção intradérmica, preferencialmente seguida por eletroporação. Esta resulta na captação da construção de DNA que codifica a vaccibody-vacina contra HPV16 e/ou HPV18 E6/E7 nas células no local da injeção (derme), incluindo células dendríticas (células de Langerhans), levando à produção in vivo da molécula vaccibody-E6/E7.
[027] Os produtos genéticos iniciais E6 e E7 a partir de tipos de HPV de “alto risco”, como HPV16 e 18, podem ser responsáveis pela transformação das células epiteliais basais e pela indução de lesões pré- cancerosas. Ambas as proteínas consistem de epítopos altamente imunogênicos e são mostradas no presente como induzindo fortes respostas imunes, levando à erradicação específica de células tumorais positivas com relação a HPV de “alto risco” tanto in vitro quanto in vivo.
[028] A molécula vaccibody descrita no presente é um homodímero consistindo de três módulos; módulo de seleção de alvo, módulo de dimerização e o módulo de vacina (Figura 1). Os genes que codificam os três módulos são geneticamente criados para serem expressados como um gene. Quando expressada in vivo, a molécula vaccibody seleciona como alvo as células apresentadoras de antígeno (APCs), que resulta em uma potência aumentada da vacina em comparação com os antígenos idênticos, não-alvo. A expressão in vivo da proteína inflamatória de macrófago humano 1 alfa de quimiocina (hMIP-1α/ LD78β) leva à atração de DCs, neutrófilos e outras células imunes carregando os receptores de CCR1 e CCR5 ao local da expressão. Dessa forma, a molécula vaccibody consistindo de hMIP-1α como o módulo de seleção de alvo não apenas selecionará como alvo os antígenos às células específicas, mas, além disso, fornecerá um efeito amplificador de resposta (efeito adjuvante) através do recrutamento de células imunes específicas ao local de injeção. Esse mecanismo único pode ser de grande importância em um cenário clínico onde pacientes podem receber a vacina sem nenhum adjuvante adicional desde que a própria vacina forneça o efeito adjuvante.
[029] Os inventores da presente invenção descrevem no presente construções de vacina onde o módulo antigênico consiste da sequência genética completa de E7 na fusão com a sequência completa de E6, originando- se a partir do subtipo de HPV16 ou HPV18. A vantagem desse formato é que tanto E6 quanto E7 estarão presentes em uma construção e podem, dessa forma, ser igualmente expressadas in vivo. Consequentemente, uma molécula vaccibody consistindo de uma unidade multiantigênica pode representar níveis iguais de E6 e E7 com relação ao sistema imune. Os produtos genéticos de HPV16 E6 e E7 são oncogênicos em sua forma natural. Para neutralizar suas propriedades oncogênicas, mutações em locais específicos podem ser introduzidas na sequência genética de E6 e E7.
[030] As mutações, incluindo deleções, podem ser introduzidas em locais específicos, conhecidos por inibirem as propriedades oncogênicas de E6 e E7, como qualquer uma descrita em qualquer uma das referências, como Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991; Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf); Nguyen, M et al., J Virol, 2002; Nominé Y et a., Molecular Cell, 2006; Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, Polakova I et al., Vaccine, 2010; Xie Q, Virologica Sinica, 2011; Mesplède T et al., J Virol, 2012; US 2008/0102084 e US6306397, cujas referências são incorporadas, no presente, para referência. Conformemente, em alguns aspectos da invenção, as construções, de acordo com a presente invenção, contêm construções quiméricas de HPV16 E6, E7 ou HPV16 E6/E7 com uma ou mais mutações em qualquer um de HPV16 E6, E7 ou ambos em uma posição conhecida por inibir as propriedades oncogênicas, conforme descrito em Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991; Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf); Nguyen, M et al., J Virol, 2002; Nominé Y et a., Molecular Cell, 2006; Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, Polakova I et al., Vaccine, 2010; Xie Q, Virologica Sinica, 2011; Mesplède T et al., J Virol, 2012; US 2008/0102084 ou US6306397. Em outros aspectos da invenção, as construções, de acordo com a invenção, contêm construções quiméricas de HPV18 E6, E7 ou HPV18 E6/E7 com uma ou mais mutações em qualquer um de HPV18 E6, E7 ou ambos em uma posição conhecida por inibir as propriedades oncogênicas, conforme descrito em Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991; Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf); Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, US 2008/0102084 e US6306397.
[031] Há uma possibilidade de que a metade vaccibody (módulos de seleção de alvo e dimerização) pode erradicar as propriedades oncogênicas de proteínas selvagens E6 e E7 na proteína de fusão final. Dessa forma, ainda em outro aspecto da invenção, está a utilização de sequências completas, selvagens de E6 e/ou E7 na construção de vaccibody.
[032] A invenção descreve diversas variantes de vacinas de DNA terapêuticas contra HPV Vaccibody, todas baseadas no formato geral descrito na figura 1, as vacinas terapêuticas, de DNA contra HPV vaccibody codificam os genes que são naturalmente expressados em humanos; os genes de módulo de seleção de alvo que codificam a hMIP-1α de quimiocina, que se liga aos seus receptores cognatos, CCR1 e CCR5 expressados na superfície celular das APCs. Os genes de módulo de dimerização podem codificar regiões de articulação e cadeia pesada 3 constante, como a partir de IgG3 humana, que conecta dois monômeros vaccibody, gerando uma molécula de homodímero. Os genes que codificam o módulo de vacina da estratégia atual consistem de HPV, como antígenos de HPV16 e/ou HPV18 E7 e E6, como os antígenos de HPV16 E7 e E6 de extensão completa, opcionalmente compreendendo uma ou mais mutações para inibir as propriedades oncogênicas. Uma vez administrada in vivo por injeção i.d., seguida por eletroporação, as células dérmicas que absorvem a construção da vacina expressarão a molécula de HPV vaccibody. As vacinas vaccibody produzidas in vivo selecionam como alvo o CCR1 e o CCR5, expressados na superfícies das APCs na pele, em particular, as DCs. A ligação da molécula vaccibody aos seus receptores cognatos leva à internalização do complexo na APC, à degradação das proteínas em pequenos peptídeos que são carregados nas moléculas de MHC e apresentados às células T CD4+ e CD8+ para induzir as respostas imunes específicas ao HPV16 E6 e E7. Uma vez simulado e com a ajuda das células T CD4+ ativadas, as células T CD8+ selecionarão como alvo e eliminarão as células que expressam HPV16 E6 e E7 (Figura 2). Essas respostas imunes potencializadas a uma vacina com um efeito adjuvante "integrado" podem potencialmente neutralizar a escapada tumoral (vigilância imune tumoral) através da quebra da tolerância imunológica e eliminar eficientemente as células malignas. A unidade de seleção de alvo de hMIP-1α pode ser conectada através de uma metade de dimerização, como uma região de articulação, a uma unidade antigênica, em que a última está na extremidade COOH-terminal ou NH2-terminal. A presente invenção não apenas relaciona-se a uma sequência de DNA que codifica essa proteína recombinante, mas também a vetores de expressão compreendendo essas sequências de DNA, linhagens celulares compreendendo os referidos vetores de expressão, aos tratamentos de mamíferos, preferencialmente pela imunização através de DNA Vaccibody, RNA Vaccibody ou proteína Vaccibody e finalmente aos farmacêuticos e um kit compreendendo as referidas moléculas.
[033] A metade de dimerização nas proteínas, de acordo com a presente invenção, pode ser construída para incluir uma região de articulação e um domínio imunológico (por exemplo, domínio CY3), por exemplo, domínio carboxiterminal C (domínio CH3), ou uma sequência que é substancialmente idêntica ao referido domínio C. A região de articulação pode ser derivada de Ig e contribuir com a dimerização através da formação de uma(s) ligação(ões) covalente(s) intercadeia(s), por exemplo, ligação(ões) dissulfeto. Além disso, esta funciona como um espaçador flexível entre os domínios permitindo que as duas unidades de seleção de alvo se liguem simultaneamente às duas moléculas alvo em APC, expressadas com distâncias variáveis. Os domínios de imunoglobulina contribuem com a homodimerização através de interações não-covalentes, por exemplo, interações hidrofóbicas. Em uma configuração preferida, o domínio CH3 é derivado de IgG. Essas metades de dimerização podem ser trocadas por outras metades de multimerização (por exemplo, de outros isotipos/subclasses de Ig). Preferencialmente, a metade de dimerização é derivada de proteínas humanas nativas, como IgG humana.
[034] Deve-se compreender que a metade de dimerização pode ter qualquer orientação com relação à unidade antigênica e à unidade de seleção de alvo. Em uma configuração, a unidade antigênica está na extremidade COOH-terminal da metade de dimerização com a unidade de seleção de alvo na extremidade N-terminal da metade de dimerização. Em outra configuração, a unidade antigênica está na extremidade N-terminal da metade de dimerização com a unidade de seleção de alvo na extremidade COOH- terminal da metade de dimerização.
[035] O pedido internacional WO 2004/076489, que é incorporado no presente para referência divulga sequências de ácido nucléico e vetores, que podem ser usados, de acordo com a presente invenção.
[036] As proteínas, de acordo com a presente invenção, incluem uma unidade antigênica, derivada de HPV, como antígenos de HPV16 E7 e E6, como os antígenos de HPV16 E7 e E6 de extensão completa, bem como fragmentos imunogênicos ou variantes destes. A sequência antigênica deve ser de extensão suficiente. A extensão mínima dessa unidade antigênica pode ser de aproximadamente 9 aminoácidos. Conformemente em algumas configurações, a unidade antigênica derivada de HPV compreende uma sequência de aminoácido de, no mínimo, 9 aminoácidos correspondendo a, no mínimo, aproximadamente 27 nucleotídeos em uma sequência de ácidos nucléicos que codifica essa unidade antigênica. Preferencialmente, a unidade antigênica derivada de HPV é consideravelmente mais longa, como os antígenos de HPV16 E7 e E6 de extensão completa. Diversidade surge dentro de um dado genótipo de HPV através das alterações limitadas de nucleotídeo nas regiões de codificação (em uma frequência de < 2%) e de não-codificação (em uma frequência de < 5%) (Bernard, HU et al., Int J Cancer, 2006). Essas variantes segregam filogeneticamente com base em sua origem geográfica e são, portanto, marcadas como Europeia, Africana, Asiática, Américo-Asiática e Norte- Americana. A inserção dessas sequências em um formato Vaccibody pode levar à ativação de ambos os grupos da resposta imune.
[037] A imunização através da proteína Vaccibody, do DNA Vaccibody ou do RNA Vaccibody, os últimos dois realizados, por exemplo, por injeção intramuscular ou intradérmica com ou sem uma eletroporação na sequência, são todos métodos viáveis, de acordo com a presente invenção.
[038] Conforme discutido acima, a presente invenção relaciona-se a uma composição de vacina contra câncer ou doenças infecciosas causadas por HPV, a composição da vacina compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz do ácido nucléico que codifica a molécula da invenção ou degenera variantes desta. A vacina pode ser capaz de estimular uma resposta imune de célula T e célula B. A presente invenção também relaciona-se a um kit compreendendo DNA, RNA ou proteína Vaccibody para fins diagnósticos, médicos ou científicos.
[039] A invenção ainda relaciona-se a um método de preparação da molécula recombinante da invenção compreendendo a transfecção do vetor compreendendo a molécula da invenção para uma população celular; cultivo da população celular; coleta da proteína recombinante expressada a partir da população celular; e purificação da proteína expressada.
[040] As sequências de nucleotídeo descritas acima podem ser inseridas em um vetor adequado para terapia genética, por exemplo, sob o controle de um promotor específico e introduzido nas células. Em algumas configurações, o vetor compreendendo a referida sequência de DNA é um vírus, por exemplo, um adenovírus, vírus vaccínia ou um vírus adeno-associado. Em algumas configurações, um retrovírus é usado como vetor. Exemplos de retrovírus adequados são, por exemplo, MoMuLV ou HaMuSV. Para fins de terapia genética, as sequências de DNA/RNA, de acordo com a invenção, podem também ser transportadas para as células alvo na forma de dispersões coloidais. Elas compreendem, por exemplo, lipossomas ou lipoplexos.
[041] A presente invenção abrange o uso de uma unidade de seleção de alvo, bem como uma unidade antigênica tendo grau mínimo de identificação de sequência ou homologia de sequência com sequência(s) de aminoácido definida(s) no presente ou com um polipetídeo tendo as propriedades específicas definidas no presente. A presente invenção abrange, em particular, o uso de variantes de peptídeo ou unidades de peptídeo a serem usadas nas construções, de acordo com a presente invenção, tendo um grau de identificação de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, or SEQ ID NO:34. No presente, o termo “variante” significa uma entidade tendo um certo grau de identificação de sequência com as sequências de aminoácido objeto ou as sequências de nucleotídeo objeto, onde a sequência de aminoácido objeto preferencialmente é SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, ou SEQ ID NO:34.
[042] Em um aspecto, a sequência de aminoácido e/ou sequência de nucleotídeo variante ou de fragmento deve fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou potencializa a atividade de um polipeptídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34.
[043] No presente contexto, uma sequência variante é coletada para incluir uma sequência de aminoácido, que pode ser, no mínimo, 80%, no mínimo, 85%, no mínimo, 90%, no mínimo, 95%, no mínimo, 96%, no mínimo, 97%, no mínimo, 98% ou, no mínimo, 99%, idêntica à sequência objeto. Tipicamente, as variantes usadas, de acordo com a presente invenção, compreenderão os mesmos locais ativos, etc., como a sequência de aminoácido objeto. Embora a homologia possa também ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácido tendo propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção, é preferida para expressar a homologia em termos de identificação de sequência.
[044] As comparações de identificação de sequência podem ser conduzidas visualmente, ou mais comumente, com o auxílio de programas de computador de comparação de sequência prontamente disponíveis. Esses programas de computador comercialmente disponíveis usam algoritmos complexos de comparação para alinhar duas ou mais sequências que melhor reflitam os eventos evolucionários que possam ter levado a diferenças entre as duas ou mais sequências. Portanto, esses algoritmos funcionam com um sistema de classificação, recompensando o alinhamento de aminoácidos idênticos ou semelhantes e penalizando a inserção das gaps, extensões de gap e alinhamento de aminoácidos não-semelhantes. O sistema de classificação dos algoritmos de comparação inclui: i) alinhamento de um escore de penalidade toda vez que uma gap for inserida (escore de penalidade de gap), ii) alinhamento de um escore de penalidade toda vez que uma gap existente for estendida com uma posição extra (escore de penalidade de extensão), iii) alinhamento de altos escores mediante o alinhamento de aminoácidos idênticos, e iv) alinhamento de escores variáveis mediante o alinhamento de aminoácidos não-idênticos.
[045] Muitos programas de alinhamento permitem que as penalidades de gap sejam modificadas. Entretanto, é preferido usar os valores padrão ao usar esse software para comparações de sequências.
[046] Os escores fornecidos para alinhamento de aminoácidos não-idênticos são indicados, de acordo com uma matriz de classificação, também chamada de matriz de substituição. Os escores fornecidos nessas matrizes de substituição estão refletindo o fato de que a probabilidade de um aminoácido ser substituído por outro durante a evolução varia e depende da natureza física/química do aminoácido a ser substituído. Por exemplo, a probabilidade de um aminoácido polar ser substituído por outro aminoácido polar é maior em comparação com ser substituído por um aminoácido hidrofóbico. Portanto, a matriz de classificação indicará o escore mais alto para aminoácidos idênticos, o escore mais baixo para aminoácidos não-idênticos, mas semelhantes e o escore ainda menor para aminoácidos não- idênticos, não-semelhantes. As matrizes de classificação mais frequentemente usadas são as matrizes PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), as matrizes BLOSUM (Henikoff e Henikoff (1992)) e a matriz Gonnet (Gonnet et al. (1992)).
[047] Os programas de computador adequados para realização de alinhamento incluem, entre outros, Vector NTI (Invitrogen Corp.) e os programas ClustalV, ClustalW e ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Uma seleção de diferentes ferramentas de alinhamento está disponível a partir do servidor da ExPASy Proteomics em www.expasy.org. Outro exemplo de software que pode realizar o alinhamento de sequência é o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool [Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico]), que está disponível a partir da webpage do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia, que pode ser encontrado em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e que foi primeiramente descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410.
[048] Uma vez que o software tiver produzido um alinhamento, é possível calcular a % de similaridade e a % de identificação de sequência. O software tipicamente faz isso como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.
[049] Em uma configuração, é preferido usar o software ClustalW para realização de alinhamentos de sequência. Preferencialmente, o alinhamento com o ClustalW é realizado com os seguintes parâmetros para alinhamento em pares:
[050] O ClustalW2, por exemplo, é disponibilizado na Internet pelo European Bioinformatics Institute [Instituto Europeu de Bioinformática] na webpage de EMBL-EBI www.ebi.ac.uk sob as ferramentas - análise de sequência - ClustalW2. Atualmente, o endereço exato da ferramenta do ClustalW2 é www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.
[051] Em outra configuração, é preferido usar o programa Align X in Vector NTI (Invitrogen) para realização dos alinhamentos de sequência. Em uma configuração, o Exp10 pode ter sido usado com configurações padrão: - Penalidade de início de gap: 10 - Penalidade de extensão de gap: 0,05 - Variação de penalidade de separação de gap: 8 - Matriz de classificação: blosum62mt2
[052] Dessa forma, a presente invenção também abrange o uso de variantes, fragmentos e derivados de qualquer sequência de aminoácido de uma proteína, polipeptídeo, metade ou domínio, conforme definido no presente, particularmente aqueles de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34.
[053] As sequências, particularmente aquelas de variantes, fragmentos e derivados de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34, podem também ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos, que produzem uma alteração silencionsa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácido podem ser realizadas com base na similaridade na polaridade, na carga, na solubilidade, na hidrofobicidade, na hidrofilicidade e/ou na natureza anfipática dos resíduos, contanto que a atividade de ligação secundária da substância seja retida. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspático e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos cabeça polares, não carregados possuindo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.
[054] A presente invenção também abrange a substituição conservativa (substituição e reposição são usadas no presente o que significa o intercâmbio de um resíduo de aminoácido existente, por um resíduo alternativo) que pode ocorrer, isto é, substituição do mesmo tipo, como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. A substituição não-conservativa também pode ocorrer, isto é, a partir de uma classe de resíduo para outra ou alternativamente envolvendo a inclusão de aminoácidos não-naturais, como ornitina (doravante, referido como Z), ornitina de ácido diaminobutírico (doravante, referido como B), norleucina ornitina (doravante, referido como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.
[055] Substituições conservativas que podem ser realizadas estão, por exemplo, dentro dos grupos de aminoácidos básicos (Arginina, Lisina e Histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos alifáticos (Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina), aminoácidos polares (Glutamina, Asparagina, Serina, Treonina), aminoácidos aromáticos (Fenilalanina, Triptofano e Tirosina), aminoácidos hidroxila (Serina, Treonina), aminoácidos grandes (Fenilalanina e Triptofano) e aminoácidos pequenos (Glicina, Alanina).
[056] Reposições também pode ser realizadas por aminoácidos não-naturais que incluem; aminoácidos alfa* e alfa-dissubstituídos*, aminoácidos N-alquila*, ácido lático*, derivados de haleto de aminoácidos, como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil- glicina*, β-alanina*, ácido L-a-amino butírico*, ácido L-y-amino butírico*, ácido L- a-amino isobutírico*, ácido L-ε-amino capróico#, ácido 7-amino heptanóico*, L- metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L- hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados de metila de fenilalanina (Phe), como 4- metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metil)*, L-Phe (4- isopropil)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxila)*, ácido L- diaminopropiônico # e L-Phe (4-benzil)*. A notação* foi utilizada para o fim da discussão acima (relacionado-se à substituição homóloga ou não-conservativa), para indicar a natureza hidrofóbica dos derivados, considerando-se que # foi utilizado para indicar a natureza hidrofílica do derivado, #* indica características anfifáticas.
[057] As sequências de aminoácido variantes podem incluir grupos espaçadores adequados que podem ser inseridos entre quaisquer dois resíduos de aminoácido da sequência, incluindo grupos alquila, como grupos metila, etila ou propila além dos espaçadores de aminoácido, como resíduos de glicina ou β-alanina. Uma forma adicional de variação, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácido na forma de peptóide, será bem compreendida pelos peritos. Para evitar dúvida, “a forma de peptóide” é usada para referir-se a resíduos de aminoácido variantes, em que o grupo substituinte a-carbono está no átomo de nitrogênio do resíduo ao invés do a-carbono. Processos de preparação de peptídeos na forma de peptóide são conhecidos na técnica, por exemplo, Simon RJ et al. (1992), Horwell DC. (1995).
[058] Em uma configuração, a unidade de seleção de alvo variante usada na proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, é variante, tendo a sequência de aminoácidos, no mínimo, 80%, no mínimo, 85%, no mínimo, 90%, no mínimo, 95%, no mínimo, 96%, no mínimo, 97%, no mínimo, 98% ou, no mínimo, 99% de identificação de sequência de aminoácido relacionada.
[059] Em um aspecto, preferencialmente a proteína ou a sequência usada na presente invenção está em uma forma purificada. O termo “purificada” significa que um dado componente está presente em um alto nível. O componente é desejavelmente o componente ativo predominante presente em uma composição.
[060] Uma “variante” ou “variantes” referem-se a proteínas, polipeptídeos, unidades, metades, domínios ou ácidos nucléicos. O termo “variante” pode ser usado intercambiavelmente com o termo “mutante”. As variantes incluem inserções, substituições, transversões, truncações e/ou inversões em um ou mais locais na sequência de aminoácido ou nucleotídeo, respectivamente. As frases “polipeptídeo variante”, "polipeptídeo”, “variante” e “enzima variante” significam um polipeptídeo/proteína que tem uma sequência de aminoácido que foi modificada a partir da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Os polipeptídeos variantes incluem um polipeptídeo tendo uma certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, de identificação de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34.
[061] “Ácidos nucléicos variantes” podem incluir sequências que são complementares a sequências que são capazes de hibridizar às sequências de nucleotídeo aqui apresentadas. Por exemplo, uma sequência variante é complementar às sequências capazes de hibridização sob condições rígidas, por exemplo, 50°C e 0,2X SSC (1X SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,0), às sequências de nucleotídeo aqui apresentadas. Mais particularmente, o termo variante abrange sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridização sob condições altamente rígidas, por exemplo, 65°C e 0,1X SSC, às sequências de nucleotídeo aqui apresentadas. O ponto de fusão (Tm) de um ácido nucléico variante pode ser aproximadamente 1, 2 ou 3°C menor do que o Tm do ácido nucléico selvagem. Os ácidos nucléicos variantes incluem um polipeptídeo tendo uma certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, de identificação de sequência com o ácido nucléico que codifica a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34, codificando a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com a invenção.
Uma categoria específica de mutações é a categoria de mutações em E6 e E7:
[062] A proteína E6 pode ser destoxificada impossibilitando a ligação de p53. Cinco posições na proteína HPV16 E6 de extensão completa são locais de mutações de inativação da funcionalidade E6, F47, L50, C63, C106 e I128. Qualquer substituição de aminoácido nessas posições pode levar à inativação de E6 e induzir a supressão tumoral. As substituições em qualquer uma dessas posições por qualquer um aminoácido diferente pode potencialmente ser utilizada. Os locais de mutações potenciais são mostrados em SEQ ID NO:22.
[063] Na proteína E7, há regiões conservadas, associadas com propriedades oncogênicas (vide Phelps et al J. Virol. April 1992, vol. 66, no. 42418-242; Gulliver et al J Virol. 1997, August; 71(8)) incluindo uma metade de local de ligação Rb N-terminal (proteína de ligação de retinoblastoma) (LXCXE) e duas regiões 3 conservadas (a montante e a jusante) com uma metade de ligação Zn (CXXC). Os locais de mutação preferidos na metade LXCXE são C24 e E26. Os locais preferidos nas duas metades CXXC são C58, C61, C91 e C94. Entretanto, quaisquer mutações nessas regiões podem ser consideradas para serem substituídas para a redução de funções de ligação e, dessa forma, abolir os efeitos oncogênicos de E7. Os locais de mutações potenciais são mostrados em SEQ ID NO:23.
Peptídeo de sinalização:
[064] Um peptídeo de sinalização na extremidade N- terminal do polipeptídeo nascente direciona a molécula para a ER antes do transporte para o complexo de Golgi. O peptídeo de sinalização é separado por peptidase de sinalização, uma vez que tiver realizado o seu propósito de seleção de alvo e importação da proteína para ER. Esses peptídeos de sinalização são geralmente entre 15 e 30 aminoácidos, mas podem ter mais de 50 resíduos (Martoglio, B. et al., Trends in Cell Biology, 1998, Knappskog, S. et al., J Biotechnol, 2007). O peptídeo de sinalização nativo pode ser substituído por peptídeos de sinalização de qualquer origem mamífera, procariótica ou marinha. Os peptídeos de sinalização comumente usados são, por exemplo, IL-2 humana e albumina humana devido à sua capacidade natural de secretar grandes quantidades de proteína. A escolha do peptídeo de sinalização pode ter um impacto considerável na quantidade de proteína sintetizada e secretada.
[065] Em algumas configurações, o peptídeo de sinalização usado na construção da proteína, de acordo com a presente invenção, é derivado de uma proteína quimiocina, como a sequência de sinalização de LD78beta.
[066] Em algumas configurações, o peptídeo de sinalização não é derivado de pLNOH2 (líder de imunoglobulina variável B1-8) divulgado no pedido internacional com Pedido Internacional No: PCT/EP2011/060628.
[067] Em algumas configurações, o peptídeo de sinalização não é derivado de um gene de imunoglobulina.
[068] O termo "proteína homodimérica”, conforme usado no presente, refere-se a uma proteína compreendendo dois filamentos idênticos, individuais de aminoácidos, ou subunidades juntas como uma proteína dimérica, simples através de ligação de hidrogênio, interações iônicas (carregadas), ligação dissulfeto covalente real ou alguma combinação dessas interações.
[069] O termo “metade de dimerização”, conforme usado no presente, refere-se à sequência de aminoácidos entre a unidade antigênica e a unidade de seleção de alvo, compreendendo a região de articulação e o segundo domínio opcional que pode contribuir com a dimerização. Esse segundo domínio pode ser um domínio de imunoglobulina e opcionalmente a região de articulação e o segundo domínio estão conectados através de um ligador. Conformemente, a metade de dimerização serve para conectar a unidade antigênica e a unidade de seleção de alvo, mas também contêm a região de articulação que facilita a dimerização das duas proteínas monoméricas em uma proteína homodimérica, de acordo com a invenção.
[070] O termo “unidade de seleção de alvo”, conforme usado no presente, refere-se a uma unidade que distribui a proteína com seu antígeno à APC de camundongo ou humana para apresentação restrita à classe II de MHC às células T CD4+ ou para fornecer apresentação cruzada às células T CD8+ pela restrição de classe I de MHC. A unidade de seleção de alvo usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada ou idêntica à LD78-beta madura.
[071] O termo “unidade antigênica”, conforme usado no presente, refere-se a qualquer molécula, como um peptídeo, que é capaz de ser especificamente reconhecido por um anticorpo ou outro componente do sistema imune, como um receptor de superfície nas células T. Incluídos nessa definição estão também imunógenos que são capazes de induzir uma resposta imune. Os termos “epítopo” ou “epítopo antigênico” são usados para referir-se a uma superfície molecular distinta, como uma superfície molecular fornecida por uma sequência de peptídeo curta dentro de uma unidade antigênica. Em algumas configurações, a unidade antigênica compreende dois ou mais epítopos antigênicos. A unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada ou idêntica aos produtos genéticos iniciais E6 e E7 de HPV, como a partir de HPV16 ou HPV18.
[072] O termo “região de articulação” refere-se a uma sequência de peptídeo da proteína homodimérica que facilita a dimerização, como através da formação de uma ligação covalente intercadeia, por exemplo, ligação(ões) dissulfeto. A região de articulação pode ser derivada de Ig, como exões de articulação h1+h4 de uma Ig, como IgG3.
CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO:
[073] Conforme descrito acima, a presente invenção relaciona-se a uma proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácido idênticas, cada cadeia de aminoácido compreendendo (1) um peptídeo de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) uma unidade antigênica, a referida unidade de seleção de alvo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 80% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 24-93 de SEQ ID NO:1, e uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de papilomavírus humano (HPV), como uma unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de HPV16 e/ou HPV18, como uma unidade antigênica derivada de proteínas iniciais E6 e/ou E7 de HPV16 e/ou HPV18. Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade de seleção de alvo, a metade de dimerização e a unidade antigênica na cadeia de aminoácido estão na ordem N-terminal ou C-terminal da unidade de seleção de alvo, da metade de dimerização e da unidade antigênica.
[074] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de HPV16, como a partir de proteínas iniciais E6 e/ou E7.
[075] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de E6 de HPV16.
[076] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de E7 de HPV16.
[077] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de HPV18, como a partir de proteínas iniciais E6 e/ou E7.
[078] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de E6 de HPV18.
[079] Em algumas configurações, a unidade antigênica usada nas construções, de acordo com a presente invenção, é derivada de E7 de HPV18.
[080] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o peptídeo de sinalização consiste de uma sequência de aminoácido de, no mínimo, 80% de identificação de sequência de aminoácido 123 de SEQ ID NO:1.
[081] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o peptídeo de sinalização consiste de uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99%, como, no mínimo, 100% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 1-23 de SEQ ID NO:1.
[082] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade de seleção de alvo consiste de uma sequência de aminoácido tendo, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 24-93 de SEQ ID NO:1.
[083] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a metade de dimerização compreende uma região de articulação e opcionalmente outro domínio que facilita a dimerização, como um domínio de imunoglobulina, opcionalmente conectados através de um ligador.
[084] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a região de articulação é derivada de Ig, como derivada de IgG3.
[085] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a região de articulação tem a capacidade de formar uma, duas ou diversas ligações covalentes. Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a ligação covalente é uma ponte dissulfeto.
[086] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o domínio de imunoglobulina da metade de dimerização é um domínio carboxiterminal C, ou uma sequência que é substancialmente idêntica ao domínio C ou uma variante deste.
[087] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o domínio carboxiterminal C é derivado de IgG.
[088] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o domínio de imunoglobulina da metade de dimerização tem a capacidade de homodimerização.
[089] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o domínio de imunoglobulina tem a capacidade de homodimerização através de interações não-covalentes. Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, as interações não- covalentes são interações hidrofóbicas.
[090] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o domínio de dimerização não compreende o domínio CH2.
[091] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a metade de dimerização consiste de exões de articulação h1 e h4, conectados através de um ligador a um domínio CH3 de IgG3 humana.
[092] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a metade de dimerização consiste de uma sequência de aminoácido de, no mínimo, 80% de identificação de sequência de aminoácido 94-237 de SEQ ID NO:3.
[093] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, o ligador é um ligador G3S2G3SG.
[094] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica e a metade de dimerização estão conectadas através de um ligador, como um ligador GLGGL ou um ligador GLSGL.
[095] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade de seleção de alvo consiste de aminoácidos 2493 de SEQ ID NO:1 ou uma variante desta.
[096] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a proteína homodimérica aumentou a afinidade de qualquer um dos receptores de quimiocina, selecionados de CCR1, CCR3 e CCR5 em comparação com a afinidade da mesma proteína homodimérica com a unidade de seleção de alvo, consistindo de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1 ou uma variante desta.
[097] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-293 de SEQ ID NO:3.
[098] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste de uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-293 de SEQ ID NO:3.
[099] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma ou mais substituições de aminoácido em uma posição selecionada da lista consistindo de F47, L50, C63, C106 e I128 de SEQ ID NO:22 ou uma deleção envolvendo um ou mais aminoácidos selecionados da lista, consistindo de Y43-L50 de SED ID NO:22.
[0100] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 substituições e/ou deleções de aminoácido relativas à SEQ ID NO:22.
[0101] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende a sequência de aminoácido 243-293 de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, ou SEQ ID NO:9 ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0102] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste da sequência de aminoácido 243-293 de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, ou SEQ ID NO:9 ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0103] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-340 de SEQ ID NO:11.
[0104] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste de uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-340 de SEQ ID NO:11.
[0105] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma ou mais substituições de aminoácido em uma posição selecionada da lista consistindo de C24, E26, C58, C61, C91 e C94 de SEQ ID NO:23 ou uma deleção envolvendo um ou mais aminoácidos selecionados da lista, consistindo de L22-E26 e/ou C58-C61 e/ou C91-S95 de SED ID NO:23.
[0106] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 substituições e/ou deleções de aminoácido relativas à SEQ ID NO:23.
[0107] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende a sequência de aminoácido 243-340 de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0108] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste da sequência de aminoácido 243-340 de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, ou SEQ ID NO:17 ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0109] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:34.
[0110] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste de uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à sequência de aminoácido 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:34.
[0111] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de papilomavírus humano 16 (HPV16) derivada de ambas as proteínas iniciais E6 e E7.
[0112] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreendendo uma sequência de aminoácido de papilomavírus humano 18 (HPV18) derivada de ambas as proteínas iniciais E6 e E7.
[0113] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma ou mais substituições de aminoácido em uma posição selecionada da lista consistindo de F47, L50G, C63, C106, I128T de SEQ ID NO:22 e C24, E26, C58, C61, C91, C94 de SEQ ID NO:23.
[0114] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 substituições e/ou deleções de aminoácido relativas à SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23.
[0115] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste da sequência de aminoácido 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, ou SEQ ID NO:34 ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0116] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a cadeia de aminoácido consiste de uma sequência de aminoácido, selecionada da lista consistindo de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:34, ou uma variante ou fragmento antigênico destas.
[0117] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica compreende uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à qualquer sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25.
[0118] Em algumas configurações, de acordo com a presente invenção, a unidade antigênica consiste de uma sequência de aminoácido, tendo, no mínimo, 80%, como, no mínimo, 81%, como, no mínimo, 82%, como, no mínimo, 83%, como, no mínimo, 84%, como, no mínimo, 85%, como, no mínimo, 86%, como, no mínimo, 87%, como, no mínimo, 88%, como, no mínimo, 89%, como, no mínimo, 90%, como, no mínimo, 91%, como, no mínimo, 92%, como, no mínimo, 93%, como, no mínimo, 94%, como, no mínimo, 95%, como, no mínimo, 96%, como, no mínimo, 97%, como, no mínimo, 98%, como, no mínimo, 99% de identificação de sequência à qualquer sequência de aminoácido selecionada de SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25.
[0119] Em algumas configurações, a proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, está em sua forma madura sem nenhuma sequência de peptídeo de sinalização.
[0120] Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, é otimizada de códon humano.
[0121] Deve-se compreender que uma molécula de ácido nucléico otimizada de códon humano, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais substituições de ácido nucléico, em comparação com a sequência selvagem, cuja substituição fornece um códon com maior frequência de uso em regiões de codificação humana. A frequência de uso de códon em homo sapiens pode ser encontrada em http://biowiki.edu- wiki.org/en/codon_table
[0122] Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, está compreendendo qualquer uma das sequências de nucleotídeo, selecionadas da lista consistindo de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:31, e SEQ ID NO:33, ou uma variante destas.
[0123] Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, é compreendida por um vetor.
[0124] Em algumas configurações, a molécula de ácido nucléico, de acordo com a presente invenção, é formulada para administração a um paciente para induzir a produção da proteína homodimérica no referido paciente.
[0125] Em algumas configurações, a vacina, de acordo com a presente invenção, ainda compreende um transportador e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[0126] Em algumas configurações, o método de tratamento ou prevenção de uma doença induzida por HPV ou condição, como um câncer ou uma doença infecciosa, causada por HPV em um paciente, de acordo com a presente invenção compreende a administração ao paciente em necessidade de uma molécula Em algumas configurações, a administração é realizada intradermicamente ou intramuscularmente.
EXEMPLO 1 Construção e expressão das vacinas
[0127] As sequências genéticas foram criadas, de acordo com a seguinte estrutura: 1: sequência líder nativa para LD78 b humana, 2: sequência LD78b de extensão completa. 3: Região 1 de articulação humana de IgG3. 4: Região 4 de articulação humana de IgG3. 5: Ligador de Glicina-Serina. 6: Domínio CH3 humano de IgG3. 7: Ligador de Glicina-Leucina. 8: oncogenes E6, E7 de papilomavírus humano selvagens e mutantes e proteínas de fusão de E6 e E7, divididos por um ligador de Glicina-Serina. As construções são criadas, de acordo com sua composição de E6 e ou E7, conforme segue: VB1001: Vaccibody-E6 selvagem; VB1005: Vaccibody-E7 selvagem;
[0128] Os mutantes são criados, de acordo com a posição de aminoácido na sequência de E6 ou E7 nativa correspondente. VB1002: Vaccibody-E6 C63R; VB1003: Vaccibody-E6 C106R; VB1004: Vaccibody-E6 F47R, C63R, C106R; VB1006: Vaccibody-E7 C24G, E26G; VB1007: Vaccibody-E7 C24G, E26G, C58G, C61G; VB1008: Vaccibody-E7 C24G, E26G, C91G, C94G; VB1009: Vaccibody-E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R; VB1016: Vaccibody-E7 C24G, E26G/ E6 C63R, C106R; VB1020: Vaccibody-E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R otimizada de códon humano VB1021: Vaccibody-E7 C24G, E26G/ E6 F47R, L50G, C106R, I128T otimizada de códon humano
[0129] Vacinas de controle compostas apenas dos antígenos foram incluídas: Controle 1: E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R; Controle 2: E7 C24G, E26G/ E6 C63R, C106R
[0130] Todas as sequências genéticas foram pedidas da Aldevron (Fargo ND, EUA) ou Eurofins MWG GmbH e clonadas no vetor de expressão pUMVC4a.
[0131] Todas as construções foram transfectadas para células 293E e a expressão verificada das proteínas vaccibody intactas foi realizada por dot blot e ELISA (dados não mostrados). Todas as sequências de aminoácido, exceto para os Controles 1 e 2, são mostrados como SEQ IDs.
EXEMPLO 2 Estudos de resposta imune
[0132] VB 1009,VB1016, VB1020 e VB1021 foram selecionadas como vacinas candidatas com seus controles 1 e 2 correspondentes, respectivamente. Como um controle negativo, o vetor pUMVC4a vazio foi utilizado.
[0133] 25, 12,5 e 1,4 μg de DNA de plasmídio de cada candidata foram injetados intradermicamente na parte inferior das costas dos camundongos C57Bl/6, seguidos por eletroporação, Dermavax, Cellectis (Paris, França). 7 dias posteriormente, os camundongos receberam reforço com quantidades semelhantes de vacinas e plasmídios de controle. No dia 21, os camundongos foram mortos e os baços foram coletados.
[0134] As respostas de célula T foram calculadas por ELISPOT. (Figuras 3 a, b e c)
EXEMPLO 3 Efeito terapêutico
[0135] VB1016, VB1020 e VB1021 com os controles 1 e 2 correspondentes foram selecionadas como a vacina candidata para estudos de vacina terapêutica.
[0136] 5x104 ou 5x105 de células TC-1 (Johns Hopkins University, Baltimore, EUA, Lin KY et al., Cancer Res, 1996) foram injetadas na área do pescoço ou da coxa dos camundongos C57Bl/6. Após os dias 3 e 10 ou dia 3,7 e 10, os camundongos foram vacinados com 2μg, 10μg, 12,5 μg ou 20μg do DNA de plasmídio, seguidos por eletroporação, Dermavax, Cellectis, França. O tamanho do tumor foi medido duas a três vezes por semana até o dia 49 após a injeção da célula TC-1 (Figura 4, 5 e 6).
EXEMPLO 4
[0137] Uma vacina terapêutica de DNA a ser usada pode ser preparada por fabricação de acordo com as BPF da vacina de plasmídio, de acordo com as diretrizes das autoridades regulatórias, incluindo o sistema de banco de célula de acordo com as BPF, a fabricação de substância medicamentosa e produto medicamentoso de acordo com as BPF, estudos de estabilidade da ICH e Preenchimento e Finalização da vacina de DNA. A vacina de DNA pode ser formulada através da dissolução em uma solução salina, como Tris a 10nM, EDTA a 1mM em uma concentração de 2-5 mg/ml. A vacina pode ser administrada intradérmica ou intramuscularmente com ou sem eletroporação subsequente.
SEQUÊNCIAS:
[0138] Precursor de quimiocina de metade C-C 3-like 1 incluindo peptídeo de sinalização (aa 1-23 em negrito) e peptídeo maduro (LD78- beta), aa 24-93 (SEQ ID NO:1): MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLEL SA
[0139] O DNA específico e as sequências de aminoácido correspondentes de construções de HPV vaccibody: Construções simples de E6 ou E7:
[0140] Para fins de ilustração apenas, os diferentes domínios das construções são separados por um “|” com os domínios na seguinte ordem: Peptídeo de sinalização|MIP-1a humana|Articulação h1|Articulação h4|Ligador de Gly-Ser ou Ligador Gly-Leu|hCH3 IgG3|Ligador de Gly-Ser ou Ligador de Gly-Leu|E6 ou E7 de extensão completa, selvagem ou mutante. Aminoácidos ou nucleotídeos em negrito ilustram os locais de mutações.
[0141] Sequência de DNA de VB1001 (SEQ ID NO:2): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTT TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC TGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACA GTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGT ATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTAT TCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATT AGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAAC TGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAG CAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGT TGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
[0142] Sequência de proteína de VB1001 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção com E6, SEQ ID NO:3): Sequência de aminoácido de 393 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFR DLCIVYRDGN PYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
[0143] Sequência de DNA de VB1002 (SEQ ID NO:4): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTT TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC TGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACA GTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGT ATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTAT TCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATT AGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAAC TGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAG CAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGT TGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
[0144] Sequência de proteína de VB1002 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:5): Sequência de aminoácido, 393 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN PYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
[0145] Sequência de DNA de VB 1003 (SEQ ID NO:6): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTT TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC TGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACA GTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGT ATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTAT TCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATT AGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAAC CGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAA GCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTT GTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
[0146] Sequência de proteína de VB1003 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:7): Sequência de aminoácido, 393 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN PYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
[0147] Sequência de DNA de VB1004 (SEQ ID NO:8): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGTT TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC TGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACA GTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTCGACGGGATTTATGCATAGT ATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTAT TCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATT AGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAAC CGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAA GCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTT GTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
[0148] Sequência de proteína de VB1004 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:9): Sequência de aminoácido, 393 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYT SRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGN PYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
[0149] Sequência de DNA de VB1005 (SEQ ID NO:10): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGA TGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA ATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTAC AAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACAC TAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
[0150] Sequência de proteína de VB1005 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção com E7, SEQ ID NO:11): Sequência de aminoácido, 340 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
[0151] Sequência de DNA de VB1006 (SEQ ID NO:12): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGG ATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTAC AATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACA CTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
[0152] Sequência de proteína de VB1006 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:13): Sequência de aminoácido, 340 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYT SRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
[0153] Sequência de DNA de VB1007 (SEQ ID NO:14): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGG ATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTAC AATATTGTAACCTTTGGATGCAAGGGAGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACA CTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
[0154] Sequência de proteína de VB1007 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:15): Sequência de aminoácido, 340 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYT SRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSD LELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREP QVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPML DSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKG LGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAE PDRAHYNIVTFG CKGDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP *
[0155] Sequência de DNA de VB1008 (SEQ ID NO:16): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGG ATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTAC AATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACA CTAGGAATTGTGGGACCCATCGGATCTCAGAAACCATAA
[0156] Sequência de proteína de VB1008 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:17): Sequência de aminoácido, 340 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYT SRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSD LELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREP QVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPML DSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKG LGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAE PDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPIGSQKP * Construções com E6 e E7:
[0157] Para fins de ilustração apenas, os diferentes domínios das construções são separados por um “|” com os domínios na seguinte ordem: Peptídeo de sinalização|MIP-1a humana|Articulação h1|Articulação h4|Ligador de Gly-Ser ou Ligador de Gly-Leu|hCH3 IgG3|Ligador de Gly-Ser ou Ligador de Gly-Leu|E7 mutante|Ligador de Gly-Ser ou Ligador de Gly-Leu|E6 mutante. Aminoácidos ou nucleotídeos em negrito ilustram os locais de mutações.
[0158] Sequência de DNA de VB1009 (SEQ ID NO:18): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGG ATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTAC AATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACA CTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA|GGCGGTGGAAGCAG CGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAG TTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAG AATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTCGACGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTAC GAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGT TATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGT GATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAA AAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGG TGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAA ACCCAGCTGTAA
[0159] Sequência de proteína de VB1009 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:19): Sequência de aminoácido, 501 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG| MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDL CIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQ L*
[0160] Sequência de DNA de VB1016 (SEQ ID NO:20): ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG|ATGCA TGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGAC AACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGG ATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTAC AATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACA CTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA|GGCGGTGGAAGCAG CGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAG TTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAG AATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTTTTCGGGATTT A TGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTAC GAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGT TATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGT GATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAA AAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGG TGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAA ACCCAGCTGTAA
[0161] Sequência de proteína de VB1016 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, SEQ ID NO:21): Sequência de aminoácido, 501 aminoácidos. MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYT SRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGGGSSGGGSG MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDL CIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQ L*
[0162] SEQ ID NO:22: >tr|Q778I6|Q778I6_HPV16 protéina E6 OS=Papilomavírus humano tipo 16 GN=E6 PE=4 SV=1; (Os aminoácidos sublinhados denotam aminoácidos que podem ser deletados; Aminoácidos potenciais que podem sofrer mutação estão destacados) MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVY RDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQ KPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
[0163] SEQ ID NO:23: >sp|P03129|VE7_HPV16 protéina E7 OS=Papilomavírus humano tipo 16 GN=E7 PE=1 SV=1; (Os aminoácidos sublinhados denotam aminoácidos que podem ser deletados; Aminoácidos potenciais que podem sofrer mutação estão destacados) MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYÇYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHY NIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP SEQ ID NO:24: >sp|P06463|VE6_HPV18 Proteína E6 OS=Papilomavírus humano tipo 18 GN=E6 PE=1 SV=1 MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYR DSI PHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKL RH LNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV
[0164] SEQ ID NO:25: >sp|P06788|VE7_HPV18 Proteína E7 OS=Papilomavírus humano tipo 18 GN=E7 PE=3 SV=2 MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQR HT MLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
[0165] SEQ ID NO:26: Regiões de articulação (IgG3 UH articulação), 12 aminoácidos: ELKTPLGDTTHT
[0166] SEQ ID NO:27: Região de articulação (IgG3, MH articulação, 15 aminoácidos): EPKSCDTPPPCPRCP
[0167] SEQ ID NO:28: Ligador de Gly-Ser: GGGSSGGGSG
[0168] SEQ ID NO:29: hCH3 IgG3: GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMH EALHNRFTQKSLSLSPGK
[0169] SEQ ID NO:30: Ligador: GLGGL
[0170] SEQ ID NO:31: sequência de DNA de VB1020: ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA|GGCCTCGGTGGCCTG/ATGCA TGGCGATACCCCAACACTCCATGAGTACATGCTGGACCTTCAGCCCGAGA CTACGGATCTGTATGGCTATGGGCAGTTGAATGACTCATCTGAGGAGGAG GACGAAATAGACGGCCCAGCTGGTCAAGCCGAACCGGATAGAGCCCACT ACAACATTGTGACCTTTTGCTGTAAGTGTGACAGCACTCTGAGACTGTGTG TTCAGTCCACTCATGTCGACATACGCACATTGGAGGATCTCCTGATGGGAA CACTGGGAATTGTGTGTCCCATCTGTTCCCAAAAGCCT/GGAGGTGGAAGC AGTGGAGGCGGTTCAGGC/ATGTTCCAAGATCCTCAAGAACGTCCTCGTAA GCTGCCACAGCTGTGTACCGAGCTTCAGACCACCATTCACGACATCATCC TGGAGTGCGTCTATTGCAAACAGCAGCTCCTTAGAAGGGAAGTGTACGAT TTTGCACGGAGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAATCCCTATGC GGTACGGGATAAATGCCTGAAGTTCTACAGCAAAATCTCCGAGTACCGGC ACTACTGCTACTCTCTCTATGGGACGACTCTGGAACAGCAGTACAACAAGC CCTTGTGCGATCTGCTGATTCGCTGCATTAATCGCCAGAAACCTCTGTGCC CAGAAGAGAAGCAAAGACACCTGGACAAGAAACAGCGATTCCACAACATC CGAGGGAGATGGACAGGGAGGTGTATGAGCTGCTGTCGGAGTTCTAGGA CAAGGCGCGAAACCCAGCTTTGA
[0171] SEQ ID NO:32: Sequência de proteína de VB1020 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção, Sequência de aminoácidos, 501 aminoácidos: MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG| MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDL CIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQ L*
[0172] SEQ ID NO:33: sequência de DNA de VB1021: ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCT GCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTTGCTGCTGAC ACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAA TTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGT CATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGAGG AGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAA AACCCCACTTGGTGACACAACTCACACA|GAGCCCAAATCTTGTGACACAC CTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAA GTGGA|GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGG AGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA ACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA/GGCCTCGGTGGCCTG/ATGCA TGGTGACACACCAACCCTGCACGAATACATGCTCGATCTGCAGCCAGAGA CTACCGACCTTTACGGCTATGGGCAGTTGAACGACAGCTCTGAGGAGGAG GACGAGATCGATGGTCCTGCTGGACAAGCAGAACCAGACAGAGCCCACTA CAACATCGTAACCTTTTGCTGCAAGTGTGACAGTACCCTTCGTTTGTGCGT TCAGAGCACGCATGTCGACATTCGGACACTGGAGGATCTGCTCATGGGGA CTCTGGGGATTGTGTGTCCTATTTGCAGCCAGAAACCA/GGCGGAGGATCT TCAGGAGGCGGGAGTGGC/ATGTTCCAAGACCCTCAGGAACGCCCTCGGA AACTGCCCCAATTGTGTACTGAGCTCCAGACAACGATACACGACATAATCC TGGAGTGCGTGTATTGCAAGCAGCAGCTTCTGAGGAGGGAAGTGTACGAT TTTGCCAGGAGAGATGGCTGCATTGTCTACCGAGATGGCAATCCCTATGC GGTGTGTGATAAGTGTCTGAAGTTCTATTCCAAAATCAGCGAATATCGGCA TTATTGCTACTCACTGTACGGAACTACCCTCGAACAGCAGTACAACAAACC GCTCTGTGATCTGCTGATCAGATGCATCAATCGGCAGAAACCCCTTTGTCC CGAAGAGAAGCAAAGACACCTGGACAAGAAGCAGAGGTTCCACAATACCC GAGGTCGTTGGACTGGGCGCTGCATGTCCTGTTGTCGCTCCTCTCGCACA AGGAGAGAGACACAACTGTGA
[0173] SEQ ID NO:34: Sequência de proteína de VB1021 (Construção homodimérica, de acordo com a invenção. Sequência de aminoácidos, 501 aminoácidos): MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSY TSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMT K NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG| MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDG CIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNTRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQ L*

Claims (11)

1. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA DE DUAS CADEIAS DE AMINOÁCIDOS IDÊNTICAS, em que cada cadeia de aminoácido compreende (1) um peptídeo de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) uma unidade antigênica, e caracterizada pelo fato de que cada cadeia de aminoácidos consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada da lista que consiste em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34.
2. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de não compreender uma sequência de peptídeo de sinalização em sua forma maturada.
3. CADEIA DE AMINOÁCIDOS, que compreende (1) um peptídeo de sinalização, (2) uma unidade de seleção de alvo, (3) uma metade de dimerização e (4) que uma unidade antigênica, e caracterizada pelo fato de a dita cadeia de aminoácidos consistir em uma sequência de aminoácidos selecionada da lista que consiste em: SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 32; e SEQ ID NO: 34, em que a cadeia de aminoácidos é capaz de formar a proteína homodimérica conforme definido na reivindicação 1.
4. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, caracterizada pelo fato de compreender qualquer uma dentre as sequências de nucleotídeo, selecionada da lista consistindo em i. SEQ ID NO:18, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:19; ii. SEQ ID NO:20, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:21; iii. SEQ ID NO:31, ou uma sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e iv. SEQ ID NO:33 ou a sequência degenerada da mesma que codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34.
5. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de ser uma molécula de ácido nucléico otimizada de códon humano.
6. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou a cadeia de aminoácido, de acordo com a reivindicação 3, ou a molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.
7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender a proteína homodimérica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou uma cadeia de aminoácido, conforme definida na reivindicação 3, ou a molécula de aminoácido, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.
8. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato de a referida célula hospedeira ser um microrganismo transgênico, e ela compreender a molécula de ácido nucléico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5.
9. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, a proteína homodimérica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou uma cadeia de aminoácidos, conforme definida na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o método compreender: a) transfecção da molécula de ácido nucléico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5 em uma população celular; b) cultivo da população celular; c) coleta e purificação da proteína homodimérica ou da cadeia de aminoácido expressada a partir da população celular.
10. MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UMA VACINA, tal como uma vacina DNA caracterizado pelo fato de compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma molécula de ácido nucléico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, o método compreendendo: a) a preparação de uma molécula de ácido nucléico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5; b) a dissolução da molécula de ácido nucléico obtida na etapa a) em um transportador, diluente ou tampão farmaceuticamente aceitável.
11. VACINA CONTRA HPV, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou uma cadeia de aminoácido, conforme definida na reivindicação 3, ou a molécula de ácido nucléico, tal como um DNA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, sendo que que a referida vacina é capaz de desencadear uma resposta imune de células T e células B.
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