BR112012032922B1 - Proteína homodimérica, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, método para a preparação de uma proteína homodimérica, e, vacina - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÕES DE PROTEÍNAS HOMODIMÉRICAS, por tratar-se a presente invenção de novas proteínas recombinantes de fusão, como, por exemplo, moléculas à base de anticorpos humanos denominadas "Vaccibodies", que podem desencadear uma resposta imune das células T e das células B. A presente invenção também se refere a um método de tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa, por meio do uso destas proteínas de fusão específicas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO:

[0001] Trata-se a presente invenção de novas proteínas recombinantes de fusão, como, por exemplo, moléculas à base de anticorpos humanos denominadas “Vaccibodies”, que podem desencadear uma resposta imune das células T e das células B. A presente invenção também se refere a um método de tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa, como, por exemplo, mieloma múltiplo ou influenza, por meio do uso destas proteínas de fusão específicas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO:

[0002] A vacinação de DNA é uma forma tecnicamente simples de induzir respostas imunes. No entanto, o sucesso em pequenos animais ainda não foi reproduzido em ensaios clínicos. Várias estratégias estão sendo atualmente desenvolvidas para aumentar a eficácia das vacinas de DNA.

[0003] O direcionamento de antígenos proteicos para células apresentadoras de antígeno (APC) pode melhorar as respostas das células T e das células B. As moléculas de imunoglobulina (Ig) recombinante são bem adaptadas para esta finalidade. Por exemplo, epítopos antigênicos curtos podem substituir alças entre as “β-fitas” nos domínios constantes de imunoglobulina (Ig), enquanto a entrega do antígeno direcionado é obtida ao dotar a imunoglobulina (Ig) recombinante com regiões variáveis (V) específicas para as moléculas de superfície em células apresentadoras de antígeno (APC). No entanto, tal estratégia é imprópria para antígenos maiores contendo epítopos não identificados e, além disso, moléculas de imunoglobulina (Ig) recombinante com epítopos curtos de células T não induziram os anticorpos contra epítopos conformacionais. Para superar estas limitações, foram produzidas vacinas de DNA (Vaccibodies) homodiméricas baseadas em imunoglobulina (Ig) direcionada, que expressam antígenos tumorais ou infecciosos, com um tamanho de pelo menos 550 aminoácidos com manutenção de epítopos conformacionais.

[0004] O ligante 3 de quimiocina (CCL3) (motivo C-C) é uma proteína que em humanos é codificado pelo gene de CCL3. A CCL3, também conhecido como proteína inflamatória de macrófago-1a (MIP-1α), é uma citocina pertencente à família das quimiocinas CC, que está envolvida no estado inflamatório agudo, no recrutamento e na ativação de leucócitos polimorfonucleares. Enquanto a CCL3 de camundongo é um gene cópia que codifica a quimiocina madura de 69 aminoácidos, o homólogo humano foi duplicado e sofreu mutação para gerar duas variantes não alélicas, LD78α (CCL3) e LD78β (CCL3-L1), ambas mostrando 74% de homologia com a CCL3 de camundongo.

[0005] Nenhuma vacina de DNA até agora foi aprovada para utilização humana devido à falta de eficácia. Também não existe uma vacina eficaz disponível para várias doenças infecciosas. Em particular, nenhuma vacina de DNA terapêutica contra o câncer foi aprovada para uso humano.

[0006] A Patente Internacional WO2004/076489 refere-se à molécula baseada em anticorpos humanos recombinantes chamada Vaccibodies, as quais são capazes de desencadear uma resposta imune das células T e das células B.

[0007] A Patente Norte-Americana US20070298051 refere-se à utilização de MIP-1-alfa para aumentar a resposta imune a um imunógeno em um mamífero.

[0008] A Patente Europeia EP920522 refere-se a uma vacina de vetor de polinucleotídeos compreendendo um produto do cDNA alvo que compreende uma sequencia de nucleotídeos que codifica uma citocina ou quimiocina.

[0009] Fredriksen AB e outros (Mol Ther 2006; 13:776-85) refere-se a vacinas de DNA que direciona o antígeno tumoral para células apresentadoras de antígeno.

[0010] Fredriksen AB e Bogen B (Blood 2007; 110: 1797-805) referem-se à vacina de DNA de fusão quimiocina-idiótipo de camundongo.

OBJETIVO DA INVENÇÃO:

[0011] Um objetivo das modalidades da presente invenção consiste em fornecer proteínas de fusão, que sejam capazes de desencadear uma resposta imune eficiente até mesmo para antígenos fracos, tais como os antígenos idiótipos derivados de, por exemplo, células de mieloma.

[0012] Além disso, um objetivo das modalidades da presente invenção consiste em fornecer polinucleotídeos, como, por exemplo, um polinucleotídeo DNA, que codificam uma proteína de fusão que desencadeia uma resposta imune eficiente contra até mesmo antígenos fracos, como, por exemplo, os antígenos idiótipos derivados de, por exemplo, células de mieloma. Esses polinucleotídeos podem ser utilizados como uma composição imunoestimulante ou vacina contra um câncer ou uma doença infecciosa, caracterizada por um antígeno associado a uma doença ou específico a uma doença.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

[0013] Foi descoberto pelo(s) presente(s) inventor(es) que a quimiocina humana LD78β, tanto nas versões completa e truncada, é apropriada para uso como unidades de direcionamento que direcionam epítopos antigênicos para a superfície das células apresentadoras de antígeno (APC). A quimiocina, ou a sua versão truncada, é ligada aos receptores de quimiocinas na superfície das células apresentadoras de antígeno (APC) na forma de uma construção de proteína homodimérica, o que facilita que duas quimiocinas idênticas sejam ligadas para fornecer direcionamento e sinalização mais eficientes. A construção homodimérica prevê ainda que dois epítopos antigênicos idênticos sejam distribuídos às células apresentadoras de antígeno (APC) que, por sua vez, apresentam-nos às células T. Mesmo com o tamanho relativamente grande das construções da proteína homodimérica, as células são capazes de produzir e exportar moléculas intactas.

[0014] Consequentemente, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticos, sendo que cada cadeia de aminoácido compreende uma unidade de direcionamento compreendendo uma sequencia de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.:1, e uma unidade antigênica, sendo que a unidade de direcionamento e a unidade antigênica são conectadas através de um motivo de dimerização.

[0015] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticos, sendo que cada uma das cadeias de aminoácidos compreende uma unidade de direcionamento compreendendo os aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 1, e uma unidade antigênica, sendo que a unidade de direcionamento e a unidade antigênica são conectadas através de um motivo de dimerização.

[0016] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína monomérica que pode formar uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0017] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, para uso como um medicamento.

[0018] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína monomérica, que pode formar uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, para uso como um medicamento.

[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0020] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, que compreende uma molécula de ácido nucleico, que codifica a proteína monomérica que pode formar uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0021] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende uma molécula de ácido nucleico, que codifica a proteína monomérica que pode formar uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0022] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, sendo que o dito método compreende as seguintes etapas: a) transfectar a molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, em uma população de células; b) cultivar a população de células; c) coletar e purificar a proteína homodimérica expressa a partir da população de células.

[0023] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma vacina contra um câncer ou uma doença infecciosa, que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, ou uma molécula de ácido nucleico, que codifica a proteína monomérica, que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, sendo que a referida vacina é capaz de desencadear uma resposta imune das células T e das células B e sendo que a dita proteína homodimérica contém uma unidade antigênica relacionada com o referido câncer ou a referida doença infecciosa.

[0024] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma composição imunomoduladora ou imunoestimulante contra um câncer ou uma doença infecciosa, que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, ou uma molécula do ácido nucleico, que codifica a proteína monomérica, que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, sendo que a referida composição imunomoduladora ou imunoestimulante é capaz de desencadear uma resposta imune das células T e das células B e sendo que a dita proteína homodimérica contém uma unidade antigênica relacionada com o referido câncer ou com a referida doença infecciosa.

[0025] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa em um paciente, sendo que o dito método compreende a administração ao paciente em necessidade do mesmo de uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, ou da molécula do ácido nucleico que codifica a proteína monomérica, que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, sendo que a referida proteína homodimérica contém uma unidade antigênica específica para o referido câncer ou para a referida doença infecciosa.

LEGENDAS DAS FIGURAS:

[0026] Figura 1. Vacinas de fusão utilizadas no presente estudo. (A) Estrutura esquemática de uma proteína homodimérica de fusão antígeno- quimiocina (Vaccibody). As unidades de direcionamento, dimerização e antigênicas são indicadas como porções expressas nas várias unidades. Em todas as construções, a unidade de dimerização e dobradiça são derivadas de IgG3 humana. Um ligante G3S2G3SG conecta os éxons da dobradiça h1+h4 ao domínio CH3. Um ligante GLSGL conecta CH3 e a unidade antigênica, ao passo que uma ligação (G4S)3 conecta VH e VL nas unidades antigênicas. (B) Sequencias do terminal NH2 (aminoácidos 1-12) de isoformas humanas CCL3, e seu controle de mutação pontual (C11S, indicada em negrito). Barra indica exclusão. (C) A mutação pontual C11S supostamente destrói uma ponte SS na estrutura da quimiocina (direita).

[0027] Figura 2. Caracterização de Vaccibodies expressando LD78β pelos testes ELISA e Western-blot. Os sobrenadantes de células 293E transientemente transfectadas coletadas no dia 5 foram testados em ELISA, por meio do uso de mAbs específicos para os diferentes componentes das moléculas Vaccibody. (A) Vaccibodies codificando scFv315 com unidades de direcionamento indicadas foram avaliadas através da ligação da camada DNP-BSA (liga scFv315) e detecção com HP6017 biotinilado (liga motivo de dimerização CH3). (B) Vaccibodies codificando CKCK com as unidades de direcionamento indicadas foram avaliadas através da ligação da camada 187,1 mAb (liga Ck de camundongo) e detecção com mAb biotinilado 187,1. (C) Vaccibodies codificando HA com as unidades de direcionamento indicadas foram avaliadas através da ligação a MCA878-G (motivo de dimerização anti-CH3) e detecção com anticorpo biotinilado anti-HA mAb H36-4-52. (D) Western-blot de Vaccibodies sondado com HP6017 biotinilado sob condições não redutoras. Da esquerda para a direita, (LD78βFv315) 2, (LD78βC11SFv315) 2 e (LD78β-2Fv315) 2.

[0028] Figura 3. Proteínas da Vaccibody LD78β ligam receptores de quimiocinas nas células humanas. As proteínas homodiméricas indicadas da Vaccibody a 25 μg/ml foram misturadas com células HEK 293 estavelmente transfectadas, quer com CCR5 humano (A, B) ou CCR1 humano (C, D). As proteínas Vaccibody ligadas foram detectadas por Ab2.1-4 mAb biotinilado específico para a unidade antigênica scFv315, seguido por PE-estreptavidina. Linhas em negrito: Vaccibodies (LD78βFv315) 2 (A, C) e (LD78β-2Fv315) 2 (B, D). Linha tracejada em (A): (LD78β (C11S) Fv315) 2. Histograma sombreado: Ab2.1-4 mAb biotinilado e PE-estreptavidina sozinho.

[0029] Figura 4. Proteínas Vaccibody LD78β ligam receptores de quimiocinas de camundongo e induzem quimiotaxia de células murinas. Vaccibody (LD78βFv315)2 (histograma aberto), mas não a variante C11S (histograma sombreado), liga-se a esplenócitos CD11b + BALB/c (A) e exibe atividade quimiotática em células linfocíticas Esb / MP (B).

[0030] Figura 5. Vaccibody com unidade de direcionamento LD78β entrega eficientemente o antígeno para as células apresentadoras de antígeno (APC) de camundongo (A) e humanas (B) para a apresentação restrita ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II às células-T CD4+. (A) Diferentes quantidades de Vaccibodies purificadas possuindo scFv315 como unidade antigênica foram misturadas com esplenócitos (8 Gy) de BALB/c irradiados e em seguida pela adição de células T Th2 específicas de Id(À2315) de camundongos transgênicos TCR. Após 48 horas, as culturas foram pulsadas com 3H-timidina durante 24 horas. (B) Diferentes quantidades de sobrenadantes de Vaccibody contendo Ck de camundongo (expressas como concentração molar (M) de CKCK) de células 293E transientemente transfectadas foram misturadas com DR4*01 PBMCs que foram então irradiados e misturados com células-T T18 Ck- específica de camundongo. Após 48 horas, a placa foi pulsada com 3H- timidina durante 24 horas.

[0031] Figura 6. Respostas imunes anti-Id315 em camundongos imunizados com DNA Vaccibody LD78βFv315. Os camundongos foram imunizados por administração intradérmica de DNA imediatamente seguido por eletroporação no local de injeção. O tipo de Vaccibodies e controles são indicados. Os soros obtidos três semanas mais tarde foram testados para anticorpos anti-Id IgG1 (A) ou IgG2a (B) que se ligam à proteína do mieloma M315. Uma média de até sete camundongos por grupo é mostrada. Os valores p referem-se a LD78β vs LD78β (C11S) (*), e a Vaccibody (**) LD78β vs (FvNIP) 2 na semana 4.

[0032] Figura 7. Indução de respostas das células-T específicas da influenza hemaglutinina CD4+ e CD8+ por Vaccibodies LD78β. Os camundongos (n=3) foram imunizados por administração intradérmica de DNA imediatamente seguido por eletroporação do local da injeção (Dermavax, Cytopulse, EUA). Tipos de Vaccibodies e controles são indicados. Os camundongos foram sacrificados três semanas depois, e as suspensões de esplenócitos individuais utilizadas nos ensaios ELISPOT com peptídeos sintéticos HA restritos ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e classe I indicados, ou peptídeo irrelevante. Respostas IFNY foram avaliadas. Os valores p referem-se a LD78β vs LD78βC11S e LD78β vs NaCl 0,9% (*), e a LD78βC11S vs NaCl 0,9% (**).

[0033] Figura 8. Vaccibodies LD78β ligadas a CCR5 de macaco Rhesus. Proteínas Vaccibody a 25 μg/ml foram misturadas com células HEK 293 estavelmente transfectadas com CCR5 de macaco Rhesus. As proteínas Vaccibody ligadas foram detectadas por Ab2,1-4 mAb biotinilado específico para a unidade antigênica scFv315 seguido por PE-estreptavidina. A linha em negrito indica Vaccibodies (LD78βFv315)2 em (A) e (LD78β- 2Fv315)2 em (B). A linha tracejada em (A) indica Vaccibody (LD78β(C11S)Fv315)2. Em ambos os histogramas sombreados A e B indicam Ab2,1-4 mAb biotinilado e PE-estreptavidina sozinha.

[0034] Figura 9. Proteção contra um desafio letal de influenza. Camundongos Balb/c foram imunizados uma vez por via intradérmica com 25μg de DNA em combinação com a eletroporação (DermaVax) e desafiados após 14 dias (n= 6/grupo) com uma dose letal do vírus de influenza PR8 (H1N1).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[0035] A eficácia das vacinas de DNA precisa ser aumentada. Uma estratégia promissora em camundongos é a construção de DNA que codifica uma proteína de fusão que direciona o antígeno para as células apresentadoras de antígeno (APC) através dos receptores de quimiocina. É crucial estender esta estratégia para melhorar as vacinas de DNA aos animais de grande porte e aos seres humanos. De acordo com a presente invenção, as quimiocinas humanas MIP-1α podem ser fundidas com unidades antigênicas diferentes. As proteínas de fusão retêm a atividade funcional e exatidão conformacional das unidades antigênicas e de direcionamento, respectivamente. As proteínas de fusão podem melhorar as respostas de células humanas clonadas CD4+ T. Além disso, uma vez que as proteínas de fusão LD78β se ligam a receptores de quimiocinas de camundongo, as vacinas de DNA humano podem ser testadas em camundongos. As vacinas de fusão de DNA LD78β, de acordo com a presente invenção, induziram respostas melhoradas de anticorpos e células T em camundongos após a injeção de plasmídeo e eletroporação da pele. As respostas das células CD8 + T são particularmente melhoradas, indicando eficiente apresentação. Os inventores da presente invenção provaram que uma versão truncada de dois aminoácidos NH2 de LD78β tem uma ligação superior às células de camundongo em comparação com a versão completa de LD78β in vitro. Surpreendentemente, a versão completa de LD78β mostrou efeito superior in vivo em modelo camundongo. Os inventores da presente invenção observaram que as proteínas da vacina de LD78β ligam-se a CCR5 do macaco Rhesus, preparando o cenário para a imunização de DNA direcionado em primatas não humanos.

[0036] Vaccibodies, de acordo com a presente invenção, podem ser vacinas homodiméricas baseadas em imunoglobulina (Ig) recombinante, sendo que cada cadeia é composta de uma unidade de direcionamento diretamente anexada à dobradiça de imunoglobulina (Ig) e CH3, cuja combinação induz a homodimerização covalente (Figura 1A).

[0037] Enquanto CCL3 de camundongo é um gene de cópia única codificado para uma quimiocina madura de 69 aminoácidos, o homólogo humano foi duplicado e sofreu mutação para gerar duas variantes não alélicas, LD78α (CCL3) e LD78β (CCL3-L1), sendo que ambas mostram uma homologia de 74 % com a CCL3 de camundongo. As duas variantes partilham uma homologia de 96%, sendo as diferenças S ou P na posição 2 e uma troca entre G e S nas posições 39 e 47.

[0038] De acordo com a presente invenção, as variantes humanas CCL3 e as unidades antigênicas diferentes podem ser construídas e expressas como proteínas funcionais. Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de LD78β e suas isoformas naturais em vacinas de fusão para direcionar a entrega de antígeno às células apresentadoras de antígeno (APC).

[0039] As Vaccibodies, de acordo com a presente invenção, têm por objetivo melhorar a imunogenicidade das vacinas (composições imunoestimulantes). Incluídas na presente invenção estão as vacinas de DNA que codificam uma proteína de fusão que direciona a entrega de antígeno para os receptores LD78β sobre células apresentadoras de antígeno (APC) profissionais.

[0040] Os pelos inventores da presente invenção descobriram que as Vaccibodies equipadas com versões truncadas de NH2 ou LD78β ligam-se às células que expressam CCR1 e/ou CCR5 murino ou macaco Rhesus ou humano (receptores para LD78β) in vitro e proporcionaram a entrega do antígeno aumentada in vitro, bem como um aumento das respostas imunes humorais e celulares in vivo após a injeção de DNA e eletroporação, em comparação com as Vaccibodies não direcionadas de controle.

[0041] As proteínas recombinantes, de acordo com a presente invenção, podem ser moléculas do tipo anticorpo humano úteis no tratamento de muitos tipos de câncer ou de doenças infecciosas, incluindo mieloma múltiplo. Estas moléculas, também referidas como Vaccibodies, ligam-se às células apresentadoras de antígeno (APC) e são capazes de desencadear uma resposta imune das células T e das células B. Por outro lado, Vaccibodies ligam-se bivalentemente às células apresentadoras de antígeno (APC) para promover a indução mais eficiente de uma forte resposta imunitária. Vaccibodies compreendem um dímero de uma unidade monomérica que consiste de uma unidade de direcionamento com especificidade para uma molécula de superfície em células apresentadoras de antígeno (APC), conectadas através de um motivo de dimerização, como, por exemplo, uma região de dobradiça e um domínio CY3, a uma unidade antigênica, estando esta última na extremidade do terminal COOH ou terminal NH2. A presente invenção também se refere a uma sequência de DNA codificada para esta proteína recombinante, vetores de expressão compreendendo estas sequências de DNA, linhas de células compreendendo os referidos vetores de expressão, para o tratamento de mamíferos, preferencialmente, por meio de imunização por Vaccibody DNA, Vaccibody RNA ou Vaccibody proteína, e, finalmente, produtos farmacêuticos e um kit compreendendo as referidas moléculas.

[0042] O motivo de dimerização das proteínas, de acordo com a presente invenção, pode ser construído de modo a incluir uma região de dobradiça e um domínio de imunoglobulina (por exemplo, domínio Cy3), por exemplo, domínio carboxiterminal C (domínio CH3), ou uma sequência que seja substancialmente homóloga ao dito domínio C. A região de dobradiça pode ser derivada de imunoglobulina (Ig) e contribui para a dimerização através da formação de uma ligação(s) covalente(s) intercadeia(s), como, por exemplo, ponte(s) de dissulfeto. Além disso, funciona como um espaçador flexível entre os domínios, permitindo às duas unidades de direcionamento ligarem-se simultaneamente às duas moléculas- alvo nas células apresentadoras de antígeno (APC) expressas com distâncias variáveis. Os domínios de imunoglobulina contribuem para a homodimerização através de interações não covalentes, como, por exemplo, interações hidrofóbicas. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o domínio CH3 é derivado de IgG. Estes motivos de dimerização podem ser trocados por outras porções de multimerização (por exemplo, a partir de outras isotipos/subclasses de imunoglobulina (Ig)). De preferência, o motivo de dimerização é derivado de proteínas nativas humanas, como, por exemplo, IgG humana.

[0043] Deve-se observar que o motivo de dimerização pode ter qualquer orientação em relação à unidade antigênica e à unidade de direcionamento. Em uma modalidade da presente invenção, a unidade antigênica fica na extremidade terminal COOH do motivo de dimerização com a unidade de direcionamento da extremidade terminal N do motivo de dimerização. Em outra modalidade da presente invenção, a unidade antigênica fica na extremidade terminal N do motivo de dimerização com a unidade de direcionamento na extremidade terminal COOH do motivo de dimerização.

[0044] O pedido de patente internacional 2004/076489, que é aqui incorporado a título de referência, descreve as sequências de ácidos nucleicos e vetores, que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção.

[0045] As proteínas, de acordo com a presente invenção, podem ser apropriadas para a indução de uma resposta imunológica contra qualquer polipeptídeo de qualquer origem. Qualquer sequência antigênica de comprimento suficiente que inclua um epítopo específico pode ser utilizada como a unidade antigênica das proteínas, de acordo com a presente invenção. O comprimento mínimo de tal unidade antigênica pode ser de aproximadamente nove aminoácidos. Por conseguinte, em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos nove aminoácidos correspondente a pelo menos aproximadamente 27 nucleotídeos de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica tal unidade antigênica. Tal sequência antigênica pode ser derivada de proteínas do câncer ou de agentes infecciosos. Exemplos de sequências de câncer são telomerase, mais especificamente hTERT, tirosinase, antígeno de melanoma TRP-1/TRP-2, antígeno específico da próstata e idiotipos. Os agentes infecciosos podem ser de origem bacteriana, como, por exemplo, antígenos de tuberculose e OMP31 de brucelose, ou de origem viral, mais especificamente sequências derivadas do HIV, como, por exemplo, sequências derivadas de gp120, glicoproteína D de HSV-2 e antígenos de vírus de influenza, como, por exemplo, hemaglutinina, nuceloproteína e M2. A inserção de tais sequências em um formato Vaccibody também pode levar à ativação de ambos os braços da resposta imune. Em alternativa, a unidade antigênica pode ser anticorpos ou fragmentos dos mesmos, como, por exemplo, o C-terminal de scFv derivado de imunoglobulina (Ig) monoclonal produzida por células de mieloma ou linfoma, também denominado componente M de mieloma/linfoma em pacientes com linfoma de células-B ou mieloma múltiplo. Tal ScFv representa o antígeno idiotípico.

[0046] Em uma modalidade específica da presente invenção, também utilizada nos exemplos aqui descritos, a unidade antigênica da proteína, de acordo com a presente invenção, é o scFv da proteína do mieloma M315 derivada do plasmocitoma BALB/c MOPC315,4. A cadeia leve À2315 de M315 abriga três mutações somáticas definidas no ciclo CDR3 e funciona como um epítopo de célula T idiotípico modelo em um sistema bem definido (Bogen, Malissen e outros, 1986; Bogen e Lambris, 1989).

[0047] A imunização por meio da proteína Vaccibody, DNA Vaccibody ou RNA Vaccibody, sendo estes dois últimos executado, por exemplo, através de injeção intramuscular ou intradérmica, com ou sem um acompanhamento de eletroporação, são todos métodos possíveis.

[0048] A unidade de direcionamento de proteínas, de acordo com a presente invenção, direciona a proteína às células apresentadoras de antígeno (APC) através da ligação aos receptores de quimiocinas.

[0049] As proteínas, de acordo com a presente invenção, podem ser geneticamente montadas, e o DNA transfectado em uma célula hospedeira compatível, como, por exemplo, células NSO, células 293E, células CHO ou células COS-7. Os transfectantes produzem e segregam as proteínas recombinantes.

[0050] A presente invenção refere-se a um produto farmacêutico que compreende, conforme descrição acima, as proteínas à base de recombinantes, sequencias de DNA/RNA ou vetores de expressão, de acordo com a presente invenção. Se necessário, o produto farmacêutico compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente compatível. Os veículos apropriados e a formulação de tais produtos farmacêuticos são conhecidos pelos especialistas na técnica. Os veículos apropriados são, por exemplo, soluções salinas comuns tamponadas com fosfato, água, emulsões, por exemplo, emulsões de óleo/água, agentes umidificantes, soluções estéreis, etc. Os produtos farmacêuticos podem ser administrados oralmente ou parentalmente. Os métodos de administração parental compreendem administração tópica, administração intra-arterial, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intramedular, administração intratecal, administração intraventricular, administração intravenosa, administração intraperitoneal ou administração intranasal. A dose apropriada é determinada pelo médico atendente e depende de diferentes fatores, como, por exemplo, idade, sexo e peso do paciente, do tipo de administração, etc. Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição de vacina ou composições imunoestimulantes contra o câncer ou doenças infecciosas, que compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz do ácido nucleico que codifica a molécula da presente invenção ou variantes degeneradas desta, sendo que a dita composição é capaz de desencadear uma resposta imune das células T e das células B. A presente invenção também se refere a um kit compreendendo Vaccibody DNA, RNA ou proteínas para fins de diagnóstico, médico ou científico.

[0051] A presente invenção também se refere a um método de preparação da molécula recombinante da presente invenção, que compreende as seguintes etapas: transfecção do vetor que compreende a molécula da presente invenção em uma população de células; cultivo da população de células; coleta da proteína recombinante expressa a partir da população de células, e; purificação da proteína expressa.

[0052] As sequências de nucleotídeos descritas acima podem ser preferivelmente inseridas em um vetor apropriado para terapia gênica, por exemplo, sob o controle de um promotor específico, e introduzidas nas células. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o vetor compreendendo a referida sequência de DNA é um vírus, por exemplo, um adenovírus, vírus de varíola ou um vírus adeno-associado. Os retrovírus são particularmente preferidos. Exemplos de retrovírus apropriados são, por exemplo, MoMuLV ou HaMuSV. Para fins de terapia gênica, as sequências de DNA/RNA, de acordo com a presente invenção, também podem ser transportadas para as células-alvo, sob a forma de dispersões coloidais. Elas compreendem, por exemplo, lipossomas ou lipoplexos.

[0053] A presente invenção também engloba o uso de polipeptídeos ou domínios ou motivos dentro dos polipeptídeos com um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com sequência(s) de aminoácido conforme aqui definidos ou com um polipeptídeo tendo as propriedades específicas definidas no presente documento. A presente invenção engloba, em particular, peptídeos que possuem um grau de identidade de sequência com SEQ. ID. No.: 1, ou seus homólogos. Aqui, o termo "homólogo" designa uma entidade que tem uma entidade de sequência com as sequências de aminoácidos objeto ou as sequências de nucleotídeos objeto, sendo que a sequência de aminoácido objeto é, de preferência, a SEQ. ID. No.: 1.

[0054] Em um aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos homólogos e/ou a sequência de nucleotídeos deve proporcionar e/ou codificar um polipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou aumenta a atividade de um polipeptídeo da SEQ. ID. No.: 1.

[0055] No presente contexto, uma sequência homóloga é tomada para incluir uma sequência de aminoácidos, que pode ser de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, idêntica à sequência objeto. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos locais ativos etc., assim como a sequência de aminoácidos objeto. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de semelhança (ou seja, os resíduos de aminoácidos com propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção, prefere-se expressar a homologia em termos de identidade da sequência.

[0056] Comparações de identidade de sequência podem ser realizadas a olho, ou mais comumente, com a ajuda de programas de comparação de sequências facilmente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis utilizam complexos algoritmos de comparação para alinhar duas ou mais sequências que melhor refletem os eventos evolutivos que poderiam ter conduzido à(s) diferença(s) entre as duas ou mais sequências. Portanto, esses algoritmos operam com um sistema de pontuação que recompensa o alinhamento de aminoácidos idênticos ou similares e penaliza a inserção de lacunas, extensões de lacunas e alinhamento de aminoácidos não semelhantes. Os sistemas de pontuação dos algoritmos de comparação incluem: I) atribuição de uma pontuação de penalidade cada vez que uma lacuna for inserida (pontuação de penalidade de lacuna); II) atribuição de uma pontuação de penalidade cada vez que uma lacuna existente for estendida com uma posição extra (pontuação de penalidade de extensão); III) atribuição de pontuações mais altas sobre o alinhamento de aminoácidos idênticos, e; IV) atribuição de pontuações variáveis sobre o alinhamento de aminoácidos não idênticos.

[0057] A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de lacuna sejam modificadas. No entanto, prefere-se utilizar os valores predefinidos quando se utiliza esse software para comparações de sequências.

[0058] As pontuações atribuídas para o alinhamento de aminoácidos não idênticos são designadas de acordo com uma matriz de pontuação, também chamada matriz de substituição. As pontuações fornecidas em tais matrizes de substituição refletem o fato de que a probabilidade de um aminoácido ser substituído por outro durante a evolução varia e depende da natureza físico-química do aminoácido a ser substituído. Por exemplo, a probabilidade de um aminoácido polar ser substituído por outro aminoácido polar é superior em comparação com o mesmo de ser substituído por um aminoácido hidrofóbico. Portanto, a matriz de pontuação irá atribuir a pontuação mais alta para aminoácidos idênticos, menor pontuação para aminoácidos não idênticos, mas aminoácidos similares, e pontuação ainda mais baixa para aminoácidos não idênticos e não semelhantes. As matrizes de pontuação mais frequentemente utilizadas são as matrizes PAM (Dayhoff e outros (1978), Jones e outros (1992)), as matrizes BLOSUM (Henikoff e Henikoff (1992)) e a matriz Gonnet (Gonnet e outros (1992)).

[0059] Programas de computador apropriados para a realização de tal alinhamento incluem, mas não estão limitados aos programas Vector NTI (Invitrogen Corp.) e o ClustalV, ClustalW e ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins e outros (1992), Thompson e outros (1994), Larkin e outros (2007)). A seleção de diferentes ferramentas de alinhamento está disponível a partir do servidor Proteomics ExPASy no endereço www.expasy.org. Outro exemplo de software que pode realizar o alinhamento da sequência é o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information, que atualmente pode ser encontrado no endereço http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e que primeiramente foi descrito por Altschul e outros (1990) em J. Mol. Biol 215, 403-410.

[0060] Uma vez que o software produziu um alinhamento, é possível calcular a porcentagem de similaridade e a porcentagem de identidade da sequência. O software tipicamente faz isto como parte da comparação de sequências e gera um resultado numérico.

[0061] Em uma modalidade da presente invenção, prefere-se usar o software ClustalW para a realização de alinhamentos de sequências. De preferência, o alinhamento ClustalW é realizado com os seguintes parâmetros para o alinhamento em pares:

3ClustalW2 é, por exemplo, disponibilizado na internet pelo Instituto Europeu de Bioinformática na página EMBL-EBI www.ebi.ac.uk em Ferramentas - análise de sequência - ClustalW2. Atualmente, o endereço exato da ferramenta ClustalW2 é www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.

[0062] Em outra modalidade da presente invenção, prefere-se usar o programa Align X no Vector NTI (Invitrogen) para a realização de alinhamentos de sequências. Em uma modalidade da presente invenção, Exp10 tem sido usado com as configurações padrão: Penalidade de abertura de lacuna: 10 Penalidade de extensão de lacuna: 0,05 Média de penalidade de separação de lacuna: 8 Matriz de Pontuação: blosum62mt2

[0063] Consequentemente, a presente invenção também engloba a utilização de variantes, homólogos e derivados de qualquer sequência de aminoácidos de uma proteína, um polipeptídeo, um motivo ou um domínio, tal como definido no presente documento, particularmente aqueles da SEQ. ID. No.: 1.

[0064] As sequências, particularmente aquelas de variantes, homólogos e derivados da SEQ. ID. No.: 1, também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma alteração silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. Substituições deliberadas de aminoácidos podem ser feitas com base em semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos, desde que a atividade de ligação secundária da substância seja mantida. Por exemplo, aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina, e; os aminoácidos com grupos cabeça polar não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0065] A presente invenção também engloba a substituição conservadora (substituição e reposição são ambas aqui utilizadas no sentido de intercâmbio de um resíduo de aminoácido existente com um resíduo alternativo) que pode ocorrer, ou seja, como substituição comparável, como, por exemplo, básica por básica, ácida por ácida, polar por polar, etc. Uma substituição não conservadora também pode ocorrer, isto é, de uma classe de resíduo para outra ou, alternativamente, envolvendo a inclusão de aminoácidos não naturais, como, por exemplo, ornitina (daqui em diante referido como Z), ácido diaminobutírico ornitina (daqui em diante referido como B), norleucina ornitina (daqui em diante referido como O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina e fenilglicina.

[0066] As substituições conservadoras que podem ser feitas são, por exemplo, no âmbito dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos alifáticos (alanina, valina, leucina, isoleucina), aminoácidos polares (glutamina, asparagina, serina, treonina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), aminoácidos hidroxilados (serina, treonina), grandes aminoácidos (fenilalanina e triptofano) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina).

[0067] As substituições também podem ser feitas por aminoácidos não naturais incluindo aminoácidos alfa* e alfa-dissubstituídos*, aminoácios* N-alquila, ácido láctico*, derivados de haleto de aminoácidos naturais, como, por exemplo, trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br- fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil-glicina*, β-alanina*, ácido L-α- amino-butírico*, ácido L-y-amino-butírico*, ácido L-α-amino-isobutirico*, ácido L-ε-amino-caproico#, ácido 7-amino-heptanóico*, L-metionina- sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L- hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Fe), como, por exemplo, 4-metil-Fe*, pentametil-Fe*, L-Fe (4-amino)#, L- Tir(metil)*, L-Fe(4-isopropil)*, L-tic(ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina- 3-carboxila)*, ácido L-diaminopropiónico# e L-Fe (4-benzil)*.

[0068] O sinal * foi utilizado para a finalidade da discussão acima (relativo à substituição homóloga ou não conservadora), para indicar a natureza hidrofóbica do derivado, enquanto o sinal # foi utilizado para indicar a natureza hidrofílica do derivado e o sinal # * para indicar características anfipáticas.

[0069] Sequências de aminoácidos variantes podem incluir grupos espaçadores apropriados que podem ser inseridos entre quaisquer dos dois resíduos de aminoácidos da sequência, incluindo grupos alquila, tais como metil, etil ou propil em adição a espaçadores de aminoácidos, tais como resíduos de glicina ou β-alanina. Outra forma de variação, que envolve a presença de um ou mais resíduos de aminoácidos na forma peptoide, será bem compreendida pelos especialistas na técnica. Para que não restem dúvidas, "a forma peptoide" é utilizada para referir-se a resíduos de aminoácidos variantes, sendo que o grupo substituinte α-carbono está ligado a um átomo de nitrogênio do resíduo e não ao α-carbono. Processos para a preparação de peptídeos na forma peptoide são conhecidos na técnica, como, por exemplo, por Simon RJ e outros (1992), Horwell DC. (1995).

[0070] Em uma modalidade da presente invenção, a unidade de direcionamento variante utilizada na proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção, é uma variante que possui a sequência de aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.: 1 e tem pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 78%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com esta sequência de aminoácidos.

[0071] Em um aspecto da presente invenção, preferivelmente, a proteína ou a sequência utilizada na presente invenção está em uma forma purificada. O termo "purificada" significa que um determinado componente está presente em um nível elevado. O componente é, desejavelmente, o componente predominante ativo presente em uma composição.

[0072] O termo "variante" ou "variantes" refere-se a proteínas, polipeptídeos, unidades, motivos, domínios ou ácidos nucleicos. O termo "variante" pode ser utilizado alternadamente com o termo "mutante". Variantes incluem inserções, substituições, transversões, truncamentos e/ou inversões, em um ou mais locais na sequência de aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente. Os termos e expressões "polipeptídeo variante", "polipeptídeo", "variante" e” enzima variante" significam um polipeptídeo/proteína que tem uma sequência de aminoácidos que foi modificada na sequência de aminoácidos da SEQ. ID. No.: 1. Os polipeptídeos variantes incluem um polipeptídeo possuindo uma determinada percentagem, como, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ. ID. No.: 1 ou a sequência de aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.: 1.

[0073] "Ácidos nucleicos variantes" podem incluir sequências que são complementares das sequências que são capazes de hibridizar com as sequências de nucleotídeos apresentadas no presente documento. Por exemplo, uma sequência variante é complementar às sequências capazes de hibridizar sob condições rigorosas, como, por exemplo, 50°C e 0,2 X SSC (1 X SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7,0), para as sequências de nucleotídeos apresentadas no presente documento. Mais particularmente, o termo “variante” engloba sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar sob condições altamente rigorosas, como, por exemplo, 65°C e 0,1 X SSC, para as sequências de nucleotídeos apresentadas no presente documento. O ponto de fusão (Tm) de um ácido nucleico variante pode ser de aproximadamente 1, 2, ou 3°C mais baixo que o ponto de fusão (Tm) do ácido nucleico do tipo selvagem. Os ácidos nucleicos variantes incluem um polinucleotídeo possuindo uma determinada percentagem, como, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, de identidade de sequência com o ácido nucleico que codifica a SEQ. ID. No.: 1 ou que codifica a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0074] A expressão "proteína homodimérica", tal como aqui utilizada, refere-se a uma proteína que compreende dois filamentos individuais idênticos de aminoácidos, ou subunidades mantidas juntas como uma única proteína dimérica por ligação de hidrogênio, interações iônicas (carregadas), ligação covalente de dissulfureto real ou alguma combinação dessas interações.

[0075] A expressão "motivo de dimerização", tal como aqui utilizada, refere-se à sequência de aminoácidos entre a unidade antigênica e a unidade de direcionamento, compreendendo a região de dobradiça e o segundo domínio opcional que pode contribuir para a dimerização. Este segundo domínio pode ser um domínio de imunoglobulina e, opcionalmente, a região de dobradiça e o segundo domínio são conectados por meio de um ligante. Por conseguinte, o motivo de dimerização serve para conectar a unidade antigênica e a unidade de direcionamento, mas também contêm a região de dobradiça que facilita a dimerização das duas proteínas monoméricas em uma proteína homodimérica, de acordo com a presente invenção.

[0076] A expressão "unidade de direcionamento", tal como aqui utilizada, refere-se a uma unidade que entrega a proteína com o seu antígeno às células apresentadoras de antígeno (APC) de camundongo ou humanas para apresentação restrita ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II a células T CD4+ ou para fornecer apresentação cruzada a células T CD8+ por restrição ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I.

[0077] A expressão "unidade antigênica", tal como aqui utilizada, refere-se a qualquer molécula, como, por exemplo, um peptídeo que seja capaz de ser especificamente reconhecido por um anticorpo ou outro componente do sistema imunológico, como, por exemplo, um receptor de superfície em células-T. Incluídos nesta definição também estão os imunógenos que são capazes de induzir uma resposta imune, como, por exemplo, imunógenos idiotipos de anticorpos. O termo "epítopo" e a expressão "epítopo antigênico" são utilizados para se referir a uma superfície molecular distinta, como, por exemplo, uma superfície molecular provida de uma sequência peptídica curta dentro de uma unidade antigênica. Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica compreende dois ou mais epítopos antigênicos.

[0078] A expressão "região de dobradiça" refere-se a uma sequência peptídica da proteína homodimérica que facilita a dimerização, como, por exemplo, por meio da formação de uma(s) ligação(s) covalente(s) intercadeia(s), por exemplo, ponte(s) de dissulfeto. A região de dobradiça pode ser derivada de imunoglobulina (Ig), como, por exemplo, os éxons dobradiça h1+h4 de uma imunoglobulina (Ig), como, por exemplo, IgG3.

[0079] A expressão "composição imunoestimulante”, conforme aqui utilizada, refere-se a qualquer composição terapêutica que seja capaz de ativar o sistema imunológico, como, por exemplo, por ativação ou inibição das funções dos linfócitos, em particular, as funções das células-T como ativação das células-T.

MODALIDADES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO:

[0080] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é um antígeno específico do câncer ou um antígeno associado ao câncer.

[0081] A expressão "antígeno associado ao câncer" refere-se a qualquer antígeno, que necessariamente não é específico a um determinado câncer, mas superexpressado na superfície das células cancerosas deste câncer. A expressão pode ser utilizada permutavelmente com a expressão "antígenos cancerosos”.

[0082] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é um antigênico scFv. Em algumas modalidades da presente invenção, um ligante, como, por exemplo, um ligante (G4S)3, conecta VH e VL no antigênico scFv. Em algumas modalidades da presente invenção, o antigênico scFv é derivado de uma imunoglobulina (Ig) monoclonal produzida por células de mieloma ou linfoma.

[0083] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é uma telomerase ou uma parte funcional desta. Em algumas modalidades da presente invenção, a telomerase é hTERT.

[0084] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é um antígeno de melanoma. Em algumas modalidades da presente invenção, o antígeno de melanoma é tirosinase, TRP-1 ou TRP-2.

[0085] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é um antígeno do câncer de próstata. Em algumas modalidades da presente invenção, o antígeno do câncer de próstata é PSA.

[0086] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é um antígeno do câncer cervical. Em algumas modalidades da presente invenção, o antígeno do câncer de colo de útero é selecionado da lista que consiste em vírus do papiloma humano E1, E2, E4, E6, e E7.

[0087] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é derivada de uma bactéria.

[0088] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica derivada de uma bactéria é um antígeno da tuberculose.

[0089] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica derivada de uma bactéria é um antígeno de brucelose.

[0090] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é derivada de um vírus.

[0091]Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica derivada de um vírus é derivada do HIV. Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica derivada do HIV é derivada de gp120 ou Gag.

[0092] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica é selecionada da lista que consiste em vírus da influenza hemaglutinina (HA), nucleoproteína e antígeno M2; antígeno da glicoproteína D do herpes simples 2 e um antígeno do vírus de papiloma humano, como, por exemplo, qualquer um selecionado da lista que consiste em E1, E2, E6, E7, L1 e L2.

[0093] Em algumas modalidades da presente invenção, o motivo de dimerização compreende uma região de dobradiça e, opcionalmente, um outro domínio que facilita a dimerização, como, por exemplo, um domínio de imunoglobulina, opcionalmente conectado através de um ligante.

[0094] Em algumas modalidades da presente invenção, a região de dobradiça é derivada imunoglobulina (Ig), como, por exemplo, derivada de IgG3.

[0095] Em algumas modalidades da presente invenção, a região de dobradiça tem a capacidade de formar uma, duas ou várias ligações covalentes. Em algumas modalidades da presente invenção, a ligação covalente é uma ponte de dissulfeto.

[0096] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de imunoglobulina do motivo de dimerização é um domínio carboxiterminal C ou uma sequência que é substancialmente homóloga ao dito domínio C. Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio carboxiterminal C é derivado de IgG.

[0097] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de imunoglobulina do motivo de dimerização tem a capacidade de homodimerização.

[0098] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de imunoglobulina do motivo de dimerização tem a capacidade de homodimerização através de interações não covalentes. Em algumas modalidades da presente invenção, as interações não covalentes são interações hidrofóbicas.

[0099] Em algumas modalidades da presente invenção, o domínio de dimerização não compreende o domínio CH2.

[00100] Em algumas modalidades da presente invenção, o motivo de dimerização consiste em éxons dobradiça h1 e h4 conectados através de um ligante a um domínio CH3 de IgG3 humana.

[00101] Em algumas modalidades da presente invenção, o ligante que conecta a região de dobradiça e um outro domínio que facilita a dimerização, como, por exemplo, um domínio de imunoglobulina, é um ligante G3S2G3SG.

[00102] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade antigênica e o motivo de dimerização estão conectados através de um ligante, como, por exemplo, um ligante GLSGL.

[00103] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 1.

[00104] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.: 1.

[00105] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.:1.

[00106] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.:1.

[00107] Em algumas modalidades da presente invenção, a proteína homodimérica não é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 1.

[00108] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.:2.

[00109] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.:2.

[00110] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.:2.

[00111] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.:2.

[00112] Em algumas modalidades da presente invenção, a proteína homodimérica não é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.:2.

[00113] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento compreende não mais do que 68 aminoácidos, como, por exemplo, 68, 67 ou 66 aminoácidos.

[00114] Em algumas modalidades da presente invenção, a unidade de direcionamento não contém a sequência de aminoácidos AP nas posições 1 e 2 da unidade de direcionamento.

[00115] Em algumas modalidades da presente invenção, a proteína homodimérica é a primeira proteína homodimérica com afinidade aumentada em comparação com a afinidade de uma segunda proteína homodimérica, sendo que a segunda proteína homodimérica apenas difere da referida primeira proteína homodimérica por ter uma unidade de direcionamento que consiste em aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 2; o aumento da afinidade é para qualquer um dos receptores de quimiocinas selecionado entre CCR1, CCR3 e CCR5.

[00116] Em algumas modalidades da presente invenção, a molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é constituída por um vetor.

[00117] Em algumas modalidades da presente invenção, a molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, é formulada para a administração a um paciente, para induzir a produção da proteína homodimérica no referido paciente.

[00118] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição imunoestimulante ou a vacina, de acordo com a presente invenção, compreende um adjuvante e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00119] Em algumas modalidades da presente invenção, o câncer tratado por uma composição imunoestimulante ou vacina ou composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção, é mieloma múltiplo ou linfoma, melanoma maligno, câncer induzido por HPV, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário e/ou câncer de fígado. Em algumas modalidades da presente invenção, a doença infecciosa tratada por uma composição imunoestimulante ou vacina ou composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção, é selecionada da lista constituída de influenza, herpes, CMV, HPV, HBV, brucelose, HIV, HSV-2 e tuberculose. MODALIDADES NUMERADAS DA INVENÇÃO: 1. Proteína homodimérica de duas cadeias de aminoácidos idênticos, sendo que cada cadeia de aminoácido compreende uma unidade de direcionamento compreendendo uma sequencia de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.:1, e uma unidade antigênica, sendo que a unidade de direcionamento e a unidade antigênica são conectadas através de um motivo de dimerização. 2. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1, sendo que a unidade antigênica é um antigênico scFv. 3. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1 ou 2, sendo que um agente de ligação, como, por exemplo, um ligante (G4S)3, conecta VH e VL no antigênico scFv. 4. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 13, sendo que o antigênico scFv é derivado de uma imunoglobulina (Ig) monoclonal produzida por células de linfoma ou mieloma. 5. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1, sendo que a unidade antigênica é uma telomerase ou uma parte funcional da mesma. 6. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 5, sendo que a referida telomerase é hTERT. 7. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1, sendo que a unidade antigênica é derivada de uma bactéria. 8. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 7, sendo que a unidade antigênica derivada de uma bactéria é selecionada entre um antígeno de tuberculose e um antígeno de brucelose. 9. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1, sendo que a unidade antigênica é derivada de um vírus. 10. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 9, sendo que a unidade antigênica derivada de um vírus é derivada do HIV. 11. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 10, sendo que a unidade antigênica derivada de HIV é derivada de gp120 ou Gag. 12. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 9, sendo que a unidade antigênica é selecionada da lista que consiste em vírus da influenza hemaglutinina (HA), nucleoproteína e antígeno M2, e; antígeno da glicoproteína D do herpes simples 2. 13. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 1, sendo que a unidade antigênica é um antígeno específico do câncer ou um antígeno associado ao câncer. 14. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 13, sendo que a unidade antigênica do câncer é um antígeno do melanoma, como, por exemplo, os antígenos de melanoma, tirosinase, TRP-1 ou TRP-2. 15. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 13, sendo que a unidade antigênica do câncer é um antígeno do câncer de próstata, como, por exemplo, o antígeno do câncer de próstata, PSA. 16. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 13, sendo que a unidade antigênica do câncer é um antígeno do câncer de colo de útero, como, por exemplo, o antígeno do câncer de colo de útero selecionado da lista que consiste em E1, E2, E4, E6, E7, L1 e L2. 17. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, sendo que o motivo de dimerização compreende uma região de dobradiça e, opcionalmente, outro domínio que facilita a dimerização, como, por exemplo, um domínio de imunoglobulina, opcionalmente conectado através de um ligante. 18. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 17, sendo que a região de dobradiça é derivada de imunoglobulina (Ig), como, por exemplo, derivada de IgG3. 19. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-18, sendo que a região de dobradiça tem a capacidade de formar uma, duas ou várias ligações covalentes. 20. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-19, sendo que a ligação covalente é uma ponte de dissulfeto. 21. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-20, sendo que o domínio de imunoglobulina do motivo de dimerização é um domínio carboxiterminal C ou uma sequência que é substancialmente homóloga ao dito domínio C. 22. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 21, sendo que o domínio carboxiterminal C é derivado de IgG. 23. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-22, sendo que o domínio de imunoglobulina do motivo de dimerização tem a capacidade de homodimerização. 24. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-23, sendo que o referido domínio de imunoglobulina tem a capacidade de homodimerização por meio de interações não covalentes. 25. Proteína homodimérica, de acordo com a modalidade 24, sendo que as referidas interações não covalentes são interações hidrofóbicas. 26. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-25, sendo que o referido domínio de dimerização não compreende o domínio CH2. 27. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-26, sendo que o motivo de dimerização compreende éxons de dobradiça h1 e h4 conectados através de um ligante a um domínio CH3 de IgG3 humana. 28. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 17-27, sendo que o referido ligante é um ligante G3S2G3SG. 29. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-28, sendo que a referida unidade antigênica e o motivo de dimerização estão conectados através de um ligante, como, por exemplo, um ligante GLSGL. 30. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 1. 31. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.: 1. 32. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 1. 33. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-30, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 1. 34. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a proteína homodimérica não é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 1. 35. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de segmentação é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 2. 36. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 5-70 da SEQ. ID. No.: 2. 37. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 2. 38. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, sendo que a referida unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 2. 39. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-29, que a proteína homodimérica não é constituída pelos aminoácidos 170 da SEQ. ID. No.: 2. 40. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-32, 35-37, sendo que cada uma das ditas unidades de direcionamento consiste em não mais do que 68 aminoácidos, como, por exemplo, 68, 67 ou 66 aminoácidos. 41. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-30, 35, sendo que a referida unidade de direcionamento não contém as sequências de aminoácidos AP nas posições 1 e 2 da unidade de direcionamento. 42. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 141, sendo que a proteína homodimérica tem afinidade aumentada para qualquer receptor de quimiocinas selecionado entre CCR1, CCR3 e CCR5, em comparação com a afinidade da mesma proteína homodimérica, sendo que a unidade de direcionamento é constituída pelos aminoácidos 1-70 da SEQ. ID. No.: 2. 43. Molécula de ácido nucleico, que codifica a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42. 44. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43, compreendida por um vetor. 45. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44, formulada para a administração a um paciente, para induzir a produção da proteína homodimérica no referido paciente. 46. Proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, ou a molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44, para uso como um medicamento. 47. Composição farmacêutica contendo a proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, ou a molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44. 48. Célula hospedeira contendo a molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44. 49. Método para a preparação de uma proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, sendo que o dito método compreende as seguintes etapas: a) transfectar a molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44, em uma população de células; b) cultivar a população de células; c) coletar e purificar a proteína homodimérica expressa a partir da população de células 50. Vacina contra um câncer ou uma doença infecciosa, compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, ou molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44, que codifica a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, sendo que a referida vacina é capaz de desencadear uma resposta imune das células T e das células B e sendo que a referida proteína homodimérica contém uma unidade antigênica específica para o referido câncer ou para a referida doença infecciosa. 51. Vacina, de acordo com a modalidade 50, compreendendo também um adjuvante e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável. 52. Vacina, de acordo com a modalidade 50 ou 51, sendo que o referido câncer é mieloma múltiplo ou linfoma, melanoma maligno, câncer induzido por HPV, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário e/ou câncer de fígado. 53. Vacina, de acordo com a modalidade 50 ou 51, sendo que a referida doença infecciosa é selecionada da lista que consiste em tuberculose, influenza, herpes, CMV, HPV, HBV, HIV, brucelose e/ou HSV-2. 54. Método de tratamento de um câncer ou de uma doença infecciosa em um paciente, sendo que o dito método compreende a administração ao paciente em necessidade do mesmo de uma proteína homodimérica, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-42, ou molécula de ácido nucleico, de acordo com a modalidade 43 ou 44, que codifica a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, sendo que a referida proteína homodimérica contém uma unidade antigênica específica para o referido câncer ou para a referida doença infecciosa.

EXEMPLO 1 Camundongos e linhas de células

[00120] Camundongos BALB/c foram obtidos junto à Taconic (Ry, Dinamarca). O receptor de células-T (TCR) específico de Id(À,2315) de camundongos transgênicos foi descrito (vide Bogen B e outros; Eur J Immunol, 1992, Mar; 22(3):703-9 e Snodgrass HR e outros, Eur J Immunol, 1992, agosto; 22(8):2169-72). O receptor de células-T (TCR) reconhece os aminoácidos 91-101 da cadeia leve À2315 produzidos pelo plasmocitoma de camundongo IgA MOPC315, apresentados nas moléculas de classe II I-Ed. Os estudos foram aprovados pela Comissão Nacional de Experimentação Animal (Oslo, Noruega). As células MOPC 315,4 (IgA, U315), HEK 293 e HEK 293E eram de ATCC. As células HEK 293 transfectadas estavelmente com hCCR5 e hCCR1 foram gentilmente cedidas por Mario Mellado (Madrid, Espanha) e Howard Zack (Frederick, MD), respectivamente. As células HEK 293 transfectadas estavelmente com macaco Rhesus (GenBank AF005660) foram obtidas junto à Pfizer Inc., (Groton, CT). As células ESB/MP de linfoma murino foram gentilmente cedidas por Jo Van Damme (Leuven, Bélgica).

Clonagem de MIP1a/CCL3 humana (Vaccibodies codificando LD78α ou LD78β)

[00121] Os genes codificados por LD78α e LD78β maduras (GenBank NM_002983 e NG_004113, respectivamente) foram amplificados a partir do cDNA de monócitos derivados da medula óssea de um doador saudável enriquecidos com CD14. Os iniciadores diretos (sítio de restrição de BsmI, em itálico) foram os seguintes: LD78α: GGTGTGCATTCCGCATCACTTGCTGCTGAC (SEQ. ID. No.:3); LD78β: GGTGTGCATTCCGCACCACTTGCTGCTGAC (SEQ. ID. No.:4);

[00122] E o iniciador reverso (sítio de restrição de BsiWI, em itálico) foi: GACGTACGACTCACCTGCAACTCAGCTCCAGGTC (SEQ. ID. No.: 5). LD78β-2 de 68 aminoácidos de comprimento (3-70) foi clonada por meio do uso do iniciador direto (site de restrição BsmI, em itálico): GGTGTGCATTCCCTTGCTGCTGACACGCC (SEQ. ID. No.: 6).

[00123] LD78α e LD78β pontualmente mutados carregando um S em vez de um resíduo de C na posição 11 foram gerados pela mudança rápida de PCR utilizando os seguintes iniciadores: direto CCGACCGCCTCCTGCTTCAG (SEQ. ID. No.: 7) e reverso CTGAAGCAGGAGGCGGTCGG (SEQ. ID. No.: 8). Os genes de quimiocina amplificados foram inseridos no cassete de direcionamento da construção da Vaccibody IlhFpLNOH2 (vide Fredriksen AB e outros, Mol Ther, 2006 Abril; 13 (4):776-85) por meio do uso de sites de restrição Bsml/BsiWI. A construção da Vaccibody resultante codificada por proteínas homodiméricas com unidades de direcionamento derivadas de hCCL3 e MOPC315 scFv em uma orientação VH-VL como unidade antigênica, conectadas via um motivo de homodimerização constituído de éxons de dobradiça humanos h1 e h4 e domínio CH3 de IgG3.

[00124] A unidade antigênica (scFv315) em Vaccibodies acima descrita foi trocada ou com domínios Ck murinos pareados (Tunheim G e outros, Vaccine, 2007, Jun 11; 25(24):4723-34) ou com o vírus da influenza hemaglutinina (HA) a partir de H1N1 A/Porto Rico/8/34 (Mt. Sinai) (G. Gr0deland, manuscrito em preparação).

Avaliação da produção de proteína da vacina

[00125] Os sobrenadantes de células 293E transientemente transfectadas foram testados nos seguintes ELISAs. Vaccibodies scFv315: DNP-BSA (liga-se a M315) como revestimento e HP6017 monoclonal biotinilado (motivo de dimerização anti-CH3) para detecção; Vaccibodies HA: MCA878G (motivo de dimerização anti-CH3) como revestimento e H36-4-52 mAB biotinilado anti-HA para detecção; Vaccibodies CKCK de camundongo: 187,1 mAb (liga-se a camundongo CK) como revestimento e 187,1 biotinilado para detecção.

Produção, purificação, quantificação e caracterização proteômica de proteínas Vaccibody.

[00126] Proteínas Vaccibody possuindo scFv315 como unidade antigênica foram purificadas por afinidade a partir dos sobrenadantes de células NS0 estavelmente transfectadas em colunas de Sepharose-DNP (ligadas por M315). Proteínas purificadas foram carregadas em 4-20% de um gel de Tris-glicina. Após a transferência da membrana, as proteínas foram detectadas com HP6017 ou mAbs Ab2-1,4 (liga-se a M315) biotinilado seguido por estreptavidina-HRP. Proteínas Vaccibody foram quantificadas por Bradford e ELISA por meio do uso de BSA e Vaccibody mCCL3 (vide Fredriksen AB e outros Mol. Ther.; 2006; Abril, 13(4):776-85) como padrões, respectivamente. As bandas de proteína correspondentes a Vaccibodies LD78β e LD78β-2 com Fv315 foram extirpadas de um gel de poliacrilamida corado com Coomassie e submetidas à digestão em gel com tripsina, conforme descrito anteriormente.

Ligação a CCR5 e CCR1 humano e murino

[00127] Proteínas Vaccibody em concentrações variando de 0,2 a 25 μg/ml foram utilizadas para corar células parentais ou transfectadas estavelmente HEK 293 ou esplenócitos de camundongos BALB/c (mediados por FSC/SSC e em células CD11b + CD3-). As proteínas Vaccibody ligadas foram detectadas por HP6017 biotinilado (liga-se a CH3 da hIgG3) ou MAbs Ab2-1,4 (liga-se a M315) seguido de estreptavidina-PE. As células foram analisadas em um FACScalibur.

Ensaio de quimiotaxia

[00128] A migração celular in vitro foi avaliada por meio de uma placa Transwell de 24 poços (Corning), conforme descrito anteriormente. Foram utilizadas membranas de policarbonato com poros de 8 μm ou 5 μm para células HEK 293 e Esb/MP, respectivamente. As quimiocinas recombinantes eram da Peprotech. Os resultados (média + SE de amostras duplicadas) são apresentados como índice quimiotático, definidos como o aumento de vezes no número de células que migram na presença de fatores quimiotáticos sobre a migração celular espontânea (isto é, na presença apenas do meio).

Ensaio de estimulação de célula T

[00129] Esplenócitos de camundongos BALB/c foram irradiados (8 Gy) e misturados com as proteínas Vaccibody contendo scFv315 a concentrações variando de 20 a 0,04 μg/ml antes da adição de células Th2 específicas Id315 polarizadas in vitro derivadas de camundongos com TCR transgênico. Um peptídeo Id correspondente à sequência 89-107 de À2315 foi utilizado como um controle positivo.

[00130] Células PBMC humanas de três diferentes doadores saudáveis DR4*01 foram misturadas com os sobrenadantes de células 293E transientemente transfectadas, contendo proteínas Vaccibody com CKCK de camundongo como unidade antigênica, antes da irradiação (20 Gy) e adição de clone de células-T T18 que reconhece os aminoácidos 40-48 de Ck murino apresentado por DR4*01. Após 48 horas, as placas foram pulsadas com 3H-timidina durante 24 horas antes da colheita.

Imunizações de camundongos

[00131] DNA Vaccibody foi purificado por meio do uso do sistema de purificação EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen). Uma solução de 25 μl de 0,5 mg/ml de DNA Vaccibody em NaCl estéril a 0,9% foi injetada por via intradérmica nas costas dos camundongos, de ambos os lados, seguido por eletroporação por meio do uso de Dermavax (Cytopulse, Suécia). Os grupos consistiam de 3 a 7 camundongos.

Medição de anticorpos Anti-Id315

[00132] Os camundongos foram sangrados três, quatro e seis semanas após uma imunização única. A proteína do mieloma M315 (IgA, À.2) foi utilizada como revestimento e anticorpos anti-Id315 em soros de camundongo foram detectados por IgG1a biotinilado anti-camundongo ou IgG2aa anti- camundongo (BD Pharmingen). O ponto final das titulações foi calculado.

Ensaio Elispot

[00133] Placas Millipore Multiscreen (Millipore, Billerca, MA, EUA) foram revestidas com IFN-y anti-camundongo (AN18) (12μg/ml) e depois bloqueadas durante 2 horas com RPMI-1640 (Invitrogen, NY, EUA) contendo FCS a 10%. Esplenócitos de célula única foram preparados individualmente a partir de camundongos vacinados com DNA três semanas antes com NaCl ou Vaccibodies contendo HA e incubados durante a noite em células/poços 106, 5x105 e 2,5x105 com um dos seguintes peptídeos derivados de HA da ProImmune (Oxford, Reino Unido): SVSSFERFEIPK (aminoácidos 107-119, I-Ed-restrito), HNTNGVTAACSHEG (aminoácidos 126-138, I-Ad-restrito) ou IYSTVASSL (aminoácidos 633-641, Kd restrito). As placas foram lavadas em PBS e as células aderentes lisadas por uma incubação de cinco minutos em água desionizada antes da incubação com IFN-y anti-camundongo biotinilado (1μg/ml) (XMG1,2, Pharmingen) e conjugado de estreptavidina/ fosfatase alcalina (1:3000) (GE Healthcare, Little Chalfont Buckinghamshire, Reino Unido). Células produtoras de IFN- y foram detectadas por meio do uso do kit de BCIP/NBT (Zymed Laboratories Inc, Carlsbad, CA, EUA), e a contagem foi realizada com KS ELISPOT versão 4.3.56 da Zeiss em um sistema de imagem Zeiss Axioplan 2 (objetiva: Epiplan-Neofluar 5x, 442,320).

Vacinação de camundongos com construção Vaccibody-HA

[00134] Os camundongos foram anestesiados, raspados e vacinados por via intradérmica com 25μl de DNA (0,5 mg/ml) em cada um dos lados da região lombar imediatamente seguida por eletroporação da pele (DermaVax/ CytoPulse). Quatorze dias depois, os camundongos foram anestesiados com Hypnorm/Dormicum e desafiados com 20μl de vírus de influenza (A/PuertoRico/8/34 (Mt. Sinai) (5xLD50)). Após o desafio, os camundongos foram pesados e cuidadosamente monitorados quanto aos sinais clínicos.

Construção e expressão de Vaccibodies à base de CCL3 humana

[00135] Vaccibodies homodiméricas foram construídas de forma que tivessem várias unidades de direcionamento à base de hCCL3, uma unidade de homodimerização derivada de imunoglobulina (Ig) humana e unidades antigênicas diversas, conforme indicado na Figura 1A. A sequência terminal de aminoácidos NH2 dos LD78α, LD78β, LD78β-2 utilizados e o efeito putativo da mutação pontual de C11S na estrutura da quimiocina LD78β (C11S) são mostrados na Figura 1B e 1C, respectivamente. Todas Vaccibodies foram expressas em níveis comparáveis por células 293E transientemente transfectadas, exceto Vaccibodies LD78β-2 que foram expressas consistentemente a uma menor extensão (Figura 2 A-C).

[00136] A integridade das proteínas Vaccibody tendo scFv315 como unidade antigênica foi testada por SDS-PAGE, sendo que as bandas individuais de aproximadamente 110 kDa eram visíveis, de tal modo que, após a transferência da membrana, poderiam ser coradas com mAbs apropriadas (Figura 2 D e dados não apresentados para outras construções.). O tamanho aparentemente aumentado da Vaccibody (C11S) mutada é provavelmente devido a um aumento no raio de Stokes devido à anulação de uma ligação S-S (Figura 1C). Sob condições de redução, bandas simples de aproximadamente 55 kDa, correspondendo a monômeros, foram observadas, conforme esperado (dados não mostrados).

[00137] A sequência de aminoácidos terminal NH2 das proteínas Vaccibody LD78β também foi confirmada, pois as células NS0 ou o soro bovino fetal no meio de cultura podem ter atividade CD26 resultando em modificações pós-translacionais de LD78β. Análise de digestão tríptica de proteínas Vaccibody LD78βIhF e LD78β-2IhF por espectrometria de massa MALDI-TOF mostrou exclusivamente os sinais a m/z 1988,89 e m/z 1820,78, correspondendo aos peptídeos de terminal-N APLAADTPTACCFSYTSR (SEQ. ID. No.: 9) e LAADTPTACCFSYTSR (SEQ. ID. No.: 10), respectivamente (dados não mostrados). Portanto, Vaccibodies LD78β-2 versão truncada NH2 ou LD78β versão completa pura podem ser expressas e purificadas a partir de células NS0 estavelmente transfectadas.

Vaccibodies LD78β e versão truncada NH2 ligam-se a receptores de quimiocina humana e murina

[00138] Dada a variabilidade na expressão de CCR5 entre os indivíduos, as células HEK 293 transfectadas estavelmente com hCCR5, em vez de PBMC, foram utilizadas para estudos funcionais. Vaccibody LD78β e LD78β-2, mas não seu congênere da mutação pontual, ligaram-se às células HEK 293 transfectadas com hCCR5 (Figuras 3 A, B e dados não mostrados). Vaccibody LD78β-2 versão truncada NH2 exibiu ligação mais forte do que a Vaccibody LD78β versão completa. A Vaccibody LD78β da mutação pontual (C11S) não se ligou a células hCCR5 transfectadas (Figura 3A). Vaccibodies LD78β-2, mas não LD78, também se ligaram a células HEK 293 expressando hCCR1 (Figuras 3 C, D e dados não apresentados), o que está de acordo com relatórios anteriores. Não houve coloração de células HEK 293 parentais não transfectadas (não mostrado).

[00139] Vaccibody LD78β, mas não seu congênere da mutação pontual, ligou-se a esplenócitos CD11b + de camundongos BALB/c (Figura 4 A), e a quimiotaxia induzida de células ESB/MP (Figura 4 B), proporcionando, assim, a justificativa lógica para testar Vaccibodies expressando LD78β em camundongos.

Entrega de antígeno a células apresentadoras de antígeno (APC) através de receptores de quimiocina aumenta as respostas das células T in vitro em sistemas de humanos e camundongos

[00140] Esplenócitos de camundongos BALB/c misturados com Vaccibodies LD78β que expressam a unidade antigênica scFv315 induziram a proliferação de células Th2 específicas de Id315 de camundongos transgênicos TCR (Figura 5 A). Vaccibodies semelhantes em que a mutação C11S foi introduzida tinha uma capacidade diminuída aproximadamente 100 vezes de estimular as células T. Quando se compara as concentrações equimolares de Vaccibody LD78β e um peptídeo Id compreendendo as mutações CDR3, Vaccibody mostrou ser até 30 vezes mais eficaz do que o peptídeo ao carregar as células apresentadoras de antígeno (APC) para apresentação de antígeno (não mostrado).

[00141] No que se refere às respostas de células-T humanas, Vaccibodies LD78β que expressam CKCK murina como um antígeno modelo foram misturadas com PBMCs doadores e células T T18 CD4 + clonadas que reconhecem os aminoácidos 40-48 de Ck murina no contexto de DR4*01. A diferença entre o tipo selvagem e LD78β da mutação pontual foi menos pronunciada no sistema camundongo (Figura 5 B). Além disso, a entrega de antígeno direcionada é demonstrada pela superioridade de LD78β sobre Vaccibody específica de NIP não direcionada (Figura 5B). Deve-se destacar que Vaccibodies LD78β-2 superaram Vaccibodies LD78β. Resultados semelhantes foram obtidos por meio do uso de três doadores diferentes (não mostrado).

Resposta humoral anti-Id melhorada induzida em camundongos por Vaccibodies LD78β contendo scFv315

[00142] Id VH + VL da proteína do mieloma M315 é um auto-antígeno muito fraco, na verdade, um esquema de imunização abrangente, incluindo imunizações múltiplas com adjuvantes de Freund completos e incompletos foi necessário para detectar anticorpos anti-Id. Portanto, testou-se se camundongos injetados via intradérmica, com DNA Vaccibody LD78βscFv315, em combinação com eletroporação, desenvolveram anticorpos anti-Id. As respostas de IgG1 (Figura 6A) e IgG2a (Figura 6B) anti-Id315 foram detectadas em camundongos que tinham sido imunizados com Vaccibodies que codificam LD78β, demonstrando também que a integridade conformacional de scFv315 é mantida em Vaccibody LD78β (Figura 6). As respostas de IgG1 foram registradas a um grau significativamente menor nos camundongos que receberam Vaccibody C11S da mutação pontual, ao passo que a diferença para IgG2a não foi significativa. Além disso, respostas Ab mais baixas estatisticamente significativas foram observadas para IgG1 e IgG2a em camundongos que foram imunizados com Vaccibodies de controle não direcionadas (anti-NIP). Estes resultados sugerem que de modo geral a entrega do antígeno direcionada melhora as respostas dos anticorpos a um modelo de auto- antígeno tumoral fraco.

Indução de respostas das células T CD4+ e CD8+ específicas da hemaglutinina do vírus da influenza em camundongos após administração de Vaccibody

[00143] A indução de respostas das células-T CD8+ foi investigada em um modelo de influenza, sendo que a hemaglutinina (HA) serviu como o antígeno alvo. A hemaglutinina (HA) da estirpe A/Puerto Rico/8/34 (Mt. Sinai) (H1N1) é conhecida por expressar três epítopos aos quais os camundongos BALB/c (H-2d) respondem. Dois destes são restritos ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II, SVSSFERFEIPK (SEQ. ID. No.: 11) (aminoácidos 107-119) restritos por I- Ed e HNTNGVTAACSHEG (SEQ. ID. No.: 12) (aminoácidos 126-138) restritos por I-Ad, respectivamente. O terceiro epítopo, IYSTVASSL (SEQ. ID. No.: 13) (aminoácidos 633-641), é restrito ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Kd). Após uma única imunização intradérmica de DNA Vaccibody LD78β e eletroporação, as respostas IFNY aumentaram significativamente para o epítopo classe I, quando foi observado para Vaccibodies direcionados versus não direcionados (C11S) e imunização simulada (NaCl) (Figura 7 A). As respostas aos epítopos de classe II foram ligeiramente elevadas, mas o efeito de direcionamento não foi significativo (apenas uma imunização foi feita nas presentes experiências) (Figura 7 A).

Vaccibody LD78β liga-se a CCR5 de Macaco Rhesus

[00144] CCR5 é conservado em diferentes espécies, incluindo macacos. Genes CCR5 de humanos e macacos são bastante homólogos aos aminoácidos (98%). Como os seres humanos, os macacos têm duas isoformas CCL3. Vaccibodies LD78β e LD78β-2 ligaram-se de uma forma dose-dependente às células HEK 293 expressando CCR5 do macaco rhesus, ao passo que LD78β da mutação pontual (C11S) não se ligou às mesmas células (Figura 8, e os dados não mostrados). Este resultado indica que Vaccibodies com LD78β e LD78β-2 projetadas para uso humano, não só podem ser testadas em camundongos, como acima, mas como também em macacos Rhesus, antes de qualquer aplicação em seres humanos.

Vaccibody LD78β-HA, mas não Vaccibody LD78β-2-HA protege camundongos da influenza.

[00145] Como mostrado na Figura 9, os camundongos foram vacinados com as duas formas de LD78 β, LD78β ou LD78β-2. A versão completa de LD78β mostrou ter efeito superior em termos de proteção de camundongos contra a infecção da influenza. SEQUÊNCIAS: LD78β (SEQ. ID. No.:1): APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGR QVCADPSEEWVQKYVSDLELSA LD78α (SEQ. ID. No.:2): ASLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSR QVCADPSEEWVQKYVSDLELSA

Claims (14)

1. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA de duas cadeias de aminoácidos idênticos, sendo que cada cadeia de aminoácido compreende uma unidade de direcionamento, a referida proteína homodimérica sendo caracterizada pelo fato de que a unidade de direcionamento compreende a sequência de aminoácidos 5 a 70 da SEQ ID NO: 1, e uma unidade antigênica, em que a unidade de direcionamento e a unidade antigênica são conectadas através de um motivo de dimerização.

2. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da referida unidade de direcionamento ser constituída pelos aminoácidos 3-70 da SEQ. ID. No.: 1.

3. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato da unidade antigênica ser um antigênico scFv; ou uma telomerase; ou uma parte funcional da mesma, como, por exemplo, hTERT.

4. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato da unidade antigênica ser derivada de uma bactéria, tal como um antígeno de tuberculose e um antígeno de brucelose.

5. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato da unidade antigênica ser derivada de um vírus, tal como derivada de HIV, ser derivada de gp120 ou Gag; ou ser selecionada da lista que consiste em vírus da influenza hemaglutinina (HA), nucleoproteína, antígeno M2; antígeno da glicoproteína D do herpes simples 2, e; um antígeno do vírus de papiloma humano, como qualquer um selecionado da lista que consiste em E1, E2, E6, E7, L1 e L2.

6. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato da unidade antigênica ser um antígeno específico do câncer como um antígeno de melanoma, como os antígenos de melanoma tirosinase, TRP-1 ou TRP-2, ou um antígeno do câncer de próstata, como o antígeno do câncer de próstata PSA, ou um vírus de papiloma humano, como o antígeno do câncer de colo de útero selecionado da lista que consiste em E1, E2, E4, E6 e E7.

7. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -6, caracterizada pelo fato do motivo de dimerização compreender uma região de dobradiça, como uma região de dobradiça derivada de imunoglobulina (Ig), como derivada de IgG3, e, opcionalmente, outro domínio que facilita a dimerização, como um domínio de imunoglobulina, opcionalmente conectado através de um ligante.

8. MOLÉCULA de ácido nucleico que codifica a proteína monomérica, que pode formar a proteína homodimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato da molécula de ácido nucleico compreender a sequência de ácido nucleico identificada pelos nucleotídeos 28-222 de SEQ ID NO: 14 ou uma sequência degenerada da mesma que codifica a sequência de aminoácidos 5-70 de SEQ ID NO: 1.

9. PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de ser para uso em um câncer ou em uma doença infecciosa.

10. MOLÉCULA de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8 caracterizada pelo fato de ser para uso em um câncer ou uma doença infecciosa.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada pelo fato de compreender a proteína homodimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7, ou a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 8 e um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA de acordo com a reivindicação 11 caracterizada pelo fato de ser para uso em um câncer ou uma doença infecciosa.

13. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA HOMODIMÉRICA, como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato do dito método compreender as seguintes etapas: a) transfectar a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, em uma população de células; b) cultivar a população de células; e c) coletar e purificar a proteína homodimérica expressa a partir da população de células.

14. VACINA contra um câncer ou uma doença infecciosa, caracterizada pelo fato de que a referida vacina compreende contendo uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína homodimérica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-7, ou molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 8, que codifica a proteína monomérica que pode formar a proteína homodimérica, a referida vacina sendo capaz de desencadear uma resposta imune das células T e das células B e a referida proteína homodimérica conter uma unidade antigênica específica para o referido câncer ou para a referida doença infecciosa.

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