ES2730718T3 - Vacunas contra el VPH - Google Patents
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Abstract
Una proteína homodimérica de dos cadenas de aminoácidos idénticas, comprendiendo cada cadena de aminoácidos (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO:22 (E6 de VPH16) y/o SEQ ID NO:24 (E6 de VPH18) y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de SEQ ID NO:23 (E7 de VPH16) y/o SEQ ID NO:25 (E7 de VPH18), y donde dichas secuencias de aminoácidos comprenden una o más mutaciones para inhibir las propiedades oncogénicas.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el VPH
Campo
La presente descripción se refiere a compuestos terapéuticos, tales como vacunas contra el virus del papiloma humano (VPH) y, en particular, a vacunas de ADN contra VPH16 y/o VPH18. La descripción también se refiere a péptidos homodiméricos que codifican construcciones de proteínas, y dichos péptidos se pueden liberar de una vacuna de ADN o utilizarse por separado. También se describen en la presente descripción formulaciones farmacéuticas, células huésped y procedimientos para producir las vacunas, así como procedimientos que se pueden aplicar para tratar diversas enfermedades inducidas por VPH, tales como cánceres y enfermedades infecciosas.
Antecedentes
En la actualidad es bien sabido que el virus del papiloma humano (VPH) es la causa del cáncer de cuello uterino y otras neoplasias malignas asociadas al VPH tales como cánceres anogenitales (de ano, vulva, vagina y pene) y un subconjunto de cánceres de cabeza y cuello. En particular, VPH16 y VPH18 son responsables de cerca de 70 % de todos los cánceres de cuello uterino en todo el mundo.
Al día de hoy, existen dos vacunas profilácticas contra el VPH en el mercado (Gardasil y Cervarix). El objetivo de las vacunas profilácticas es inducir respuestas inmunes humorales estimulando la producción de anticuerpos neutralizantes específicos para las proteínas de cápside vírica de VPH, L1 y L2. Si bien las vacunas preventivas son un logro importante para el control de cáncer de cuello uterino inducido por VPH y posiblemente otras neoplasias malignas asociadas con VPH, el efecto de estas vacunas no será significativo hasta que no pasen 20-40 años (Ma B et al., Current Cancer Therapy Reviews, 2010). Asimismo, puesto que la cobertura de la vacunación masiva para las vacunas profilácticas es, hoy en día, limitada, con una gran población en todo el mundo ya infectada con el VPH, las neoplasias malignas asociadas con VPH seguirán avanzando. Por ende, será importante desarrollar vacunas terapéuticas específicas para VPH con el propósito de reducir la mortalidad y morbilidad de neoplasias malignas asociadas con VPH y sus lesiones precursoras (Ma B et al., Current Cancer Therapy Reviews, 2010).
El desarrollo de diversas vacunas contra el cáncer y de estrategias de inmunoterapia contra el cáncer ha avanzado durante las últimas dos décadas. Sin embargo, hasta ahora solo una vacuna terapéutica contra el cáncer, denominada Provenge (Dendreon INC) ha sido aprobada para aplicarse como terapia estándar contra el cáncer de próstata. En especial, por cuestiones éticas, la mayor parte de las vacunas terapéuticas contra el cáncer se prueban en un grupo de pacientes que padecen tumores en estadio tardío. Este grupo de pacientes está sustancialmente inmunosuprimido, lo cual significa que las células tumorales han escapado del sistema inmunitario durante mucho tiempo y han contribuido a inducir tolerancia inmunológica al tumor a lo largo de la carcinogénesis. Asimismo, la elección de antígenos (específicos de tumor vs. asociados con tumor) aplicados como vacunas es crítica para inducir respuestas inmunitarias específicas de tumor y evitar matar células sanas en los pacientes, lo cual puede conducir a reacciones adversas graves. Por lo tanto, los grandes retos en la inmunoterapia contra el cáncer son vencer la tolerancia inmunológica y activar las funciones efectoras específicas de tumor para reconocer y matar células tumorales. Si bien algunos informes de casos muestran respuesta clínica a las vacunas terapéuticas contra el cáncer en pacientes con tumores en estadio tardío, el criterio de valoración primario más común es observar el impacto en la supervivencia general en comparación con las terapias convencionales (cirugía, quimioterapia y radioterapia). No obstante, la mayor parte de los estudios son o bien no concluyentes, o directamente no consiguen demostrar esto. Una causa de los resultados negativos está en el grupo de pacientes que padecen tumores en estadio terminal que son difíciles de tratar en primer lugar. Una posible estrategia podría ser incluir pacientes con tumores en etapas tempranas en ensayos de vacunas terapéuticas.
Una estrategia es centrarse en lesiones pre-cancerígenas. Los retos para esta estrategia son principalmente la falta de biomarcadores fiables que sean específicamente expresados por lesiones pre-cancerígenas en muchos tejidos y el diagnóstico precoz deficiente (o bien no existente o utilizando procedimientos existentes que no tienen suficiente sensibilidad). De manera excepcional, este no es el caso de las neoplasias inducidas por VPH. Por ejemplo, la mayor parte de los países occidentales tienen buenos programas de detección precoz para displasia de cuello uterino y cáncer de cuello uterino mediante la realización de la prueba de Papanicolaou (citología vaginal). Si la citología vaginal arroja resultados poco claros o anormales, se llevará a cabo una colposcopía (Coalición Nacional Estadounidense del Cáncer de Cuello Uterino). También se puede recomendar la prueba del VPH a algunos pacientes para detectar la presencia de un tipo de VPH de «alto riesgo» en la lesión pre-cancerígena. Por lo tanto, el
VPH representa un biomarcador potencial de lesiones pre-cancerígenas asociadas con VPH, en particular, displasia intraepitelial del cuello uterino (CIN, por su sigla en inglés).
Las vacunas de ADN han demostrado ser cada vez más prometedoras en cuanto al tratamiento de enfermedades humanas, en particular, cáncer. Las vacunas de ADN inducen respuestas inmunes específicas de antígeno potentes y se pueden administrar repetidas veces para mantener las respuestas inmunitarias con finalidad específica. Dichas vacunas son consideradas seguras y fáciles y económicas de producir a gran escala en comparación con otros formatos terapéuticos contra el cáncer. Muchas intervenciones inmunoterapéuticas no consiguen inducir memoria innmunológica. De manera excepcional, la vacunación de ADN garantiza la liberación continua de la vacuna in vivo, lo cual potencia la memoria inmunológica específica de antígeno. La administración directa de antígenos a células presentadoras de antígeno (CPA) profesionales estimula las respuestas inmunes in vivo de tanto linfocitos T CD4+ como CD8+. Dichas respuestas inmunes celulares potentes han demostrado reconocer y matar específicamente células malignas antígeno-positivas de manera eficaz tanto in vitro como in vivo.
La publicación internacional WO 2004/076489 describe construcciones homodiméricas (vaccicuerpos) que comprenden una unidad de direccionamiento, una unidad de dimerización, y una unidad antigénica.
La publicación internacional WO 2005/089792 describe vacunas contra el cáncer que comprenden una proteína recombinante que lleva antígenos/epítopos de virus del papiloma, que son fragmentos E7.
Sigue existiendo la necesidad en la técnica de desarrollar vacunas mejoradas para inducir respuestas inmunes específicas y potentes contra el VPH, responsable de tanto enfermedades infecciosas como cánceres.
Objeto
Constituye un objeto de las realizaciones de la descripción proporcionar compuestos terapéuticos específicos y sumamente eficaces, tales como vacunas de ADN contra enfermedades y afecciones producidas por el v Ph .
Resumen
Los inventores de la presente invención han descubierto que combinando los antígenos de los productos génicos tempranos E6 y E7 del VPH, tal como de VPH16 y/o VPH18 con el módulo de direccionamiento de hMIP-1a, se proporcionan vacunas terapéuticas, donde los epítopos inmunogénicos potentes de productos génicos de VPH se presentan con gran eficacia a CPA para inducir una respuesta inmune específica y potente. Los productos según la presente descripción están concebidos principalmente como vacunas terapéuticas de ácido nucleico, tales como vacunas de ADN, donde una construcción de ácido nucleico que codifica la construcción de vaccicuerpo se utiliza como el compuesto terapéutico que da pie a la producción in vivo de la proteína en la persona que recibe la vacuna. No obstante, como alternativa la proteína en sí misma se puede formular y utilizar directamente en la vacuna.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente descripción se refiere a una proteína homodimérica de dos cadenas de aminoácidos idénticas, comprendiendo cada cadena de aminoácidos (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano (VPH), tal como una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de VPH16 y/o VPH18, tal como una unidad antigénica derivada de las proteínas tempranas E6 y/o E7 de VPH16 y/o VPH18.
En un segundo aspecto, la presente descripción se refiere a una cadena de aminoácidos que comprende (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano (VPH), tal como una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de VPH16 y/o VPH18, tal como una unidad antigénica derivada de las proteínas tempranas E6 y/o E7 de VPH16 y/o VPH18, y dicha cadena de aminoácidos es capaz de formar una proteína homodimérica según la descripción.
En un tercer aspecto, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico, tal como un ADN, que codifica una cadena de aminoácidos que comprende (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano (VPH), tal como una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de VPH16 y/o VPH18, tal como una unidad antigénica derivada de las proteínas tempranas E6 y/o E7 de VPH16 y/o VPH18, y dicha cadena de aminoácidos es capaz de formar una proteína homodimérica según la descripción.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a una proteína homodimérica según la descripción, o a una cadena de aminoácidos según la descripción, o a la molécula de ácido nucleico según la descripción para uso como medicamento.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una proteína homodimérica según la descripción, o a una cadena de aminoácidos según la descripción, o a la molécula de ácido nucleico según la descripción.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico según la descripción.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un procedimiento para preparar una proteína homodimérica según la descripción, o a una cadena de aminoácidos de la descripción, comprendiendo el procedimiento a) transfectar la molécula de ácido nucleico según la descripción en una población de células; b) cultivar la población de células; c) recoger y purificar la proteína homodimérica, o cadena de aminoácidos expresada a partir de la población de células.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un procedimiento para preparar una vacuna, tal como una vacuna de ADN, que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una molécula de ácido nucleico según la descripción, comprendiendo el procedimiento a) preparar una molécula de ácido nucleico según la descripción; b) disolver la molécula de ácido nucleico obtenida mediante la etapa a) en un vehículo, diluyente o tampón farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una vacuna contra el VPH que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una proteína homodimérica según la descripción, o a una cadena de aminoácidos según la descripción, o a una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, según la descripción, donde dicha vacuna es capaz de desencadenar una respuesta inmune tanto de linfocitos T como de linfocitos B.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección inducida por VPH, tal como un cáncer o enfermedad infecciosa producida por VPH en un paciente, comprendiendo el procedimiento administrar al paciente que lo necesite una proteína homodimérica según la descripción, o una cadena de aminoácidos según la descripción, o la molécula de ácido nucleico, tal como ADN, según la descripción.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Estructura general de las vacunas de vaccicuerpo con antígeno de fusión E7/E6. Se muestran formatos tanto de ADN como de proteína. El vaccicuerpo consiste en tres módulos funcionales; la quimiocina MIP-1a humana (LD78p) en el módulo de direccionamiento, secuencias bisagra y CH3 de IgG3 humana en el módulo de dimerización y fusión de E7 y/o E6 de longitud completa en el módulo de vacuna.
Figura 2: Modo de acción sugerido para una vacuna de ADN de vaccicuerpo contra neoplasias malignas inducidas por VPH. Un vaccicuerpo que codifica plásmido de ADN desnudo es inyectado por vía intradérmica con posterior electroporación. El plásmido es absorbido por células locales y se producen y secretan proteínas de vaccicuerpo. Los módulos de direccionamiento quimiotácticos atraen CCR1 y CCR5 que expresan células presentadoras de antígenos (CPA) y garantizan unión y captación en células dendríticas (CD). Las CD presentarán péptidos antigénicos a linfocitos T CD4+ y CD8+ y los linfocitos T CD8+ matarán las células infectadas y transformadas por el VPH en el cuello uterino.
Figura 3: Resultados de la prueba ELISpot que muestran el número de respuestas de linfocitos T específicas de E7 y E6 como una función de distintas cantidades de vacuna administradas. A ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía intradérmica (ID) plásmidos de ADN desnudo que codifican VB1009 y VB1016 y sus controles correspondientes con posterior electroporación (Cellectis, Francia) el día 0 y el día 7. Se recolectaron esplenocitos el día 21 y se
estimularon con péptido E7 o E6 restringido por CMH de clase I durante 24 horas. La cantidad de esplenocitos que secretaban IFNy se calculó mediante la prueba ELISpot. (A) respuestas específicas de E7 después de vacunación ID con 25 |jg de VB1009, control 1 (solo antígeno) y pUMVC4a (vector vacío). (B) respuestas específicas de E7 después de vacunación ID con 12,5 y 1,4 jg de VB1016, control 2 (solo antígeno) y pUMVC4a (vector vacío). (C) respuestas específicas de E6 después de vacunación ID con 12,5 y 1,4 jg de VBl0l6, control 2 (solo antígeno) y pUMVC4a (vector vacío).
Figura 4. Efecto terapéutico de VB1016 mostrado por volumen de tumor medido. A ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía SC 5x105 linfocitos TC-1 el día 0. El día 3 y el día 10, a los ratones se les inyectaron por vía ID 12,5 jg de plásmidos de ADN desnudo que codifican VB1016, control 2 o vector vacío con posterior electroporación (Cellectis, Francia). Se midió el tamaño de los tumores con calibradores de dos a tres veces por semana y se calculó el volumen de los tumores.
Figura 5. Efecto terapéutico de VB1016 mostrado por volumen de tumor medido. A ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía SC en la zona del cuello 5x104 linfocitos TC-1 el día 0. El día 3, 7 y el día 10, a los ratones se les inyectaron por vía ID 20 jg o 2 jg de plásmidos de ADN desnudo que codifican VB1016, control 2 o vector vacío con posterior electroporación (Cellectis, Francia). Se midió el tamaño de los tumores con calibradores de dos a tres veces por semana y se calculó el volumen de los tumores.
Figura 6. Efecto terapéutico de VB1020 y VB1021 mostrado por volumen de tumor medido. A ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía SC en la zona del muslo 5x104 linfocitos TC-1 el día 0. El día 3 y el día 10, a los ratones se les inyectaron por vía ID 10 jg de plásmidos de ADN desnudo que codifican VB1016, VB1020, VB1021 o vector vacío con posterior electroporación (Cellectis, Francia). Se midió el tamaño de los tumores con calibradores de dos a tres veces por semana y se calculó el volumen de los tumores.
Descripción detallada
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
Las construcciones y la tecnología de vacuna de ADN descritas en el presente documento por los inventores de la presente descripción (también referidas como moléculas/vacunas/construcciones de «vaccicuerpo») representan una estrategia de vacuna novedosa para inducir respuestas inmunes potentes y específicas para tanto enfermedades infecciosas como cáncer. Las E6/E7 del VPH, tal como la vacuna de E6/E7 de VPH16 o VPH18 descrita en el presente documento, se pueden administrar como una vacuna de ADN por inyección intradérmica, preferentemente seguida de electroporación. Esto produce la captación de la construcción-ADN que codifica el vaccicuerpo-vacuna de E6/E7 de VPH16 y/o VPH18 en células en el sitio de la inyección (dermis) incluyendo células dendríticas (células de Langerhans), lo cual da pie a la producción in vivo de la molécula de vaccicuerpo-E6/E7. Los productos génicos tempranos E6 y E7 de tipos de VPH de «alto riesgo» tales como VPH16 y 18 pueden ser responsables de la transformación de las células basales-epiteliales y de la inducción de lesiones pre-cancerígenas. Ambas proteínas están compuestas por epítopos sumamente inmunogénicos y muestran en el presente documento que inducen respuestas inmunes potentes que dan pie a la erradicación específica de células tumorales de VPH de alto riesgo positivas tanto in vitro como in vivo.
La molécula de vaccicuerpo descrita en el presente documento es un homodímero compuesto por tres módulos; módulo de direccionamiento, módulo de dimerización y el módulo de la vacuna (Figura 1). Los genes que codifican los tres módulos están modificados genéticamente para expresarse como un gen. Cuando se expresa in vivo, la molécula de vaccicuerpo se dirige hacia células presentadoras de antígeno (CPA), lo cual da como resultado una potencia de vacuna mejorada en comparación con antígenos idénticos no direccionados. La expresión in vivo de la quimiocina proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa humana (hMIP-1a/ LD78p) da pie a la atracción de CD, neutrófilos y otras células inmunes que llevan los receptores CCR1 y CCR5 al sitio de expresión. Por lo tanto, la molécula de vaccicuerpo compuesta por hMIP-1a como el módulo de direccionamiento no solamente dirigirá los antígenos a células específicas sino que también producirá un efecto de amplificación de respuesta (efecto adyuvante) reclutando células inmunes específicas al sitio de inyección. Este mecanismo único puede ser de gran importancia en un entorno clínico donde los pacientes pueden recibir la vacuna sin ningún adyuvante adicional puesto que la vacuna en sí misma proporciona el efecto adyuvante.
Los inventores de la presente descripción describen en el presente documento construcciones de vacuna donde el módulo antigénico está compuesto por la secuencia genética de longitud completa de E7 fusionada con la secuencia
de longitud completa de E6 que se originan en el subtipo VPH16 o VPH18. La ventaja de este formato es que tanto E6 como E7 estarán presentes en una construcción y, por lo tanto, se pueden expresar igualmente in vivo. En consecuencia, una molécula de vaccicuerpo compuesta por una unidad multi-antigénica puede representar niveles iguales de E6 y E7 para el sistema inmunitario. Los productos génicos E6 y E7 de VPH16 son oncogénicos en su forma natural. Para neutralizar sus propiedades oncogénicas, se pueden introducir mutaciones en sitios específicos en la secuencia genética de E6 y e7.
Las mutaciones, incluidas las eliminaciones, se pueden introducir en sitios específicos, conocidos por inhibir las propiedades oncogénicas de E6 y E7, tales como cualquiera de los descritos en cualquiera de las fuentes Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991;Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdfj;Nguyen, M et al., J Virol, 2002; Nominé Y et al., Molecular Cell, 2006;Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, Polakova I et al., Vaccine, 2010;Xie Q, Virologica Sinica, 2011; Mespléde T et al., J Virol, 2012; US 2008/0102084 y US6306397. En consecuencia, en algunos aspectos de la descripción, las construcciones según la presente descripción contienen construcciones quiméricas de E6, E7 de VPH16 o E6/E7 de VPH16 con una o más mutaciones en o bien E6, E7 de VPH16 o ambas en una posición conocida por inhibir las propiedades oncogénicas según se describe en las fuentes Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991; Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf); Nguyen, M et al., J Virol, 2002; Nominé Y et al., Molecular Cell, 2006;Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, Polakova I et al., Vaccine, 2010;Xie Q, Virologica Sinica, 2011; Mespléde T et al., J Virol, 2012; US 2008/0102084 o US6306397. En otros aspectos de la descripción, las construcciones según la presente descripción contienen construcciones quiméricas de E6, E7 de VPH18 o E6/E7 de VPH18 con una o más mutaciones en o bien E6, E7 de VPH18 o ambas en una posición conocida por inhibir las propiedades oncogénicas según se describe en las fuentes Dalal S et al., J Virol, 1996; Münger K et al., EMBO, 1989; Nakagawa S et al., Virology, 1995; Crook T et al., Cell, 1991; Münger K et al., HPV Compendium Online, 1997 (http://www.stdgen.lanl.gov/COMPENDIUM_PDF/97PDF/3/E7.pdf); Moody C et al., Nat Rev Cancer, 2010, US 2008/0102084 y US6306397.
Existe la posibilidad de que la fracción-vaccicuerpo (módulos de direccionamiento y dimerización) pueda erradicar las propiedades oncogénicas de las proteínas de tipo salvaje E6 y E7 en la proteína de fusión final. Por lo tanto, incluso en otro aspecto de la descripción es la utilización de las secuencias de E6 y/o E7 de longitud completa de tipo salvaje en la construcción de vaccicuerpo.
La descripción describe distintas variantes de vacunas terapéuticas de ADN contra VPH-vaccicuerpo, todas basadas en el formato general descrito en la Figura 1, las vacunas terapéuticas de ADN contra VPH-vaccicuerpo codifican genes que están expresados naturalmente en los seres humanos; los genes del módulo de direccionamiento codifican la quimiocina hMIP-1a, que se une a sus receptores cognados, CCR1 y CCR5 expresados en la superficie celular de las CPA. Los genes del módulo de dimerización pueden codificar regiones bisagra y cadena pesada 3 constante, tal como a partir de IgG3, humana la cual conecta dos monómeros de vaccicuerpo generando una molécula homodimérica. Los genes que codifican el módulo de vacuna para la presente estrategia consisten en VPH, tal como antígenos E6 y E7 de VPH16 y/o VPH18, tales como antígenos E7 y E6 de VPH16 de longitud completa, que opcionalmente comprenden una o más mutaciones para inhibir las propiedades oncogénicas. Una vez administradas in vivo por inyección ID con posterior electroporación, las células dérmicas que absorben la construcción de vacuna expresarán la molécula de vaccicuerpo-VPH. Las vacunas de vaccicuerpo producidas in vivo se dirigen a CCR1 y CCR5 expresados en la superficie de CPA en la piel, en particular CD. La unión de la molécula de vaccicuerpo con sus receptores cognados da pie a la internalización del complejo en la CPA, a la degradación de las proteínas en péptidos pequeños que se cargan en moléculas del CMH y se presentan a linfocitos T CD4+ y CD8+ para inducir respuestas inmunes específicas de E6 y E7 de VPH16. Una vez estimulados y con la ayuda de linfocitos T CD4+ activados, los linfocitos T CD8+ se dirigirán a y matarán las células que expresan E6 y E7 de VPH16 (Figura 2). Dichas respuestas inmunes potenciadas a una vacuna con un efecto adyuvante «incorporado» pueden superar potencialmente el escape tumoral (inmunovigilancia tumoral) venciendo la tolerancia inmunológica y matando las células malignas de forma eficaz. La unidad de direccionamiento de hMIP-1a puede estar conectada a través de un motivo de dimerización, tal como una región bisagra, con una unidad antigénica, donde la última se encuentra o bien en el extremo COOH terminal o en el extremo NH2 terminal. La presente descripción no solo se refiere a codificación de secuencias de ADN para esta proteína recombinante, sino también a vectores de expresión que comprenden estas secuencias de ADN, a líneas celulares que comprenden dichos vectores de expresión, a tratamiento de mamíferos preferentemente mediante inmunización a través de ADN de vaccicuerpo, ARN de vaccicuerpo o proteína de vaccicuerpo y finalmente a productos farmacéuticos y a un kit que comprende dichas moléculas.
El motivo de dimerización en las proteínas según la presente descripción se puede construir para que incluya una
región bisagra y un dominio de inmunoglobulina (p. ej., dominio Cy3), p. ej., dominio C carboxiterminal (dominio Ch3), o una secuencia que sea sustancialmente idéntica a dicho dominio C. La región bisagra puede ser derivada de Ig y contribuye con la dimerización a través de la formación de uno o más enlaces covalentes intercadena, p. ej., uno o más puentes disulfuro. Asimismo, funciona como un espaciador flexible entre los dominios que permite que las dos unidades de direccionamiento se unan simultáneamente a dos moléculas diana en CPA expresadas con distancias variables. Los dominios de inmunoglobulina contribuyen con la homodimerización a través de interacciones no covalentes, p. ej., interacciones hidrófobas. En una realización preferida, el dominio Ch3 deriva de IgG. Estos motivos de dimerización se pueden intercambiar con otras fracciones de multimerización (p. ej., de otros isotipos/subclases de Ig). Preferentemente el motivo de dimerización deriva de proteínas humanas nativas tales como IgG humana.
Se ha de entender que el motivo de dimerización puede tener cualquier orientación respecto de la unidad antigénica y la unidad de direccionamiento. En una realización, la unidad antigénica se encuentra en el extremo COOH terminal del motivo de dimerización con la unidad de direccionamiento en el extremo N terminal del motivo de dimerización. En otra realización la unidad antigénica se encuentra en el extremo N terminal del motivo de dimerización con la unidad de direccionamiento en el extremo COOH terminal del motivo de dimerización.
La solicitud internacional WO 2004/076489 describe secuencias de ácido nucleico y vectores, que se pueden utilizar según la presente descripción.
Las proteínas según la presente descripción incluyen una unidad antigénica derivada de VPH, tal como antígenos E7 y E6 de VPH16, tal como los antígenos E7 y E6 de VPH16 de longitud completa, así como fragmentos inmunogénicos o variantes de los mismos. La secuencia antigénica debería ser de longitud suficiente. La longitud mínima de dicha unidad antigénica debería ser de alrededor de 9 aminoácidos. En consecuencia, en algunas realizaciones, la unidad antigénica derivada de VPH comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 9 aminoácidos correspondiente a al menos 27 nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos que codifican dicha unidad antigénica. Preferentemente, la unidad antigénica derivada de VPH es considerablemente más larga, tal como los antígenos E7 y E6 de VPH16 de longitud completa. La diversidad surge dentro de determinado genotipo de VPH mediante cambios de nucleótidos limitados en las regiones de codificación (a una frecuencia de <2 %) y no codificación (a una frecuencia de <5 %) (Bernard, HU et al., Int J Cancer, 2006). Dichas variantes se segregan filogenéticamente según su origen geográfico y, por ende, se etiquetan como europeas, africanas, asiáticas, asiático-estadounidenses y norteamericanas. La inserción de dichas secuencias en un formato de vaccicuerpo podría dar pie a la activación de ambos brazos de la respuesta inmune.
La inmunización mediante proteína de vaccicuerpo, ADN de vaccicuerpo o ARN de vaccicuerpo, los dos últimos practicados, p. ej., por inyección intramuscular o intradérmica con o sin electroporación posterior, son todos procedimientos viables según la presente descripción.
Como se describió anteriormente, la presente descripción se refiere a una composición de vacuna contra cáncer o enfermedades infecciosas producidas por VPH, comprendiendo la composición de vacuna una cantidad inmunológicamente efectiva del ácido nucleico que codifica la molécula de la descripción o variantes degeneradas correspondientes. La vacuna puede ser capaz de desencadenar una respuesta inmune tanto de linfocitos T como de linfocitos B. La presente descripción también se refiere a un kit que comprende ARN, ADN de vaccicuerpo, o proteína para fines de diagnóstico, médicos o científicos.
La descripción, además, se refiere a un procedimiento para preparar la molécula recombinante de la descripción que comprende transfectar el vector que comprende la molécula de la descripción en una población de células; cultivar la población de células; recoger proteína recombinante expresada a partir de la población de células; y purificar la proteína expresada.
Las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente se pueden insertar en un vector adecuado para terapia génica, p. ej., controladas por un promotor específico, e introducir en las células. En algunas realizaciones el vector que comprende dicha secuencia de ADN es un virus, p. ej., adenovirus, virus vacuna o un virus adeno-asociado. En algunas realizaciones, se utiliza un retrovirus como vector. Entre los ejemplos de retrovirus adecuados se incluyen, p. ej., MoMuLV o HaMuSV. A los efectos de la terapia génica, las secuencias de ADN/ARN según la descripción también se pueden transportar a las células diana en forma de dispersiones coloidales. Estas comprenden, p. ej., liposomas o lipolejos.
La presente descripción engloba el uso de una unidad de direccionamiento así como una unidad antigénica que tiene un grado mínimo de identidad de secuencia u homología de secuencia con una o más secuencias de
aminoácidos definidas en el presente documento o con un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en el presente documento. La presente descripción engloba, en particular, el uso de variantes peptídicas o unidades peptídicas que se han de utilizar en las construcciones según la presente descripción con un grado de identidad de secuencia respecto de cualquiera de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34. En el presente documento, el término «variante» significa una entidad que tiene cierto grado de identidad de secuencia respecto de secuencias de aminoácidos objeto o secuencias de nucleótidos objeto, donde la secuencia de aminoácidos objeto es preferentemente SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, o SEQ ID NO:34.
En un aspecto de la descripción, la secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleótidos variante o de fragmento debería proporcionar y/o codificar un polipéptido que retiene la actividad funcional y/o potencia la actividad de un polipéptido de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34.
En el presente contexto, se entiende que una secuencia variante incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica respecto de la secuencia objeto. Normalmente, las variantes utilizadas según la presente descripción comprenderán los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología puede considerarse también en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente descripción se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Las comparaciones de identidad de secuencias se pueden llevar a cabo mediante examen visual o, más comúnmente, con ayuda de programas informáticos de comparación de secuencias de fácil acceso. Estos programas informáticos disponibles en el mercado utilizan algoritmos de comparación complejos para alinear dos o más secuencias que mejor reflejan los acontecimientos evolutivos que podrían haber dado pie a la diferencia o diferencias entre las dos o más secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos funcionan con un sistema de puntuación que recompensa la alineación de aminoácidos idénticos o similares y penaliza la inserción de espacios, extensiones de espacios y alineación de aminoácidos no similares. El sistema de puntuación de los algoritmos de comparación incluye:
i) asignación de una puntuación de penalización cada vez que se inserta un espacio (puntuación de penalización por espacios),
ii) asignación de una puntuación de penalización cada vez que un espacio se extiende con una posición extra (puntuación de penalización por extensiones),
iii) asignación de puntuaciones elevadas tras la alineación de aminoácidos idénticos, y
iv) asignación de puntuaciones variables tras la alineación de aminoácidos no idénticos.
La mayor parte de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por espacios. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores predeterminados cuando se utiliza dicho software para las comparaciones de secuencias. Las puntuaciones otorgadas por alineación de aminoácidos no idénticos se asignan según una matriz de puntuación también denominada matriz de substitución. Las puntuaciones proporcionadas en dichas matrices de sustitución reflejan el hecho de que la probabilidad de que un aminoácido sea sustituido por otro durante la evolución varía y depende de la naturaleza física/química del aminoácido que va a ser sustituido. Por ejemplo, la probabilidad de que un aminoácido polar sea sustituido por otro aminoácido polar es más alta en comparación con ser sustituido por un aminoácido hidrófobo. Por lo tanto, la matriz de puntuación asignará la puntuación más elevada a aminoácidos idénticos, una puntuación inferior a aminoácidos no idénticos pero similares e incluso una puntuación inferior a aminoácidos no idénticos y no similares. Las matrices de puntuación más comúnmente utilizadas son las matrices PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), las matrices BLOSUM (Henikoff y Henikoff (1992)) y la matriz Gonnet (Gonnet et al. (1992)).
Los programas informáticos adecuados para llevar a cabo dicha alineación incluyen, sin carácter restrictivo, Vector NTI (Invitrogen Corp.) y los programas ClustalV, ClustalW y ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). En el servidor de ExPASy Proteomics en www.expasy.org hay una selección de distintas herramientas de alineación disponibles. Otro ejemplo de software que puede llevar a cabo alineación de secuencias es BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica), disponible en la página web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica de Estados Unidos, que se puede encontrar actualmente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y que fue descrito por primera vez en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
215; 403-410.
Una vez que el software ha producido una alineación, es posible calcular el porcentaje de similitud y el porcentaje de identidad de secuencia. El software normalmente lleva esto a cabo como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En una realización, se prefiere utilizar el software ClustaIW para llevar a cabo alineaciones de secuencias. Preferentemente, la alineación con ClustaIW se lleva a cabo con los siguientes parámetros para alineación en pares:
ClustaIW2 ha sido puesto a disposición en Internet por el Instituto Europeo de Bioinformática en la página web EMBL-EBI www.ebi.ac.uk en Herramientas - Análisis de secuencias - ClustaIW2. En la actualidad, la dirección exacta de la herramienta ClustalW2 es www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.
En otra realización, se prefiere utilizar el programa Align X en Vector NTI (Invitrogen) para llevar a cabo alineaciones de secuencias. En una realización, Exp 10 se puede utilizar con los siguientes parámetros predeterminados:
Penalización por abertura de espacio: 10
Penalización por extensión de espacio: 0,05
Intervalo de penalización por separación de espacio: 8
Matriz de penalización: blosum62mt2
Por ende, la presente descripción también engloba el uso de variantes, fragmentos y derivados de cualquier secuencia de aminoácidos de una proteína, polipéptido, motivo o dominio como se define en el presente documento, en particular aquellos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34.
Las secuencias, en particular aquellas de variantes, fragmentos, y derivados de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34, también pueden tener eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden llevar a cabo sustituciones de aminoácidos intencionadas según la similitud en cuanto a polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre y cuando se retenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga con valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
La presente descripción también engloba sustitución conservadora (sustitución y reemplazo también se utilizan en el presente documento para referirse al intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo) que se puede producir, es decir, sustitución de igual por igual tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También se puede producir sustitución no conservadora, es decir, de una clase de residuo a otra o que implique de manera alternativa la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (de aquí en adelante denominada Z), ornitina de ácido diaminobutírico (de aquí en adelante denominada B), ornitina de norleucina (de aquí en adelante denominada O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Las sustituciones conservadoras que se pueden llevar a cabo se encuentran, por ejemplo, en los grupos de aminoácidos básicos (Arginina, Lisina e Histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos alifáticos (Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina), aminoácidos polares (Glutamina, Asparagina, Serina, Treonina), aminoácidos aromáticos (Fenilalanina, Triptófano y Tirosina), aminoácidos hidroxilados (Serina, Treonina), aminoácidos grandes (Fenilalanina y Triptófano) y aminoácidos pequeños (Glicina, Alanina).
Los reemplazos que también se pueden llevar a cabo por aminoácidos no naturales incluyen; aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, N-alquil aminoácidos*, ácido láctico*, derivados de haluros de aminoácidos naturales tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil-glicina*, p-alanina*, ácido L-aaminobutírico*, ácido L-Y-aminobutírico*, ácido L-a-aminoisobutírico*, ácido L-£-aminocaproico#, ácido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, metil derivados de fenilalanina (Phe) tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metil)*, L-Phe (4-isopropil)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4 bencil)*. La notación * se ha utilizado a los efectos de la descripción anterior (en relación con sustitución homóloga o no conservadora) para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características anfipáticas.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos de espaciadores adecuados que se pueden insertar entre cualesquiera dos residuos de aminoácidos de la secuencia incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o p-alanina. Una forma adicional de variación, que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide, será bien comprendida por los expertos en la materia. Para despejar cualquier duda, «la forma peptoide» se utiliza para referirse a residuos de aminoácidos variantes donde el grupo sustituyente a-carbono está en el átomo de nitrógeno del residuo en vez de en el a-carbono. Los procesos para preparar péptidos en forma peptoide son conocidos en la materia, por ejemplo Simon RJ et al. (1992), Horwell DC. (1995).
En una realización, la unidad de direccionamiento variante utilizada en la proteína homodimérica según la presente descripción es variante teniendo la secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de ella.
En un aspecto de la descripción, preferentemente la proteína o secuencia utilizada en la presente descripción está en una forma purificada. El término «purificada» significa que determinado componente está presente a un nivel elevado. Idealmente, el componente es el componente activo predominante presente en una composición.
Una «variante» o «variantes» se refiere a proteínas, polipéptidos, unidades, motivos, dominios o ácidos nucleicos. El término «variante» se puede utilizar de manera intercambiable con el término «mutante». Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, tranversiones, truncamientos y/o inversiones en una o más ubicaciones en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente. Los términos «polipéptido variante», «polipéptido», «variante» y «enzima variante» significan un polipéptido/proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que se ha modificado respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Los polipéptidos variantes incluyen un polipéptido que tiene cierto porcentaje, p. ej., 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %, de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34.
Los «ácidos nucleicos variantes» pueden incluir secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento. Por ejemplo, una secuencia variante es complementaria con secuencias capaces de hibridar en condiciones astringentes, p. ej., 50°C y 0,2X SSC (1X SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0), a las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento. Más en particular, el término «variante» engloba secuencias que son complementarias con las secuencias que son capaces de hibridar en condiciones sumamente astringentes, p. ej., 65°C y 0,1X SSC, a secuencias de nucleótidos presentadas en este documento. El punto de fusión (Tm) de un ácido nucleico variante puede ser alrededor de 1, 2 o 3°C inferior que el Tm del ácido nucleico de tipo salvaje. Los ácidos nucleicos variantes incluyen un polinucleótido que tiene cierto porcentaje, p. ej., 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %, de identidad de secuencia respecto del ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID
NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34 que codifica la proteína monomérica que puede formar la proteína homodimérica según la descripción.
Una categoría específica de las mutaciones son las mutaciones en E6 y E7:
Se puede eliminar la toxicidad de la proteína E6 impidiendo la unión a p53. Hay cinco posiciones en la E6 de VPH16 de longitud completa que son sitios para mutaciones destinadas a inactivar la funcionalidad de E6, F47, L50, C63, C106 y I128. Cualquier sustitución de aminoácidos en estas posiciones puede dar pie a la inactivación de E6 e induce la supresión tumoral. Potencialmente se pueden utilizar sustituciones en cualquiera de estas posiciones por cualquier aminoácido diferente. Los sitios para mutaciones potenciales se muestran en la SEQ ID NO:22.
En la proteína E7 hay regiones conservadas asociadas con propiedades oncogénicas (véase Phelps et al J. Virol. Abril 1992, vol. 66, N°. 42418-242; Gulliver et al J Virol. Agosto l997; 71(8)) que incluyen un motivo de sitio de unión a extremo N Rb (proteína de unión del retinoblastoma) (LXCXE) y dos regiones conservadas 3 (cadena arriba y cadena abajo) con un motivo de unión a Zn (CXXC). Los sitios de mutación preferidos en el motivo LXCXE son C24 y E26. Los sitios preferidos en los dos motivos CXXC son C58, C61, C91 y C94. Sin embargo, se puede prever que cualquier mutación en estas regiones sea sustituida por la reducción en las funciones de unión y así eliminar los efectos oncogénicos de E7. Los sitios para mutaciones potenciales se muestran en la SEQ ID NO:23.
Péptido señal:
Un péptido señal en el extremo N terminal del polipéptido naciente dirige la molécula hacia el RE antes de transportarla al complejo de Golgi. El péptido señal es escindido por la peptidasa señal una vez que ha cumplido su función de dirigir e importar la proteína en el RE. Estos péptidos señal, por lo general, tienen entre 15 y 30 aminoácidos, pero pueden tener más de 50 residuos (Martoglio, B. et al., Trends in Cell Biology, 1998, Knappskog, S. et al., J Biotechnol, 2007,). El péptido señal nativo se puede reemplazar por péptidos señal de cualquier origen mamífero, procariota o marino. Los péptidos señal comúnmente utilizados son, p. ej., IL-2 humana y albúmina humana debido a su capacidad natural para secretar grandes cantidades de proteína. La elección de péptido señal puede tener un impacto considerable en la cantidad de proteína sintetizada y secretada.
En algunas realizaciones, el péptido señal utilizado en la construcción de proteína según la presente descripción deriva de una proteína de quimiocina, tal como la secuencia señal de LD78beta.
En algunas realizaciones de la presente descripción el péptido señal no deriva de pLNOH2 (líder de inmunoglobulina variable B1-8) descrito en la solicitud internacional con N.° de solicitud internacional: PCT/EP2011/060628.
En algunas realizaciones de la presente descripción el péptido señal no deriva de un gen de inmunoglobulina.
El término «proteína homodimérica», como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende dos cadenas individuales idénticas de aminoácidos, o subunidades que se mantienen unidas como una única proteína dimérica mediante enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas (con carga), enlaces de disulfuro covalentes reales o alguna combinación de estas interacciones.
El término «motivo de dimerización», como se utiliza en el presente documento, se refiere a la secuencia de aminoácidos entre la unidad antigénica y la unidad de direccionamiento que comprende la región bisagra y el segundo dominio opcional que puede contribuir con la dimerización. Este segundo dominio puede ser un dominio de inmunoglobulina y opcionalmente la región bisagra y el segundo dominio están conectados mediante un enlazador. En consecuencia, el motivo de dimerización sirve para conectar la unidad antigénica y la unidad de direccionamiento, pero también para contener la región bisagra que facilita la dimerización de las dos proteínas monoméricas en una proteína homodimérica según la descripción.
El término «unidad de direccionamiento» como se utiliza en el presente documento se refiere a una unidad que entrega la proteína con su antígeno a CPA de ratón o humanas para presentación restringida por CMH de clase II a linfocitos T CD4+ o para proporcionar presentación cruzada a linfocitos T CD8+ mediante restricción por CMH de clase I. La unidad de direccionamiento utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de o es idéntica a LD78-beta madura.
El término «unidad antigénica» como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier molécula, tal como un péptido que es capaz de ser reconocido específicamente por un anticuerpo u otro componente del sistema inmunitario, tal como un receptor superficial en linfocitos T. También se incluyen en esta definición inmunógenos que son capaces de inducir una respuesta inmune. Los términos «epítopo» o «epítopo antigénico» se utilizan para
referirse a una superficie molecular distinta, tal como una superficie molecular proporcionada por una secuencia de péptidos corta dentro de una unidad antigénica. En algunas realizaciones de la presente descripción la unidad antigénica comprende dos o más epítopos antigénicos. La unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de o es idéntica a los productos génicos tempranos E6 y E7 de VPH, tales como VPH16 o VPH18.
El término «región bisagra» se refiere a una secuencia de péptidos de la proteína homodimérica que facilita la dimerización, tal como a través de la formación de uno o más enlaces covalentes intercadena, p. ej., uno o más puentes disulfuro. La región bisagra puede derivar de Ig, tal como los exones bisagra h1+h4 de una Ig, tal como IgG3.
Realizaciones específicas de la descripción:
Como se describió anteriormente, la presente descripción se refiere a una proteína homodimérica de dos cadenas de aminoácidos idénticas, comprendiendo cada cadena de aminoácidos (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano (VPH), tal como una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos del VPH16 y/o VPH18, tal como una unidad antigénica derivada de las proteínas tempranas E6 y/o E7 de VPH16 y/o VPH18. En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad de direccionamiento, motivo de dimerización y unidad antigénica en la cadena de aminoácidos se encuentran en el orden N terminal a C terminal de la unidad de direccionamiento, motivo de dimerización y unidad antigénica.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva del VPH16, tal como de las proteínas tempranas E6 y/o E7.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de la E6 del VPH16.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de la E7 del VPH16.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva del VPH18, tal como de las proteínas tempranas E6 y/o E7.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de la E6 del VPH18.
En algunas realizaciones, la unidad antigénica utilizada en las construcciones según la presente descripción deriva de la E7 del VPH18.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el péptido señal consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones según la presente descripción, el péptido señal consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 %, tal como 100 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad de direccionamiento consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el motivo de dimerización comprende una región bisagra y
opcionalmente otro dominio que facilita la dimerización, tal como un dominio de inmunoglobulina, opcionalmente conectado mediante un enlazador.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la región bisagra deriva de Ig, tal como de IgG3.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la región bisagra tiene la capacidad para formar uno, dos o varios enlaces covalentes. En algunas realizaciones según la presente descripción, el enlace covalente es un puente disulfuro.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el dominio de inmunoglobulina del motivo de dimerización es un dominio C carboxiterminal, o una secuencia que es sustancialmente idéntica al dominio C o una variante correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el dominio C carboxiterminal deriva de IgG.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el dominio de inmunoglobulina del motivo de dimerización tiene capacidad para homodimerizar.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el dominio de inmunoglobulina tiene capacidad para homodimerizar mediante interacciones no covalentes. En algunas realizaciones según la presente descripción, las interacciones no covalentes son interacciones hidrófobas.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el dominio de dimerización no comprende el dominio CH2. En algunas realizaciones según la presente descripción, el motivo de dimerización consiste en los exones bisagra h1 y h4 conectados mediante un enlazador a un dominio Ch3 de IgG3 humana.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el motivo de dimerización consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 94-237 de SEQ ID NO:3.
En algunas realizaciones según la presente descripción, el enlazador es un enlazador G3S2G3SG.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica y el motivo de dimerización se conectan mediante un enlazador, tal como un enlazador GLGGL o un enlazador GLSGL.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad de direccionamiento consiste en los aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, o una variante correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la proteína homodimérica tiene mayor afinidad por cualquier receptor de quimiocina seleccionado de entre CCR1, CCR3 y CCR5 en comparación con la afinidad de la misma proteína homodimérica estando la unidad de direccionamiento compuesta por los aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, o una variante correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-293 de SEQ ID NO:3.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-293 de SEQ ID NO:3.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada de entre el listado compuesto por F47, L50, C63, C106 e I128 de SEQ ID NO:22, o una eliminación que implica uno o más aminoácidos seleccionados de entre el listado compuesto por Y43-L50 de SEQ ID NO:22.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos respecto de la SEQ ID NO:22.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende la secuencia de aminoácidos 243-293 de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:9, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en la secuencia de aminoácidos 243-293 de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:9, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-340 de SEQ ID NO:11.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-340 de SEQ ID NO:11.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada de entre el listado compuesto por c24, E26, C58, C61, C91 y C94 de SEQ ID NO:23, o una eliminación que implica uno o más aminoácidos seleccionados de entre el listado compuesto por L22-E26 y/o C58-C61 y/o C91-S95 de SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos respecto de la SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende la secuencia de aminoácidos 243-340 de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, o SEQ ID NO:17, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en la secuencia de aminoácidos 243-340 de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, o SEQ ID NO:17, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %,
tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano 16 (VPH16) deriva de ambas proteínas tempranas E6 y E7.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos de virus del papiloma humano 18 (VPH18) deriva de ambas proteínas tempranas E6 y E7.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada de entre el listado compuesto por F47, L50G, C63, C106, I128T de SEQ ID NO:22 y C24, E26, C58, C61, C91, C94 de SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 sustituciones y/o eliminaciones de aminoácidos respecto de la SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en la secuencia de aminoácidos 243-501 de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, o SEQ ID NO:34, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la cadena de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el listado compuesto por SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:32, y SEQ ID NO:34, o una variante o fragmento antigénico correspondiente.
En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25. En algunas realizaciones según la presente descripción, la unidad antigénica consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de cualquier secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25. En algunas realizaciones, la proteína homodimérica según la presente descripción está en su forma madura sin ninguna secuencia de péptidos señal.
En algunas realizaciones la molécula de ácido nucleico según la presente descripción está optimizada con codones humanos.
Se ha de entender que una molécula de ácido nucleico optimizada con codones humanos según la presente descripción comprende una o más sustituciones de ácido nucleico en comparación con la secuencia de tipo salvaje, y dicha sustitución proporciona un codón con mayor frecuencia de uso en regiones de codificación humana. La frecuencia de uso de codones en homo sapiens se puede consultar en http://biowiki.edu-wiki.org/en/codon_table En algunas realizaciones la molécula de ácido nucleico según la presente descripción comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre el listado compuesto por SEQ ID NO:2, SEQ ID nO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:31, y SEQ ID NO:33, o una variante correspondiente.
En algunas realizaciones la molécula de ácido nucleico según la presente descripción está comprendida en un
vector.
En algunas realizaciones la molécula de ácido nucleico según la presente descripción se formula para administrar a un paciente con el propósito de inducir producción de la proteína homodimérica en dicho paciente.
En algunas realizaciones la vacuna según la presente descripción también comprende un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o afección inducida por VPH, tal como cáncer o una enfermedad infecciosa producida por VPH en un paciente según la presente descripción comprende administrar al paciente que lo necesite una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, según la presente descripción con una etapa posterior de electroporación. En algunas realizaciones de la presente descripción la administración se lleva a cabo por vía intradérmica o intramuscular.
Los ejemplos que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.
Ejemplo 1
Construcción y expresión de las vacunas.
Se diseñaron secuencias de genes según la siguiente estructura: 1: secuencia líder nativa para LD78 b humana, 2: secuencia de LD78b de longitud completa. 3: Región bisagra humana 1 de IgG3. 4: Región bisagra humana 4 de IgG3. 5: Enlazador glicina-serina. 6: Dominio CH3 humano de IgG3. 7: Enlazador glicina-leucina. 8: oncogenes de virus del papiloma humano de tipo salvaje y mutantes E6, E7 y proteínas de fusión de tanto E6 como E7 divididas por un enlazador glicina-serina. Las construcciones se designan según su composición de E6 y E7 según se indica a continuación:
VB1001: Vaccicuerpo-E6 de tipo salvaje;
VB1005: Vaccicuerpo-E7 de tipo salvaje;
Los mutantes se designan según la posición de aminoácido en la secuencia de E6 o E7 nativa correspondiente. VB1002: Vaccicuerpo-E6 C63R;
VB1003: Vaccicuerpo-E6 C106R;
VB1004: Vaccicuerpo-E6 F47R, C63R, C106R;
VB1006: Vaccicuerpo-E7 C24G, E26G;
VB1007: Vaccicuerpo-E7 C24G, E26G, C58G, C61G;
VB1008: Vaccicuerpo-E7 C24G, E26G, C91G, C94G;
VB1009: Vaccicuerpo- E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R;
VB1016: Vaccicuerpo- E7 C24G, E26G/ E6 C63R, C106R;
VB1020: Vaccicuerpo- E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R optimizada con codones humanos
VB1021: Vaccicuerpo- E7 C24G, E26G/ E6 F47R, L50G, C106R, I128T optimizada con codones humanos
Se incluyeron vacunas de control compuestas por únicamente los antígenos:
Control 1: E7 C24G, E26G/ E6 F47R, C63R, C106R;
Control 2: E7 C24G, E26G/ E6 C63R, C106R
Todas las secuencias de genes se pidieron a Aldevron (Fargo ND, EE.UU.) o Eurofins MWG GmbH y se clonaron en el vector de expresión pUMVC4a.
Todas las construcciones se transfectaron en células 293E y la expresión verificada de proteínas de vaccicuerpo intactas se llevó a cabo mediante la técnica dot blot y el ensayo ELISA (no se muestran los datos). Todas las secuencias de aminoácidos a excepción de los Controles 1 y 2 se muestran como SEQ ID.
Ejemplo 2:
Estudios de respuesta inmune:
Se seleccionaron VB 1009, VB1016, VB1020 y VB1021 como candidatos de vacuna con sus correspondientes controles 1 y 2 respectivamente. Como control negativo se utilizó el vector pUMVC4a vacío.
Se inyectaron 25, 12,5 y 1,4 |jg de ADN plasmídico de cada candidato por vía intradérmica en la zona lumbar de ratones C57BI/6 con posterior electroporación, Dermavax, Cellectis (París, Francia). Al cabo de 7 días los ratones recibieron refuerzos de cantidades similares de vacunas y plásmidos de control. El día 21 los ratones fueron sacrificados y se recolectaron los bazos.
Las respuestas de los linfocitos T se calcularon mediante la prueba ELISpot. (Figuras 3a, b y c)
Ejemplo 3:
Efecto terapéutico
Se seleccionaron VB1016, VB1020 y VB1021 con los correspondientes controles 1 y 2 como candidatos de vacuna para estudios de vacunas terapéuticas.
5x104 o 5x105 linfocitos TC-1 (Johns Hopkins University, Baltimore, EE.UU., Lin KY et al., Cancer Res, 1996) se inyectaron en la región del cuello o muslo de ratones C57BI/6. Después de los días 3 y 10 o los días 3, 7 y 10, los ratones fueron vacunados con 2 jg, 10 jg, 12,5 jg o 20 jg de ADN plasmídico con posterior electroporación, Dermavax, Cellectis, Francia. Se midió el tamaño del tumor dos a tres veces por semana hasta el día 49 después de la inyección de linfocitos TC-1 (Figuras 4, 5 y 6).
Ejemplo 4:
Una vacuna terapéutica de ADN que se va a utilizar se puede preparar mediante fabricación BPF de la vacuna de plásmidos según las pautas de las autoridades reguladoras, incluyendo bancos de células BPF, fabricación BPF de principios activos y medicamentos, estudios de estabilidad ICH y llenado y acabado de la vacuna de ADN. La vacuna de ADN se puede formular mediante disolución en solución salina, tal como Tris 10nM, EDTA 1mM con una concentración de 2-5 mg/ml. La vacuna se puede administrar ya sea por vía intradérmica o intramuscular con o sin electroporación posterior.
SECUENCIAS:
Precursor de proteína 1 similar a quimiocina 3 con motivo C-C que incluye péptido señal (aa 1-23 en negrita) y péptido maduro (LD78-beta), aa 24-93 (SEQ ID NO:1):
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKR GRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA ADN específico y secuencias de aminoácidos correspondientes de construcciones de vaccicuerpo de VPH:
Construcciones simples de E6 o E7:
Con fines únicamente ilustrativos, los distintos dominios de las construcciones se separan con «|» con los dominios en el siguiente orden: Péptido señal | MIP-1a humana | h1 bisagra | h4 bisagra | Enlazador Gly-Ser o Enlazador Gly-Leu | IgG3 hCH3 | Enlazador Gly-Ser o Enlazador Gly-Leu | E6 o E7 de tipo salvaje o mutante de longitud completa. Los aminoácidos o nucleótidos en negrita ilustran los sitios de las mutaciones.
Secuencia de ADN de VB1001 (SEQ ID NO:2):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC |GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A |GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGC-TGGCCTG IATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTG CAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAA AATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGAT TTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGAT TCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCT GTAA
Secuencia de proteína de VB1001 (construcción homodimérica según la descripción con E6, SEQ ID NO:3): Secuencia de aminoácidos, 393 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSIAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVGADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHTIEPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSOIAVEWESSGQPENUYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER
PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN PYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
Secuencia de ADN de VB1002 (SEQ ID NO:4):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACC-AGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG |ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCA.CAGTTATGCACAGAGCTG CAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAA AATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGAT TTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGAT TCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCT GTAA
Secuencia de proteína de VB1002 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:5): Secuencia de aminoácidos, 393 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWQKYVSDLELSAIELKTPLG DTTHTIEPKSCDTPPPCPRCPIGGGSSGGGSGIGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRKQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN PYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCOLLIRCINCQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
Secuencia de ADN de VB1003 (SEQ ID NO:6):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG |ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTG CAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAA AATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGAT TTGTTAATTAGGTGTATTAACCG&.CAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGAT TCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCT GTAA
Secuencia de proteína de VB1003 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:7): Secuencia de aminoácidos, 393 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|CGGSEGCGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MFQDPQER
PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN PYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
Secuencia de ADN de VB1004 (SEQ ID NO:8):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCCIGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG |ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTG CAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTG CTCGACGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAA AATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGAT TTGTTAATTAGGTGTATTAACCGftGAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGAT TCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCT GTAA
Secuencia de proteína de VB1004 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:9): Secuencia de aminoácidos, 393 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGN PYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYMKPLCDLLIRCINRQK PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
Secuencia de ADN de VB1005 (SEQ ID NO:10):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC |GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A |GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG IATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA ACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA TAA
Secuencia de proteína de VB1005 (construcción homodimérica según la descripción con E7, SEQ ID NO:11): Secuencia de aminoácidos, 340 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWQKYVSDLELSAIELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTK HQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENHYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSY'MHEALHNRFTQKSLSLSPGK |GLGGL |MHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDE1DGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
Secuencia de ADN de VB1006 (SEQ ID NO:12):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC IGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A |GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTAlCCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTA.CAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG IATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAA.TATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA ACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA TAA
Secuencia de proteína de VB1006 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:13): Secuencia de aminoácidos, 340 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFET5SQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEKVQKYV5DLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK HQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPEITHYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVHHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
Secuencia de ADN de VB1007 (SEQ ID NO:14):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC IGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A |GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA| GGACAGCCCCGA-GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATTCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAYXT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGGTGGCCTG IATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA ACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTGGATGCAAGGGAGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA TAA
Secuencia de proteína de VB1007 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:15): Secuencia de aminoácidos, 340 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIA-VEWESSGQPEENYHTTPPMLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFG CKGDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
Secuencia de ADN de VB1008 (SEQ ID NO:16):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT
GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|
GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTA-CCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC
CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA| GGCCTCGCTC-GCCTG |ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA
ACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGGGACCCATCGGATCTCAGAAACCA TAA
Secuencia de proteína de VB1008 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:17): Secuencia de aminoácidos, 340 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVGPIGSQKP*
Construcciones con E6 y E7:
Con fines únicamente ilustrativos, los distintos dominios de las construcciones se separan con «|» con los dominios en el siguiente orden: Péptido señal | MIP-1a humana | h1 bisagra | h4 bisagra | Enlazador Gly-Ser o Enlazador Gly-Leu | IgG3 hCH3 | Enlazador Gly-Ser o Enlazador Gly-Leu | mutante de E7 | Enlazador Gly-Ser o Enlazador Gly-Leu | mutante de E6. Los aminoácidos o nucleótidos en negrita ilustran los sitios de las mutaciones.
Secuencia de ADN de VB1009 (SEQ ID NO:18):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT
GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCCIGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|
GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAXAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA | GGCCTCGC-TGGCCTG |ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA
ACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCA.TCTGTTCTCAGAAACCA
|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATG
CACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTA TATGACTTTGCTCGRCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACG&GATAAATGTTTAAAGT
TTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACC GTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCG&CAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAA
AAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAG AAACCCAGCTGTAA
Secuencia de proteína de VB1009 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:19): Secuencia de aminoácidos, 501 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS|APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD
YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAIELKTPLG DTTHT|EPKSCDTPPPCPRCP|GGGSSGGGSG|GQPREPQVYTLPPSREEMTK
NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK|GLGGL|MHGDTPTL
HEYMLDLQPETTDLYGYGQLHDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP|GGGSSGGGSG|
MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDL CIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQ
L*
Secuencia de ADN de VB1016 (SEQ ID NO:20):
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT
GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACA.GAATTTCATAGCTGA.CTACTTTG
AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC|GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA|GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|
GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA | GGCCTCGGTGGCCTG ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACA
ACTGATCTCTACGGATATGGACAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAG AACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCAC ACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCA GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA|ATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATG
CACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTñCTGCGACGTGAGGTñ
TATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTACGAGA.TAAATGTTTAAAGT
TTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAAC.AAA.CC
GTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACCGACAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAA AAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAG AAACCCAGCTGTAA
Secuencia de proteína de VB1016 (construcción homodimérica según la descripción, SEQ ID NO:21): Secuencia de aminoácidos, 501 aminoácidos.
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWQKYVSDLELSAELKTPLG DTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMHGDTPTL HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGGGSSGGGSG MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDL CIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLL IRCTNRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNTRGRMTGRCMSCCRSSRTRRETQ
L*
SEQ ID NO:22:
Proteína E6 de >tr|Q778I6|Q778I6_VPH16 OS=virus del papiloma humano tipo 16 GN=E6 PE=4 SV=1; (los aminoácidos subrayados denotan aminoácidos que se pueden eliminar; los aminoácidos potenciales que se pueden mutar están resaltados)
MFODPOERPRKLPOLCTELOTTIHDIILECVYCKOOLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYS KISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCR SSRTRRETQL
SEQ ID NO:23:
Proteína E7 de >sp|P03129|VE7_VPH16 OS=virus del papiloma humano tipo 16 GN=E7 PE=1 SV=1; (los aminoácidos subrayados denotan aminoácidos que se pueden eliminar; los aminoácidos potenciales que se pueden mutar están resaltados)
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEOLNDSSEEEDEIDGPAGOAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQ STHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
SEQ ID NO:24: Proteína E6 de >>sp|P06463|VE6_VPH18 OS=virus del papiloma humano tipo 18 GN=E6 PE=1 SV=1;
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSI PHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRH LNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV
SEQ ID NO:25: Proteína E7 de >>sp|P06788|VE7_VPH18 OS=virus del papiloma humano tipo 18 GN=E7 PE=2 SV=2
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHT MLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO:26:
Regiones bisagra (IgG3, bisagra superior (UH, por su sigla en inglés)), 12 aminoácidos: ELKTPLGDTTHT
SEQ ID NO:27:
Región bisagra (IgG3, bisagra media (MH, por su sigla en inglés)), 15 aminoácidos: EPKSCDTPPPCPRCP
SEQ ID NO:28:
Enlazador Gly-Ser: GGGSSGGGSG
SEQ ID NO:29: lgG3 hCH3:
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:30: Enlazador: GLGGL
SEQ ID NO:31: Secuencia de ADN de VB1020:
ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT|GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC IGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC
A|GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAIGGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGAI GGACAGCCCCGA.GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA.TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAAI GGCCTCGGTGGCCTG/ATGCATGGCGATACCCCAA.CACTCCATGAGTACATGCTGGACCTTCAGCCCGAGAC TACGGATCTGTATGGCTATGGGCAGTTGAATGACTCATCTGAGGAGGAGGACGAAATAGACGGCCCAGCTGGTCAAGCC GAACCGGATAGAGCCCACTACAACATTGTGACCTTTTGCTGTAAGTGTGACAGCACTCTGAGACTGTGTGTTCAGTCCA CTCATGTCGACATACGCACATTGGAGGATCTCCTGATGGGAACACTGGGAATTGTGTGTCCCATCTGTTCCCAAAAGCC
T/GGAGGTGGAAGCAGTGGAGGCGGTTCAGGC/ATGTTCCAAGATCCTCAAGAACGTCCTCGTAAGCTGCCACAGCTGT GTACCGAGCTTCAGACCACCATTCACGACATCATCCTGGAGTGCGTCTATTGCAAACAGCAGCTCCTTAGAAGGGAAGT GTACGATTTTGCACGGAGGGACCTCTGCATCGTGTATCGGGACGGCAATCCCTATGCGGTACGGGATAAATGCCTGAAG TTCTACAGCAAAATCTCCGAGTACCGGCACTACTGCTACTCTCTCTATGGGACGACTCTGGAACAGCAGTACAACAAGC CCTTGTGCGATCTGCTGATTCGCTGCATTAATCGCCA.GAAACCTCTGTGCCCAGAAGAGAAGCAAAGACACCTGGACAA GAAACAGCGATTCCACAACATCCGAGGGAGATGGACAGGGAGGTGTATGAGCTGCTGTCGGAGTTCTAGGACAAGGCGC GAAACCCAGCTTTGA
SEQ ID NO:32: Secuencia de proteína de VB1020 (construcción homodimérica según la descripción, Secuencia de aminoácidos, 501 aminoácidos:
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSIAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA|ELKTPLG
Claims (15)
1. Una proteína homodimérica de dos cadenas de aminoácidos idénticas, comprendiendo cada cadena de aminoácidos (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la s Eq ID NO:22 (E6 de VPH16) y/o SEQ ID NO:24 (E6 de VPH18) y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de SEQ ID NO:23 (E7 de VPH16) y/o SEQ ID NO:25 (E7 de VPH18), y donde dichas secuencias de aminoácidos comprenden una o más mutaciones para inhibir las propiedades oncogénicas.
2. La proteína homodimérica según la reivindicación 1, donde dicho péptido señal consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:1.
3. La proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicha unidad de direccionamiento consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1.
4. La proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicha unidad antigénica consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, tal como al menos 81 %, tal como al menos 82 %, tal como al menos 83 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 85 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 87 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 89 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 243-293 de SEQ ID NO:3.
5. La proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en su forma madura sin ninguna secuencia de péptidos señal.
6. Una cadena de aminoácidos que comprende (1) un péptido señal, (2) una unidad de direccionamiento, (3) un motivo de dimerización, y (4) una unidad antigénica, comprendiendo dicha unidad de direccionamiento una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos 24-93 de SEQ ID NO:1, y una unidad antigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de la s Eq ID NO:22 (E6 de VPH16) y/o SEQ ID NO:24 (E6 de VPH18) y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia respecto de SEQ ID NO:23 (E7 de VPH16) y/o SEQ ID NO:25 (E7 de VPH18), y donde dicha cadena de aminoácidos es capaz de formar una proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, que codifica la cadena de aminoácidos de la reivindicación 6.
8. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, y dicha molécula de ácido nucleico está optimizada con codones humanos.
9. Una molécula de ácido nucleico que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre el listado compuesto por SeQ ID No :18, SEQ ID nO:20, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:33.
10. La proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una cadena de aminoácidos según la reivindicación 6, o la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para uso como medicamento.
11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una cadena de aminoácidos según la reivindicación 6, o la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
12. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
13. Un procedimiento para preparar una proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una cadena de aminoácidos de la reivindicación 6, comprendiendo el procedimiento a) transfectar la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en una población de células;
b) cultivar la población de células;
c) recoger y purificar la proteína homodimérica, o cadena de aminoácidos expresada a partir de la población de células.
14. Un procedimiento para preparar una vacuna, tal como vacuna de ADN, que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, comprendiendo el procedimiento
a) preparar una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8;
b) disolver la molécula de ácido nucleico obtenida mediante la etapa a) en un vehículo, diluyente o tampón farmacéuticamente aceptable.
15. Una vacuna contra VPH que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de una proteína homodimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una cadena de aminoácidos según la reivindicación 6, o molécula de ácido nucleico, tal como ADN, según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicha vacuna es capaz de desencadenar una respuesta inmune tanto de linfocitos T como de linfocitos B.
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