JP2014534807A - クロスプレゼンテーションを行う樹状細胞を標的としたワクチボディ - Google Patents
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Abstract
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え型融合タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、抗体成分および標的成分を含む融合タンパク質と、該融合タンパク質を使用し、免疫応答を誘導することに関する。
Description
(関連出願のクロスリファレンス)
本出願は、2012年9月23日に出願した係属中の米国仮出願第61/538,186号に対する優先権を主張するものである。本出願には、上記仮出願の全体が参照により含まれる。
〔技術分野〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ(vaccibodies))および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
本出願は、2012年9月23日に出願した係属中の米国仮出願第61/538,186号に対する優先権を主張するものである。本出願には、上記仮出願の全体が参照により含まれる。
〔技術分野〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ(vaccibodies))および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
DNAワクチン接種は、免疫応答を誘導する技術的には簡単な方法である。しかし、小動物を被験体とした試験での成功はいまだ臨床試験で再現されたことはない。DNAワクチン接種の効能を増加させるために、現在幾つかの戦略が検討されている。
抗原提示細胞(APC)をタンパク質抗原の標的とした場合、T細胞応答およびB細胞応答を改善することができる。組換え型免疫グロブリン(Ig)分子は、この目的に非常に適している。例えば、APCの表面分子に特異的な可変(V)領域を有する上記組換え型Igを備えることで標的抗原の送達を達成しながら、短鎖抗原エピトープは、Ig定常ドメイン内のβ−鎖間のループに置き換わることができる。しかし、このような戦略は、同定されていないエピトープを含むより大型の抗原には適しておらず、そのうえ短鎖T細胞エピトープを有する組換え型Ig分子は、構造エピトープに対する抗体を誘導させることができない。このような限界を克服するために、構造エピトープを維持しつつ、少なくとも550aaのサイズを有する伝染性抗原または腫瘍抗原を発現する、Igをベースとした標的ホモ二量体DNAワクチン(ワクチボディ)が作製されている。
DNAワクチンは、効果が不十分だとして人への接種はいまだ承認されていない。また、幾つかの伝染病に対しては、有効なワクチンが存在しない。特に、治療用DNAがんワクチンの人への使用はまだ承認されていない。
効能が改善されたDNAワクチンが必要とされている。
〔発明の概要〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ)および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
〔発明の概要〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ)および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
したがって、本発明の実施形態は融合ポリペプチドと、上記ポリペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターと、上記融合ポリペプチドをコードする上記ベクターを含む細胞であって、上記融合ポリペプチドは、ヒトまたはマウスのXcl1またはXcl2のアミノ酸配列(例えば、配列番号1、2、または3と記載)と少なくとも80%の配列同一性(例えば少なくとも85%、90%、95%、99%、または100%の相同性)を有するアミノ酸配列と、抗原性ユニットと、を含む標的ユニットを含み、上記標的ユニットと、上記抗原性ユニットは二量体化モチーフを介して結合されている、融合ポリペプチドと、上記ポリペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターと、上記融合ポリペプチドをコードする上記ベクターを含む細胞とを提供する。幾つかの実施形態においては、上記融合ポリペプチドは、クロスプレゼンテーションを行うDC上のXcr1と結合することが好ましい。幾つかの実施形態において、ヒトもしくはマウスのXcl1もしくはXcl2の変異体または相同体は、天然の、ヒトもしくはマウスのXcl1もしくはXcl2よりも、Xcl1に対してより高い親和性を提示する。
幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは抗原性scFv、細菌性抗原、ウイルス抗原、またはがん関連抗原もしくはがん特異性抗原である。幾つかの実施形態においては、(G4S)3リンカーのようなリンカーが上記抗原性scFVのVHとVLとを結合する。幾つかの実施形態においては、上記抗原性scFvは、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞から産生したモノクローナルIg由来である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはテロメラーゼまたはその機能的部分である。幾つかの実施形態においては、上記テロメラーゼはhTERTである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはメラノーマ抗原である。幾つかの実施形態においては、上記メラノーマ抗原はチロシナーゼ、TRP−1、もしくはTRP−2である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは前立腺がん抗原である。幾つかの実施形態においては、上記前立腺がん抗原はPSAである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは頸がん抗原である。幾つかの実施形態においては、上記頸がん抗原は、E1、E2、E4、E6、E7、L1、およびL2からなるリストから選択される。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットは細菌由来である。幾つかの実施形態においては、上記細菌由来抗原性ユニットは結核抗原である。幾つかの実施形態においては、上記細菌由来の抗原性ユニットはブルセラ病抗原である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはウイルス由来である。幾つかの実施形態においては、上記ウイルス由来抗原性ユニットはHIV由来である。幾つかの実施形態においては、上記HIV由来抗原性ユニットはgp120もしくはGag由来である。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットはインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)、核タンパク質、ならびにM2抗原、および単純疱疹2抗原糖タンパク質Dからなるリストから選択される。
幾つかの実施形態においては、上記ポリペプチドは二量体として存在する。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフは、ヒンジ領域と、任意でリンカーを介して結合されている、二量体化を促進する任意の他のドメイン(免疫グロブリンドメインなど)と、を含む。幾つかの実施形態においては、上記二量体ドメインはヒトIgG3二量体ドメイン(hCH3)を含む。幾つかの実施形態においては、上記ヒンジ領域は1つ、2つ、または複数の共有結合を形成する能力を持つ。幾つかの実施形態においては、上記共有結合はジスルフィド架橋である。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインはカルボキシ末端Cドメイン、または上記Cドメインと実質的に相同である配列である。幾つかの実施形態において、上記カルボキシ末端CドメインはIgG由来である。幾つかの実施形態において、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインはホモ二量体化を行う能力を有する。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフの上記免疫グロブリンドメインは非共有相互作用を介してホモ二量体化を行う。幾つかの実施形態においては、上記非共有相互作用は疎水性相互作用である。幾つかの実施形態においては、上記二量体ドメインは、上記CH2ドメインを含まない。幾つかの実施形態においては、上記二量体化モチーフは、リンカーを介してヒトIgG3のCH3ドメインに結合された、ヒンジエキソンh1およびh4からなる。幾つかの実施形態においては、上記ヒンジ領域と二量体化を促進する他のドメイン(免疫グロブリンドメインなど)とを結合させる上記リンカーは、G3S2G3SGリンカーである。幾つかの実施形態においては、上記抗原性ユニットおよび上記二量体化モチーフはGLSGLリンカーのようなリンカーを介して結合される。幾つかの実施形態においては、好ましい変異型ホモ二量体タンパク質は、天然ホモ二量体タンパク質の親和性と比べて、Xcr1ケモカイン受容体に対する親和性が増加している。
幾つかの実施形態においては、本発明は、上記で説明したワクチボディをコードする核酸分子を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明に係る上記核酸分子はベクターに含まれている。幾つかの実施形態においては、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明に係る上記核酸分子は、患者の体内においてホモ二量体タンパク質の産生を誘導するために、患者への投与目的で調剤される。
幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンは薬学的に許容できるキャリアおよび/またはアジュバントを含む。幾つかの実施形態においては、本発明は、がんまたは伝染病に対するワクチンであって、上記ワクチンは、上記で説明したホモ二量体タンパク質、または上記で説明したホモ二量体タンパク質を形成することができる上記単量体タンパク質をコードする核酸分子を免疫学的な有効量含み、上記ワクチンは、T細胞免疫応答および/またはB細胞免疫応答(好ましくは両方)を誘起させることができ、上記ホモ二量体タンパク質は、上記がんまたは上記伝染病に特異的な抗原性ユニットを含有することができる。
幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンまたは医薬組成物によって治療される上記がんは、多発性骨髄腫もしくは多発性リンパ腫、悪性メラノーマ、HPV誘導性がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、および/または肝臓がんである。幾つかの実施形態において、本発明に係るワクチンまたは医薬組成物によって治療される上記伝染病は、インフルエンザ、ヘルペス、CMV、HPV、HBV、ブルセラ病、HIV、HSV−2および結核からなるリストから選択される。
本発明はさらに上記融合ポリペプチドを含むキットを提供する。
本発明のさらなる実施形態は、被験体が上記抗原性ユニットに対して免疫応答を生成するよう、一定の条件下、本明細書中に記載のワクチン組成物を上記被験体に投与する工程を含む、免疫応答の誘導方法を提供する。
幾つかの実施形態においては、本発明はさらに、上記で説明したホモ二量体タンパク質の作成方法を提供し、上記方法は、上記で説明したホモ二量体タンパク質を形成することができる上記単量体タンパク質をコードする上記核酸分子を細胞集団へ導入する工程と、上記細胞集団を培養する工程と、上記細胞集団から発現したホモ二量体化タンパク質の回収および精製を行う工程と、を含む。
さらなる実施形態は本明細書中にて説明されている。
(定義)
本明細書で使われている「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムによる応答を指す。例えば、免疫応答の例として、Toll受容体の活性化、リンフォカイン(サイトカイン(例:Th1タイプもしくはTh2タイプのサイトカイン)もしくはケモカインなど)の発現および/または分泌、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化、T細胞の活性化(CD4+もしくはCD8+T細胞など)、NK細胞の活性化、および/またはB細胞の活性化(例えば、抗体生成および/または分泌)における検知可能な変化(すなわち増加)が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答のさらなる例として、細胞障害性T細胞(「CTL」)応答を誘導する、免疫原(例えば、抗原(例:免疫原性ポリペプチド)のMHC分子への結合、抗原性ポリペプチドの由来となる抗原に対するB細胞応答(例えば、抗体産生)ならびに/もしくはヘルパーT細胞応答、および/または遅延型過敏(DTH)応答の誘導、免疫システム細胞(例:(血漿細胞などの)いかなる発達段階におけるT細胞、B細胞)の増殖(例えば、細胞集団の増加)、および抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび抗原提示の増加が挙げられる。免疫応答は、被験体の免疫システムによって外来性であると認識される免疫原に対するものであってよい(例えば、微生物からの非自己抗原(病原体など)、または外来性として認識された自己抗原)。したがって、本明細書で使われている「免疫応答」は、自然免疫応答(例えばToll受容体シグナルカスケードの活性化)、細胞性免疫応答(例えばT細胞(すなわち抗原特異性T細胞)および免疫システムの非特異性細胞の仲介による応答)、および液性免疫応答(例えば、(血漿、リンパ液および/または組織液に、抗体を生成および分泌することを介した)B細胞の仲介による応答)を含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の免疫応答を指すものであると理解されるべきである。「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムが抗原および/または免疫原に対して応答できる能力(例えば免疫原(病原体など)に対する初期応答および後天性免疫応答の結果である獲得(例えば、記憶)免疫応答)の全側面を包含するものである。
本明細書で使われている「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムによる応答を指す。例えば、免疫応答の例として、Toll受容体の活性化、リンフォカイン(サイトカイン(例:Th1タイプもしくはTh2タイプのサイトカイン)もしくはケモカインなど)の発現および/または分泌、マクロファージの活性化、樹状細胞の活性化、T細胞の活性化(CD4+もしくはCD8+T細胞など)、NK細胞の活性化、および/またはB細胞の活性化(例えば、抗体生成および/または分泌)における検知可能な変化(すなわち増加)が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答のさらなる例として、細胞障害性T細胞(「CTL」)応答を誘導する、免疫原(例えば、抗原(例:免疫原性ポリペプチド)のMHC分子への結合、抗原性ポリペプチドの由来となる抗原に対するB細胞応答(例えば、抗体産生)ならびに/もしくはヘルパーT細胞応答、および/または遅延型過敏(DTH)応答の誘導、免疫システム細胞(例:(血漿細胞などの)いかなる発達段階におけるT細胞、B細胞)の増殖(例えば、細胞集団の増加)、および抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび抗原提示の増加が挙げられる。免疫応答は、被験体の免疫システムによって外来性であると認識される免疫原に対するものであってよい(例えば、微生物からの非自己抗原(病原体など)、または外来性として認識された自己抗原)。したがって、本明細書で使われている「免疫応答」は、自然免疫応答(例えばToll受容体シグナルカスケードの活性化)、細胞性免疫応答(例えばT細胞(すなわち抗原特異性T細胞)および免疫システムの非特異性細胞の仲介による応答)、および液性免疫応答(例えば、(血漿、リンパ液および/または組織液に、抗体を生成および分泌することを介した)B細胞の仲介による応答)を含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の免疫応答を指すものであると理解されるべきである。「免疫応答」という用語は、被験体の免疫システムが抗原および/または免疫原に対して応答できる能力(例えば免疫原(病原体など)に対する初期応答および後天性免疫応答の結果である獲得(例えば、記憶)免疫応答)の全側面を包含するものである。
本明細書で使われている「免疫」という用語は、疾病の原因となり得る微生物(病原体など)に曝露された際に当該疾病から防護すること(例えば当該疾病の徴候、症候、状態を防ぐことまたは和らげること(抑制など))を指す。免疫は、先天性(例:過去に抗原の曝露を受けていなくても存在する非適応性(非後天性)免疫応答)、および/または後天性(例:過去に抗原の曝露を受けたことによりB細胞およびT細胞によって仲介される免疫応答(つまり、上記抗原に対して特異性と反応性の増加を示す))であってもよい。
本明細書で使われている「免疫原」という用語は、被験体内で免疫応答を誘導することができる病原体(例えば、微生物(バクテリア、ウイルスもしくは菌類など)および/または病原体の一部もしくは成分(タンパク質抗原など)を指す。幾つかの実施形態において、免疫原は上記免疫原(例えば、病原体もしくは病原体生成物などの微生物)に対して免疫を誘導する。
「試験化合物」という用語は、疾病、疾患、病気、もしくは身体機能の不調の治療または予防に使うことができる、またはサンプルの生理学的状態もしくは細胞の状態を変化させる、あらゆる化学成分、医薬、薬物などを指す。試験化合物には、公知の治療用化合物と、治療用化合物となり得る化合物の双方が含まれる。試験化合物が治療効果を有するか否かは、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングをすることで判断される。「公知の治療用化合物」は、(例えば、動物実験もしくは過去のヒトへの投与経験を通じて)そのような治療または予防において有効であると認められている治療用化合物を指す。
本明細書で使われる「サンプル」という用語にはその用語が意味し得る最も広い範囲を適用する。ある意味においては、「サンプル」という用語は組織サンプルを指し、別の意味においては、「サンプル」という用語は生体ソースなどのあらゆるソースから得られた標本または培養物を含むことを意図する。生体サンプルは動物(ヒトを含む)から得られるものであってよく、液体、固体、組織、気体を包含する。生体サンプルとしては、血漿や血清などの血液製剤が挙げられるがこれらに限定されない。これらの例は本発明に適用できるサンプルの種類を限定するものとして解釈されるべきではない。ヒトの染色体またはヒト染色体と関連する配列を含むと推定されるサンプルは、細胞、細胞から分離された染色体(中期染色体スプレッドなど)、ゲノムDNA(溶液中に存在するもの、またはサザンブロット分析に用いられるような固体支持体に結合されているもの)、RNA(溶液中に存在するもの、またはノーザンブロット分析に用いられるような固体支持体に結合されているもの)、cDNA(溶液中に存在するもの、または固体支持体に結合されているもの)などを含んでいてもよい。タンパク質を含むと推定されるサンプルは、細胞、組織の一部、1つまたはそれ以上のタンパク質を含んだ抽出物などを含んでいてもよい。
本明細書において「アミノ酸配列」という記載を用いて天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、「アミノ酸配列」という用語、および「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」のような類似用語は、上記アミノ酸配列を、記載されたタンパク質分子に関連する、完全長で天然のアミノ酸配列に限定するものではない。
本明細書に使われている「ペプチド」という用語は、2つまたはそれ以上のアミノ酸がペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合を介して結合したポリマーを指す。本明細書で使われている「ジペプチド」という用語は、2つのアミノ酸がペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合を介して結合したポリマーを指す。
「野生型」という用語は、天然起源のソースから分離されたときに、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を持った遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、個体群の中で最も頻繁に見られるものであるため、遺伝子の「正常型」または「野生型」として示される。反対に、「改変体(modified)」、「変異体(mutant)」、「変異体(variant)」という用語は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較して、配列およびまたは機能特性(すなわち改変された特徴)における改変を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。なお、天然起源の突然変異体を単離したものであってもよい。これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子生成物と比べた際に改変した特徴があるという事実から同定される。
本明細書で使われる「フラグメント」という用語は、天然タンパク質と比べて、アミノ末端および/またはカルボキシ末端が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が全長cCNA配列から演繹したアミノ酸配列における対応ポジションと同一のものであるポリペプチドを指す。フラグメントは、典型的には少なくとも4アミノ酸の長さを有し、好ましくは少なくとも20アミノ酸の長さを有し、典型的には少なくとも50アミノ酸またはそれ以上の長さを有し、上記ポリペプチドの組成と上記ポリペプチドの種々のリガンドおよび/または基質とが分子内結合をするうえで必要な上記ポリペプチドの部分に及ぶ。
本明細書で使われる「精製された」または「精製」はサンプルから夾雑物を除去することを意味する。例えば、抗原は夾雑タンパク質を除去することによって精製される。夾雑物の除去により、上記サンプルにおける抗原(例えば、本発明の抗原)の割合が増加する。
「変異体(variant)」という用語は、「変異体(mutant)」という用語と置き換えて使ってもよい。変異体という用語は、アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列のそれぞれにおける1か所またはそれ以上の位置での挿入、置換、トランスバージョン、トランケーション、および/または反転を含む。「変異型ポリペプチド」、「ポリペプチド」、「変異体」および「変異体酵素」という表現は、天然Xcl1のアミノ酸配列から改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド/タンパク質を意味する。上記変異型ポリペプチドは、Xcl1との配列同一性を一定の割合、例えば80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%有するポリペプチドを含む。
「変異体核酸」は、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列を含む。例えば、変異体配列は、例えば50℃、0.2SSCのようなストリンジェント条件下で(1× SSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7・0)、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列である。より具体的には、「変異型」という用語は、例えば65℃および0.1× SSCのような高いストリンジェント条件下で、本明細書に提示するヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能な配列と相補的な配列を包含する。変異体核酸の融点(Tm)は野生型核酸のTmよりも約1、2、または3℃低い。上記変異体核酸は、Xcl1をコードする、または本発明に係るホモ二量体タンパク質を形成することができる単量体タンパク質をコードする核酸との配列同一性を一定の割合、例えば、80%、85%、90%、95%、または99%有するポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使われている「ホモ二量体タンパク質」という用語は、2本の個別かつ同一のアミノ酸鎖、または水素結合、イオン性(荷電した)相互作用、実在の共有ジスルフィド結合、もしくはこれらの相互作用の組合せによって単一の二量体タンパク質として結合されたサブユニットを含むタンパク質を指す。
本明細書で使われている「二量体化モチーフ」は、抗原性ユニットと標的ユニットとの間のアミノ酸配列であり、二量体化に寄与する、ヒンジ領域および任意の第2ドメインを含む。この第2ドメインは免疫グロブリンドメインであってよく、上記ヒンジ領域と上記第2ドメインは、任意的にリンカーによって結合される。したがって、二量体化モチーフは抗原性ユニットと標的ユニットとを結合する役割を果たすだけでなく、2つの単量体タンパク質を本発明に係るホモ二量体タンパク質へと二量体化することを促進するヒンジ領域を含む。
本明細書で使われる「標的ユニット」は標的細胞(クロスプレゼンテーションを行う樹状細胞など)に対して、タンパク質とその抗原を送達するユニットを指す。
「ヒンジ領域」という用語は鎖間共有結合(例えばジスルフィド架橋)の形成などを通じて二量体化を促進するホモ二量体タンパク質のペプチド配列を指す。ヒンジ領域はIgG3といった、Igのヒンジエキソンh1+h4のように、Ig由来であってもよい。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ)および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、樹状細胞を標的とした遺伝子組換え融合タンパク質とその使用に関する。特に、本発明は、免疫応答を誘導させるための、標的成分、抗原、リンカー領域、および抗体成分を含む融合タンパク質(ワクチボディ)および該ホモ二量体融合タンパク質の使用、または該融合タンパク質をコードするDNAに関する。
樹状細胞(DC)は解剖学的部位の異なる場所で免疫センチネルの機能を発揮する。非リンパ系組織(NLT)の実質組織に常在するDCは、間質性DC(int−DC)と呼ばれる。これらのDCは組織抗原を流入領域リンパ節(LN)に輸送し、この場合のDCは遊走性DC(mig−DC)と呼ばれる。マウスの皮膚において、DCは表皮のランゲルハンス細胞(LC)と真皮DCの3つの主要サブセット(CD11bhiCD24 DC、CD11b−CD24+CD1032 DC、およびCD11bCD24+CD103+ DC(1))を構成する。上記3つの主要サブセットはこれ以降CD11b+ DC、CD103 DC、およびCD103+ DC(表I)とする。LCおよびすべての真皮DCサブセットが皮膚から皮膚LN(CLN)恒常的に遊走するとしても、上記DC103+ DCは上記CLN内のCD8T細胞に対してケラチノサイト由来Agを提示するもっとも強力なサブセットとして目立っている(1)。この能力は、クロスプレゼンテーションを行うためのリンパ系組織(LT)常在性CD8a+ DCの高い効率性を連想させる。DC103+ int−DCはまた、肺や腸のような他の解剖学的部位でも見ることができる。CD103+ int−DCおよびLT常在性CD8a+ DCの発達は、転写因子の共通セットに選択的に依存する(2、3)。したがって、これらマウスのDC集団はCD8a+−タイプDCに特有のカテゴリーに属してもよい(1)。
CD8a+−タイプDCは、ヒトおよびヒツジに存在しており、その同定は、CD8a+−タイプDCによる、マウスの脾臓のCD8a+DCと共通する特有の転写フィンガープリントの発現(4、5)、およびCD8a+−タイプDCの、AGのクロスプレゼンテーションの効率性(5−9)に基づいて行われた。DCには、組織や種に関係なく、単球由来炎症性DC、LC、形質細胞様DC、CD11b+-タイプDC、およびCD8a+−タイプDCを主要5つのサブセットとする世界共通の分類が公表されている(1)。ケモカイン受容体XCR1は特に、マウスの脾臓、ヒトの血液、およびヒツジのリンパ内のCD8a+−タイプDCによって発現する(4−7、10)。Xcr1の機能は、R.Kroczek(10)のグループによって最初に明らかになった。R.Kroczekは、抗CD205抗体に結合させたOVAまたはOVAを発現させる同種異形の前駆B細胞のいずれかをin vivoで投与する実験モデルにおいて、CD8+T細胞のクロスプライミングは、CD8+T細胞がXcr1のリガンドXCL1を分泌できる能力に左右されるということを示した。CD8a+ DCにおけるXcr1の発現もまた、リステリア菌の感染の際のCD8+T細胞応答を最適に誘導させるために重要であることが分かった(6)。
融合タンパク質ワクチンの例として、例えば国際公開第2004/076489号、US20070298051、EP920522、Fredriksen AB et al. (Mol Ther 2006; 13: 776-85)、およびFredriksen AB and Bogen B (Blood 2007; 110: 1797-805)が挙げられる。本明細書はこれら各文献内容の全体を参照により含む。本発明の実施形態は、Xcr1を標的としたXcl1ケモカインまたはXcl2ケモカインを含む遺伝子組換え融合タンパク質(すなわちワクチボディ)を提供する。本発明の実施形態のワクチボディは、抗原に対する免疫応答、具体的にはCD8+T細胞応答を高めるという利点がある。
多くの研究において、抗原提示細胞(APC)を抗原の標的とした場合、免疫応答を高めるということが示されてきた。しかし、すべてのAPCがCD8+T細胞を誘導する能力を有するわけではない。最近の公表では、Xcr1はCD8+T細胞を誘導する能力をもつ、クロスプレゼンテーションを行うDCにのみ発現することが示唆されている。クロスプレゼンテーションを行うDCへ抗原をターゲティングする(例えばDEC205に向けたターゲティング)ために他のターゲティング方法が追求される一方で、これらの受容体はしばしばAPCの他の集団にも同様に発現する。したがって、Xcl1またはXcl2を介したターゲティングは特異性の高いターゲティングアプローチを確実なものにする。
したがって、本発明の実施形態は免疫グロブリンおよび/または免疫原と融合させたヒトまたはマウスのXcl1もしくはXcl2を含む融合タンパク質を提供する。Xcl1およびXcl2は受容体Xcr1へ融合ポリペプチドをターゲティングする。Xcl1はGenbankにて、受託番号NM_002995(ヒト核酸)およびNM_008510(マウス核酸)で記載されている。本発明の実施形態はさらに、Xcl1の変異体、相同体、模倣物を活用する(詳細は以下に記載)。
ヒトおよびマウスXcl1ポリペプチドの配列は、VGTEVLEESSCVNLQTQRLPVQKIKTYIIWEGAMRAVIFVTKRGLKICADPEAKWVKAAIKTVDGRASTRKNMAETVPTGAQRSTSTAITLTG(配列番号:1;マウス)、VGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG(配列番号:2;ヒト)と記載されている。ヒトXcl2のアミノ酸配列はVGSEVSHRRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG(配列番号:3;ヒト)と記載されており、核酸配列はATGAGACTTCTCATCCTGGCCCTCCTTGGCATCTGCTCTCTCACTGCATACATTGTGGAAGGTGTAGGGAGTGAAGTCTCACATAGGAGGACCTGTGTGAGCCTCACTACCCAGCGACTGCCAGTTAGCAGAATCAAGACCTACACCATCACGGAAGGCTCCTTGAGAGCAGTAATTTTTATTACCAAACGTGGCCTAAAAGTCTGTGCTGATCCACAAGCCACGTGGGTGAGAGACGTGGTCAGGAGCATGGACAGGAAATCCAACACCAGAAATAACATGATCCAGACCAAGCCAACAGGAACCCAGCAATCGACCAATACAGCTGTGACCCTGACTGGCTAG(配列番号:4;ヒト)と記載されている。天然Xcl2は21アミノ酸のシグナル配列MRLLILALLGICSLTAYIVEG(配列番号:5)で発現している。
本発明の実施形態に係る融合タンパク質の例を図1に示す。幾つかの実施形態においては、上記融合タンパク質は、標的ユニットとしてXcl1(Xcl2とXcl1とを置換してもよい)、ヒトIgG3二量体ドメイン(hCH3)、および抗原からなるがそれに限定されない抗原性ユニット、とを含む。二量体化によって、標的ユニット(Xcl1またはXcl2)および抗原の双方の点から、ワクチン分子は二価になる。本発明は特定の機構に限定されない。実際、本発明を実施するにあたって上記特定の機構の理解は必要としない。それでもなお、クロスプレゼンテーションを行うDC上のXcr1への、ワクチボディのターゲティングはMHC−I上のウイルスペプチドのCD8+T細胞への提示を誘導すると考えられている。後者は、活性化すると、ウイルス感染細胞または同様のペプチド/MHC複合体を提示するその他の標的細胞を死滅させることができる。
本発明の実施形態の展開過程において行われた実験は、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)を抗原性ユニットとして使った非標的ワクチボディと比較して試験した際に、Xcl1/Xcl2を標的としたワクチボディはDNAワクチンとしてより良い効能があることを立証した。Xcl1/Xcl2を標的としたワクチボディは、致命的なインフルエンザ感染に対して、より強いIgG2a抗体応答と、より良好なマウスの防護とを誘導した(実施例1および図4−6などを参照)。
本明細書に記載の実験においては、蛍光タンパク質mCherryおよびインフルエンザウイルスからのウイルス性抗原血球凝集素(HA)とを組み合わせた標的ユニットとしてのXcl1を含むワクチボディコンストラクトを生成した。初めに、Xcl1-mCherryワクチボディを評価した。リンパ節または皮膚のいずれかによって強化されたDC上において結合が分析された。Xcl1−mCherryは、いずれもMHC−I上に抗原(図2−3)のクロスプレゼンテーションを行うとして知られる、CD8+常在性DCおよびCD103+遊走性DCに対してのみ結合することが認められた。ワクチン設定においてXcl1ターゲティングの効果を測定するために、我々はXcl1−HAワクチボディをマウスに投与し、続いて血清サンプルを回収し、IgGレベルを測定した。Xcl1−HAは強力で持続的なIgG2a応答を誘導した。次に、インフルエンザウイルスによる致命的な感染からマウスを保護するXcl1−HAの能力を測定した。Xcl1−HAによって免疫されたマウスは、DNA25μgの一度の投与後のウイルスから完全に保護された。我々は、タイトレーションにより、マウスを免疫化するために使われるDNAの量を4.16μgにまで減少させてもマウスはウイルスから完全に保護されることを突き止めた。このことは、Xcl1/Xcl2へのターゲティングは、防護的な免疫応答を誘導させる強力な方法を提供することを示す。
本発明に係る融合タンパク質ワクチン(すなわちワクチボディ)は、遺伝子組換え型Igベースのホモ二量体ワクチンであってもよく、各鎖は、IgヒンジおよびCH3に直接付着した標的ユニットから構成されており、これらの組合せが共有結合したホモ二量体化を誘導する。
Xcl1/Xcl2ポリペプチドならびにその変異体、および異なる抗体ユニットを含む融合タンパク質は、機能性タンパク質として構築され、発現することが好ましい。特に、本発明は、融合ワクチンにおけるXcl1/Xcl2およびそれらの天然イソフォームを活用し、抗原提示細胞へ抗原送達をターゲティングすることに関する。特に好ましい実施形態において、抗原提示細胞はクロスプレゼンテーションを行う樹状細胞またはXcr1を提示するその他のAPCである。本発明には、プロフェッショナルな抗原提示細胞(APC)上のXcl1/Xcl2受容体(Xcr1)へ抗原送達をターゲティングする融合タンパク質をコードするDNAワクチンが含まれる。好ましい実施形態において、クロスプレゼンテーションを行うDC上のXcr1への、ワクチボディのターゲティングはMHC−I上のウイルスペプチドのCD8+T細胞への提示を誘導すると考えられている。後者は、活性化すると、同様のペプチド/MHC複合体を提示するウイルス感染細胞を死滅させることができる。
本発明に係る遺伝子組換え型タンパク質は、がんワクチンのような、ワクチンに有用なヒト抗体様分子であってもよい。ワクチボディとも呼ばれるこれらの分子は、APCを結合させ、T細胞免疫応答及びB細胞免疫応答の双方を誘起する。さらに、ワクチボディは二価でAPCに結合し、強い免疫応答の誘導をより効率的に促進すると考えられている。ワクチボディは、APCの表面分子に特異性を示す標的ユニットからなる単量体ユニットの二量体であって、ヒンジ領域およびCγ3ドメイン(後者はCOOH末端またはNH2末端部に存在する)のような二量体化モチーフを介して、抗原性ユニットに接続されていることが好ましい。本発明はまた、(i)この遺伝子組換え型タンパク質のDNA配列をコードすること、(ii)これらのDNA配列を含む発現ベクターおよび上記発現ベクターを含む細胞株、(iii)ワクチボディDNA、ワクチボディRNAまたはワクチボディタンパク質による免疫化を優先させた哺乳動物の治療、そして最後に(iv)そのような分子を含む医薬品およびキット、に関する。
本発明に係るタンパク質の二量体化モチーフは、ヒンジ領域および免疫グロブリンドメイン(例えばCγ3ドメイン)例えばカルボキシ末端Cドメイン(CH3ドメイン)、または上記Cドメインに対して実質的に相同する配列、を含んで構築されてもよい。上記ヒンジ領域はIg由来であってもよい。上記ヒンジ領域はジスルフィド架橋のような鎖間共有結合を形成することによって二量体化に寄与する。さらに、上記ヒンジ領域は2つの標的ユニットを、様々な距離を有して発現したAPC上の2つの標的分子に同時に結合することを可能にしながら、ドメイン間の柔軟なスペーサーとして機能する。免疫グロブリンドメインは、疎水性相互作用のような非共有相互作用を通じてホモ二量体化に寄与する。好ましい実施形態において、上記CH3ドメインはIgG由来である。これらの二量体化モチーフは他の多量体化部分(他のIgアイソタイプ/サブクラスからなど)と交換されてもよい。上記二量体化モチーフは、ヒトIgGのような、天然ヒトタンパク質由来であることが好ましい。上記二量化体モチーフは、抗原性ユニットおよび標的ユニットに対して、どのような配向性を有していてもよいと理解されるべきである。一実施形態において、上記抗原性ユニットは、上記二量体化モチーフのN終端に上記標的ユニットが存在する状態で、上記二量体化モチーフのCOOH終端に存在する。他の実施形態において、上記抗原性ユニットは、上記二量体化モチーフのCOOH終端に上記標的ユニットが存在する状態で、上記二量体化モチーフのN終端に存在する。
本明細書に参照され含まれている国際出願第2004/076489は、核酸配列とベクターを開示しており、これらは本発明の内容に応じて使われてもよい。
本発明に係るタンパク質は、どのような起源のポリペプチドに対しても免疫応答を誘導するのに適している。特異的エピトープを含み、十分な長さを持つ抗原配列であればどのようなものでも本発明に係るタンパク質の抗原性ユニットとして使ってもよい。したがって、幾つかの実施形態において、上記抗原性ユニットは、そのような抗原性ユニットをコードする核酸配列において少なくとも約27のヌクレオチドに相当する、少なくとも9アミノ酸の配列を含む。そのような抗原配列は、がんタンパク質由来、または感染因子由来であってもよい。そのようながん配列の例としては、テロメラーゼ、より具体的にはhTERT、チロシナーゼ、TRP−1/TRP−2メラノーマ抗原、前立腺特異抗原、およびイディオタイプが挙げられる。上記感染因子は、結核抗原およびブルセラ病からのOMP31のようなバクテリア起源、またはウイルス起源、より具体的にはgp120由来の配列のようなHIV由来の配列、HSV−2からの糖たんぱく質D、および血球凝集素、核タンパク質、並びにM2のようなインフルエンザウイルス抗原であってよい。そのような配列のワクチボディのフォーマットへの挿入は、免疫応答の両アームの活性化につながるかもしれない。または、上記抗原性ユニットは抗体またはそのフラグメント(例えばB細胞リンパ腫または多発性骨髄腫を患った患者の骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞(骨髄腫/リンパ腫M成分とも呼ばれる)から製造されたモノクローナルIg由来のC末端scFv)であってもよい。
本発明に係る上記ワクチボディタンパク質、ワクチボディDNA、またはワクチボディRNAは、例えば、次に続く電気穿孔ありもしくはなしでの筋肉注射または皮下注射によって、対象の免疫化のために使うことができる。
本発明に係るタンパク質の標的ユニットは、ケモカイン受容体への結合を通じて、タンパク質をAPCへターゲティングする。特に好ましい実施形態において、上記ケモカイン受容体はXcr1である。
本発明に係る融合タンパク質の様々なユニットは、標準的な分子生物的手法、および適切な宿主細胞(NS0細胞、293E細胞、CHO細胞、またはCOS−7細胞など)にトランスフェクトされたDNAを介して、操作可能に連結されてもよい。トランスフェクタントは遺伝子組換え型タンパク質を産生、分泌する。
本発明はさらに、上記にて説明した遺伝子組換えに基づいたタンパク質、DNA/RNA配列、または本発明に係る発現ベクターを含む医薬品に関する。上記医薬品はさらに、薬学的に適合性を有するキャリアを適宜含む。適切なキャリア及びそのような医薬品の調剤については、当業者に周知のものである。適切なキャリアの例として、一般的なリン酸緩衝食塩水、水、乳剤(油/水乳剤等)、湿潤剤、無菌液などが挙げられる。上記医薬品は経口投与または非経口投与されてもよい。非経口投与の方法は、局所的投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、骨髄内投与、髄腔内投与、心室投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与を含む。適切な投与量はかかりつけの医者によって決定され、異なる要因(患者の年齢、性別、体重、投与の種類など)に依存する。さらに、本発明は、免疫学的に有効な量の核酸を含む、がんまたは感染性の疾病に対するワクチン成分であって、上記核酸は本発明の分子をコードする、もしくはその変異体を変性するものであり、上記成分はT細胞免疫応答およびB細胞免疫応答の双方を誘起することができる、ワクチン成分に関する。
本発明はまた、診療用、医療用、科学目的のワクチボディDNA、RNA、またはタンパク質を含むキットに関する。
本発明はさらに、本発明に係る分子を含むベクターを細胞群にトランスフェクトする工程と、上記細胞群を培養する工程と、上記細胞群から発現した遺伝子組換え型タンパク質を回収する工程と、上記発現したタンパク質を精製する工程と、を含んだ、本発明に係る遺伝子組換え型分子の作成方法に関する。
上記で説明したヌクレオチド配列は、遺伝子治療に適したベクター(特定のプロモーターの制御下におかれ、細胞に導入されたベクター)に挿入されることが好ましい。好まし実施形態において、上記DNA配列を含む上記ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである。レトロウイルスは特に好ましい。適切なレトロウイルスの例としては、MoMuLVまたはHaMuSVが挙げられる。遺伝子治療の目的で、本発明に係るDNA/RNA配列はまた、コロイド状分散体の形態で標的細胞に輸送することができる。上記コロイド状分散体は、例えば、リポソームやリポプレックスを含む。
本発明はまた、ポリペプチド、または本明細書に規定されたアミノ酸配列もしくは本明細書に規定された特異的性質を有するポリペプチドと一定の配列同一性または配列相同性を有するポリペプチド内のドメインもしくはモチーフの使用も包含する。特に本発明は、Xcl1/Xcl2との配列同一性をある程度有するペプチド、またはその相同体を含む。ここで、「相同体」という用語は対象となるアミノ酸配列または対象となるヌクレオチド配列と配列同一性を有する要素であり、この場合、上記対象とするアミノ酸配列はXcl1/Xcl2のアミノ酸配列であることが好ましい。
一つの様態において、上記相同アミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列は、機能的活性を維持し、および/またはXcl1/Xcl2ポリペプチドの活性を増加させるポリペプチドを提供および/またはコードしなければならない。
本内容においては、相同性配列は、対象とする配列との同一性が少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%であるアミノ酸配列を含むものとする。典型的には、相同体は、対象となるアミノ酸配列と同じ活性部位とその他の機能的配列を含む。相同性はまた類似性という観点で考慮されることもあるが(例えばアミノ酸残基が同様の化学特性/機能を持つことなど)、本発明の内容においては、相同性は配列同一性として表現されることが好ましい。
配列同一性の比較は目視によって行うことができるが、より一般的には、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使って、互いの相違点をもたらしたかもしれない進化的事象を最もよく反映する2つまたはそれ以上の配列のアラインメントを行う。したがって、これらのアルゴリズムは、同一または同様のアミノ酸のアラインメントには得点を与え、ギャップの挿入、ギャップの拡張、ならびに非類似アミノ酸のアラインメントにはペナルティーを与えるという評価システムの下運用される。上記比較アルゴリズムの評価システムは、i)ギャップが挿入されるたびにペナルティースコアを割り当てること(ギャップペナルティースコア)、ii)既存のギャップが延長して余分のポジションが発生するたびにペナルティースコアを割り当てること(延長ペナルティースコア)、iii)同一のアミノ酸のアラインメントが行われたときには高得点を割り当てること、およびiv)非同一アミノ酸のアラインメントが行われたときには変数スコアを割り当てること、を含む。多くのアラインメントプログラムはギャップペナルティーの変更が可能である。しかし、配列比較にそのようなソフトウエアを使う際には、デフォルト値を使うことが好ましい。
非同一アミノ酸のアラインメントに対して与えられたスコアは、スコア行列、別名アミノ酸置換行列に基づいて割り当てられる。このような置換行列に提供されたスコアは、進化の間、別のアミノ酸に置換されたアミノ酸の類似性は異なるものであり、置換されるアミノ酸の物理的/化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸で置換された場合の類似度は、疎水性アミノ酸で置換されたときに比べて高いものとなる。したがって、スコア行列は同一のアミノ酸に対しては最も高い得点を割り当て、非同一であるが類似するアミノ酸には低い得点を割り当て、非同一であり類似性のないアミノ酸にはさらに低い得点を割り当てる。もっとも頻繁に使われているスコア行列はPAM行列(Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992))、BLOSUM行列(Henikoff and Henikoff (1992))、およびGonnet行列(Gonnet et al. (1992))である。
そのようなアラインメントを行うための適切なコンピュータプログラムとしては、Vector NTI(Invitrogen Corp.)、およびClustalV、ClustalWならびにClustalW2プログラム(Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007))が挙げられるが、これらに限定されない。異なるアラインメントツールは、ExPASyプロテオミクスサーバから選択することができる。配列アラインメントを行うことができるソフトウエアの別の例としては、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)が挙げられる。BLASTは、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)のウェブページから入手できる(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410)。
ソフトウエアがアラインメントを作成すると、類似度の割合(%)と配列同一性の割合(%)の計算が可能となる。ソフトウエアは通常この計算を配列比較の一部として行い、数値結果を算出する。
一実施形態においては、ClustalWソフトウエアを使って配列アラインメントを行うことが好ましい。ClustalWを用いたアラインメントについては、以下のパラメータを用いてペアワイズアラインメントを行うことが好ましい。
別の実施形態においては、Vector NTI(Invitrogen)のAlign Xプログラムを使って配列アラインメントを行うことが好ましい。一実施形態においては、Exp10をデフォルト設定として用いてもよい。
ギャップオープンペナルティー:10
ギャップ延長ペナルティー:0.05
ギャップ分離ペナルティー範囲:8
スコア行列:blosum62mt2
このように、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、本明細書に規定するモチーフまたはドメイン、特にXcl1/Xcl2のアミノ酸配列の変異体、相同体、誘導体の使用をも含む。
ギャップ延長ペナルティー:0.05
ギャップ分離ペナルティー範囲:8
スコア行列:blosum62mt2
このように、本発明は、タンパク質、ポリペプチド、本明細書に規定するモチーフまたはドメイン、特にXcl1/Xcl2のアミノ酸配列の変異体、相同体、誘導体の使用をも含む。
とりわけXcl1/Xcl2の変異体、相同体および誘導体の配列はまた、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換があってもよい。これらにより静的異変が生じるが、機能的に同等な物質がもたらされる。入念なアミノ酸置換は、物質の二次的な結合活性が維持される限り、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性における類似性、および/または残基の両親媒性に基づき行われる。例えば、負電荷をもつアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸を含み、正電荷を持つアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、同様の疎水性数値を示し非電荷極性頭部基を持つアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
本発明は、例えば同種置換(塩基性と塩基性との置換、酸性と酸性との置換、極性と極性との置換など)ような、保存的置換(本明細書で使われている「置換」と「交換」はともに既存のアミノ酸残基と別の残基の相互交換を意味する)を含む。また、残基の1クラスから別のクラスへの置換、または非天然アミノ酸(オルニチン(以降Zとする)、ジアミノ酪酸オルニチン(以降Bとする)、ノルロイシンオルニチン(以降Oとする)、pyriylalanine、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、およびフェニルグリシンなど)の含有が関連する置換、といった、非保存的置換も含む。
起こり得る保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸群(アルギニン、リジン、ヒスチジン)、酸性アミノ酸群、(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、脂肪族アミノ酸群(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン)、極性アミノ酸群(グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン)、芳香族アミノ酸群(フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)、ヒドロキシル基を有するアミノ酸群(セリン、トレオニン)、大型アミノ酸群(フェニルアラニンおよびトリプトファン)、および小型アミノ酸群(グリシン、アラニン)の中で行われる。
交換もまた、非天然アミノ酸によって行われてもよい。上記非天然アミノ酸としては、アルファ*およびアルファ二置換型*アミノ酸、N−アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然アミノ酸のハライド誘導体(トリフルオロチロシン*、p−Cl−フェニルアラニン*、p−Br−フェニルアラニン*、p−I−フェニルアラニン*、L−アリル−グリシン*、β−アラニン*、L−α−アミノ酪酸*、L−γ−アミノ酪酸*、L−α−アミノイソ酪酸*、L−ε−アミノカプロン酸#、7−アミノヘプタン酸*、L−メチオニンスルフォン#*、L−ノルロイシン*、L−ノルバリン*、p−ニトロ−L−フェニルアラニン*、L−ヒドロキシプロリン#、L−チオプロリン*など)、フェニルアラニン(Phe)のメチル誘導体(4−メチル−Phe*、ペンタメチル−Phe*、L−Phe(4−アミノ)#、L−Tyr(メチル)*、L−Phe(4−イソプロピル)*、L−Tic(1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸)*、L−ジアミノプロピオン酸#およびL−Phe(4−ベンジル)*など)が含まれる。「*」という表記は、上記説明(相同性置換または非保存的置換に関連する)の目的で使用しており、誘導体の疎水性を示す。「#」という表記は誘導体の親水性を示すために使用している。「#*」という表記は両親媒性を示す。
変異型アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基、またはプロピル基のようなアルキル基を含む配列を有する任意の2つのアミノ酸残基の間に適切なスペーサー基を含んでもよい。1つまたはそれ以上のアミノ酸残基がペプトイド形態で存在する、さらなる変異形態については、当業者に十分に理解されるであろう。疑義を避けるために、上記「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基が、α−炭素ではなく、アミノ酸残基の窒素原子上に存在する、変異型アミノ酸残基を指すために用いている。ペプチドをペプトイド形態で作成する工程は、例えばSimon RJ et al. (1992)、Horwell DC (1995)のように、知られている技術である。
一実施形態において、本発明に係るホモ二量体タンパク質内で用いられている変異体標的ユニットは、Xcl1/Xcl2の配列を持ち、Xcl1/Xcl2の配列と少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも78%、少なくとも80%、すくなくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を持つ変異体である。一態様において、本発明で用いられているタンパク質または配列は精製されていることが好ましい。「変異体」はタンパク質、ポリペプチド、ユニット、モチーフ、ドメインまたは核酸を指す。
(実験)
以下の実施例は本発明の幾つかの好ましい実施形態および様態を立証し、さらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
〔実施例1〕
材料および方法
細胞株、ウイルス、および抗体
HEK293E株を用いて、HA−ワクチボディの発現と、Xcr1−eGFPのトランスフェクトを行った。Xcl1に対する抗体はLifespan Biosciences社(C−16241)から取得し、抗体α−HA(H−36−4−52)、α−ヒトIgG3(HP−6017)およびα−mCherryを実験室で精製した。ELISAに用いるための血清免疫グロブリンは、α−マウスIgG1−bio(BH Pharmingen社、クローン10.9)、α−マウスIgG2a−bio(BD Pharmingen社、クローン8.3)、α−マウスIgG2b−bio(BD Pharmingen社、クローンR12−3)を用いた。インフルエンザウイルス株A/PR/8/34(H1N1)はNorwegian Institute of Public Healthから取得した。
以下の実施例は本発明の幾つかの好ましい実施形態および様態を立証し、さらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではない。
〔実施例1〕
材料および方法
細胞株、ウイルス、および抗体
HEK293E株を用いて、HA−ワクチボディの発現と、Xcr1−eGFPのトランスフェクトを行った。Xcl1に対する抗体はLifespan Biosciences社(C−16241)から取得し、抗体α−HA(H−36−4−52)、α−ヒトIgG3(HP−6017)およびα−mCherryを実験室で精製した。ELISAに用いるための血清免疫グロブリンは、α−マウスIgG1−bio(BH Pharmingen社、クローン10.9)、α−マウスIgG2a−bio(BD Pharmingen社、クローン8.3)、α−マウスIgG2b−bio(BD Pharmingen社、クローンR12−3)を用いた。インフルエンザウイルス株A/PR/8/34(H1N1)はNorwegian Institute of Public Healthから取得した。
Xcl1−mCherryワクチボディの精製
Xcl1−mCherryまたはXcl1(C11A)−mCherryDNA40μgを含むPBS内で、2×107NS0細胞を電気穿孔して安定発現株を生成した。上記細胞を新鮮なRPMI培地に移し、T−25フラスコ内に入れ、セレクションを行わずに37℃で24時間静置して回復させた。翌日、最終濃度800μg/mlになるようG418を添加し、細胞を1ウェルあたり5×104の密度で96ウェルプレートに播種した。安定的にトランスフェクトされた細胞が2〜3週間後に得られた。続いて、得られた安定発現株をローラーボトルで増殖させ、5日後に上清を回収し、Aktaprime Plus(GE Healthcare社)に接続したα−mCherryカラムに導入した。結合ワクチボディをPBSで洗浄し、pH10.5の0.1Mグリシン−Hclに溶出させ、直ちにPBS透析した。
Xcl1−mCherryまたはXcl1(C11A)−mCherryDNA40μgを含むPBS内で、2×107NS0細胞を電気穿孔して安定発現株を生成した。上記細胞を新鮮なRPMI培地に移し、T−25フラスコ内に入れ、セレクションを行わずに37℃で24時間静置して回復させた。翌日、最終濃度800μg/mlになるようG418を添加し、細胞を1ウェルあたり5×104の密度で96ウェルプレートに播種した。安定的にトランスフェクトされた細胞が2〜3週間後に得られた。続いて、得られた安定発現株をローラーボトルで増殖させ、5日後に上清を回収し、Aktaprime Plus(GE Healthcare社)に接続したα−mCherryカラムに導入した。結合ワクチボディをPBSで洗浄し、pH10.5の0.1Mグリシン−Hclに溶出させ、直ちにPBS透析した。
ELISA
ELISA用96ウェルプレート(Coastar社)を不活化されたPR8インフルエンザウイルス(Supplier)2μg/mlでコーティングし、4℃で一晩(ON)インキュベートした。その後上記プレートをウェルあたり150μlのブロッキングバッファ(アジ化ナトリウム0.02%(w/v)含有PBSが1%(w/v)のBSAを含んだもの)で、室温(RT)にて1時間インキュベートした。上記プレートの洗浄後、血清サンプルを1:50の割合で希釈し、続いてELISAバッファ(アジ化ナトリウム0.02%(w/v)含有PBSが0.1%(w/v)のBSAを含んだもの)で1:3の割合で段階希釈した。ELISAプレートを血清サンプルとともに4℃で一晩培養した。次に、プレートを洗浄し、IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3に特異的なビオチン化抗体(BP Pharmingen社)1μg/mlを用いて、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、上記プレートをストレプトアビジン−ALP(GE Healthcare (RPN1234V)、1:3000)を用いて、室温(RT)にて45分インキュベートした。ウェルあたり100μlの基質バッファ(リン酸基質1μg/ml(Sigma社、P4744))を添加してELISAを展開した。30分後、Tecan社のSunriseでOD405が計測された。総血清免疫グロブリンを分析するために、プレートをALP結合抗マウスFc(Sigma社)(1:300)でインキュベートした。抗体力価は、NaClを投与されたマウスのOD値の(平均+5xSD)よりも大きいOD値を有する血清サンプルの最も高い希釈度として決定した。
ELISA用96ウェルプレート(Coastar社)を不活化されたPR8インフルエンザウイルス(Supplier)2μg/mlでコーティングし、4℃で一晩(ON)インキュベートした。その後上記プレートをウェルあたり150μlのブロッキングバッファ(アジ化ナトリウム0.02%(w/v)含有PBSが1%(w/v)のBSAを含んだもの)で、室温(RT)にて1時間インキュベートした。上記プレートの洗浄後、血清サンプルを1:50の割合で希釈し、続いてELISAバッファ(アジ化ナトリウム0.02%(w/v)含有PBSが0.1%(w/v)のBSAを含んだもの)で1:3の割合で段階希釈した。ELISAプレートを血清サンプルとともに4℃で一晩培養した。次に、プレートを洗浄し、IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3に特異的なビオチン化抗体(BP Pharmingen社)1μg/mlを用いて、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、上記プレートをストレプトアビジン−ALP(GE Healthcare (RPN1234V)、1:3000)を用いて、室温(RT)にて45分インキュベートした。ウェルあたり100μlの基質バッファ(リン酸基質1μg/ml(Sigma社、P4744))を添加してELISAを展開した。30分後、Tecan社のSunriseでOD405が計測された。総血清免疫グロブリンを分析するために、プレートをALP結合抗マウスFc(Sigma社)(1:300)でインキュベートした。抗体力価は、NaClを投与されたマウスのOD値の(平均+5xSD)よりも大きいOD値を有する血清サンプルの最も高い希釈度として決定した。
マウス
Deltagen社作製のXcr1tm1Dgenマウス(Xcr1−bGal)(6、10)を、Centre d’Immunologie Marseille-Luminy animal care facilitiesで飼育した。C57BL/6J Q:8マウスはCharles River Laboratories(フランス)から購入した。研究は、動物保護および使用に関する制度規則に則って行った。
Deltagen社作製のXcr1tm1Dgenマウス(Xcr1−bGal)(6、10)を、Centre d’Immunologie Marseille-Luminy animal care facilitiesで飼育した。C57BL/6J Q:8マウスはCharles River Laboratories(フランス)から購入した。研究は、動物保護および使用に関する制度規則に則って行った。
DC分離および分類方法
酵素消化、機械的な破壊、および濃度勾配濃縮(11)の組合せによって各種器官のDCを分離した。CLN DCの分類は先の説明のとおりに行った(12)。
酵素消化、機械的な破壊、および濃度勾配濃縮(11)の組合せによって各種器官のDCを分離した。CLN DCの分類は先の説明のとおりに行った(12)。
Abおよびフローサイトメトリー
Abの多くはeBioscience社かBD Biosciences社から購入した。mig−DCの同定は、上記mig−DCがCD11cおよびMHCクラスIIを発現するときの特定パターンに基づいて行った。ヤギ抗ニワトリIgGで明らかにされたニワトリ抗SynCAM/TSLC1 Ab(クローン3.E.1)を用いてCADM1染色を行った。b−ガラクトシダーゼ(bGal)の蛍光性基質としてフルオレセインdi−b−D−ガラクトピラノシドを用いて、XCR1の発現を検出した(6)。CLNにおいても、赤色蛍光タンパク質mCherryと共有結合した遺伝子組換え型マウスXCL1を用いて、XCR1の発現を検出した。
Abの多くはeBioscience社かBD Biosciences社から購入した。mig−DCの同定は、上記mig−DCがCD11cおよびMHCクラスIIを発現するときの特定パターンに基づいて行った。ヤギ抗ニワトリIgGで明らかにされたニワトリ抗SynCAM/TSLC1 Ab(クローン3.E.1)を用いてCADM1染色を行った。b−ガラクトシダーゼ(bGal)の蛍光性基質としてフルオレセインdi−b−D−ガラクトピラノシドを用いて、XCR1の発現を検出した(6)。CLNにおいても、赤色蛍光タンパク質mCherryと共有結合した遺伝子組換え型マウスXCL1を用いて、XCR1の発現を検出した。
結果
高レベルのXCR1が、皮膚のCD103+int−DCおよびCLNのCD103+mig−DCに選択的に発現した。
高レベルのXCR1が、皮膚のCD103+int−DCおよびCLNのCD103+mig−DCに選択的に発現した。
皮膚およびCLNでXCR1を発現しているのはどのDCサブセットかを調査するために、我々は、XCR1のかわりにb−ガラクトシダーゼ(bGal)を発現する、レポーター変異体マウスモデルを開発した。皮膚において、int−DCサブセットは、表皮LCと真皮サブセットCD103+ DC、CD1032 DC、CD11b+ DC、およびCD11bCD24 T1 DCを包含する(表I)。皮膚のint−DCでは、bGal活性はCD103+ DCでは高く、CD103 DCでは低く、CD11bCD24 DC、CD11b DC、およびLCにおいては検出されなかった(図2A、2B)。CLNにおいては、LT常在性CD8a+ DCおよびDC103+mig−DCのみがXCR1を発現した(図2C、2E)。CLN細胞染色を行うための蛍光標識された遺伝子組換え型マウスXCL1を利用することにより、野生型マウスからのLT常在性CD8a+ DCおよびCD103+mig−DCにおいて、強力かつ非常に特異的なシグナルを発した(図2D)。これらのデータにより、タンパク質XCR1はLT常在性CD8a+ DCおよびCD103+mig−DCに特異的に発現することが確認され、またbGal活性がXCR1の発現の忠実なレポーターとして使用されることが実証された。したがって、皮膚及びCLNにおいて、高レベルのXCR1はCD8a+−type DCに選択的に発現する。
XCR1の発現は内臓器官およびその流入領域LNにおけるCD8a+−タイプ DCを定義する
次に我々は、異なる組織に常在するDCにおけるXCR1の発現を分析した。皮膚およびCLNと同様、肝臓、肺、小腸において、3つの主要集団をそれぞれCD11b+ DC、CD103+ DC、およびCD103 DCとして定義した(表I)。これらの器官において、XCR1の発現は、皮膚において観察されたように、CD103+int−DCでは高く、CD103 int−DCでは中程度で、CD11b+ int−DCでは検出されなかった(図2G)。腸の腸間膜LN(MLN)および肺の縦隔LN(MedLN)流入領域からのmig−DCにおいて、XCR1の発現はCD103+サブセットにおいて最も高い状態を維持した(図2H)。内在性Gal活性阻害剤を用いたにもかかわらず腸内の上記CD103+ int−DCおよびMedLN内の上記CD103+ mig−DCは、野生型マウスにおいて、相当レベルのbGal活性を示した。しかし、そのバックグラウンドシグナル以上の明確な増加は、XCR1−bGalマウスから分離させた対応するサブセットにおいて検出されるかもしれない。LT常在性DCの中では、XCR1の発現は、CD8a+サブセット(図2I)に制限されていた。
次に我々は、異なる組織に常在するDCにおけるXCR1の発現を分析した。皮膚およびCLNと同様、肝臓、肺、小腸において、3つの主要集団をそれぞれCD11b+ DC、CD103+ DC、およびCD103 DCとして定義した(表I)。これらの器官において、XCR1の発現は、皮膚において観察されたように、CD103+int−DCでは高く、CD103 int−DCでは中程度で、CD11b+ int−DCでは検出されなかった(図2G)。腸の腸間膜LN(MLN)および肺の縦隔LN(MedLN)流入領域からのmig−DCにおいて、XCR1の発現はCD103+サブセットにおいて最も高い状態を維持した(図2H)。内在性Gal活性阻害剤を用いたにもかかわらず腸内の上記CD103+ int−DCおよびMedLN内の上記CD103+ mig−DCは、野生型マウスにおいて、相当レベルのbGal活性を示した。しかし、そのバックグラウンドシグナル以上の明確な増加は、XCR1−bGalマウスから分離させた対応するサブセットにおいて検出されるかもしれない。LT常在性DCの中では、XCR1の発現は、CD8a+サブセット(図2I)に制限されていた。
Xcr1を発現したDCを標的としたワクチボディを作成するため、我々は、Xcl1の内在性シグナルペプチドを、ワクチボディ遺伝子コンストラクトに本来含まれていたヒトIGg3の内在性シグナルペプチドと交換した。モデル抗原として、蛍光体に対する固有の能力によって、また我々の実験室で作成した特定の抗体(図3a)を介して検知できるmCherryを使用した。Xcl1−mCherryに加えて、Cys11をアラニンに変異させたC11A−mCherry変異型Xcl1を作製した。Cys48に加えてCys11は、Xcl1において唯一のシステイン架橋の形成にかかわっているため、変異体は機能を欠くと考えられてきた2。上記2つのワクチボディを、α−mCherryカラムで精製し、SDS−PAGEで大きさと二量体化を評価した。β−メルカプトエタノールの存在下では、上記2つのワクチボディの大きさは〜60kd、非還元の状態においては、上記大きさは〜148kdと、精製されたワクチボディは主に二量体から構成されることを示した(図3b)。標的ユニットの大きさが比較的小さいため、我々はまた、α−Xcl1が一次抗体として用いられたELISAアッセイのワクチボディに、Xcl1およびC11Aが存在することも確認した(図3C)。
Xcl1標的ワクチボディが、Xcr1を発現するとして知られるCD8α+ DC集団に結合したかどうかを評価するため、我々は脾臓からDCを分離し、分離したDCをXcl1−mCherryまたはC11A−mCherryと共にインキュベートした(図3d)。Xcl1−mCherryはCD8+ DCにのみ結合し、CD11b+ DCには結合しなかった。このことは、上記ワクチボディはXcr1+ DCを特異的に標的にするということを示す。この結合がXcr1に特異的であることを確実にするため、Xcr1−/−マウスからDCを分離し、Xcl1−およびC11A−mCherryで染色した(図3e)。Xcrl-/-マウスのDC集団には結合が認められなかった。このことはCD8α+ DCへの結合はXcr1によって仲介されていることを示す。Xcl1−mCherryとの結合に比べると大幅に少ないが、C11A−mCherryワクチボディとの結合がいくらか確認された。これは、システイン11のアラニンへの変異は、完全に結合を抑制するものではないということを示す。Xcr1−/−マウスにおいては上記C11A−mCherryの結合が喪失したため、結合はXcr1に特異的で、非特異的バックグラウンドではないようである。
次に、Balb/cマウスを、Xcl1−HAワクチボディをコードするDNA25μgで免疫化した。C11A−HAに加えて、追加的なコントロールとして、PR8HAのみを発現するプラスミドで免疫化したマウス群、NaCl0.9%で免疫化したマウス群、NIP−HA(ハプテンNIPに特異的なscFv)で免疫化したマウス群をそれぞれ1群ずつ含んだ。免疫化から14日後に血清サンプルを回収し、最初にHA特異的血清IgG(図4a)を分析した。Xcl1−HAで免疫化されたマウスにおいて、IgGが最も強く誘導されていることが認められた。興味深いことに、IgGサブクラス応答の分析時に、Xcl1−HAは主にIgG2aを誘導し、しかもこれらのレベルは他のどの群よりも非常に高いものであることを確認した(図4b)。これは標的ワクチボディで免疫化されたマウスと、非標的ワクチボディで免疫化されたマウスで比較したIgG1のレベルとは対照的なものである(図4b)。経時的な液性応答の観察時、我々はIgG2aの力価が免疫化後7〜10週あたりでピークを示し、続いて約15週後の安定的レベルに達するまで減少することを確認した(図4c)。IgG1については、免疫化後10週まで非標的ワクチボディ(NIP−HAおよびC11A−HA)にて力価の増加が認められた(図4d)。これは第3週後にIgG1の力価の増加がまったく認められなかったXcl1−HAワクチボディと対照的である。
Xcrl発現細胞に対する抗原のターゲティングの効力を評価するために、我々は、Xcl1−HA DNAの量を減少させてBalb/cマウスを免疫化した。免疫化から2週間後に血清サンプルを回収し、IgG1およびIgG2a同様、総IgGを分析した。DNA0.46μgおよび1.39μgで免疫化したマウスでは最小限のIgG2a応答しか確認できなかったのに対し、DNA4.16μgを投与されたマウスの血清では中程度のIgG2aが確認された(図4e)。
クロスプライミングを行うXcr1+ DCサブセットへの抗原のターゲティングは、CD8+T細胞を誘導すると考えられてきた。これを試験するために、我々はXcl1−HAでマウスを免疫化し、免疫化から14日後に流入領域リンパ節(鼠蹊部および予備(auxiliary))を回収し、HA特異的CD8+T細胞を確認するために、IYSTVASSLペンタマーを用いて分離した細胞を染色した(図5a)。Xcl1−HAワクチボディとともに得られたCD8+陽性T細胞のペンタマーの割合と、非標的コントロール(NIP−HAまたはC11A−HA)から得られたCD8+陽性T細胞のペンタマーの割合を比較した際、我々は、HA特異的CD8+T細胞が、Xcl1標的ワクチボディに対して非常に高い数値を示すことを確認した(Mann-Whitney)(図5b)。
クロスプライミングを行うXcr1+ DCサブセットへの抗原のターゲティングは、CD8+T細胞を誘導すると考えられてきた。これを試験するために、我々はXcl1−HAでマウスを免疫化し、免疫化から14日後に流入領域リンパ節(鼠蹊部および予備(auxiliary))を回収し、HA特異的CD8+T細胞を確認するために、IYSTVASSLペンタマーを用いて分離した細胞を染色した(図5a)。Xcl1−HAワクチボディとともに得られたCD8+陽性T細胞のペンタマーの割合と、非標的コントロール(NIP−HAまたはC11A−HA)から得られたCD8+陽性T細胞のペンタマーの割合を比較した際、我々は、HA特異的CD8+T細胞が、Xcl1標的ワクチボディに対して非常に高い数値を示すことを確認した(Mann-Whitney)(図5b)。
次に、我々はXcr1を発現したDCに対する抗原のターゲティングによって誘導された免疫応答がインフルエンザ感染からマウスを保護するのに十分かどうかを評価することにした。Balb/cマウスをDNA25μgで免疫化し、免疫化から14日後に致命量の5倍のインフルエンザウイルスA/PR/8/34(H1N1)を感染させた。疾病の進行の徴候として、体重の減少を観察した。Xcl1−HAを投与されたマウスは、はじめは体重の減少がみられたがウイルス感染から4日後に回復した(図6a)。HAのみ投与されたマウスは防御反応が誘導されず、7日目に実験が終了するまで体重の減少を続けた。コントロールを含め、マウスの個体ごとにウイルス感染から7日目のデータを評価した際、非標的ワクチン(HA、NIP−HAおよびC11A−HA)を投与されたマウスとXcl1−HAを投与されたマウスとの比較において体重に大きな違いを認めた(Mann-Whitney)(図6b)。
DNAワクチン投与技術をより大型の動物に移転する際の一つの潜在的な障害としては、動物の大きさに応じて防御を誘導するために必要なDNAの量が増加するということである。したがって、ワクチンが比較的低濃度で防御を誘導できることが好ましい。Xcr1を発現したCD8α+ DCへのワクチボディのターゲティングの有効性を評価するために、免疫化から2週間後にPR8を感染させる前に、マウスに投与したDNAの量をタイトレーションした。マウスは計4.16μgのXcl1−Ha DNA(図6c)で免疫化されて以降、一貫して防護された。これは、血清IgGの力価によって決定された、一貫した免疫応答を誘導するために必要なDNAの量と十分に相関するものである(図6c)。
Xcl1−HAワクチボディが長期間にわたる保護を誘導する能力があるかどうかを判断するために、我々は、免疫化から26週間後に、PR8をマウスに感染させ、体重減少を観察した(図6d)。Hcl1−HAで免疫化されたマウスには、初めに体重減少がみられたが、マウス5匹中1匹を除くすべてのマウスが6日目以降回復し始めた。反対に、NaClで免疫化されたマウスには継続して体重の減少がみられ、9日目までには6匹中4匹のマウスを安楽死させる必要があった。変異型Cl1A−HAで免疫化したマウスは、総じてより多くの体重減少がみられたが、感染から6日後回復し始めた。
〔実施例2〕
標的ユニットとしてXcl2をXcl1に置換した以外は、上記の説明と同様にワクチボディを産生した。
〔実施例2〕
標的ユニットとしてXcl2をXcl1に置換した以外は、上記の説明と同様にワクチボディを産生した。
HEK293E細胞に対し、ネズミ科Xcl1−HA(mXcl1)、ヒトXcl1−HA(hXcl1)もしくはヒトXcl1−Ha(hXcl2)ワクチボディをコードするプラスミドを用いて、一過性のトランスフェクトを行った。48時間後上清を回収し、ELISAによってワクチボディの分泌を分析した。これら3つのワクチボディは、すべて効率的に発現、分泌し、hXcl1およびhXcl2がmXcl1よりも良好に発現した。結果を図8に示す。次に、mXcl1、hXcl1もしくはhXcl2−HAワクチボディをコードするDNA25μgでBalb/cマウスを免疫化した。免疫化から14日後に血液サンプルを回収し、ELISAによって、IgG1およびIgG2aの血清の力価が決定された。hXcl1およびhXcl2の双方が、mXcl1よりも高いIgG1応答およびIgG2応答を誘導した。結果を図9aおよび図9bに示す。その後、mXcl1、hXcl1もしくはhXcl2−HAワクチボディをコードするDNA25μgでBalb/cマウスを免疫化し、ワクチン投与から14日後に致死量のインフルエンザウイルスを感染させた。結果を図10(a)に示す。図10(a)は7日間にわたる体重減少の観察結果であり疾病の進行の徴候として用いられる。NaClもしくはHAのみの投与を受けたマウスは感染により死亡したが、mXcl1、hXcl1もしくはhXcl2を投与されたマウスは生き残った。図10(b)は感染から7日後のすべてのマウスの体重低下を示したものである。
(参考文献)
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本明細書は上記の明細書に言及されているすべての出版物および特許を参照により含む。記載されている発明の方法およびシステムに対する種々の変更および変形例は、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者にとって明らかなものである。本発明は特定の好ましい実施形態について記載しているが、特許請求を行う発明がそのような特定の好ましい実施形態に不当に限定されるものではないことは理解されるべきである。さらに、発明を行うために記載された様式に対する種々の変更であって、当業者にとって明らかな変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
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12. Henri, S., L. F. Poulin, S. Tamoutounour, L. Ardouin, M. Guilliams, B. de Bovis, E. Devilard, C. Viret, H. Azukizawa, A. Kissenpfennig, and B. Malissen. 2010. CD207+CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J. Exp. Med. 207: 189-206.
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16. Galibert, L., G. S. Diemer, Z. Liu, R. S. Johnson, J. L. Smith, T. Walzer, M. R. Comeau, C. T. Rauch, M. F. Wolfson, R. A. Sorensen, et al. 2005. Nectinlike protein 2 defines a subset of T-cell zone dendritic cells and is a ligand for class-Irestricted T-cell-associated molecule. J. Biol. Chem. 280: 21955-21964.
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19. Ziegler-Heitbrock, L., P. Ancuta, S. Crowe, M. Dalod, V. Grau, D. N. Hart, P. J. Leenen, Y. J. Liu, G. MacPherson, G. J. Randolph, et al. 2010. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood 116: e74-e80.
本明細書は上記の明細書に言及されているすべての出版物および特許を参照により含む。記載されている発明の方法およびシステムに対する種々の変更および変形例は、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者にとって明らかなものである。本発明は特定の好ましい実施形態について記載しているが、特許請求を行う発明がそのような特定の好ましい実施形態に不当に限定されるものではないことは理解されるべきである。さらに、発明を行うために記載された様式に対する種々の変更であって、当業者にとって明らかな変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
Claims (14)
- 配列番号1、2、または3と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列と、抗原性ユニットと、を含む標的ユニットを含むことを特徴とする、融合ポリペプチド。
- 上記標的ユニットと、上記抗原性ユニットとが二量体化モチーフを介して結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 上記抗原性ユニットは、抗原性scFv、細菌性抗原、ウイルス性抗原、およびがん関連抗原もしくはがん特異性抗原からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の融合ポリペプチド。
- 上記標的ユニットが配列番号1、2、または3と、少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記標的ユニットが配列番号1、2、または3と、少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記標的ユニットが、配列番号1、2、または3のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記ポリペプチドが二量体として提供されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記二量体ドメインが、ヒトIgG3二量体ドメイン(hCH3)を含むことを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 上記融合ポリペプチドが、クロスプレゼンテーションを行うDC上のXcr1と結合することを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の上記融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 上記融合ポリペプチドまたは請求項1から9のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とするワクチン。
- 上記ワクチンは、薬学的に許容できるキャリアをさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載のワクチン。
- 被験体が上記抗原に対して免疫応答を作製する条件下、請求項11から12のいずれか1項に記載のワクチン組成物を上記被験体に投与する工程を含む、免疫応答の誘導方法。
- 被験体内に免疫応答を産生するための、請求項1から9に記載の融合タンパク質、または請求項11から12に記載のワクチンの、使用。
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