KR20240007235A - 관용-유도 컨스트럭트 및 조성물 및 면역 장애의 치료를 위한 그들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 질환의 치료, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 컨스트럭트 및 조성물에 관한 것이다.

Description

관용-유도 컨스트럭트 및 조성물 및 면역 장애의 치료를 위한 그들의 용도
본 발명은 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 질환의 치료, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 컨스트럭트 및 조성물에 관한 것이다.
면역 반응은 질병, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 기생충과 같은 병원체에 의해 유발되는 질병으로부터 보호하기 위해 필요하다. 그러나 바람직하지 않은 면역 활성화는 자신의 조직을 손상시키거나 파괴하는 과정을 유발할 수 있다. 예를 들어, 항체 및/또는 T 림프구가 자기 항원과 반응하여 예컨대 조직 손상과 병리를 초래하는 자가면역 질환에서 바람직하지 않은 면역 활성화가 발생한다. 바람직하지 않은 면역 활성화는 알레르기 반응에서도 발생하는데, 이는 일반적으로 환경의 무해한 물질에 대한 과장된 면역 반응을 특징으로 하며 조직 파괴로 이어지는 염증 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 이식 거부반응, 예를 들어, 기증자 동종항원 또는 이종항원을 인식하고 이식된 장기 또는 조직의 파괴를 초래하는 숙주에 존재하는 동종반응성 T 세포에 의해 주요하게 매개되는 이식된 장기 또는 조직의 거부 반응에서 바람직하지 않은 면역 활성화가 발생한다.
면역 관용은 주어진 유기체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진 물질이나 조직에 대한 특정 면역 반응이 후천적으로 부족한 것이다.
일반적으로 특정 항원에 대한 내성을 유도하려면, 활성화 신호가 없는 상태에서 항원-제시 세포 (APC)에 의해 다른 면역 세포에 항원이 제시되어야 하며, 이로 인해 항원-특이적 림프구의 사멸 또는 기능적으로 비활성화되거나 내성을 유지하는 항원-특이적 세포가 생성된다. 이 과정은 일반적으로 자기 항원에 대한 관용 또는 자기-관용을 설명한다. 면역억제제는 바람직하지 않은 면역 반응 (예: 자가면역 질환 또는 동종 이식 환자의 치료)을 예방하거나 감소시키는 데 유용하다.
원치 않는 면역 반응의 면역억제를 생성하기 위한 기존 전략은 광범위하게 작용하는 면역억제제를 기반으로 한다. 또한, 면역억제를 유지하기 위해, 면역억제제 치료는 평생 동안 지속되는 경우가 많다. 불행하게도 광범위하게 작용하는 면역억제제의 사용은 예를 들어 이들 대부분이 비선택적으로 작용하여 감염에 대한 감수성을 증가시키고 암 면역감시를 감소시키기 때문에 면역결핍과 같은 심각한 부작용의 위험과 관련이 있다. 따라서, 항원-특이적 관용을 유도하는 새로운 화합물 및 조성물이 유익할 것이다.
수지상 세포와 같은 APC는 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 수지상 세포의 활성화 상태와 미세 환경(사이토카인 및 성장 인자)에 따라 항원-특이적 T 세포에 신호를 보내 제시된 항원 (병원체로 추정)과 싸우거나 제시된 항원 (비-병원성 항원으로 추정)에 대한 반응을 침묵시키고 말초 관용을 유도한다. 관용성 면역 치료법을 개발하는 과제는염증성 면역 반응과 같은 염증 또는 면역 반응을 유발하지 않는 방식으로 항원을 수지상 세포와 같은 APC에 효율적으로 전달하는 것이다.
과학 논문 “Schjetne K W et al., Eur. J. Immunol. 35(11), 3142-3152, 2005”에는 "트로이바디(Troybodies)"로 지칭되는 재조합 항체 컨스트럭트가 개시된다. 이러한 트로이바디는 APC 표면 분자에 특이적인 V 영역과 C 도메인의 β-가닥 사이의 루프에 이식된 T 세포 에피토프를 갖는 재조합 항체이다.
요약
본 발명은 항원 유닛 및 염증성 활성화와 같은 활성화 없이 항원 제시를 리드 하는 비-염증성 또는 관용성 방식으로 수지상 세포와 같은 APC 상의 표면 분자와 상호작용하는 표적화 유닛을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트에 관한 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 백시바디 (Vaccibody) 플랫폼이 조절 T 세포 (Treg)의 유도 및 기억 및 효과 T 세포 반응의 억제와 같은 내성 유도 방법으로 구조물을 내재화하고 항원을 제시하는 APC 상의 선택된 표면 수용체에 결합하고 이를 통한 신호전달을 통해, 선택된 항원-특이적 내성 반응을 유도하는 최적의 방법으로 질병-관련 항원을 항원-제시 세포 (APC)에 전달 할 수 있다는 것을 발견했다.
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 Schjetne K W et al., Eur. J. Immunol. 35(11), 3142-3152, 2005에 개시된 삼량체와 같은 공지된 컨스트럭트와 비교해서 개선된 유연성을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 개시된 컨스트럭트의 표적화 유닛는 항체-유래 V 영역에 한정되지 않고, 매우 다양한 상이한 유닛일 수 있다.
공지된 구성물과 비교하여 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트의 추가 이점은 더 적은 용량, 예를 들어 1회 용량으로도 동일한 기능적 효과에 도달하기에 충분할 수 있다는 점일 수 있다. 예를 들어, 1회 용량과 같은 더 적은 용량으로도 면역 반응 수준을 낮추고, 면역 반응의 시작 또는 진행을 지연시키고/시키거나 면역 반응의 시작 또는 진행 위험을 감소시키는데 충분할 수 있다.
상기 백시바디 컨스트럭트는 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예를 들어 각각이 항원-제시세포를 표적화하는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 두 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질이다. - 예를 들어 WO 2004/076489 A1, WO 2011/161244 A1, WO 2013/092875 A1 또는 WO 2017/118695 A1을 보라. 이러한 컨스트럭트는 항원 또는 항원 유닛에 포함된 에피토프에 대해 면역 반응을 생성하는데 효과적인 것으로 나타났다.
상기 백시바디 또는 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예: DNA 플라스미드) 의 형태로 대상체에 투여될 수 있다. 숙주 세포 (예: 인간의 근육 세포)에 투여한 후, 상기 폴리펩티드가 발현되고 다량체화 유닛에 의해 다량체 단백질을 형성하며; 이량체화 유닛이 사용될 때는 상기 폴리펩티드가 발현될 때 이량체 단백질을 형성한다.
본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응과 같은 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 백시바디 구조에 기초한 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다.
상기 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 자기-항원, 알레르겐 또는 동종항원/이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛, 다량체화 유닛 (예: 이량체화 유닛), 및 APC를 표적화하는 표적화 유닛을 포함한다. 상기 표적화 유닛은 상기 컨스트럭트가 내재화되고 상기 항원 유닛의 에피토프가 관용-유도 방식으로 제시되는 방법으로 APC 상의 표면 분자와 상호작용 한다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
i) 항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다중 폴리펩티드, 예컨대 두 개의 폴리펩티드로 구성된, 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
(ii)에 정의된 다중 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
(ii)에 정의된 두 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 두 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 관용-유도 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 정의된 이량체 단백질과 같은 다량체를 포함하는 본 명세서에 정의된 약학적 조성물을 제조하는 방법, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염 시키는 것;
b) 상기 세포를 배양하는 것;
c) 상기 세포로부터 발현된 이량체 단백질과 같은 다량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 것; 및
d) 단계 c)로부터 얻어진 이량체 단백질과 같은 다량체 단백질, 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 명세서에 정의된 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 것;
b) 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 클로닝 하는 것; 및
c) 단계 a)로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드 또는 단계 b)로부터 얻어진 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 정의된 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 약학적 조성물을 제공한다.
상세한 설명
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
i) 항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
i) 항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 제공한다:
i) 항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
이러한 컨스트럭트는 일단 대상체에 투여되면, 관용-유도 방식으로 항원 유닛의 에피토프가 제시될 수 있게하므로 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부와 같은 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료로서 사용하기에 적합하다.
관용-유도 컨스트럭트는 문제의 면역 질환을 일으키는 면역계의 질병-특이적 세포의 하향 조절을 유발하므로 일반적인 면역 체계를 억제하지 않는다. 따라서, 본 발명의 컨스트럭트를 이용한 문제의 면역 질환의 치료는 감염에 대한 감수성의 증가 및 암 면역감시의 감소를 초래하지 않을 것이다. 그러나 유도된 항원- 특이적 조절 세포와의 세포 간 접촉에 의해 단기간 억제 사이토카인이 방출되기 때문에, 관련 질병 항원에 특이적인 면역 세포의 방관자 억제가 예상된다.
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 본 발명의 컨스트럭트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물의 형태로, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부와 같은 면역질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위해 투여될 수 있다.
“뉴클레오티드 서열”은 뉴클레오티드로 구성되는 서열이다. 상기 용어 “뉴클레오티드 서열” 및 “핵산 서열”은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
“관용-유도 컨스트럭트”는 예를 들어 염증성 면역 반응과 같은 면역 반응을 유발하지 않지만, 대상체에게 투여에 적합한 형태로 그리고 관용을 유도하는데 유효한 양 (즉, 유효량)으로 투여될 때 항원 유닛에 포함된 T 세포 에피토프에 대한 관용을 유도하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "관용"은 염증성 면역 반응과 같은 면역 반응의 감소된 수준, 염증성 면역 반응과 같은 면역 반응의 개시 또는 진행의 지연, 및/또는 염증성 면역 반응과 같은 면역 반응의 시작 또는 진행의 위험 감소를 의미한다..
"대상체"는 동물 또는 인간이다. 대상체는 환자, 즉, 자가면역 질환, 알레르기 또는 이식 거부와 같은 면역 질환으로부터 고통을 받는 치료가 필요한 사람이다. 상기 용어 "대상체" 및 "개인"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"질병"은 질병에 의해 영향을 받고 있는 대상체에서 일반적으로 특정 징후 및 증상과 관련된 비정상적인 의학적 상태이다.
본원에 사용된 "면역 질환"은 자가면역 질환, 알레르기 또는 이식 거부, 즉 동종이식 또는 이종 이식의 거부 (예커대 숙주에게 이식된 동일한 종 (동종) 또는 다른 종 (이종)의 다수의 세포, 조직 또는 기관에 의한 거부)를 포함하는 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 장애 또는 질환을 의미한다.
본 원에서 사용된 용어 "동종항원" 또는 "동종이식 항원"은 기증자로부터 수혜자에게 전달될 때, 수혜자의 B 또는 T-세포 수용체의 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 세포 또는 조직에서 유래된 (떨어져 나온 및/또는 존재하는) 항원을 의미한다. 동종항원은 일반적으로 다형성 유전자의 산물이다. 동종항원은 기증자와 수혜자 (동일한 종에 속함)를 비교할 때, 약간의 구조적 차이를 보이는 단백질 또는 펩티드이다. 수혜자의 신체에 이러한 기증자 항원이 존재하면 수혜자에게서 면역 반응이 유발될 수 있다. 이러한 동종반응성 면역반응은 동종항원에 특이적이다.
본 원에서 사용된 용어 “쥣과” 및 “마우스”는 마우스로부터 유래된 물질, 예를 들어 펩티드, 단백질, 핵산 등을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 원에서 사용된 용어 “이종항원”은 이동의 개인에게서 유래된 항원을 의미한다.
"치료 (treatment)”는 예방적 (prophylactic) 치료 또는 치료적(therapeutic) 치료 이다.
"예방적 치료"는 면역 질환의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 초기 징후 또는 증상만 나타내는 대상체에게 투여되는 치료로서, 치료는 질병의 발행 위험을 예방하거나 적어도 감소시킬 목적으로 투여된다. 예방적 치료는 면역 질환에 대한 예방적 치료로서, 또는 면역 질환 및/또는 이와 관련된 증상의 추가 발생 또는 강화를 억제하거나 감소시키는 치료로서 기능한다. 용어 "예방적 치료 (prophylactic treatment)", "프로필락스 (prophylaxis)" 및 "예방 (prevention)"는 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"치료적 치료"는 면역 질환의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료로서, 이러한 징후 또는 증상을 감소 또는 제거할 목적으로 및/또는 질병 진행을 지연시키거나 멈추는 것을 목적으로 대상체에 투여하는 치료이다.
"일부"는 항원의 부분 또는 단편, 즉 항원의 아미노산 서열 또는 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편, 예를 들어 에피토프를 의미하며; 바람직하게는, 항원의 부분 또는 단편은 면역원성 (immunogenic)이다. 이 용어는 전체에 걸쳐 상호 교환적으로 사용될 것 이다.
본 원에서 사용된 “T 세포 에피토프”는 단일 T 세포 에피토프 또는 다수의 T 세포 에피토프를 함유하는 항원의 일부 또는 영역, 예를 들어 다수의 최소 에피토프 (multiple minimal epitope)를 의미한다.
상기 용어 “백신접종 (vaccination)” 및 “투여 (administration)”는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
상기 용어 “최소 에피토프”는 MHC I 또는 MHC II에 결합하는 것으로 예측되는 에피토프의 부분 서열 (subsequence)을 의미한다. 다시 말해, 상기 최소 에피토프는 면역원성 일 수 있고, 즉, 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 용어 최소 에피토프는 따라서 MHC I 또는 MHC II에 결합하는 것으로 예측되는 에피토프의 짧은 부분 서열을 의미할 수 있다. 27-mer 에피토프는 따라서 여러 개의 최소 에피토프를 포함할 수 있고, 이는 27 개의 아미노산 보다 더 짧은 길이를 가질 수 있고, 각각 면역원성이다. 예를 들어, 최소 에피토프는 MHC I 또는 MHC II에 결합할 것으로 예상되는 경우, 에피토프의 처음 14 개 아미노산으로 구성될 수 있거나, MHC I 또는 MHC II에 결합할 것으로 예상되는 경우, 에피토프의 9 내지 18 개 아미노산 또는 7 내지 22 아미노산으로 구성될 수 있다.
여기에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
관용-유도 컨스트럭트
도 1 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트의 예를 보여준다. 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 N-말단 시작 및 C-말단 끝을 가지는 폴리펩티드로 기술될 수 있다(도 1에 게시됨). 폴리펩티드의 요소 -표적화 유닛 (TU), 이량체화 유닛 (DimU) 및 항원 유닛- 는 항원 유닛이 폴리펩티드의 C-말단 끝 (도 1a) 또는 폴리펩티드의 N-말단 시작 (도 1b)에 위치하도록 폴리펩티드에 배열될 수 있다. 바람직하게는, 항원 유닛은 폴리펩티드의 C-말단 끝에 위치한다.
항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프(들)를 포함하며, 다수의 T 세포 에피토프가 존재하는 경우 하나 이상의 T 세포 에피토프 링커(TL)를 포함할 수 있다.유닛 라이너(UL)는 이량체화 유닛과 항원 유닛을 연결할 수 있다. 도 1은 TL로 분리된 2 개의 T 세포 에피토프 (T1, T2)를 갖는 항원 유닛을 보여준다. 위에서 설명한 유닛과 요소의 순서와 방향은 /이량체 단백질과 폴리뉴클레오티드에서 동일하다.
다음에서, 컨스트럭트의 다양한 유닛이 상세하게 설명될 것이다. 이들 유닛은 유닛을 인코딩하는 핵산 서열로서 폴리뉴클레오티드에 존재하는 반면, 이들 유닛은 폴리펩티드, 다량체 단백질 또는 이량체 단백질에서 아미노산 서열로서 존재한다. 쉽게 읽기 위해, 이하에서 컨스트럭트의 유닛은 주로 폴리펩티드, 다량체 단백질 또는 이량체 단백질과 관련하여, 즉 아미노산 서열을 기준으로 설명된다.
표적화 유닛
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 항원-제시세포 (APC)를 표적화하는 표적화 유닛을 포함한다.
본원에서 사용된 상기 용어 "표적화 유닛"은 세포를 활성화 하지 않고 및/또는 세포의 성숙을 유도하지 않고, 본 발명의 컨스트럭트를 APC에 전달하고 APC 상의 표면 분자와 상호작용하는, 예를 들어 APC의 표면 수용체에 결합하는 유닛을 의미한다. APC는 구조물을 내재화하고 항원 유닛에 포함된 T 세포 에피토프를 항염증성, 관용원성 방식으로, 예를 들어, 공동 자극 신호를 상향 조절하지 않고/않거나 저해 표면 수용체 및/또는 저해 사이토카인 분비를 상향 조절하는 방식으로 이의 표면 상의 MHC 상에 제시한다.
일부 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 TGFβ 수용체 (예컨대 TGFβR1, TGFβR2, 또는 TGFβR3), IL10R (예컨대 IL-10RA 및 IL10-RB), IL2R, IL4R, IL6R, IL11R 및 IL13R, IL27R, IL35R, IL37R, GM-CSFR, FLT3, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, CD83, SIGLEC, MGL/Clec10A, ASGR (ASGR1/ASGR2), CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, 랑게린 (Langerin), MR, DC-Sign, Treml4, 덱틴-1 (Dectin-1), PDL1, PDL2, HVEM, CD163 및 CD141로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체에 결합하는 모이어티를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 hTGFβ 수용체 (예컨대 hTGFβR1, hTGFβR2, 또는 hTGFβR3), hIL10R (예컨대 hIL-10RA 및 hIL10-RB, hIL2R, hIL4R, hIL6R, hIL11R 및 hIL13R, hIL27R, hIL35R, hIL37R, hGM-CSFR, hFLT3, hCCR7, hCD11b, hCD11c, hCD103, hCD14, hCD36, hCD205, hCD109, hVISTA, hMARCO, hMHCII, hCD83, hSIGLEC, hMGL/hClec10A, hASGR (hASGR1/hASGR2), hCD80, hCD86, hClec9A, hClec12A, hClec12B, hDCIR2, h랑게린 (Langerin), hMR, hDC-Sign, hTreml4, h덱틴-1 (hDectin-1), hPDL1, hPDL2, hHVEM, hCD163 및 hCD141으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 (h) 수용체에 결합하는 모이어티를 포함하거나 이로 구성된다.
상기 모이어티는 천연 리간드, 항체 또는 이의 일부, 예를 들어 scFv, 또는 합성 리간드 일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 모이어티는 앞서 언급된 수용체 중 임의의 것에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 이의 일부, 예를 들어 scFv이고, 수용체에 결합하면 항원 및/또는 T 세포 에피토프가 항-염증성, 관용원성 방식으로 제시된다.
다른 실시 양태에서, 상기 모이어티는 앞서 언급한 수용체 중 임의의 것에 대해 특이성을 갖는 합성 리간드이며, 여기서 수용체에 결합하면 항원 및/또는 T 세포 에피토프가 항-염증성, 관용원성 방식으로 제시된다. 단백질 모델링은 이러한 합성 리간드를 설계하는 데 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 상기 모이어티는 천연 리간드이다.
일부 실시 양태에서, 천연 리간드는 TGFβ (예컨대 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3), IL-10, IL2, IL4, IL6, IL11, IL13, IL27, IL35, IL37, GM-CSF, FLT3L, CCL19, CCL21, ICAM-1 (또한 CD54로 알려진 세포간 부착 분자 1), 케라틴, VSIG-3, SCGB3A2, CTLA-4, 바람직하게 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1, 바람직하게 PD-1의 세포외 도메인 및 BTLA, 바람직하게 BTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 IL2, 바람직하게 인간 IL2이거나 이를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL2의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 33와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 IL-10 또는 TGFβ, 바람직하게 인간 IL-10 또는 인간 TGFβ (그의 동형단백질 TGFβ-1, TGFβ-2 및 TGFβ-3를 포함)이거나 이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 205-207 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 205-207 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 TGFβ의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 205-207로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 아미노산 서열, 또는 인간 TGFβ를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 208-210로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 TGFβ의 그것, 예컨대 SEQ ID NO: 177에 제시된 바와 같은 쥣과의 TGFβ와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 이에 대해 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 상기 표적화 유닛은 최대 22개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 IL-10의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열, 또는 인간 IL-10을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 212의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 IL-10과, 예컨대 SEQ ID NO: 169에 제시된 바와 같은 쥣과의 IL-10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 SCGB3A2 또는 VSIG-3, 바람직하게 인간 VSIG-3 또는 인간 SCGB3A2 이거나 이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 213과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 213과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 SCGB3A2의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 213의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2의 아미노산 서열, 또는 인간 SCGB3A2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO: 214의 뉴클레오티드 서열를 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 SCGB3A2와, 예컨대 SEQ ID NO: 171에 제시된 바와 같은 쥣과의 SCGB3A2와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 215에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 215와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 VSIG-3의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 215의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3의 아미노산 서열, 또는 인간 VSIG-3를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 216의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 VSIG-3의 그것, 예컨대 SEQ ID NO: 173에 제시된 바와 같은 쥣과의 VSIG-3과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 CD205에 특이성을 갖는 항체 또는 그 일부 (예: scFv), 예를 들어 인간 또는 쥣과의 CD205 또는 scFv 항-DEC205에 특이성을 갖는 scFv 이거나 이를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 쥣과의 CD205에 대해 특이성을 갖는 scFv는 SEQ ID NO: 49를 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛 인간 CTLA4의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 217에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 CTLA4의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 217과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 CTLA4의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 217의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 CTLA4의 아미노산 서열, 또는 인간 CTLA4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 CTLA4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 218의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 CTLA4의 그것, 예컨대 SEQ ID NO: 175에 제시된 바와 같은 쥣과의 CTLA4와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 PD-1의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 219에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 PD-1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 219와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 PD-1의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 219의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 PD-1의 아미노산 서열, 또는 인간 PD-1를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 PD-1를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 220의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 쥣과의 PD-1의 그것, 예컨대 SEQ ID NO: 179에 제시된 바와 같은 쥣과의 PD-1과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 그것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, 인간 IL-10의 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열, 또는 인간 IL-10를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 212의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
항원 유닛
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트의 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
항원 유닛에 포함되기에 적합한 T 세포 에피토프는 당업계에 공지되어 있을 수 있다. 즉, 특정 면역 질환에 연관되고 관련성이 있는 것으로 연구, 제안 및/또는 검증되었으며 문헌에 공개되었다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 자기-항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉, 자기-항원의 하나의 T 세포 에피토프 또는 자기-항원의 하나 보다 더 많은 T 세포 에피토프, 즉, 자기-항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 자기-항원, 즉, 동일한 자기-항원에 포함된다. 다른 실시 양태에서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 상이한 자기-항원, 즉, 상이한 자기-항원에 포함된다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 예를 들어 T reg 에피토프 또는 억제성 신생항원(inhibitory neoantigen)와 같은 자기-항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우, 항원 유닛은 T 세포 에피토프를 분리하는 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 T 세포 에피토프는 바람직하게 링커에 의해 분리된다. 또 다른 실시 양태에서, 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하며, 여기서 각 T 세포 에피토프는 링커에 의해 다른 T 세포 에피토프로부터 분리된다. 링커에 의한 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 각 T 세포 에피토프를 다른 T 세포 에피토프로부터 분리하는 것을 설명하는 대안적인 방법은 말단 T 세포 에피토프를 제외한 모든 에피토프, 즉, 폴리펩티드의 N-말단 시작 부분 또는 폴리펩티드의 C-말단 끝(즉, 이량체화 유닛에 연결되지 않은 항원 유닛의 말단에 위치함)에 있는 T 세포 에피토프가 서브유닛에 배열되며, 여기서 각 서브유닛은 본 명세서에 기술된 T 세포 에피토프 및 링커를 포함하거나 그로 구성된다.
따라서, n개의 항원을 포함하는 항원 유닛은 n-1개의 서브유닛을 포함하며, 여기서 각 서브유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 T 세포 에피토프, 및 링커를 포함하며, 그리고 말단 T 세포 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, n은 1 내지 50의 정수, 예를 들어 1 내지 50, 예컨대 3 내지 50 또는 15 내지 40 또는 10 내지 30 또는 10 내지 25 또는 10 내지 20 또는 15 내지 30 또는 15 내지 25 또는 15 내지 20 이다.
항원 유닛의 링커는 그 안에 포함된 항원, 예컨대 에피토프를 분리한다. 전술한 바와 같이, 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 모든 T 세포 에피토프는 링커에 의해 서로 분리되어 서브유닛으로 배열될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 링커는 비-면역원성이 되도록 설계된다. 이는 단단한(rigid) 링커일 수 있으며, 이는, 상기 링커가 연결하는 두 개의 아미노산 서열이 서로에 대해 실질적으로 자유롭게 움직이는 것을 허용하지 않음을 의미한다. 대안적으로, 이는 유연한 링커, 즉 상기 링커가 연결하는 두 개의 아미노산 서열이 서로에 대해 실질적으로 자유롭게 이동할 수 있게 하는 링커일 수 있다.
두 가지 유형의 링커 모두 유용하다. 한 실시 양태에서, T 세포 에피토프 링커는 항원 유닛이 다수의 T 세포 에피토프를 포함하더라도 최적의 방식으로 T 세포에 에피토프를 T 세포에 제시할 수 있는 유연한 링커이다.
링커에 의한 T 세포 에피토프의 분리로 인해, 자가항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 각 T 세포 에피토프가 면역체계에 최적의 방식으로 제시된다.
예를 들어, 수초 염기성 단백질 (MBP), 단백질지방질 단백질 (proteolipid protein; PLP), 미엘린-관련 당단백질 (MAG), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG) 및 미엘린 관련 염기성 희소돌기 아교세포 단백질 (MOBP)은 모두 다발성 경화증 (MS)과 관련된 자기-항원으로 연구되고 제안되었고 항원 유닛은 예를 들어 MBP의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉, MBP의 하나의 T 세포 에피토프 또는 MBP의 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 항원 유닛은 예를 들어 MOG 및 PLP의 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 MOG의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프 및 PLP의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 MOG의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프, 예컨데 SEQ ID NO: 180-182로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 MOG의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉, 알레르겐의 하나의 T 세포 에피토프 또는 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 알레르겐, 즉, 동일한 알레르겐에 포함된다. 다른 실시 양태에서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 상이한 알레르겐, 즉, 상이한 알레르겐에 포함된다.
예를 들어, Fel d1, Fel d4 및 Fel d7은 인간 고양이 알레르기의 대부분을 차지하는 가장 두드러진 세 가지의 고양이 알레르겐이며, 항원 유닛은 예를 들어 Fel d1의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉, Fel d1의 하나의 T 세포 에피토프 또는 Fel d1의 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 항원 유닛은 예를 들어 Fel d4 및 Fel d7의 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 Fel d4의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프 및 Fel d7의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 Met e 1의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프, 예컨대 SEQ ID NO: 184에 포함된 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 Met e 1의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프, 예컨대 Met e 1(16-35), Met e 1(46-65), Met e 1(76-95), Met e 1(136-155), Met e 1(210-230) 및/또는 Met e 1(241-260)를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 Met e 1의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프, 예컨대 SEQ ID NO: 185-190중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 항원 유닛은 동종항원/이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 동종항원/이종항원의 하나의 T 세포 에피토프 또는 동종항원/이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 동종항원/이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 동종항원/이종항원의 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 동종항원/이종항원, 즉 동일한 동종항원/이종항원의에 포함된다. 다른 실시 양태에서, 다수의 T 세포 에피토프는 다중의 상이한 동종항원/이종항원, 즉 상이한 동종항원/이종항원의에 포함된다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는는 개별화된 치료 (individualized treatment), 즉 특정 대상체/하나의 환자를 위해 설계된 것일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 환자 집단 또는 환자들에 대해 일반적으로 사용하기 위한 것, 즉 기성품 치료를 위한 것이다.
개별화된 관용-유도 컨스트럭트
개별화된 관용-유도 컨스트럭트의 경우, T 세포 에피토프는 항원 유닛에 포함되도록 선택되며, 이 T 세포 에피토프는 상기 컨스트럭트를 이용해서 치료를 받을 환자에 대해 최적화 된다. 이는 관용-유도 컨스트럭트를 포함하는 기성품 치료와 비교하여 치료 효과를 증가시킬 것이다.
개별화된 관용-유도 컨스트럭트의 항원 유닛은 MS를 앓고 있는 환자에 대해 예시된 바와 같이 다음과 같이 설계될 수 있다:
1) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자가 결정된다
2) T 세포 에피토프는 하나 이상의 자기-항원 (예: MS와 관련된 자기-항원으로 연구, 제안 및/또는 검증된 자기-항원)에 포함되는 것으로 확인된다
3) T 세포 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자에 대한 예상 결합을 기반으로 선택된다
4) 하나 이상의 관용 유도 시험 컨스트럭트가 설계 및 생산되며, T 세포 에피토프는 본 출원에 기술된 바와 같이 컨스트럭트의 항원 유닛에 선택적으로 배열된다.
상기 T 세포 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합할 것으로 예상되는 능력을 기반으로 위에서 설명한 방법으로, 즉, 예측 HLA-결합 알고리즘을 사용하여 인실리코에서 선택된다. 관련 에피토프를 확인한 후 그들의 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 능력에 따라 에피토프의 순위를 매기고, 가장 잘 결합할 것으로 예상되는 에피토프를 선택하여 테스트 컨스트럭트의 항원 유닛에 포함시킨다.
다음 중 하나와 같은 적절한 HLA-결합 알고리즘을 사용할 수 있다:
펩티드-MHC 결합의 가능한 소프트웨어 분석 (IEDB, NetMHCpan 및 NetMHCIIpan)은 다음 웹사이트에서 다운로드하거나 온라인으로 사용할 수 있다:
www.iedb.org/
services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.0
services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2
기성품 관용 유도 컨스트럭트
기성품 관용 유도 컨스트럭트의 항원 유닛은 바람직하게 최소 T 세포 에피토프의 핫스팟 (hotspot), 즉, 광범위한 대상체 (예: 민족 인구, 심지어 세계 인구 또는 지구의 인구)를 커버하기 위해 다양한 HLA 대립유전자에 의해 나타날 것으로 예측되는 다수의 최소 T 세포 에피토프 (예: 7-15개의 아미노산 길이)를 포함하는 항원의 하나 이상의 영역을 포함한다.
이러한 핫스팟을 포함함으로써, 상기 컨스트럭트가 광범위한 대상체에서 관용을 유도할 가능성이 최대화된다.
항원 유닛에 대한 추가 설명
본 발명의 컨스트럭트의 항원 유닛에 포함된 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 200 개의 아미노산 길이를 가지며, 더 긴 T 세포 에피토프는 아마도 최소 에피토프의 핫스팟을 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 7 내지 150 개의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프, 바람직하게 7 내지 100 개의 아미노산, 예를 들어 9 내지 100 개의 아미노산 또는 15 내지 100 개의 아미노산 또는 9 내지 60 개의 아미노산 또는 9 내지 30 개의 아미노산 또는 15 내지 60 개 또는 15 내지 30 개 또는 20 내지 75 개의 아미노산 또는 25 내지 50 개의 아미노산, 예컨대 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 아미노산을 포함한다.
약 60 내지 200 개의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 더 짧은 서열로 분할될 수 있고 본원에 기술된 링커에 의해 분리된 항원 유닛에 포함될 수 있다. 예를 들어, 150개의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 각각 50 개의 아미노산으로 구성된 3개의 서열로 분할될 수 있으며, 3개의 서열을 서로 분리하는 링커를 사용하여 항원 유닛에 포함될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 하나의 T 세포 에피토프의 길이는 단백질이 올바르게 접히지 않는 정도이다. 예를 들어, 가장 두드러진 고양이 알레르겐인 Fel d 1은 두 개의 이종이량체로 형성된 단백질이며, 각 이량체는 두 개의 사슬로 구성되며, 사슬 1은 70 개의 아미노산 잔기를 포함하고 사슬 2는 90 또는 92 개의 잔기를 포함한다. 두 사슬의 긴 T 세포 에피토프를 항원 유닛에 포함시키면 단백질이 올바르게 접힐 수 있으며, 만약 대상체의 비만 세포 및 호염기구에 있는 하나 이상의 IgE가 컨스트럭트의 항원 유닛에 결합하면 알레르기 반응을 유발할 수 있다.
더 긴 T 세포 에피토프를 항원 유닛에 포함되는 경우, 단백질 접힘이 예를 들어 ELISA에 의해 단백질 (예: 고양이 알레르겐)에 대한 항체를 이용하여 시험관 내에서 테스트될 수 있고 항체가 T 세포 에피토프에 결합하는지 여부를 결정한다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 MHC (주요 조직적합성 복합체)에 의해 제시되기에 적합한 길이를 갖는다. MHC 분자에는 MHC 클래스 I과 MHC II의 두 가지 기본 클래스가 있다. 상기 용어 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II는 본 명세서에서 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II와 상호교환적으로 사용된다. HLA (인간 백혈구 항원)은 인간의 주요 조직적합성 복합체이다. 따라서, 하나에서, 항원 유닛은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 상에 특이적 제시에 적합한 길이를 갖는 T 세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 제시를 위해 7 내지 11 개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 실시 양태에서, MHC 클래스 II 제시의 경우 상기 T 세포 에피토프 서열은 9 내지 60 개의 아미노산 길이, 예컨대 9 내지 30 개의 아미노산, 예컨대 15 내지 60 개의 아미노산, 예컨대 15 내지 30 개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 제시의 경우 15 개의 아미노산 길이를 갖는다.
항원 유닛의 T 세포 에피토프의 수는 다양할 수 있고, 항원 유닛에 포함된 다른 요소, 예를 들어 본 출원에 기술된 T 세포 에피토프 링커의 길이와 수, 에 따라 달라진다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 최대 3500 개의 아미노산, 예컨대 60 내지 3500 개의 아미노산, 예를 들어 약 80 또는 약 100 또는 약 150 개의 아미노산 부터 약 3000 개의 아미노산 까지, 예컨대 약 200 내지 약 2500 개의 아미노산, 예컨대 약 300 내지 약 2000 개의 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500 개의 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 1 내지 10 개의 T 세포 에피토프 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 10 개의 T 세포 에피토프 또는 11 내지 20 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 T 세포 에피토프 또는 21 내지 30 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 T 세포 에피토프 또는 31 내지 40 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 개의 T 세포 에피토프 또는 41 내지 50 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 항원 유닛은 1 내지 3 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 1개, 2개, 3개, 또는 1 내지 5 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 3 내지 6 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 5 내지 15 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15 개의 T 세포 에피토프, 또는 7 내지 17 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17 개의 T 세포 에피토프, 또는 9 내지 19 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 또는 19 개의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 항원 유닛에 무작위로 배열된다. 다른 실시 양태에서, 항원 유닛에 이들을 배열하기 위한 다음의 방법 중 하나 이상이 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛으로부터 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 더 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열된다. 대안적으로, 특히 친수성/소수성이 T 세포 에피토프 사이에서 크게 변하는 경우, 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)는 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치할 수 있고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛에 가장 가깝거나 항원 유닛의 끝 부분에 위치한다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 다량체화 유닛으로부터 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 더 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열된다. 대안적으로, 특히 친수성/소수성이 T 세포 에피토프 사이에서 크게 변하는 경우, 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)는 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치할 수 있고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)는 다량체화 유닛에 가장 가깝거나 항원 유닛의 끝 부분에 위치한다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프는 이량체화 유닛으로부터 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 더 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열된다 (도 1 참고). 대안적으로, 특히 친수성/소수성이 T 세포 에피토프 사이에서 크게 변하는 경우, 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)는 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치할 수 있고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)는 이량체화 유닛에 가장 가깝거나 항원 유닛의 끝 부분에 위치한다.
항원 유닛의 가운데에 진정으로 위치하는 것은 항원 유닛이 홀수개의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우에만 가능하기 때문에, 이 문맥에서 용어 "실질적으로"는 짝수개의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 지칭하며, 여기서 가장 소수성인 T 세포 에피토프는 가능한 한 가운데에 가깝게 위치한다.
예를 들어, 항원 유닛은 다음과 같이 배열된 5 개의 T 세포 에피토프를 포함한다: 1-2-3*-4-5; 1, 2, 3*,4 및 5 각각은 다른 T 세포 에피토프이고 - 는 T 세포 에피토프 링커 및 * 는 항원 유닛의 중앙에 위치하는 가장 소수성인 T 세포 에피토프를 가르킴.
또 다른 예에서, 항원 유닛은 다음과 같이 배열된 6 개의 T 세포 에피토프를 포함한다: 1-2-3*-4-5-6 또는, 대안적으로 다음과 같다: 1-2-4-3*-5-6; 1, 2, 3*, 4, 5 및 6 각각은 T 세포 에피토프 이고 - 는 T 세포 에피토프 링커 및 *는 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치하는 가장 소수성인 T 세포 에피토프를 가르킴.
대안적으로, 상기 T 세포 에피토프는 친수성 T 세포 에피토프와 소수성 T 세포 에피토프를 교대로 배열할 수 있다. 선택적으로, GC 풍부 T 세포 에피토프는 GC 클러스터가 방지되는 방식으로 배열된다. 바람직한 실시 양태에서, GC 풍부 T 세포 에피토프는 그들 사이에 적어도 하나의 비-GC 풍부 T 세포 에피토프가 존재하도록 배열된다. 일부 실시 양태에서, T 세포 에피토프를 인코딩하는 GC 풍부 서열은 그들 사이에 적어도 하나의 비-GC 풍부 T 세포 서열이 존재하도록 배열된다. GC 풍부 서열은 GC 함량이 60% 이상, 예컨대 65% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상인 서열이다.
항원 유닛이 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우, 상기 에피토프는 바람직하게 T 세포 에피토프 링커에 의해 분리된다. 이는 각각의 T 세포 에피토프가 면역계에 적합한 방식으로 제시되도록 보장한다. 항원 유닛이 n 개의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우, 이는 바람직하게 각 T 세포 에피토프를 하나 또는 두 개의 다른 T 세포 에피토프로 분리하는 n-1 개의 T 세포 에피토프 링커를 포함한다.
상기 T 세포 에피토프 링커는 비-면역원성이 되도록 설계되고 바람직하게는 또한 유연한 링커이며, 이는 항원 유닛이 많은 수의 T 세포 에피토프를 포함하더라도, T 세포 에피토프를 면역 체계에 최적의 방법으로 제시할 수 있게 한다.
바람직하게, 상기 T 세포 에피토프 링커는 4 내지 20 개의 아미노산, 예를 들어 5 내지 20 개의 아미노산 또는 5 내지 15 개의 아미노산 또는 8 내지 20 개의 아미노산 또는 8 내지 15 개의 아미노산, 예컨대 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 아미노산 10 내지 15 개의 아미노산 또는 8 내지 12 개의 아미노산, 예컨대 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 10 개의 아미노산으로 이루어진다.
항원 유닛에 포함된 모든 T 세포 에피토프 링커는 바람직하게는 동일하다. 그러나, 하나 이상의 T 세포 에피토프가 링커의 서열과 유사한 서열을 포함하는 경우, 인접한 T 세포 에피토프 링커를 다른 서열의 링커로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 또한, T 세포 에피토프/링커 접합이 에피토프를 구성할 것으로 예측된다면, 다른 서열의 T 세포 에피토프 링커를 사용하는 것이 바람직하다.
하나의 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 비-면역원성이도록 설계된다. 이는 단단한(rigid) 링커일 수 있으며, 이는, 상기 링커가 연결하는 두 개의 아미노산 서열이 서로에 대해 실질적으로 자유롭게 움직이는 것을 허용하지 않음을 의미한다. 대안적으로, 이는 유연한 링커, 즉 상기 링커가 연결하는 두 개의 아미노산 서열이 서로에 대해 실질적으로 자유롭게 이동할 수 있게 하는 링커일 수 있다.
두 가지 유형의 링커 모두 유용하다. 한 실시 양태에서, T 세포 에피토프 링커는 항원 유닛이 다수의 T 세포 에피토프를 포함하더라도 최적의 방식으로 T 세포에 에피토프를 T 세포에 제시할 수 있는 유연한 링커이다.
바람직하게, 상기 T 세포 에피토프 링커는 세린 (S) 및/또는 글리신 (G) 풍부 링커, 즉, 여러개의 세린 및/또는 여러개의 글리신 잔기를 포함하는 링커이다. 바람직한 예로 GGGGSGGGSS (SEQ ID NO: 51), GGGSG (SEQ ID NO: 52), GGGGS (SEQ ID NO: 53), SGSSGS (SEQ ID NO: 54), GGSGG (SEQ ID NO: 55) 또는 이들의 다중 변이체 예컨대 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), (GGGGS)m (SEQ ID NOs: 53, 및 56-59), (GGGSS)m (SEQ ID NOs: 60-64), (GGGSG)m (SEQ ID NOs: 52 및 65-68), 또는 (SGSSGS)m (SEQ ID NOs: 54 및 69-72)이 있고, 여기서 m은 1 내지 5 사이의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다, 바람직한 실시 양태에서, m은 2이다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 상기 세린 및/또는 글리신 풍부 링커는 적어도 하나의 류신 (L) 잔기, 예를 들어 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 류신 잔기, 예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 4개의 류신 잔기를 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGGS (SEQ ID NO: 73), GLGGS (SEQ ID NO: 74), GGLGS (SEQ ID NO: 75), GGGLS (SEQ ID NO: 76) 또는 GGGGL (SEQ ID NO: 77)를 포함하거나 그로 구성된다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSG (SEQ ID NO: 78), GLGSG (SEQ ID NO: 79), GGLSG (SEQ ID NO: 80), GGGLG (SEQ ID NO: 81) 또는 GGGSL (SEQ ID NO: 82)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSS (SEQ ID NO: 83), GLGSS (SEQ ID NO: 84), 또는 GGLSS (SEQ ID NO: 85)를 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGLGS (SEQ ID NO: 86), GLGLS (SEQ ID NO: 87), GLLGS (SEQ ID NO: 88), LGGLS (SEQ ID NO: 89), GLGGL (SEQ ID NO: 90) 또는 (GLGGL)m (SEQ ID NOs: 90-94)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGLSG (SEQ ID NO: 95), GLLSG (SEQ ID NO: 96), GGLSL (SEQ ID NO: 97), GGLLG (SEQ ID NO: 98) 또는 GLGSL (SEQ ID NO: 99)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGLSS (SEQ ID NO: 100), 또는 GGLLS (SEQ ID NO: 101)를 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 10 개의 아미노산 길이를 가지며1 또는 2 개의 류신 잔기를 포함하는 세린-글리신 링커이다.
일부 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 102), GLGGSGGGGS (SEQ ID NO: 103), GGLGSGGGGS (SEQ ID NO: 104), GGGLSGGGGS (SEQ ID NO: 105) 또는 GGGGLGGGGS (SEQ ID NO: 106)를 포함하거나 그로 구성된다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 107), GLGSGGGGSG (SEQ ID NO: 108), GGLSGGGGSG (SEQ ID NO: 109), GGGLGGGGSG (SEQ ID NO: 110) 또는 GGGSLGGGSG (SEQ ID NO: 111)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 112), GLGSSGGGSS (SEQ ID NO: 113), GGLSSGGGSS (SEQ ID NO: 114), GGGLSGGGSS (SEQ ID NO: 115) 또는 GGGSLGGGSS (SEQ ID NO: 116)를 포함하거나 그로 구성된다.
추가의 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGGSLGGGS (SEQ ID NO: 117), GLGGSGLGGS (SEQ ID NO: 118), GGLGSGGLGS (SEQ ID NO: 119), GGGLSGGGLS (SEQ ID NO: 120) 또는 GGGGLGGGGL (SEQ ID NO: 121)를 포함하거나 그로 구성된다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSGLGGSG (SEQ ID NO: 122), GLGSGGLGSG (SEQ ID NO: 123), GGLSGGGLSG (SEQ ID NO: 124), GGGLGGGGLG (SEQ ID NO: 125) 또는 GGGSLGGGSL (SEQ ID NO: 126)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 LGGSSLGGSS (SEQ ID NO: 127), GLGSSGLGSS (SEQ ID NO: 128), 또는 GGLSSGGLSS (SEQ ID NO: 129)를 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 GSGGGA (SEQ ID NO: 130), GSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 131), GSGGGAGSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 132), GSGGGAGSGGGAGSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 133) 또는 GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 134)를 포함하거나 그로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 유연한 유닛은 SGGGSSGGGS (SEQ ID NO: 135), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), SSGGGSSGGG (SEQ ID NO: 136), GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 137), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 138), GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139), GGGSSS (SEQ ID NO: 140), GGGSSGGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 62) 또는 GLGGLAAA (SEQ ID NO: 141)를 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 단단한 링커이다. 이러한 단단한 링커는 (더 큰) 항원을 효율적으로 분리하고 항원이 서로 간섭하는 것을 방지하는 데 유용할 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 KPEPKPAPAPKP (SEQ ID NO: 142), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 143), (EAAAK)m (SEQ ID NOs: 144-148), PSRLEEELRRRLTEP (SEQ ID NO: 149) 또는 SACYCELS (SEQ ID NO: 150)를 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 서열 TQKSLSLSPGKGLGGL (SEQ ID NO: 151)를 포함하거나 그로 구성된다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 서열 SLSLSPGKGLGGL (SEQ ID NO: 152)를 포함하거나 그로 구성된다. 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 AAY 또는 GPGPG (SEQ ID NO: 153)를 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 GSAT 링커, 즉 하나 이상의 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌 잔기를 포함하는 링커, 예를 들어 서열 GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 154)를 포함하거나 이로 이루어진 링커 또는 SEG 링커, 즉 하나 이상의 세린, 글루탐산 및 글리신 잔기를 포함하는 링커, 예를 들어 서열 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 155)를 포함하거나 이로 이루어진 링커 또는 ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 156) 이다.
다른 실시 양태에서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 절단 가능한 링커, 예를 들어 엔도펩티다제 (예: 푸린, 카스파제, 카텝신 등과 같은 엔도펩티다제)에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 링커이다. 절단 가능한 링커는 유리 기능성 단백질 도메인 (예: 더 큰 항원에 의해 인코딩됨)을 방출시키기 위해 도입될 수 있으며, 이는 그러한 도메인 사이의 입체 장애 또는 그러한 도메인의 간섭으로 인한 다른 단점 (예: 감소된 생체 활성, 변경된 생체 분포)을 극복할 수 있다.
T 세포 에피토프 링커의 예는 단락 [0098]-[0099] 및 WO 2020/176797A1의 인용 서열(특히 SEQ ID NO: 37 내지 65 및 SEQ ID NO: 67 내지 76)에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함되고, US 2019/0022202A1의 단락 [0135] 내지 [0139]에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다.
알레르겐
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 다양한 단백질 알레르겐에 대한 관용을 유도하는 데 유용하며, 예를 들어 알레르겐은 본 발명의 컨스트럭트의 폴리뉴클레오티드에 포함된 핵산 서열에 의해 인코딩 될 수 있고 번역 후 번형을 겪는 단백질 알레르겐을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 식품 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 조개류 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 트로포미오신, 다른 실시 양태에서 상기 알레르겐은 아르기닌 키나아제, 미오신 경쇄, 근형질의 칼슘 결합 단백질, 트로포닌 C 또는 3탄당-인산 이성질체화효소 또는 액틴이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 Pan b 1이다. 일부 실시 양태에서 상기 항원 유닛은 Pan b 1 T 세포 에피토프 (251-270) 이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 소의 우유 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 소의 우유 알레르겐은 Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Bos d 9, Bos d 10, Bos d 11 또는 Bos d 12이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 달걀 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 달걀 알레르겐은 오보뮤코이드이고, 다른 실시 양태에서 상기 달걀 알레르겐은 난백알부민, 오보트랜스페린, 콘알부민, Gal 3 3, 달걀 라이소자임 또는 오보뮤신이다.
당업계에 공지되어 있고 계란 알레르기와 관련하여 연구된 T 세포 에피토프 중 하나는 아미노산 서열 SIINFEKL (SEQ ID NO: 45)을 포함하는 OVA (257-264)이다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 따른 컨스트럭트의 항원 유닛은 T 세포 에피토프 OVA (257-264)를 포함한다. 상기 T 세포 에피토프를 포함하는 약학적 조성물은 계란 알레르기의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 생선 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 생선 알레르겐은 파브알부민이다. 다른 실시 양태에서 상기 생선 알레르겐은 엔올라아제, 알돌라아제 또는 비텔로제닌이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 과일 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 과일 알레르겐은 발병 관련 단백질 10, 프로필린, nsLTP, 타우마틴-유사 단백질, 지베렐린 조절 단백질, 이소플라본 환원효소 관련 단백질, 클래스 1 키티나제, 베타 1,3 글루칸가수분해효소, 저민 유사 단백질 (germin like protein), 알칼리성 세린 단백질분해효소, 발병-관련 단백질 1, 악티니딘, 파이토시스타틴 (phytocyctatin), 키웰린, 주요 라텍스 단백질, 큐핀 또는 2S 알부민이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 야채 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 야채 알레르겐은 발병 관련 단백질 10, 프로필린, nsLTP 타입 1, nsLTP 타입 단백질 2, 오스모틴-유사 단백질, 이소플라본 환원효소-유사 단백질, 베타-프룩토푸라노시다제, PR 단백질 TSI-1, 시클로필린 또는 옥시다아제를 함유한 FAD이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 밀 (wheat) 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 밀 알레르겐은 Tri a 12, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 20, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37 또는 Tri a 38이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 콩 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 콩 알레르겐은 Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5, Gly m 6, Gly m 7 또는 Gly m 8이다. 다른 실시 양태에서 상기 콩 알레르겐은 Gly m 응집소, Gly m Bd28K, Gly m 30 kD, Gly m CPI 또는 Gly m TI이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 땅콩 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 땅콩 알레르겐은 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Ara h 12, Ara h 13, Ara h 14, Ara h 15, Ara h 16, 또는 Ara h 17이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 견과류 또는 씨앗 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 11S 글로불린, 7S 글로불린, 2S 글로불린, PR10, PR-14 nsLTP, 올레오신 또는 프로필린이다.
다른 실시 양태에서 상기 식품 알레르겐은 메밀, 셀러리, 색소 첨가물, 마늘, 글루텐, 귀리, 콩류, 옥수수, 겨자, 가금류, 고기, 쌀, 참깨이거나 메밀, 셀러리, 색소 첨가물, 마늘, 글루텐, 귀리, 콩류, 옥수수, 겨자, 가금류, 고기, 쌀, 참깨 유래이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 벌독 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 벌독 알레르겐은 포스포리파제 A2, 히알루로니다제, 산 포스파타제, 멜리틴, 알레르겐 C/DPP, CRP/l카라핀 (CRP/lcarapin) 또는 비텔로제닌이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 말벌 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 말벌 알레르겐은 포스포리파제 A1, 히알루로니다제, 프로테아제, 항원 5, DPP IV 또는 비텔로제닌이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 라텍스 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 라텍스 알레르겐은 Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hev b 15이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 먼지 벌레 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서 상기 알레르겐은 집먼지 진드기 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 저장소 먼지 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 집먼지 진드기 알레르겐은 Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 7, Der p 8, Der p 10, Der p 11, Der p 21, 또는 Der p 23이다. 일부 실시 양태에서 상기 항원 유닛은 Der p 1 T 세포 에피토프 (111-139)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 집먼지 진드기 알레르겐은 Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 8 또는 Der f 10이다. 일부 실시 양태에서, 상기 집먼지 진드기 알레르겐은 Blot t 1, Blot t 2, Blot t 3, Blot t 4, Blot t 5, Blot t 8, Blot t 10, Blot t 12 또는 Blot t 21이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 바퀴벌레 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 바퀴벌레 알레르겐은 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8 또는 Bla g 11이다. 일부 실시 양태에서, 상기 바퀴벌레 알레르겐은 Per a 1, Per a 2, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9 또는 Per a 10이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 곰팡이 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 곰팡이 알레르겐은 아스페르질루스 푸미가투스 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 아스페르질루스 푸미가투스 알레르겐은 Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 14, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29 또는 Asp f 34이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 진균 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 진균 알레르겐은 마라세지아 (Malassezia) 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 마라세지아 (Malassezia) 알레르겐은 Mala f 1, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala f 5, Mala f 6, Mala f 7, Mala f 8, Mala f 9, Mala f 10, Mala f 11, Mala f 12 or Mala f 13 또는 MGL_1204이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 털짐승 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 개 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 개 알레르겐은 Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Can f 5, 또는 Can f 6이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 말 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 말 알레르겐은 Ecu c 1, Ecu c 2, Ecu c 3 또는 Ecu c 4이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 고양이 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 고양이 알레르겐은 Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5, Fel d 6, Fel d 7, 또는 Fel d 8이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 실험동물 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 리포칼린, 요중 전알부민(urinary prealbumin), 분비글로불린 (secretoglobulin) 또는 혈청알부민이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 목초 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 목초 꽃가루 알레르겐은 큰조아재비 (Timothy Grass), 오리새 (orchard grass), 왕포아풀 (Kentucky bluegrass), 다년생 라이 (perennial rye), 향기풀 (sweet vernal grass), 바히아그래스 (bahia grass), 옥수수 사초(johnson grass) 또는 우산잔디 (Bermuda grass) 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서 상기 목초 꽃가루 알레르겐은 Phl p 1, Phl p 2, Phl p 3, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12 또는 Phl p 13이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 나무 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 나무 꽃가루 알레르겐은 오리나무, 자작나무, 서어나무, 개암나무, 유럽 새우나무, 밤나무, 유럽 너도밤나무, 갈참나무, 물푸레나무, 쥐똥나무, 올리브, 라일락, 사이프러스 또는 향나무 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 나무 꽃가루 알레르겐은 Aln g 1 또는 Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 또는 Bet v 7, Car b 1, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 6, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Ost c 1, Cas 1, Cas 5, Cas 8, 또는 Cas 9, Fag s 1, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 2, 3 Ole e, 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, 또는 Ole e 12, Syr v 1, Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun v 1, Jun v 3, Pla a 1, Pla a 2 또는 Pla a 3 또는 Pla or 1, Pla or 2 또는 Pla or 3이다. 일부 실시 양태에서, 상기 항원 유닛은 Bet v 1 T 세포 에피토프 (139-152)일 것이다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 풀 (weed) 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서 상기 풀 알레르겐은 돼지풀, 쑥, 해바라기, 피버뷰, 펠리트륨 (pellitory), 영국 질경이, 다년생 머큐리 (annual mercury), 명아주, 명아줏과 식물 또는 아마란스 꽃가루 알레르겐이다. 일부 실시 양태에서 상기 돼지풀 꽃가루 알레르겐은 Amb a 1, Amb a 4, Amb a 6, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, 또는 Amb a 11이다. 일부 실시 양태에서 상기 쑥 꽃가루 알레르겐은 Art v 1, Art v 3, Art v 4, Art v 5, 또는 Art v 6이다. 일부 실시 양태에서, 상기 해바라기 꽃가루 알레르겐은 Hel a 1 또는 Hel a 2이다. 일부 실시 양태에서, 상기 펠리트륨 꽃가루 알레르겐은 Par j 1, Par j 2, Par j 3 또는 Par j 4이다. 일부 실시 양태에서, 상기 영국 질경이 꽃가루 알레르겐은 Pla l 1이다. 일부 실시 양태에서, 상기 다년생 머큐리 꽃가루 알레르겐은 Mer a 1이다. 일부 실시 양태에서, 상기 명아주 꽃가루 알레르겐은 Che a 1, Che a 2 또는 Che a 3이다. 일부 실시 양태에서, 명아줏과 식물 (Russian thistle) 꽃가루 알레르겐은 Sal k 1, Sal k 4 또는 Sal k 5이다. 일부 실시 양태에서, 상기 아마란스 꽃가루 알레르겐은 Ama r 2이다.
또 다른 실시 양태에서 상기 알레르겐은 곤충, 바퀴벌레, 집 먼지 진드기 또는 곰팡이와 같은 환경적 알레르겐으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 상기 알레르기 질환 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 위장병증, 접촉성 피부염, 먼지 알레르기 또는 이들의 조합이다.
약물에 대한 알레르기는 일반 인구의 7% 이상에게 영향을 미친다. 본 발명의 컨스트럭트는 이러한 약물에 존재하는 면역원성 에피토프에 대한 내성을 유도하여 영향을 받은 환자가 약물 치료를 계속하고 약물 치료로부터 이익을 얻을 수 있게 할 것이다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 알레르겐은 원치 않는 면역원성을 갖는 약물에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 인자 VIII (Factor VIII)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 알레르겐은 인슐린이다. 일부 실시예에서, 상기 알레르겐은 치료에 사용되는 하나 이상의 단클론 항체이다.
자기-항원
다른 실시 양태에서, 본 관용-유도 컨스트럭트는 자가면역 질환과 관련된 자기-알레르겐에 포함된 T 세포 에피토프를 포함한다. 이는 면역체계를 일반적으로 억제하지 않고도 자가면역 질환을 담당하는 면역체계 일부의 항원-특이적 하향-조절을 가능하게 한다.
일부 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 다발성 경화증 (MS)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG)이다. 다른 실시 양태에서 상기 자기-항원은 MAG, MOBP, CNPase, S100beta 또는 트랜스알돌라아제이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 수초 염기성 단백질 (MBP)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 미엘린 단백질지방질 단백질(proteolipid protein; PLP)이다.
실시예에서 우리는 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG)의 짧은 (35-55 아미노산) 또는 더 긴 (27-63 아미노산) T 세포 에피토프를 포함하는 다발성 경화증을 위한 컨스트럭트를 제공한다. MOG는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 중추신경계에서만 발현된다. MOG (35-55)는 자가항체 생성과 재발-완화 신경 질환을 유발하여 광범위한 플라크-유사 탈수초화를 일으킬 수 있다. MOG(35-55)에 대한 자가항체 반응이 MS 환자에서 관찰되었으며, MOG(35-55)-유발 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 C57/BL6 마우스 및 루이스 쥐에서 관찰되었다.
당업계에 알려져 있고 연구되어온 다른 MS-관련 T 세포 에피토프는 다음과 같다:
*T 세포 에피토프에 의해 유발된 EAE가 관찰됨
바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 컨스트럭트의 항원 유닛은 MOG (35-55), MOG (27-63), PLP (139-151), PLP (131-159), PLP (178-191), PLP (170-199), MBP (84-104) 및 MBP (76-112)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. 이러한 컨스트럭트를 포함하는 약학적 조성물은 MS의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 제1형 당뇨병이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 글루탐산 탈탄산효소 65-킬로달톤 동형단백질 (GAD65)이고, 이는 제1형 당뇨병과 연관된 자기-항원이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 인슐린, IA-2 또는 ZnT8이다. 일부 다른 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 IGRP, ChgA, IAPP, 페리페린, 테트라스패닌-7, GRP78, 우로코르틴-3 또는 인슐린 유전자 강화 단백질 isl-1이다.
일부 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 셀리악병이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 저분자량 글루테닌, 고분자량 글루테닌, 호르데인, 세칼린 또는 아베닌 b이다. 일부 실시 양태에서, 항원 유닛은 T 세포 에피토프 α-글리아딘 (76-95)을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 콜라겐이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 열충격 단백질 60 (HSP60)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 밴드 3이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 소핵리보핵산단백질 D1 (SmD1)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 아세틸콜린 수용체(AChR)이다. 일부 실시 양태에서, 상기 자기-항원은 수초 단백질 제로 (P0)이다.
일부 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP)이고 상기 자기-항원은 뉴로파신 155이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은하시모토 갑상선염 (HT)이고 상기 자기-항원은 갑상선과산화효소 및/또는 티로글로불린이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 낙엽성 천포창이고 상기 자기-항원은 데스모솜-연관 당단백질이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 심상성 천포창이고 상기 자기-항원은 데스모글레인 3이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 갑상선 눈 질환 (TED)이고 상기 자기-항원은 칼슘결합 단백질 (칼시퀘스트린)이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 그레이브스병이고 상기 자기-항원은 갑상선자극호르몬수용체이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 원발 담즙성 간경화 (PBC)이고 상기 자기-항원은 항미토콘드리아 항체 (AMA), 항핵항체 (ANA), 림-유사/막 (RL/M, Rim-like/membrane) 및/또는 다중 핵 점 (multiple nuclear dot, MND)이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 중증 근무력증이고 상기 자기-항원은 아세틸콜린 수용체이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 인슐린-저항성 당뇨병이고 상기 자기-항원은 인슐린 수용체이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 자가면역 용혈성 빈혈이고 상기 자기-항원은 적혈구이다. 다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염이고 상기 자기-항원은 시트룰린화, 호모시트룰린화 단백질 및/또는 IgG의 Fc 부분이다.
다른 실시 양태에서, 상기 자가면역질환은 건선이고 상기 자기-항원은 s are 카델리시딘 (LL-37), 디스인테그린-유사 및 트롬보스폰딘 1형 모티프-유사 5 (ADAMTSL5)를 함유하는 메탈로프로테아제 도메인, 포스포리파제 A2 그룹 IVD(PLA2G4D), 이종 핵 리보핵산단백질 A1(hnRNP-A1) 및 케라틴 17이다.
유닛 링커
항원 유닛 및 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛은 바람직하게 링커에 의해 연결된다. 상기 유닛 링커는 폴리뉴클레오티드의 구성을 용이하게 하기 위해 제한부위를 포함할 수 있다. 유닛 링커는 GLGGL 링커(SEQ ID NO: 90) 또는 GLSGL 링커(SEQ ID NO: 163)인 것이 바람직하다. 일부 실시 양태에서, 상기 유닛 링커는 SEQ ID NO: 204에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
항원 유닛 및 다량체화 유닛은 바람직하게 링커에 의해 연결된다. 상기 유닛 링커는 폴리뉴클레오티드의 구성을 용이하게 하기 위해 제한부위를 포함할 수 있다. 유닛 링커는 GLGGL 링커(SEQ ID NO: 90) 또는 GLSGL 링커(SEQ ID NO: 163)인 것이 바람직하다. 일부 실시 양태에서, 상기 유닛 링커는 SEQ ID NO: 204에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
항원 유닛 및 이량체화 유닛은 바람직하게 링커에 의해 연결된다. 상기 유닛 링커는 폴리뉴클레오티드의 구성을 용이하게 하기 위해 제한부위를 포함할 수 있다. 유닛 링커는 GLGGL 링커(SEQ ID NO: 90) 또는 GLSGL 링커(SEQ ID NO: 163)인 것이 바람직하다. 일부 실시 양태에서, 상기 유닛 링커는 SEQ ID NO: 204에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 상기 유닛 링커는 GGGGS (SEQ ID NO: 53), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 164), EAAAK (SEQ ID NO: 144), (EAAAK)m (SEQ ID NOs: 165), (EAAAK)mGS (SEQ ID NO: 166), 또는 (EAAK)mGS (SEQ ID NO: 31)를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 m은 1보다 크거나 같은 정수이고, GPSRLEEELRRRLTEPG (SEQ ID NO: 167), AAY 또는 HEYGAEALERAG (SEQ ID NO: 168)를 포함하거나 그로 구성된다.
다량체화 유닛 및 이량체화 유닛
본 발명의 컨스트럭트는 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 컨스트럭트는 다량체화 유닛을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 컨스트럭트는 이량체화 유닛을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "다량체화 유닛"은 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 다량체화 유닛은 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 폴리펩티드를 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질, 삼량체 단백질 또는 사량체 단백질로 다량체화/결합시키는 것을 촉진한다. 다량체화 유닛은 또한, APC가 가변 거리(variable distances)로 위치하더라도 표적화 유닛이 APC의 표면 분자에 최적으로 결합할 수 있도록 다량체 단백질에 유연성을 제공한다. 다량체화 유닛은 이러한 요건 중 하나 이상을 충족하는 임의의 유닛일 수 있다.
2개 이상의 폴리펩티드의 다량체화/결합을 촉진하는 다량체화 유닛
한 실시 양태에서, 다량체화 유닛은 삼량체화 유닛, 예컨대 콜라겐-유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐-유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인(예를 들어, [A. Alvarez-Cienfuegos et al., Sci Rep 6, 28643 (2016)] 참조) 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인이다. 따라서, 한 실시 양태에서, 상기 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 42의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다. 다른 실시 양태에서, 삼량체화 유닛은 T4 피브리틴의 C-말단 도메인이다. 따라서, 한 실시 양태에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다.
다른 실시 양태에서, 다량체화 유닛은 p53으로부터 유래된 도메인과 같은 사량체화 유닛이며, 선택적으로 아래에 기술되는 바와 같은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 따라서, 한 실시 양태에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 43의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 선택적으로 하기 기재된 바와 같은 힌지 영역을 추가로 포함하는 사량체화 유닛이다.
다량체화 유닛과 같은 맥락에서 상기 용어 "힌지 영역"은 두 개 이상의 폴리펩티드 (예: 3개 또는 4개의 폴리펩티드)를 연결하는 데 기여하는 다량체화 유닛에 포함된 아미노산 서열을 의미하며, 즉, 다량체 또는 이량체 단백질의 형성에 기여하고/하거나 유연한 스페이서로서 기능하여, 심지어 표면 분자들이 가변 거리에 위치한다고 하더라도, 다량체 단백질의 표적화 유닛이 APC 상의 다수의 표면 분자에 동시에 결합할 수 있도록 한다.
이량체화 유닛
본 명세서에서 사용된 용어 "이량체화 유닛"은 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 이량체화 유닛은 두 개의 폴리펩티드의 이량체화를 촉진하거나 이량체 단백질로 결합시킨다. 이량체화 유닛은 또한 이량체 단백질에 유연성을 제공하여, APC가 가변 거리에 위치하더라도, APC의 표면 분자에 대한 표적화 유닛의 최적 결합을 가능하게 한다. 이량체화 유닛은 이러한 요건 중 하나 이상을 충족하는 임의의 유닛일 수 있다.
따라서, 일부 실시 양태에서 본 발명의 컨스트럭트는 힌지 영역을 포함하는 이량체화 유닛을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하며, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결한다. 다른 실시 양태에서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커, 그리고 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 포함하며, 여기서 상기 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결한다. 상기 이량체화 유닛 링커는 아래에서 더 설명된다.
한 실시 양태에서, 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커이고, 바람직하게는 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)이며, 즉, 이량체화 유닛은 글리신-세린 풍부 이량체화 유닛 링커이고, 바람직하게는 이량체화 유닛 링커 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 이량체화 유닛 링커는 SEQ ID NO: 201에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
상기 용어 "힌지 영역"은 두 개의 폴리펩티드를 연결하는 데 기여하는 이량체화 유닛에 포함된 아미노산 서열을 의미하며, 즉, 이량체 단벡질의 형성에 기여한다.
또한, 힌지 영역은 유연한 스페이서 역할을 하여, 이량체 단백질의 두 표적화 유닛이, 비록 이들이 가변적인 거리에 위치하더라도 APC 상의 두 표면 분자에 동시에 결합할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 Ig 유래, 예를 들어 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3으로부터 유래될 수 있다.　한 실시 양태에서, 힌지 영역은 IgM으로부터 유래되며, 예를 들어 SEQ ID NO: 47의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.　힌지 영역은 공유 결합(들), 예를 들어 시스테인 잔기들 사이의 이황화 가교(들)의 형성을 통해, 이량체화 (또는 다량체화)에 기여할 수 있다.　따라서, 일부 실시 양태에서, 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다.　바람직하게는, 공유 결합은 이황화 가교이다.
일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4(인간 힌지 영역 1 및 인간 힌지 영역 4)를 포함하거나 그로 구성된다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27과 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 그로 구성된다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은, 최대 10 개의 아미노산, 예를 들어 최대 9 개의 아미노산, 예를 들어 최대 8 개의 아미노산, 예를 들어 최대 7 개의 아미노산, 예를 들어 최대 6 개의 아미노산, 예를 들어 최대 5 개의 아미노산, 예를 들어 최대 4 개의 아미노산, 예를 들어 최대 3개의 아미노산, 예를 들어 최대 2개의 아미노산 또는 예를 들어 최대 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 그로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛 아미노산 서열 ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 156) 및/또는 EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 46), 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 200 또는 SEQ ID NO: 28에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
다른 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하는데; 바람직하게는, 상기 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 예컨대 면역글로불린 불변 도메인 (C 도메인), 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 카르복시 말단 C 도메인 (즉, CH3 도메인), 또는 그러한 C 도메인과 실질적으로 동일한 서열 또는 그 변이체이다. 바람직하게는, 이량체화를 촉진하는 상기 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다. 더욱 바람직하게는, 이량체화를 촉진하는 상기 다른 도메인은 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다.　
일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시 말단 C 도메인 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93 %, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 그로 구성된다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144를 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시 말단 C 도메인을 포함하거나 그로 구성된다.
한 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은, 최대 16 개, 예를 들어 최대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144를 포함하거나 그로 구성된다.
면역글로불린 도메인은 비-공유 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용을 통해 이량체화에 기여한다.　따라서, 일부 실시 양태에서, 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용을 통해 이량체를 형성하는 능력을 갖는다.　바람직하게는, 비공유 상호작용은 소수성 상호작용이다.
이량체화 유닛이 CH3 도메인을 포함하는 경우, CH2 도메인을 포함하지 않는 것이 바람직하고 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함한다.　추가의 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 실시 양태에서 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
훨씬 더 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
한 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 최대 22 개, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다.
한 바람직한 실시 양태에서, 이량체화 유닛은 최대 22 개, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성된다.
일부 실시 양태에서, 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커이고, 바람직하게는 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)이며, 즉 이량체화 유닛은 글리신-세린 풍부 이량체화 유닛 링커 및 바람직하게 이량체화 유닛 링커 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)를 포함한다.
신호 펩티드
바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 컨스트럭트는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.　신호 펩티드는, 폴리펩티드 내 표적화 유닛의 배향에 따라, 표적화 유닛의 N-말단 또는 표적화 유닛의 C-말단에 위치한다 (도 1).　신호 펩티드는, 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 분비를 허용하도록 설계된다.　
임의의 적합한 신호 펩티드가 사용될 수 있다.　적합한 펩티드의 예는 인간 Ig VH 신호 펩티드 또는 본 명세서에 기술된 임의의 표적화 유닛의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드, 예를 들어 인간 IL-10의 인간 신호 펩티드 또는 인간 TGFβ의 인간 신호 펩티드이다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-10 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 인간 IL-10 표적화 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 Ig VH 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 바람직하게는 scFv, 예를 들어 인간 항-DEC205를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시 양태에서, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 이다.
다른 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 최대 5 개의 아미노산, 예컨대 최대 4 개의 아미노산, 예컨대 최대 3 개의 아미노산, 예컨대 최대 2 개의 아미노산 또는 예컨대 최대 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 쥣과의 IL-10 신호 펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 50에 제시된 IL-10 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 바람직하게는 쥣과의 IL-10 표적화 유닛, SEQ ID NO: 169에 제시된 쥣과의 IL-10 표적화 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 신호 펩티드는 IL-10 신호 펩티드, SCGB3A2 신호 펩티드, VSIG-3 신호 펩티드, CTLA4 신호 펩티드, 또는 PD-1 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩티드이고, 예컨대 쥣과의 IL-10 신호 펩티드, 쥣과의 SCGB3A2 신호 펩티드, 쥣과의 VSIG-3 신호 펩티드, 쥣과의 CTLA4 신호 펩티드, 또는 쥣과의 PD-1 신호 펩티드로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 50, 170, 172, 174, 176 및 178으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
서열 동일성
서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제2 서열이 제1 서열로부터 유래될 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 두 개의 정렬된 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 참조 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은 정렬 후 후보 서열의 아미노산의 70%가 참조 서열의 상응하는 아미노산과 동일해야 할 것을 요구한다. 동일성(identity)은 비제한적인 예로서 ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: 서열 가중치, 위치-특정 갭 패널티 및 가중치 매트릭스 선택을 통한 점진적 다중 서열 정렬의 감도를 개선하는 것. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), 및 여기에 제안된 기본 매개변수와 같은 컴퓨터 분석의 도움으로 결정될 수 있다. 기본 설정으로 이 프로그램을 사용하면 쿼리의 성숙한(생물 활성) 부분과 참조 폴리펩티드가 정렬된다. 완전히 보존된 잔기의 수를 세고 이를 참조 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 할 때, 쿼리 시퀀스의 일부를 형성하는, 임의의 태그 또는 융합 단백질 서열은 정렬 및 서열 동일성의 후속 결정에서 무시된다.
ClustalW 알고리즘이 뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 표시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
서열 비교에 사용되는 또 다른 선호되는 수학적 알고리즘은 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다(Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219). 정렬은 글로벌 정렬(global alignment)을 기반으로 서열 동일성을 계산한다. Align0은 서열 끝에 있는 간격에 불이익을 주지 않는다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 및 Align0 프로그램을 사용할 때, -12/-2의 갭 개방/확장 페널티를 갖는 BLOSUM50 치환 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
아미노산 서열 변이체는 관용 유도 컨스트럭트를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 또는 펩티드 합성을 통해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그러한 잔기로의 삽입 및/또는 그러한 잔기의 치환이 포함된다.　아미노산 서열 및 서열 동일성과 관련하여 본원에 사용된 용어 치환된/치환, 결실된/결실 및 삽입된/삽입은 당업자에게 잘 알려져 있고 명백하다.　최종 컨스트럭트가 원하는 특성을 갖는다면, 최종 컨스트럭트에 도달하기 위하여 모든 조합의 결실, 삽입 및 치환이 이루어질 수 있다.　예를 들어, 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환은 침묵 변화를 일으킬 수 있고, 기능적으로 동등한 펩티드/폴리펩티드가 되게 할 수 있다.
물질의 2차 결합 활성이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성을 기반으로 고의적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.　예를 들어, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되며;　양전하를 띤 아미노산에는 리신과 아르기닌이 포함되며;　유사한 친수성 값을 갖는 비전하 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산에는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다.
여기에서는, 보존적 치환, 즉 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 하는 것과 같은 유사 치환(like-for-like substitution), 및 비-보존적 치환, 즉 잔기의 한 부류에서 다른 부류로, 또는 대안적으로 예컨대 오르니틴, 디아미노부티르산 오르니틴, 노르류신, 오르니틴, 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 비-보존적 치환이 포함된다.　이루어질 수 있는 보존적 치환은 예를 들어 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산(알라닌, 발린 (aaline), 류신, 이소류신), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 하이드록실 아미노산(세린, 트레오닌), 큰 아미노산(페닐알라닌, 트립토판) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌) 그룹 내에서 이루어질 수 있다.
치환은 또한 비천연 아미노산에 의해 이루어질 수 있으며 치환 잔기는 다음을 포함한다;　알파* 및 알파-이치환* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 젖산*, 천연 아미노산의 할로겐화물 유도체, 예컨대 트리플루오로티로신*, p-CI-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-I-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-a-아미노부티르산*, L-y-아미노부티르산*, L-a-아미노이소부티르산*, L-e-아미노카프로산*, 7-아미노헵탄산*, L-메티오닌 술폰*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린*, L-티오프롤린*, 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 예컨대 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe(4-아미노)#, L-Tyr(메틸)*, L-Phe(4-이소프로필)*, L-Tic(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산* 및 L-Phe(4-벤질)*.
위 문단에서, *는 치환 잔기의 소수성을 나타내고, #은 치환 잔기의 친수성을 나타내고, #*는 치환 잔기의 양친매성을 나타낸다.　변이체 아미노산 서열은, 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에, 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 2개의 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 그룹을 포함할 수 있다.　변이체의 추가적인 형태는 펩토이드 형의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 관용-유도 컨스트럭트 폴리뉴클레오티드 형태일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 항원 제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원성 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 항원성 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 DNA 또는 RNA일 수 있습니다. 바람직한 실시 양태에서, 상기 컨스트럭트는 DNA 플라스미드, 즉 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
폴리뉴클레오티드는 이것이 투여되는 종에서의 사용에 최적화되는 것이 바람직하다. 인간에게 투여하기 위해, 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화되는 것이 바람직하다.
폴리펩티드 및 다량체/이량체 단백질
본 발명의 컨스트럭트는 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 포함된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 형태일 수 있다
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 폴리펩티드는 관용-유도 컨스트럭트, 예를 들어, 상기 컨스트럭트를 포함하는 약학적 조성물의 생산을 위해 시험관 내에서 발현될 수 있거나, 상기 기재한 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드의 대상체로의 투여의 결과로서 생체내에서 발현될 수 있다. 다량체화/이량체화 유닛의 존재로 인해, 폴리펩티드가 발현될 때, 즉 각각의 다량체화/이량체화 유닛을 통해 다수의 폴리펩티드를 연결함으로써 다량체/이량체 단백질이 형성된다.
본 발명의 추가 측면은 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드를 포함하는 다량체, 예컨대 이량체 단백질이며, 이들 각각은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛과 같은 다량체 유닛, 및 항원 유닛을 포함하며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 다수의 폴리펩티드를 포함하는 다량체이며, 이들 각각은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체 유닛, 및 항원 유닛을 포함하며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 다수의 폴리펩티드를 포함하는 이량체 단백질이며, 이들 각각은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체 유닛, 및 항원 유닛을 포함하며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 다량체 단백질은 동종다량체, 즉, 다수의 폴리펩티드 사슬이 동일하고, 결과적으로 동일한 유닛을 포함함으로써 동일한 항원 서열을 포함하는 다량체 단백질일 수 있거나, 다수의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종다량체 일 수 있는데, 여기서 각 폴리펩티드 사슬이 그의 항원 유닛에서 상이한 항원 서열을 포함할 수 있다. 상기 이량체 단백질은 동종이량체, 즉 두 개의 폴리펩티드 사슬이 동일하고, 결과적으로 동일한 유닛으로 포함하여 항원 서열을 포함하는 이량체 단백질 일 수 있거나, 상기 이량체 단백질은 이종이량체일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드 사슬 1은 이의 항원 유닛에서 폴리펩티드 2와 상이한 T 세포 에피토프를 포함한다. 항원 유닛에 포함될 T 세포 에피토프의 수가 항원 유닛의 크기 상한을 초과하는 경우 후자가 관련될 수 있다. 다량체/이량체 단백질은 동종다량체/동종이량체 단백질인 것이 바람직하다.
벡터
상기 컨스트럭트의 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포를 형질감염시키고 폴리뉴클레오티드에 포함된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 다량체/이량체 단백질의 발현에 적합한 벡터에 포함된 DNA 폴리뉴클레오티드, 즉, 발현 벡터, 바람직하게는 DNS 플라스미드 일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 상기 벡터는 숙주 세포를 형질감염시키고 폴리펩티드/다량체 단백질을 인코딩하는 mRNA의 발현에 적합하다.
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 벡터이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 벡터이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하는 벡터이며, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
바람직하게, 상기 벡터는 위에서 설명된 다양한 유닛, 특히 항원 유닛의 용이한 교환을 가능하게 한다.
일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 pALD-CV77 또는 대상체에 도입될 때 좋지 않은 방식으로 면역 반응을 유발하는 것으로 알려진 박테리아 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 임의의 다른 벡터일 수 있다. 상기 항원 유닛은 편리한 제한 효소에 의해 제한되는 항원 유닛 카세트로 교환될 수 있으며, 예를 들어, SfiI 제한 효소 카세트, 여기서 5' 부위가 GLGGL (SEQ ID NO: 90) 및/또는 GLSGL(SEQ ID NO: 163) 유닛 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 포함되고 3'부위는 벡터의 정지 코돈 뒤에 포함된다.
본 발명의 상기 벡터는 DNA 또는 RNA와 같은 외래 핵산 서열을 이들이 발현될 수 있는 세포 내로 운반하는데 적합한 임의의 분자, 즉 발현 벡터일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 벡터는 DNA 플라스미드와 같은 DNA 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 거대세포바이러스 및 센다이 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 DNA 바이러스 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 상기 벡터는 RNA 플라스미드와 같은 RNA 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 RNA 바이러스 벡터이고, 예를 들어 알파바이러스, 렌티바이러스, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 및 랍도바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 레트로바이러스 벡터이다.
바람직한 실시 양태에서, 상기 벡터는 DNA 벡터, 더 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 바람직한 실시 양태에서, 상기 벡터는 DNA 플라스미드이고 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
플라스미드
플라스미드는 염색체 DNA와 물리적으로 분리되어 있고 독립적으로 복제할 수 있는 세포 내의 작은 염색체외 DNA 분자이다. 플라스미드는 대부분 박테리아에서 작은 원형의 이중-가닥 DNA 분자로 발견되나; 플라스미드는 때때로 고세균과 진핵생물에 존재한다. 인공 플라스미드는 분자 복제에서 벡터로 널리 사용되며, 숙주 유기체 내에서 재조합 DNA 서열의 높은 발현을 전달하고 보장하는 역할을 한다. 플라스미드는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택을 위한 특징, 예를 들어 항생제 내성을 위한 유전자, 복제 기점, 다수의 클로닝 부위(MCS) 및 삽입된 관심 유전자(들)의 발현을 유도하기 위한 프로모터를 포함하는 몇 가지 중요한 특징을 포함한다.
일반적으로 프로모터는 개시인자와 중합효소를 프로모터로 끌어당겨 유전자가 전사되게 하는 서열이다. 프로모터는 DNA 상류의 유전자 전사 시작 부위 근처에 위치한다. 프로모터는 약 100 내지 1000개 염기쌍 길이일 수 있다. 프로모터의 성질은 일반적으로 유전자와 전사의 산물, 그리고 해당 부위에 모집된 RNA 중합효소의 종류나 유형에 따라 달라진다. RNA 중합효소가 플라스미드의 DNA를 읽으면, RNA 분자가 전사된다. 처리 후, 상기 mRNA는 여러 번 번역될 수 있으므로 리보솜이 mRNA를 단백질로 번역할 때, 관심 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 많은 복사본이 생성된다. 일반적으로 리보솜은 상보적인 tRNA 안티코돈 서열이 mRNA 코돈에 결합하도록 유도하여 해독 (decoding)을 촉진한다. tRNA는 mRNA가 통과하여 리보솜에 의해 "읽혀질" 때 함께 사슬로 연결되어 폴리펩티드가 되는 특정 아미노산을 운반한다. 번역은 시작, 연장, 종료의 세 단계로 진행된다. 번역 과정에 따라, 폴리펩티드는 활성 단백질로 접혀 세포 내에서 기능을 수행하거나 세포에서 내보내져 다른 곳에서 기능을 수행하며, 때로는 상당한 수의 번역 후 변형이 수행된다.
단백질이 세포 밖으로 내보내질 예정인 경우, 신호 펩티드는 단백질을 소포체로 안내하며, 여기서 상기 신호 펩티드는 절단되고 단백질은 번역이 종료된 후 세포 주변으로 전달된다.
상기 본 발명의 DNA 플라스미드는 임의의 특정 플라스미드로 제한되지 않으며, 통상의 기술자는 적합한 백본을 갖는 임의의 플라스미드가 본 발명의 요소 및 유닛을 포함하도록 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 선택되고 조작될 수 있음을 이해할 것이다.
숙주 세포
본 발명의 추가 측면은 다음을 포함하는 숙주 세포이다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질.
본 발명의 추가 측면은 다음을 포함하는 숙주 세포이다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질.
본 발명의 추가 측면은 다음을 포함하는 숙주 세포이다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 숙주 세포는 인간 세포, 바람직하게는 면역 질환을 앓고 있고 본 발명의 컨스트럭트를 사용한 예방적 또는 치료적 치료가 필요한 인간 개체의 세포이다.
약학적 조성물
본 발명의 컨스트럭트는 컨스트럭트, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 다량체/이량체 단백질의 형태, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물으로서 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 약학적으로 허용가능한 담체 및 다음을 포함하는 약학적 조성물이다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 약학적으로 허용가능한 담체 및 다음을 포함하는 약학적 조성물이다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 약학적으로 허용가능한 담체 및 다음을 포함하는 약학적 조성물이다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체에는 식염수, 완충 식염수(예: PBS), 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 아쥬반트를 포함할 수 있다. 적합한 아쥬반트는 덱사메타손, 장독소 콜레라 독소(CTB)의 B 서브유닛, TLR2 리간드, 기생충 유래 배설/분비(ES) 생성물, 라파마이신 또는 비타민 D3 유사체 및 아릴 탄화수소 수용체 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 특정 실시 양태에서 상기 조성물은, 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 블록을 포함하는, 약학적으로 허용되는 양친매성 블록 공중합체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "양친매성 블록 공중합체"는 폴리(에틸렌 옥사이드)("PEO") 블록 및 폴리(프로필렌 옥사이드)("PPO") 블록을 포함하거나 이로 구성된 선형 또는 분지형 공중합체이다.　유용한 PEO-PPO 양친매성 블록 공중합체의 전형적인 예는 일반 구조 PEO-PPO-PEO(폴록사머), PPO PEO PPO, (PEO PPO-)4ED(폴록사민) 및 (PPO PEO-)4ED(역방향 폴록사민)을 갖고, 여기서 "ED"는 에틸렌디아미닐 그룹이다.
"폴록사머"는 한 블록의 PEO에 커플링된 한 블록의 폴리(프로필렌 옥사이드)에 커플링된 한 블록의 폴리(에틸렌 옥사이드)로 구성된, 즉, 식 EOa-POb-EOa의 구조의 선형 양친매성 블록 공중합체로, 여기서 EO는 에틸렌 옥사이드, PO는 프로필렌 옥사이드, a는 2 내지 130의 정수, b는 15 내지 67의 정수이다. 폴록사머는 일반적으로 3자리 식별자를 사용하여 명명되며, 처음 2자리에 100을 곱하면 PPO 함량의 대략적인 분자 질량이고, 마지막 자리에 10을 곱한 값은 PEO 함량의 대략적인 백분율을 나타내다.　예를 들어, "폴록사머 188"은 분자량 약 1800의 PPO 블록(약 31 PPO인 b에 해당)과 약 80%(w/w)의 PEO(약 82인 a에 해당)를 포함하는 중합체를 의미한다.　그러나, 값은 어느 정도 달라지는 것으로 알려져 있으며, 연구 등급 Lutrol® F68 및 임상 등급 Kolliphor® P188과 같은 상용 제품은 - 생산자의 데이터 시트에 따르면 둘 다 Poloxamer 188임 - 분자량에 있어 큰 변화를 나타내고 (7,680에서 9,510 사이), 이들 특정 제품에 제공된 a와 b의 값은 각각 약 79와 28인 것으로 표시된다. 이는 블록 공중합체의 이질적인 특성을 반영하며, 이는 a와 b의 값이 최종 제제에서 발견되는 평균임을 의미한다.
"폴록사민" 또는 "순차적 폴록사민" (Tetronic®이라는 상표명으로 시판됨)은 PEO-PPO-아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 모이어티 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PEO-PPO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다. 역 폴록사민도 마찬가지로, PPO-PEO 아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PPO-PEO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다.
바람직한 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머 또는 폴록사민이다.　바람직한 것은 폴록사머 407 및 188, 특히 폴록사머 188이다. 바람직한 폴록사민은 화학식 (PEO-PPO)4-ED의 순차적 폴록사민이다.　특히 바람직한 폴록사민은 각각 등록 상표 Tetronic® 904, 704 및 304로 시판되는 것들이다.　이들 폴록사민의 특성은 다음과 같다: Tetronic® 904는 총 평균 분자량이 6700이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 4020이며 PEO 비율이 약 40%이다.　Tetronic® 704는 총 평균 분자량이 5500이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 3300이며 PEO 백분율이 약 40%이며;　Tetronic® 304는 총 평균 분자량이 1650이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 990이며 PEO 백분율이 약 40%이다.
일부 실시 양태에서, 상기 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 0.2% w/v 내지 20% w/v, 예를 들어 0.2% w/v 내지 18% w/v, 0.2% w/v 내지 16% w/v, 0.2% w/v 내지 14% w/v, 0.2% w/v 내지 12% w/v, 0.2% w/v 내지 10% w/v, 0.2% w/v 내지 8% w/v, 0.2% w/v 내지 6% w/v, 0.2% w/v 내지 4% w/v, 0.4% w/v 내지 18% w/v, 0.6% w/v 내지 18% w/v, 0.8% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 18% w/v, 2% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 5% w/ v, 또는 2% w/v 내지 4% w/v의 양으로 포함한다. 0.5% w/v 내지 5% w/v 범위의 양이 특히 바람직하다.　다른 실시 양태에서, 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 2% w/v 내지 5% w/v, 예컨대 약 3% w/v의 양으로 포함한다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물의 경우, 상기 조성물은 세포의 형질감염을 용이하게 하는 분자를 추가로 포함할 수 있다.
약학적 조성물은, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 앓고 있거나 앓고 있다고 의심되는 환자와 같은 대상체에 적합한 임의의 투여 방식, 예를 들어 주사 (예: 피내 또는 근육내 주사)를 위한 액체 제제로 제제화될 수 있다.
일부 실시 양태에서 본 원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 벡터에 포함된)를 포함하는 약학적 조성물은 대상체에 투여하기 적합한 임의의 방식, 예를 들어, 피내, 근육내, 또는 피하 주사에 의해 투여되거나, 비강내 또는 경구 투여와 같은 점막 또는 상피 적용에 의해 투여될 수 있다.
바람직한 실시 양태에서, 약학적 조성물은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 벡터에 포함되어 포함하며 근육내 또는 피내 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 0.1 μg 내지 10 mg, 예를 들어 0.2 μg, 0.3 μg, 0.4 μg, 0.5 μg, 0.75 μg, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg, 또는 그 이상; 예를 들어 0.1 내지 10 mg, 예컨대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 mg 또는 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg의 범위로 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 이량체 단백질 또는 다량체 단백질의 양은 약학적 조성물이 예방적 또는 치료적 치료를 위해 투여되는지 여부, 이를 앓고 있는 개인의 면역 질환의 중증도 및 연령, 체중, 성별, 병력 및 기존 상태와 같은 매개변수에 따라 달라질 수 있다.
약학적 조성물의 제조 방법
본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신을 제조하기 위한 적합한 방법은 WO 2004/076489A1, WO 2011/161244A1, WO 2013/092875A1 및 WO 2017/118695A1에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 시험관 내에서 폴리펩티드를 생산함으로써 상기 정의된 바와 같은 다량체/이량체 단백질, 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 폴리펩티드 및 단백질의 시험관내 합성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 펩티드 합성 또는 다양한 발현 시스템에서 폴리펩티드의 발현에 이어 정제에 의해 수행될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 시험관 내에서 폴리펩티드를 생산함으로써 상기 정의된 바와 같은 다량체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 폴리펩티드 및 단백질의 시험관내 합성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 펩티드 합성 또는 다양한 발현 시스템에서 폴리펩티드의 발현에 이어 정제에 의해 수행될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 시험관 내에서 폴리펩티드를 생산함으로써 상기 정의된 바와 같은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 폴리펩티드 및 단백질의 시험관내 합성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 펩티드 합성 또는 다양한 발현 시스템에서 폴리펩티드의 발현에 이어 정제에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개, 3 개, 4 개 또는 그 이상의 폴리펩티드로 이루어진 다량체 단백질 또는 이량체 단백질; 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법이며,
여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 단계; 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 다량체 단백질 또는 이량체 단백질 또는 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 얻은 다량체 단백질, 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개, 3 개, 4 개 또는 그 이상의 폴리펩티드로 이루어진 다량체 단백질; 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법이며,
여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 단계; 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 다량체 단백질 또는 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 얻은 다량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계.
따라서, 본 발명의 추가 측면은 2 개의 폴리펩티드의 이량체 단백질; 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법이며,
여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염시키는 단계; 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고;
b) 세포를 배양하는 단계;
c) 이량체 단백질 또는 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 얻은 다량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계.
바람직한 실시 양태에서, 단계 c)에서 얻은 다량체 단백질, 이량체 단백질 또는 폴펩티드는 상기 약학적으로 허용가능한 담체에 용해된다.
바람직한 실시 양태에서, 단계 c)에서 얻은 다량체 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 약학적으로 허용가능한 담체에 용해된다.
바람직한 실시 양태에서, 단계 c)에서 얻은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 약학적으로 허용가능한 담체에 용해된다.
정제는 크로마토그래피, 원심분리 또는 용해도 차이와 같은 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;
b) 선택적으로 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 단계; 및
c) 단계 a)에서 얻은 폴리뉴클레오티드 또는 단계 b)에서 얻은 벡터와 약학적으로 허용가능한 단체를 혼합하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;
b) 선택적으로 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 단계; 및
c) 단계 a)에서 얻은 폴리뉴클레오티드 또는 단계 b)에서 얻은 벡터와 약학적으로 허용가능한 단체를 혼합하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항원-제시세포를 표적화하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;
b) 선택적으로 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 단계; 및
c) 단계 a)에서 얻은 폴리뉴클레오티드 또는 단계 b)에서 얻은 벡터와 약학적으로 허용가능한 단체를 혼합하는 단계.
폴리뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성을 통해 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
특히, 표적화 유닛 및/또는 이량체화 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 개별적으로 합성된 다음, 항원 유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 벡터에 연결함으로써 최종 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 벡터 백본에 연결될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 의약으로서 본원에 기술된 컨스트럭트, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 의약으로서 본원에 기술된 컨스트럭트, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 다량체 단백질의 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 의약으로서 본원에 기술된 컨스트럭트, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질의 용도에 관한 것이다.
치료
본 발명의 컨스트럭트 또는 약학적 조성물은 자가면역 질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 치료는 예방적 또는 치료적 목적일 수 있다.
상기 컨스트럭트/약학적 조성물은 이러한 약학적 조성물을 투여한 개인에서 관용을 유도하도록 투여된다, 관용은 단일 투여에 의해 유도되거나 바람직하게는 적절한 시간 간격을 두고 다중 투여에 의해 유도된다
추가적인 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 갖거나 가질 것으로 의심되거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 갖거나 가질 것으로 의심되거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 갖거나 가질 것으로 의심되거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1회 용량의 약이 대상체에게 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다중 용량의 약학적 조성물이 대상체에게 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛,이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약젝학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1회 투여량의 약이 대상체에게 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다회 투여량의 약학적 조성물이 대상체에게 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되는 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되는 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되는 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1 회 용량의 약이 대상체에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다회 용량의 약학적 조성물이 대상체에 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체에서 상기 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체에서 상기 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고있거나 앓고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체에서 상기 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1 회 용량의 약이 대상체에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다회 용량의 약학적 조성물이 대상체에 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체를 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 치료는 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체를 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 치료는 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체를 예방적으로 또는 치료적으로 치료하기 위한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 치료는 대상체에 다음을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다:
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1 회 용량의 약이 대상체에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다회 용량의 약학적 조성물이 대상체에 투여된다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 가지고 있거나 가지고 있다고 의심되거나 이의 예방이 필요한 대상체의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약을 제공하며, 상기 의약은 다음을 포함한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 1 회 용량의 약이 대상체에 투여된다. 일부 실시 양태에서, 다회 용량의 약학적 조성물이 대상체에 투여된다.
추가적인 측면에서, 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 구성된 군에서 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용되는 경우, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가적인 측면에서, 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 구성된 군에서 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용되는 경우, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
추가적인 측면에서, 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 구성된 군에서 선택된 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용되는 경우, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다
i) 항원-제시 세포를 표적화하거나 표적화할 수 있는 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 및 항원 유닛를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트 또는 약학적 조성물의 1 회 용량이 대상체에게 투여된다. 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트 또는 약학적 조성물의 다회 용량이 대상체에게 투여된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 이용하여 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법을 제공한다
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체에서 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관용-유도 컨스트럭트 또는 본원발명에 따른 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트 또는 약학적 조성물의 1 회 용량이 대상체에게 투여된다. 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트 또는 약학적 조성물의 다회 용량이 대상체에게 투여된다.
치료 성공의 지표는 항원-특이적 조절 T 세포의 수준 증가, 항원-특이적 이펙터 T 세포의 수준 감소 (및 조절 T 세포의 수준 증가), 효과 T 세포 수준 감소, 항원 유닛/항원 유닛의 T-세포 에피토프로 자극된 경우 ELISPOT에서 T 세포 활성화 수준 감소, 호염기구 활성화 시험 (BAT)에서 호염기구 활성화 수준의 감소를 포함하여 당업계에 알려져 있다.
마찬가지로 방사성알레르기 흡착 시험(radioallergosorbent test; RAST)을 사용하여 면역치료 컨스트럭트의 투여 전후에 대상체로부터 채취한 혈액 시료에서 알레르겐-특이적 IgE 항체 수준을 비교할 수 있으며, 여기서 더 낮은 알레르겐-특이적 IgE 항체 수준은 성공적인 관용 유도를 나타낸다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 벡터의 설계 및 생산
실시예 1a, 1b 및 1c에 기재된 모든 유전자 서열은 GenScript (New Jersey, US)에서 주문하였고, 발현 벡터 pALD-CV77로 클론시켰다.
실시예 1a: 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 벡터의 설계 및 생산.
미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG)은 중추 신경계에 위치한 단백질이다. MOG의 면역우세 35-55 에피토프(MOG 35-55)는 다발성 경화증 동안 세포성 및 체액성 면역 반응 모두에 대한 주요 표적이다. MOG(35-55)-유발 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 가장 일반적으로 사용되는 다발성 경화증의 동물 모델이다 (Hunterman, H. et al. 2022).
표 1에 기술한 바와 같이, 다음의 유닛/일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계하였다.
컨스트럭트 ID 신호 펩티드 표적화 유닛 이량체화 유닛 항원 유닛 아미노산 서열:
VB5001b 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 NA NA MOG(27-63)* SEQ ID NO: 37
VB5051 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 NA NA MOG(27-63) SEQ ID NO: 24
VB5002b 천연 선도 서열 인간 CCL3L1 Human CCL3L1 인간 IgG3의 힌지-영역 1

인간 IgG3의 힌지-영역 4

글리신-세린-링커.
　
인간 IgG3 CH3 도메인.

유닛 링커: 글리신-류신 링커　		 MOG(27-63)* SEQ ID NO: 38
VB5052 천연 선도 서열 인간 CCL3L1　 Human CCL3L1　 MOG(27-63) SEQ ID NO: 18
VB5003b 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 쥣과의 CD205에 대해 특이성 갖는 scFv MOG(35-55)　 SEQ ID NO: 13
VB5004b 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 쥣과의 CD205에대해 특이성 갖는 scFv　 MOG(27-63)* SEQ ID NO: 39
VB5005b 천연 선도 서열 쥣과의 IL-10 쥣과의 IL-10 MOG(35-55) SEQ ID NO: 14
VB5006b 천연 선도 서열 쥣과의 IL-10 쥣과의 IL-10 MOG(27-63)* SEQ ID NO: 40
VB5012b 천연 선도 서열 쥣과의 SCGB3A2 쥣과의 SCGB3A2 MOG(35-55)　 SEQ ID NO: 41
VB5046 천연 선도 서열 쥣과의 VSIG-3 쥣과의 VSIG-3** MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 16
VB50048 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 쥣과의 CD205에대해 특이성 갖는 scFv　 MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 17
VB5058 천연 선도 서열 쥣과의 IL-10 쥣과의 IL-10 MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 19
VB5059 천연 선도 서열 쥣과의 TGF*?*1 쥣과의 TGFβ1 MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 20
VB5060 천연 선도 서열 쥣과의 SCGB3A2 쥣과의 SCGB3A2 MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 21
VB5061 천연 선도 서열 쥣과의 CTLA4 쥣과의 CTLA-4** MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 22
VB5071 천연 선도 서열 쥣과의 PD-1 쥣과의 PD-1** MOG(27-63)　 SEQ ID NO: 23
표 1
*쥣과의 MOG (27-63) 서열은 Krienke et al. 2021 및 US 특허 출원 US2020061166A1으로부터 수득하였다.
**세포외 도메인 (Extracellular domain)
DNA 벡터 VB5003b, VB5004b, VB5005b, VB5006b, VB5012b, VB5046, VB5048, VB5058, VB5059, VB5060, VB5061 및 VB5071는 표 1에 특정된 바와 같이 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 인코딩한다. 상기 쥣과의 MOG (27-63) 항원 유닛은 T-세포 에피토프 MOG(35-55)를 포함한다.
DNA 벡터 VB5002b 및 VB5052는 호-염증성 방법으로 APC를 표적화하는 것으로 알려진 인간 CCL3L1 표적화 유닛을 포함하는 컨스트럭트 (“백시바디”)를 인코딩하며, 즉, 이러한 표적화 유닛을 포함하는 컨스트럭트는 이들이 투여된 대상체에서 향상된 면역 반응을 유도할 것이고 이러한 화합물은 증가된 IFN-γ 생산과 함께 활성화된 면역 반응을 유도하는 것으로 예상된다 (예를 들어 WO2011161244 A1 참고).
DNA 벡터 VB5001b 및 VB5051은 표적화 유닛 또는 이량체화 유닛을 인코딩하지 않고, 항원 유닛으로서 MOG(27-63) 만, 즉 신호 단백질/펩티드를 인코딩한다.
실시예 1b: 당뇨병 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 벡터의 설계 및 생산
글루탐산 탈탄산효소 65 (GAD65)는 당뇨병의 주요 자가항원으로 여겨진다. 펩티드 GAD65(201-220)는 GAD65로 면역화한 후 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 대립유전자 HLA-DQ8을 발현하는 형질전환 마우스에서 가장 큰 T-세포 반응을 보였다. GAD65(206-220)는 NOD 마우스에서 GAD65의 면역우세 T 세포 에피토프이다 (Liu, J. et al. 1999).
표 2에 기술된 바와 같이, 하기 유닙/일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터가 설계되었다.
컨스트럭트 ID 신호 펩티드 표적화 유닛 이량체화 유닛 항원 유닛 아미노산 서열:
VB5016b 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 쥣과의 CD205에 특이성을 갖는 scFv　 인간 IgG3의 힌지-영역 1
인간 IgG3의 힌지-영역 4
글리신-세린-링커.
인간 IgG3 CH3 도메인.
유닛 링커: 글리신-류신 링커 　		 GAD65(202-221) SEQ ID NO: 27
VB5015b 천연 선도 서열 인간 CCL3L1　 인간 CCL3L1 GAD65(202-221) SEQ ID NO: 26
VB5014b 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드　 NA NA GAD65(202-221) SEQ ID NO: 25
표 2
DNA 벡터 VB5016b는 표 2에 기재된 바와 같이 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트를 인코딩한다.
DNA 벡터 VB5015b는 호-염증성 방식으로 APC를 표적화하는 것으로 알려진 인간 CCL3L1 표적화 유닛를 포함하는 컨스트럭트 (“백시바디”)를 인코딩하며, 즉, 이러한 표적화 유닛을 포함하는 컨스트럭트는 그들이 투여되는 대상체에서 염증성 면역반응을 유도하고 이러한 화합물은 IFN-γ 생산을 유도하는 것으로 예상된다(예를 들어 WO2011161244 A1 참고).
DNA 벡터 VB5014b는 표적화 유닛 또는 이량체화 유닛을 인코딩하지 않고, 항원 유닛으로서 GAD65(202-221), 즉, 단일 단백질/펩티드 만을 인코딩한다.
쥣과의 글루탐산 탈탄산효소 65 (GAD65) 202-221 (SEQ ID NO: 183) 항원 유닛은 공지된 T-세포 에피토프 GAD65 (206-220) 및 GAD65(202-221)를 포함한다.
실시예 1c: 새우 알레르기 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 벡터의 설계 및 생산.
트로포미오신은 어패류에서 주요 알레르기 유발물질이다. Met e 1 과민증의 Balb/c 마우스 모델에서 메타페나에우스 엔시스 (Metapenaeus ensis) 종 (Met e 1)의 트로포미오신에 대한 6 개의 주요 T-세포 에피토프가 확인되었다. 6 개의 T-세포 에피토프의 펩타이드를 사용한 경구 면역요법은 새우 트로포미오신에 대한 알레르기 반응을 효과적으로 감소시켰다 (Wai, C.Y.Y et al. 2015).
표 3에 기재된 바와 같이, 다음의 유닛/일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터가 설계되었다.
컨스트럭트 ID 신호 펩티드 표적화 유닛 이량체화 유닛 항원 유닛
VB5024 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드 쥣과의 CD205에 특이성을 갖는 scFv 인간 IgG3의 힌지-영역 1
인간 IgG3의 힌지-영역 4
글리신-세린-링커.
인간 IgG3 CH3 도메인.
유닛 링커: 글리신-류신 링커		 Met e 1 (241-260)
VB5030 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드 쥣과의 CD205에 특이성을 갖는 scFv Met e 1　(241-260), (210-230), (136-155), (76-95),　(46-65), (16-35)
VB5079 쥣과의 Ig VH 신호 펩티드 쥣과의 CD205에 특이성을 갖는 scFv Met e 1 (1-274)
표 3
항원 유닛의 서열은 아래의 표 3a에 추가로 기재된다.
표 3a
DNA 벡터 VB5024, VB5030 및 VB5079는 표 3에 기술된 바와 같이 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 관용 유도 컨스트럭트를 인코딩한다.
Met e 1 (241-260), (210-230), (136-155), (76-95), (46-65), (16-35) 항원 유닛 (SEQ ID NO: 29)는 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56) 링커를 T-세포 에피토프들 사이에 포함한다. The Met e 1 (1-274) 항원 유닛 (SEQ ID NO: 30) 완전한 Met e 1 알레르겐을 포함한다.
실시예 1d: 다발성 경화증의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 다른 DNA 컨스트럭트의 설계 및 생산.
실시예 1d 및 1e에 설명된 테스트된 구성의 모든 유전자 서열은 Genscript(860 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA)에서 주문하고 발현 벡터 pALD-CV77에만 클로닝된 컨스트럭트 VB5017을 제외하고, 발현 벡터 pUMVC4a 및/또는 pALD-CV77에 클로닝했다.
마우스에 사용하기 위해, 다양한 쥣과의 신호 펩티드 및 표적화 유닛, 동일한 쥣과의 이량체화 유닛 및 짧은 T 세포 에피토프 쥣과의 다발성 경화증 (MS) 자가항원 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG)의 짧은 T 세포 에피토프, 즉 MOG (35-55) 또는 쥣과의 MOG의 더 긴 T 세포 에피토프, 즉, MOG (27-63)를 포함한 항원 유닛을 포함하는 8개의 컨스트럭트 (DNA 플라스미드)를 설계하였다.
*세포외 도메인
실시예 1e: 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트의 설계 및 생산
마우스에 사용하기 위해서, 쥣과의 글루탐산 탈탄산효소, GAD65 (202-221)의 T 세포 에피토프를 포함하는 하나의 컨스트럭트 (DNA 플라스미드)를 설계하였다. GAD65는 중요한 당뇨병 자기-항원. 상기 컨스트럭트는 아래의 표에 나타낸 요소들을 더 포함한다 (모두 쥣과의 단백질):
실시예 1f: 새우 알레르기의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트의 설계 및 생산
마우스에 사용하기 위한 트로포미오신의 T 세포 에피토프 (Pan b 1 에피토프)를 포함하는 컨스트럭트 (DNA 플라스미드)가 설계된다. 이러한 에피토프는 중요한 어패류 알레르기 유발 인자이다. 상기 컨스트럭트는 다음 표의 구성 요소를 추가로 포함한다 (모두 쥣과의 단백질):
실시예 2a: MOG 함유 컨스트럭트의 단백질 발현 및 분비의 시험관 내 특성
이 연구의 목적은 포유동물 세포에 일시적 형질감염 후 MOG 함유 DNA 벡터에 의해 인코딩된 단백질 발현 및 단백질의 분비를 특징짓는 것이다.
HEK293 세포는 ATCC로부터 얻었고 MOG 함유 DNA 벡터(VB5002b, VB5003b, VB5004b, VB5005b, VB5006b 및 VB5012b)로 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히 말하면, 2x105 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조자(Thermo Fischer Scientific)가 제안하는 조건 하에서 리포펙타민® 2000 시약을 사용하여 각각의 DNA 벡터 1μg으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 5% CO2, 37°C에서 5일 동안 유지하고 세포 상청액을 수집했다.
Expi293F 세포를 Thermo Fisher로부터 얻었고 MOG(27-63) 함유 DNA 벡터 (VB5052, VB5046, VB5048, VB5058, VB5059, VB5060, VB5061 및 VB5071)로 일시적으로 형질감염 되었다. 간략하게 설명하면, Expi293F 세포 (1.7x106 세포/ml, 1ml)를 96-웰 배양 플레이트에 접종했다. 엑스피펙타민 293 (ExpiFectamine 293) 시약(Thermo Fisher Sci.)을 사용하면서 0.64 μg/ml 플라스미드 DNA로 세포를 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터 (8% CO2, 37°C) 내 궤도 진탕기 (직경 3 mm, 900 rpm)에서 인큐베이션 하였다. 상청액은 형질감염 72시간 후에 수집하였다.
MOG 포함 벡터에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비는 MOG에 대한 항체 (포획 항체, 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology) 및 hIgG CH3 도메인에 대한 항체 (검출 항체, 마우스 항-인간 IgG Fc 2차 항체, 비오틴, 0.1 μg/ml, 100 μl/웰, 05-4240, Invitrogen)를 사용하여 상청액의 샌드위치 ELISA에 의해 특징화되었다 도 2A와 2B는 14 개의 MOG 함유 컨스트럭트 모두가 높은 수준으로 발현되고 분비되었음을 보여준다.
MOG 항원 유닛과 6 개의 서로 다른 표적화 유닛을 포함하는 전장의 관용-유도 단백질의 분비가 MOG 및 쥣과의 IL-10, TGFβ1, SCGB3A2, CTLA-4, PD-1 및 CCL1L3의 서열 각각을 갖는 표적화 유닛에 대한 항체를 이용해 상청액의 샌드위치 ELISA를 통해 확인되었다. 관용-유도 단백질에 대한 결과는 도 3A-3F에 표시되며 호-염증성 대조군은 도 3G에 표시된다.
IL-10 (VB5005b, VB5006b 및 VB5058), TGFβ1 (VB5059), SCGB3A2 (VB5060), CTLA-4 (VB5061), PD-1 (VB5071) 및 CCL3L1 (VB5052) 각각의 검출과 MOG의 검출은 전장의 관용-유도 단백질과 호-염증성 대조군의 높은 수준의 분비를 보여준다.
벡터 VB5051에 의해 인코딩되는, MOG(27-63) 항원 단독 대조 펩티드의 분비 및 발현을 평가하기 위해, Expi293F 세포를 VB5051로 일시적으로 형질감염시키고, 3일 후에 상청액을 수집하였다. VB5051의 분비 및 발현은 상청액을 코트로 사용하여 MOG에 대한 항체(마우스 항-MOG 항체, 3.3 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 직접 ELISA로 평가하였다. 도 4는 VB5051로 포유동물 세포를 형질감염시키면 MOG(27-63) 펩티드가 분비된다는 것을 보여준다.
실시예 2b: 본 발명의 컨스트럭트의 단백질 발현 및 분비의 시험관 내 특성
이 연구의 목적은 DNA 플라스미드로 포유동물 세포에 일시적 형질감염시킨후, 상기 단백질의 표적화, 이량체화 및 항원 유닛에 대한 특이적 항체의 결합을 이용하는 ELISA 분석에 의해 세포 상청액 내 단백질의 존재를 측정함으로써 단백질 발현 수준을 특징화하는 것이다.
HEK293 세포는 ATCC로부터 입수하였다. HEK293 세포를 컨스트럭트로 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히 말하면, 2x105 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조사(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)가 제안한 조건 하에서 리포펙타민® 2000 시약을 사용하여 1 μg DNA 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 5% CO2, 37℃에서 6일 동안 유지하고, 단백질 발현의 특징화를 위해 세포 상청액을 수집했다.
HEK293 세포에서 생산되어 세포 상청액으로 분비되는 단백질의 양을 확인하기 위해 ELISA를 수행하였다. MaxiSorp Nunc-면역 플레이트는 100 μl/웰의 1x PBS 내의 포획 항체로서 0.06 μg/ml의 토끼 항 인간 TGFbeta1 (orb77216, Biorbyte)로 코팅되었고 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 미세역가 웰은 1x PBS 내 200 μl/웰 4% BSA를 첨가하여 차단되었다. DNA 플라스미드로부터 발현된 단백질을 함유하는 형질감염된 HEK293 세포의 세포 상청액 100 μl를 플레이트에 첨가하였다.
검출 항체에 대하여, 1 μg/ml 비오티닐화된 마우스 항-인간 IgG (HP6017, Invitrogen, 컨스트럭트에 포함된 이량체화 유닛의 CH3 도메인에 결합)를 첨가하고 인큐베이팅하였다. 그 후, SA-HRP (스트렙트아비딘 호스래디쉬 페록시다아제, S2438-250UG, Sigma-Aldrich, 1:3000)를 첨가하고 인큐베이팅하였다. 명시하지 않는 한 모든 인큐베이션은 37 ℃에서 1 시간 동안 수행된 후 PBS-트윈으로 3회 세척했다. 그 후, 100 μl/웰의 TMB 용액을 첨가하고 100 μl/웰의 1 M HCl을 첨가한 후 5-15분 후에 발색을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도는 자동화된 플레이트 판독기 (Thermo Scientific Multiscan GO) 상에서 측정되었다.
도 13은 컨스트럭트 VB5009가 단백질로 발현되고 분비되었을 보여준다.
실시예 3: Met e 1 함유 컨스트럭트의 단백질 발현 및 분비의 시험관 내 특성
이 연구의 목적은 포유동물 세포의 일시적 형질감염 후 Met e 1 함유 DNA 벡터(표 3 참조)에 의해 인코딩된 관용-유도 단백질의 단백질 발현 및 분비를 특징짓는 것이다.
간략하게 설명하면, Expi293F 세포(1.7x106 세포/ml, 1 ml, Thermo Fisher Sci.)를 96웰 배양 플레이트에 접종하였다. 엑스피펙타민 293 시약 (Thermo Fisher Sci.)을 사용하여 세포를 0.64 μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터 (8% CO2, 37℃) 내 궤도 진탕기 (직경 3 mm, 900 rpm)에서 인큐베이션 하였다. 상청액은 형질감염 72시간 후에 수집하였다.
Met e 1 포함 벡터에 의해 인코딩된 분비된 단백질은 hIgG CH3 도메인에 대한 항체 (포획 항체, 0.5 μg/ml 마우스 항-인간 IgG3 (CH3 도메인) 항체, 100 μl/웰, MCA878G) 및 hIgG Fc 도메인에 대한 항체 (검출 항체, 0.250 μg/ml CaptureSelect™ 비오틴 항-IgG-Fc(인간) 컨쥬게이트, 100 μl/웰, 7103262100, Invitrogen)를 사용하여 상청액의 샌드위치 ELISA에 의해 특징화되었다. 결과는 도 5에서 보여진다.
도 5로부터 명백한 바와 같이, 모든 Met e 1 함유 관용-유도 단백질 (VB5024, VB5030 및 VB5079)이 발현되고 분비되었다.
실시예 4: DEC205 수용체에 대한 관용-유도 컨스트럭트의 결합의 시험관 내 특성
이 실험의 목적은 재조합 DEC205 수용체에 대한 VB5004b의 scFv 항-DEC205 표적화 유닛 (표 1 참조)의 기능적 결합을 특징짓는 것이다. 상기 표적화 유닛의 기능적 결합은 표적화 유닛으로서 scFv 항-DEC205를 인코딩하는 관용-유도 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 상청액에, 재조합 DEX205 수용체로 ELISA-플레이트를 코팅하고 검출 항체로서 항원 유닛 또는 이량체화 유닛에 대한 항체를 사용하여 평가되었다.
HEK293 세포는 ATCC로부터 얻었고, scFv 항-DEC205 인코딩 DNA 벡터 VB5004b로 일시적으로 형질감염시켰다. 간략하게 말하면, 2x105 HEK293 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조사(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)가 제안한 조건 하에서 리포펙타민® 2000 시약을 사용하여 각각의 DNA 벡터 1 μg으로 형질감염 시켰다. 상기 형질감염된 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 5일 동안 유지하였고, 상기 세포 상청액을 수집하였다. scFv 항-DEC205 포함 벡터에 의해 인코딩된 분비 단백질은 상청액의 직접 ELISA에 의해 특징을 확인하였다. ELISA 플레이트가 100 μl/웰의 5 μg/ml 재조합 DEC205(216-503) (OPCD05072, Aviva Systems Biology)로 코팅되었고 상청액을 첨가하기 전에 차단되었다. 재조합 수용체로의 결합은 MOG (100 μl/웰, 1 μg/ml 마우스 항-MOG 항체, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체 또는 hIgG CH3 도메인에 대한 항체 (100 μl/웰, 0.1 μg/ml 마우스 항-인간 IgG Fc 2차 항체, 비오틴, 05-4240, Invitrogen)로 검출하였다. 결과는 도 6에 보여진다.
도 6은 관용-유도 단백질인 VB5004b를 포함하는 scFv 항-DEC205가 DEC205 수용체에 결합하고 전장의 관용-유도 단백질이 분비되는 것을 확인한다.
실시예 5: IL10 수용체에 대한 관용-유도 컨스트럭트의 결합에 대한 시험관 내 특성
이 실험의 목적은 재조합 IL-10 수용체 (IL-10R)에 대한 VB5006b의 IL-10 표적화 유닛 (표 1 참조)의 기능적 결합의 특성을 확인하는 것이다. 표적화 유닛의 기능적 결합은 표적화 유닛으로서 IL-10을 인코딩하는 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 상층액에 대해, ELISA-플레이트를 재조합 IL-10 수용체로 코팅하고 검출 항체로서 항원 유닛 또는 이량체화 유닛에 대한 항체를 사용한 ELISA에서 측정된다.
간략하게, HEK293 세포는 ATCC로부터 얻어 IL-10 함유 DNA 벡터 VB5006b로 일시적으로 형질감염되었다. 간단히 말하면, 2x105 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조사(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)가 제안한 조건 하에서 리포펙타민® 2000 시약을 사용하여 각각의 DNA 벡터 1 μg으로 형질감염 시켰다. 상기 형질감염된 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 5일 동안 유지하였고, 상기 세포 상청액을 수집하였다. IL-10 포함 벡터에 의해 인코딩된 분비 단백질은 상청액의 직접 ELISA에 의해 특성이 확인되었다. ELISA 플레이트가 100 μl/웰의 2.5 μg/ml 재조합 IL-10 수용체로 코팅되었고 상청액을 첨가하기 전에 차단되었다. 재조합 수용체로의 결합은 MOG (100 μl/웰, 1 μg/ml 마우스 항-MOG 항체, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체 또는 hIgG CH3 도메인에 대한 항체 (100 μl/웰, 0.1 μg/ml 마우스 항-인간 IgG Fc 2차 항체, 비오틴, 05-4240, Invitrogen)로 검출하였다. VB5006b에 대한 결과는 도 7에 보여진다.
도 7은 IL10 포함 관용-유도 단백질, VB5006b의 IL-10 수용체로의 결합 및 전장의 관용-유도 단백질이 분비되는 것을 확인한다.
실시예 6: 관용유도 컨스트럭트의 크기 및 단백질 완전성에 대한 의 시험관내 특성
VB5046, VB5052, VB5058, VB5059, VB5061 및 VB5071에 의해 인코딩되는 단백질의 특성을 더 확인하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포의 상청액 시료에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
간략하게 설명하면, Expi293F 세포 (1.7x106 세포/ml, 1ml)를 96-웰 배양 플레이트에 접종하였다. 상기 세포는 엑스피펙타민 293 시약 (Thermo Fisher Sci.)을 사용하여 0.64 μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염되었고, 상기 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터 (8% CO2, 37°C) 내 궤도 진탕기 (직경 3 mm, 900 rpm)에서 인큐베이션 하였다. 상청액은 형질감염 72시간 후에 수집하였다.
시료는 환원 및 비-환원 조건을 위해, 각각, 1 μl의 DTT (Cayman Chemical) 또는 1 μl의 초순수 및 5 μl의 4x Laemmli 시료 완충액 (Bio-Rad)과 형질감염된 Expi293F 세포의 상청액 14 μl를 혼합하여 준비하였다 (주어진 비율에 따른 총 시료량의 확대). 시료(환원 또는 비-환원)를 70°C에서 10분간 가열한 후 4%?20% 기준 TGX 스테인-프리 프리캐스트 겔 (Criterion TGX Stain-Free precast gel, Bio-Rad)에 첨가하였다. SDS-PAGE는 Precision Plus Protein All Blue Prestained 표준 단백질 (Bio-Rad)을 사용하여 1x 트리스/글리신/SDS 러닝 버퍼 (Bio-Rad)에서 수행되었다. Tran-Blot Turbo 반건식 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 겔에서 EtOH 활성화 저형광 (LF) 0.45 μm PVDF 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. PVDF 막을 EveryBlot 완충액(Bio-Rad)에서 5분간 차단하고 마우스 항-MOG(sc-73330, Santa Cruz Biotechnology), 랫트 항-쥐과의 IL-10 (MAB417, R&D Systems) 또는 염소 항-쥐과의 CTLA-4 (AF467, R&D Systems)로 MOG, IL-10 또는 CTLA-4 각각을 검출하였다. 상기 막을 형광색소-결합된 종-특이적 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 ?延?베이션한 다음 세척하고 건조했다. Dylight 488 채널에서, IL-10 검출을 위해 막을 Dylight-488 2차 항체로 재-프로브되었다. 막은 에탄올 및 TBST에서 재활성화 되었다. 막을 차단하고 Dylight 488-결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하고 건조했다. ChemiDoc™ MP 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득하였다.
항-MOG 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석은 전장 관용-유도 단백질과 VB5052의 분비를 보여준다(도 8A). VB5059을 제외한, 모든 단백질은 단백질 서열을 기준으로 예상한 것보다 더 높은 분자량을 갖는 것으로 보이며, 이는 번역 후 변형으로 인한 것일 수 있다. VB5059는 표적화 유닛으로서 TGFβ1를 가지며, 이는 잠복기- 관련 펩티드 (latency-associated 펩티드)와 성숙한 TGFβ1으로 절단될 때 크기가 28 kDa만큼 감소하는 것으로 알려져 있다. 도 8B 는 단백질이 비환원 조건 하에서 이량체를 형성한다는 것을 보여준다. 도 8B는 또한 비환원 조건 하에서 단백질의 단량체 형태가 존재함을 나타낸다. 항-IL-10 및 항-CTLA-4 (각각 도 8C 및 8D)로 프로브된 막은 항-MOG(그림8A)로 프로브된 막에서 검출된 밴드와 동일한 분자량에 해당하는 밴드를 표시하였다. 따라서, 도 8C 및 8D는 MOG 및 IL-10 또는 CTLA-4, 각각은, 동일한 융합 단백질의 일부임을 나타낸다. 도 8C 및 8D 에서 VB5048은 항-IL-10 및 항-CTLA-4, 각각이 비특이적으로 결합하지 않는다는 것을 보여주기 위한 대조군으로서 포함되었다.
실시예 7: 본 발명의 DNA 벡터의 관용 유도 능력의 평가
VB5004b의 관용-유도하는 능력 (표 1에 기술됨)은 VB5004b로 백신 접종된 마우스의 비장에서 평가되었고, 유도된 IL-10/IFN-γ 비율을 계산하여 결정하였다. IL-10 (면역 관용과 관련된 비-염즘성 사이토카인) 및 IFN-γ (염증성 면역 반응을 유도하는 마커) 신호는 MOG(35-55) 펩티드로 백신 접종된 마우스에서 수확한 비장 세포를 재자극한 후 이중 색상 플루오로스팟 분석에서 결정되었다. 상기 IL-10/IFN-γ 비율은 DNA 벡터에 의해 유도된 면역 반응이 관용원성 반응 쪽으로 어느 정도 치우쳐 있는지를 나타낸다. 관용원성 프로파일은 유도된 Foxp3+ 세포의 빈도와 VB5004b 백신 접종 후 CD4+ T 세포로부터 IFN-γ+ 및 IL-17+ 생산의 결핍 (lack)으로 추가로 평가되었다. 얻어진 결과를 호-염증성 대조군 백신 VB5002b (표 1에 설명)에 의해 유도된 반응 및 VB5001b의 관용-유도 능력 (표 1에 설명)과 비교했다.
마우스 백신 접종 및 플루오로스팟
다음 연구 설계가 적용되었다:
6주령 암컷 C57BL/6 마우스는 Janvier Labs (프랑스)에서 구입했다. 모든 동물은 래디움 병원(Radium Hospital, 노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. VB5004b, VB5002b 및 VB5001b의 시험에는 그룹당 4-5 마리의 마우스를 사용하였으나, 음성 대조군 (PBS 만)에는 그룹당 2 마리의 마우스를 사용했다. VB5002b는 MOG(27-63) 컨스트럭트의 호-염증성 버전으로 포함되었고, 이는 APC를 표적으로 하고 염증성 면역 반응을 유도하는 것으로 알려진 인간 CCL3L1 표적화 단위를 포함한다. 즉, 이러한 표적화 유닛을 포함하는 컨스트럭트는 그것이 투여되는 대상체에서 호-염증성 면역 반응을 유발하며 이러한 화합물은 인코딩된 항원에 특이적인 T 세포에서 IFN-γ 생산을 유도할 것으로 예상된다. MOG(27-63) 펩티드 만을 인코딩하는 DNA 벡터, VB5001b, 는 VB5004b와의 비교 대상으로 포함되었다.
멸균 PBS에 용해된 VB5004b 또는 대조군 DNA 벡터 VB5001b 및 VB5002b 50 μg의 1회 용량이 각 전경골근에 근육내 바늘 주사(2 x 25 μl, 1000 μg/ml)로 투여된 후, AgilePulse를 사용한 생체내 전기천공 시스템을 사용하여 전기천공했다 (BTX, USA).
백신 접종 7일 후 비장을 수확하고 세포 스트레이너에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 적혈구는 염화암모늄-칼륨 (ACK) 용해 완충액을 사용하여 용해하였다. 세척 후, 상기 비장세포를 NucleoCounter NC-202(ChemoMetec, 덴마크)를 사용해서 계수하였고, 최종 농도 6x106 세포/ml로 재현탁하고, 6x105 세포/웰로 96-웰 IFN-γ/IL-10 이중 색상 플루오로스팟 플레이트에 접종하였다. 그 다음 제조사 (Mabtech AB, Sweden)의 프로토콜에 따라 이중 색상 플루오로스팟 분석에서 IFN-γ 및 IL-10 사이토카인 생산을 시험하기 전에, 상기 비장세포는 44시간 동안 16.67 μg/ml MOG (35-55) 펩티드로 재자극되었다. 스팟-형성 세포는 IRIS 플루오로스팟 및 ELISpot 플레이트 판독기(Mabtech AB)에서 측정하고 Apex 소프트웨어(Mabtech AB)를 사용하여 분석하였다. 결과는 IL-10+ 또는 IFN-γ+ spots/106 비장세포의 3회 평균값으로 표시된다.
도 9A에서 볼 수 있듯이, VB5004b는 VB5001b에 의해 유도된 수준에 비해 더 높은 수준의 IL-10을 유도했다. 또한, 상승된 수준의 IFN-γ를 유도하는 VB5002b와는 대조적으로, VB5004b 백신 접종에 반응하여 낮은 배경 수준의 IFN-γ이 검출되었다. 도 9B는 도 9A에 제시된 값으로부터 계산된 IL-10/IFN-γ의 비율을 보여준다. 상기 IL-10/ IFN-γ 비율은 VB5004b에서 높으며, 이는 VB5004b가 염증성 사이토카인 IFN-γ 보다 면역억제성 사이토카인 IL-10을 현저히 더 놓은 수준으로 유도했음을 의미한다. 대조적으로, VB5002b가 투여된 마우스의 비장세포는 약 1의 IL-10/IFN-γ 비율을 보였고, 이는 MOG (35-55) 펩티드로 재-자극된 후에 두 사이토카인 모두 동등한 수준으로 생산되었음을 의미한다. 과도한 염증을 방지하고 염증의 궁극적인 해결을 보장하기 위해서, IFN-γ와 같은 호-염증성 사이토카인의 생성이 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 생성을 포함한- 음성 피드백 메커니즘에 의해 조절되는 것이 중요하다 (Sugimoto MA et al 2016). 따라서, VB5002b에서 관찰되는 증가된 수준의 IL-10은 유도된 염증성 반응을 제어하기 위한 이러한 피드백 메커니즘으로 설명될 수 있다. VB5001b와 비교해서 VB5004b에서 현저히 증가된 IL-10/IFN-γ 비율이 또한 나타났고, 이는 VB5002b 및 VB5001b 대비 VB5004b의 더 높은 관용-유도 잠재력을 나타낸다.
유세포분석
상기 비장세포는 유세포분석을 통해 Foxp3, IFN-γ 및 IL-17의 발현에 대해 추가로 분석되었다. Foxp3는 조절 T 세포 (Tregs)의 발달과 기능에서 억제 경로의 최종 (master) 조절자이다.
간략하게, MOG(35-55) 펩티드로 16시간 재-자극한 후, 세포를 수확하고, 계수하고, 세척한 후 어둠 속에서 10분간 고정 생존 염료(FVD)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 원심분리하고 세척한 후 표면 염색 혼합물 (항-CD3 (BUV395), 항-CD4 (BV785) 및 항-CD8)을 첨가하고 4℃ 암실에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션한 후에, 상기 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 재현탁시킨 후, 유동 완충액 (PBS, 10% FBS 및 2 mM EDTA)에서 세척하였다. Foxp3 고정/투과화 용액을 세포에 첨가하고 암실에서 4℃, 60분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 단계 후, 세포를 재현탁시키고 투과성 완충액에서 세척한 후 원심분리하고 세포내 항체 혼합물 (항-Foxp3 (Alexa fluor 700), 항-IFN-γ (APC), 항-IL-17 (Alexa fluor 488))을 첨가하고, 암실에서 4℃, 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고 획득될 때까지 유동 완충액에 재현탁시켰다. 고정 생존 염료를 위해 단일 염색된 Ultra comp eBeads 및 ArC 반응성 비드를 사용하여 보상을 설정했다. 염색의 품질을 평가하기 위해 우리는 유체 불일치, 세포 파편, 더블릿 (doublet) 및 사멸 세포를 배제하는 게이팅 전략을 고안했다. 우리는 CD3의 발현을 기반으로 T 세포를 추가로 정의했다. CD3+ T 세포를 CD4의 발현에 대해 검사한 다음 세포를 Foxp3 및 사이토카인 발현에 대해 분석했다. 각 그룹의 자극되지 않은 세포를 사용하여 분석에서 사이토카인 생산의 배경 수준을 평가했다. 유세포 분석 파일 (FCS)을 FACSDiva™ 소프트웨어에서 내보내고 FlowJo를 사용하여 분석했다. 유세포 분석에서 얻은 데이터는 GraphPad 프리즘 9를 사용하여 분석되었다.
도 10A에 나타낸 바와 같이, CD4+ T 세포 중 Foxp3+ 세포의 비율이 VB5002b, VB5001b 또는 PBS로 백신 접종한 마우스에서 검출된 수준과 비교하여 VB5004b로 백신 접종한 마우스에서 크게 증가했다. IFN-γ 및 IL-17 모두 호-염증성 사이토카인으로 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 및 다발성 경화증을 포함하는 만성 염증성 및 자가면역 질환의 발병에 기여한다 (Gobel K et al 2018). 따라서, 관용원성 백신은, 예를 들어 자가면역성을 악화시킬 수 있는 호-염증성 사이토카인을 유도하는 것 처럼 자가항원 면역반응을 부주의하게 감작시키지 않고 신뢰성 있게 관용을 유도해야 한다. 도 10B 및 10C에서 볼 수 있는 바와 같이, VB5002b에 대한 반응으로 IFN-γ 및 IL-17 발현의 증가가 검출된 반면, VB5004b로 백신 접종된 마우스에서는 이러한 호-염증성 사이토카인의 결핍이 확인되었다.
실시예 7은 따라서 scFv 항-DEC205 표적화 유닛 및 MOG (27-63) 항원 유닛을 인코딩하는, VB5004b가 더 높은 비염증성 대 염증성 사이토카인 비율 (IL-10/IFN-γ)을 유도하였음을 보여주며 호-염증성 버전 VB5002b 대비 염증성 사이토카인 생성의 결핍을 보여준다. 실시예 7은 VB5004b가 VB5001b, VB5002b 및 PBS 백신 접종된 마우스의 배경 수준과 비교하여 더 높은 빈도의 Foxp3+ CD4+ T 세포를 유도한다는 것을 보여주며, 이는 대조군과 비교하여 VB5004b에 의해 유도된 Treg의 더 높은 존재를 의미한다.
실시예 8: 본 발명에 따른 DNA 벡터의 관용 유도 능력 평가
VB5012b의 관용-유도하는 능력 (표 1에 설명됨)은 실시예 7에 기재된 바와 같이 IL-10/ IFN-γ 비율을 계산하여 결정되었다. VB5012b, VB5048, VB5058 및 VB504 (표 1에 기재된 모든 컨스트럭트)의 관용원성 프로파일은 백신 접종에 반응하여 유도된 MOG (38-49)-특이적 Foxp3+ T 세포의 비율에 의하여 추가로 평가되었다.
마우스 백신 접종 및 플루오로스팟
다음 시험 설계가 적용되었다:
6주령 암컷 C57BL/6 마우스는 Janvier Labs(프랑스)에서 구입했다. 모든 동물은 래디움 병원(Radium Hospital, 노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. VB5012b, VB5048, VB5006b, VB5046, VB5052 및 VB5051의 시험에는 그룹당 5마리의 마우스를 사용하였으나, 음성 대조군 (PBS만으로 백신 접종된 마우스)에는 그룹당 2마리의 마우스를 사용했다. 실시예 7에서와 같이, VB5052는 컨스트럭트를 인코딩하는 호-염증성 MOG (27-63)로 포함되었고, VB5012b, VB5048, VB5006b 및 VB5046과의 비교를 위해 VB5051은 항원 단독 대조군을 인코딩하는 MOG(27-63)로 포함되었다.
DNA 벡터 VB5012b, VB5048, VB5006b, VB5046, VB5051 또는 VB5052의 50 μg 용량을 2회 (0일 및 4일) 근육 주사한 후 전기천공법을 시행하고, 실시예 7에 기재된 바와 같이, 첫 번째 백신 접종 10일 후 비장을 채취하여 셀 스트레이너에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 비장세포를 MOG(35-55) 펩티드로 재자극하였고 이중 색상 플루오로스팟 분석에서 IFN-γ 및 IL-10 사이토카인 생성에 대해 시험하였다.
도 11A는 VB5012b로 백신 접종된 비장에서 생산된 IL-10의 높은 수준과 함께 MOG(35-55)로 재자극 시 IFN-γ 생성의 결핍을 보여준다. 백신 접종된 마우스의 비장세포에서 증가된 IFN-γ 수준을 보여주는 VB5052와는 대조적이다. 도 11B에 나타낸 바와 같이, VB5052 대비 현저히 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율은 VB5012b에서 검출되었고, VB5051와 비교해서 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율 경향이 검출되었다.
사량체 (H-2IAb / GWYRSPFSRVVH)를 이용해 백신 접종된 마우스의 비장세포에서 MOG (38-49)-특이적 CD4+ T 세포의 유세포 분석
MOG-특이적 염증성 면역 반응을 억제 및 조절하여 자가 관용을 유지하는 Treg 세포를 나타내는, MOG-특이적 Foxp3+ 세포의 생성은 MOG-특이적 사량체 염색 및 유세포 분석 (CD4+Foxp3+MOG(38-49)-tet+ cells)을 통해서 확인되었다.
간략하게, 각 그룹에서 모아진 2x106 비장세포를 96웰 V 바닥 플레이트로 옮겼다. 사량체 및 Ab는 사용 전에 5% FBS가 포함된 PBS에서 희석하고 빛으로부터 보호했다. 세포 세척이 필요한 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 5% FBS가 포함된 PBS를 사용하여 수행되었다. 먼저, 세포를 MOG (38-49)에 특이적인 ProT2® MHC 클래스 II 사량체 (1 μg/ml, H-2 IAb - GWYRSPFSRVVH - ProT2® Tetramer PE, 2958, Proimmune)로 염색하고 플레이트를 가습된 CO2 세포 배양기(5% CO2, 37°C)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하지 않고, FC 수용체를 얼음 위에서 5분 동안 차단하여 Fc 수용체 (0.25 μg/ml, TruStain FcX™ PLUS (항-마우스 CD16/32) 항체, 156604, Biolegend)로 유세포분석 항체 (Ab)의 비-특이적 결합을 방지하였다. 세포를 세척하지 않고, 항-마우스 CD8 PE-Cy7 (0.25 μg/ml, Clone: 53-6.7, 100721, BD Biosciences), 항-마우스 CD4 eFluor450 (0.25 μg/ml, Clone: GK1.5, 48-0041-82, Thermofischer/eBioscience), 항-마우스 CD25 PerCP-Cy5.5 (0.25 μg/ml, Clone: PC61, 102030, Biolegend)를 포함하는 표면 항체 칵테일로 세포를 얼음 상에서 30분 동안 염색시켰다. 세포를 PBS 만으로 2 회 세척하였다. 다음으로, 세포를 고정성 생존 염료 (웰당 150 μl, PBS에서 1:8000 희석, Fixable Viability Stain 780, 565388, BD biosciences)를 사용하여 얼음 위에서 10 분간 염색했다. 세포를 PBS로만 2회 세척하고 제조사의 지시에 따라 Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트(웰당 200μl, 00-5523-00, Thermofischer/eBioscience)를 사용하여 고정 및 투과화시켰다. 세포를 세척하고 항-마우스 FOXP3 eFluor 660 (0.25 μg/ml, Clone: FJK-16s, 50-5773-82, Thermofischer/eBioscience), 항-마우스 Ki-67 Alexa Fluor 488 (0.25 μg/ml, Clone: Clone: 11F6, 151204, Biolegend)를 포함하는 세포내 Ab 칵테일을 이용해서 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고 5% FBS가 포함된 PBS 150μl에 재현탁한 후 BD FACSymphony™ A3 세포 분석기로 분석했다. 다음 대조군들, 염색되지 않은 대조군 (= 세포가 어떤 Ab도 받지 않음) 및 플루오레센스 마이너스 원 (FMO) 대조군 (= 모든 형광단 표지된 Ab로 염색된 시료, 양성 신호 대 음성 신호를 정확하게 구별하기 위해 그 중 하나를 뺌), 은 FlowJo™ v10.8 소프트웨어 (BD Life Sciences)로 원하는 모집단을 게이팅하기 위한 가이드로 사용되었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, VB5051 또는 PBS 백신 접종과 비교해서 관용-유도 컨스트럭트 VB5012b, VB5048, VB5006b 및 VB5046을 사용한 2회 용량 백신 접종 요법 (0 일 + 4 일) 후에 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포가 관찰될 수 있다.
따라서 실시예 8은 표적화 유닛으로 MARCO 리간드 SCGB3A2를 인코딩하고 항원 유닛으로 MOG(27-63)를 인코딩하는 VB5012b가 호-염증성 버전 VB5052 대비 더 높은 비염증성 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)을 유도했음을 보여준다. 실시예 8은 관용-유도 컨스트럭트 VB5012b, VB5048, VB5006b 또는 VB5046을 사용한 백신 접종이 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포를 유도한다는 것을 추가로 보여주며, 이는 VB5051 및 배경 수준의 PBS 백신 접종된 마우스와 비교하여 더 높은 수준의 Treg 유도를 나타낸다. 이러한 결과는 DNA 벡터 VB5048, VB5012b, VB5006b 및 VB5046는 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
서열
SEQ ID NO: 1
ELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 2
VB5003
쥣과의 IgVH 신호 펩티드 (1-19), 쥣과의 항-DEC205 scFv (20-265), 이량체화 유닛 (266-442), 유닛 링커 (443-447), 쥣과의 MOG 35-55 (448-468)
M1NFGLRLIFLVLTLKGVQC19D20IQMTQSPSFLSTSLGNSITITCHASQNIKGWLAWYQQKSGNAPQLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYIFTISNLQPEDIATYYCQHYQSFPWTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFYMNWIRQPPGQAPEWLGVIRNKGNGYTTEVNTSVKGRFTISRDNTQNILYLQMNSLRAEDTAIYYCARGGPYYYSGDDAPYWGQGVMVTVSS265P266SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK442G443LGGL447M248EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK468
SEQ ID NO: 3
VB5004
쥣과의 IgVH 신호 펩티드 (1-19), 쥣과의 항-DEC205 scFv (20-265), 이량체화 유닛 (266-442), 유닛 링커 (443-447), 쥣과의 MOG 27-63 (448-484)
M1NFGLRLIFLVLTLKGVQC19DIQMTQSPSFLSTSLGNSITITCHASQNIKGWLAWYQQKSGNAPQLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYIFTISNLQPEDIATYYCQHYQSFPWTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFYMNWIRQPPGQAPEWLGVIRNKGNGYTTEVNTSVKGRFTISRDNTQNILYLQMNSLRAEDTAIYYCARGGPYYYSGDDAPYWGQGVMVTVSS265P266SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK442G443LGGL447S448PGKNATGMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKDQDAEAQP484
SEQ ID NO: 4
VB5012
쥣과의 SCGB3A2 신호 펩티드 (1-21), 쥣과의 SCGB3A2 (22-91), 이량체화 유닛 (92-268), 유닛 링커 (269-273), 쥣과의 MOG 35-55 (274-294)
M1KLVSIFLLVTIGICGYSATA21L22LINRLPVVDKLPVPLDDIIPSFDPLKMLLKTLGISVEHLVTGLKKCVDELGPEASEAVKKLLEALSHLV91P92SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK268G269LGGL273M274EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK294
SEQ ID NO: 5
VB5013
쥣과의 VSIG-3 신호 펩티드 (1-22), 쥣과의 VSIG-3 (23-428), 이량체화 유닛 (429-605), 유닛 링커 (606-610), 쥣과의 MOG 35-55 (611-631)
M1TRRRSAPASWLLVSLLGVATS22L23EVSESPGSVQVARGQTAVLPCAFSTSAALLNLNVIWMVIPLSNANQPEQVILYQGGQMFDGALRFHGRVGFTGTMPATNVSIFINNTQLSDTGTYQCLVNNLPDRGGRNIGVTGLTVLVPPSAPQCQIQGSQDLGSDVILLCSSEEGIPRPTYLWEKLDNTLKLPPTATQDQVQGTVTIRNISALSSGLYQCVASNAIGTSTCLLDLQVISPQPRSVGVIAGAVGTGAVLIVICLALISGAFFYWRSKNKEEEEEEIPNEIREDDLPPKCSSAKAFHTEISSSENNTLTSSNTYNSRYWNNNPKPHRNTESFNHFSDLRQSFSGNAVIPSIYANGNHLVLGPHKTLVVTANRGSSPQVLPRNNGSVSRKPWPQHTHSYTVSQMTLERIGAVPVMVPAQSRAGSLV428P429SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKG606LGGL610M611EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK631
SEQ ID NO: 6
쥣과의 IgVH 신호 펩티드 (1-19)
MNFGLRLIFLVLTLKGVQC
SEQ ID NO: 7
VB5016
쥣과의 IgVH 신호 펩티드 (1-19), 쥣과의 항-DEC205 scFv (20-265), 이량체화 유닛 (266-442), 유닛 링커 (443-447), 쥣과의 GAD65 202-221 (448-467)
M1NFGLRLIFLVLTLKGVQC19D20IQMTQSPSFLSTSLGNSITITCHASQNIKGWLAWYQQKSGNAPQLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYIFTISNLQPEDIATYYCQHYQSFPWTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFYMNWIRQPPGQAPEWLGVIRNKGNGYTTEVNTSVKGRFTISRDNTQNILYLQMNSLRAEDTAIYYCARGGPYYYSGDDAPYWGQGVMVTVSS265P266SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK442G443LGGL447T448NMFTYEIAPVFVLLEYVTL467
SEQ ID NO: 8
VB5005
쥣과의 IL10 신호 펩티드 (1-18), 쥣과의 IL10 (2-178), 이량체화 유닛 (179-355), 유닛 링커 (356-360), 쥣과의 MOG 35-55 (361-381)
M1PGSALLCCLLLLTGMRI18SRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS178P179SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK355G356LGGL360M361EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK381
SEQ ID NO: 9
VB5006
쥣과의 IL10 신호 펩티드 (1-18), 쥣과의 IL10 (2-178), 이량체화 유닛 (179-355), 유닛 링커 (356-360), 쥣과의 MOG 27-63 (361-397)
M1PGSALLCCLLLLTGMRI18SRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS178P179SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK355G356LGGL360SPGKNATGMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKDQDAEAQP397
SEQ ID NO: 10
VB5009
쥣과의 TGFβ1 신호 펩티드 (1-29), 쥣과의 TGFβ1 30-390), 이량체화 유닛 (391-567), 유닛 링커 (568-572), 쥣과의 MOG 35-55 (573-593)
MPPSGLRLLPLLLPLPWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEVTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYMFFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRLLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMATPLERAQHLHSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASASPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK
SEQ ID NO: 11
VB5017
쥣과의 CTLA4 신호 펩티드 (1-35), 쥣과의 CTLA4 (36-161), 이량체화 유닛 (162-338), 유닛 링커 (339-343), 쥣과의 MOG 35-55 (344-364)
M1ACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFS35EAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSD161P162SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK338G339LGGL343M344EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK364
SEQ ID NO: 12
VB5022
쥣과의 IgVH 신호 펩티드 (1-19), 쥣과의 항-DEC205 scFv (20-265), 이량체화 유닛 (266-442), 유닛 링커 (443-447), 쥣과의 Pan b 1 에피토프 (448-468)
M1NFGLRLIFLVLTLKGVQC19D20IQMTQSPSFLSTSLGNSITITCHASQNIKGWLAWYQQKSGNAPQLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYIFTISNLQPEDIATYYCQHYQSFPWTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDFYMNWIRQPPGQAPEWLGVIRNKGNGYTTEVNTSVKGRFTISRDNTQNILYLQMNSLRAEDTAIYYCARGGPYYYSGDDAPYWGQGVMVTVSS265P266SVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK442G443LGGL447A448YKEQIKTLTNKLKAAEARAE468
도 1: 예시적인 관용-유도 컨스트럭트의 개략도
도 1은 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트의 일 예를 보여준다. 상기 본 발명의 관용-유도 컨스트럭트는 N-말단 시작 및 C-말단 끝을 갖는 폴리펩티드로서 기술될 수 있다 (도 1에 예시됨). 상기 폴리펩티드의 구성요소 - 표적화 유닛 (TU), 이량체화 유닛 (DimU) 및 항원 유닛 - 는 항원 유닛이 상기 폴리펩티드의 C-말단 끝 (Fig. 1a) 또는 폴리펩티드의 N-말단 시작 (Fig. 1b) 에 위치하도록 폴리펩티드에 배열될 수 있다.
상기 항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프(들)를 포함하며, 만약 다중 T 세포 에피토프가 존재하는 경우, 하나 이상의 T 세포 에피토프 링커를 포함할 수 있다. 유닛 링커 (UL)는 이량체화 유닛과 항원 유닛을 연결할 수 있다. 도 1은 T 세포 에피토프 링커 (TL)에 의해 분리된 2 개의 T 세포 에피토프 (T1, T2)를 갖는 항원 유닛을 보여준다. 전술한 유닛 및 요소의 순서 및 방향은 다량체 단백질, 이량체 단백질 및 폴리뉴클레오티드에서 동일하다.
도 2: MOG-함유 관용-유도 컨스트럭트의 발현 및 분비
도 2A 및 2B는 샌드위치 ELISA로 검출된 MOG-함유 관용-유도 컨스트럭트 및 호염증 (pro-inflammatory) 대조군 컨스트럭트 VB5002b 및 VB5052의 단백질 발현 및 분비 수준을 보여준다 (포획 항체: 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체) (A) DNA 벡터 VB5002b, VB5003b, VB5004b, VB5005b, VB5006b 및 VB5012b로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 상청액, (B) DNA 벡터 VB5052, VB5046, VB5048, VB5058, VB5059, VB5060,VB5061 및 VB5071로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포의 상청액. 모든 MOG-함유 컨스트럭트는 고도로 발현되고 분비되었디. (A)의 음성 대조군은 형질감염 시약인 리포펙타민으로만 처리된 HEK293 세포의 상청액 이고 (B)에서는 형질감염 시약 엑스피펙타민으로만 처리된 Expi293F 세포 상청액 형태이다.
도 3: 상이한 표적화 유닛을 갖는 전장 MOG-함유 관용-유도 컨스트럭트의 분비.
도 3은 벡터 VB5005b, VB5006b (HEK293 세포), VB5052, VB5058, VB5059, VB5060 및 VB5061 (Expi293F 세포)로 일시적으로 형질전환된 HEK293 세포 또는 Expi293F 세포의 상청액의 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 상이한 표적화 유닛을 갖는, 전장 관용-유도 컨스트럭트, 및 호염증 (pro-inflammatory) 대조군 컨스트럭트 VB5052의 높은 수준의 분비를 보여준다. 포획 항체: 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology. 검출 항체: (A) 및 (B) 0.2 μg/ml 염소 항-쥣과의 IL-10 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems (C) 0.8 μg/ml 닭 항-인간 TGF-beta 1 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, BAF240, RD 시스템. (D) 0.83 μg/ml 염소 항-쥣과의 SCGB3A2 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, BAF3465, R&D Systems. (E) 0.8 μg/ml 염소 항-쥣과의 CTLA-4 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, BAF476, RD Systems. (F) 0.29 μg/ml 염소 항-마우스 PD-1 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, DY1021, R&D System. (G) 0.2 μg/ml 염소 항-인간 CCL3 비오티닐화된 항체, 100 μl/웰, BAF270, R&D 시스템. 음성 대조군은 형질감염 시약인 리포펙타민으로만 처리된 HEK293 세포의 상청액 또는 엑스피펙타민으로만 처리된 Expi293F 세포의 상청액이다.
도 4: MOG(27-63) 펩티드의 분비
DNA 벡터 VB5051에서 인코딩된 MOG(27-63) 펩티드의 분비는 DNA 벡터 VB5051로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포의 상청액을 직접 ELISA하여 확인되었다 (검출 항체: 마우스 항-MOG 항체, 3.3 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology). 음성 대조군은 엑스피펙타민만으로 처리된 Expi293F 세포의 상청액 이다.
도 5: Met e 1 함유 관용-유도 컨스트럭트의 발현 및 분비
도 5는 Met e 1-함유 DNA 벡터 VB5024, VB5030 및 VB5079로 일시적으로 형질 감염된 Expi293F의 상청액에 대한 샌드위치 ELISA (포획 항체: 항-인간 IgG3 (CH3 domain) 항체, 검출 항체: CaptureSelect™ 비오틴-항-IgG-Fc (인간) 컨쥬게이트)로 검출된 Met e 1 함유 관용-유도 컨스트럭트의 단백질 발현 및 분비 수준을 보여준다.
모든 Met e 1 함유 관용-유도 컨스트럭트가 발현 및 분비되었다. 음성 대조군은 형질감염 시약 엑스피펙타민으로만처리된 Expi293F의 상청액이다.
도 6: 재조합 DEC205 수용체에 결합하는 표적화 유닛으로서 scFv 항-DEC205를 포함하는 관용-유도 컨스트럭트
도 6은 scFv 항-DEC205-함유 DNA 벡터 VB5004b로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 상청액의 직접 ELISA (코트: 재조합 DEC205(216-503), 검출 항체: 항-MOG 항체 또는 항-hIgG CH3 도메인 항체)를 통해 scFv 항-DEC205 표적화 유닛을 포함하는 관용-유도 단백질이 재조합 DEC205에 결합함을 보여준다. 두 항체 모두 수용체에 대한 결합을 확인하였고, 항-MOG 항체는 전장 단백질의 분비를 확인하였다.
도 7: 재조합 IL-10 수용체에 결합하는 표적화 유닛으로서 IL-10를 포함하는 관용-유도 컨스트럭트
도 7은 IL-10 함유 DNA 벡터 VB5006b로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포의 상청액의 직접 ELISA (코트: 재조합 IL-10 수용체, 검출 항체: 항- MOG 항체 또는 항-hIgG CH3 도메인 항체)를 통해 표적화 유닛으로서 IL-10을 포함하는 관용-유도 단백질이 재조합 IL-10 수용체에 결합함을 보여준다. 두 항체 모두 수용체에 대한 결합을 확인하였고, 항-MOG 항체는 전장 단백질의 분비를 확인하였다.
도 8: 분비된 관용-유도 컨스트럭트의 크기, 단백질 완전성 및 이량체 형성의 특성
도 8은 환원 및 비-환원 조건 하에서 MOG-함유 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포의 상청액에 대한 웨스턴 블롯(WB) 분석을 보여준다. 음성대조군은 형질감염 시약인엑스피펙타민 (형질감염 대조군)으로 처리된 Expi293F 세포의 상청액이다.
도 8A: 웨스턴 블롯은 관용-유도 단백질의 발현 및 전장의 분비를 보여준다. 형질감염된 Expi293F 세포의 환원된 상청액 시료 (25 μL 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG (sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800 (SA5-10172). 표준 단백질은 Chemidoc 채널 Dylight 650 (신호는 표시되지 않음) 및 Chemidoc 채널 Dylight 800에서 검출되었다.
도 8B: 웨스턴 블롯은 관용-유도 단백질의 이량체화를 보여준다(검은색 화살표). 형질감염된 Expi293F 세포의 비-환원된 상청액 시료. 1차 항체: 마우스 항-MOG (sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800 (SA5-10172). Chemidoc 채널 Dylight 650 (표준 단백질을 위해) 및 800.
도 8C: 웨스턴 블롯은 관용-유도 단백질의 발현 및 전장의 분비를 보여준다. 형질감염된 Expi293F 세포의 환원된 상청액 시료 (25 μL 로드). 1차 항체: 랫트 항-IL10 (MAB417). 2차 항체: 당나귀 항-랫트, Dylight 488 (SA5-10026). Chemidoc 채널 Dylight 650 (표준 단백질을 위해) 및 488.
도 8D: 웨스턴 블롯은 관용-유도 단백질의 발현 및 전장의 분비를 보여준다 (검은색 화살표). 형질감염된 Expi293F 세포의 환원된 상청액 시료 (35 μL 로드). 1차 항체: 염소 항-CTLA-4 (AF476). 2차 항체: 당나귀 항-염소, Dylight 800 (SA5-10092). Chemidoc 채널 Dylight 650 (표준 단백질 위해) 및 800.
도 9. 이중 색상 IL-10/IFNγ 플루오로스팟.
C57BL/6 마우스에 50 μg의 표시된 DNA 벡터 (VB5004b, VB5002b 및 VB5001b)를 1 회 (0일) 백신 접종하고, 백신 접종 후 7일째에 비장을 수확했다. (A) MOG(35-55) 펩티드로 재자극 시 IFN-γ 및 IL-10 분비 (SFU/106 비장세포)에 대해 이중 색상 플루오로스팟을 사용하여 시험된 마우스의 비장세포. 그룹당 n=4 (VB5001b), 5 (VB5004b 및 VB5002b) 또는 2 (PBS)의 개별적인 마우스가 표시된다. (B) IL-10/IFN-γ 비율은 (A)의 데이터로부터 구성된다. 개별 마우스 및 평균±범위가 표시됨, *(p<0.05) **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 시험.
도 10. 유세포분석에 의한 % Foxp3+, % IFN-γ 및 % IL-17 생산 CD4+ T 세포의 검출.
C57BL/6 마우스에 50 μg의 표시된 DNA 벡터 (VB5004b, VB5002b 및 VB5001b)를 1 회 (0일) 백신 접종하고, 백신 접종 후 7일째에 비장을 수확했다. MOG(35-55) 펩티드로 재자극 시 전체 CD4+ T 세포 집단 중 (A) Foxp3+, (B) IFN-γ+ 및 (C) IL-17+ 비장세포의 백분율 [%]이 표시된다. 데이터는 4 (VB5001b), 5 (VB5004b 및 VB5002b) 또는 2 (PBS) 마우스/그룹의 풀에서 수집되었다. 컨스트럭트 ID 번호는 x-축에 표시된다.
도 11. 이중 색상 IL-10/IFNγ 플루오로스팟.
C57BL/6 마우스에 50 μg의 표시된 DNA 벡터 (VB5004b, VB5002b 및 VB5001b)를 2 회 (0일 및 4일) 백신 접종하고, 백신 접종 후 10일째에 비장을 수확했다. (A) MOG(35-55) 펩티드로 재자극 시 IFN-γ 및 IL-10 분비 (SFU/106 비장세포)에 대해 이중 색상 플루오로스팟을 사용하여 시험된 마우스의 비장세포. 개별적인 마우스가 표시된다. (B) IL-10/IFN-γ 비율은 (A)의 데이터부터 구성된다. 개별 마우스 및 평균±범위가 표시됨, 그룹당 n=5 또는 n=2 (PBS), **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 시험.
도 12. MOG(38-49) 특이적 Foxp3+ T 세포의 검출.
C57BL/6 마우스에 50 μg의 표시된 DNA 벡터 (VB5012b, VB5048, VB5006b, VB5046, VB5051)를 2 회 (0일 및 4일) 백신 접종하고, 백신 접종 후 10일째에 비장을 수확했다. CD4+ 세포 집단 중 H-2 Iab/MOG(38-49) 사량체에 의해 생체 외에서 검출된 비장 Foxp3+ 세포의 백분율. 데이터는 그룹당 5 마우스 또는 2 (PBS)의 풀에서 수집되었다. 컨스트럭트 ID 번호는 x-축에 표시된다.
도 13: MOG-함유 관용-유도 컨스트럭트의 발현 및 분비
도 13은 VB5009로 일시적으로 형질 감염된 HEK293 세포의 상청액의 표적화 유닛으로서 TGFβ1를 갖는 MOG-함유 관용-유도 컨스트럭트 VB5009의 단백질 발현 및 분비 수준을 보여준다 - 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 것으로서 (포획 항체: 토끼 항 인간 TGFβ1 (orb77216, Biorbyte), 검출 항체: 비오티닐화된 마우스 항-인간 IgG (05-4240, Invitrogen) - 음성 대조군은 형질감염 시약 리포펙타민만으로 처리된 HEK293 세포의 상청액이다.
실시 양태
1. 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트:
i) 항원-제시세포 (APC)를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
ii) (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
iii) (ii)에 정의된 다수의 폴리펩티드, 예컨대 두 개의 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질, 예컨대 이량체 단백질;
여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
2. 실시 양태 1에 있어서, 상기 컨스트럭트는 다량체화 유닛을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트.
3. 실시 양태 1에 있어서, 상기 컨스트럭트는 이량체화 유닛을 포함하고 및/또는 상기 다량체 단백질은 이량체 단백질인, 관용-유도 컨스트럭트.
4. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 APC를 활성화하지 않고, 상기 컨스트럭트를 항원-제시 세포로 전달할 수 있고 APC 상의 표면 분자와 상호작용하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
5. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 APC 상의 표면 수용체에 결합할 수 있는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
6. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 TGFβ 수용체, 예를 들어 TGFβR1, TGFβR2, 또는 TGFβR3, IL10R, 예를 들어 IL-10RA 및 IL10-RB, IL2R, IL4R, IL6R, IL11R 및 IL13R, IL27R, IL35R, IL37R, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, MHCII, CD83, SIGLEC, MGL, CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, 랑게린(Langerin), MR, DC-Sign, Treml4, 덱틴-1(Dectin-1), PDL1, PDL2 및 HVEM로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체에 결합하는 모이어티를 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
7. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 모이어티는 천연 리간드, 합성 리간드 및 항체 또는 이들의 일부, 예를 들어 scFv로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
8. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 모이어티는 상기 수용체에 특이성을 갖는 항체 또는 이들의 일부, 예를 들어 scFv 이고, 여기서 상기 수용체에 결합하면 항-염증성, 관용원성 방식으로 항원이 제시되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
9. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 모이어티는 상기 수용체에 특이성을 갖는 합성 리간드이고, 여기서 상기 수용체에 결합하면 항-염증성, 관용원성 방식으로 항원이 제시되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
10. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 모이어티는 천연 리간드인 관용-유도 컨스트럭트.
11. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 천연 리간드는 TGFβ, 예를 들어 TGFβ1, TGFβ2 TGFβ3, IL-10, IL2, IL4, IL6, IL11, IL13, IL27, IL35, IL37, CCL19, CCL21, ICAM-1 (또한 CD54로 알려진 세포간 부착 분자 1), 케라틴, VSIG-3, SCGB3A2, CTLA-4, 예를 들어 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1, 예를 들어 PD-1의 세포외 도메인, 및 BTLA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
12. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 천연 리간드 TGFβ, IL-10, SCGB3A2, CTLA-4, 예를 들어 CTLA-4의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
13. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 천연 리간드는 BTLA의 세포외 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
14. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 IL-10 또는 TGFβ, 바람직하게 인간 IL-10 또는 인간 TGFβ로 이루어지거나 이를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
15. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 205-207로 부터 선택되는 아미노산 서열, 과적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
16. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 205-207로부터 선택된 아미노산 서열, 에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
17. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고 인간 TGFβ의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 205-207로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
18. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것 인, 관용-유도 컨스트럭트
19. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 IL-10의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
20. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고, 인간 IL-10의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것 인, 상기한 실시 양태 중 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트.
21. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SCGB3A2 또는 VSIG-3, 예를 들어 인간 VSIG-3 또는 인간 SCGB3A2 이거나 이를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
22. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3에 대한 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 215의 아미노산 서열에 대한 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
23. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 VSIG-3의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 215의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 예를 들어 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
24. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고, 인간 VSIG-3의 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 215의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
25. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2에 대한 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 213의 아미노산 서열에 대한 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
26. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2에 대한 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 213의 아미노산 서열과 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 100% 그에 대한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
27. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 최대 22 개의 아미노산, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고 인간 SCGB3A2에 대한 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 213의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
28. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 항체 CD205에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 그의 일부로 이루어지거나 이를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
29. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 표적화 유닛은 CD205에 대한 특이성을 갖는 scFv, 예컨대 항-DEC205 scFv, 예컨대 SEQ ID NO: 49를 포함하거나 그로 이루어진 scFv로 이루어지거나 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
30. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 자기-항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 자기-항원의 하나의 T 세포 에피토프 또는 자가 항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
31. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다중 T 세포 에피토프는 동일한 자기-항원 이거나 다중의 상이한 자기-항원인 관용-유도 컨스트럭트.
32. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 T 세포 에피토프를 분리하는 하나 이상의 링커를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
33. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 T 세포 에피토프는 링커에 의해 분리된 것인, 관용-유도 컨스트럭트.
34. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 말단 T 세포 에피토프를 제외한 모든 T 세포 에피토프는 서브유닛으로 배열되고, 여기서 각 서브유닛은 T 세포 에피토프 및 링커를 포함하거나 그로 구성되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
35. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, N-말단 T 세포 에피토프를 제외한 모든 T 세포 에피토프는 서브유닛으로 배열되고, 여기서 각 서브유닛은 T 세포 에피토프 및 링커를 포함하거나 그로 구성되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
36. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, C-말단 T 세포 에피토프를 제외한 모든 T 세포 에피토프는 서브유닛으로 배열되고, 여기서 각 서브유닛은 T 세포 에피토프 및 링커를 포함하거나 그로 구성되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
37. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 항원 유닛은 n 항원 및 n-1 서브유닛을 포함하고, 여기서 각 서브유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 T 세포 에피토프, 및 링커를 포함하며, 및 말단 T 세포 에피토프를 추가로 포함하는, 관용-유도 컨스트럭트.
38. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 n은 1 내지 50, 예를 들어 3 내지 50 또는 15 내지 40 또는 10 내지 30 또는 10 내지 25 또는 10 내지 20 또는 15 내지 30 또는 15 내지 25 또는 15 내지 20의 정수인 관용-유도 컨스트럭트.
39. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 링커는 비-면역원성인 관용-유도 컨스트럭트.
40. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 링커는 강성 링커 또는 유연한 링커인 관용-유도 컨스트럭트.
41. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 수초 염기성 단백질 (MBP)의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 MBP의 하나의 T 세포 에피토프 또는 MBP의 다수의 T 세포 에피토프, 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG)의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 MOG의 하나 이상의 T 세포 에피토프 또는 MOG의 다수의 T 세포 에피토프, 또는 단백질지방질 단백질 (proteolipid protein; PLP)의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 PLP의 하나의 T 세포 에피토프 또는 PLP의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
42. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 MOG의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프를 포함하고, 예를 들어 MOG의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프는 SEQ ID NO: 180-182로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 그로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
43. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 알레르겐의 하나의 T 세포 에피토프 또는 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
44. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 알레르겐의 것 이거나 다수의 상이한 알레르겐의 것인 관용-유도 컨스트럭트.
45. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 Fel d1의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 Fel d1의 하나의 T 세포 에피토프 또는 Fel d1의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
46. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 Fel d4 및/또는 Fel d7의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 Fel d4의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프 및/또는 Fel d7의 하나 또는 다중의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
47. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 동종항원/이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 예를 들어 동종항원/이종항원의 하나의 T 세포 에피토프 또는 동종항원/이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
48. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 동종항원/이종항원의 것 이거나 다수의 상이한 동종항원/이종항원의 것인 관용-유도 컨스트럭트.
49. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 또는 T 세포 에피토프는 7 내지 약 200 개의 아미노산 길이를 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
50. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 또는 T 세포 에피토프는 7 내지 150 개의 아미노산, 바람직하게 7 내지 100 개의 아미노산, 예를 들어 9 내지 100 개의 아미노산 또는 15 내지 100 개의 아미노산 또는 9 내지 60 개의 아미노산 또는 9 내지 30 개의 아미노산 또는 15 내지 60 개의 또는 15 또는 30 개의 또는 20 내지 75 개의 아미노산 또는 25 내지 50 개의 아미노산 길이를 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
51. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 또는 T 세포 에피토프는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 아미노산 길이를 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
52. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 7 내지 11 개의 아미노산 길이를 갖는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
53. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 9 내지 60 개의 아미노산, 예를 들어 9 내지 30 개의 아미노산, 예를 들어 15 내지 60 개의 아미노산, 예를 들어 15 내지 30 개의 아미노산 길이를 갖는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
54. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 15 개의 아미노산 길이를 갖는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
55. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 최대 3500 개의 아미노산, 예를 들어 60 내지 3500 개의 아미노산, 예를 들어 약 80 또는 약 100 또는 약 150 개의 아미노산 부터 약 3000 개의 아미노산 까지, 예를 들어 약 200 내지 약 2500 개의 아미노산, 예를 들어 약 300 내지 약 2000 개의 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500 개의 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000 개의 아미노산을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
56. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 1 내지 10 개의 T 세포 에피토프 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 또는 9 개 또는 10 개의 T 세포 에피토프; 또는 11 내지 20 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 T 세포 에피토프; 또는 21 내지 30 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 T 세포 에피토프; 또는 31 내지 40 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 개의 T 세포 에피토프; 또는 41 내지 50 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
57. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 1 내지 3 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 또는 1 내지 5 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 3 내지 6 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 5 내지 15 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15 개의 T 세포 에피토프, 또는 7 내지 17 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17 개의 T 세포 에피토프, 또는 9 내지 19 개의 T 세포 에피토프, 예를 들어 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 또는 19 개의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
58. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 T 세포 에피토프는 항원 유닛에 무작위로 배열되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
59. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 T 세포 에피토프는 다량체화 유닛에서 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 높은 것 부터 항원성이 낮은 것 순으로 배열되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
60. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)은 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치하고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)은 다량체화 유닛 또는 항원 유닛의 말단에 가장 가깝게 위치하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
61. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프는 이량체화 유닛에서 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
62. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)이 실질적으로 항원 유닛의 중앙에 위치하고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)은 다량체화 유닛 또는 항원 유닛의 말단에 가장 가깝게 위치하는, 관용-유도 컨스트럭트.
63. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 T 세포 에피토프가 친수성 T 세포 에피토프와 소수성 T 세포 에피토프가 번갈아 배열되는 관용-유도 컨스트럭트.
64. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 GC 풍부 T 세포 에피토프가 그들 사이에 적어도 하나의 비-GC 풍부 T 세포 에피토프가 존재하도록 배열되는 관용-유도 컨스트럭트.
65. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다수의 T 세포 에피토프는 T 세포 에피토프 링커에 의해 분리되는 관용-유도 컨스트럭트.
66. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 n T 세포 에피토프 및 n-1 T 세포 에피토프 링커를 포함하는 관용-유도 컨스트럭트.
67. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 비-면역원성인 관용-유도 컨스트럭트.
68. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 유연한 링커인 관용-유도 컨스트럭트.
69. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 4 내지 20 개의 아미노산, 예를 들어 5 내지 20 개의 아미노산 또는 5 내지 15 개의 아미노산 또는 8 내지 20 개의 아미노산 또는 8 내지 15 개의 아미노산, 예를 들어 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개의 아미노산 10 내지 15 개의 아미노산 또는 8 내지 12 개의 아미노산, 예를 들어 8, 9, 10,11, 또는 12 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 관용-유도 컨스트럭트.
70. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 10 개의 아미노산으로 이루어지는 관용-유도 컨스트럭트.
71. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛에 포함된 모든 T 세포 에피토프 링커는 바람직하게는 동일한 것인 관용-유도 컨스트럭트.
72. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커가 세린 (S) 및/또는 글리신 (G) 풍부 링커인 관용-유도 컨스트럭트.
73. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 세린 및/또는 글리신 풍부 T 세포 에피토프 링커는 적어도 하나의 류신 (L) 잔기, 예를 들어 적어도 1 개 또는 적어도 2 개 또는 적어도 3 개 또는 적어도 4 개의 류신 잔기를 더 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
74. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 10 개의 아미노산 길이를 갖는 세린-글리신 링커이고 1 또는 2 개의 류신 잔기를 포함하는 관용-유도 컨스트럭트.
75. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 GSAT 링커 또는 SEG 링커인 관용-유도 컨스트럭트.
76. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 GLGGL (SEQ ID NO: 90)을 포함하거나 이로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
77. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 절단가능한 링커인 관용-유도 컨스트럭트.
78. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 식품 알레르겐, 예를 들어 조개류 알레르겐, 예를 들어 트로포미오신, 아르기닌 키나아제, 미오신 경쇄, 근형질의 칼슘 결합 단백질, 트로포닌 C, 3탄당-인산 이성질체화효소 또는 액틴인 관용-유도 컨스트럭트.
79. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 Pan b 1이고, 선택적으로 상기 항원 유닛은 Pan b 1 T 세포 에피토프 (251-270)를 포함하거나 이로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
80. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 소 우유 알레르겐, 예를 들어 Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Bos d 9, Bos d 10, Bos d 11 또는 Bos d 12인 관용-유도 컨스트럭트.
81. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 달걀 알레르겐, 예를 들어 오보뮤코이드, 난백알부민, 오보트랜스페린, 콘알부민, Gal 3 3, 달걀 라이소자임 또는 오보뮤신인 관용-유도 컨스트럭트.
82. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 관용-유도 컨스트럭트, 상기 알레르겐은 SIINFEKL (SEQ ID NO: 45)의 아미노산 서열을 포함하는 OVA (257-264)인 관용-유도 컨스트럭트.
83. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 T 세포 에피토프 OVA (257-264)를 포함하는 관용-유도 컨스트럭트.
84. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 생선 알레르겐, 예를 들어 파브알부민, 엔올라아제, 알돌라아제 또는 비텔로제닌인 관용-유도 컨스트럭트.
85. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 과일 알레르겐, 예를 들어 발병 관련 단백질 10, 프로필린, nsLTP, 타우마틴-유사 단백질, 지베렐린 조절 단백질, 이소플라본 환원효소 관련 단백질, 클래스 1 키티나제, 베타 1,3 글루칸가수분해효소, 저민 유스 단백질 (germin like protein), 알칼리성 세린 단백질분해효소, 발병-관련 단백질 1, 악티니딘, 파이토시스타틴 (phytocyctatin), 키웰린, 주요 라텍스 단백질, 큐핀 또는 2S 알부민인 관용-유도 컨스트럭트.
86. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 야채 알레르겐, 예를 들어 발병 관련 단백질 10, 프로필린, nsLTP 타입 1, nsLTP 타입 단백질 2, 오스모틴-유사 단백질, 이소플라본 환원효소-유사 단백질, 베타-프룩토푸라노시다제, PR 단백질 TSI-1, 시클로필린 또는 옥시다아제를 함유한 FAD인 관용-유도 컨스트럭트.
87. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 밀 (wheat) 알레르겐, 예를 들어 Tri a 12, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 20, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37 또는 Tri a 38인 관용-유도 컨스트럭트.
88. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 콩 알레르겐, 예를 들어 Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5, Gly m 6, Gly m 7 or Gly m 8, Gly m 응집소, Gly m Bd28K, Gly m 30 kD, Gly m CPI 또는 Gly m TI인 관용-유도 컨스트럭트.
89. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 땅콩 알레르겐, 예를 들어 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Ara h 12, Ara h 13, Ara h 14, Ara h 15, Ara h 16, 또는 Ara h 17인 관용-유도 컨스트럭트.
90. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 견과류 또는 씨앗 알레르겐인 관용-유도 컨스트럭트.
91. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 11S 글로불린, 7S 글로불린, 2S 글로불린, PR10, PR-14 nsLTP, 올레오신 또는 프로필린인 관용-유도 컨스트럭트.
92. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 식품 알레르겐은 메밀, 셀러리, 색소 첨가물, 마늘, 글루텐, 귀리, 콩류, 옥수수, 겨자, 가금류, 고기, 쌀 또는 참깨인 관용-유도 컨스트럭트.
93. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 벌독 알레르겐, 예를 들어 포스포리파제 A2, 히알루로니다제, 산 포스파타제, 멜리틴, 알레르겐 C/DPP, CRP/l카라핀 (CRP/lcarapin) 또는 비텔로제닌인 관용-유도 컨스트럭트.
94. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 말벌 알레르겐, 예를 들어 포스포리파제 A1, 히알루로니다제, 프로테아제, 항원 5, DPP IV 또는 비텔로제닌인 관용-유도 컨스트럭트.
95. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 라텍스 알레르겐, 예를 들어 Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14 또는 Hev b 15인 관용-유도 컨스트럭트.
96. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 먼지 벌레 알레르겐, 예를 들어 집먼지 진드기 알레르겐 또는 저장소 먼지 알레르겐, 예컨대 Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 7, Der p 8, Der p 10, Der p 11, Der p 21, Der p 23, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 8 Der f 10, Blot t 1, Blot t 2, Blot t 3, Blot t 4, Blot t 5, Blot t 8, Blot t 10, Blot t 12 또는 Blot t 21인 관용-유도 컨스트럭트.
97. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 Der p 1 T 세포 에피토프 (111-139)를 포함하거나 이로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
98. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 바퀴벌레 알레르겐, 예를 들어 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Bla g 11, Per a 1, Per a 2, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9 또는 Per a 10인 관용-유도 컨스트럭트.
99. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 곰팡이 알레르겐, 예를 들어 아스페르질루스 푸미가투스 알레르겐, 예컨대 Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 14, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29 또는 Asp f 34인 관용-유도 컨스트럭트.
100. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 진균 알레르겐, 예를 들어 마라세지아 (Malassezia) 알레르겐, 예컨대 Mala f 1, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala f 5, Mala f 6, Mala f 7, Mala f 8, Mala f 9, Mala f 10, Mala f 11, Mala f 12 or Mala f 13 또는 MGL_1204인 관용-유도 컨스트럭트.
101. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 털짐승 알레르겐, 예를 들어 개 알레르겐, 예컨대 Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Can f 5, 또는 Can f 6, 또는 상기 알레르겐은 말 알레르겐, 예를 들어 Ecu c 1, Ecu c 2, Ecu c 3 또는 Ecu c 4, 또는 상기 알레르겐은 고양이 알레르겐, 예컨대 Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5, Fel d 6, Fel d 7, 또는 Fel d 8, 또는 상기알레르겐은 실험동물 알레르겐, 예컨대 리포칼린, 요중 전알부민(urinary prealbumin), 분비글로불린 (secretoglobulin) 또는 혈청알부민인 관용-유도 컨스트럭트.
102. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 꽃가루 알레르겐, 예를 들어 목초 꽃가루 알레르겐, 예컨대 큰조아재비 (Timothy Grass), 오리새 (orchard grass), 왕포아풀 (Kentucky bluegrass), 다년생 라이 (perennial rye), 향기풀 (sweet vernal grass), 바히아그래스 (bahia grass), 옥수수 사초(johnson grass), 우산잔디 (Bermuda grass) 알레르겐, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 3, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12 또는 Phl p 13인 관용-유도 컨스트럭트.
103. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 관용-유도 컨스트럭트, 상기 알레르겐은 나무 꽃가루 알레르겐, 예를 들어 오리나무, 자작나무, 서어나무, 개암나무, 유럽 새우나무, 밤나무, 유럽 너도밤나무, 갈참나무, 물푸레나무, 쥐똥나무, 올리브, 라일락, 사이프러스 또는 향나무 꽃가루 알레르겐, 예컨대 Aln g 1 또는 Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 또는 Bet v 7, Car b 1, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 6, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Ost c 1, Cas 1, Cas 5, Cas 8, 또는 Cas 9, Fag s 1, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 2, 3 Ole e, 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, 또는 Ole e 12, Syr v 1, Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun v 1, Jun v 3, Pla a 1, Pla a 2 또는 Pla a 3 또는 Pla or 1, Pla or 2 또는 Pla or 3.
104. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 Bet v 1 T 세포 에피토프 (139-152)로 이루어지거나 이를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
105. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 풀 (weed) 꽃가루 알레르겐, 예를 들어 돼지풀, 쑥, 해바라기, 피버뷰, 펠리트륨 (pellitory), 창질경이, 다년생 머큐리 (annual mercury), 명아주, 명아줏과 식물 또는 아마란스 꽃가루 알레르겐, 예컨대 Amb a 1, Amb a 4, Amb a 6, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10, 또는 Amb a 11, Art v 1, Art v 3, Art v 4, Art v 5, 또는 Art v 6, Hel a 1 또는 Hel a 2, Par j 1, Par j 2, Par j 3 또는 Par j 4, Pla l 1, Mer a 1, Che a 1, Che a 2 또는 Che a 3, Sal k 1, Sal k 4 또는 Sal k 5 또는 Ama r 2인 관용-유도 컨스트럭트.
106. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 곤충, 바퀴벌레, 집 먼지 진드기 또는 곰팡이와 같은 환경적 알레르겐으로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
107. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 위장병증, 접촉성 피부염, 약물 알레르기 또는 이들의 조합으로부터 선택된 알레르기 질환을 야기하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
108. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 원치않는 면역원성을 갖는 약물에 포함되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
109. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 인자 VIII (Factor VIII)인 관용-유도 컨스트럭트.
110. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 인슐린인 관용-유도 컨스트럭트.
111. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 알레르겐은 치료를 위해 사용되는 하나 이상의 단클론 항체인 관용-유도 컨스트럭트.
112. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 컨스트럭트는 자가면역 질환과 관련된 자기-항원과 관련된 자기-알레르겐에 포함된 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
113. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 다발성 경화증 (MS)과 관련된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
114. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG), MAG, MOBP, CNPase, S100beta, 트랜스알돌라아제, 수초 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 단백질지방질 단백질 (proteolipid protein; PLP) 인 관용-유도 컨스트럭트인 관용-유도 컨스트럭트.
115. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 MOG (35-55), MOG (27-63), PLP (139-151), PLP (131-159), PLP (178-191), PLP (170-199), MBP (84-104) 및 MBP (76-112)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
116. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 SEQ ID NO: 185-190 또는 192-197로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
117. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 제1형 당뇨병과 관련된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
118. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 글루탐산 탈탄산효소 65-킬로달톤 동형단백질 (GAD65), 인슐린, IA-2 또는 ZnT8, IGRP, ChgA, IAPP, 페리페린, 테트라스패닌-7, GRP78, 우로코르틴-3 또는 인슐린 유전자 강화 단백질 isl-1인 관용-유도 컨스트럭트.
119. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 셀리악병과 관련된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
120. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 저분자량 글루테닌, 고분자량 글루테닌, 호르데인, 세칼린 또는 아베닌 b인 관용-유도 컨스트럭트.
121. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛은 T 세포 에피토프 α-글리아딘 (76-95)을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
122. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 류마티스 관절염과 관련된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
123. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 콜라겐, 열충격 단백질 60 (HSP60), 밴드 3, 소핵리보핵산단백질 D1 (SmD1), 아세틸콜린 수용체(AChR) 또는 수초 단백질 제로 (P0)인 관용-유도 컨스트럭트.
124. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP)과 관련된 것이고 상기 자기-항원은 뉴로파신 155인 관용-유도 컨스트럭트.
125. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 하시모토 갑상선염 (HT)과 관련된 것이고 상기 자기-항원은 갑상선과산화효소 및/또는 티로글로불린인 관용-유도 컨스트럭트.
126. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 낙엽성 천포창과 관련된 것이고 상기 자기-항원은 데스모솜-연관 당단백질인 관용-유도 컨스트럭트.
127. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 심상성 천포창과 관련되고 상기 자기-항원은 데스모글레인 3인 관용-유도 컨스트럭트.
128. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 갑상선 눈 질환 (TED)과 관련되고 상기 자기-항원은 칼슘결합 단백질 (칼시퀘스트린)인 관용-유도 컨스트럭트.
129. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 그레이브스병과 관련되고 상기 자기-항원은 갑상선자극호르몬수용체인 관용-유도 컨스트럭트.
130. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 원발 담즙성 간경화 (PBC)과 관련된고 상기 자기-항원은 항미토콘드리아 항체 (AMAs), 항핵항체 (ANA), 림-유사/막 (RL/M, Rim-like/membrane) 및/또는 다중 핵 점 (multiple nuclear dot, MND)인 관용-유도 컨스트럭트.
131. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 중증 근무력증과 관련되고 상기 자기-항원은 아세틸콜린 수용체인 관용-유도 컨스트럭트.
132. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 인슐린-저항성 당뇨병과 관련되고 상기 자기-항원은 인슐린 수용체인 관용-유도 컨스트럭트.
133. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 자가면역 용혈성 빈혈과 관련되고 상기 자기-항원은 적혈구인 관용-유도 컨스트럭트.
134. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 자기-항원은 류마티스 관절염과 관련되고 자기-항원은 시트룰린화, 호모시트룰린화 단백질 및 IgG의 Fc 부분인 관용-유도 컨스트럭트.
135. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛 및 다량체화 유닛은 유닛 링커에 의해 연결되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
136. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 항원 유닛 및 이량체화 유닛은 유닛 링커에 의해 연결되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
137. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 유닛 링커는 제한부위를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
138. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 유닛 링커는 GLGGL 링커 (SEQ ID NO: 90) 또는 GLSGL 링커 (SEQ ID NO: 163)인 관용-유도 컨스트럭트.
139. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 유닛 링커는 GGGGS (SEQ ID NO: 53), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 164), EAAAK (SEQ ID NO: 144), (EAAAK)m (SEQ ID NO: 165), (EAAAK)mGS (SEQ ID NO: 166), 또는 (EAAK)mGS (SEQ ID NO: 31)를 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 m은 1보다 크거나 같은 정수이고, GPSRLEEELRRRLTEPG (SEQ ID NO: 167), AAY 또는 HEYGAEALERAG (SEQ ID NO: 168)인 관용-유도 컨스트럭트.
140. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 컨스트럭트는 다량체화 유닛을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
141. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 컨스트럭트는 이량체화 유닛을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
142. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 삼량체화 유닛 또는 사량체화 유닛인 관용-유도 컨스트럭트.
143. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 삼량체화 유닛, 예를 들어 콜라겐-유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐-유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
144. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 42의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛인 관용-유도 컨스트럭트.
145. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서,상기 다량체화 유닛은 T4 피브리틴의 C-말단 도메인인 삼량체화 유닛인 관용-유도 컨스트럭트.
146. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛인 관용-유도 컨스트럭트.
147. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 사량체화 유닛, 예컨대 p53 유래 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
148. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 44의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 관용-유도 컨스트럭트.
149. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
150. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
151. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하며, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
152. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하며, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 연결하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
153. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커, 예컨대 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)인 관용-유도 컨스트럭트.
154. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 힌지 영역은 Ig 유래, 예를 들어 IgG 유래, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG3으로부터 유래되는 관용-유도 컨스트럭트.
155. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgM 유래으로부터 유래되며 선택적으로 SEQ ID NO: 47의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
156. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합, 예컨대 하나 이상의 이황화 가교를 형성하는 능력을 가지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
157. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4(인간 힌지 영역 1 및 인간 힌지 영역 4)를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
158. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27과 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
159. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
160. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 최대 10 개의 아미노산, 예를 들어 최대 9 개의 아미노산, 예를 들어 최대 8 개의 아미노산, 예를 들어 최대 7 개의 아미노산, 예를 들어 최대 6 개의 아미노산, 예를 들어 최대 5 개의 아미노산, 예를 들어 최대 4 개의 아미노산, 예를 들어 최대 3개의 아미노산, 예를 들어 최대 2개의 아미노산 또는 예를 들어 최대 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
161. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인, 예를 들어 면역글로불린 도메인, 예컨대 면역글로불린 불변 도메인 (C 도메인), 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 카르복시 말단 C 도메인 (즉, CH3 도메인), 또는 그러한 C 도메인과 실질적으로 동일한 서열 또는 그 변이체를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
162. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화를 촉진하는 상기 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카복시말단 C 도메인, 예컨대 IgG3로부터 유래된 카복시말단 C 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
163. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시 말단 C 도메인 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 관용-유도 컨스트럭트.
164. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93 %, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어지는 관용-유도 컨스트럭트.
165. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144를 갖는, IgG3으로부터 유래된 카르복시 말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어지는 관용-유도 컨스트럭트.
166. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 최대 16 개, 예를 들어 최대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 39-144를 포함하거나 이로 이루어지는 관용-유도 컨스트럭트.
167. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 도메인은 비-공유 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용을 통해 이량체를 형성하는 능력을 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
168. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 CH3 도메인을 포함하고, CH2 도메인을 포함하지 않거나 상기 이량체화 유닛은 CH2 도메인을 포함하고, CH3 도메인을 포함하지 않는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
169. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
170. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
171. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 이루어지는 폴리펩티드로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
172. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
173. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
174. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
175. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
176. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 최대 22 개, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
177. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 최대 22 개, 예를 들어 최대 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된다는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 이루어지는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
178. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커, 예컨대 GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 139)인 관용-유도 컨스트럭트.
179. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
180. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 신호 펩티드는 표적화 유닛의 N-말단 또는 표적화 유닛의 C-말단에 위치하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
181. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 신호 펩티드는 인간 Ig VH 신호 펩티드 또는 본 명세서에 기술된 임의의 표적화 유닛의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드이고, 예를 들어 인간 IL-10의 인간 신호 펩티드 또는 인간 TGFβ의 인간 신호 펩티드인 관용-유도 컨스트럭트.
182. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 IL-10 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는 인간 IL-10 표적화 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
183. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 인간 Ig VH 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 바람직하게는 scFv, 예를 들어 인간 항-DEC205를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
184. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
185. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
186. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열과 적어도 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98% 또는 예를 들어 적어도 99%를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
187. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
188. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 최대 5 개의 아미노산, 예컨대 최대 4 개의 아미노산, 예컨대 최대 3 개의 아미노산, 예컨대 최대 2 개의 아미노산 또는 예컨대 최대 1 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입되는 것을 제외하고는, SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
189. 상기한 실시 양태 중 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA ㅅ서열 또는 RNA 서열인 관용-유도 컨스트럭트.
190. 상기한 실시 양태 중 어느 하나에 정의된 폴리뉴클레오티드.
191. 실시 양태 190에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
192. 실시 양태 190에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 실시 양태 191에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
193. 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 정의된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드.
194. 두 개의 폴리펩디드로 이루어진 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 정의된 이량체 단백질.
195. 두 개 이상의 폴리펩디드로 이루어진 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 정의된 다량체 단백질.
196. 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
197. 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 실시 양태 191에 따른 벡터, 실시 양태 193에 따른 폴리펩티드, 실시 양태 194에 따른 이량체 단백질 또는 실시 양태 195에 따른 다량체 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
198. 실시 양태 196-197 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석재를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
199. 실시 양태 196-198 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, PBS, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
200. 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 다량체 단백질, 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법으로,
상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 실시 양태 190에 따른 폴리뉴클레오티드를 이용해서 세포를 형질감염 시키는 단계;
ii) 상기 세포를 배양하는 단계;
iii) 상기 세포로부터 발현된 다량체 단백질, 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 단계; 및
iv) 단계 iii)에서 얻은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계.
201. 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로, 상기 약학적 조성물은 실시 양태 190에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
i) 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계;
ii) 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 얻은 폴리뉴클레오티드 또는 단계 ii)에서 얻은 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계.
202. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 앓고있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 대상체에 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
203. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료를 위한 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물.
204. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료를 위한 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 용도.
205. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 용도.
206. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 갖는 대상체를 치료하기 위한 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물의 용도
207. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료를 위한 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭를 포함하는 의약.
208. 약학적으로 허용가능한 담체 및 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 포함하는 약학적 조성물의 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 갖는 대상체의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도.
209. 약학적으로 허용가능한 담체 및 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 포함하는 약학적 조성물의 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 갖는 대상체의 치료를 위한 용도.
210. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료에 사용하는 경우 약학적으로 허용가능한 담체 및 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 포함하는 약학적 조성물.
211. 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원 using 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 이용한 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법.
212. 실시 양태 1 내지 189 중 어느 하나에 따른 관용-유도 컨스트럭트 또는 실시 양태 196-199 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Nykode Therapeutics AS <120> Tolerance-inducing constructs and composition and their use for the treatment of immune disorders <130> P5967PC00 <160> 220 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Dimerization unit <400> 1 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Glu Pro Lys Ser 1 5 10 15 Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 35 40 45 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 50 55 60 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 85 90 95 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 100 105 110 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 115 120 125 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 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<223> Linker, REPEAT: m is 1 or more <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> The sequence can be repeated m times, where m is an integer greater than or equal to 1 <400> 166 Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ser 1 5 <210> 167 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Linker <400> 167 Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 Gly <210> 168 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Linker <400> 168 His Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Ala Gly 1 5 10 <210> 169 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Murine IL-10 <400> 169 Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe Ser Gln 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile Leu Leu 35 40 45 Thr Asp Ser Leu Met Gln 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sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Natural leader sequence humane CCL3L1 <400> 198 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser 20 <210> 199 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> humane CCL3L1 <400> 199 Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 200 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Hinge-region 1 from human IgG3? <400> 200 gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacaca 36 <210> 201 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Hinge-region 4 from human IgG3? <400> 201 ggcggtggaa gcagcggagg tggaagtgga 30 <210> 202 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human IgG3 CH3 domain? <400> 202 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 203 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human IgG3 CH3 domain? <400> 203 ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac tacaacacca cgcctcccat gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240 aacatcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggtaa a 321 <210> 204 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Linker <400> 204 ggcctcggtg gcctg 15 <210> 205 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human transforming growth factor beta-1 <400> 205 Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr 20 25 30 Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala 35 40 45 Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val 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Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys Lys Asn Ser Gly 290 295 300 Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr Arg Leu Glu 305 310 315 320 Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Ala Ala Tyr 325 330 335 Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile 340 345 350 Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly 355 360 365 Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser 370 375 380 Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro 385 390 395 400 Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu 405 410 415 Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser 420 425 430 Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 435 440 <210> 207 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human transforming growth factor beta-3 <400> 207 Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn 1 5 10 15 Phe Ala Thr Val Ser Leu Ser Leu 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Ile Leu Glu 225 230 235 240 Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu 245 250 255 Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp 260 265 270 His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu 275 280 285 Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr 290 295 300 Asn Tyr Cys Phe Arg 305 <210> 208 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human transforming growth factor beta-1 <400> 208 atgccgccct ccgggctgcg gctgctgccg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60 ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120 gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180 agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300 gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360 tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420 cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480 aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540 tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600 accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660 gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720 accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780 atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840 gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900 gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020 gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080 ctggagccgc tgcccatcgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140 aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173 <210> 209 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human transforming growth factor beta 2 <400> 209 atgcactact gtgtgctgag cgcttttctg atcctgcatc tggtcacggt cgcgctcagc 60 ctgtctacct gcagcacact cgatatggac cagttcatgc gcaagaggat cgaggcgatc 120 cgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagtcccc cagaagacta tcctgagccc 180 gaggaagtcc ccccggaggt gatttccatc tacaacagca ccagggactt gctccaggag 240 aaggcgagcc ggagggcggc cgcctgcgag cgcgagagga gcgacgaaga gtactacgcc 300 aaggaggttt acaaaataga catgccgccc ttcttcccct ccgaaactgt ctgcccagtt 360 gttacaacac cctctggctc agtgggcagc ttgtgctcca gacagtccca ggtgctctgt 420 gggtaccttg atgccatccc gcccactttc tacagaccct acttcagaat tgttcgattt 480 gacgtctcag caatggagaa gaatgcttcc aatttggtga aagcagagtt cagagtcttt 540 cgtttgcaga acccaaaagc cagagtgcct gaacaacgga ttgagctata tcagattctc 600 aagtccaaag atttaacatc tccaacccag cgctacatcg acagcaaagt tgtgaaaaca 660 agagcagaag gcgaatggct ctccttcgat gtaactgatg ctgttcatga atggcttcac 720 cataaagaca ggaacctggg atttaaaata agcttacact gtccctgctg cacttttgta 780 ccatctaata attacatcat cccaaataaa agtgaagaac tagaagcaag atttgcaggt 840 attgatggca cctccacata taccagtggt gatcagaaaa ctataaagtc cactaggaaa 900 aaaaacagtg ggaagacccc acatctcctg ctaatgttat tgccctccta cagacttgag 960 tcacaacaga ccaaccggcg gaagaagcgt gctttggatg cggcctattg ctttagaaat 1020 gtgcaggata attgctgcct acgtccactt tacattgatt tcaagaggga tctagggtgg 1080 aaatggatac acgaacccaa agggtacaat gccaacttct gtgctggagc atgcccgtat 1140 ttatggagtt cagacactca gcacagcagg gtcctgagct tatataatac cataaatcca 1200 gaagcatctg cttctccttg ctgcgtgtcc caagatttag aacctctaac cattctctac 1260 tacattggca aaacacccaa gattgaacag ctttctaata tgattgtaaa gtcttgcaaa 1320 tgcagctaa 1329 <210> 210 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human transforming growth factor beta 3 <400> 210 atgaagatgc acttgcaaag ggctctggtg gtcctggccc tgctgaactt tgccacggtc 60 agcctctctc tgtccacttg caccaccttg gacttcggcc acatcaagaa gaagagggtg 120 gaagccatta ggggacagat cttgagcaag ctcaggctca ccagcccccc tgagccaacg 180 gtgatgaccc acgtccccta tcaggtcctg gccctttaca acagcacccg ggagctgctg 240 gaggagatgc atggggagag ggaggaaggc tgcacccagg aaaacaccga gtcggaatac 300 tatgccaaag aaatccataa attcgacatg atccaggggc tggcggagca caacgaactg 360 gctgtctgcc ctaaaggaat tacctccaag gttttccgct tcaatgtgtc ctcagtggag 420 aaaaatagaa ccaacctatt ccgagcagaa ttccgggtct tgcgggtgcc caaccccagc 480 tctaagcgga atgagcagag gatcgagctc ttccagatcc ttcggccaga tgagcacatt 540 gccaaacagc gctatatcgg tggcaagaat ctgcccacac ggggcactgc cgagtggctg 600 tcctttgatg tcactgacac tgtgcgtgag tggctgttga gaagagagtc caacttaggt 660 ctagaaatca gcattcactg tccatgtcac acctttcagc ccaatggaga tatcctggaa 720 aacattcacg aggtgatgga aatcaaattc aaaggcgtgg acaatgagga tgaccatggc 780 cgtggagatc tggggcgcct caagaagcag aaggatcacc acaaccctca tctaatcctc 840 atgatgattc ccccacaccg gctcgacaac ccgggccagg ggggtcagag gaagaagcgg 900 gctttggaca ccaattactg cttccggtga 930 <210> 211 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human interleukin-10 isoform 1 <400> 211 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 212 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human interleukin 10 (IL10) <400> 212 atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60 ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120 cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180 ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240 caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300 caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360 ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420 caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480 tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaactga 537 <210> 213 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human secretoglobin family 3A member 2 precursor (SCGB3A2) <400> 213 Met Lys Leu Val Thr Ile Phe Leu Leu Val Thr Ile Ser Leu Cys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Ala Thr Ala Phe Leu Ile Asn Lys Val Pro Leu Pro Val Asp 20 25 30 Lys Leu Ala Pro Leu Pro Leu Asp Asn Ile Leu Pro Phe Met Asp Pro 35 40 45 Leu Lys Leu Leu Leu Lys Thr Leu Gly Ile Ser Val Glu His Leu Val 50 55 60 Glu Gly Leu Arg Lys Cys Val Asn Glu Leu Gly Pro Glu Ala Ser Glu 65 70 75 80 Ala Val Lys Lys Leu Leu Glu Ala Leu Ser His Leu Val 85 90 <210> 214 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human secretoglobin family 3A member 2 (SCGB3A2) <400> 214 atgaagctgg taactatctt cctgctggtg accatcagcc tttgtagtta ctctgctact 60 gccttcctca tcaacaaagt gccccttcct gttgacaagt tggcaccttt acctctggac 120 aacattcttc cctttatgga tccattaaag cttcttctga aaactctggg catttctgtt 180 gagcaccttg tggaggggct aaggaagtgt gtaaatgagc tgggaccaga ggcttctgaa 240 gctgtgaaga aactgctgga ggcgctatca cacttggtgt ga 282 <210> 215 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> IGSF11 (VSIG3) (ECD) <400> 215 Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile 20 25 30 Gln Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr 35 40 45 Ser Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu 50 55 60 Ser Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln 65 70 75 80 Met Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly 85 90 95 Thr Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu 100 105 110 Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile 115 120 125 Gly Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro 130 135 140 Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp 145 150 155 160 Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr 180 185 190 Gln Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser 210 215 220 Thr Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile 225 230 235 240 Gly <210> 216 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> IGSF11 (VSIG3) (ECD) <400> 216 atgacttctc agcgttcccc tctggcgcct ttgctgctcc tctctctgca cggtgttgca 60 gcatccctgg aagtgtcaga gagccctggg agtatccagg tggcccgggg tcagccagca 120 gtcctgccct gcactttcac taccagcgct gccctcatta acctcaatgt catttggatg 180 gtcactcctc tctccaatgc caaccaacct gaacaggtca tcctgtatca gggtggacag 240 atgtttgatg gtgccccccg gttccacggt agggtaggat ttacaggcac catgccagct 300 accaatgtct ctatcttcat taataacact cagttatcag acactggcac ctaccagtgc 360 ctggtcaaca accttccaga catagggggc aggaacattg gggtcaccgg tctcacagtg 420 ttagttcccc cttctgcccc acactgccaa atccaaggat cccaggatat tggcagcgat 480 gtcatcctgc tctgtagctc agaggaaggc attcctcgac caacttacct ttgggagaag 540 ttagacaata ccctcaaact acctccaaca gctactcagg accaggtcca gggaacagtc 600 accatccgga acatcagtgc cctgtcttca ggtttgtacc agtgcgtggc ttctaatgct 660 attggaacca gcacctgtct tctggatctc caggttattt caccccagcc caggaacatt 720 gga 723 <210> 217 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> CTLA4_HUMAN Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 (ECD) <400> 217 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp <210> 218 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA4) (ECD) <400> 218 atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60 ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120 gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180 gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240 gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300 tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360 gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420 ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480 gac 483 <210> 219 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> MISC_FEATURE <223> Human programmed cell death protein 1 PDCD1 (PD-1) (ECD) <400> 219 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val 165 170 <210> 220 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <223> Human programmed cell death 1 PDCD1 (PD-1) (ECD) <400> 220 atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60 ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120 ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180 gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240 gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300 cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360 tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420 gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480 aggccagccg gccagttcca aaccctggtg 510

Claims (63)

  1. 다음을 포함하는 관용-유도 컨스트럭트:
    항원-제시세포를 표적화 하거나 표적화 할 수 있는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (i)에 정의된 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드; 또는
    (ii)에 정의된 다중 폴리펩티드, 예를 들어 두 개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 단백질과 같은 다량체 단백질;
    여기서 상기 항원 유닛은 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 세포를 활성화하지 않고, 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용 하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  3. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 다량체화 유닛을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  4. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 이량체화 유닛을 포함하고 및/또는 상기 다량체 단백질은 이량체 단백질인, 관용-유도 컨스트럭트.
  5. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 유닛은 TGFβR1, TGFβR2, TGFβR3, IL10R, IL-10RA and IL10-RB, IL2R, IL4R, IL6R, IL11R 및 IL13R, IL27R, IL35R, IL37R, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, MHCII, CD83, SIGLEC, MGL, CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, 랑게린(Langerin), MR, DC-Sign, Treml4, 덱틴-1(Dectin-1), PDL1, PDL2, 및 HVEM로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체에 결합하는 모이어티를 포함하거나 그로 구성되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 모이어티는 항체 또는 이의 일부이고, 예컨데 scFv인 관용-유도 컨스트럭트.
  7. 제 5 항 내지 제 6 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 모이어티는 CD205에 특이성을 갖는 항체이거나, 예컨데 scFv와 같은 CD205에 특이성을 갖는 항체의 일부인 관용-유도 컨스트럭트.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 모이어티는 합성 리간드인 관용-유도 컨스트럭트.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 모이어티는 천연 리간드인 관용-유도 컨스트럭트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 천연 리간드는 TGFβ, IL-10, IL2, IL4, IL6, IL11, IL13, IL27, IL35, IL37, CCL19, CCL21, ICAM-1, 케라틴, VSIG-3, SCGB3A2, CTLA-4, PD-1 및 BTLA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 천연 리간드는 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1의 세포외 도메인 및 BTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 천연 리간드는 IL-10, TGFβ, SCGB3A2 및 VSIG-3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  13. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 하나의 자기-항원 또는 하나의 알레르겐 또는 하나의 동종항원 또는 하나의 이종항원의 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  14. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 하나의 자기-항원 또는 하나의 알레르겐 또는 하나의 동종항원 또는 하나의 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  15. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 다수의 상이한 자기-항원 또는 다수의 상이한 알레르겐 또는 다수의 상이한 동종항원 또는 다수의 상이한 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  16. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 약 200 개의 아미노산 길이, 예컨대 7 내지 150 개의 아미노산, 바람직하게 7 내지 100 개의 아미노산, 예를 들어, 9 내지 100 개의 아미노산 또는 15 내지 100 개의 아미노산 또는 9 내지 60 개의 아미노산 또는 9 내지 30 개의 아미노산 또는 15 내지 60 또는 15 내지 30 또는 20 내지 75 개의 아미노산 또는 25 내지 50 개의 아미노산 길이를 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  17. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 상에 특이적 제시에 적합한 길이를 갖는 것, 예를 들어 MHC 클래스 I 제시를 위한 7 내지 11 개의 아미노산 길이 또는 예를 들어 MHC 클래스 II 제시를 위해 15 개의 아미노산 길이를 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  18. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 최대 3500 개의 아미노산, 예컨대 60 내지 3500 개의 아미노산, 예를 들어 약 80 또는 약 100 또는 약 150 개의 아미노산 부터 약 3000 개의 아미노산 까지, 예컨대 약 200 내지 약 2500 개의 아미노산, 예커대 약 300 내지 약 2000 개의 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500 개의 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000 개의 아미노산을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  19. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 1 내지 10 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 10 개의 T 세포 에피토프 또는 11 내지 20 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 T 세포 에피토프 또는 21 내지 30 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 T 세포 에피토프 또는 31 내지 40 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 개의 T 세포 에피토프 또는 41 내지 50 개의 T 세포 에피토프, 예컨대 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  20. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 T 세포 에피토프 링커로 분리된 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 비-면역원성 이고 바람직하게는 또한 유연한 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  22. 제 20 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프 링커는 4 내지 20 아미노산, 예를 들어 5 내지 20 아미노산 또는 5 내지 15 아미노산 또는 8 내지 20 아미노산 또는 8 내지 15 아미노산 10 내지 15 아미노산 또는 8 내지 12 아미노산으로 구성되는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  23. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 개별화된 관용-유도 컨스트럭트인, 관용-유도 컨스트럭트.
  24. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 기성품의 관용-유도 컨스트럭트인, 관용-유도 컨스트럭트
  25. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 알레르겐은 식품 알레르겐, 벌독 알레르겐, 라텍스 알레르겐, 먼지 벌레 알레르겐, 바퀴벌레 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 진균 알레르겐, 털짐승 알레르겐, 꽃가루 알레르겐 및 약물에 포함된 알레르겐으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  27. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 자기-항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 자기-항원은 다발성 경화증 자기-항원, 제1형 당뇨병 자기-항원, 셀리악병 자기-항원, 류마티스 관절염 자기-항원, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 자기-항원, 하시모토 갑상선염 자기-항원, 낙엽성 천포창 자기-항원, 심상성 천포창 자기-항원, 갑상선 눈 질환 자기-항원, 그레이브스병 자기-항원, 원발 담즙성 간경화 자기-항원, 중증 근무력증 자기-항원, 인슐린-저항성 당뇨병 자기-항원 및 용혈성 빈혈 자기-항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  29. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 유닛은 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  30. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 영역을 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  32. 제 30 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 Ig 유래인 관용-유도 컨스트럭트.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 더 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 다른 도메인은 면역글로불린 도메인이고, 바람직하게는 면역글로불린 불변 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
  35. 제 33 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카복시말단 C 도메인 이고, 바람직하게는 IgG3 유래인 관용-유도 컨스트럭트.
  36. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 이량체화 유닛 링커를 추가로 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  38. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는 것 인, 관용-유도 컨스트럭트 .
  39. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 삼량체화 유닛이고, 예를 들어 콜라겐-유래 삼량체화 유닛이고, 예컨대 인간 콜라겐-유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
  40. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 다량체화 유닛은 T4 피브리틴의 C-말단 도메인인 삼량체화 유닛인 관용-유도 컨스트럭트.
  41. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체화 유닛은 사량체화 유닛이고, 예를 들어 p53 유래 도메인인 관용-유도 컨스트럭트.
  42. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 폴리뉴클레오티드 (i)인 관용-유도 컨스트럭트.
  43. 청구항 제 42 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 RNA 또는 DNA, 바람직하게 DNA인 관용-유도 컨스트럭트.
  44. 제 42 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것인 관용-유도 컨스트럭트.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 정의된 폴리뉴클레오티드.
  46. 제 45 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  47. 제 45 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제 46 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  48. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 정의된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드.
  49. 제 48 항에 따른 폴리펩티드 2 개로 구성된 이량체 단백질.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 이량체 단백질은 동종이량체 단백질인 이량체 단백질.
  51. 제 48 항에 따른 폴리펩티드 2 개 이상으로 구성된 다량체 단백질.
  52. 제 48 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 이량체 단백질의 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 N-말단에서 C-말단 순서로 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛으로 존재하는 것 인, 폴리펩티드, 이량체 단백질 또는 다량체 단백질.
  53. 의약으로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 따른 관용-유도 컨스트럭트, 제45항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제46항에 따른 벡터, 제48항에 따른 폴리펩티드, 제49항 또는 제50항 중 어느 한 항에 따른 이량체 단백질, 또는 제51항에 따른 다량체 단백질.
  54. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 따른 관용-유도 컨스트럭트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, PBS, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약학적 조성물.
  56. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 따른 관용-유도 컨스트럭트 또는 제 54 항 내지 제 55 항에 따른 약학적 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 치료는 예방적 치료(prophylactic treatment) 또는 치료적 치료(therapeutic treatment) 인, 관용-유도 컨스트럭트 또는 약학적 조성물.
  58. 제 54 항 내지 제 55 항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로,
    상기 약학적 조성물은 제 48 항에 따른 폴리펩티드, 제 49 항 또는 제 50 항 중 어느 한 항에 따른 이량체 단백질을 포함하고,
    상기 방법은 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 제 45 항에 따른 폴리뉴클레오티드로 세포를 형질감염 시키는 단계;
    b) 상기 세포를 배양하는 단계;
    c) 상기 세포로부터 발현된 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집하고 정제하는 단계; 및
    d) 단계 c)로부터 얻어진 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계.
  59. 제 54 항 내지 제 55 항에 따른 약학적 조성물을 제조하는 방법으로,
    상기 약학적 조성물은 제 45 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;
    b) 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 클로닝 하는 단계; 및
    c) 단계 a)로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드 또는 단계 b)로부터 얻어진 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것.
  60. 제 54 항 내지 제 55 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부를 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법.
  61. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태, 예를 들어 자가면역질환, 알레르기 질환 또는 이식 거부의 치료에 사용하기 위한 제 54 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물.
  62. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 따른 관용-유도 컨스트럭트를 이용한 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 따른 관용-유도 컨스트럭트 또는 제 54 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 자기-항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원에 대한 관용을 개선하는 방법.
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