KR20240019136A - 작제물과 면역억제 화합물의 공동발현 - Google Patents

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아그네트 브룬스빅 프레드릭센
아우둔 트리게 하우겐 베르사스
스티네 그라눔
하이디 미르세트
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니코데 테라퓨틱스 에이에스에이
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Abstract

본 발명은 별도의 분자로서 공동발현되도록 조작된 다수의 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드와 같은 벡터에 관한 것이다. 이러한 별도의 분자는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함한다.

Description

작제물과 면역억제 화합물의 공동발현
본 발명은 별개의 분자들로서 공동발현되도록 조작된 다수의 관심 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드와 같은 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물, 및 질병의 치료 또는 예방에서의 이러한 벡터 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
질병, 예를 들어 바이러스, 박테리아 또는 기생충과 같은 병원체로 인한 질병으로부터 보호하려면 면역 반응이 필요하다. 그러나 바람직하지 않은 면역 활성화는 자신의 조직을 손상시키거나 파괴하는 과정을 유발할 수 있다. 예를 들어, 바람직하지 않은 면역 활성화는 항체 및/또는 T 림프구가 자가 항원과 반응하여 예를 들어 조직 손상 및 병리를 초래하는 자가면역 질환에서 발생한다. 바람직하지 않은 면역 활성화는 알레르기 반응에서도 발생하는데, 이는 일반적으로 환경에 있는 무해한 물질에 대한 과장된 면역 반응을 특징으로 하며 조직 파괴로 이어지는 염증 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 바람직하지 않은 면역 활성화는 이식 거부, 예를 들어 이식된 장기 또는 조직의 거부에서 발생하며, 이는 기증자 동종항원 또는 이종항원을 인식하고 이식된 장기 또는 조직의 파괴를 초래하는 숙주에 존재하는 동종반응성 T 세포에 의해 상당히 매개된다.
면역 관용은 주어진 유기체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 가진 물질이나 조직에 대한 특정 면역 반응이 후천적으로 부족한 것이다.
일반적으로 특정 항원에 대한 내성을 유도하려면 활성화 신호가 없는 상태에서 항원-제시 세포(APC)가 다른 면역 세포에 항원을 제시해야 하며, 이로 인해 항원 특이적 림프구가 죽거나 기능적으로 비활성화되거나 또는 내성을 유지하는 항원 특이적 세포가 생성된다. 이 과정은 일반적으로 자기 항원에 대한 내성 또는 자기 내성을 설명한다. 면역억제제는 바람직하지 않은 면역 반응을 예방하거나 감소시키는 데, 예컨대 자가면역 질환에 걸린 환자를 치료하거나 또는 또는 동종 이식 환자를 치료하는데 유용하다. 원치 않는 면역 반응의 면역억제를 생성하기 위한 기존 전략은 광범위하게 작용하는 면역억제제를 기반으로 한다. 또한, 면역억제를 유지하기 위해 면역억제제 치료는 평생 동안 지속되는 경우가 많다. 불행하게도 광범위하게 작용하는 면역억제제의 사용은 면역결핍과 같은 심각한 부작용의 위험과 관련이 있다. 그 이유는 이들 약물의 대부분이 비선택적으로 작용하여 감염에 대한 감수성이 증가하고 암 면역감시(cancer immunosurveillance)가 감소하기 때문이다. 따라서, 항원-특이적 관용을 유도하는 새로운 화합물 및 조성물이 유익할 것이다.
수지상 세포와 같은 항원-제시 세포(APC)는 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, APC의 활성화 상태와 미세 환경(사이토카인 및 성장 인자)에 따라 이것은 제시된 항원(병원체로 추정)과 싸우거나 제시된 항원(비병원성 항원으로 추정)에 대한 반응을 침묵시키고 말초 내성을 유도하기 위한 신호를 항원 특이적 T 세포에 제공한다. 관용원성 면역요법(tolerogenic immunotherapies) 개발의 과제는 염증성 면역 반응을 유발하지 않는 방식으로 APC에 항원을 효율적으로 전달하는 것이다.
본 발명은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛과 비염증성 또는 관용원성 방식으로 APC의 표면 분자와 상호작용하여 염증성 활성화 상태가 없을 때 항원 제시를 유도하는 표적화 유닛을 포함하는 작제물에 관한 것이다.
백신체 작제물(Vaccibody constructs)은 2개의 폴리펩티드로 구성된 이량체 융합 단백질로서, 각 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 하나 이상의 질병 관련 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 백신 작제물은 다수의 폴리펩티드로 구성된 다량체 융합 단백질로서, 각각은 APC를 표적으로 하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 및 하나 이상의 질병 관련 항원 또는 이의 일부를 포함하는 항원 유닛을 포함한다 - 예를 들어 WO 2004/076489 A1, WO 2011/161244 A1, WO 2013/092875 A1 또는 WO 2017/118695 A1 참조. 이들 작제물은 항원 유닛에 포함된 항원 또는 이의 일부, 예를 들어 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하는 데 효율적인 것으로 나타났다.
백신체 작제물은 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 플라스미드와 같은 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드의 형태로 대상체에 투여될 수 있다. 숙주 세포에 투여된 후, 예를 들어 대상체의 근육 세포에 투여한 후, 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛으로 인해 이량체 단백질과 같은 다량체 융합 단백질을 형성하는 폴리펩티드가 발현된다.
본 발명자들은 놀랍게도 변형된 백신체 플랫폼이, 작제물을 내재화하고 관용 유도 방식으로 그 안에 포함된 항원을 제시하는 APC의 선택된 표면 수용체에 대한 결합 및 이를 통한 신호 전달을 통해 선택된 항원 특이적 관용 반응의 유도를 위한 최적의 방식으로 APC에 질병 관련 항원을 전달하는 데 사용될 수 있음을 발견하였다.
요약
본 발명은 작제물 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 공동발현을 위한 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드를 제공한다. 벡터 및 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응의 예방적 또는 치료적 치료와 같이 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태의 치료에 사용하기 위한 것이다.
이러한 작제물 및 면역억제 화합물(들)은 일단 벡터가 대상체에게 투여되면 관용을 유도하는 방식으로 항원 유닛에서 에피토프의 제시를 허용하며, 따라서 본 발명의 벡터는 자가면역질환, 알레르기 질환, 이식거부반응 등 면역질환의 예방적 또는 치료적 치료에 사용하기에 적합하다.
작제물 및 면역억제 화합물(들)은 문제의 면역 질환을 일으키는 면역체계의 질병 특이적 세포의 하향조절을 유발하므로, 이들은 일반 면역체계를 억제하지 않는다. 따라서, 본 발명의 벡터를 사용하여 문제의 면역 질환을 치료하면 감염에 대한 감수성이 증가되고 암 면역감시가 감소되지 않는다.
하나 이상의 면역억제 화합물은 관용 유도 방식으로, 또는 예를 들어 관용 유지 세포의 유도를 촉진하거나 그러한 세포의 유지를 도음으로써 항원 유닛에서 에피토프의 제시를 선호하는 환경을 생성하거나 촉진하는 데 도움을 준다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 활성화시키지 않고 표적화하는 표적화 유닛을 포함한다.
본 발명의 벡터는 면역 질환의 예방적 또는 치료적 치료를 필요로 하는 대상체에게 벡터/약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질환의 예방적 또는 치료적 치료를 위해, 예를 들어 약학적 조성물, 즉 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 사용될 수 있다.
도 1
두 코딩 영역 사이에 삽입되는 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 IRES 공동발현 요소를 보여준다. mRNA가 형성되면 두 개의 리보솜(T)이 mRNA의 두 별도 위치에서 번역을 시작할 수 있고 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A 및 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물일 수 있다.
도 2
두 유전자 사이에 삽입된 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 2A 자가 절단 펩티드 공동발현 요소를 보여준다. 전사 후, 하나의 리보솜이 mRNA를 번역하고 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. 도면의 상단은 2A 서열이 코딩 서열의 일부가 아닌 경우 융합 단백질이 어떻게 형성되는지 보여준다. A 및 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물일 수 있다.
도 3
본 발명의 벡터에 사용하기 위한 양방향 프로모터(P) 공동발현 요소를 보여주며, 이는 두 코딩 영역 사이에 위치한다. 하나의 mRNA가 형성되고 두 개의 리보솜(T)이 2 개의 상이한 mRNA에서 번역을 시작할 수 있으며 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A와 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물일 수 있다.
도 4
2개의 프로모터(P), 즉 2개의 코딩 영역 앞에 위치하는 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 공동발현 요소를 보여준다. 두 개의 mRNA가 형성되고 두 개의 리보솜(T)이 두 개의 서로 다른 mRNA에서 번역을 시작할 수 있으며 두 개의 단백질(A와 B)이 형성된다. A 및 B는 예를 들어 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물일 수 있다.
도 5
제1 폴리펩티드에 기초하여 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물의 구현예를 예시한다.
도 6
DNA 벡터 VB5049*(본 발명에 따른 벡터) 또는 VB5052*를 사용하여 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시킨 후 얻은 ELISA 결과(단백질의 발현 및 분비)를 보여준다.
도 7
DNA 벡터 VB5049*(본 발명에 따른 벡터) 또는 VB5052*로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다.
도 8
DNA 벡터 VB5049* 또는 VB5052*를 단일 투여하고 MOG(35-55) 펩티드로 재자극한 후 마우스에서 얻은 비장세포에 대한 FluoroSpot 분석(IL-10/IFN-γ 비율)의 결과를 보여준다.
도 9
MOG(35-55) 펩티드로 16시간 재자극 시 결정된 전체 CD4+ T 세포 집단 중 비장 IFN-γ+ T 세포(9A) 및 IL-17+ T 세포(9B)의 비율을 유세포 계측법으로 평가하여 보여준다. C57BL/6 마우스에 DNA 벡터 VB5049*, VB5051* 또는 VB5052*를 근육 내로 1회 투여하고 7일 후에 비장을 채취하였다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 10
MOG 사량체 염색 결과와 MOG 특이적 T 세포 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 0일차에 DNA 벡터 VB5049*, VB5051* 또는 VB5052*를 근육내 투여한 후 전기천공법을 시행하고 비장을 투여 후 7일차에 수확하였다. CD4+MOG(35-55) tet+ T 세포 집단 중 비장 Foxp3+ 세포의 비율은 H-2 IAb/MOG(35-55) 사량체에 의해 검출되었다. 사량체 염색은 생체외에서 수행되었으며 비장세포는 MOG(35-55) 펩티드로 재자극되지 않았다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 11
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA(포획 항체: 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체)에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민(ExpiFectamine)만 처리한 Expi293F 세포의 상등액.
도 12
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 면역억제 화합물의 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 다음 항체가 사용되었다: (A) 포획 항체: 1μg/ml 래트 항-쥐 IL-10 항체, 100μl/웰, MAB417, R&D Systems. 검출 항체: 0.2 μg/ml, 염소 항-쥐 IL-10 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems. (B) 포획 항체: 2 μg /ml TGF-베타 1 항체, 100 μl /웰, MAB2402, RD Systems. Detection 항체: 0.8 μg/ml 닭 항-인간 TGF-베타 1 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, BAF240, RD Systems. (C) 포획 항체: 0.8 μg/ml 염소 항-쥐 CTLA-4 항체, 100 μl /웰, AF476, RD Systems. 검출 항체: 0.8 μg/ml 염소 항-쥐 CTLA-4 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, BAF476, RD Systems. (D) 포획 항체: 2 μg/ml rat 항-쥐 IL-2 항체, 100 μl /웰, 503701, BioLegend. 검출 항체: 2 μg/ml rat 항-쥐 IL-2 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, 503803, BioLegend. (E) 포획 항체: 2 μg/ml rat 항-쥐 IFN-γ 항체, 100 μl /웰, 505802, BioLegend. 검출 항체: 2 μg/ml rat 항-쥐 IFN-γ 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, 505704, BioLegend.
도 13
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 지시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물의 별도의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 다음 항체가 사용되었다: 포획 항체: 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology. 검출 항체: (A) 0.2 μg/ml 염소 항-마우스 항-IL-10 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems. (B) 0.8 μg/ml 닭 항-인간 TGFbeta1 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF240, RD Systems. (C) 0.8 μg/ml 염소 항-마우스 CTLA-4 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF476, RD Systems. (D) 2 μg/ml rat 항-마우스 IFN-γ 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, 505704, BioLegend.
도 14
표시된 DNA 벡터로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. A: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG(sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800(SA5-10172). 단백질 표준은 Chemidoc 채널 Dylight 650에서 검출되었다(신호는 표시되지 않음). Chemidoc 채널 Dylight 800. 검은색 화살표는 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비되는 제1 폴리펩티드를 나타낸다. B: 비환원 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG(sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800(SA5-10172). Chemidoc 채널 Dylight 650(단백질 표준용) 및 800. 검은색 화살표는 각각의 DNA 벡터로부터 발현되고 형질감염된 세포로부터 분비된 2개의 제1 폴리펩티드 분자에 의해 형성된 이량체 단백질을 나타낸다. C: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 래트 항-IL10(MAB417). 2차 항체: 당나귀 항쥐, Dylight 488(SA5-10026). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 488이다. 검은색 화살표는 IL-10이 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다. D: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 염소 항-CTLA-4(AF476). 2차 항체: 당나귀 항-염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 800이다. 검은색 화살표는 CLTA-4가 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다. E: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 래트 항-IL2(503702). 2차 항체: 당나귀 항쥐, Dylight 650(SA5-10029). Chemidoc 채널 Dylight 650. 검은색 화살표는 IL-2가 각각의 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다.
도 15
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 DNA 벡터 VB5051에 의해 인코딩된 MOG(27-63)의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 검출 항체: 마우스 항-MOG 항체, 3.3 μg/ml, 100 μl/well, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology.
도 16
이중 색상 IL-10/IFN-γ FluoroSpot 분석 결과를 표시한다. C57BL/6 마우스에 지시된 DNA 벡터를 4회(0일, 3일, 7일 및 10일) 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 첫 번째 투여 후 14일에 비장을 수확하였다. 재자극되지 않은(A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극한 후 이중 색상 FluoroSpot 분석으로 비장 세포를 IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/106 비장세포)에 대해 테스트하였다. (B). 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, *(p<0.05), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 17
도 16B에 표시된 데이터로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율을 보여준다. 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, *(p<0.05), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 18
유세포 계측법을 통해 Foxp3+ 생산 CD4+ T 세포를 검출한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 투여한 후 0일, 3일, 7일 및 10일에 4회 전기천공을 실시하고 첫 번째 투여 후 14일에 비장을 수확하였다. 비장 CD4+Foxp3+ T 세포의 백분율은 MOG(35-55) 펩티드로 16시간 재자극하여 결정되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 19
유세포 계측법을 통한 IFN- γ 및 IL-17 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 4회 투여한 후 0, 3, 7 및 10일에 전기천공을 실시하고 첫 번째 투여 후 14일에 비장을 수확하였다. 전체 CD4+ T 세포 집단 중 (A) IFN- γ + T 세포 및 (B) IL-17+ T 세포의 백분율은 MOG(35-55) 펩티드로 16시간 재자극 시 결정되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 20
이중 색상 IL-10/IFN-γ FluoroSpot 분석 결과를 표시한다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. 재자극되지 않은 이중 색상 FluoroSpot(A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극 시(B) IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/106 비장 세포) 에 대해 비장세포를 테스트하였다. 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 21
도 20B에 표시된 데이터로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율을 보여준다. 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, *(p<0.05), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 22
MOG 사량체 염색 결과와 MOG 특이적 T 세포 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. CD4+MOG(38-49) tet+ T 세포 집단 중 비장 Foxp3+ 세포의 비율은 H-2 IAb/MOG(38-49) 사량체에 의해 검출되었다. 사량체 염색은 생체외에서 수행되었으며 비장세포는 MOG(35-55) 펩티드로 재자극되지 않았다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 23
이중 색상 IL-10/IFN-γ FluoroSpot 분석 결과를 표시한다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. 비장 세포를 IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/106 비장세포)에 대해 이중 색상 FluoroSpot으로 시험하였다. 재자극되지 않은 경우 (대조군, A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극된 경우 (B). 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 24
도 23B에 표시된 데이터로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율을 보여준다. 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, *(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 25
MOG 사량체 염색 결과와 MOG 특이적 T 세포 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. CD4+MOG(38-49) tet+ T 세포 집단 중 비장 Foxp3+ 세포의 비율은 H-2 IAb/MOG(38-49) 사량체에 의해 검출되었다. 사량체 염색은 생체외에서 수행되었으며 비장세포는 MOG(35-55) 펩티드로 재자극되지 않았다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 26
Treg 증식 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포 집단 중 Ki67+ 세포의 백분율이 생체외에서 검출되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 27
이중 색상 IL-10/IFN-γ FluoroSpot 분석 결과를 표시한다. C57BL/6 마우스에게 지시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 투여 후 7일에 비장을 수확하였다. 비장 세포를 IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/106 비장세포)에 대해 이중 색상 FluoroSpot으로 시험하였다. 재자극되지 않은 경우 (대조군, A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극된 경우 (B). 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, **(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 28
도 27B에 표시된 데이터로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율을 보여준다. 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹, *(p<0.01), 양측 Mann-Whitney 테스트).
도 29
MOG 사량체 염색 결과와 MOG 특이적 T 세포 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 지시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 투여 후 7일에 비장을 수확하였다. CD4+MOG(38-49) tet+ T 세포 집단 중 비장 Foxp3+ 세포의 비율은 H-2 IAb/MOG(38-49) 사량체에 의해 검출되었다. 사량체 염색은 생체외에서 수행되었으며 비장세포는 MOG(35-55) 펩티드로 재자극되지 않았다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 30
Treg 증식 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포 집단 중 Ki67+ 세포의 백분율이 생체외에서 검출되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 31
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 포획 항체: 쥐 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체.
도 32
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 면역억제 화합물의 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 다음 조건과 항체가 사용되었다: A) 상등액은 1:100으로 희석되었다. 포획 항체: 마우스 IL-10 항체, 0.4 μg/ml, 100 μl/웰, MAB417, R&D Systems. 검출 항체: 마우스 IL-10 바이오티닐화 항체, 0.2 μg/ml, BAF417, R&D Systems. B) 포획 항체: TGFbeta1 항체, 2 μg/ml, 100 μl/웰, MAB2402, RD Systems. 검출 항체: 닭 항-TGFbeta1 바이오티닐화 항체, 0.8 μg/ml, 100 μl/웰, BAF240, R&D Systems. C) 포획 항체: 마우스 GM-CSF 항체, 2 μg/ml, 100 μl/웰, MAB415, R&D Systems. 검출 항체: 항-GM-CSF 바이오티닐화 항체, 0.8 μg/ml, BAF415, R&D Systems.
도 33
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 지시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 단백질의 별도의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 포획 항체: 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/well, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology. 다음 검출 항체가 사용되었다: A) 마우스 항-IL-10 바이오티닐화 항체, 0.2 μg/ml, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems, B) 닭 항-TGFbeta1 바이오티닐화 항체, 0.8 μg/ml, 100 μl/웰, BAF240, R&D Systems. C) 항-GM-CSF 바이오티닐화 항체, 0.8 μg/ml, BAF415, R&D Systems.
도 34
표시된 DNA 벡터로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. A: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG(sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800(SA5-10172). 단백질 표준은 Chemidoc 채널 Dylight 650에서 검출되었다(신호는 표시되지 않음). Chemidoc 채널 Dylight 800. 검은색 화살표는 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비되는 제1 폴리펩티드를 나타낸다. B: 비환원 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG(sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800(SA5-10172). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 800이다. 검은색 화살표는 표시된 DNA 벡터에서 발현되고 형질감염된 세포에서 분비된 두 개의 제1 폴리펩티드 분자에 의해 형성된 이량체 단백질을 나타낸다. C: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 래트 항-IL10(MAB417). 2차 항체: 당나귀 항-래트, Dylight 488(SA5-10026). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 488이다. 검은색 화살표는 IL-10이 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다. VB5044 및 VB5054의 경우 IL-10의 크기 증가는 리보솜 건너뛰기의 결과로 IL-10에 융합된 P2A 꼬리 때문이다. D: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 토끼 항-TGF- β1 항체(USB1042777-비오틴). 2차 항체: 당나귀 항토끼, Dylight 650(SA5-10041). Chemidoc 채널 Dylight 650. 검은색 화살표는 TGF- β1 이 각각의 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다. E: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 염소 항-쥐 GM-CSF(BAF415). 2차 항체: 당나귀 항염소, Dylight 800(SA5-10092). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 800이다. 검은색 화살표는 GM-CSF가 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다.
도 35
DNA 벡터 VB50 68, VB5069 또는 VB5070 으로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA(포획 항체: 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체)에 의해 검출된 제1 폴리펩티드의 단백질 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액.
도 36
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA(포획 항체: 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체)에 의해 검출된 지시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 다음의 검출 항체가 사용되었다: A) 항-쥐 SCBG3A2 바이오티닐화 항체, 0.83 μg/ml, 100 μl/웰, BAF3465, R&D Systems, B) 항-쥐 PD-1 바이오티닐화 항체, 0.72 μg/ml, 100 μl/ml, DY1021, R&D Systems).
도 37
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 IL-10의 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 포획 항체: 마우스 IL-10 항체, 0.4 μg/ml, 100 μl/웰, MAB417, R&D Systems, 검출 항체: 마우스 항-IL-10 바이오티닐화 항체, 0.2 μg/ml, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems
도 38
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 표시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 면역억제 화합물의 별도의 발현 및 분비를 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 상등액 희석 1:100. 포획 항체: 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology, 검출 항체: 마우스 항-IL-10 바이오티닐화 항체, 0.2 μg/ml, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems.
도 39
표시된 DNA 벡터로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. A: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 마우스 항-MOG(sc-73330). 2차 항체: 당나귀 항-마우스, Dylight 800(SA5-10172). Chemidoc 채널 Dylight 800. 검은색 화살표는 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비되는 무손상 제1 폴리펩티드를 나타낸다. B: 환원된 상등액 샘플(35μl 로드). 1차 항체: 래트 항-IL10(MAB417). 2차 항체: 당나귀 항쥐, Dylight 488(SA5-10026). Chemidoc 채널은 Dylight 650(단백질 표준용) 및 488이다. 검은색 화살표는 IL-10이 각 DNA 벡터에서 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비됨을 나타낸다.
도 40
이중 색상 IL-10/IFN-γ FluoroSpot 분석 결과를 표시한다. C57BL/6 마우스에게 지시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 투여 후 7일에 비장을 수확하였다. 재자극되지 않은 이중 색상 FluoroSpot(대조군, A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극 시 비장 세포를 IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/10 6 비장세포) 에 대해 테스트하였다. (비). 개별 마우스 및 평균 ± SEM이 표시된다(5마리 마우스/그룹).비장 세포를 IL-10 및 IFN-γ 분비(SFU/106 비장세포)에 대해 이중 색상 FluoroSpot으로 시험하였다. 재자극되지 않은 경우 (대조군, A) 또는 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 재자극된 경우 (B). 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 42
MOG 사량체 염색 결과와 MOG 특이적 T 세포 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 지시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 투여 후 7일에 비장을 수확하였다. CD4+CD25+Foxp3+ 비장세포 중 MOG(38-49) tet+ 비장세포의 백분율은 H-2 IAb/MOG(38-49) 사량체에 의해 검출되었다. 사량체 염색은 생체외에서 수행되었으며 비장세포는 MOG(35-55) 펩티드로 재자극되지 않았다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 43
Treg 증식 검출 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 근육내 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포 집단 중 Ki67+ 비장세포의 백분율이 생체외에서 검출되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 44
유세포 계측법을 통해 CD4+CD25+Foxp3+ 세포를 검출한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에게 표시된 DNA 벡터를 0일에 투여한 후 전기천공을 실시하고 비장을 투여 후 7일에 수확하였다. CD4+CD25+Foxp3+ 비장세포의 백분율은 MOG(35-55) 펩티드로 16시간 재자극하여 결정되었다. 데이터는 그룹당 5마리의 마우스 풀에서 생성되었으며 분석 전에 마우스 비장을 모았다.
도 45
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상둥액을 이용한 샌드위치 ELISA(포획 항체: 마우스 항-인간 IgG (CH3 domain), 1ug/ml, 100 μl/웰, MCA878G, BioRad, 검출 항체: CaptureSelect?? Biotin 항-IgG-Fc (인간) 컨쥬게이트, 1 μg/ml, 100 μl/웰, 7103262100, Thermo Fisher)에 의해 검출된 지시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 IL-10의 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 ExpiFectamine만 처리한 Expi293F 세포의 상등.
도 46
상기 DNA 벡터로 일시적으로 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액을 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 지시된 DNA 벡터에 의해 인코딩된 IL-10의 발현 및 분비 수준을 보여준다. 음성 대조군(Neg ctrl): 형질감염 시약인 엑스피펙타민만 처리한 Expi293F 세포의 상등액. 포획 항체: 마우스 IL-10 항체, 0.4μg/ml, 100μl/웰, MAB417, R&D Systems. 검출 항체: 마우스 IL-10 비오티닐화 항체, 0.2μg/ml, BAF417, R&D Systems.
도 47
표시된 DNA 벡터로 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. 환원된 상등액 샘플(35 μl 로드). 1차 항체: 래트 항-IL-10(MAB417). 2차 항체: 당나귀 항-래트, Dylight 650 (SA5-10029). Chemidoc 채널 Dylight 650. 검은색 화살표는 표시된 DNA 벡터와 별도의 단백질로 발현되고 형질감염된 세포에서 분비되는 IL-10을 나타낸다.
상세한 설명
제1 폴리펩티드 및/또는 다량체 단백질은 본원에서 작제물(construct)로도 지칭될 것이다.
일 구현예에서, 작제물은 관용 유도 작제물이다.
"관용 유도 작제물(tolerance-inducing construct)"은 투여에 적합한 형태와 관용을 유도하는데 유효한 양(즉, 유효량))으로 대상체에게 투여될 때 염증성 면역 반응을 유발하지 않고 오히려 항원 유닛에 포함된 T 세포 에피토프에 대한 관용을 유도하는 것이다. 내성을 유도한다.
본원에 사용된 용어 "관용성"은 염증성 면역 반응의 감소된 수준, 염증성 면역 반응의 개시 또는 진행의 지연 및/또는 자가 항원, 알레르겐, 동종항원, 이종항원과 같은 항원에 대한 염증성 면역 반응의 개시 또는 진행의 감소된 위험을 의미한다.
"대상체"는 동물, 예를 들어 마우스 또는 인간, 좋기로는 인간이다. 용어 "마우스", "쥐" 및 "m"은 마우스를 나타내거나 마우스를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 인간 및 "h"라는 용어는 인간을 나타내거나 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 자가면역 질환, 알레르기 또는 이식 거부와 같은 면역 질환을 앓고 있는 환자, 즉 인간일 수 있으며, 치료학적 치료가 필요하거나 예방적 치료가 필요한 대상체일 수 있다. 면역질환이 의심되는 대상체. "대상체"와 "개인"이라는 용어는 본 문서에서 상호교환적으로 사용된다.
"질병"은 일반적으로 질병에 의해 영향을 받는 대상의 특정 징후 및 증상과 관련된 비정상적인 의학적 상태이다. 본원에 사용된 "면역 질환"은 자가면역 질환, 알레르기 또는 이식 거부, 즉 숙주에 이식되는 것과 동일한(동종) 또는 상이한(이종) 종으로부터의 세포, 조직 또는 장기의 숙주에 의한 거부와 같은 동종 이식 또는 이종 이식의 거부를 비롯한 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 상태를 의미한다.
"치료"는 예방적 치료 또는 치료적 치료이다.
"예방적 치료"는 질병의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 아직 나타내지 않거나 초기 징후 또는 증상만을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료로, 치료는 질병 및/또는 질병과 관련된 증상이 발생할 위험을 예방 또는 감소시킬 목적으로 투여된다. 예방적 치료는 질병에 대한 예방적 치료로서, 또는 면역 질환의 추가 발달 또는 강화를 억제하거나 감소시키는 치료로서 기능한다. 예방적 치료, 예방 및 예방이라는 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.
"치료적 치료"는 면역 질환의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료법으로서, 이러한 징후 또는 증상을 감소 또는 제거할 목적으로 또는 질병 진행을 지연 또는 중단시킬 목적으로 대상체에게 투여되는 치료법이다.
본 명세서에 사용된 "T 세포 에피토프"는 별개의 단일 T 세포 에피토프 또는 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 다수의 최소 T 세포 에피토프, 예를 들어 핫스팟을 함유하는 항원의 일부 또는 영역을 의미한다.
"뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드로 구성된 서열이다. 용어 "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 본원에서 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 본원에 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
벡터
본 발명의 벡터는 DNA 또는 RNA와 같은 외래 핵산 서열을, 이들이 발현될 수 있는 세포 내로 운반하는데 적합한 임의의 분자, 즉 발현 벡터일 수 있다.
일 구현예에서, 벡터는 DNA 플라스미드와 같은 DNA 벡터 또는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 거대세포바이러스 및 센다이 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 바이러스 벡터와 같은 DNA 바이러스 벡터이다.
다른 구현예에서, 벡터는 RNA 플라스미드와 같은 RNA 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 α바이러스, 렌티바이러스, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 및 랍도바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 레트로바이러스 벡터와 같은 RNA 바이러스 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 DNA 벡터, 더욱 좋기로는 DNA 플라스미드이다.
DNA 플라스미드
플라스미드는 염색체 DNA와 물리적으로 분리되어 있고 독립적으로 복제할 수 있는 세포 내의 작은 염색체외 DNA 분자이다. 플라스미드는 대부분 박테리아에서 작은 원형의 이중 가닥 DNA 분자로 발견된다. 그러나 플라스미드는 때때로 고세균(archaea)과 진핵생물에 존재한다. 인공 플라스미드는 분자 복제에서 벡터로 널리 사용되며, 숙주 유기체 내에서 재조합 DNA 서열의 높은 발현을 전달하고 보장하는 역할을 한다. 플라스미드는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택을 위한 특징, 예를 들어 항생제 내성을 위한 유전자, 복제 기점, 다수의 클로닝 부위(MCS) 및 삽입된 유전자(들)의 발현을 구동하기 위한 프로모터를 비롯한, 몇 가지 중요한 특징을 갖는다.
일반적으로 프로모터는 개시 인자와 중합효소를 프로모터로 끌어당겨 유전자가 전사되도록 하는 서열이다. 프로모터는 DNA 상류의 유전자 전사 시작 부위 근처에 위치한다. 프로모터의 길이는 약 100~1000개 염기쌍일 수 있다. 프로모터의 성질은 일반적으로 전사의 유전자와 산물, 그리고 해당 부위에 모집된 RNA 중합효소의 종류나 종류에 따라 달라진다. RNA 중합효소가 플라스미드의 DNA를 읽으면 RNA 분자가 전사된다. 처리 후 mRNA는 여러 번 번역될 수 있으므로 리보솜이 mRNA를 단백질로 번역할 때 관심 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 많은 복사본이 생성된다. 일반적으로, 리보솜은 상보적인 tRNA 안티코돈 서열이 mRNA 코돈에 결합하도록 유도하여 해독을 촉진한다. tRNA는 mRNA가 통과하여 리보솜에 의해 "읽혀질" 때 함께 사슬로 연결된 특정 아미노산을 운반하여 폴리펩티드를 만든다. 번역은 시작, 연장, 종료의 세 단계로 진행된다. 번역 과정에 따라 폴리펩티드는 활성 단백질로 접혀 세포 내에서 기능을 수행하거나 세포에서 내보내져 다른 곳에서 기능을 수행한다. 때로는 상당한 수의 번역 후 변형이 수행된다.
단백질이 세포 밖으로 내보내질 예정인 경우, 신호 펩티드는 단백질을 소포체로 안내하며, 여기서 신호 펩티드는 절단되고 단백질은 번역이 종료된 후 세포 주변으로 전달된다.
DNA 플라스미드는 임의의 특정 플라스미드로 제한되지 않으며, 당업자는 적합한 백본을 갖는 임의의 플라스미드가 본 개시내용의 요소 및 유닛을 포함하도록 당업계에 공지된 방법에 의해 선택 및 조작될 수 있음을 이해할 것이다.
공동발현(Co-expression)
본 개시내용의 벡터는 여러 단백질을 공동발현한다. 이러한 벡터(및 플라스미드)는 멀티시스트론 또는 폴리시스트론 벡터(및 멀티시스트론 또는 폴리시스트론 플라스미드)라고도 한다. 당업자는 이들 여러 단백질을 코딩하는 서열을 포함하도록 벡터를 조작하는 방법을 알고 있으며, 이들 단백질이 별도의 단백질로서 하나의 벡터로부터 공동발현되도록 보장하기 위해 다양한 수단을 선택하고 상이한 기술을 사용할 수 있다.
따라서, 당업자는 다양한 단백질, 즉 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 공동발현하는 본 발명의 벡터를 구성할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소, 즉 동일한 벡터로부터의 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 공동발현을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 공동발현 요소(또는 1개 초과의 공동발현 요소)를 포함하는데, 이로 인해 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물이 단일 전사체 상에서 전사되지만, 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물로 독립적으로 번역되게 된다. 따라서 공동발현 요소가 존재하면 최종적으로 별도의 번역 결과물이 생산된다.
IRES
본 개시내용의 일 구현예에서, 공동발현 요소는 IRES 요소이고, 그 개념은 도 1에 예시되어 있다. IRES로 약칭되는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site)는 더 큰 단백질 합성 과정의 일부로서, 캡-독립적인 방식으로, 번역 개시를 가능하게 하는 RNA 요소이다. 진핵생물 번역에서는 개시 복합체의 조립을 위해 5' 캡 인식이 필요하기 때문에 개시는 일반적으로 mRNA 분자의 5' 말단에서 일어난다. 두 코딩 영역 사이에 IRES 요소를 배치하면 개시 복합체가 이 사이트에서 조립될 수 있으며 하류 코딩 영역의 번역이 가능해진다. 따라서, 본 개시내용의 구현예에서, 벡터는 IRES를 포함하고 하나의 전사체가 벡터로부터 생성되고, 이는 후속적으로 별도의 단백질로 번역된다.
IRES 요소는 동일한 프로모터의 제어 하에 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물의 공동발현을 허용한다. 프로모터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 코딩 영역을 함유하는 단일 mRNA의 전사를 지시한다. 2 이상의 면역억제 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우에는, IRES 요소가 면역억제 화합물을 인코딩하는 각 핵산 서열의 상류에 있는 본 발명의 벡터에 존재할 필요가 있다. 대안적으로, 2 이상의 면역억제 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우 다른 유형의 공동발현 요소가 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터에 사용하기 위한 IRES 요소는 바이러스 게놈 또는 세포 mRNA로부터 유래될 수 있다. DNA 플라스미드와 같은 IRES 요소를 포함하는 벡터는 상업적으로 이용 가능하다.
2A 자가 절단 펩티드
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 공동발현 요소는 2A 자가 절단 펩티드(2A self-cleaving peptide: 또는 줄여서 "2A 펩티드")를 인코딩하는 핵산 서열이며, 그 개념은 도 2에 예시되어 있다.
본 출원의 맥락에서, 용어 "2A 자가 절단 펩티드" 및 "2A 펩티드"는 두 코딩 영역 사이에 위치할 때 두 코딩 영역의 전사를 단일 전사체로서 일으키지만, 두 개의 개별 펩티드 사슬로 번역되는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 펩티드에 대해 사용된다. 일반적으로 리보솜이 mRNA를 번역할 때 아미노산은 N-말단에서 C-말단 방식으로 공유 결합된다. 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 존재하면 리보솜이 2A 펩티드의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 건너뛰기 때문에 두 개의 별도 펩티드 사슬이 생성된다. 2A 자가 절단 펩티드는 일반적으로 길이가 18-22개 아미노산이고 컨센서스 서열 DXEXNPGP(SEQ ID NO: 68)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 리보솜은 2A 자가 절단 펩티드의 C-말단에서 발견되는 프롤린 잔기와 글리신 사이의 펩티드 결합을 건너뛰는데, 이는 상류 유전자 산물이 말단에 몇 개의 추가적인 아미노산 잔기를 가질 것인 반면, 하류 유전자 산물은 프롤린으로 시작될 것임을 의미한다.
일 구현예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 컨센서스 서열 DXEXNPGP(SEQ ID NO: 68)를 포함하는 18-22개 아미노산 길이의 서열이고, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
따라서, 2A 자가 절단 펩티드도 동일한 프로모터의 제어 하에 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물의 공동발현을 허용한다. IRES 요소와 마찬가지로, 2 이상의 면역억제 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우, 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 벡터에서 면역억제 화합물을 인코딩하는 각 핵산 서열의 상류에 존재할 필요가 있다. 예컨대, 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제1 면역억제 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열 및 제2 면역억제 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 벡터는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 T2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 P2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 2 이상의 면역억제 화합물이 본 발명의 벡터로부터 발현되는 경우 다른 유형의 공동발현 요소가 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, 2A 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드 및 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 2A-펩티드이다.
일 구현예에서, T2A 펩티드는 표 1 또는 2에 열거된 T2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 아미노산 서열 DVEENPGP(SEQ ID NO: 69)가 존재하지만 T2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 T2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, T2A 펩티드는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, P2A 펩티드는 표 1 또는 2에 나열된 P2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 아미노산 서열 DVEENPGP(SEQ ID NO: 69)가 존재하지만 P2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 P2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, P2A 펩티드는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, E2A 펩티드는 표 1 또는 2에 나열된 E2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 서열 DVESNPGP(SEQ ID NO: 70)가 존재하지만 E2A 서열의 나머지 부분은 표 1의 E2A 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을갖는다. 다른 구현예에서, E2A 펩티드는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, F2A 펩티드는 표 1 또는 2에 열거된 F2A 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 서열 DVESNPGP(SEQ ID NO: 70)가 존재하지만 F2A 아미노산 서열의 나머지 부분은 표 1의 F2A 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어 81%, 82%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, F2A 펩티드는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어 표 2에 나타낸 바와 같이 야생형 서열의 N-말단 앞에 GSG 서열을 삽입함으로써 2A-펩티드의 효율을 조절하여 절단 및 발현 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 일반적으로 알려져 있다.
예를 들어 표 2에 나타낸 바와 같이 야생형 서열의 N-말단 앞에 GSG 서열을 삽입함으로써 2A-펩티드의 효율을 조절하여 절단 및 발현 효율을 증가시킬 수 있다는 것이 일반적으로 알려져 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 IRES 요소 및 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 모두 함유한다. 예를 들어, 벡터는 첫 번째 핵산을 포함한다. 제1 폴리펩티드, 두 번째 핵산을 인코딩하는 서열 제1 면역억제 화합물을 인코딩하는 서열 및 제2 면역억제 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열. 벡터는 첫 번째 핵산과 두 번째 핵산 사이에 IRES 요소를 포함할 수 있다. 서열 및 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이의 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 대안 적으로, 벡터는 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 서열 및 두 번째와 세 번째 핵산 서열 사이의 IRES 요소. 추가 면역억제 화합물을 인코딩하는 추가 핵산 서열은 동일한 방식으로 벡터에 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 2개의 2A 펩티드로 구성된 연속 서열로서 2개의 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 일례로서, 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 면역억제 화합물을 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 벡터는 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 연속 서열로서 2개의 2A 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
양방향 프로모터
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물이 별도의 전사체로서 전사되어 별도의 전사 산물 및 따라서 별도의 단백질을 초래하는 공동발현 요소(또는 2 이상의 공동발현 요소)를 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 공동발현 요소는 양방향 프로모터이고, 그 개념은 도 3에 예시되어 있다. 양방향 프로모터는 일반적으로 양방향 유전자 쌍에서 유전자의 5' 말단 사이에 있는 DNA의 짧은(예컨대 <1 kbp) 유전자간 영역이다. "양방향 유전자 쌍"은 각각의 5' 말단이 서로를 향하고 있는 반대 가닥에 코딩된 두 개의 인접한 유전자를 의미한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 4개의 CMV 인핸서를 갖는 CAG 프로모터의 백-투-백 배열이다(Sladitschek HL, Neveu PA et al., PLoS One 11(5), e0155177, 2016).
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 RPBSA이다(Kevin He et al., Int. J. Mol. Sci. 21(23), 9256, 2020).
본 개시내용의 일 구현예에서, 양방향 프로모터는 마우스 Pgk1 및 인간 진핵 번역 신장 인자 1 α 1 프로모터의 백-투-백 구성이다(Golding & Mann, Gene Therapy 18, 817-826, 2011).
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 5' 말단 사이에 양방향 프로모터를 포함하는 양방향 유전자 쌍으로서 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 면역억제 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 플라스미드이다.
다수의 프로모터
본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 공동발현 요소는 다양한 프로모터이다. 즉, 벡터는 예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 각각의 핵산 서열에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 즉 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물 각각의 별도 전사를 위한, 플라스미드이다.
일 구현예에서, 상기 핵산 서열 각각은 상이한 프로모터를 가질 것이며, 그 개념은 도 4에도 예시되어 있다. 일 구현예에서, 모든 핵산 서열은 등분자 발현을 목표로 하는 동일한 프로모터를 갖는다. 대안적인 구현예에서, 하나의 핵산 서열은 다른 것(들)보다 더 강한 프로모터를 갖고; 즉, 더 강한 프로모터를 갖는 핵산 서열이 다른 것(들)보다 더 높은 수준으로 발현될 가능성이 높다.
수많은 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며 본 발명의 플라스미드에 포함시키기에 적합하다. 본 개시내용의 일 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터와 같은 거대세포바이러스로부터 유래된다.
상이한 공동발현 효소들의 조합
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 공동발현 요소, 좋기로는 IRES 요소, 2A 펩티드, 양방향 프로모터 및 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동발현 요소를 포함한다.
본 발명의 벡터는 공동발현 요소의 모든 종류의 조합을 포함할 수 있다.
일례로서, 본 발명의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제1 면역억제 화합물을 인코딩하는 제2 핵산 서열 및 제2 면역억제 화합물을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하는 DNA 플라스미드이다. 일 구현예에서, DNA 플라스미드는 제1 폴리펩티드(프로모터의 제어 하에)와 제1 및 제2 면역억제 화합물의 공동발현을 허용하는 2A 펩티드 및 IRES를 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 플라스미드는 양방향 프로모터 및 또 다른 프로모터를 포함한다.
당업자는 위의 예에서와 같은 용어 제1, 제2 및 제3 핵산 서열이 본 발명의 플라스미드가 제1, 제2 및 제3 핵산 서열의 순서로 핵산 서열을 포함한다는 것을 의미하지 않는다는 것을 알 것이다. 제2 핵산 서열은 제1 또는 제3 핵산 서열의 하류 또는 상류에 있을 수 있고, 제3 핵산 서열은 제1 또는 제2 핵산 서열의 하류 또는 상류에 있을 수 있으며, 제1 핵산 서열은 제 또는 제3 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 제1 및 제3 또는 제2 및 제3 핵산 서열과 마찬가지로 동일한 DNA 가닥에서 반대 방향일 수 있다. 추가 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열은 반대편 DNA 가닥 상에 있을 수 있다.
면역억제 화합물
본 발명의 벡터는 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역억제 화합물은 면역 관용을 유도, 증가 또는 유지하는 화합물이다. 본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 면역억제 화합물은 면역 관용을 유도, 증가 또는 유지하는 것으로 알려진 화합물이다.
또 다른 구현예에서, 면역억제 화합물은 관용 유도 방식으로 항원 유닛에서 에피토프의 제시를 선호하고/하거나 관용 유지 세포(조절 T 세포, 이펙터 T 세포의 무반응 또는 아폽토시스뿐만 아니라)의 유도를 선호하고/하거나 이러한 관용 유지 세포를 유지하는 데 도움이 되는 화합물이다.
또 다른 구현예에서, 면역억제 화합물은 관용 유도 방식으로 항원 유닛 내 에피토프의 제시를 촉진 및/또는 지원하고/하거나 관용 유지 세포(조절 T 세포, 이펙터 T 세포의 무반응 또는 아폽토시스뿐만 아니라)의 유도를 촉진 및/또는 지원하고/하거나 이러한 관용 유지 세포를 유지하는 데 도움이 되는 화합물이다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역억제 화합물은 억제 체크포인트 분자의 세포외 부분, 예컨대 세포외 도메인이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 CLTA-4, PD-1, BTLA, LAG3, NOX2, SIGLEC7, SIGLEC9 및 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 CLTA-4이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 PD-1이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 BTLA이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 TIM-3이다.
바람직한 구현예에서, 면역억제 화합물은 세포외 부분, 예컨대 인간(h) 억제 체크포인트 분자의 세포외 도메인, 예컨대 인간 억제 체크포인트 분자의 세포외 부분, 예컨대 hCLTA-4, hPD-1, hBTLA, hLAG3, hNOX2, hSIGLEC7, hSIGLEC9 및 hTIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 억제 체크포인트의 세포외 도메인이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 SEQ ID NO: 51의 hCTLA-4와 같은 hCLTA-4이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 SEQ ID NO: 52의 hPD-1과 같은 hPD-1이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 hBTLA이다. 일 구현예에서, 억제 체크포인트 분자는 hTIM-3이다.
본 개시내용의 일 구현예에서, 면역억제 화합물은 IL-10, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, IL-27, IL-2, GM-CSF, FLT3L, IFN- γ, IL-37 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택 되는 사이토카인이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IL-10이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 TGF-β1이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IL-27이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 GM-CSF이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 FLT3L이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IFN-γ이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IL-37이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 IL-35이다.
바람직한 구현예에서, 면역억제 화합물은 hIL-10, hTGF-β1, hTGF-β2, hTGF-β3, hIL-27, hIL-2, hGM-CSF, hFLT3L, hIFN-γ, hIL-37 및 hIL-35로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 사이토카인이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIL-10, 예컨대 SEQ ID NO: 53의 hIL-10이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hTGF-β1, 예컨대 SEQ ID NO: 54의 hTGF-β1이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hTGF-β2, 예컨대 SEQ ID NO: 58의 hTGF-β2이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hTGF-β3, 예컨대 SEQ ID NO: 59의 hTGF-β3이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIL-27이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIL-2, 예컨대 SEQ ID NO: 55의 hIL-2이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hGM-CSF, 예컨대 SEQ ID NO: 56의 hGM-CSF이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hFLT3L이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIFN-γ, 예컨대 SEQ ID NO: 57의 hIFN-γ이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIL-37이다. 일 구현예에서, 사이토카인은 hIL-35이다.
다수의 면역억제 화합물을 인코딩하는 다수의 핵산 서열을 포함하는 벡터
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 2 내지 6개의 면역억제 화합물, 즉 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6개의 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 면역억제 화합물은 동일하거나 상이할 수 있으며, 좋기로는 상이할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상이한 면역억제 화합물들이 다양한 수준에서 관용 유도 환경을 생성하거나 촉진한다. 일례로서, 본 발명의 벡터는 3개의 서로 다른 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 첫 번째는 관용을 유도하고, 두 번째는 관용을 증가시키며, 세 번째는 관용을 유지한다.
제1 핵산 서열
본 개시내용의 벡터는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 제1 핵산 서열, 즉 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 핵산 서열은 DNA이다. 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 이것이 투여되는 대상체의 종에 최적화된다. 인간에게 투여하기 위해, 일 구현예에서, 제1 핵산 서열은 인간 코돈 최적화된다.
제1 핵산 서열은 APC를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하며, 여기서 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일단 대상체에게 투여되면, 제1 폴리펩티드가 발현되고, 다량체화 유닛의 존재로 인해 항원 유닛에 포함된 하나 이상의 T 세포 에피토프에 대한 관용원성 반응을 이끌어내는 다량체 단백질을 형성한다.
작제물(Construct)
작제물은 N-말단 시작 및 C-말단 끝을 갖는 폴리펩티드로 설명될 수 있다(도 5에 예시됨). 제1 폴리펩티드의 요소 및 유닛 - 표적화 유닛(TU), 다량체화 유닛(예컨대 이 도 5에서는 이량체화 유닛(DimU)) 및 항원 유닛 - 은 항원 유닛이 폴리펩티드의 C-말단 끝(도 5a) 또는 폴리펩티드의 N-말단 시작 부분(도 5b)에 위치하도록 폴리펩티드에 배열될 수 있다. 좋기로는, 항원 유닛은 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
항원 유닛은 하나 이상의 T 세포 에피토프(들)을 포함하며, 다수의 T 세포 에피토프가 존재하는 경우 T 세포 에피토프를 분리하기 위해 하나 이상의 T 세포 에피토프 링커를 포함할 수 있다. 유닛 링커(UL)는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛과 항원 유닛을 연결할 수 있다. 도 5는 T 세포 에피토프 링커(TL)에 의해 분리된 2개의 T 세포 에피토프(T1, T2)를 갖는 항원 유닛을 보여준다. 전술한 유닛 및 요소의 순서와 배향은 다량체 단백질 및 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열에서 동일하다.
다음에서는 제1 폴리펩티드/작제물의 다양한 유닛과 요소에 대해 자세히 설명한다. 이들은 유닛/요소를 인코딩하는 핵산 서열로서 제1 핵산 서열에 존재하는 반면, 제1 폴리펩티드 또는 다량체 단백질에는 아미노산 서열로서 존재한다. 읽기의 용이성을 위해, 다음에서 유닛/요소는 주로 제1 폴리펩티드/다량체 단백질과 관련하여, 즉 아미노산 서열을 기준으로 설명된다.
표적화 유닛
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 APC를 표적으로 하는 표적화 유닛을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "표적화 유닛"은 본 발명의 작제물을 항원-제시 세포에 전달하고 APC의 표면 분자와 상호작용하는 유닛, 예를 들어 세포를 활성화시키지 않고 APC의 표면 수용체에 결합하는 유닛을 의미한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에 사용된 용어 "표적화 유닛"은 본 발명의 작제물을 항원-제시 세포에 전달하고 APC의 표면 분자와 상호작용하는 유닛, 예를 들어 세포의 성숙을 유도하지 않고 APC의 표면 수용체에 결합하는 유닛을 의미한다.
APC는 작제물을 내재화하고 예를 들어 공동자극 신호를 상향조절하지 않고/않거나 억제 표면 분자를 상향 조절하고/하거나 억제 사이토카인의 분비를 촉진함으로써, 항염증, 관용원성 방식으로 항원 유닛에 포함된 T 세포 에피토프를 그의 표면 상의 MHC에 제시한다.
일 구현예에서, 표적화 유닛은 TGFβ 수용체(TGFβR1, TGFβR2 및 TGFβR3 포함), IL-10R, 예컨대 IL-10RA and IL-10RB, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-11R, IL-13R, IL-27R, IL-35R, IL-37R, GM-CSFR, FLT3, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, CD83, SIGLEC, Clec10A (MGL), ASGR (ASGR1/ASGR2), CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, Langerin, MR, DC-Sign, Treml4, Dectin-1, PDL1, PDL2, HVEM, CD163 및 CD141로 이루어진 군으로부터 선택된 APC 상의 표면 분자에 결합하는 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 hTGFβ 수용체(hTGFβR1, hTGFβR2 및 hTGFβR3 포함), hIL-10R, such as hIL-10RA and hIL-10RB, hIL-2R, hIL-4R, hIL-6R, hIL-11R, hIL-13R, hIL-27R, hIL-35R, hIL-37R, hGM-CSFR, hFLT3, hCCR7, hCD11b, hCD11c, hCD103, hCD14, hCD36, hCD205, hCD109, hVISTA, hMARCO, hMHCII, hCD83, hSIGLEC, hClec10A (hMGL), hASGR (hASGR1/hASGR2), hCD80, hCD86, hClec9A, hClec12A, hClec12B, hDCIR2, hLangerin, hMR, hDC-Sign, hTreml4, hDectin-1, hPDL1, hPDL2, hHVEM, hCD163 및 hCD141로 이루어진 군으로부터 선택된 인간(h) APC 상의 표면 분자에 결합하는 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진다..
모이어티는 천연 리간드, 항체 또는 이의 일부, 예를 들어 scFv 또는 합성 리간드일 수 있다.
일 구현예에서, 모이어티는 전술한 임의의 표면 분자에 대해 특이성을 갖는 항체 또는 그의 일부, 예를 들어 scFv로서, 표면 분자에 대한 결합으로 인해 T 세포 에피토프가 항염증성, 관용원성 방식으로 제시되는 항원 유닛에 포함된다.
또 다른 구현예에서, 모이어티는 전술한 임의의 표면 분자에 대해 특이성을 갖는 합성 리간드로서, 표면 분자에 대한 결합으로 인해 T 세포 에피토프가 항염증성, 관용원성 방식으로 제시되는 항원 유닛에 포함된다. 단백질 모델링은 이러한 합성 리간드를 설계하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 모이어티는 천연 리간드이다. 일 구현예에서, 천연 리간드는 TGFβ, IL-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-13, IL-27, IL-35, IL-2, IL-13, IL-13, IL-27, IL-35, IL-10, 37, GM-CSF, FLT3L, CCL19, CCL21, ICAM-1(CD54로도 알려진 세포간 접착 분자 1), 케라틴, VSIG-3, 좋기로는 VSIG-3의 세포외 도메인, SCGB3A2, CTLA-4, 좋기로는 세포외 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, 및 BTLA, 좋기로는 BTLA의 세포외 도메인이다.
바람직한 구현예에서, 모이어티는 hTGFβ, hIL-10, hIL-2, 예컨대 SEQ ID NO: 55의 hIL-2, hIL-4, hIL-6, hIL-11, hIL-13, hIL-27, hIL-35, hIL-37, hGM-CSF, 예컨대 SEQ ID NO: 56의 hGM-CSF, hFLT3L, hCCL19, hCCL21, hICAM-1(세포간 접착 분자 1, CD54로도 알려짐), hkeratin, hVSIG-3, 좋기로는 hVSIG-3의 세포외 도메인, hSCGB3A2, hCTLA-4, 좋기로는 hCTLA-4의 세포외 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 51의 hCTLA4의 세포외 도메인, hPD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 52의 hPD-1의 세포외 도메인, 및 hBTLA, 좋기로는 hBTLA의 세포외 도메인이다.
다른 구현예에서, 표적화 유닛은 IL10 또는 TGFβ, 좋기로는 인간 IL-10 또는 이소형 TGFβ-1, TGFβ-2 및 TGFβ-3을 비롯한 인간 TGFβ이거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 표적화 유닛은 인간 TGFβ의 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO:54 또는 SEQ ID NO:58 또는 SEQ ID NO:59의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 80개의 아미노산, 예컨대 최대 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 80개의 아미노산, 예컨대 최대 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 58 또는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO:60 또는 SEQ ID NO:61 또는 SEQ ID NO:62의 핵산 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO:60 또는 SEQ ID NO:61 또는 SEQ ID NO:62의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO:60 또는 SEQ ID NO:61 또는 SEQ ID NO:62의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 60 또는 SEQ ID NO: 61 또는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 인간 IL-10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열로 이루어진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 35개의 아미노산, 예컨대 최대 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 35개의 아미노산, 예컨대 최대 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열로 이루어진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 63의 핵산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, 표적화 유닛은 SCGB3A2 또는 VSIG-3, 좋기로는 인간 VSIG-3, 좋기로는 세포외 부부나, 예컨대 인간 VSIG-3 또는 인간 SCGB3A2의 세포외 도메인이거나 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 표적화 유닛은 인간 SCGB3A2의 것과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열로 구성된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 18개의 아미노산, 예컨대 최대 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 18개의 아미노산, 예컨대 최대 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외한, SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열로 이루어진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다.
다른 바람직한 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 65의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 인간 VSIG-3의 세포외 도메인에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열로 구성된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 86개의 아미노산, 예컨대 최대 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고, SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 최대 86개의 아미노산, 예컨대 최대 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고, SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열로 구성된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 67의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 표적화 유닛은 항-인간 CD205와 같은 CD205에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 이의 일부, 예를 들어 scFv이거나 이를 포함한다.
다량체화 유닛/이량체화 유닛
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "다량체화 유닛"은 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 다량체화 유닛은 2개, 3개, 4개 이상의 폴리펩티드와 같은 다수의 폴리펩티드를 이량체 단백질, 삼량체 단백질 또는 사량체 단백질과 같은 다량체 단백질로 다량체화/결합시키는 것을 촉진한다. 더욱이, 다량체화 유닛은 또한 다량체 단백질에 유연성을 제공하여 APC가 가변 거리에 위치하더라도 표적 유닛이 APC의 표면 분자에 최적으로 결합할 수 있도록 한다. 다량체화 유닛은 이러한 요건 중 하나 이상을 충족하는 임의의 유닛일 수 있다.
2개 초과의 폴리펩티드의 다량체화/결합을 촉진하는 다량체화 유닛
일 구현예에서, 다량체화 유닛은 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인과 같은 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인과 같은 콜라겐 유래 삼량체화 유닛과 같은 삼량체화 유닛(예를 들어 A. Alvarez-Cienfuegos et al., Sci Rep 6, 28643 (2016) 참조) 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인이다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 116의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다. 다른 구현예에서, 삼량체화 유닛은 T4 피브리틴의 C-말단 도메인이다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 삼량체화 유닛이다.
다른 구현예에서, 다량체화 유닛은 p53으로부터 유래된 도메인과 같은 사량체화 유닛이며, 선택적으로 아래에 기술된 힌지 영역을 추가로 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 다량체화 유닛은 SEQ ID NO: 113의 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 선택적으로 하기 기재된 바와 같은 힌지 영역을 추가로 포함하는 사량체화 유닛이다..
이량체화 유닛
본 명세서에 사용된 용어 "이량체화 유닛"는 항원 유닛과 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 항원 유닛과 표적화 유닛을 연결하는 것 외에도, 이량체화 유닛은 두 개의 단량체 폴리펩티드의 이량체화를 촉진하거나 이량체 단백질로 결합시킨다. 더욱이, 이량체화 유닛은 또한 이량체 단백질의 유연성을 제공하여 APC가 다양한 거리에 위치하더라도 APC의 표면 분자에 대한 표적화 유닛의 최적 결합을 허용한다. 이량체화 유닛은 이러한 요구 사항을 충족하는 모든 유닛일 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 힌지 영역을 포함하는 이량체화 유닛을 포함한다. 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하며, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결한다. 일 구현예에서, 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커, 좋기로는 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 118)이다. 즉, 이량체화 유닛은 글리신-세린 풍부 이량체화 유닛 링커 및 좋기로는 이량체화 유닛 링커 GGGSSGGGSG(SEQ ID NO: 118)를 포함한다.
용어 "힌지 영역"은 두 개의 폴리펩티드를 연결하는 데 기여하는, 즉 이량체 단백질의 형성을 촉진하는 이량체화 유닛에 포함된 아미노산 서열을 의미한다. 2개 이상의 폴리펩티드의 다량체화를 촉진하거나 연결하는 다량체화 유닛의 맥락에서, 용어 "힌지 영역"은 3개 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 3개 또는 4개 폴리펩티드 및/또는 유연한 스페이서 역할을 하여 다량체 단백질의 두 표적화 유닛이 가변 거리(variable distances)에 위치하더라도 APC의 여러 표면 분자에 동시에 결합할 수 있게 해주는, 아미노산 서열을 가리킨다.
힌지 영역은 Ig 유래, 예를 들어 IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG2 또는 IgG3으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 힌지 영역은 IgM으로부터 유래되며, 예를 들어 SEQ ID NO: 119의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 힌지 영역은 공유 결합(들), 예를 들어 시스테인들 간의 이황화 가교(들)의 형성을 통해 이량체화에 기여할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다. 좋기로는, 공유 결합은 이황화 가교이다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 IgG3의 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4(인간 힌지 영역 1 및 인간 힌지 영역 4), 좋기로는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27의 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4 를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 4개의 아미노산, 예를 들어 최대 3개의 아미노산, 예를 들어 최대 2개의 아미노산 또는 최대 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-27을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하고, 상기 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 예컨대 면역글로불린 불변 도메인(C 도메인), 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 카르복시말단 C 도메인(즉, CH3 도메인), 또는 이러한 C 도메인 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 좋기로는, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다. 더욱 좋기로는, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 38-144와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 38-144와 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 38-144를 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 16개의 아미노산, 예컨대 최대 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 38-144를 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 11의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 11의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 11의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용, 예를 들어 소수성 상호작용을 통해 이량체화에 기여한다. 따라서, 일 구현예에서, 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용을 통해 이량체를 형성하는 능력을 갖는다. 좋기로는, 비공유 상호작용은 소수성 상호작용이다.
이량체화 유닛이 CH3 도메인을 포함하는 경우 CH2 도메인을 포함하지 않는 것이 바람직하고 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1, 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드로 구성된다.
일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
훨씬 더 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다.
훨씬 더 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 최대 28개의 아미노산, 예를 들어 최대 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것을 제외하고는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 일 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열과 적어도 85% 서열 동일성, 예컨대 적어도 86% 또는 적어도 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
추가의 바람직한 구현예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 12의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
제1 핵산 서열에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드에서 다량체화 단위, 예를 들어 이량체화 단위는 항원 유닛 및 표적 유닛과 관련하여 임의의 배향을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 항원 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 (예를 들어, 유닛 링커를 통해) 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 N-말단에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 항원 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 N-말단에 (예를 들어, 유닛 링커를 통해) 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 연결된다. 항원 유닛은 예를 들어 링커를 통해, 좋기로는 유닛 링커를 통해 다량체화/이량체화 유닛의 C-말단에 연결되고, 표적화 유닛은 다량체화/이량체화의 N-말단에 연결되는 것이 바람직하다.
항원 유닛
본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산 서열에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 조절 T 세포(Treg)의 하나 이상의 에피토프와 같은 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프 또는 하나 이상의 억제성 신생항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원을 포함하는 항원 유닛을 포함한다.
항원 유닛에 포함되기에 적합한 T 세포 에피토프는 당업계에 공지되어 있을 수 있으며, 즉, 특정 면역 질환에 관련되고 관련성이 있는 것으로 연구, 제안 및/또는 검증되고 예를 들어 과학 문헌에 발표되었다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프 또는 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 자가 항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 자가 항원, 즉 동일한 자가 항원에 포함된다. 또 다른 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 서로 다른 자가 항원으로 구성되며, 즉 서로 다른 자가 항원에 포함된다.
"다수, 다중(multiple)", "복수" 및 "여러"라는 용어는 본 명세서에서 "하나 이상"과 상호교환적으로 사용된다.
예를 들어, 미엘린 염기성 단백질(MBP), 단백지질 단백질(PLP), 미엘린 관련 당단백질(MAG), 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 및 미엘린 관련 염기성 희소돌기아교세포 단백질(MOBP)이 모두 연구되었고 다발성 경화증(MS)과 관련된 자가 항원으로 제안되었으며 그 항원 유닛은 예를 들어 MBP의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 MBP의 하나의 T 세포 에피토프 또는 MBP의 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 추가로, 항원 유닛은 예를 들어 MOG 및 PLP의 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 MOG의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프 및 PLP의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 알레르겐의 하나의 T 세포 에피토프 또는 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 알레르겐, 즉 동일한 알레르겐에 포함된다. 또 다른 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 서로 다른 알레르겐으로 구성되며, 즉 서로 다른 알레르겐에 포함된다.
예를 들어, Fel d 1, Fel d 4 및 Fel d 7은 인간 고양이 알레르기의 대부분을 차지하는 가장 두드러진 세 가지 고양이 알레르겐이며 항원 유닛은 예를 들어 Fel d 1의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉, Fel d 1의 하나의 T 세포 에피토프 또는 Fel d 1의 다수의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 항원 유닛은 예를 들어 Fel d 4 및 Fel d 7의 다수의 T 세포 에피토프, 예를 들어 Fel d 4의 하나 또는 다수의 T 세포 에피토프 및 Fel d 7의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 항원 유닛은 동종항원/이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 즉 동종항원/이종항원의 하나의 T 세포 에피토프 또는 동종항원/이종항원의 2 이상의 T 세포 에피토프, 즉 동종항원/이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 동일한 동종항원/이종항원의 것일 수 있고, 즉 동일한 동종항원/이종항원에 포함된다. 또 다른 구현예에서, 다수의 T 세포 에피토프는 다수의 서로 다른 동종항원/이종항원이며 즉, 서로 다른 동종항원/이종항원에 포함된다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원 유닛은 2 이상의 T 세포 에피토프, 즉 다수의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터/이러한 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 개별화된 치료에 사용하기 위한 것으로, 즉 특정 대상체/한 명의 환자를 위해 특별히 설계된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터/이러한 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 환자 집단 또는 환자들에서 일반적으로 사용하기 위한 것, 즉 기성품 치료를 위한 것이다.
개별화된 작제물
개별화된 작제물의 경우, T 세포 에피토프는 이러한 구성을 인코딩하는 벡터로 치료를 받을 환자에 대해 최적화된 항원 유닛에 포함되도록 선택된다. 이는 작제물을 포함하는 상용 치료제와 비교하여 치료 효과를 증대시킨다.
개별화된 작제물의 항원 유닛은 MS를 앓고 있는 환자에 대해 예시할 경우, 다음과 같이 설계될 수 있다:
1) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자를 결정한다.
2) 하나 이상의 자가 항원(예컨대 MS와 관련된 자가 항원인 것으로 연구, 제안 및/또는 검증된 자가 항원)에 포함되어 있는 T 세포 에피토프를 확인한다.
3) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자에 대한 예상 결합을 기반으로 T 세포 에피토프를 선택한다.
4) 하나 이상의 테스트 작제물을 설계 및 제조하고, T 세포 에피토프를 본원에 기술된 바와 같은 작제물의 항원 유닛에 선택적으로 배열한다.
T 세포 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 예측된 능력을 기반으로 위에서 설명한 방법으로 선택된다. 즉 예측 HLA 결합 알고리즘을 사용하여 인실리코(in silico)로 선택된다. 관련 에피토프를 확인한 후 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자에 결합하는 능력에 따라 에피토프의 순위를 매기고, 가장 잘 결합할 것으로 예상되는 에피토프를 선택하여 테스트 작제물의 항원 유닛에 포함시킨다.
다음 중 하나와 같은 적절한 HLA 결합 알고리즘을 사용할 수 있다.
펩티드-MHC 결합에 이용가능한 소프트웨어 분석(IEDB, NetMHCpan 및 NetMHCIIpan)은 다음 웹사이트에서 온라인으로 다운로드하거나 사용할 수 있다.
www.iedb.org/
services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.0
services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2
기성품 관용 유도 작제물
본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 기성품 작제물의 항원 유닛은 별개의 T 세포 에피토프, 최소 T 세포 에피토프의 핫스팟 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 이러한 항원 유닛은 좋기로는 최소 T 세포 에피토프의 핫스팟, 즉 예컨대 민족 집단 또는 세계 집단과 같은 광범위한 대상체를 포괄하기 위해, 상이한 HLA 대립유전자에 의해 제시될 것으로 예측되는 다수의 최소 T 세포 에피토프(예컨대 7-15개 아미노산의 길이를 가짐)를 함유하는 항원의 하나 이상의 영역을 포함한다. 이러한 핫스팟을 포함함으로써 해당 작제물이 광범위한 대상체에서 내성을 유도할 가능성이 최대화된다.
항원 유닛의 추가 구현예
본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 항원 유닛에 포함된 T 세포 에피토프는 7 내지 약 200개 아미노산의 길이를 갖고, 더 긴 T 세포 에피토프는 아마도 최소 T 세포 에피토프의 핫스팟을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 7 내지 150개 아미노산, 좋기로는 7 내지 100개 아미노산, 예를 들어 9 내지 100개 아미노산 또는 15 내지 100개 아미노산, 또는 9 내지 60개 아미노산 또는 9 내지 30개 아미노산 또는 15 내지 60개 또는 15 내지 30개 또는 20 내지 75개 아미노산 또는 25 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
약 60 내지 200개의 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 더 짧은 서열로 분할될 수 있고 링커, 예를 들어 본원에 기술된 링커에 의해 분리된 항원 유닛에 포함될 수 있다. 예를 들어, 150개 아미노산 길이를 갖는 T 세포 에피토프는 각각 50개 아미노산의 3개 서열로 분할될 수 있고, 이들 3개 서열을 서로 분리하는 링커를 사용하여 항원 유닛에 포함시킬 수 있다.
일 구현예에서, 하나의 T 세포 에피토프의 길이는 T 세포 에피토프를 포함하는 단백질이 정확히 접히지 않도록 조정된다. 예를 들어, 가장 눈에 띄는 고양이 알레르겐인 Fel d 1은 두 개의 이종이량체로 형성된 단백질이며, 각 이량체는 두 개의 사슬로 구성되는데, 사슬 1은 70개의 아미노산 잔기를 포함하고 사슬 2는 90 또는 92개의 잔기를 포함한다. 두 사슬의 긴 T 세포 에피토프를 항원 유닛에 포함시키면 단백질이 정확히 접힐 수 있으며, 대상체의 비만 세포 및 호염기구에 있는 2 이상의 IgE가 T 세포 에피토프를 포함하는 작제물의 항원 유닛에 결합하면 알레르기 반응이 유발될 수 있다.
따라서, 더 긴 T 세포 에피토프가 항원 유닛에 포함되어 있는 경우, 단백질 접힘은 단백질에 대한 항체(예컨대 고양이 알레르겐)를 사용하고 항체가 T 세포 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 ELISA 등을 통해 시험관내에서 테스트할 수 있다. 항체가 T 세포 에피토프에 결합하는 경우, 본 명세서에 설명된 대로 길이가 조정되거나 더 짧은 서열로 분할될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프는 MHC(주조직적합성 복합체)에 의해 제시되기에 적합한 길이를 갖는다. MHC 분자에는 MHC 클래스 I과 MHC II의 두 가지 기본 클래스가 있다. MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II라는 용어는 본 명세서에서 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II와 상호교환적으로 사용된다. HLA(인간 백혈구 항원)는 인간의 주요 조직적합성 복합체이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 항원 유닛은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II에 대한 특정 제시에 적합한 길이를 갖는 T 세포 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 제시에 대해 7 내지 11개 아미노산의 길이를 갖는다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 제시를 위해 약 15개 아미노산 길이를 갖는다.
T 세포 에피토프의 배열 및 세부사항
항원 유닛 내 T 세포 에피토프의 수는 다양할 수 있으며 항원 유닛에 포함된 다른 요소, 예컨대 본 출원에 설명된 T 세포 에피토프 링커의 길이와 수에 따라 달라진다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 최대 3500개의 아미노산, 예를 들어 60 내지 3500개의 아미노산, 예를 들어 약 80개 또는 약 100개 또는 약 150개의 아미노산 내지 약 3000개의 아미노산, 예를 들어 약 200 내지 약 2500개의 아미노산, 예를 들어, 약 300 내지 약 2000개의 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500개의 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000개의 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 유닛은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 10개의 T 세포 에피토프와 같은 1 내지 10개의 T 세포 에피토프 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 T 세포 에피토프와 같은 11 내지 20개의 T 세포 에피토프, 또는 예컨대 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 T 세포 에피토프와 같은 21 내지 30개의 T 세포 에피토프, 또는 예를 들어 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 T 세포 에피토프와 같은 31 내지 40개의 T 세포 에피토프 또는, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프와 같은 41 내지 50개의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프는 항원 유닛에 무작위로 배열된다. 다른 구현예에서, 항원 유닛에 이들을 배열하기 위해 다음 방법 중 하나 이상이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프는 다량체화 유닛(이량체화 유닛과 같은)부터 항원 유닛의 말단 방향으로 항원성이 높은 것부터 항원성이 낮은 것의 순서로 배열된다(도 5 참조). 대안적으로, 특히 친수성/소수성이 T 세포 에피토프들 간에 크게 차이가 나는 경우, 가장 소수성인 T 세포 에피토프(들)는 실질적으로 항원 유닛의 중간에 위치시킬 수 있고 가장 친수성인 T 세포 에피토프(들)는 다량체화 유닛에 가장 가깝게 또는 항원 유닛의 끝에 위치시킬 수 있다.
항원 유닛의 가운데에 진정으로 위치하는 것은 항원 유닛이 홀수개의 항원을 포함하는 경우에만 가능하기 때문에, 이 문맥에서 용어 "실질적으로"는 짝수개의 항원을 포함하는 항원 유닛을 지칭하며, 여기서 가장 소수성인 항원은 가능한 한 가운데에 가깝게 위치한다.
예로서, 항원 유닛은 다음과 같이 배열된 5개의 T 세포 에피토프를 포함한다: 1-2-3*-4-5; 여기서 1, 2, 3*, 4 및 5는 각각 다른 T 세포 에피토프이고 -는 T 세포 에피토프 링커이며 *는 항원 유닛의 가운데에 위치하는 가장 소수성인 T 세포 에피토프를 나타낸다.
또 다른 예에서, 항원 유닛은 6개의 T 세포 에피토프를 포함하며, 이는 다음과 같이 배열된다: 1-2-3*-4-5-6 또는 대안적으로 다음과 같이: 1-2-4-3*-5-6; 여기서 1, 2, 3*, 4, 5 및 6은 각각 T 세포 에피토프이고 -는 T 세포 에피토프 링커이며, *는 항원 유닛의 실질적으로 가운데에 위치하는 가장 소수성인 T 세포 에피토프를 나타낸다.
대안적으로, T 세포 에피토프는 친수성 T 세포 에피토프와 소수성 T 세포 에피토프를 교대로 배열할 수 있다. 선택적으로, T 세포 에피토프를 인코딩하는 GC 풍부 서열은 GC 클러스터가 방지되는 방식으로 배열된다. 일 구현예에서, T 세포 에피토프를 인코딩하는 GC 풍부 서열은 이들 사이에 적어도 하나의 비-GC 풍부 서열이 존재하도록 배열된다.
T 세포 에피토프 링커
항원 유닛이 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우, 에피토프는 좋기로는 T 세포 에피토프 링커에 의해 분리된다. 이는 각 T 세포 에피토프가 면역체계에 최적의 방식으로 제시되도록 보장한다. 항원 유닛이 n개의 T 세포 에피토프를 포함하는 경우, 이는 좋기로는 n-1개의 T 세포 에피토프 링커를 포함하여 각 T 세포 에피토프를 하나 또는 두 개의 다른 T 세포 에피토프로부터 분리한다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 비면역원성이도록 설계된다. T 세포 에피토프 링커는 강성 링커일 수 있으며, 이는 링커가 연결하는 2개의 아미노산 서열이 실질적으로 서로에 대해 자유롭게 이동하는 것을 허용하지 않음을 의미한다. 대안적으로, 이는 유연한 링커, 즉 연결되는 두 개의 아미노산 서열이 실질적으로 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있게 하는 링커일 수 있다. 두 가지 유형의 링커 모두 유용하다. 일 구현예에서, 링커는 항원 유닛이 다수의 T 세포 에피토프를 포함하더라도 최적의 방식으로 면역계에 T 세포 에피토프를 제시할 수 있는 유연한 링커이다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 4 내지 40개 아미노산, 예를 들어 35, 30, 25 또는 20개 아미노산, 예를 들어 4 내지 20개 아미노산, 예컨대 5 내지 20개 아미노산 또는 5 내지 15개 아미노산 또는 8 내지 20개 아미노산 또는 8 내지 15개 아미노산, 10 내지 15개의 아미노산 또는 8 내지 12개의 아미노산으로 구성된 펩티드이다. 일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 10개의 아미노산으로 구성된다.
일 구현예에서, 항원 유닛에 포함된 모든 T 세포 에피토프 링커는 동일하다. 그러나, T 세포 에피토프들 중 하나 이상이 링커의 서열과 유사한 서열을 포함하는 경우, 이웃하는 T 세포 에피토프 링커(들)를 다른 서열의 링커로 대체하는 것이 유리할 수 있다.　또한, T 세포 에피토프/링커 접합이 그 자체로 에피토프를 구성할 것으로 예측되는 경우, 다른 서열의 T 세포 에피토프 링커를 사용하는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 유연한 링커, 바람직하게는 작은, 비-극성(예를 들어 글리신, 알라닌 또는 류신) 또는 극성(예를 들어 세린 또는 트레오닌) 아미노산을 포함하는 유연한 링커이다.　이들 아미노산의 작은 크기는 유연성을 제공하고 연결된 아미노산 서열의 이동성을 허용한다.　세린 또는 트레오닌의 혼입은 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있으므로, 링커와 항원 사이의 불리한 상호 작용을 감소시킨다.　일 구현예에서, 유연성 링커는 세린(S) 및/또는 글리신(G) 풍부 링커, 즉 여러 세린 및/또는 여러 글리신 잔기를 포함하는 링커이다. 바람직한 예는 GGGGSGGGSS (SEQ ID NO: 75), GGGSG (SEQ ID NO: 76), GGSGG (SEQ ID NO: 77), SGSSGS (SEQ ID NO: 78) 또는 그의 다수의 변이체, 예를 들어 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 79), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 80), (GGGSS)m (SEQ ID NO: 81), (GGSGG)m (SEQ ID NO: 82), (GGGSG)m (SEQ ID NO: 83) or (SGSSGS)m (SEQ ID NO: 84)이고, m은 1 내지 5의 정수, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5)이다. 바람직한 구현예에서, m은 2이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 세린 및/또는 글리신 풍부 링커는 적어도 하나의 류신(L) 잔기, 예를 들어 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 류신 잔기, 예컨대　1, 2, 3 또는 4개의 류신 잔기를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGGS (SEQ ID NO: 85), GLGGS (SEQ ID NO: 86), GGLGS (SEQ ID NO: 87), GGGLS (SEQ ID NO: 88) 또는 GGGGL (SEQ ID NO: 89).을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSG (SEQ ID NO: 90), GLGSG (SEQ ID NO: 91), GGLSG (SEQ ID NO: 92), GGGLG (SEQ ID NO: 93) or GGGSL (SEQ ID NO: 94)을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSS (SEQ ID NO: 95), GLGSS (SEQ ID NO: 96) 또는 GGLSS (SEQ ID NO: 97)를 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGLGS (SEQ ID NO: 98), GLGLS (SEQ ID NO: 99), GLLGS (SEQ ID NO: 100), LGGLS (SEQ ID NO: 101) 또는 GLGGL (SEQ ID NO: 102)를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 of LGLSG (SEQ ID NO: 103), GLLSG (SEQ ID NO: 104), GGLSL (SEQ ID NO: 105), GGLLG (SEQ ID NO: 106) 또는 GLGSL (SEQ ID NO: 107)을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGLSS (SEQ ID NO: 108) 또는 GGLLS (SEQ ID NO: 109)를 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 10개의 아미노산 길이를 갖고 1 또는 2개의 류신 잔기를 포함하는 세린-글리신 링커이다.
일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 110), GLGGSGGGGS (SEQ ID NO: 111), GGLGSGGGGS (SEQ ID NO: 112), GGGLSGGGGS (SEQ ID NO: 155) 또는 GGGGLGGGGS (SEQ ID NO: 114)를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 115), GLGSGGGGSG (SEQ ID NO: 156), GGLSGGGGSG (SEQ ID NO: 157), GGGLGGGGSG (SEQ ID NO: 158) 또는 GGGSLGGGSG (SEQ ID NO: 159)를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 121), GLGSSGGGSS (SEQ ID NO: 122), GGLSSGGGSS (SEQ ID NO: 123), GGGLSGGGSS (SEQ ID NO: 124) 또는 GGGSLGGGSS (SEQ ID NO: 125)를 포함하거나 이로 이루어진다.
추가 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGGSLGGGS (SEQ ID NO: 126), GLGGSGLGGS (SEQ ID NO: 127), GGLGSGGLGS (SEQ ID NO: 128), GGGLSGGGLS (SEQ ID NO: 129) 또는 GGGGLGGGGL (SEQ ID NO: 130)를 포함하거나 이로 이루어진다. 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSGLGGSG (SEQ ID NO: 131), GLGSGGLGSG (SEQ ID NO: 132), GGLSGGGLSG (SEQ ID NO: 133), GGGLGGGGLG (SEQ ID NO: 134) 또는 GGGSLGGGSL (SEQ ID NO: 135)를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 LGGSSLGGSS (SEQ ID NO: 136), GLGSSGLGSS (SEQ ID NO: 137) 또는 GGLSSGGLSS (SEQ ID NO: 138)를 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 GSGGGA (SEQ ID NO: 139), GSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 140), GSGGGAGSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 141), GSGGGAGSGGGAGSGGGAGSGGGA (SEQ ID NO: 142) 또는 GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 143)를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 서브유닛 링커는 SGGGSSGGGS (SEQ ID NO: 144), SSGGGSSGGG (SEQ ID NO: 145), GGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 146), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 147), GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 118), GGGSSS (SEQ ID NO: 149), GGGSSGGGSSGGGSS (SEQ ID NO: 150) 또는 GLGGLAAA (SEQ ID NO: 151)를 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 견고한 링커이다. 이러한 견고한 링커는 (더 큰) T 세포 에피토프를 효율적으로 분리하고 서로의 간섭을 방지하는 데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 KPEPKPAPAPKP(SEQ ID NO: 152), AEAAAKEAAAAKA(SEQ ID NO: 153), (EAAAK)m(SEQ ID NO: 154), PSRLEEELRRRLTEP(SEQ ID NO: 160) 또는 SACYCELS(SEQ ID NO: 161)을 포함하거나 이로 이루어진다).
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 서열 TQKSLSLSPGKGLGGL(SEQ ID NO:162)을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 서열 SLSLSPGKGLGGL(SEQ ID NO:163)을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(SEQ ID NO:164) 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(SEQ ID NO:165) 또는 EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO:166)을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구현예에서, T 세포 에피토프 링커는 절단가능한 링커, 예를 들어 엔도펩티다제, 예를 들어 푸린, 카스파제, 카텝신 등과 같은 엔도펩티다제에 대해 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 링커이다.
T 세포 에피토프 링커의 예는 단락 [0098]-[0099] 및 WO 2020/176797A1의 인용된 서열, US 2019/0022202A1의 단락 [0135] 내지 [0139], WO 2017/118695 A1 및 WO에 개시되어 있다. 2021/219897A1에 기재되어 있으며, 이들 모두는 참조로 본 문서에 포함되어 있다.
알레르겐(Allergens)
본 명세서에 기술된 작제물을 인코딩하는 벡터는 다양한 단백질 알레르겐, 예를 들어 번역 후 변형을 겪는 단백질 알레르겐을 포함하여, 본 발명의 벡터의 제1 핵산 서열에 포함된 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있는 알레르겐의 T 세포 에피토프에 대한 내성을 유도하는 데 유용하다.
항원 유닛에 포함된 하나 이상의 T 세포 에피토프는 다음 알레르겐으로부터 유래될 수 있다:
일부 구현예에서, 알레르겐은 식품 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 패류 알레르겐이다. 일부 구현예에서 알레르겐은 트로포미오신이고, 다른 구현예에서 알레르겐은 아르기닌 키나제, 미오신 경쇄, 근형질 칼슘 결합 단백질, 트로포닌 C 또는 트리오스-포스페이트 이소머라제 또는 액틴이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 Pan b 1이다. 일부 구현예에서 항원 유닛은 Pan b 1 T 세포 에피토프(251-270)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 유닛은 Met e 1을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 유닛은 Met e 1 T 세포 에피토프(241-260), (210-230), (136-155), (136-155), (76-95), (46-65) 및 (16-35)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 유닛은 Met e1 T 세포 에피토프 (241-260), (210-230), (136-155), (76-95), (46-65) 및 (16-35)를 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 우유 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 우유 알레르겐은 Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Bos d 9, Bos d 10, Bos d 11 또는 Bos d 12이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 달걀(egg) 알레르겐이다. 일부 구현예에서 달걀 알레르겐은 오보뮤코이드이고, 다른 구현예에서 달걀 알레르겐은 오발부민, 오보트랜스페린, 콘알부민, Gal d 3, 달걀 라이소자임 또는 오보뮤신이다.
당업계에 알려져 있고 달걀 알레르기와 관련하여 연구된 T 세포 에피토프 중 하나는 아미노산 서열 SIINFEKL(SEQ ID NO:120)을 갖는 OVA(257-264)이다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 인코딩된 작제물의 항원 유닛은 T 세포 에피토프 OVA(257-264)를 포함한다. 이러한 벡터 또는 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 달걀 알레르기의 치료에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 생선 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 생선 알레르겐은 파르발부민이다. 다른 구현예에서 생선 알레르겐은 에놀라제, 알돌라제 또는 비텔로게닌이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 과일 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 과일 알레르겐은 병인-관련 단백질 10, 프로필린, nsLTP, 타우마틴 유사 단백질, 지베렐린 조절 단백질, 이소플라본 환원효소 관련 단백질, 클래스 1 키티나제, β 1,3 글루카나제, 발아 유사 단백질, 알칼리성 세린 프로테아제, 병인-관련 단백질 1, 액티니딘, 피토시스타틴, 키웰린, 주요 라텍스 단백질, 쿠핀 또는 2S 알부민이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 식물성 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 식물성 알레르겐은 병인-관련 단백질 10, 프로필린, 1형 nsLTP, 2형 nsLTP 단백질, 오스모틴 유사 단백질, 이소플라본 환원효소 유사 단백질, β-프럭토푸라노시다제, PR 단백질 TSI-1, 사이클로필린 또는 FAD 함유 산화효소이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 밀 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 밀 알레르겐은 Tri a 12, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 20, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37 또는 Tri a 38이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 대두 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 대두 알레르겐은 Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5, Gly m 6, Gly m 7 또는 Gly m 8이다. 다른 구현예에서 대두 알레르겐은 Gly m 아글루티닌, Gly m Bd28K, Gly m 30 kD, Gly m CPI 또는 Gly m TI이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 땅콩 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 땅콩 알레르겐은 Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Ara h 12, Ara h 13, Ara h 14, Ara h 15, Ara h 16, 또는 Ara h 17이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 트리 넛 또는 종자 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 11S 글로불린, 7S 글로불린, 2S 글로불린, PR10, PR-14 nsLTP, 올레오신 또는 프로필린이다.
다른 구현예에서 식품 알레르겐은 메밀, 셀러리, 색소 첨가물, 달걀, 생선, 과일, 마늘, 글루텐, 귀리, 콩과 식물, 옥수수, 우유, 겨자, 견과류, 땅콩, 가금류, 육류, 쌀, 참깨, 패류, 대두, 트리 넛 및 밀로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르겐이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 봉독 알레르겐이다. 일부 구현예에서 봉독 알레르겐은 포스포리파제 A2, 히알루로니다제, 산 포스파타제, 멜리틴, 알레르겐 C/DPP, CRP/이카라핀 또는 비텔로게닌이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 베스피드(vespid) 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 베스피드 알레르겐은 포스포리파제 A1, 히알루로니다제, 프로테아제, 항원 5, DPP IV 또는 비텔로게닌이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 라텍스 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 라텍스 알레르겐은 Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14 또는 Hev b 15이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 먼지 진드기 알레르겐이다. 일부 구현예에서 알레르겐은 집 먼지 진드기 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 저장 먼지 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 집 먼지 진드기 알레르겐은 Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 7, Der p 8, Der p 10, Der p 11, Der p 21, 또는 Der p 23이다. 일부 구현예에서 항원 유닛은 Der p 1 T 세포 에피토프(111-139)를 포함한다. 일부 구현예에서, 집 먼지 진드기 알레르겐은 Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7, Der f 8 또는 Der f 10이다. 일부 구현예에서, 집 먼지 진드기 알레르겐은 Blot t 1, Blot t 2, Blot t 3, Blot t 4, Blot t 5, Blot t 8, Blot t 10, Blot t 12 또는 Blot t 21이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 바퀴벌레 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 바퀴벌레 알레르겐은 Bla g 1, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8 또는 Bla g 11이다. 알레르겐은 Per a 1, Per a 2, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9 또는 Per a 10이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 곰팡이 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 곰팡이 알레르겐은 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 아스퍼질러스 푸미가투스 알레르겐은 Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 14, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, Asp f 28, Asp f 29 또는 Asp f 34이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 진균 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 진균 알레르겐은 말라세지아(Malassezia) 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 말라세지아 알레르겐은 Mala f 1, Mala f 2, Mala f 3, Mala f 4, Mala f 5, Mala f 6, Mala f 7, Mala f 8, Mala f 9, Mala f 10, Mala f 11, Mala f 12 또는 Mala f 13 또는 MGLβ1204이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 모피 동물 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 개 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 개 알레르겐은 Can f 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 말 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 말 알레르겐은 Ecu c 1, 2, 3 또는 4이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 고양이 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 고양이 알레르겐은 Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5, Fel d 6, Fel d 7 또는 Fel d 8이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 실험실 동물 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 리포칼린, 소변 프리알부민, 세크레토글로불린 또는 혈청 알부민이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 풀 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 잔디 꽃가루 알레르겐은 티모시풀, 과수원풀, 켄터키 블루그래스, 다년생 호밀, 스위트 봄풀, 바이아풀, 존슨풀 또는 버뮤다풀 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 풀 꽃가루 알레르겐은 Phl p 1, Phl p 2, Phl p 3, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12 또는 Phl p 13이다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 나무 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 나무 꽃가루 알레르겐은 오리나무, 자작나무, 서어나무속, 개암나무, 유럽사비속, 밤나무, 유럽너도밤나무, 참나무, 물푸레나무, 사탕수수, 올리브, 라일락, 사이프러스 또는 삼나무 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 나무 꽃가루 알레르겐은 Aln g 1 또는 Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 또는 Bet v 7, Car b 1, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 6, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, 1 Cor a 3, Cor a 14, Ost c 1, Cas 1, Cas 5, Cas 8 또는 Cas 9, Fag s 1, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11 또는 Ole e 12, Syr v 1, Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun v 1, Jun v 3, Pla a 1, Pla a 2 또는 Pla a 3이다. 일부 구현예에서 항원 유닛은 Bet v 1 T 세포 에피토프(139-152)를 포함한다.
일부 구현예에서, 알레르겐은 잡초 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서 잡초 알레르겐은 돼지풀, 쑥, 해바라기, 화란국화, 펠리토리, 영국 질경이, 연간 수은, 거위발, 러시안 엉겅퀴 또는 아마란스 꽃가루 알레르겐이다. 일부 구현예에서 돼지풀 꽃가루 알레르겐은 Amb a 1, Amb a 4, Amb a 6, Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10 또는 Amb a 11이다. 일부 구현예에서 쑥 꽃가루 알레르겐은 Art v 1, Art이다. v 3, Art v 4, Art v 5, 또는 Art v 6이다. 일부 구현예에서, 해바라기 꽃가루 알레르겐은 Hela 1 또는 Hel a 2이다. 일부 구현예에서, 펠리토리 꽃가루 알레르겐은 Par j 1, Par j 2, Par j 3 또는 Par j 4이다. 일부 구현예에서 영국 질경이 꽃가루 알레르겐은 Pla l 1이다. 일부 구현예에서 연간 수은 꽃가루 알레르겐은 Mer a 1이다. 일부 구현예에서 거위발 꽃가루 알레르겐은 Che a 1, Che이다 a 2 또는 Che a 3이다. 일부 구현예에서, 러시아 엉겅퀴 꽃가루 알레르겐은 Sal k 1, Sal k 4 또는 Sal k 5이다. 일부 구현예에서, 아마란스 꽃가루 알레르겐은 Ama r 2이다.
또 다른 구현예에서 알레르겐은 곤충, 바퀴벌레, 집 먼지 진드기 또는 곰팡이와 같은 환경적 알레르겐으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 알레르기성 비염, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 위장병증, 접촉성 피부염 및 약물 알레르기 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 알레르기 질환의 치료에 사용될 수 있다.
약물에 대한 알레르기는 일반 인구의 7% 이상에게 영향을 미친다. 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 이러한 약물에 존재하는 면역원성 T 세포 에피토프에 대한 내성을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라 영향을 받은 환자가 약물 치료를 계속하고 약물 치료로부터 이익을 얻을 수 있게 해줄 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 알레르겐은 원치 않는 면역원성을 갖는 약물에 포함된다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 인자 VIII이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 인슐린이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 치료에 사용되는 모노클로날 항체이다.
자가 항원
다른 구현예에서, 본 벡터는 자가면역 질환과 관련된 자가-알레르겐에 포함된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 함유하는 작제물을 인코딩한다. 이는 일반적으로 면역체계를 억제하지 않고도 자가면역 질환을 담당하는 면역체계 부분의 항원 특이적 하향 조절을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 자가면역 질환은 MS이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG: myelin oligodendrocyte glycoprotein)이다. 다른 구현예에서, 자가 항원은 MAG, MOBP, CNPase, S100β 또는 트랜스알돌라제이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 미엘린 염기성 단백질(MBP)이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 미엘린 단백지질 단백질(PLP)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 전술한 자가 항원 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
MS 관련 T 세포 에피토프는 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG)의 T 세포 에피토프이다. MOG는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 중추신경계에서만 발현된다. MOG(35-55)는 자가항체 생산과 재발 완화 신경 질환을 유발하여 광범위한 플라크 유사 탈수초화를 일으킬 수 있다. MOG(35-55)에 대한 자가항체 반응은 MS 환자에서 관찰되었으며, MOG(35-55)에 의해 유발된 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 C57/BL6 마우스 및 루이스 래트에서 관찰되었다. 또 다른 MOG T 세포 에피토프는 MOG(27-63)이다.
당업계에 알려져 있고 연구된 다른 MS-관련 T 세포 에피토프에는 표 3에 나열된 것들이 포함된다:
바람직한 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩되는 작제물의 항원 유닛은 MOG (35-55), MOG (27-63), PLP (139-151), PLP (131-159), PLP (178-191), PLP (170-199), MBP (84-104) 및 MBP (76-112)이다. 이러한 벡터 또는 이러한 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 MS의 치료에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 글루탐산 데카르복실라제 65-킬로달톤 이소형(GAD65)이며, 이는 제1형 당뇨병과 관련된 자가 항원이다. 일부 다른 구현예에서, 자가 항원은 인슐린, IA-2 또는 ZnT8이다. 또 다른 일부 구현예에서, 자가 항원은 IGRP, ChgA, IAPP, 페리페린, 테트라스파닌-7, GRP78, 유로코르틴-3 또는 인슐린 유전자 강화제 단백질 isl-1이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 전술한 자가 항원 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 자가면역 질환은 셀리악병이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 α-글리아딘, γ-글리아딘, ω-글리아딘, 저분자량 글루테닌, 고분자량 글루테닌, 호르데인, 세칼린 또는 아베닌 b이다. 일부 구현예에서, 항원 유닛은 T 세포 에피토프 α-글리아딘(76-95)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 전술한 자가 항원 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 콜라겐이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 열충격 단백질 60(HSP60)이다. 일부 구현예에서, 자기 항원은 밴드 3이다. 일부 구현예에서, 자기 항원은 소형 핵 리보핵단백질 D1(SmD1)이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 아세틸콜린 수용체(AChR)이다. 일부 구현예에서, 자가 항원은 미엘린 단백질 제로(P0)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 전술한 자가 항원 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
일 구현예에서, 자가면역 질환은 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP)이고 자가 항원은 뉴로파신 155이다. 또 다른 구현예에서 자가면역 질환은 하시모토 갑상선염(HT)이고 자가 항원은 갑상선 퍼옥시다제 및/또는 티로글로불린이다. 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 잎사귀천포창이고 자가 항원은 데스모솜 관련 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창이고 자가 항원은 데스모글레인 3이다. 또 다른 구현예에서 자가면역 질환은 갑상선안질환(TED)이고 자가 항원은 칼슘 결합 단백질(칼세퀘스트린)이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 그레이브병이고 자가 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 원발성 담즙성 간경변증(PBC)이고 자가 항원은 항미토콘드리아 항체(AMA), 항핵항체(ANA), 림-유사/막(RL/M) 및/또는 다수의 핵점(MND)이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 중증근육무력증이고 자가 항원은 아세틸콜린 수용체이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 인슐린 저항성 당뇨병이고 자가 항원은 인슐린 수용체이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 자가면역 용혈성 빈혈이고 자가 항원은 적혈구이다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 건선이고 자가 항원은 카텔리시딘(LL-37), 디스인테그린 유사 및 트롬보스폰딘 1형 모티프 유사 5 (ADAMTSL5)를 함유하는 메탈로프로테아제 도메인, 포스포리파제 A2 그룹 IVD(PLA2G4D), 이종 핵 리보핵산단백질 A1(hnRNP-A1) 및 케라틴 17로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염이고 자가 항원은 시트룰린화 단백질, 호모시트룰린화 단백질 및 IgG의 Fc 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 벡터에 의해 인코딩된 작제물은 전술한 자가 항원 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다.
유닛 링커
항원 유닛은 좋기로는 유닛 링커에 의해 다량체화 유닛에 연결된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 인코딩한다.
유닛 링커는 제1 핵산 서열의 구축을 용이하게 하기 위해 제한 부위를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 유닛 링커는 GLGGL(SEQ ID NO:102) 또는 GLSGL(SEQ ID NO:174)이다. 다른 구현예에서, 유닛 링커는 GGGGS (SEQ ID NO: 175), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 79), (GGGGS)m (SEQ ID NO: 80), EAAAK (SEQ ID NO: 176), (EAAAK)m (SEQ ID NO: 154), (EAAK)mGS (SEQ ID NO: 178), (EAAAK)mGS (SEQ ID NO: 177), GPSRLEEELRRRLTEPG (SEQ ID NO: 179), AAY 또는 HEYGAEALERAG (SEQ ID NO: 173)를 포함하거나 이로 이루어진다.
신호 펩티드
본 개시내용의 일 구현예에서, 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열 또는 제1 핵산 서열 중 적어도 하나는 또한 신호 펩티드를 인코딩한다. 신호 펩티드는 제1 폴리펩티드의 표적화 유닛의 방향에 따라 표적화 유닛의 N-말단 또는 표적화 유닛의 C-말단에 위치한다. 또한, 신호 펩티드는 면역억제 화합물의 N 말단에 위치한다. 신호 펩티드는 본 발명의 벡터를 포함하는 세포로부터 제1 폴리펩티드 및/또는 면역억제 화합물(들)의 분비를 허용하도록 설계된다. 좋기로는, 제1 핵산 서열 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 각각의 추가 핵산 서열은 신호 펩티드도 인코딩하는 것이 바람직하다.
임의의 적합한 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 제 폴리펩티드의 예는 신호 펩티드, 인간 Ig VH 신호 펩티드이고, 좋기로는 표적화 유닛이 scFv와 같은 항체 또는 그의 일부인 경우이다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 표적화 유닛인 단백질의 천연 리더 서열, 즉 본 발명의 벡터에서 표적화 유닛으로서 인코딩되는 임의의 단백질의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드이다. 이러한 신호 펩티드의 예로는 인간 IL-10의 신호 펩티드(표적 유닛은 인간 IL-10임) 또는 인간 TGF-β1의 신호 펩티드(표적 유닛은 인간 TGF-β1임)을 들 수 있다.
하나 이상의 면역억제 화합물의 경우, 신호 펩티드는 좋기로는 면역억제 화합물의 천연 리더 서열, 즉 면역억제 화합물의 N-말단에 자연적으로 존재하는 신호 펩티드이다. 이러한 신호 펩티드의 예는 CTLA-4의 신호 펩티드(면역억제 화합물은 CTLA-4, 좋기로는 CTLA-4의 세포외 도메인) 또는 GM-CSF(면역억제 화합물은 GM-CSF)의 신호 펩티드이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 SEQ ID NO: 69의 인간 IL-10 신호와 같은 인간 IL-10 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 벡터는 인간 IL-10 표적화 유닛을 인코딩하고 또한 인간 IL-10 신호 펩티드 역시도 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 SEQ ID NO: 2의 인간 Ig VH 신호 펩티드와 같은 인간 Ig VH 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 벡터는 scFv 표적화 유닛, 예를 들어 항-인간 CD205 표적화 유닛을 인코딩하고 또한 인간 Ig VH 신호 펩티드 역시도 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 인간 Ig VH 신호 펩티드, hTGF-β1의 신호 펩티드, hTGF-β2의 신호 펩티드, hTGF-β3의 신호 펩티드, hIL-10의 신호 펩티드, hIL-2의 신호 펩티드, hIL-4의 신호 펩티드, hIL-6의 신호 펩티드, hIL-11의 신호 펩티드, hIL-13의 신호 펩티드, hIL-27의 신호 펩티드, hIL-35의 신호 펩티드, hIL-37의 신호 펩티드, hGM-CSF의 신호 펩티드, hFLT3L의 신호 펩티드, hCCL19의 신호 펩티드, hCCL21의 신호 펩티드, hICAM-1의 신호 펩티드, hkeratin의 신호 펩티드, hVSIG-3의 신호 펩티드, hSCGB3A2의 신호 펩티드, hCTLA-4의 신호 펩티드, hPD-1의 신호 펩티드 및 hBTLA의 신호 펩티드, 예를 들어 본원의 "서열 개관" 섹션에 나열된 전술한 신호 펩티드 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하고 hCLTA-4의 신호 펩티드, hPD-1의 신호 펩티드, hBTLA의 신호 펩티드, hLAG3의 신호 펩티드, hNOX2의 신호 펩티드, hSIGLEC7의 신호 펩티드, hSIGLEC9의 신호 펩티드, hTIM-3의 신호 펩티드, hIL-10의 신호 펩티드, hTGF-β1의 신호 펩티드, hTGF-β2의 신호 펩티드, hTGF-β3의 신호 펩티드, hIL-27의 신호 펩티드, hIL-2의 신호 펩티드, hGM-CSF의 신호 펩티드, hFLT3L의 신호 펩티드, hIFN-γ의 신호 펩티드 및 hIL-37의 신호 펩티드 및 hIL-35의 신호 펩티드, 예를 들어 본원의 "서열 개관" 섹션에 나열된 전술한 신호 펩티드 중 임의의 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열을 포함한다.
서열 동일성
서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제2 서열이 제1 서열로부터 유래될 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 두 개의 정렬된 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 참조 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은 정렬 후 후보 서열의 아미노산의 70%가 참조 서열의 상응하는 아미노산과 동일해야 할 것을 요구한다. 동일성(identity)은 비제한적인 예로서 ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: 개선 서열 가중, 위치-특정 갭 패널티 및 가중치 매트릭스 선택을 통한 점진적 다중 서열 정렬의 감도(Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), 및 여기에 제안된 기본 매개변수와 같은 컴퓨터 분석의 도움으로 결정될 수 있다. 기본 설정으로 이 프로그램을 사용하면 쿼리의 성숙한(생체 활성) 부분과 참조 폴리펩티드가 정렬된다. 완전히 보존된 잔기의 수를 세고 이를 참조 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 할 때 쿼리 시퀀스의 일부를 형성하는 모든 태그 또는 융합 단백질 시퀀스는 정렬 및 시퀀스 동일성의 후속 결정에서 무시된다.
ClustalW 알고리즘이 뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 표시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
서열 비교에 사용되는 또 다른 선호되는 수학적 알고리즘은 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다(Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219). 정렬은 전역 정렬(global alignment)을 기반으로 시퀀스 ID를 계산한다. Align0은 서열 끝에 있는 간격에 불이익을 주지 않는다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 및 Align0 프로그램을 사용할 때 -12/-2의 갭 개방/확장 페널티를 갖는 BLOSUM50 치환 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
아미노산 서열 변이체는 제1 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 면역억제 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그러한 잔기로의 삽입 및/또는 그러한 잔기의 치환이 포함된다.　아미노산 서열 및 서열 동일성과 관련하여 본원에 사용된 용어 치환된/치환, 결실된/결실 및 삽입된/삽입은 당업자에게 잘 알려져 있고 명백하다. 최종 단백질이 원하는 특징을 갖는다면 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 통해 최종 제1 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 면역억제 화합물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 폴리펩티드/면역억제 화합물을 생성할 수 있다.
관심 대상 단백질의 원하는 특징이 유지되는 한, 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 잔기의 양친매성 특징의 유사성을 기반으로 고의적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.　예를 들어, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되며;　양전하를 띤 아미노산에는 리신과 아르기닌이 포함되며;　유사한 친수성 값을 갖는 비전하 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산에는 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다.
여기에서는, 보존적 치환, 즉 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 하는 것과 같은 유사 치환(like-for-like substitution), 및 비-보존적 치환, 즉 잔기의 한 부류에서 다른 부류로, 또는 대안적으로 예컨대 오르니틴, 디아미노부티르산 오르니틴, 노르류신, 오르니틴, 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 비-보존적 치환이 포함된다.　이루어질 수 있는 보존적 치환은 예를 들어 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 지방족 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴, 세린, 트레오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 하이드록실 아미노산(세린, 트레오닌), 큰 아미노산(페닐알라닌, 트립토판) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌) 그룹 내에서 이루어질 수 있다.
치환은 또한 비천연 아미노산에 의해 이루어질 수 있으며 치환 잔기는 다음을 포함한다;　알파* 및 알파-이치환* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 젖산*, 천연 아미노산의 할로겐화물 유도체, 예컨대 트리플루오로티로신*, p-CI-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, pI-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-a-아미노부티르산*, L-y-아미노부티르산*, L-a-아미노이소부티르산*, L-e-아미노카프로산*, 7-아미노헵탄산*, L-메티오닌 술폰*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린*, L-티오프롤린*, 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 예컨대 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe(4-아미노)#, L-Tyr(메틸)*, L-Phe(4-이소프로필)*, L-Tic(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산* 및 L-Phe(4-벤질)*.
위 문단에서, *는 치환 잔기의 소수성을 나타내고, #은 치환 잔기의 친수성을 나타내고, #*는 치환 잔기의 양친매성을 나타낸다.　변이체 아미노산 서열은, 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에, 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 2개의 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 그룹을 포함할 수 있다.　변이체의 추가적인 형태는 펩토이드 형의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함한다.
폴리펩티드 및 다량체/이량체 단백질
본 발명의 벡터는 전술한 바와 같은 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 폴리펩티드(및 하나 이상의 면역억제 화합물)는 벡터를 대상체에 투여한 결과 생체내에서 발현된다.
이량체화 유닛과 같은 다량체화 유닛의 존재로 인해, 폴리펩티드가 발현될 때 다량체 단백질이 형성된다.
다량체 단백질은 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있으며, 예를 들어 단백질이 이량체 단백질인 경우, 이량체 단백질은 동종이량체, 즉 2개의 폴리펩티드 사슬이 동일하고 결과적으로 동일한 유닛 및 이에 따른 T 세포 에피토프를 포함하는 이량체 단백질일 수 있거나, 또는 이량체 단백질은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체일 수 있으며, 여기서 폴리펩티드 사슬 1은 그의 항원 유닛에 폴리펩티드 2와는 다른 T 세포 에시토프를 포함한다. 후자는 항원 유닛에 포함될 T 세포 에피토프의 수가 항원 유닛에서의 크기의 상한을 초과하는 경우와 관련될 수 있다.　다량체 단백질은 동종다량체 단백질인 것이 바람직하다.
숙주 세포 및 벡터의 제조
본 발명의 벡터는 일반적으로 숙주 세포를 형질감염시키는데 적합하고 a) 제1 폴리펩티드의 발현 및 제1 핵산 서열에 의해 인코딩되는 다수의 이러한 제1 폴리펩티드로 구성된 다량체 단백질의 형성 및 b) 추가 핵산 서열에 의해 각각 인코딩되는 하나 이상의 면역억제 화합물의 발현에 적합한 벡터들이다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 세포 인큐베이션 세포, 예를 들어 박테리아 세포이고, 벡터에 의해 인코딩된 단백질은 시험관내에서 발현된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 대상체의 세포이고, 벡터에 의해 인코딩된 단백질은 대상체에 대한 벡터의 투여의 결과로서 상기 대상체에서, 즉 생체내에서 발현된다.
시험관내 형질감염에 적합한 숙주 세포에는 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 고등 진핵생물 세포가 포함된다. 생체내 형질감염에 적합한 숙주 세포는 예를 들어 근육 세포이다.
일 구현예에서, 벡터는 CpG가 없는 벡터이다. 또 다른 일 구현예에서, 벡터는 pALD-CV77 벡터이다.
본 발명의 벡터, 예를 들어 DNA 및 RNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터의 조작 및 생산 방법은 잘 알려져 있으며, 당업자는 이러한 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 벡터를 조작/생산할 수 있을 것이다. 또한 다양한 상업 제조업체가 벡터 디자인 및 생산을 위한 서비스를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 제조 방법에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는것이고, 상기 방법은:
a) 상기 벡터를 사용하여 시험관내에서 세포를 형질감염시키는 단계 ;
b) 상기 세포를 인큐베이션하는 단계;
c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
d) 벡터 또는 DNA 플라스미드를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
를 포함한다.
약학적 조성물
본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 약제로 사용하기 위한 것이다.
따라서, 본 개시내용의 일 구현예에서, 벡터는 상기 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 (ii) 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예컨대 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수(예컨대 PBS), 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 등장성 수성 완충액 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않다.
일 구현예에서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 수성 완충액이다.　다른 실시 형태에서, 수성 완충액은 Tyrode's 완충액, 예를 들어 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(Hepes) pH 7.4, 및 10 mM 글루코스를 포함하는 Tyrode's 완충액이다.
약학적 조성물은 숙주 세포의 형질감염을 용이하게 하는 분자, 즉 형질감염제를 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 아주반트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 아주반트는 덱사메타손, 장독소 콜레라 독소(CTB)의 B 서브유닛, TLR2 리간드, 기생충 유래 배설/분비(ES) 생성물, 라파마이신 비타민 D3 유사체 및 아릴 탄화수소 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 구현예에서 약학적 조성물은 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 포함하는 약학적으로 허용되는 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
본원에 사용된 "양친매성 블록 공중합체"는 폴리(에틸렌 옥사이드)("PEO") 블록 및 폴리(프로필렌 옥사이드)("PPO") 블록을 포함하거나 이로 구성된 선형 또는 분지형 공중합체이다.　유용한 PEO-PPO 양친매성 블록 공중합체의 전형적인 예는 일반 구조 PEO-PPO-PEO(폴록사머), PPO PEO PPO, (PEO PPO-)4ED(폴록사민) 및 (PPO PEO-)4ED(역방향 폴록사민)을 갖고, 여기서 "ED"는 에틸렌디아미닐 그룹이다.
"폴록사머"는 한 블록의 PEO에 커플링된 한 블록의 폴리(프로필렌 옥사이드)에 커플링된 한 블록의 폴리(에틸렌 옥사이드)로 구성된, 즉, 식 EOa-POb-EOa의 구조의 선형 양친매성 블록 공중합체로, 여기서 EO는 에틸렌 옥사이드, PO는 프로필렌 옥사이드, a는 2~130의 정수, b는 15~67의 정수이다. 폴록사머는 일반적으로 3자리 식별자를 사용하여 명명되며, 처음 2자리에 100을 곱하면 PPO 함량의 대략적인 분자 질량이고, 마지막 자리에 10을 곱한 값은 PEO 함량의 대략적인 백분율을 나타내다.　예를 들어, "폴록사머 188"은 분자량 약 1800의 PPO 블록(약 31 PPO인 b에 해당)과 약 80%(w/w)의 PEO(약 82인 a에 해당)를 포함하는 중합체를 의미한다.　그러나, 값은 어느 정도 달라지는 것으로 알려져 있으며, 연구 등급 Lutrol® F68 및 임상 등급 Kolliphor® P188과 같은 상용 제품은 - 생산자의 데이터 시트에 따르면 둘 다 Poloxamer 188임 - 분자량에 있어 큰 변화를 나타내고 (7,680에서 9,510 사이), 이들 특정 제품에 제공된 a와 b의 값은 각각 약 79와 28인 것으로 표시된다. 이는 블록 공중합체의 이질적인 특징을 반영하며, 이는 a와 b의 값이 최종 제제에서 발견되는 평균임을 의미한다.
"폴록사민" 또는 "순차적 폴록사민"(Tetronic®이라는 상표명으로 시판됨)은 PEO-PPO-아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 모이어티 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PEO-PPO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다. 역 폴록사민도 마찬가지로, PPO-PEO 아암(arm)에 포함된 유리 OH 그룹과 에틸렌디아민 내 1차 아민 그룹 사이의 결합을 통해, 중앙의 에틸렌디아민 모이어티에 연결되는 4개의 PPO-PEO 아암을 보유하는 X자-형 블록 공중합체이다.
바람직한 양친매성 블록 공중합체는 폴록사머 또는 폴록사민이다.　바람직한 것은 폴록사머 407 및 188, 특히 폴록사머 188이다. 바람직한 폴록사민은 화학식 (PEO-PPO)4-ED의 순차적 폴록사민이다.　특히 바람직한 폴록사민은 각각 등록 상표 Tetronic® 904, 704 및 304로 시판되는 것들이다.　이들 폴록사민의 특징은 다음과 같다: Tetronic® 904는 총 평균 분자량이 6700이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 4020이며 PEO 비율이 약 40%이다.　Tetronic® 704는 총 평균 분자량이 5500이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 3300이며 PEO 백분율이 약 40%이며;　Tetronic® 304는 총 평균 분자량이 1650이고 PPO 유닛의 총 평균 중량이 990이며 PEO 백분율이 약 40%이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 0.2% w/v 내지 20% w/v, 예를 들어 0.2% w/v 내지 18% w/v, 0.2% w/v 내지 16% w/v, 0.2% w/v 내지 14% w/v, 0.2% w/v 내지 12% w/v, 0.2% w/v 내지 10% w/v, 0.2% w/v 내지 8% w/v, 0.2% w/v 내지 6% w/v, 0.2% w/v 내지 4% w/v, 0.4% w/v 내지 18% w/v, 0.6% w/v 내지 18% w/v, 0.8% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 18% w/v, 2% w/v 내지 18% w/v, 1% w/v 내지 5% w/ v, 또는 2% w/v 내지 4% w/v의 양으로 포함한다. 0.5% w/v 내지 5% w/v 범위의 양이 특히 바람직하다.　다른 구현예에서, 약학적 조성물은 양친매성 블록 공중합체를 2% w/v 내지 5% w/v, 예컨대 약 3% w/v의 양으로 포함한다.
약학적 조성물은, 예를 들어 피내 또는 근육내 주사를 위한, 주사용 액체 제제와 같이 예컨대 대상체에게 투여하는데 적합한 임의의 투여 방식으로 제제화될 수 있다.
약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 비강내 또는 경구와 같은 점막 또는 상피 적용과 같이 대상체에게 투여하기에 적합한 임의의 방식으로 투여될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 근육내 또는 피내 주사에 의해 투여된다.
약학적 조성물 중 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드의 양은 약학적 조성물이 예방적 또는 치료적 치료를 위해 투여되는지 여부에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 벡터, 예컨대 DNA 플라스미드를 전형적으로 0.1 내지 10 mg, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 mg 또는 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg의 범위로 포함한다.
바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균된 약학적 조성물이다.
치료
본 개시내용의 일부 측면에서, 벡터, 예를 들어 DNA 플라스미드는 바람직하지 않은 면역 반응, 즉 면역 질환과 관련된 상태의 예방 또는 치료 치료, 예컨대 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환을 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 알레르기 질환을 앓고 있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 본 발명은 이식 거부반응이 있거나 그의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 동종항원 또응 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하되,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 한다.
전술한 치료 방법에서, 벡터는 좋기로는 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 투여된다. 이러한 양의 벡터는 1회 투여, 즉 1회 투여로, 또는 수회 투여로, 즉 반복 투여, 즉 일련의 투여로, 예를 들어 며칠, 몇 주, 몇 달 또는 몇 년에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여할 실제 용량은 치료가 예방적 치료인지 치료적 치료인지, 치료할 면역 질환의 중증도, 대상체의 연령, 체중, 성별, 병력, 기존 질환 및 일반적인 상태와 의료 전문가의 판단과 같은 매개변수에 따라 달라질 수 있다.
치료 방법에서, 벡터는 약학적 조성물의 형태로, 그리고 본원에 기술된 투여 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료 방법은 환자의 치료를 감독하는 임상의가 방법이 효과적이며 치료가 필요하다고 판단하는 한 계속될 수 있다.
치료 성공의 지표는 항원 특이적 조절 T 세포의 수준 증가, 항원 특이적 이펙터 T 세포의 수준 감소(및 조절 T 세포의 수준 증가), 이펙터 T 세포의 수준 감소, 항원 유닛/항원 유닛의 T 세포 에피토프로 자극시 ELISPOT의 T 세포 활성화의 수준 감소, 호염기구 활성화 테스트(BAT)에서 호염기구 활성화 수준 감소등을 포함하여 당업계에 알려져 있다.
마찬가지로 방사성알레르기 흡착 시험(RAST)을 사용하여 면역치료 작제물의 투여 전후에 대상체로부터 채취한 혈액 시료의 알레르겐 특이적 IgE 항체 수준을 비교할 수 있으며, 여기서 더 낮은 알레르겐 특이적 IgE 항체 수준은 성공적인 관용 유도를 나타낸다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 앓고 있거나, 이의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 한다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 앓고 있거나, 이의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하며, 여기서 상기 약제가 상기 대상체에게 투여된다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 앓고 있거나, 이의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환의 치료적 또는 예방적 치료에 사용시, 상기 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터의 용도가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환의 치료적 또는 예방적 치료를 위해, 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
또한, 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 앓고 있거나 상기 질환의 예방이 필요한 대상체에게 다음, 즉:
(a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산 서열; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터를 투여함으로써 상기 면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제가 본원에 개시되며,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것이다.
실시예
전술한 설명은 당업자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 다음 구현예는 단지 설명의 목적으로만 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 설명된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
실시예 1:
쥐과 수초 희돌기교세포 당단백질(MOG) 27-63을 인코딩하고 다음 요소/유닛을 추가로 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계 및 제조하였다.
요소/유닛 VB5049*
SEQ ID NO:3 		VB5052*
SEQ ID NO:4 		VB5051*
SEQ ID NO:5
신호 펩티드 쥐 Ig VH 신호 펩티드
SEQ ID NO:2 		천연 리더 서열 인간 CCL3L1
SEQ ID NO:13 		쥐 Ig VH 신호 펩티드
SEQ ID NO:2
표적화 유닛 쥐 CD205에 특이성을 갖는 scFv
SEQ ID NO: 15 		인간 CCL3L1
SEQ ID NO:14 		NA
이량체화 유닛 인간 IgG3의 힌지 영역 1
인간 IgG3의 힌지 영역 4
글리신-세린-링커
인간 IgG3 CH3 도메인
SEQ ID NO:1 		인간 IgG3의 힌지 영역 1
인간 IgG3의 힌지 영역 4
글리신-세린-링커
인간 IgG3 CH3 도메인
SEQ ID NO:1 		NA
유닛 링커 글리신-류신 링커
SEQ ID NO: 3의 아미노산 410-414 		글리신-류신 링커
SEQ ID NO: 3의 아미노산 410-414 		NA
항원 유닛 쥐과 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG) 27-63*
SEQ ID NO:16
공동발현 요소 T2A 펩티드
SEQ ID NO:6 		NA NA
면역억제 화합물용 신호 펩티드 천연 리더 서열 쥐 IL-10
SEQ ID NO:17 		NA NA
면역억제
화합물 		쥐 IL-10
SEQ ID NO:18 		NA NA
표 4*MOG(27-63) 서열은 Krienke et al., Science 371, 145-153, 2021로부터 구득하였다.
미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG)은 중추신경계에서 발현되는 단백질이다. 상기 기술된 DNA 벡터의 항원 유닛에 포함된 MOG(27-63) 서열은 MOG의 면역우세 35-55 T 세포 에피토프인 MOG(35-55)를 포함하며, 이는 다발성 경화증 동안 세포성 및 체액성 면역 반응 두 가지 모두의 주요 표적이다. MOG(35-55) 유발 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델이다.
이하에서, "m", "뮤린" 및 "마우스"는 상호교환적으로 사용되며, "h"와 인간은 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 따른 벡터인 DNA 벡터 VB5049*(SEQ ID NO: 3)는 상기 표 4에 언급된 바와 같은 표적화 유닛, 이량체화 유닛, 유닛 링커 및 항원 유닛 및 면역억제 화합물로서 IL-10을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 공동발현 요소 T2A의 존재로 인해, 제1 폴리펩티드와 면역억제 화합물은 별도의 분자로 발현된다.
DNA 벡터 VB5052*(SEQ ID NO: 4)는 면역원성 방식으로 APC를 표적으로 하는 것으로 알려진 인간 대식세포 염증성 단백질 알파 변이체 표적화 유닛(hCCL3L1, LD78β 또는 hMIP1α라고도 함)를 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하며, 이러한 표적화 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 이들이 투여되는 대상체에서 염증 유발(pro-inflammatory) 면역 반응을 유도할 것이다(예를 들어 WO 2011/161244 A1 참조). VB5052*는 VB5049*의 "염증 유발 버전"이며 본 발명의 작제물과의 비교를 위해 사용된다.
DNA 벡터 VB5051*(SEQ ID NO: 5)은 항원 유닛, 즉 MOG(27-63)만을 인코딩하는; 단일 단백질/펩티드이다. VB5051*은 본 발명의 작제물에 대한 비교를 위해 사용된다.
DNA 벡터 생산
본 실시예 섹션의 모든 DNA 벡터는 네덜란드 Genscript Biotech BV로부터 본 실시예 섹션의 표에 명시된 대로 서열을 주문하고 이를 DNA 플라스미드인 발현 벡터 pALD-CV77에 클로닝하여 생산되었다.
실시예 2:
이 연구의 목적은 포유동물 세포의 일시적 형질감염 후 DNA 벡터 VB5049* 및 VB5052*에 의해 인코딩된 단백질의 단백질 발현 및 분비를 특징화하는 것이었다.
HEK293 세포를 ATCC에서 구득하여 VB5049* 또는 VB5052* DNA 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 간략하게, 2x105개 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 포함된 24-웰 조직 인큐베이션 플레이트에 플레이팅하고 Lipofectamine® 2000 시약(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 각각의 DNA 벡터 1μg으로 형질감염시켰다. 이어서, 형질감염된 세포를 5% CO2, 37℃에서 5일 동안 유지한 후, hIgG CH3 도메인 (검출 항체, 100 μl/well, 0.1 μg/ml 마우스 항인간 IgG Fc 2차 항체, biotin (05-4240, Invitrogen)) 및 MOG (포획항체, 100 μl/well, 0.25 μg/ml 마우스 항MOG 항체 (NYRMOG, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology))에 대한 항체를 사용하여 상등액의 샌드위치 ELISA에 의해 VB5049* 또는 VB5052*에 의해 인코딩된 분비 단백질의 특징화를 위해 세포 상등액을 수집하였다. 결과를 도 6A에 나타내었다.
VB5049*에 의해 인코딩된 IL-10의 분비는 쥐 IL-10에 대한 항체포획항체, 100 μl/well, 0.4 μg/ml 래트 항-마우스 IL-10 항체 (MAB417, R&D Systems), 검출 항체, 100 μl/well, 0.2 μg/ml 염소 항-마우스 IL-10 바이오티닐화 항체 (BAF417, R&D Systems))를 사용하여 샌드위치 ELISA로 측정되었다. 결과를 도 6B에 나타내었다.
VB5049*로부터 두 개의 별도 단백질인 제1 폴리펩티드와 IL-10의 분비는 쥐 MOG(포획항체, 100 ml/well, 0.25 μg/ml 마우스 항MOG 항체 (NYRMOG, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology) 및 쥐 IL-10 (검출 항체, 100 μl/웰, 0.2 μg/ml 염소 항-마우스 IL-10 바이오티닐화 항체 (BAF417, R&D Systems)에 대한 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 결과를 도 6C에 나타내었다.
VB5052*에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드의 분비는 hIgG CH3 도메인에 대한 항체(포획 항체, 100μl/웰, 1μg/ml, 마우스 항-인간 IgG(CH3 도메인), 153272, Biorad) 및 hCCL3L1(검출 항체, 100μl/웰, 0.2μg/ml, 염소 항-인간 CCL3L1 비오틴 항체)에 대한 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 도 6D에 나타내었다.
도 6A(포획 항체: 항-MOG 항체, 검출 항체: 항-hIgG CH3 도메인 항체) 및 6D(포획 항체: 항-hIgG CH3 도메인, 검출 항체: 항-인간 CCL3L1) 로부터 명백한 바와 같이, VB5049* 및 VB5052*에 의해 각각 인코딩된 두 개의 제1 폴리펩티드는 모두 높은 수준으로 분비되었다.
도 6B는 희석되지 않은 상등액의 IL-10 분비 수준을 보여준다. 상등액의 희석 곡선과 재조합 IL-10의 희석 곡선을 비교함으로써 상등액의 분비 수준은 2.25μg/ml인 것으로 추정되었다.
도 6C는 포획 항체로서 항-MOG 항체 및 검출 항체로서 항-쥐 IL-10 항체를 사용하여 얻은 ELISA 결과를 보여준다. 예상한 대로 VB5049*는 매우 약한 신호를 제공하여 T2A 펩티드의 존재로 인해 제1 폴리펩티드와 IL-10이 두 개의 별도 분자로 발현된다는 것을 확인하였다.
도 6A-D에 도시된 결과는 DNA 벡터 VB5049* 및 VB5052*에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질(표적 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함함)이 형질감염된 세포로부터 분비되고, VB5049*의 경우, IL-10 역시도 별도의 단백질로 발현되고 분비되었음을 보여준다.
발현된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 웨스턴 블롯(WB) 분석을 수행하였다. 간략하게 설명하면, Expi293F 세포(3x106 세포/ml, 1.6ml)를 6웰 인큐베이션 플레이트에 접종하였다. 엑스피펙타민 293 Reagent(Thermo Fisher Sci.)를 사용하여 세포를 1μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터(8% CO2, 37℃) 내 오비탈 진탕기(직경 19mm, 125rpm)에서 인큐베이션하였다. 18시간 인큐베이션 후 엑스피펙타민 293 Transfection Enhancer(Thermo Fisher Sci.)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 28시간 동안 인큐베이션한 후 상등액을 수집하였다.
샘플은 환원 및 비환원 조건용으로 각각 7.5μl DTT(Thermo Fisher Sci.) 또는 7.5μl 초순수와 함께 37.5μl 4x Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)과 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 105μl를 혼합하여 준비되었다. 샘플(환원 또는 비환원)을 70℃에서 10분 동안 가열한 후 10 μl를 4%~20% Criterion TGX Stain-Free 프리캐스트 젤(Bio-Rad)에 첨가하였다. Precision Plus Protein All Blue Prestained 단백질 표준품(Bio-Rad)을 사용하여 1x Tris/Glycine/SDS 실행 완충액(Bio-Rad)에서 SDS-PAGE를 수행하였다. Tran-Blot Turbo 반건식 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 단백질을 겔에서 EtOH 활성화 저형광(LF) 0.45μm PVDF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. PVDF 막을 EveryBlot 완충액(Bio-Rad)에서 5분 동안 차단하고 마우스 항-MOG(sc-73330, Santa Cruz Biotechnology) 및 래트 항-마우스 IL-10 항체(MAB417, R&D 시스템)로 프로빙하여 첫 제1 폴리펩티드/이량체 단백질 및 IL-10을 각각 검출하였다. 막을 형광색소가 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하고 건조시켰다. ChemiDoc™ MP 이미징 시스템(Dylight 488 및 800, 자동 최적 설정)을 사용하여 이미지를 획득하였다.
도 7A 및 7B는 VB5049* 및 VB5052*에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질과 VB5049*에 의해 인코딩된 IL-10의 성공적인 발현 및 분비를 보여준다.
도 7A는 VB5052* 및 VB5049*에 의해 발현되고 형질감염된 세포에서 분비되고 환원 및 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에서 실행된 단백질이 검출될 수 있음을 보여준다. 막을 마우스 항-쥐 MOG로 프로빙하였다. 환원 조건에서 VB5052*에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 단량체(31 kDa)로 검출되는 반면, 비환원 조건에서는 단량체(31 kDa, 제1 폴리펩티드)와 이량체(61 kDa, 이량체 단백질)로 검출되었다. 환원 조건에서는 VB5049*에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드가 단량체(51 kDa)로 검출된 반면, 비환원 조건에서는 단량체(51 kDa, 제1 폴리펩티드)와 이량체(101 kDa, 이량체 단백질)로 검출되었다.
도 7B는 IL-10(18kDa)의 검출을 보여준다. 71 kDa의 단백질은 검출되지 않았으며, 이는 IL-10이 VB5049*에서 별도의 단백질로 발현되었음을 확인시켜 준다.
종합하면, ELISA 및 웨스턴 블롯 데이터는 공동발현 요소로서 T2A 펩티드를 사용함으로써 무손상 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이 DNA 벡터로부터 mIL10과 함께 공동발현될 수 있음을 입증한다.
실시예 3:
VB5049*의 관용 유발 능력은 IL-10(면역 관용과 관련된 항염증 사이토카인)과 IFN-γ(염증성 면역 반응을 유도하는 마커)를 측정하여 IL-10/IFN-γ 비율을 계산하여 결정하였다. 이 비율은 VB5049*에 의해 유도된 면역 반응의 확장이 어느 정도까지 관용원성 프로파일 쪽으로 치우쳐 있는지를 보여준다.
다음 연구 설계가 적용되었다:
6주령 암컷 C57BL/6 마우스를 Janvier Labs(프랑스)에서 구입하였다. 모든 동물은 Radium Hospital(노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 노르웨이 식품 안전청(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. VB5049*, VB5052* 및 VB5051* 테스트에는 그룹당 5마리의 마우스가 사용되었으며, 음성 대조군(PBS 단독)에는 그룹당 2마리의 마우스가 사용되었다. VB5052*는 VB5049*의 염증 유발 버전이며 VB5049*에 대한 비교를 위해 포함되었다. VB5049*의 염증 유발 버전인 VB5052*는 IFN-γ 생산을 유도할 것으로 예상된다. VB5051*은 VB5049*와의 비교 대상으로 포함되었다.
멸균 PBS에 용해된 각 DNA 벡터 50μg을 각 경골근 내부에 근육내 바늘 주사(2 x 25μl, 1000μg/ml)로 1회 투여한 후 AgilePulse 생체내 전기천공 시스템(BTX, USA)을 사용하여 전기천공하였다.
투여 7일 후 비장을 수집하고 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 적혈구는 염화암모늄-칼륨(ACK) 용해 완충액을 사용하여 용해되었다. 세척 후, NucleoCounter NC-202(ChemoMetec, 덴마크)를 사용하여 비장세포를 계수하고, 6x106 세포/ml의 최종 농도로 재현탁하고, 96웰 IFN-γ/IL-10 이중 색상 FluoroSpot 플레이트에 6x105 세포/웰로 접종하였다. 그런 다음 제조사의 프로토콜(Mabtech AB, 스웨덴)에 따라 이중 색상 FluoroSpot에서 IFN-γ 및 IL-10 사이토카인 생산을 테스트하기 전에 비장 세포를 16.67μg/ml MOG(35-55) 펩티드로 44시간 동안 재자극하였다. 스팟 형성 세포는 IRIS FluoroSpot 및 ELISpot 플레이트 판독기(Mabtech AB)에서 측정하고 Apex 소프트웨어(Mabtech AB)를 사용하여 분석하였다. 결과는 IL-10+ 또는 IFN- γ + 스팟/106 비장세포의 3중 평균 수로 표시된다.
도 8에서 볼 수 있듯이, VB5049*로 얻은 IL-10/IFN-γ의 비율이 높으며, 이는 VB5049*가 염증성 사이토카인 IFN-γ보다 훨씬 더 높은 수준의 면역억제 사이토카인 IL-10을 유도함을 나타낸다. 이는 IL-10/IFN-γ 비율이 약 1인 VB5052*의 경우에는 해당되지 않으며, 이는 두 사이토카인이 MOG(35-55) 펩티드로 재자극한 후 동일한 수준으로 생성되었음을 나타낸다.
DNA 벡터를 투여한 마우스로부터 얻은 전체 비장세포도 다색 유세포 계측법으로 분석하였다. 간략하게, 세포를 MOG(35-55) 펩티드로 16시간 동안 재자극한 후 수확하고 계수하였다. 샘플당 2x106 개의 세포를 유세포 계측법에 사용하였다. 먼저 세포를 고정 가능한 생존 염료 (eFluor780)로 암실의 실온에서 10분 동안 염색하였다. 그 후, 세포를 1x PBS(원심분리(400g/10분/4℃))에서 세척하고 표면 염색 항체(Ab) 혼합물(항-CD3 BUV395, 항-CD4 BV785 및 항-CD8)과 함께 4℃ 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 세포 펠렛을 유동 완충액(PBS, 10% FBS 및 2mM EDTA)에 재현탁시켰다. 그런 다음 세포를 고정하고 암실에서 4℃에서 45~60분 동안 투과화하였다(eBioscience™ Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트). 이어서, 세포를 1x 투과화 완충액으로 세척하고 이전에 설명한 대로 원심분리한 다음 세포 펠릿을 세포내 염색 Ab 혼합물(항-IFN-γ APC, 항-IL-17 Alexa 플루오르 488, BV421, 항-Foxp3 PE)에 재현탁시켰다. 세포를 세포내 염색 Ab 혼합물과 함께 4℃ 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 세척하고 BD Symphony A5 유세포 계측기에서 유세포 계측법을 수행할 때까지 유세포 완충액에 재현탁시켰다. 형광색소 접합 Ab에 대해서는 단일 염색 Ultra comp eBead를 사용하고 고정 가능한 생존 염료에 대해서는 ArC 반응성 비드를 사용하여 보상을 설정하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 유세포 계측법 파일을 분석하였다.
IFN-γ와 IL-17은 두 가지 모두 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 및 다발성 경화증을 비롯한 만성 염증성 및 자가면역 질환의 발병에 기여하는 염증 유발 사이토카인이다. 따라서 관용 유도 작제물은 자가 항원 면역 반응을 부주의하게 감작시킴이 없이, 예를 들어 자가면역을 악화시킬 수 있는 염증 유발 사이토카인을 유도함으로써 관용을 확실하게 유도해야 한다.
도 9A 및 9B는 FluoroSpot 분석에서 관찰된 바와 같이 VB5049* 투여 시 IFN-γ 생산의 부족이 유세포 계측법을 통해 확인되었음을 보여준다. 더욱이, 유세포 계측법을 통해 VB5049*가 IL-17 생산을 유도하지 않는다는 사실도 입증되었다. 반대로, 염증 유발 VB5052*의 투여는 예상한 대로 IFN-γ 및 IL-17의 생성을 유도하였다. VB5051* 투여는 비장세포에서 일부 IFN-γ를 유도하였으나, IL-17의 수준은 매우 낮았다.
MOG 특이적 조절 T 세포(Treg), 즉 MOG 특이적 염증성 면역 반응을 억제 및 조절하여 자가 관용을 유지하는 T 세포의 생성은 MOG 특이적 사량체 염색 및 유세포 계측법(CD4+ MOG(35-55)-tet+Foxp3+ 세포)에 의해 확인되었다.
간략하게, 각 그룹으로부터 모아진 1 내지 2x106 개의 비장세포를 96웰 V 바닥 플레이트로 옮겼다. 사량체와 항체는 사용 전에 5% FBS가 포함된 PBS에 희석하고 빛으로부터 보호하였다. 세포 세척이 필요한 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 5% FBS가 포함된 PBS를 사용하여 수행되었다. 먼저, 세포를 제조업체 지침에 따라 MOG(35-55)에 특이적인 T-Select MHC 클래스 II 테트라머(웰당 10μl, H-2 IAb MOG(35-55) 테트라머-PE, TS-M704-1, MBL International Corporation) 또는 MOG(38-49)에 특이적인 ProT2® MHC 클래스 II 테트라머(1μg/ml, H-2 IAb - GWYRSPFSRVVH - ProT2® Tetramer PE, 2958, Proimmune)로 염색하였다. 세포를 세척하지 않고 FC 수용체를 얼음 위에서 5분 동안 차단하여 Fc 수용체(0.25μg/ml, TruStain FcX™ PLUS(항-마우스 CD16/32) 항체, 156604, BioLegend)에 대한 유세포 계측법 항체(Ab)의 비특이적 결합을 방지하였다. 세척하지 않고, 세포를 항-마우스 CD8 PE-Cy7 (0.25 μg/ml, Clone: 53-6.7, 100721, BD Biosciences), 항-마우스 CD4 eFluor450 (0.25 μg/ml, Clone: GK1.5, 48-0041-82, Thermo Fischer/eBioscience) 및 항-마우스 CD25 PerCP-Cy5.5 (0.25 μg/ml, Clone: PC61, 102030, BioLegend)를 함유하는 표면 Ab 칵테일로 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 다음으로, 세포를 고정성 생존 염료(웰당 150μl, PBS에 1:8000 희석, Fixable Viability Stain 780, 565388, BD biosciences)로 얼음 위에서 10분간 염색하였다. 세포를 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척하고 제조업체 지침(웰당 200μl, 00-5523-00, Thermo Fischer/eBioscience)에 따라 Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트를 사용하여 고정 및 투과화하였다. 세포를 세척하고 Anti-Mouse FOXP3 eFluor 660(0.25μg/ml, Clone: FJK-16s, 50-5773-82, Thermo Fischer/eBioscience) 및 Anti-Mouse Ki-67 Alexa Fluor 488(0.25μg/ml, 클론: 클론: 11F6, 151204, BioLegend)가 포함된 세포내 Ab 칵테일을 사용하여 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. 세포를 두 번 세척하고 5% FBS가 포함된 PBS 200μl에 재현탁한 후 BD FACSymphony™ A3 세포 분석기로 분석하였다. FlowJo™ v10.8 소프트웨어(BD Life Sciences)를 사용하여 원하는 모집단을 게이팅하기 위한 가이드로서 다음 대조군들을 사용하였다: 염색되지 않은 대조군(세포는 Ab로 처리되지 않음) 및 Fluorescence Minus One(FMO) 대조군(게이트될 하나의 형광단을 빼고, 본원에 사용된 모든 형광단-표지된 Ab로 염색된 샘플).
도 10에 도시된 k와 같이, VB5052* 및 VB5051*에 비해 VB5049*를 단일 투여한 후 더 높은 비율의 MOG(35-55) 특이적 Foxp3+ 세포가 검출되었다. VB5052*의 경우, 관찰된 MOG 특이적 Treg는 VB5052*에 의해 유발된 염증성 면역 반응에 대한 자연적인 피드백 루프의 결과이다(실시예 5에서 더 자세히 논의됨).
따라서 실시예 3은 VB5049*가 더 높은 항염성 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)을 유도하고 염증 유발 대조군 작제물 VB5052*와 비교하여 염증성 IFN-γ 생산의 부족을 나타냄을 보여준다. 실시예 3은 VB5049*가 VB5052* 또는 VB5051*에 비해 더 많은 수의 MOG(35-55)-특이적 Foxp3+ 세포를 유도한다는 것을 추가로 보여준다. 종합적으로, 이들 결과는 VB5049*의 투여가 VB5051* 및 VB5052*의 투여에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도했음을 나타낸다.
실시예 4
MOG(27-63)를 인코딩하고 추가로 다음 요소/유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계 및 제조하였다.
요소/유닛 VB5062
SEQ ID NO:20 		VB5063
SEQ ID NO:21 		VB5064
SEQ ID NO:22
VB5065
SEQ ID NO:23 		VB5048
SEQ ID NO:35
신호
펩티드 		표 4와 같음
표적화
유닛 		표 4와 같음
이량체화 유닛 표 4와 같음
유닛 링커 표 4와 같음
항원 유닛 MOG (27-63)SEQ ID NO:19
공동발현 요소 T2A 펩티드
SEQ ID NO:6 		NA
면역억제 화합물용 신호 펩티드 천연 리더 서열
쥐 TGF-β1
SEQ ID NO:24 		천연 리더 서열 쥐 CTLA-4
SEQ ID NO:26 		천연 리더 서열 쥐 IL-2
SEQ ID NO:28 		천연 리더 서열 쥐 IFN-γ
SEQ ID NO:30 		NA
면역억제 화합물 쥐 TGF-β1SEQ ID NO:25 쥐 CTLA-4 세포외 도메인
SEQ ID NO:27 		쥐 IL-2
SEQ ID NO:29 		쥐 IFN-γ
SEQ ID NO:31 		NA
또한, DNA 벡터 VB5049(SEQ ID NO: 32), VB5052(SEQ ID NO: 33) 및 VB501(SEQ ID NO: 34)을 설계하여 제작하였다. 이는 VB5049*, VB5052* 및 VB501*(표 4)과 동일하지만, MOG(27-63)*을 인코딩하는 SEQ ID NO:16의 뉴클레오티드 서열 대신 MOG(27-63)를 인코딩하는SEQ ID NO: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
DNA 벡터 VB5049, VB5052 및 VB5062-VB5065는 MOG(27-63)를 갖는 항원 유닛을 포함하는 동일한 제1 폴리펩티드를 코딩한다:
● VB5049는 별도의 분자로 표현되는 mIL-10을 추가로 인코딩한다.
● VB5062는 별도의 분자로 표현되는 mTGF-β1을 추가로 인코딩한다.
● VB5063은 별도의 분자로 발현되는 mCTLA-4의 세포외 도메인을 추가로 인코딩한다.
● VB5064는 별도의 분자로 표현되는 mIL-2를 추가로 인코딩한다.
● VB5065는 별도의 분자로 표현되는 mIFN-γ를 추가로 인코딩한다.
● VB5048은 제1 폴리펩티드만 인코딩하고 면역억제 화합물은 인코딩하지 않는다. 이는 본 발명의 벡터에 대한 비교 역할을 한다.
● VB5052는 앞서 나열된 DNA 벡터의 "염증 유발" 버전이며 본 발명의 벡터에 대한 비교 역할을 한다.
● VB5051은 MOG(27-63)만을 인코딩하고 본 발명의 벡터에 대한 비교 역할을 한다.
DNA 벡터에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비의 특징 분석
VB5049, VB5052, VB5062, VB5063, VB5064 및 VB5065에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비는 다음과 같이 특징화되었다:
간략하게 설명하면, Expi293F 세포(1.7x106 세포/ml, 1ml)를 96웰 인큐베이션 플레이트에 접종하였다. 엑스피펙타민 293 Reagent(Thermo Fisher Sci.)를 사용하여 세포를 0.64μg/ml 플라스미드 DNA로 형질감염시키고, 플레이트를 가습된 CO2 세포 인큐베이터(8% CO2, 37℃) 내 오비탈 진탕기(직경 3mm, 900rpm)에서 인큐베이션하였다. 형질감염 72시간 후에 상등액을 수집하였다.
분비된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 MOG (포획 항체, 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology) 및 hIgG CH3 도메인 (검출 항체, 마우스 항인간 IgG Fc 2차 항체, 비오틴, 0.1 μg/ml, 100 μl/웰, 05-4240, Invitrogen)에 대한 항체를 사용하여 상등액의 샌드위치 ELISA에서 특징화되었다. CH3 도메인(검출 항체, 마우스 항-인간 IgG Fc 2차 항체, 비오틴, 0.1μg/ml, 100μl/웰, 05-4240, Invitrogen). 도 11에 나타낸 바와 같이, 모든 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 고도로 발현되고 분비되었다.
y인코딩된 면역억제 화합물인 mIL-10, mTGF-β1, mCTLA-4, mIL-2 및 mIFN-γ의 발현 및 분비는 각각 mIL-10, hTGF-β1 (mTGF-β1에도 결합함), mCTLA-4, mIL-2 및 mIFN-γ에 대한 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 특징화되었다. 결과를 도 12A-12E에 나타내었다.
다음 항체가 사용되었다.
(A) 포획 항체: 1 μg/ml 래트 항-쥐 IL-10 항체, 100 μl /웰, MAB417, R&D Systems. 검출 항체: 0.2 μg/ml, 염소 항-쥐 IL-10 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems.
(B) 포획 항체: 2 μg /ml TGF-β 1 항체, 100 μl /웰, MAB2402, RD Systems. 검출 항체: 0.8 μg/ml 닭 항-인간 TGF-β1 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, BAF240, RD Systems.
(C) 포획 항체: 0.8 μg/ml 염소 항-쥐 CTLA-4 항체, 100 μl /웰, AF476, RD Systems. 검출 항체: 0.8 μg/ml 염소 항-쥐 CTLA-4 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, BAF476, RD Systems.
(D) 포획 항체: 2 μg/ml 래트 항-쥐 IL-2 항체, 100 μl /웰, 503701, BioLegend. 검출 항체: 2 μg/ml 래트 항-쥐 IL-2 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, 503803, BioLegend.
(E) 포획 항체: 2 μg/ml 래트 항-쥐 IFN-γ 항체, 100 μl /웰, 505802, BioLegend. 검출 항체: 2 μg/ml 래트 항-쥐 IFN-γ 바이오티닐화 항체, 100 μl /웰, 505704, BioLegend.
도 12A-E에 도시된 바와 같이, 5가지 면역억제 화합물 모두 각각의 벡터로부터 발현되고 분비되었다.
제1 폴리펩티드/이량체 단백질과 개별 단백질로서의 면역억제 화합물의 발현 및 분비는 각각 MOG 및 면역억제 화합물 mIL-10, mTGF-β1, mCTLA-4 및 mIL-2에 대한 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 검증되었다. 결과는 도 13A-13D에 나타나 있다.
다음 항체가 사용되었다.
포획 항체: 마우스 항-MOG 항체, 0.25 μg/ml, 100 μl/웰, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology. 검출 항체:
(A) 0.2 μg/ml 염소 항마우스 항IL-10 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF417, R&D Systems.
(B) 0.8 μg/ml 닭 항-인간 TGF-β1 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF240, RD Systems.
(C) 0.8 μg/ml 염소 항마우스 CTLA-4 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, BAF476, RD Systems.
(D) 2 μg/ml 래트 항마우스 IFN-γ 바이오티닐화 항체, 100 μl/웰, 505704, BioLegend
도 13A-D에 도시된 바와 같이, 제1 폴리펩티드와 면역억제 화합물은 융합 단백질로 발현되지 않고 별도의 분자로 발현 및 분비된다.
DNA 벡터에서 발현된 무손상 단백질의 특징 분석
VB5049, VB5062, VB5063 및 VB5064에 의해 인코딩된 단백질(동일한 제1 폴리펩티드를 코딩하지만 상이한 면역억제 화합물을 코딩함)을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액 샘플에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 앞서 언급한 DNA 벡터와 동일한 제1 폴리펩티드를 코딩하지만 면역억제 화합물은 없는 VB5048이 비교 대상으로 포함되었다.
샘플은 환원 및 비환원 조건을 위해 각각 1μl DTT(Cayman Chemical) 또는 1μl 초순수와 5μl 4x Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad)을 가진 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액 14μl를 혼합하여 준비되었다(주어진 비율로 총 샘플량의 규모를 늘린다). 샘플(환원 또는 비환원)을 70℃에서 10분간 가열한 후 4%~20% Criterion TGX Stain-Free 프리캐스트 젤(Bio-Rad)에 추가하였다. SDS-PAGE는 Precision Plus Protein All Blue Prestained 단백질 표준품(Bio-Rad)을 사용하여 1x Tris/Glycine/SDS 실행 완충액(Bio-Rad)에서 수행되었다. Trans-Blot Turbo 반건식 전달 시스템(Bio -Rad)을 사용하여 단백질을 겔에서 EtOH 활성화 저형광(LF) 0.45μm PVDF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. PVDF 막을 EveryBlot 완충액(Bio-Rad)에서 5분 동안 차단하고 마우스 항-MOG (sc-73330, Santa Cruz Biotechnology), 래트 항-쥐 IL-10 (MAB417, R&D Systems), 염소 항-쥐 CTLA-4 (AF467, R&D Systems) or 래트 항-쥐 IL-2 (503702)로 프로빙하여 각각 MOG, mIL-10, mCTLA-4 또는 mIL-2를 검출하였다. 막을 형광 색소가 결합된 종 특이적 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음 세척하고 건조하였다. Dylight 채널 488에서 mIL10 검출을 위해 막을 Dylight-488 2차 항체로 다시 프로빙하였다. 막을 에탄올 및 TBST에서 재활성화하였다. 막을 차단하고 Dylight 488이 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세척하고 건조하였다. ChemiDoc™ MP 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득하였다. 결과는 도 14에 나와 있다.
웨스턴 블롯 분석은 ELISA 결과를 확인하여 VB5049, VB5062, VB5063 및 VB5064가 2개의 단백질, 즉 제1 폴리펩티드/이량체 단백질(도 14A 및 B, 환원 및 비환원 조건)과 두 번째 단백질로서 면역억제 화합물, 즉, mIL-10(도 14C), mCTLA-4(도 14D) 또는 mIL-2(도 14E)을 발현함을 입증하였다. 중요한 것은 항-IL-10, 항-CTLA-4 및 항-IL-2 프로브 막에 대해 추가 밴드가 관찰되지 않았다는 것인데 이는 T2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하여 제1 폴리펩티드와 면역억제 화합물이 단일 DNA 플라스미드로부터 분리 단백질로서 발현되었음을 가리킨다.
종합하면, ELISA 및 웨스턴 블롯 데이터는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 무손상 이량체 단백질이 공동발현 요소로서 T2A 펩티드를 사용하여 면역억제 화합물과 함께 DNA 플라스미드로부터 공동발현될 수 있음을 입증한다.
벡터 VB5051로부터 MOG(27-63) 펩티드의 발현 및 분비의 특징화
벡터 VB5051에 의해 인코딩된 MOG(27-63)의 단백질 발현 및 분비는 본 실시예 4에서 이전에 기술된 바와 같이 결정되었다.
MOG(27-63) 펩티드의 분비는 상등액 코팅 및 MOG에 대한 항체(포획 항체, 100 μl/웰, 3.3 μg/ml 마우스 항-MOG 항체, sc-73330, Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 직접 ELISA에 의해 특징화하였다. 도 15는 MOG(27-63) 펩티드가 VB5051로부터 발현되고 상기 벡터로 형질감염된 포유동물 세포로부터 분비된다는 것을 보여준다.
실시예 5:
VB5049의 관용 유도 능력을 VB5049(실시예 4 참조)를 투여한 마우스의 비장에서 평가하고 MOG(35-55) 펩티드로 재자극하고 CD4+Foxp3+ T 세포를 검출한 후 이중 색상 FluoroSpot 분석에서 생성된 IL-10(면역 관용과 관련된 항염증 사이토카인) 및 IFN-γ(염증성 면역 반응을 유도하는 마커) 신호로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율에 의해 결정하였다. 또한, MS 병리학에 관여하는 것으로 알려진 두 가지 염증 유발 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-17 생산의 부재가 입증되었다. 얻은 결과를 VB5052 또는 VB5051 투여에 의해 유발된 반응과 비교하였다(이러한 벡터의 유닛/요소 및 설명은 실시예 4 참조).
적용된 연구 설계 및 방법은 실시예 3에서 얻은 결과를 검증하고 단일 투여 요법을 넘어 데이터를 추가로 확장하기 위해 VB5049의 경우 다른 투여 일정을 테스트한 것을 제외하고는 실시예 3의 VB5049*에 대해 설명된 것과 유사하였다.
간략히 설명하면, DNA 벡터 VB5049, VB5051 또는 VB5052 50μg을 근육 내로 4회(D0, D3, D7 및 D10) 투여한 후 전기천공을 실시하고, 첫 투여로부터 14일 후에 비장을 채취하였다. 비장을 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻고, 비장 세포를 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 동안 재자극하거나 재자극하지 않은 후 IFN-γ 및 IL-10 생산을 실시예 3에 설명된 대로 수행된 이중 색상 FluoroSpot 분석으로 테스트하였다.
도 16A에 도시된 바와 같이, VB5049, VB5051 또는 VB5052가 투여된 마우스로부터 수확된 재자극되지 않은 비장세포에서 IL-10의 일부 생성이 검출된 반면, IFN-γ의 낮은 배경 수준만이 관찰되었다. 비장세포의 MOG(35-55) 재자극 시, VB5049 또는 VB5051을 투여한 마우스 그룹에서는 유의미한 IFN-γ 생산이 검출되지 않았지만, 이에 비해 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포에서는 IFN-γ의 수준이 유의하게 증가한 것으로 나타났다(도 16B). 과도한 염증을 방지하고 궁극적으로 염증을 해결하려면 IFN-γ와 같은 염증 유발 사이토카인의 생성이 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 생성을 포함한 음성 피드백 메커니즘에 의해 조절되는 것이 중요하다(예를 들어 Sugimoto et al., Front Immunol. 2016, Vol.7, Article 160 참조). 따라서 VB5052에 반응하여 관찰된 IL-10의 수준 증가는 유도된 염증 반응을 조절하는 피드백 메커니즘으로 설명될 수 있다. 도 17에 도시된 바와 같이, VB5052에 비해 VB5049에서 상당히 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율이 검출되었으며, 이는 VB5052에 비해 VB5049의 더 높은 면역억제 잠재력을 나타낸다.
유세포 계측법을 통한 Foxp3, IFN-γ 및 IL-17 검출:
Foxp3을 발현하는 CD4+ T 세포의 존재는 유세포 계측법을 통해 비장세포 집단에서 확인되었다. CD4+Foxp3+ T 세포는 효과 T 세포와 염증성 면역 반응을 억제하여 자가 관용을 유지할 수 있다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 유세포 계측법을 수행하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, VB5051 투여에 비해 VB5049 투여에 대한 반응에서 더 높은 비율의 CD4+Foxp3+ T 세포가 검출되었으며, 이는 VB5051에 비해 VB5049에 의해 유도된 억제 T 세포의 수준이 더 높음을 나타낸다. 염증 유발 사이토카인 IFN-γ 및 IL-17은 각각 도 19A 및 19B에 도시된 바와 같이 VB5049 투여에 반응하여 유세포 계측법에 의해 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, 두 가지 염증 유발 사이토카인 모두가 염증 유발 비교 벡터 VB5052의 투여에 반응하여 검출되었다.
따라서 실시예 5는 항-DEC205 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 MOG(27-63)를 포함하는 항원을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 IL-10을 추가로 인코딩하는 VB5049의 투여가, MOG(27-63)만을 인코딩하는 VB5051의 투여에 비해 더 높은 항염증 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ) 가져온다는 것을 보여준다. 또한 VB5049를 투여하면 VB5051에 비해 염증성 IFN-γ 및 IL-17 사이토카인 생산이 부족하고 CD4+Foxp3+ T 세포의 비율이 더 높아진다. 전체적으로, 이들 결과는 VB5049가 그의 염증 유발 버전인 VB5052와는 대조적으로 항염증 방식으로 항원 단독(VB5051)에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 이들 결과는 또한 실시예 3의 결과를 검증하고 VB5049의 관용원성 특징이 마우스에 대한 반복 투여 후에도 보존된다는 것을 보여준다.
실시예 6:
VB5062의 관용 유도 능력을 VB5062가 투여된 마우스의 비장에서 평가하고(표 5/실시예 4 참조), MOG(35-55) 펩티드로 재자극한 후 이중 색상 FluoroSpot 분석에서 생성된 IL-10(면역 관용과 관련된 항염증 사이토카인) 및 IFN-γ(염증성 면역 반응을 유도하는 마커) 신호로부터 계산된 IL-10/IFN-γ 비율에 의해 구하고 MOG(38-49)-특이적 사량체를 사용하여 Foxp3+ MOG(38-49)-특이적 조절 T 세포(Treg)를 생체외에서 검출하였다. 얻은 결과를 VB5052에 의해 유도된 면역원성 및 VB5051의 관용 유도 능력과 비교하였다(이러한 벡터의 유닛/요소 및 설명에 대해서는 실시예 4 참조).
간략하게, 50μg의 DNA 벡터 VB5062, VB5051 또는 VB5052를 마우스(그룹당 5마리)에게 근육내로 투여한 후 전기천공을 실시하였다. 투여 7일 후 비장을 수확하고 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 실시예 3에 설명된 대로 수행된 이중 색상 FluoroSpot 분석에서 IFN-γ 및 IL-10의 생성에 대해 테스트하기 전에 비장세포를 MOG(35-55) 펩티드로 44시간 동안 재자극하거나 재자극하지 않았다.
도 20A에 도시된 바와 같이, VB5062, VB5051 또는 VB5052가 투여된 마우스로부터 수확된 재자극되지 않은 비장세포에서 IL-10 생성이 검출된 반면, IFN-γ는 낮은 배경 수준만이 관찰되었다. 비장세포의 MOG(35-55) 재자극 시, VB5062 또는 VB5051 그룹이 투여된 마우스 그룹에서는 유의미한 IFN-γ 생성이 검출되지 않았지만, 이에 비해 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포의 IFN-γ의 수준은 유의하게 증가한 것으로 나타났다(도 20B). VB5052에 대한 반응으로 관찰된 IL-10의 증가된 수준은 실시예 5에 기술된 바와 같이 유도된 염증 반응을 조절하기 위한 잠재적인 피드백 메커니즘에 의해 설명될 수 있다. 도 21에 도시된 바와 같이, 상당히 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율이 VB5052에 비해 VB5062에서 검출되었으며, 이는 VB5052에 비해 VB5062의 면역억제 가능능이 더 높다는 것을 나타낸다.
MOG(38-49) 사량체 염색 및 유세포 계측법은 실시예 3에 설명된 대로 수행되었다. 이중 색상 FluoroSpot 분석에서 VB5062 및 VB5051에 대해 유사한 IL-10 수준이 검출되었지만(도 20A-B), 도 22에 나타낸 바와 같이, 추가 단일 세포 분석 결과 VB5051을 투여한 마우스에 비해 VB5062를 투여한 마우스에서 CD4+MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포가증가된 백분율로 나타났다.
따라서 실시예 6은 항-DEC205 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 MOG(27-63)를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하고 면역억제 화합물 TGFβ1을 추가로 인코딩하는 VB5062의 투여가 더 높은 항염증 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)을 가져온다는 것을 보여준다. 더욱이, VB5062를 투여한 마우스의 비장세포는 염증 유발 버전 VB5052를 투여한 마우스에서 얻은 것과 비교하여 염증성 IFN-γ 사이토카인 생산이 결여된 것으로 나타났다. VB5062의 투여는 VB5051에 비해 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포를 유도하였다. 전체적으로, 이러한 결과는 VB5062가 그의 염증 유발 버전인 VB5052와는 반대로, 항염증 방식으로 항원 단독(VB5051)에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7:
VB5063의 관용 유도 능력을 측정하고 실시예 6에 설명된 대로 VB5052의 면역원성 및 VB5051의 관용 유도 능력(이들 벡터의 유닛/요소 및 설명은 표 5/실시예 4 참조)과 비교하였다.
도 23A에 도시된 바와 같이, VB5062, VB5051 또는 VB5052가 투여된 마우스로부터 수확된 재자극되지 않은 비장세포에서 IL-10의 생성이 검출된 반면, IFN-γ는 낮은 배경 수준으로만 관찰되었다. 비장세포의 MOG(35-55) 재자극 시, VB5063 또는 VB5051을 투여한 마우스 그룹에서는 유의미한 IFN-γ 생성이 검출되지 않았지만, 이에 비해 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포에서는 유의하게 높은 수준의 IFN-γ가 검출되었다(도 23B). VB5051을 투여한 마우스에서 검출된 수준과 비교하여 VB5063을 투여한 마우스에서 수확한 비자극 비장세포와 MOG(35-55)-재자극 비장세포 모두에서 유의하게 높은 IL-10 수준이 검출되었다. VB5052에 대한 반응으로 관찰된 IL-10의 증가된 수준은 실시예 5에 기술된 바와 같이 염증 반응을 조절하기 위한 잠재적인 피드백 메커니즘에 의해 설명될 수 있다. 도 24에 도시된 바와 같이, 상당히 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율이 VB5052에 비해 VB5063에서 검출되었으며, 이는 VB5052에 비해 VB5063의 면역억제 잠재력이 더 높다는 것을 나타낸다.
도 25에 도시된 바와 같이, VB5051에 비해 VB5063에 대한 반응에서 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포가 검출되었으며, 이는 VB5063 투여에 대한 반응에서 면역억제 Treg의 생성이 증가되었음을 나타낸다.
추가로, VB5063의 투여에 반응하여 유도된 활발하게 증식하는 Treg 세포의 백분율을 결정하기 위해, VB5063 또는 VB5051을 투여한 마우스로부터 수확한 비장세포에서 Ki67(분열 세포와 엄격하게 연관된 핵 마커)의 발현을 분석하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 집단 내의 Ki67+ 세포의 더 높은 백분율이 VB5051에 비해 VB5063을 투여한 마우스에서 생체외에서 검출되었다.
따라서 실시예 7은 항-DEC205 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 MOG(27-63)를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 면역억제 화합물 CTLA-4를 추가로 인코딩하는 VB5063을 투여하면 더 높은 항염증성 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)이 결과됨을 보여준다. 더욱이, VB5063을 투여한 마우스의 비장세포는 염증 유발 버전인 VB5052에 비해 염증성 IFN-γ 사이토카인 생산이 부족한 것으로 나타났다. 또한, VB5063은 VB5051에 비해 MOG(38-49) 특이적 Foxp3+ 및 CD4+CD5+Foxp3+Ki67+ 증식 Treg 세포 모두를 더 높은 비율로 유도하였다. 종합적으로, 이러한 결과는 VB5063이 그의 염증 유발 버전인 VB5052와는 반대로 항염증 방식으로 항원 단독(VB5051)에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8:
VB5064의 관용 유도 능력을 결정하고 실시예 6에 설명된 대로 VB5052의 면역원성 및 VB5051의 관용 유도 능력과 비교하였다(이러한 벡터의 유닛/요소 및 설명은 표 5/실시예 4 참조).
도 27A에 도시된 바와 같이, VB5064, VB5051 또는 VB5052가 투여된 마우스로부터 수확된 재자극되지 않은 비장세포에서 IL-10의 생산이 검출된 반면, IFN-γ의 낮은 배경 수준만이 관찰되었다. 비장세포의 MOG(35-55) 재자극 시, VB5064 또는 VB5051을 투여한 마우스 그룹에서는 유의미한 IFN-γ 생성이 검출되지 않았지만, 이에 비해 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포에서는 유의하게 높은 수준의 IFN-γ가 검출되었다(도 27B). VB5052에 대한 반응으로 관찰된 IL-10의 증가된 수준은 실시예 5에 기술된 바와 같이 염증 반응을 조절하는 잠재적인 피드백 메커니즘에 의해 설명될 수 있다. 도 28에 도시된 바와 같이, 유의하게 더 높은 IL-10/IFN-γ 비율이 VB5052에 비해 VB5064에서 검출되었으며, 이는 VB5052에 비해 VB5064의 면역억제 잠재력이 더 높다는 것을 나타낸다.
이중 색상 FluoroSpot 분석에서 VB5064 및 VB5051에 대해 유사한 IL-10 수준이 검출되었지만(도 27A-B), VB5051에 비해 VB5064에 반응하여 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포가 검출되었다(도 29).
추가로, VB5064의 투여에 반응하여 유도된 활발하게 증식하는 Treg 세포의 백분율을 결정하기 위해, VB5064 또는 VB5051을 투여한 마우스로부터 수확한 비장세포에서 Ki67(세포 분열과 엄격하게 연관된 핵 마커)의 발현을 분석하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 집단 내의 Ki67+ 세포의 더 높은 백분율이 VB5051에 비해 VB5064가 투여된 마우스의 비장세포에서 생체외에서 검출되었다.
실시예 8은 따라서 항-DEC205 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 MOG(27-63)를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 면역억제 화합물 IL-2를 인코딩하는 VB5064를 투여하면 더 높은 항염증성 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)이 결과됨을 보여준다. 더욱이, VB5064를 투여한 마우스의 비장세포는 염증 유발 버전 VB5052를 투여한 마우스에서 얻은 것과 비교하여 염증성 IFN-γ 사이토카인 생산이 부족한 것으로 나타났다. 또한, VB5064는 VB5051에 비해 MOG(38-49) 특이적 Foxp3+ 및 CD4+CD5+Foxp3+Ki67+ 증식 Treg 세포 모두의 더 높은 비율을 유도하였다. 종합적으로, 이러한 결과는 VB5064가 그의 염증 유발 버전인 VB5052와는 반대로 항염증 방식으로 항원 단독(VB5051)에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9
MOG(27-63)를 인코딩하고 추가로 다음 요소/유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계 및 제조하였다.
요소/유닛 VB5049
SEQ ID NO:32 		VB5044
SEQ ID NO: 36 		VB5054
SEQ ID NO:37
신호 펩티드 표 4와 같음
표적화 유닛 표 4와 같음
이량체화 유닛 표 4와 같음
유닛 링커 표 4와 같음
항원 유닛 MOG (27-63)SEQ ID NO:1 9
공동발현 요소 T2ASEQ ID NO:6
면역억제 화합물 1에 대한 신호 펩티드 마우스 IL-10의 천연 리더 서열 SEQ ID NO:17
면역억제 화합물 1 마우스 IL-10SEQ ID NO:18
공동발현 요소 NA P2A
SEQ ID NO:7
면역억제 화합물 2에 대한 신호 펩티드 NA 마우스 TGF-β1의 천연 리더 서열
SEQ ID NO:24
면역억제 화합물 2 NA 마우스 TGF-β1
SEQ ID NO:25
공동발현 요소 NA NA T2A
SEQ ID NO:6
면역억제 화합물 3에 대한 신호 펩티드 NA NA 마우스 GM-CSF의 천연 리더 서열
SEQ ID NO:3 8
면역억제 화합물 3 NA NA 마우스 GM-CSF
SEQ ID NO:3 9
DNA 벡터 VB5049, VB5044 및 VB5054는 MOG(27-63)를 갖는 항원 유닛을 포함하는 동일한 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 추가로 표 6에 나열된 공동발현 요소의 존재로 인해, 별도의 분자로 발현되는 다음의 면역억제 화합물을 코딩한다. :
● VB5049: mIL-10(웨스턴 블롯 분석에서 대조군 역할을 함)
● VB 5044: mIL-10 및 mTGF-β1
● VB 5054: mIL-10 및 mTGF-β1 및 mGM-CSF
DNA 벡터에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비의 특징 분석
VB5044 및 VB5054에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비는 실시예 4에 기술된 바와 같이 특징화되었다. 도 31에 도시된 바와 같이, 두 벡터로부터의 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 고도로 발현되고 분비되었다.
인코딩된 면역억제 화합물인 mIL-10, mTGF-β1 및 mGM-CSF의 발현 및 분비는 각각 mIL-10, hTGF-β1 및 mGM-CSF에 대한 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 특징화되었다. 결과는 도 32A-C에 나타나 있으며, 이는 VB5044 또는 VB5054에 의해 인코딩된 모든 면역억제 화합물이 발현되고 분비되었음을 보여준다. 벡터 VB5054에 의해 인코딩된 제3의 면역억제 화합물인 mGM-CSF도 고도로 발현되고 분비되었다(도 32C).
제1 폴리펩티드/이량체 단백질 및 별도의 단백질로서의 면역억제 화합물의 발현 및 분비는 MOG 및 면역억제 화합물 mIL-10, mTGF-β1 및 mGM-CSF에 대한 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검증되었다. 결과는 리보솜 스키핑 펩티드 T2A 및 P2A가 매우 효과적이며 모든 제1 폴리펩티드/이량체 단백질 및 면역억제 화합물이 별도의 단백질로 발현되고 분비되었음을 보여준다(도 33A-C).
웨스턴 블롯을 통해 VB5044 및 VB5054에서 발현된 무손상 단백질의 특징 분석
VB5044 및 VB5054에 의해 인코딩된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대해 웨스턴 블롯(WB) 분석을 수행하였다. 동일한 제1 폴리펩티드와 면역억제 화합물 IL-10을 인코딩하는 VB5049가 대조군으로 포함되었다.
WB는 실시예 4에 설명된 대로 수행되었다. PVDF 막을 마우스 항-MOG(sc-73330, Santa Cruz Biotechnology), 래트 항-쥐 IL-10(MAB417, R&D Systems), 토끼 항-TGFβ1(USB1042777-Biotin, United States Biological) 또는 염소 항-쥐 GM-CSF(BAF415, R&D Systems)를 사용하여 프로빙하여 각각 제1 폴리펩티드/이량체 단백질인 mIL-10, mTGF-β1 및 mGM-CSF를 검출한다. 결과는 도 34A-E에 제시되어 있다.
WB 분석은 ELISA 결과를 확인하여 VB5044 및 VB5054가 각각 3개 및 4개의 단백질을 발현함을 입증하였다: 제1 폴리펩티드/이량체 단백질(도 34A 및 B, 환원 및 비환원 조건) 및 2개 또는 3개의 면역억제 화합물, 즉 mIL- 10(도 34C), mTGF-β1(도 34D) 및 mGM-CSF(도 34E). 중요한 것은 항-IL-10, 항-TGF-β1 및 항-GM-CSF 프로브 막에 대해 추가 밴드가 관찰되지 않았다는 것인데, 이는 2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하며 제1 폴리펩티드와 면역억제 화합물이 단일 DNA 플라스미드로부터 별도의 단백질로서 발현되었음을 나타낸다.
종합하면, ELISA 및 WB 데이터는 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 무손상 이량체 단백질이, 공동발현 요소로 다양한 2A 펩티드를 사용하여 여러 면역억제 화합물과 함께 DNA 벡터에서 공동발현될 수 있음을 보여준다.
실시예 10
MOG(27-63)를 인코딩하고 추가로 다음 요소/유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계 및 제조하였다.
요소/유닛 VB5068
SEQ ID NO:40 		VB5069
SEQ ID NO:41 		VB5070
SEQ ID NO: 42
신호 펩티드 마우스 SCGB3A2의 천연 리더 서열
SEQ ID NO:43 		마우스 VSIG-3의 천연 리더 서열
SEQ ID NO:45 		마우스 PD-1의 천연 리더 서열
SEQ ID NO:47
표적화 유닛 마우스 SCGB3A2SEQ ID NO: 44 마우스 VSIG-3
세포외 도메인
SEQ ID NO:46 		마우스 PD-1
세포외 도메인
SEQ ID NO:48
이량체화 유닛 표 4와 같음
유닛 링커 표 4와 같음
항원 유닛 MOG (27-63)SEQ ID NO:19
공동발현 요소 T2A 펩티드SEQ ID NO:6
면역억제 화합물용 신호 펩티드 천연 리더 서열 쥐 IL-10SEQ ID NO:17
면역억제 화합물 쥐 IL-10SEQ ID NO:18
DNA 벡터 VB5068, VB5069 및 VB5070은 MOG(27-63)를 갖는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 T2A 펩티드 공동발현의 존재로 인해 별도의 분자로서 발현되는 면역억제 화합물 IL-10을 추가로 인코딩한다. 이들 벡터에 의해 인코딩된 제1 폴리펩티드는 다양한 표적화 유닛을 포함한다:
● VB5068: mSCGB3A2
● VB5069: mVSIG3 세포외 도메인
● VB5070: mPD-1 세포외 도메인
DNA 벡터에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비의 특징 분석
VB5068, VB5069 및 VB5070에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비는 실시예 4에 기술된 바와 같이 특징화되었다. 도 35에 도시된 바와 같이, 세 벡터 모두로부터의 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 고도로 발현되고 분비되었다.
VB5068 및 VB5070에 의해 인코딩된 전체 길이의 제1 폴리펩티드/이량체 단백질의 발현 및 분비는 MOG 및 각각의 표적화 유닛인 mSCGB3A2 및 mPD-1에 대한 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 검증되었다. 도 36A 및 B는 전장 단백질들이 두 벡터 모두에서 고도로 발현되고 분비되었음을 보여준다.
종합하면, 이들 결과는 DNA 벡터 VB5068 및 VB5070으로 형질감염된 세포가 표적화 유닛 (mSCGB3A2 또는 mPD-1), CH3 함유 이량체화 유닛 및 마우스 MOG(27-63) 항원을 포함하는 단백질을 발현 및 분비한다는 것을 입증한다.
VB5068 및 VB5069에 의해 인코딩된 면역억제 화합물 mIL-10의 분비는 마우스 IL-10에 대한 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 특징화되었다. 도 37은 mIL-10이 두 벡터 모두에서 고도로 발현되고 분비되었음을 보여준다.
제1 폴리펩티드/이량체 단백질과 면역억제 화합물 IL-10의 별도 단백질로서의 발현 및 분비를 MOG 및 쥐 IL-10에 대한 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 검증하였다. 결과는 리보솜 스키핑 펩티드 T2A가 매우 효과적이며 제1 폴리펩티드/이량체 단백질과 mIL-10이 별도의 단백질로 발현 및 분비되었음을 보여준다(도 38).
VB5069 및 VB5070에서 발현된 무손상 단백질의 특징 분석
DNA 벡터 VB5069 및 VB5070에 의해 인코딩된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포의 상등액에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯은 실시예 4에 설명된 대로 수행되었다. PVDF 막을 제1 폴리펩티드/이량체 단백질을 검출하기 위해 마우스 항-MOG(sc-73330, Santa Cruz Biotechnology)로 프로빙하고 면역억제 화합물 mIL-10을 검출하기 위해 래트 항-쥐 IL-10(MAB417, R&D Systems)을 사용하여 프로빙하였다. 결과를 도 39A 및 B에 나타내었다.
웨스턴 블롯 분석으로 ELISA 결과가 확인되었으며, 이는 VB5069 및 VB5070이 2개의 단백질, 즉 제1 폴리펩티드(도 39A, 환원된 상등액 샘플) 및 mIL-10(도 39B)을 발현함을 입증하였다. 중요한 것은, 항-IL-10-프로브 막에 대해 추가 밴드가 관찰되지 않았다는 것으로, 이는 T2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하여 단일 DNA 벡터로부터 두 개의 별도 단백질이 발현되었음을 가리킨다.
이러한 결과와 본원에 개시된 전술한 실시예들을 종합하면, ELISA 및 WB 데이터는 (mIL-10) T2A 펩티드를 공동발현 요소로 사용함으로써, 쥐 CD205에 대한 특이성을 갖는 scFv와는 다른 표적화 유닛을 포함하는 무손상 제1 폴리펩티드가, 면역억제 화합물과 함께 DNA 벡터로부터 공동발현될 수 있음을 입증한다.
실시예 11
실시예 6에 설명된 바와 같이 VB5068의 관용 유도 능력(표 7 참조)을 결정하고 VB5052(VB5068의 염증 유발 버전)의 면역원성 및 VB5051의 관용 유도 능력(이러한 벡터의 유닛/요소 및 설명은 실시예 4 참조)과 비교하였다.
도 40A에 도시된 바와 같이, VB5068, VB5051 또는 VB5052가 투여된 마우스로부터 수확된 재자극되지 않은 비장세포에서는 IL-10의 생성이 검출된 반면, IFN-γ의 낮은 배경 수준만이 관찰되었다. 비장세포의 MOG(35-55) 재자극 시, VB5068 또는 VB5051을 투여한 마우스 그룹에서는 유의미한 IFN-γ 생성이 검출되지 않았지만, 이에 비해 VB5052가 투여된 마우스의 비장세포에서는 IFN-γ가 상승된 수준으로 검출되었다(도 40B). VB5052에 반응하여 관찰된 IL-10의 증가된 수준은 실시예 5에 기술된 바와 같이 염증 반응을 조절하는 잠재적인 피드백 메커니즘에 의해 설명될 수 있다.
이중 색상 FluoroSpot 분석에서 VB5068 또는 VB5051을 투여한 마우스의 비장 세포에서 유사한 IL-10 수준이 검출되었지만(도 40A/B), 유세포 계측법을 통해, VB5051에 비해 VB5068에 반응하여 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포가 검출되었다(도 41).
VB5068에 대한 반응으로 검출된 Tregs를 나타내는 관찰된 더 높은 비율의 MOG(38-49)-특이적 Foxp3+ 세포(도 41)는 Treg를 식별하기 위한 추가 표현형 마커인 CD25를 포함시켜 검증 및 확인되었다. VB5068을 투여한 마우스에서 수확하고 유세포 계측법으로 분석한 비장세포는 VB5051 또는 VB5052를 투여한 마우스의 비장에서 검출된 수준과 비교하여 더 높은 수준의 CD4+CD25+Foxp3+MOG(38-49)-tet+Treg를 보여주었다(도 42).
추가로, VB5064의 투여에 반응하여 유도된 활발하게 증식하는 Treg 세포의 백분율을 결정하기 위해, VB5068 또는 VB5051을 투여한 마우스로부터 수확한 비장세포에서 Ki67(세포 분열과 엄격하게 연관된 핵 마커)의 발현을 분석하였다. 도 43에 도시된 바와 같이, VB5051 및 VB5052에 비해 VB5068을 투여한 마우스에서 Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 집단 내의 Ki67+ 세포의 더 높은 비율이 생체외에서 검출되었다.
VB5068 투여 후 생체외에서 유도되고 검출된 Treg의 백분율을 평가하고 확인하기 위해 (도 41 및 42), 비장세포의 MOG(35-55)-재자극 후에 Tregs의 유도도 평가하였다. VB5068, VB5051 또는 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포를 MOG(35-55) 펩티드로 16시간 동안 재자극하고 추가 실험에서 유세포 계측기로 분석하였다. 도 44에 도시된 바와 같이, VB5051 또는 VB5052를 투여한 마우스의 비장에서 검출된 것과 비교하여 VB5068을 투여한 마우스에서 수확한 비장세포에서 더 높은 비율의 CD4+CD25+Foxp3+ Treg가 검출되었다.
실시예 11은 SCGB3A2 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 MOG(27-63)를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고 추가로 면역억제 화합물 IL-10을 인코딩하는 VB5068을 마우스에 투여하면 더 높은 항염증 대 염증성 사이토카인 비율(IL-10/IFN-γ)이 결과됨을 보여준다. 더욱이, VB5068을 투여한 마우스의 비장세포는 염증 유발 버전 VB5052를 투여한 마우스의 비장세포에 비해 염증성 IFN-γ 사이토카인 생산이 부족한 것으로 나타났다. 또한, VB5068은 VB5051 및 VB5052 양자 모두에 비해 MOG(38-49) 특이적 Foxp3+ Treg 및 CD4+CD5+Foxp3+Ki67+ 증식 Treg 세포의 더 높은 비율을 유도하였다. 종합적으로, 이러한 결과는 VB5064가 그의 염증 유발 버전인 VB5052와는 반대로 항염증 방식으로 항원 단독(VB5051)에 비해 더 큰 항원 특이적 관용원성 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 추가로, 실시예 11에 제시된 데이터는 본 발명의 벡터의 다재다능성을 보여주며, 다양한 표적화 유닛(항-CD205 및 SCGB3A2 표적화 유닛)이 관용원성 방식으로 항원 유닛에 포함된 항원의 APC에 대한 표적화를 허용한다는 것을 입증한다.
실시예 12
Metapenaeus ensis 종의 새우 알레르겐 트로포미오신의 T 세포 에피토프를 인코딩하고 다음 요소/유닛을 추가로 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 벡터를 설계 및 제조하였다.
요소/유닛 VB5076
SEQ ID NO:49
신호 펩티드 쥐 Ig VH 신호 펩티드
SEQ ID NO:2
표적화 유닛 쥐 CD205에 특이성을 갖는 scFv
SEQ ID NO: 15
이량체화 유닛 표 4와 같음
유닛 링커 표 4와 같음
항원 유닛 Met e 1 (241-260), (210-230), (136-155), (76-95), (46-65), 및 (16-35)
SEQ ID NO: 50
공동발현 요소 T2A 펩티드
SEQ ID NO:6
면역억제 화합물용
신호 펩티드 		천연 리더 서열 쥐 IL-10
SEQ ID NO:17
면역억제 화합물 쥐 IL-10
SEQ ID NO:18
트로포미오신은 패류의 주요 알레르기 유발물질이다. Met e 1 과민증이 있는 Balb/c 마우스 모델에서 새우 종 Metapenaeus ensis(Met e 1 알레르겐)의 트로포미오신에 대해 6개의 주요 T 세포 에피토프가 확인되었다. 6개 T 세포 에피토프의 펩티드를 사용한 경구 면역요법은 새우 트로포미오신에 대한 알레르기 반응을 효과적으로 감소시켰다(Wai et al., Int J Mol Sci 20(18), 4656, 2015).
DNA 벡터 VB5076은 Met e 1로부터의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩한다. 6개의 T 세포 에피토프((241-260), (210-230), (136-155), (76-95), (46-65) 및 (16-35))은 T 세포 에피토프 링커 GGGGSGGGGS에 의해 서로 분리되어 있다. VB5076은 면역억제 화합물인 mIL10을 추가로 인코딩한다.
DNA 벡터 VB5076에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비의 특징화
VB5076에 의해 인코딩된 단백질의 발현 및 분비는 실시예 4에 기술된 바와 같이 특징화되었다. 도 45에 도시된 바와 같이, VB5076으로부터의 제1 폴리펩티드/이량체 단백질은 높은 수준으로 발현되고 분비되었다.
VB5076에 의해 인코딩된 면역억제 화합물 mIL-10의 분비는 마우스 IL-10에 대한 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 특징화되었다. 도 46은 mIL-10이 VB5076에서 고도로 발현되고 분비되었음을 보여준다.
VB5076에서 발현된 무손상 단백질의 특징 분석
VB5076에 의해 인코딩된 단백질을 추가로 특징화하기 위해 형질감염된 Expi293F 세포로부터의 상등액에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. VB5076에 의해 발현된 제1 폴리펩티드/이량체 단백질에 대한 웨스턴 블랏팅과 상용성인 상업적으로 이용 가능한 항체는 식별되지 않았다: 따라서 면역억제 화합물인 mIL-10만이 검출될 수 있었다.
실시예 4에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 면역억제 화합물 mIL-10을 검출하기 위해 PVDF 막을 래트 항-쥐 IL-10(MAB417, R&D Systems)으로 프로브하였다. 결과를 도 47에 나타내었다.
IL-10의 예상 분자량에서 하나의 주요 밴드가 항-IL-10-프로브 막에 대해 관찰되었으며, 이는 T2A 서열에서 성공적인 리보솜 건너뛰기를 입증하여 VB5076과 별도의 분자로서 mIL10이 발현되는 결과를 가져왔다.
종합적으로, ELISA 및 웨스턴 블롯 데이터는 여러 T 세포 에피토프를 갖는 항원 유닛을 포함하는 제1 폴리펩티드/이량체 단백질이, 공동발현 요소로서 T2A 펩티드를 사용함으로써 또 다른 단백질(면역억제 화합물)과 함께 DNA 플라스미드로부터 공동발현될 수 있음을 입증한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
구현예
1. (a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산; 및
(b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
을 포함하는 벡터로서,
여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것인, 벡터.
2. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 면역 관용을 유도하는 것인, 벡터.
3. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 면역 관용을 증가시키는 것인, 벡터.
4. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 면역 관용을 유지하는 것인, 벡터.
5. 구현예 1에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 면역 관용을 유도하고/하거나 면역 관용을 증가시키고/시키거나 면역 관용을 유지하는 것인, 벡터.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 관용 유도 방식으로 항원 유닛에서 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제시를 선호하는 것인, 예컨대, 관용 유도 방식으로 항원 유닛에서 하나 이상의 T 세포 에피토프의 제시를 촉진 및/또는 지원하는 것인, 벡터.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 관용 유지 세포의 유도를 선호하는, 예를 들어 관용 유지 세포의 유도를 촉진 및/또는 지원하는 것인, 벡터.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 관용 유지 세포를 유지하는 데 도움이 되는 것인, 벡터.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 면역억제 화합물은 억제 체크포인트 분자의 세포외 도메인과 같은 세포외 부분인, 벡터.
10. 구현예 9에 있어서, 억제 체크포인트 분자는 CLTA-4, PD-1, BTLA, LAG3, NOX2, SIGLEC7, SIGLEC9 및 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
11. 구현예 9 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 억제 체크포인트 분자는 인간 억제 체크포인트 분자, 좋기로는 hCLTA-4, 예를 들어 SEQ ID NOL 51의 hCTLA-4, hPD-1, 예를 들어 SEQ ID NO: 52의 hPD-1, hBTLA, hLAG3, hNOX2, hSIGLEC7, hSIGLEC9 및 hTIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
12. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 면역억제 화합물은 IL-10, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, IL-27, IL-2, GM-CSF, FLT3L, IFN-γ, IL-37 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인인, 벡터.
13. 구현예 12에 있어서, 사이토카인은 hIL-10, 예컨대 SEQ ID NO: 53의 hIL-10, hTGF-β1, 예컨대 SEQ ID NO: 54의 hTGF-β1, hTGF-β2, hTGF-β3, hIL-27, hIL-2, 예컨대 SEQ ID NO:55의 hIL-2, hGM-CSF, 예컨대 SEQ ID NO:56의 hGM-CSF, hFLT3L, hIFN-γ, 예를 들어 SEQ ID NO: 57의 hIFN-γ, hIL-37 및 hIL-35로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 사이토카인인, 벡터.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 다수의 면역억제 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역억제 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상이한 면역억제 화합물을 인코딩하는 다수의 추가 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 다수의 면역억제 화합물은 다양한 수준으로 관용 유도 환경을 생성하거나 촉진하는 상이한 면역억제 화합물들인, 벡터.
16. 구현예 14 내지 15 중 어느 한 구현예에에 있어서, 상기 상이한 면역억제 화합물은 관용을 유도하고 관용을 증가시키고 관용을 유지하거나 관용을 유도하고 관용을 증가시키거나 관용을 유도하고 관용을 유지하는 것인, 벡터.
17. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 단일 전사체 상에 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 전사 및 별도의 제1 폴리펩티드 및 별도의 하나 이상의 면역억제 화합물로의 독립적인 번역을 유발하는 것인, 벡터.
19. 구현예 17 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 공동발현 요소는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인, 벡터.
20. 구현예 17 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 IRES 요소 및 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인 1개 초과의 공동발현 요소를 포함하는 벡터.
21. 구현예 17 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드 및 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
22. 구현예 17 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 T2A 펩티드, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 P2A 펩티드, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 E2A 펩티드 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
23. 구현예 17 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 2A 자가 절단 펩티드는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 T2A 펩티드, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 P2A 펩티드, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 E2A 펩티드 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 F2A 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
24. 구현예 17에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 전사를 별도의 전사체로서 유발하는, 벡터.
25. 구현예 24에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 양방향 프로모터인, 벡터.
26. 구현예 24에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 프로모터이고, 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열 각각에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 벡터.
27. 구현예 24에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 양방향 프로모터 및 프로모터인, 벡터.
28. 구현예 17 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 IRES 요소, 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 양방향 프로모터 및 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
30. 구현예 29에 있어서, 항원 유닛은 자가 항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
31. 구현예 29에 있어서, 항원 유닛은 다수의 상이한 자가 항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
32. 구현예 29 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 자가 항원은 다발성 경화증과 관련된 것인, 벡터.
33. 구현예 29 내지 32 중 어느 한 구현예 있어서, 하나 이상의 T 세포 에피토프는 MOG, 예컨대 MOG(35-55), MBP, 예컨대 MBP(84-104) 및 MBP(76-112), PLP, 예컨대 PLP(139-151), PLP(131-159) 및 PLP(178-191), MAG, MOBP, CNPase, S100β 및 트랜스알돌라제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
34. 구현예 29 내지 33 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 of MOG (35-55), MOG (27-63), PLP (139-151), PLP (131-159), PLP (178-191), PLP (170-199), MBP (84-104) 및 MBP (76-112)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
35. 제29 내지 제31 구현예 중 어느 한 구현예 있어서, 자가 항원은 제1형 당뇨병에 관여하는, 벡터.
36. 구현예 35에 있어서, 자가 항원은 글루탐산 데카르복실라제 65-킬로달톤 이소형(GAD65), 인슐린, IA-2, ZnT8, IGRP, ChgA, IAPP, 페리페린, 테트라스파닌-7, GRP78, 유로코르틴-3 및 인슐린 유전자 강화 단백질 isl-1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
37. 제29 내지 제31 구현예 중 어느 한 구현예 있어서, 자가 항원은 셀리악병과 관련된, 벡터.
38. 구현예 37에 있어서, 자가 항원은 α-글리아딘, γ-글리아딘, 예컨대 α-글리아딘(76-95), ω-글리아딘, 저분자량 글루테닌, 고분자량 글루테닌, 호르데인, 세칼린 및 아베닌 b로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
39. 구현예 29 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 자가 항원은 류마티스 관절염과 관련된, 벡터.
40. 구현예 39에 있어서, 자가 항원은 콜라겐, 열 충격 단백질 60(HSP60), 밴드 3, 소형 핵 리보핵단백질 D1(SmD1), 아세틸콜린 수용체(AChR) 및 미엘린 단백질 제로(P0)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
41. 구현예 29 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 자가 항원은 다발성 경화증, 제1형 진성 당뇨병, 셀리악병, 류마티스 관절염, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증, 하시모토 갑상선염, 잎사귀성 천포창, 심상성 천포창, 갑상선 안질환, 그레이브병, 원발성 담즙성 간경변, 중증 근무력증, 인슐린 저항성 당뇨병, 용혈성 빈혈 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병과 관련된 것이고 및/또는 항원 유닛은 뉴로파신 155, 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 데스모솜 관련 당단백질, 데스모글레인 3 칼슘 결합 단백질(칼세퀘스트린), 갑상선 자극 호르몬 수용체, 항미토콘드리아 항체(AMA), 항핵항체(ANA), 림-유사/ 막(RL/M), 다수의 핵점(MND), 아세틸콜린 수용체, 인슐린 수용체, 적혈구 카텔리시딘(LL-37), 1형 트롬보스폰딘 모티프-유사 5(ADAMTSL5)를 포함하는 디스인테그린- 유사 및 금속프로테아제 도메인, 포스포리파제 A2 그룹 IVD (PLA2G4D), 이종 핵 리보핵단백질 A1(hnRNP-A1), 케라틴 17, 시트룰린화 단백질, 호모시트룰린화 단백질 및 IgG의 Fc 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
42. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
43. 구현예 42에 있어서, 항원 유닛은 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
44. 구현예 42에 있어서, 항원 유닛은 다수의 상이한 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
45. 제42 내지 제44 구현예 중 어느 한 구현예 있어서, 알레르겐은 식품 알레르겐인, 벡터.
46. 구현예 42 내지 45 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은이 패류 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 생선 알레르겐, 과일 알레르겐, 밀 알레르겐, 땅콩 알레르겐, 트리 넛 알레르겐, 대두 알레르겐, 종자 알레르겐, 메밀 알레르겐, 셀러리 알레르겐, 마늘 알레르겐, 글루텐 알레르겐, 귀리 알레르겐, 콩류 알레르겐, 옥수수 알레르겐, 밀크 알레르겐, 겨자 알레르겐, 견과류 알레르겐, 가금류 알레르겐, 육류 알레르겐, 쌀 알레르겐, 및 참깨 알레르겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
47. 구현예 42 내지 45 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 트로포미오신, 아르기닌 키나제, 미오신 경쇄, 근형질 칼슘 결합 단백질, 트로포닌 C, 트리오스-포스페이트 이소머라제 및 액틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 패류 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
48. 구현예 47에 있어서, 하나 이상의 T 세포 에피토프는 Pan b 1 T 세포 에피토프 (251-270), Met e 1 T 세포 에피토프 (241-260), Met e 1 T 세포 에피토프 (210-230), Met e 1 T 세포 에피토프 (136-155), Met e 1 T 세포 에피토프 (76-95), Met e 1 T 세포 에피토프 (46-65) 및 Met e 1 T 세포 에피토프 (16-35)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
49. 구현예 42 내지 44 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛이 봉독 알레르겐, 베스피드 알레르겐, 라텍스 알레르겐, 먼지 진드기 알레르겐, 집먼지 진드기 알레르겐, 집먼지진드기 알레르겐으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 벡터. 집먼지진드기 알레르겐, 저장먼지 진드기 알레르겐, 바퀴벌레 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 개 알레르겐, 고양이 알레르겐, 말 알레르겐 등의 털동물 알레르겐, 잔디 꽃가루 알레르겐, 나무 꽃가루 알레르겐, 잡초 꽃가루 알레르겐 등 꽃가루 알레르겐, 곤충 알레르겐 및 약물 알레르겐.
50. 구현예 42 내지 44 및 49 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 인자 VIII, 인슐린 및 치료적 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물의 약물 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
51. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 동종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
52. 구현예 51에 있어서, 항원 유닛은 동종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
53. 구현예 51에 있어서, 항원 유닛은 다수의 상이한 동종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
54. 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
55. 구현예 54에 있어서, 항원 유닛은 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
56. 구현예 54에 있어서, 항원 유닛은 다수의 상이한 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 별개의 T 세포 에피토프인 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
58. 구현예 1 내지 56 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 핫스팟에 포함된 최소 T 세포 에피토프인 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
59. 구현예 1 내지 56 중 어느 한 구현예 있어서, 항원 유닛은 별개의 T 세포 에피토프 및 하나 이상의 핫스팟에 포함된 최소 T 세포 에피토프로 이루어진 군으로부터의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
60. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 T 세포 에피토프는 길이가 7 내지 약 200개 아미노산, 예를 들어 7 내지 150개 아미노산, 좋기로는 7 내지 100개 아미노산인 벡터. 예를 들어, 9 내지 100개 아미노산 또는 15 내지 100개 아미노산 또는 9 내지 60개 아미노산 또는 9 내지 30개 아미노산 또는 15 내지 60개, 또는 15 내지 30개 또는 20 내지 75개 아미노산 또는 25 내지 50개 아미노산인, 벡터.
61. 구현예 60에 있어서, 하나 이상의 T 세포 에피토프는 MHC(주요 조직적합성 복합체)에 의한 제시에 적합한 길이, 예를 들어 MHC 클래스 I 제시를 위한 7 내지 11개의 아미노산 길이 또는 MHC 클래스 II 제시를 위한 약 15개의 아미노산 길이를 갖는, 벡터.
62. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 최대 3500개 아미노산, 예컨대 약 21 내지 약 2000개 아미노산 또는 약 60 내지 3500개 아미노산, 예컨대 약 80 또는 약 100개 또는 약 150 아미노산 내지 약 3000개 아미노산, 예컨대 약 200 내지 약 2500개 아미노산, 예컨대 약 300 내지 약 2000개 아미노산 또는 약 400 내지 약 1500개 아미노산 또는 약 500 내지 약 1000개 아미노산을 포함하는, 벡터.
63. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 또는 10개의 T 세포 에피토프와 같은 1 내지 10개의 T 세포 에피토프 또는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 T 세포 에피토프와 같은 11 내지 20개의 T 세포 에피토프, 또는 예컨대 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 T 세포 에피토프와 같은 21 내지 30개의 T 세포 에피토프, 또는 예를 들어 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 T 세포 에피토프와 같은 31 내지 40개의 T 세포 에피토프 또는, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 개의 T 세포 에피토프와 같은 41 내지 50개의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
64. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 유닛은 T 세포 에피토프 링커에 의해 분리된 다수의 별개 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
65. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 유닛은 세포를 활성화시키지 않고 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
66. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 유닛은 세포의 성숙을 유도하지 않고 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
67. 구현예 65 내지 66 중 어느 한 구현예 있어서, 표면 분자는 TGFβ 수용체, 예컨대 TGFβR1, TGFβR2 및 TGFβR3, IL-10R, 예컨대 IL-10RA 및 IL-10RB, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-11R, IL-13R, IL-27R, IL-35R, IL-37R, GM-CSFR, FLT3, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, CD83, SIGLEC, Clec10A (MGL), ASGR (ASGR1/ASGR2), CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, Langerin, MR, DC-Sign, Treml4, Dectin-1, PDL1, PDL2, HVEM, CD163 및 CD141로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
68. 구현예 65 내지 66 중 어느 한 구현예 있어서, 표면 분자는 인간 항원-제시 세포 상에 존재하는 표면 분자이고, 상기 표면 분자는 hTGFβ 수용체, 예컨대 hTGFβR1, hTGFβR2, 및 hTGFβR3, hIL-10R, 예컨대 hIL-10RA 및 hIL-10RB, hIL-2R, hIL-4R, hIL-6R, hIL-11R, hIL-13R, hIL-27R, hIL-35R, hIL-37R, hGM-CSFR, hFLT3, hCCR7, hCD11b, hCD11c, hCD103, hCD14, hCD36, hCD205, hCD109, hVISTA, hMARCO, hMHCII, hCD83, hSIGLEC, hClec10A (hMGL), hASGR (hASGR1/hASGR2), hCD80, hCD86, hClec9A, hClec12A, hClec12B, hDCIR2, hLangerin, hMR, hDC-Sign, hTreml4, hDectin-1, hPDL1, hPDL2, hHVEM, hCD163 및 hCD141로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
69. 구현예 65 내지 68 중 어느 한 구현예 있어서, 모이어티는 천연 리간드, 항체 또는 이의 일부, 예컨대 scFv 또는 합성 리간드인, 벡터.
70. 구현예 65 내지 68 중 어느 한 구현예 있어서, 모이어티는 TGFβ, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3, IL-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-13, IL-27, IL-35, IL-37, GM-CSF, FLT3L, CCL19, CCL21, ICAM-1 (CD54로도 알려진 세포간 접착 분자 1), 케라틴, VSIG-3, 좋기로는 VSIG-3, SCGB3A2, CTLA-4의 세포외 도메인, 좋기로는 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, BTLA, 좋기로는 BTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 리간드인, 벡터.
71. 구현예 65 내지 68 중 어느 한 구현예 있어서, 모이어티는 hTGFβ, hIL-10, hIL-2, 예컨대 SEQ ID NO: 55의 hIL-2, hIL-4, hIL-6, hIL-11, hIL-13, hIL-27, hIL-35, hIL-37, hGM-CSF, 예를 들어 SEQ ID NO: 56의 hGM-CSF, hFLT3L, hCCL19, hCCL21, hICAM-1(CD54로도 알려진 세포간 접착 분자 1), h케라틴, hVSIG-3, 좋기로는 hVSIG-3의 세포외 도메인, hSCGB3A2, hCTLA-4, 좋기로는 hCTLA-4의 세포외 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 51의 hCTLA4의 세포외 도메인, hPD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, 예를 들어 SEQ ID NO: 52의 hPD-1의 세포외 도메인 및 hBTLA, 좋기로는 hBTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 천연 리간드인, 벡터.
72. 구현예 65 내지 70 중 어느 한 구현예 있어서, 표적화 유닛은 IL1-10, TGFβ, 예컨대 TGFβ-1, TGFβ-2 및 TGFβ-3, SCGB3A2 또는 VSIG-3, 좋기로는 VSIG-3의 세포외 도메인이거나 이를 포함하는 벡터.
73. 구현예 65 내지 70 중 어느 한 구현예 있어서, 표적화 유닛은 hIL1-10, hTGFβ, 예컨대 hTGFβ-1, hTGFβ-2 및 hTGFβ-3, hSCGB3A2 또는 hVSIG-3, 좋기로는 hVSIG-3의 세포외 도메인이거나 이를 포함하는 벡터.
74. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛, 삼량체화 유닛, 예컨대 콜라겐 유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인 또는 T4 피브리틴의 C-말단 도메인 및 사량체화 유닛, 예컨대 p53으로부터 유래된 도메인이고, 여기서 상기 다량체화 유닛은 선택적으로 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 좋기로는 IgG3의 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 4와 같은 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
75. 구현예 74에 있어서, 벡터는 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
76. 구현예 74 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, 힌지 영역이 Ig 유래된 것인, 벡터.
77. 구현예 74 내지 76 중 어느 한 구현예에 있어서, 다량체화 유닛이 이량체화 유닛이고, 상기 이량체화 유닛이 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 추가로 포함하는, 벡터.
78. 구현예 77에 있어서, 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인인, 벡터.
79. 구현예 77 내지 78 중 어느 한 구현예에 있어서, 다른 도메인은 IgG, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인, 벡터.
80. 구현예 77 내지 구현예 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 이량체화 유닛이 GGGSSGGGSG와 같은 글리신-세린 풍부 링커와 같은 이량체화 유닛 링커를 추가로 포함하는, 벡터.
81. 구현예 80에 있어서, 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인, 벡터.
82. 구현예 77 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 이량체화 유닛이 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는, 벡터.
83. 구현예 82에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 벡터.
84. 구현예 83에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
85. 구현예 85에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
86. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 상기 유닛 링커는 비면역원성 링커이고/이거나는 유연하거나 견고한 링커인, 벡터.
87. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는, 벡터.
88. 구현예 87에 있어서, 신호 펩티드는 표적화 유닛인 단백질의 천연 리더 서열인, 벡터.
89. 구현예 87 내지 88 중 어느 한 구현예에 있어서, 신호 펩티드는 인간 Ig VH 신호 펩티드, hTGF-β1의 신호 펩티드, hTGF-β2의 신호 펩티드, hTGF-β3의 신호 펩티드, hIL-10의 신호 펩티드, hIL-2의 신호 펩티드, hIL-4의 신호 펩티드, hIL-6의 신호 펩티드, hIL-11의 신호 펩티드, hIL-13의 신호 펩티드, hIL-27의 신호 펩티드, hIL-35의 신호 펩티드, hIL-37의 신호 펩티드, hGM-CSF의 신호 펩티드, hFLT3L의 신호 펩티드, hCCL19의 신호 펩티드, hCCL21의 신호 펩티드, hICAM-1의 신호 펩티드, h케라틴의 신호 펩티드, hVSIG-3의 신호 펩티드, hSCGB3A2의 신호 펩티드, hCTLA-4의 신호 펩티드, hPD-1의 신호 펩티드 및 hBTLA의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
90. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 추가 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 것인, 벡터.
91. 구현예 90에 있어서, 신호 펩티드는 면역억제 화합물의 천연 리더 서열인, 벡터.
92. 구현예 90 내지 91 중 어느 한 구현예에 있어서, 신호 펩티드는 hCLTA-4의 신호 펩티드, hPD-1의 신호 펩티드, hBTLA의 신호 펩티드, hLAG3의 신호 펩티드, hNOX2의 신호 펩티드, hSIGLEC7의 신호 펩티드, hSIGLEC9의 신호 펩티드, hTIM-3의 신호 펩티드, hIL-10의 신호 펩티드, hTGF-β1의 신호 펩티드, hTGF-β2의 신호 펩티드, hTGF-β3의 신호 펩티드, hIL-27의 신호 펩티드, hIL-2의 신호 펩티드, hGM-CSF 신호 펩티드 of hFLT3L의 신호 펩티드, hIFN-γ의 신호 펩티드, hIL-37의 신호 펩티드 및 hIL-35의 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
93. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 RNA 바이러스 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 RNA 플라스미드 또는 DNA 플라스미드와 같은 플라스미드인, 벡터.
94. 선행하는 구현예들 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 DNA 플라스미드, 좋기로는 DNA 플라스미드인, 벡터.
95. 구현예 1 내지 94 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 시험관 내에서 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계;
b) 상기 세포를 인큐베이션하는 단계;
c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
d) 벡터를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
를 포함하는, 방법.
96. 구현예 1 내지 94 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 동물 또는 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
97. 약제로서 사용하기 위한 것인, 구현예 1 내지 94 중 어느 한 구현예에 정의된, 벡터.
98. 구현예 1 내지 98 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
99. 구현예 98에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 식염수, 완충 식염수, 예를 들어 PBS, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 등장성 수성 완충액 및 티로드 완충액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
100. 구현예 98 내지 99 중 어느 한 구현예에 있어서, 형질감염제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
101. 구현예 98 내지 100 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물은 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 포함하는 약학적으로 허용되는 양친매성 블록 공중합체를 추가로 포함하고, 예를 들어 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리프로필렌 옥사이드의 블록을 0.2% w/v 내지 20% w/v의 양으로 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
102. 구현예 98 내지 101 중 어느 한 구현예 있어서, 조성물은 덱사메타손, 장독소 콜레라 독소의 B 서브유닛(CTB), TLR2 리간드, 기생충 유래 배설/분비(ES) 생성물, 라파마이신 비타민 D3 유사체 및 아릴 탄화수소 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 아주반트와 같은 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
103. 구현예 98 내지 102 중 어느 한 구현예 있어서, 상기 벡터, 예를 들어 상기 DNA 플라스미드를 0.1 내지 10 mg 범위로 포함하는 것인 제약 조성물.
104. 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 구현예 1 내지 94 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터 또는 구현예 98 내지 103 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
105. 구현예 104에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되는, 방법.
106. 구현예 104 내지 105 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여되거나, 비강내 또는 경구와 같은 점막 또는 상피 적용에 의해 투여되는, 방법.
107. 자가면역 질환을 앓고 있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 41 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터 또는 이러한 벡터를 포함하는 구현예 98 내지 103 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
108. 구현예 107에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료 유효량으로 투여되는, 방법.
109. 구현예 107 내지 108 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물이 피내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여되거나, 비강내 또는 경구와 같은 점막 또는 상피 적용에 의해 투여되는, 방법.
110. 알레르기 질환을 앓고 있거나 이의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 28 또는 42 내지 50 중 어느 한 구현예에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 구현예 98 내지 103 중 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
111. 구현예 110에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료 유효량으로 투여되는, 방법.
112. 구현예 110 내지 111 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
113. 이식 거부를 앓고 있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 28 또는 51 내지 56중 어느 한 구현예에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 구현예 98 내지 103 어느 한 구현예에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
114. 구현예 113에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 유효량으로 투여되는, 방법.
115. 구현예 113 내지 114 중 어느 한 구현예에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Nykode Therapeutics AS <120> Co-expression of constructs and immunoinhibitory compounds <130> P6010PC00 <160> 179 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dimerization unit <400> 1 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Glu Pro Lys Ser 1 5 10 15 Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 35 40 45 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 50 55 60 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 85 90 95 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 100 105 110 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 115 120 125 Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 130 135 140 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal 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Ile 370 375 380 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 385 390 395 400 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Leu Ser Pro 405 410 415 Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe 420 425 430 Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Ala Glu 435 440 445 Ala Gln Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly 450 455 460 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Pro Gly Ser Ala Leu Leu Cys 465 470 475 480 Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Met Arg Ile Ser Arg Gly Gln Tyr Ser 485 490 495 Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His Phe Pro Val Gly Gln Ser His Met 500 505 510 Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe Ser Gln Val Lys Thr Phe Phe Gln 515 520 525 Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile Leu Leu Thr Asp Ser Leu Met Gln 530 535 540 Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln 545 550 555 560 Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Lys His Gly Pro Glu 565 570 575 Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu 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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 130 135 140 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 145 150 155 160 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly 165 170 175 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 180 185 190 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 195 200 205 Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 210 215 220 Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu 225 230 235 240 Gly Gly Leu Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp 245 250 255 Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys 260 265 270 Asp Gln Asp Ala Glu Ala Gln Pro 275 280 <210> 5 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VB5051* <400> 5 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp 20 25 30 Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys 35 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cccccgtgcc caaggtgccc a 81 <210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding amino acids 38-144 of SEQ ID NO: 1 <400> 11 ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac tacaacacca cgcctcccat gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240 aacatcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 300 ctctccctgt ctccgggtaa a 321 <210> 12 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 <400> 12 gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacacagagc ccaaatcttg tgacacacct 60 cccccgtgcc caaggtgccc aggcggtgga agcagcggag gtggaagtgg aggacagccc 120 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 180 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 240 agcgggcagc cggagaacaa ctacaacacc acgcctccca tgctggactc cgacggctcc 300 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacatcttc 360 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccgcttca cgcagaagag cctctccctg 420 tctccgggta aa 432 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide hCCL3L1 <400> 13 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser 20 <210> 14 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCL3L1 <400> 14 Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 15 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv with specificity for murine CD205 <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asn Ser 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137 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 137 Gly Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 138 Gly Gly Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 139 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 139 Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 140 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 140 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 141 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 141 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala <210> 142 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 142 Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala 20 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 143 Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 144 Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 145 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 145 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 146 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 147 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 148 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 149 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 149 Gly Gly Gly Ser Ser Ser 1 5 <210> 150 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 150 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 <210> 151 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 151 Gly Leu Gly Gly Leu Ala Ala Ala 1 5 <210> 152 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 152 Lys Pro Glu Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro 1 5 10 <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 153 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 154 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> can be repeated m times, where m is an integer from 1 to 5 <400> 154 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 155 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 156 Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 157 Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 158 Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 159 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 160 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 160 Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 <210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 161 Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser 1 5 <210> 162 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 162 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Leu 1 5 10 15 <210> 163 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 163 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Leu Gly Gly Leu 1 5 10 <210> 164 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 164 Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly 20 25 30 Thr Gly Ser Gly 35 <210> 165 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 165 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser 35 <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 166 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 167 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 167 His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 168 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 168 Ala His Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly 1 5 10 15 His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile Thr Tyr Ala Leu Thr 20 25 <210> 169 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 169 Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys 1 5 10 <210> 170 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 170 Ala Val Pro Val Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser 1 5 10 15 Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser Leu 20 25 30 <210> 171 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 171 Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Gln Gly Lys Gly Arg 20 <210> 172 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope <400> 172 Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val 1 5 10 15 Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Arg Phe 35 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 173 His Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Ala Gly 1 5 10 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 174 Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 175 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 176 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> SITE <222> (1)..(5) <223> can be repeated m times, where m is an integer from 1 to 5 <400> 177 Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ser 1 5 <210> 178 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <220> <221> SITE <222> (1)..(4) <223> can be repeated m times, where m is an integer from 1 to 5 <400> 178 Glu Ala Ala Lys Gly Ser 1 5 <210> 179 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 179 Gly Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro 1 5 10 15 Gly

Claims (51)

  1. (a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산 서열로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 항원-제시 세포를 표적화하는 표적화 유닛, 다량체화 유닛, 예를 들어 이량체화 유닛, 및 항원 유닛을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 자가 항원, 알레르겐, 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 제1 핵산; 및
    (b) 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 서열
    을 포함하는 벡터로서,
    여기서 벡터는 제1 폴리펩티드와 하나 이상의 면역억제 화합물을 별도의 분자로서 공동발현시키는 것을 가능하게 하는 것인, 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 면역억제 화합물은 면역 관용을 유도하고/하거나 면역 관용을 증가시키고/시키거나 면역 관용을 유지하는 것인, 벡터.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 화합물은 억제 체크포인트 분자의 세포외 도메인과 같은 세포외 부분인, 벡터
  4. 청구항 3에 있어서, 억제 체크포인트 분자는 CLTA-4, PD-1, BTLA, LAG3, NOX2, SIGLEC7, SIGLEC9 및 TIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 좋기로는 hCLTA-4, hPD-1, hBTLA, hLAG3, hNOX2, hSIGLEC7, hSIGLEC9 및 hTIM-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 억제 체크포인트 분자인 것인, 벡터.
  5. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 화합물은 IL-10, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, IL-27, IL-2, GM-CSF, FLT3L, IFN-γ, IL-37 및 IL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이고, 좋기로는, hIL-10, hTGF-β1, hTGF-β2, hTGF-β3, hIL-27, hIL-2, hGM-CSF, hFLT3L, hIFN-γ, hIL-37 및 hIL-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 사이토카인인, 벡터.
  6. 벡터는 2 이상의 면역억제 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 면역억제 화합물, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상이한 면역억제 화합물을 인코딩하는 다수의 추가 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
  7. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 공동발현 요소를 포함하는, 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 단일 전사체 상에 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 전사 및 별도의 제1 폴리펩티드 및 별도의 하나 이상의 면역억제 화합물로의 독립적인 번역을 유발하는 것인, 벡터.
  9. 청구항 7 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공동발현 요소는 IRES 요소 또는 2A 자가 절단 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열인, 벡터.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물의 전사를 별도의 전사체로서 유발하는, 벡터.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 하나 이상의 공동발현 요소는 a) 양방향 프로모터이거나, 또는 b) 프로모터이고, 여기서 벡터는 제1 폴리펩티드 및 하나 이상의 면역억제 화합물을 인코딩하는 핵산 서열 각각에 대해 별도의 프로모터를 포함하는, 벡터.
  12. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 자가 항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  13. 청구항 12에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 자가 항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, 하나 이상의 자가 항원은 다발성 경화증과 관련된 자가 항원, 제1형 당뇨병과 관련된 자가 항원, 셀리악병과 관련된 자가 항원, 류마티스 관절염에 관련된 자가 항원, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경근병증에 관련된 자가 항원, 하시모토 갑상선염에 관련된 자가 항원, 잎사귀 천포창에 관련된 자가 항원, 심상성 천포창에 관련된 자가 항원, 갑상선안질환에 관련된 자가 항원 그레이브병에 관련된 자가 항원, 원발성 담도경변에 관련된 자가 항원, 중증 근무력증에 관련된 자가 항원, 인슐린 저항성 당뇨병에 관련된 자가 항원, 용혈성 빈혈에 관련된 자가 항원, 건선에 관련된 자가 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  15. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 알레르겐의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  17. 청구항 16에 있어서, 항원 유닛은 패류 알레르겐, 우유 알레르겐, 달걀 알레르겐, 생선 알레르겐, 과일 알레르겐, 밀 알레르겐, 땅콩 알레르겐, 트리 넛 알레르겐, 대두 알레르겐, 종자 알레르겐, 메밀 알레르겐, 셀러리 알레르겐, 마늘 알레르겐, 글루텐 알레르겐, 귀리 알레르겐, 콩류 알레르겐, 옥수수 알레르겐, 밀크 알레르겐, 겨자 알레르겐, 견과류 알레르겐, 가금류 알레르겐, 육류 알레르겐, 쌀 알레르겐, 참깨 알레르겐, 봉독 알레르겐, 베스피드 알레르겐, 라텍스 알레르겐, 집먼지 진드기 알레르겐, 곤충 알레르겐, 곰팡이 알레르겐, 진균 알레르겐, 모피 동물 알레르겐, 꽃가루 알레르겐 및 약물 알레르겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  18. 청구항 15 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 인자 VIII, 인슐린 및 치료적 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물의 약물 알레르겐의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  19. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 동종항원 또는 이종항원의 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  20. 청구항 12에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 동종항원의 다수의 T 세포 에피토프 또는 하나 이상의 이종항원의 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  21. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 T 세포 에피토프 링커에 의해 분리된 다수의 별개 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  22. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 핫스팟에 포함된 최소 T 세포 에피토프인 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는, 벡터.
  23. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 세포를 활성화시키지 않고 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
  24. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 세포의 성숙을 유도하지 않고 항원-제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는, 벡터.
  25. 청구항 23 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 표면 분자는 TGFβ 수용체, 예컨대 TGFβR1, TGFβR2 및 TGFβR3, IL-10R, 예컨대 IL-10RA 및 IL-10RB, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-11R, IL-13R, IL-27R, IL-35R, IL-37R, GM-CSFR, FLT3, CCR7, CD11b, CD11c, CD103, CD14, CD36, CD205, CD109, VISTA, MARCO, MHCII, CD83, SIGLEC, Clec10A (MGL), ASGR (ASGR1/ASGR2), CD80, CD86, Clec9A, Clec12A, Clec12B, DCIR2, Langerin, MR, DC-Sign, Treml4, Dectin-1, PDL1, PDL2, HVEM, CD163 및 CD141로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  26. 청구항 25에 있어서, 표면 분자는 인간 항원-제시 세포 상에 존재하는 표면 분자이고, 상기 표면 분자는 hTGFβ 수용체, 예컨대 hTGFβR1, hTGFβR2, 및 hTGFβR3, hIL-10R, 예컨대 hIL-10RA 및 hIL-10RB, hIL-2R, hIL-4R, hIL-6R, hIL-11R, hIL-13R, hIL-27R, hIL-35R, hIL-37R, hGM-CSFR, hFLT3, hCCR7, hCD11b, hCD11c, hCD103, hCD14, hCD36, hCD205, hCD109, hVISTA, hMARCO, hMHCII, hCD83, hSIGLEC, hClec10A (hMGL), hASGR (hASGR1/hASGR2), hCD80, hCD86, hClec9A, hClec12A, hClec12B, hDCIR2, hLangerin, hMR, hDC-Sign, hTreml4, hDectin-1, hPDL1, hPDL2, hHVEM, hCD163 및 hCD141로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  27. 청구항 23 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 모이어티는 천연 리간드, 항체 또는 이의 일부, 예컨대 scFv 또는 합성 리간드인, 벡터.
  28. 청구항 27에 있어서, 모이어티는 TGFβ, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3, IL-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-13, IL-27, IL-35, IL-37, GM-CSF, FLT3L, CCL19, CCL21, ICAM-1, 케라틴, VSIG-3, 좋기로는 VSIG-3, SCGB3A2, CTLA-4의 세포외 도메인, 좋기로는 CTLA-4의 세포외 도메인, PD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, BTLA, 좋기로는 BTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 리간드인, 벡터.
  29. 청구항 28에 있어서, 모이어티는 hTGFβ, hIL-10, hIL-2, hIL-4, hIL-6, hIL-11, hIL-13, hIL-27, hIL-35, hIL-37, hGM-CSF, hFLT3L, hCCL19, hCCL21, hICAM-1, h케라틴, hVSIG-3, 좋기로는 hVSIG-3의 세포외 도메인, hSCGB3A2, hCTLA-4, 좋기로는 hCTLA-4의 세포외 도메인, hPD-1, 좋기로는 PD-1의 세포외 도메인, 및 hBTLA, 좋기로는 hBTLA의 세포외 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 천연 리간드인, 벡터.
  30. 청구항 23 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 유닛은 hIL1-10, hTGFβ, 예컨대 hTGFβ-1, hTGFβ-2 및 hTGFβ-3, hSCGB3A2 또는 hVSIG-3, 좋기로는 hVSIG-3의 세포외 도메인이거나 이를 포함하는 벡터.
  31. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛, 삼량체화 유닛, 예컨대 콜라겐 유래 삼량체화 유닛, 예컨대 인간 콜라겐 유래 삼량체화 도메인, 예컨대 인간 콜라겐 유래 XVIII 삼량체화 도메인 또는 인간 콜라겐 XV 삼량체화 도메인 또는 T4 피브리틴의 C-말단 도메인 및 사량체화 유닛, 예컨대 p53으로부터 유래된 도메인이고, 여기서 상기 다량체화 유닛은 선택적으로 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4와 같은 힌지 영역을 포함하는, 벡터.
  32. 청구항 31에 있어서, 벡터는 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 힌지 영역을 포함하고 좋기로는 Ig 유래된 것인, 벡터.
  33. 청구항 31 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 유닛은 이량체화 유닛이고, 상기 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 추가로 포함하며, 좋기로는 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 더욱 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인인, 벡터.
  34. 청구항 33에 있어서, 다른 도메인은 IgG, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인, 벡터.
  35. 청구항 33 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 이량체화 유닛이 GGGSSGGGSG와 같은 글리신-세린 풍부 링커와 같은 이량체화 유닛 링커를 추가로 포함하고, 좋기로는 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 것인, 벡터.
  36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 이량체화 유닛이 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4, 이량체화 유닛 링커 및 인간 IgG3의 CH3 도메인을 포함하는, 벡터.
  37. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 항원 유닛을 다량체화 유닛에 연결하는 유닛 링커를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 상기 유닛 링커는 비면역원성 링커이고/이거나는 유연하거나 견고한 링커인, 벡터.
  38. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하고, 좋기로는 하나 이상의 추가 핵산 서열 역시도 신호 펩티드를 추가로 인코딩하는, 벡터.
  39. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 RNA 바이러스 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 RNA 플라스미드 또는 DNA 플라스미드와 같은 플라스미드인, 벡터.
  40. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 시험관내에서 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계;
    b) 상기 세포를 배양하는 단계;
    c) 선택적으로, 세포를 용해시켜 세포로부터 벡터를 방출시키는 단계; 및
    d) 벡터를 수집하고 선택적으로 정제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  41. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 동물 또는 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  42. 약제로서 사용하기 위한 것인, 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 정의된, 벡터.
  43. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 조성물은 형질감염제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  45. 청구항 43 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 덱사메타손, 장독소 콜레라 독소의 B 서브유닛(CTB), TLR2 리간드, 기생충 유래 배설/분비(ES) 생성물, 라파마이신 비타민 D3 유사체 및 아릴 탄화수소 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 아주반트와 같은 아주반트를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  46. 청구항 43 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터, 예를 들어 상기 DNA 플라스미드를 0.1 내지 10 mg 범위로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  47. 자가면역 질환, 알레르기 질환 및 이식 거부반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 질환을 앓고 있거나 그의 예방이 필요한 대상을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터 또는 청구항 43 내지 46 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 자가면역 질환을 앓고 있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1 내지 14 및 21 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터 또는 이러한 벡터를 포함하는 청구항 43 내지 46 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 알레르기 질환을 앓고 있거나 이의 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 11, 15 내지 18 및 21 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 청구항 43 내지 46 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 이식 거부를 앓고 있거나 이의 예방이 필요한 대상체를 치료하는 방법으로서, 청구항 1 내지 11 및 19 내지 39 중 어느 한 항에 정의된 벡터, 또는 이러한 벡터를 포함하는 청구항 43 내지 46 중 어느 한 항에 정의된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  51. 청구항 47 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여되고, 예컨대 피내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 점막 또는 상피 적용, 예컨대 비강내 또는 경구에 의해 투여되는, 방법.
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