KR20230004585A - 개별화된 치료용 항암 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개별화된 치료용 항암 백신, 이러한 항암 백신이 사용되는 암의 치료 방법 및 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

개별화된 치료용 항암 백신

본 발명은 개별화된 치료적 항암 백신, 이러한 항암 백신이 사용되는 암의 치료 방법 및 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

암의 치료는 특히 조기 발견 및 진단으로 인해 지난 수십 년 동안 개선되어 생존율이 크게 증가했지만 암 진단을 받은 환자의 약 60%만이 진단 후 5년 동안 생존한다. 현재 사용되고 있는 대부분의 암 치료법은 수술, 방사선, 세포독성 화학요법이지만 모두 심각한 부작용이 있다. 지난 몇 년 동안 환자 자신의 면역 체계의 도움으로 암세포를 표적으로 하는 암 면역 요법, 즉 항암 백신은 이러한 요법이 전통적인 암 치료에서 볼 수 있는 일부 부작용을 줄이거나 제거할 수 있기 때문에 관심의 대상이 되어 왔다.

면역학의 기초는 자기-비자기-차별에 기반을 두고 있다. 감염성 질병을 유발하는 대부분의 병원체는 숙주가 인식하고 면역 반응을 유발할 수 있는 분자적 특징을 포함한다. 그러나 종양세포는 정상세포에서 유래하며, 일반적으로 어떠한 분자적 특징도 발현하지 않아 정상세포와 구별하기 어렵다. 그럼에도 불구하고 대부분의 종양 세포는 다양한 유형의 종양 항원을 발현한다. 이들은 공유 종양 항원(shared tumor antigens), 즉 여러 개체에서 동일한 종류의 종양에 의해 발현되거나 여러 개체에서 다양한 종양에 의해 발현되는 항원 또는 특정 환자에서 발견되는 환자-특이적 항원일 수 있다.

공유 종양 항원에는 과발현되거나 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 종양 유전자 또는 종양 억제 유전자의 돌연변이 및 바이러스 항원이 포함된다. 환자-특이적 종양 항원은 종양 게놈의 하나 이상의 돌연변이로 인해 발생하여 해당 단백질의 아미노산 서열이 변경될 수 있다. 여기에는 비동의(non-synonymous) 돌연변이, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 융합 항원 및 인트론 보유 항원이 포함된다.

발명의 개요

본 발명자들은 그를 위해 백신이 설계되고 제조되는 대상 환자-존재 공유 종양 항원 및 선택적으로 이에 추가하여 환자-특이적 종양 항원에 대한 면역 반응을 높이는 개별화된 항암 백신(individualized anticancer vaccine)이, 종양 세포의 성장을 조절하거나 억제하는데 필요한 항암 면역 반응을 향상시킨다는 것을 깨달았다.

정의

종양은 현재 문맥에서 혈액과 같은 체액에서 발견되는 종양 세포 뿐만 아니라 고형 종양 모두에 대해 사용된다.

환자-특이적 종양 항원, 환자-특이적 암 항원 및 환자-특이적 항원은 본원에서 특정 개체/환자에서 발견되는 종양 항원에 대해 상호교환적으로 사용되며, 여기서 상기 종양 항원은 환자의 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 발견되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

환자-특이적 종양 에피토프, 환자-특이적 암 에피토프, 환자-특이적 에피토프 및 네오에피토프는 본원에서 환자-특이적 종양 항원에 포함된 펩티드와 상호교환적으로 사용되며, 이 펩티드는 하나 이상의 면역원성 돌연변이를 포함한다.

환자-특이적 종양 에피토프 서열, 환자-특이적 암 에피토프 서열, 환자-특이적 에피토프 서열 및 네오에피토프 서열은 에피토프/네오에피토프를 암호화하는 핵산 서열 또는 에피토프/네오에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 기술하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

공유 종양 항원(shared tumor antigen), 공유된 암 항원(shared cancer antigen) 및 공유 항원(shared antigen)은 복수의 개체에서 동일한 종류의 종양에 의해 발현되거나 복수의 개체에서 다양한 종양에 의해 발현되는 종양 항원을 설명하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

공유 종양 항원 서열, 공유된 암 항원 서열 및 공유 항원 서열은 공유 항원의 일부 또는 전체를 포함하는 아미노산 서열 또는 암호화하는 핵산 서열을 기술하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

환자-존재 공유 종양 항원, 환자에 존재하는 공유된 암 항원 및 환자-존재 공유 항원은 상기 환자에 존재하거나 존재하는 것으로 확인된 공유 종양 항원을 기술하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

환자-존재 공유 종양 항원 서열, 환자에 존재하는 공유된 암 항원 서열 및 환자-존재 공유 항원 서열은 상호교환적으로 사용되어 환자에 존재하는 공유되니 항원의 일부 또는 전체를 포함하는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 기술하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

개별화된 치료용 항암 백신은 개체/환자에 이미 존재하는 종양 세포를 인식하고 이러한 종양 세포의 성장을 제어 또는 억제할 수 있는 면역 반응을 자극하기 위한 목적으로, 상기 특정 개체/환자를 위해 설계 및 제조된 백신을 설명하는 데 사용된다.

개체(indivisual) 및 환자는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 암이 있거나 암이 의심되는 특정 인간을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

암은 돌연변이로 인해 세포가 비정상적이고 통제되지 않는 증식을 시작하는 하나 또는 몇 개의 세포에 의해 환자의 정상 조직에서 발생한다. 암 세포는 돌연변이가 되더라도 게놈의 대부분은 손상되지 않고 환자의 나머지 세포와 동일한다. 종양을 공격하는 한 가지 접근 방식은 개체/환자의 모든 종양이 고유하다는 지식을 기반으로 한다: 환자-특이적 돌연변이는 특정 환자에게 고유한 환자-특이적 돌연변이 단백질(종양-특이적 항원)의 발현으로 이어진다. 이러한 종양-특이적 및 환자-특이적 항원은 환자의 정상 세포에 있는 어떤 단백질과도 동일하지 않다. 따라서, 이러한 환자-특이적 항원은 해당 환자를 위해 특이적으로 제조된 치료용 항암 백신, 즉 개별화된 치료용 항암 백신의 적합한 표적이어야 한다. 이러한 유형의 항암 백신의 과제는, 비록 환자-특이적 항원이 예측된 치료 효능에 따라 백신에 포함하기 위해 선택되기는 하지만, 전체가 아닌 일부만이 임상 환경에서 예상되는 치료 효능을 나타낸다는 것이다. 따라서 이에 대한 개선이 필요한다.

공유 종양 항원은 동일한 암 유형을 가진 환자 또는 환자 및 암 유형에 걸쳐 많은 종양에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 HPV16 항원은 모든 두경부 편평 세포 암종(SCCHN) 환자의 약 50%에서 발현되지만 자궁경부암 및 외음부 편평 세포 암종(vSCC)과 같은 다른 암 환자에서도 발현되는 바이러스 항원이다. 이러한 공유 항원의 대부분은 이전에 면역원성 및/또는 특정 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립유전자(alleles)로 특성화되었다. 공유 항원은 많은 환자에게 사용되는 기성품(off-the-shelf) 치료용 항암 백신에 포함될 수 있다(예를 들어 WO 2013/092875 참조). 그러나 이러한 유형의 항암 백신은 일부 환자에서 임상 효능을 나타내지만 다른 환자에서는 치료 효능이 전혀 또는 거의 나타나지 않다.

T 세포 반응은 각 환자의 HLA 분자에 대한 암 에피토프의 처리 및 표시에 따라 달라진다. HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자의 다양성으로 인해 여러 환자에게 사용되는 기성품 백신은 광범위한 HLA 분자에 존재하는 에피토프를 항원이 포함할 가능성을 최적화하기 위해 일반적으로 큰 전장 항원을 포함한다. 그러나 환자는 그 특정 환자의 HLA 분자와 일치하는 에피토프를 포함하는 더 짧은 항원 서열만을 필요로 할 것이다. 따라서 모든 환자의 모든 종양 항원을 포괄하는 기성품 항암 백신을 설계하고 생산하는 것은 불가능한다.

또한, 하나의 종양 항원만을 표적으로 하는 기성품 치료용 항암 백신은 종양에서 일반적으로 발견되는 종양 이질성을 무시하며 하나의 항원에 대한 면역 압력은 상이한 돌연변이를 갖는 종양 클론을 생성할 수 있다.

본 발명은 선택적으로 환자-특이적 항원에 추가하여 환자-존재 공유 항원을 표적화하는 개별화된 치료용 항암 백신을 제공한다. 이것은 환자-특이적 항원만을 포함하는 항암 백신 또는 공유 항원을 포함하는 기성품 항암 백신에 비해 치료 효과를 증가시킬 것이다.

본 발명의 백신에 포함될 환자-존재 공유 항원은 공지된 면역원성, 공지된 발현 패턴 및 특정 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 대한 공지된 결합을 가질 수 있다. 환자에게 존재하는 공유 항원에 특이적인 T 세포는 종양으로 이동하여 종양 미세 환경에 영향을 미치므로 추가의 종양-특이 T 세포가 종양 세포를 공격할 가능성이 높아진다. 종양은 다양한 정도로 이질적이며 따라서 백신에 포함된 환자-존재 공유 항원의 다른 서브세트를 발현하는 종양 세포로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 개별화 백신 내에 환자-존재 공유 항원 및 선택적으로 환자-특이적 항원을 포함하는 것은 종양으로 이동하는 활성화된 T 세포의 역치에 도달시 면역 미세 환경의 이동으로 인해 여러 또는 모든 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 가능성을 높인다.

본 발명에 따른 백신은 정상적인 적응 면역체계(adaptive immune system)를 사용하여 종양 세포에 대한 면역을 제공한다. 적응 면역 시스템은 모든 항원이 항원 제시라고 하는 과정 동안 특정 항원을 인식함으로써 상기 항원에 대해 특이적으로 면역 반응을 유발한다는 점에서 특이적이다. 적응 면역 체계의 세포는 림프구, 특히 B 세포 및 T 세포이다. B 세포는 체액성 면역 반응에 관여하는 반면 T 세포는 세포-매개형 면역 반응에 관여한다.

특히, 본 발명에 따른 백신은 종양 항원에 대한 T 세포의 활성화를 통해 세포-매개형 면역 반응을 유발하도록 설계된다. T 세포는 에피토프를, 그들이 처리되어 후술되는 바와 같이 MHC 분자와 복합되어 제시될 때 인식한다.

주조직적합성 복합체(MHC)

본 발명에 따른 백신에 포함된 공유 항원의 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열은 MHC-펩티드 복합체로서 MHC 분자의 펩티드-결합 그루브에 제시되도록 설계된다. 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에는 MHC I 및 MHC II의 두 가지 기본 클래스가 있다. MHC(클래스) I 및 MHC(클래스) II라는 용어는 여기에서 HLA(클래스) I 및 HLA(클래스) II와 호환되어 사용된다. 인간 백혈구 항원(HLA)은 인간의 주조직적합성 복합체이다.

MHC I은 신체의 모든 유핵 세포의 세포 표면에서 발견된다. MHC I의 기능 중 하나는 세포 내에서 세포독성 T 세포로 비자기(non-self) 단백질의 펩티드를 표시하는 것이다. MHC I 펩티드 복합체는 세포독성 T 세포에 펩티드를 제시하는 세포의 원형질막에 삽입됨으로써, 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 세포독성 T 세포의 활성화가 촉발된다. 펩티드는 MHC I 분자의 그루브 내에 위치하여 펩티드 길이가 약 8-10개 아미노산이 되도록 한다.

MHC II 분자는 일반적으로 수지상 세포, 단핵 식세포, 일부 내피 세포, 흉선 상피 세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포에서만 발견되는 분자 패밀리이다.

MHC I과는 대조적으로, MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 항원은 세포외 단백질에서 유래한다. 세포외 단백질은 세포내이입되고, 리소좀에서 소화되며, 생성된 펩티드는 MHC 클래스 II 분자에 로드된 다음 세포 표면에 제시된다. MHC 클래스 II 분자의 항원-결합 그루브는 양 말단이 개방되어 있고 일반적으로 15~24개 아미노산 잔기 길이의 더 긴 펩티드를 제공할 수 있다.

MHC 클래스 I 분자는 일반적으로 CD8+ T 세포(또는 CD8+ 세포)라고 칭해지는, T 세포의 CD8 및 공동 수용체에 의해 인식되는 반면, MHC 클래스 II 분자는 일반적으로 CD4+ T 세포(또는 CD4+ 세포)라고 하는, T 세포의 CD4 및 공동 수용체에 의해 인식된다.

백신

본 발명의 개별화된 항암 백신은 3개의 유닛, 즉, 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이량체화 유닛로 인해 폴리펩타이드는 이량체 단백질, 이른바 백시바디(vaccibody)를 형성한다.

3개의 유닛을 암호화하는 유전자는 하나의 유전자로 발현되도록 유전적으로 조작된다. 생체내에서 발현될 때, 폴리펩타이드/이량체 단백질은 항원 제시 세포(APC)를 표적으로 하므로, 동일한 비표적 항원에 비해 백신 효능이 향상된다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

세 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

네 번째 측면에서, 본 발명은:

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다); 또는

(ii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질

의 면역학적 유효량; 및

약학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신에 관한 것이다.

일 구체예에서, 본 발명은:

(a) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다)의 면역학적 유효량; 및

(b) 제약상 허용되는 담체

를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은:

(a) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 이량체 단백질 또는 폴리펩티드(여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다)의 면역학적 유효량; 및

(b) 제약상 허용되는 담체

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 이량체 단백질 및 개별화된 치료용 항암 백신에 포함된 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다. 일 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 암 고환 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아(oncofetal) 항원, 공유된 융합 항원, 공유된 인트론 보유 항원, 암흑 물질(dark matter) 항원, 스플라이세오솜 돌연변이로 인한 공유 항원 및 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 공유 항원이다.

일 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질, 즉 정상의 건강한 세포 및 조직과 비교하여 종양에서 증가된 수준으로 발견되는 세포 단백질이다. 이러한 과발현 또는 비정상적으로 발현된 세포 단백질의 예에는 종양 단백질 D52, Her-2/neu, hTERT(텔로머라제) 및 서바이빈이 포함된다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 그의 발현이 정상 고환 조직 뿐만 아니라 인간 악성종양에서 발생하는 암 고환 항원이다. 암 고환 항원의 예로는 MAGE-A, MAGE-B, GAGE, PAGE-1, SSX, HOM-MEL-40 (SSX2), NY-ESO-1, LAGE-1 및 SCP-1을 들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 분화 항원, 예를 들어 티로시나제 및 TRP-2이다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 항원의 예로는 인유두종 바이러스(HPV), B형 간염 바이러스(HBV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(KSHV), 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCV 또는 MCPyV), 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) 및 인간 T-림프자극성 바이러스(HTLV)를 들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 돌연변이된 종양유전자이다. 돌연변이된 종양유전자의 예로는 KRAS, PIK3CA 돌연변이 및 EGFR 돌연변이를 포함하는 RAS 돌연변이를 들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 돌연변이된 종양 억제 유전자이다. 이의 예로는 돌연변이된 p53, 돌연변이된 pRB, 돌연변이된 BCL2 및 돌연변이된 SWI/SNF가 있다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 종양태아 항원, 예를 들어 알파-태아단백질 또는 암배아 항원이다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 공유 인트론 보유 항원 또는 프레임시프트 돌연변이에 의해 유발된 공유 항원, 예를 들어 CDX2 또는 CALR이다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원은 스플라이세오좀 돌연변이에 의해 유발된 공유 항원이다. 예를 들어 SF3B1 돌연변이와 같은 돌연변이로 인한 항원이 있다.

어떠한 암 항원이든, 환자가 암에 걸렸을 때 면역 관용이 발생했을 가능성이 있다. 항암 백신은 백신에 포함된 항원에 대한 면역 반응을 특이적으로 유발해야 한다. 선택된 항원에 대한 말초 면역 내성은 약하거나 강할 수 있다. 환자는 정상 조직에서도 발현되는 공유 항원, 즉 과발현된 항원 및 분화 항원과 같은 인간 세포 단백질에 대해 중추 면역 관용을 확립할 가능성이 더 높다. 이러한 공유 항원 서열 또는 이의 일부를 항원 유닛에 통합함으로써(단독으로 또는 다른 환자-존재 공유 항원 서열 및 임의로 환자-특이적 항원 서열과 함께), 항원 유닛을 포함하는 본 발명에 따른 백신은 종양 미세 환경에 영향을 미치고 종양에 대한 환자의 면역 반응을 억제성(suppressive)/내약형(tolerated) 유형에서 전-염증성 유형의 면역 반응으로 변경하기에 충분히 강하고 광범위한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 이것은 여러 다른 항원에 대한 내성을 깨는 데 도움이 될 수 있으므로 환자에게 상당한 임상적 이점을 나타낸다. 전술한 개념은 암 면역 설정점을 티핑(tipping)하는 것으로 지칭할 수 있다.

따라서, 일 구체예에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 인간 세포 단백질, 좋기로는 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질 또는 분화 항원인 공유 항원이다.

적어도 하나의 환자-존재 공유 항원은 다음을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 환자의 조직 또는 체액에서 검출될 수 있다:

● 환자의 게놈 또는 엑솜을 시퀀싱하고 선택적으로 전체 게놈/엑솜-서열 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색하여 예를 들어 돌연변이된 종양 유전자 또는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 식별하는 방법;

● 돌연변이 단백질의 존재를 검출하기 위한 환자의 종양 조직의 면역조직화학;

● 바이러스 항원의 존재 또는 종양유전자의 알려진 돌연변이를 탐지하기 위한 RT-PCR;

● 혈청 샘플에서 돌연변이된 종양 단백질에 대한 항체를 사용하는 ELISA;

● 공유 항원의 발현/과발현을 검출하기 위한 종양 조직의 RNA-seq 및 건강한 조직과의 비교;

● 인트론 보유 항원을 식별하기 위해 원시 RNA 서열 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색하는 방법;

● 암흑 물질 항원의 요소인 전이가능한 요소를 식별하기 위해 전체 게놈-seq 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색하는 방법;

● 암흑 물질 항원을 식별하기 위해 원시 전체 엑솜/RNA 서열 데이터에서 짧은 반복물을 검출하는 방법;

● 공유 바이러스 항원을 식별하기 위한 RNA-seq 데이터; 및

● 환자의 종양 샘플의 RNA-seq를 환자 자신의 건강한 조직 또는 코호트/데이터베이스(예: TCGA) 대 GTEX/HPA 유전자 발현 데이터와 비교하는 방법.

바람직한 일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 다른 환자에서 면역원성 반응을 나타낸 바 있거나, 다른 환자에서 면역 반응을 이끌어낸 것으로 설명된 바 있거나, 또는 특정 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예상되는, 그러한 항원 서열의 일부(들)을 포함한다. 또 다른 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립형질에 결합할 것으로 예측되는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 추가의 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 하나 이상의 에피토프를 포함한다.

일 구체예에서, 항원 유닛은 특정 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이를 갖는 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다. 따라서, 일 구체예에서 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 일부는 7 내지 30개 아미노산 길이이다. 또 다른 구체예에서, 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 일부는 7 내지 10개 아미노산의 길이 또는 13 내지 30개 아미노산의 길이, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 예컨대 9개 아미노산의 길이를 갖는다.

항원 유닛은 전장으로 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열을 포함할 수 있거나 이의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 환자-존재 공유 항원 서열의 한 부분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 환자-존재 공유 항원 서열의 여러 부분을 포함한다. 항원 유닛은 복수개의 환자-존재 공유 항원 서열, 즉, 각각이 그러한 각 항원의 전장 또는 하나 이상의 부분인 여러 환자-공유 항원의 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 전장의 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 및 하나 이상의 다른 환자-존재 공유 항원 서열의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 하나의 다른 환자-존재 공유 항원 서열의 한 부분 또는 하나의 다른 환자-존재 공유 항원 서열의 여러 부분 또는 여러 다른 환자-존재 공유 항원 각각의 서열의 한 부분 또는 여러 다른 환자-존재 공유 항원의 일부 또는 각각의 서열의 여러 부분을 포함한다. 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원의 서열, 예를 들어, 여러 환자-존재 공유 항원의 서열의 여러 부분, 더욱 좋기로는 여러 환자-존재 공유 항원의 여러 에피토프를 포함하되, 여기서 이 에피토프는 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자, 좋기로는 특정 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 에피토프이다

또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 전장의 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 및 하나 이상의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 부분을 포함한다. 이의 예에는 다음이 포함된다:

● 전장의 하나의 환자-존재 공유 항원 및 하나의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및

● 각각이 전장인 여러 환자-존재 공유 암 항원 및 하나의 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및

● 전장의 하나의 환자-존재 공유 항원 및 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛; 및

● 각각이 전장인 여러 환자-존재 공유 암 항원 및 여러 환자-존재 공유 암 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 유닛.

또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 전장의 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 전장의 여러 환자-존재 공유 항원 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 1 내지 10개의 환자-존재 공유 항원 서열을 전장으로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 예컨대 약 28 내지 100개의 아미노산 길이의 긴 펩티드 서열 형태, 또는 그러한 긴 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 형태로 환자-존재 공유 항원 서열의 1 내지 30 부분을 포함하되, 여기서 상기 긴 펩타이드 서열은 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 복수의 에피토프를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 짧은 펩티드 서열/에피토프 또는 이러한 짧은 펩티드 서열/에피토프를 암호화하는 핵산 서열의 형태로 환자-존재 공유 항원 서열의 1 내지 50 부분을 포함한다.

일 구체예에서 3 내지 50개의 환자-존재 공유 항원 서열, 예컨대 3 내지 30개 서열, 예컨대 3 내지 20개 서열, 예컨대 3 내지 15개 서열, 또는 예컨대 3 내지 10개 서열이 항원 유닛에 포함된다.

또 다른 구체예에서, 5 내지 50개의 환자-존재 공유 항원 서열, 예컨대 5 내지 30개의 서열, 예컨대 5 내지 25개의 서열, 예컨대 5 내지 20개의 서열, 예컨대 5 내지 15개의 서열 또는 5 내지 10개의 서열이 항원 유닛에 포함된다.

추가 구체예에서, 10 내지 50개의 환자-존재 공유 항원 서열, 예컨대 10 내지 40개의 서열, 예컨대 10 내지 30개의 서열, 예컨대 10 내지 25개의 서열, 예컨대 10 내지 20개의 서열 또는 예를 들어 10 내지 15개의 서열이 항원 유닛에 포함된다.

종양이 면역 체계를 벗어나는 것을 피하기 위해 예를 들어 항암 백신의 표적인 항원의 발현을 차단하기 위해, 복수의 상이한 환자-존재 공유 항원의 서열 및 임의로 복수의 상이한 환자-특이적 항원의 서열을 항원 유닛에 포함시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 종양이 면역계를 탈출하기 위해 차단해야 하는 유전자가 많을수록, 종양이 여전히 증식하거나 심지어 생존하면서 동시에 실제로 모든 유전자를 차단할 수 있는 가능성은 낮아진다. 더욱이, 종양은 모든 환자-존재 공유 항원 또는 환자-특이적 항원이 모든 종양 세포에 의해 발현되지 않는다는 점에서 이질적일 수 있다.

따라서, 바람직일 구체예에서, 접근법은 종양 세포에 의해 발현되는 더 많은 종양 항원을 인식할 수 있는 T-세포를 활성화함으로써 종양을 효율적으로 공격하기 위해 가능한 한 많은 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열을 본 발명의 백신의 항원 유닛에 포함시키는 것이다. 또한, 모든 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열이 동일한 항원 제시 세포에 효율적으로 흡수되도록 하기 위해, 이들을 하나의 아미노산 사슬로, 또는 불연속적인 펩타이드 대신 하나의 아미노산 사슬(즉 항원 유닛)을 암호화하도록 배열한다. 그러나, 전술한 바와 같이, 본 발명의 백신의 목적은 항원 유닛에 포함된 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열에 대해 환자의 T 세포를 활성화하는 것이며, 그러한 서열을 항원 유닛에 포함시키면 T 세포의 희석이 초래될 수 있다. 따라서, 항원 유닛에 포함시키기 위한 최적의 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열을 선택하는 것이 중요하다.

최적의 환자-존재 공유 항원 서열은 면역원성이 있는 것으로 알려진 것들이다. 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 대립유전자, 좋기로는 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다.

항원 유닛을 "최적의 사용"으로 만드는 것이 바람직한다. 즉, 항원 유닛은 항원 유닛의 면역원성에 기여하지 않는 아미노산/서열을 가능한 최소한의 수로 포함하는 것이 좋다. 예를 들어, 전장(full-length)의 환자-존재 공유 항원 서열이 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 대립유전자에 결합할 것으로 예상되는 몇몇 에피토프만 함유할 뿐 서열의 나머지는 항원 유닛의 면역원성에 기여하지 않을 경우, 그러한 전장의 환자-존재 공유 항원 서열을 항원 유닛에 포함하는 것은 덜 바람직한다. 다른 한편으로, 그러한 서열이 서로 근접해 있는 그러한 에피토프를 여러 개 또는 다수 포함하는 경우, 전장의 환자-존재 공유 항원 서열을 함유하는 것이 합리적일 수 있다.

항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열을 추가로 포함할 수 있다. 환자-특이적 항원은 환자 종양의 게놈 또는 엑솜을 시퀀싱하여 동정할 수 있다. 환자의 정상 조직 엑솜과 비교하여 이러한 서열은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산의 변화를 초래하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 따라서 돌연변이는 다음 중 하나일 수 있다.

● 아미노산의 변화로 이어지는 비동의 돌연변이

● 프레임시프트를 초래함으로써 돌연변이 후 그 방향에서 완전히 다른 오픈 리딩 프레임을 초래하는 돌연변이

● 정지 코돈이 수정되거나 삭제되어 종양-특이적 에피토프가 있는 더 긴 단백질로 이어지는 리드-쓰루(read-through) 돌연변이

● 고유한 종양-특이적 단백질 서열로 이어지는 스플라이스 돌연변이

● 두 단백질의 접합부에 종양-특이적 에피토프가 있는 키메라 단백질을 생성하는 염색체 재배열.

항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 하나 이상의 (여러) 환자-특이적 항원 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 이러한 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열, 좋기로는 하나 이상의 환자-특이적 에피토프의 하나 이상의 부분을 포함한다.

에피토프는 좋기로는 상기 논의된 MHC 분자에 의한 제시에 적합한 길이를 갖는다. 따라서, 바람직일 구체예에서 에피토프는 7 내지 30개의 아미노산 길이이다. 7 내지 10개 아미노산 길이를 갖는 에피토프 서열 또는 13 내지 30개 아미노산 길이, 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산을 갖는 에피토프 서열이 더 바람직하다.

바람직한 일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-특이적 에피토프 또는 적어도 5개의 환자-특이적 에피토프 또는 적어도 10개의 환자-특이적 에피토프를 포함한다. 또 다른 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 20개의 환자-특이적 에피토프와 같은 적어도 15개의 환자-특이적 에피토프를 포함한다.

일 구체예에서, 3 내지 50개의 환자-특이적 항원 서열, 예컨대 3 내지 30개의 서열, 예컨대 3 내지 20개의 서열, 예컨대 3 내지 15개의 서열 또는 예컨대 3 내지 10개의 서열과 같은 3 내지 50개의 환자-특이적 항원 서열이 항원 유닛에 포함된다. 바람직일 구체예에서, 이러한 서열은 에피토프이다.

또 다른 구체예에서, 예컨대 5 내지 30개의 서열, 예컨대 5 내지 25개의 서열, 예컨대 5 내지 20개의 서열, 예컨대 5 내지 15개의 서열이 항원 유닛에 포함된다. 시퀀스 또는 5 내지 10개의 서열과 같은 5 내지 50개의 환자-특이적 항원 서열이 항원 유닛에 포함된다. 바람직일 구체예에서, 이러한 서열은 에피토프이다.

추가 구체예에서 예컨대 10 내지 30개의 서열, 예컨대 10 내지 25개의 서열, 예컨대 10 내지 20개의 서열이 항원 유닛에 포함될 수 있다. 시퀀스 또는 예를 들어 10 내지 15개의 서열과 같은 10 내지 50개의 환자-특이적 항원 서열이 항원 유닛에 포함될 수 있다. 바람직일 구체예에서, 이러한 서열은 에피토프이다.

특히 항원 유닛에 포함될 환자-특이적 항원 서열이 짧은 에피토프, 예를 들어, 수 개의 아미노산 길이에 불과한 짧은 에피토프인 경우, 이러한 짧은 에피토프는 아미노산 서열이 그의 양측에 인접해 있도록(flanked at both sides) 항원 유닛에 포함되는 것이 바람직하다. 좋기로는, 짧은 에피토프는 에피토프가 처리된 후 항원 제시 세포에 의해 제시되는 것을 보장하기 위해 본질적으로 2개의 인접(flanking) 서열의 중간에 위치한다. 인접 서열은 좋기로는 항원에서 에피토프를 플랭킹하는 아미노산 서열이다.

다음은 환자-존재 공유 항원 서열 및 그의 일부에 적용되며, 존재하는 경우 환자-특이적 항원 서열 및 그의 일부에도 적용된다. 따라서, 이하에서 항원 서열이라는 용어는 환자-존재 공유 항원 서열 및 그의 일부와 환자-특이적 항원 서열 및 그의 일부 양자 모두를 포함하는 것으로 사용 및 의도된다.

일 구체예에서, 항원 유닛은 각각의 항원 서열의 하나의 카피를 포함하여, 예를 들어 이러한 10 가지 상이한 이런 서열들이 항원 유닛에 포함되면, 상기 항원 유닛을 포함하는 백신은 10가지 상이한 항원 서열 모두에 대해 세포 매개 면역 반응을 유도한다.

그러나 몇몇 소수의 항원 서열만 항원 유닛에 포함되어 있는 경우 - 소수의 항원만 확인되었거나 확인된 항원 중 오직 소수만이 충분히 면역원성이거나/환자의 HLA 대립유전자에 알려져 있거나 결합할 것으로 예측되기 때문에 - 항원 유닛은 항원에 대한 면역 반응을 강화하기 위해 특정 항원 서열의 2개 이상의 카피를 포함할 수 있다.

항원 유닛의 길이는 주로 그 안에 포함된 항원 서열의 길이와 그 수에 의해 결정된다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 7 내지 2000개의 아미노산, 예를 들어, 21 내지 2000개의 아미노산, 좋기로는 약 30개의 아미노산 내지 약 1500개의 아미노산, 더욱 좋기로는 약 50 내지 약 1000개의 아미노산, 예를 들어 약 100 내지 약 500개의 아미노산 또는 약 100 내지 약 400개의 아미노산 또는 약 100 내지 약 300개의 아미노산을 포함한다.

항원 서브유닛에서 항원 서열이 무작위로 배열된다면 종양에 대한 적절한 면역 반응을 얻는 것이 가능하지만, 면역 반응을 향상시키기 위해서는 항원 유닛에서 이들을 배열하기 위한 다음의 방법들 중 적어도 하나를 따르는 것이 바람직하다:

항원 유닛은 N-말단 시작 및 C-말단 엔드을 갖는 폴리펩티드로 설명될 수 있다. 항원 유닛은 좋기로는 유닛 링커를 통해 이량체화 유닛에 연결된다. 항원 유닛은 폴리펩티드/이량체 단백질의 COOH-말단 엔드 또는 NH2-말단 엔드에 위치한다. 항원 유닛은 폴리펩티드/이량체 단백질의 COOH-말단 엔드에 있는 것이 바람직하다.

항원 서열은 좋기로는 링커에 의해 분리된다. 일 구체예에서, 말단 항원 서열, 즉 이량체화 유닛에 연결되지 않은 항원 유닛의 말단에 위치한 항원 서열을 제외한 모든 것은 항원 서브유닛으로 배열되고, 각각의 서브유닛은 항원 서열 및 서브유닛 링커로 이루어진다. 링커에 의한 항원 서열의 분리로 인해, 각 항원은 면역계에 최적의 방식으로 제시된다.

일 구체예에서, 항원 서열은 항원 유닛의 N-말단 시작부로부터 항원 유닛의 C-말단 엔드까지의 방향으로, 좋기로는 항원 유닛의 C-말단 엔드을 향해 이량체화 유닛 방향으로, 항원성이 가장 큰 것에서 항원성이 가장 낮은 것으로 배열된다.

또 다른 구체예에서, 특히 친수성/소수성이 항원 서열 사이에서 크게 변하는 경우, 가장 소수성인 항원 서열(들)은 실질적으로 항원 유닛의 가운데(middle)에 존재/위치하고 가장 친수성인 항원 서열(들)은 항원 유닛의 시작 및/또는 말단부에 존재/위치하는 것이 바람직하다.

항원 유닛의 가운데에 위치하는 것은 항원 유닛이 홀수개의 항원 서열을 포함하는 경우에만 가능하기 때문에, 이 문맥에서 용어 "실질적으로"는 짝수개의 항원 서열을 포함하는 항원 유닛을 지칭하며, 여기서 가장 소수성인 항원 서열은 가능한 한 가운데에 가깝게 위치한다.

예를 들어, 항원 유닛은 5개의 항원 서브유닛을 포함하고, 각각은 하기와 같이 배열되는 상이한 항원 서열을 포함한다: 1-2-3*-4-5; 1, 2, 3*, 4 및 5. 여기서 각각은 다른 항원 서열이고 -는 링커이고 *는 가장 소수성인 항원 서열을 나타내며 항원 유닛의 가운데에 위치한다.

또 다른 예에서, 항원 유닛은 6개의 항원 서브유닛을 포함하고, 각각은 하기와 같이 배열되는 상이한 항원 서열을 포함한다: 1-2-3*-4-5-6 또는 별법으로: 1-2-4-3*-5-6; 1, 2, 3*, 4, 5 및 6. 이들 각각은 다른 항원 서열이고 -는 링커이고 *는 가장 소수성인 항원 서열을 나타내며 실질적으로 항원 유닛의 가운데에 위치한다. .

별법으로, 항원 서열은 친수성과 소수성 항원 서열이 교대로 배열될 수 있다.

또한, GC 클러스터를 피하기 위해서는 GC가 풍부한 항원 서열이 서로 인접하게 배열되어서는 안된다. 바람직일 구체예에서, 하나의 GC 풍부 항원 서열은 제2 GC 풍부 항원 서열이 뒤따르기 전에 적어도 하나의 비-GC 풍부 항원 서열이 뒤따른다.

일 구체예에서 항원 유닛은 하기 순서로 항원 서열을 포함한다: E7 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E6. 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 서열 14를 포함한다.

또 다른 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15를 포함한다. SEQ ID NO: 15는 하기 순서로 항원 서열을 포함한다:

T1D320 | 링커 | T1D814 | 링커 | T1D182 | 링커 | T1D689 | 링커 | E7 | 링커 | T1D339 | 링커 | T1D428 | 링커 |NY-ESO-1 | 링커 | T1D572 | 링커 | T1D359 | 링커 | T1D488 | 링커 | T1D554 | 링커 | T1D272 | 링커 | T1D210 | 링커 | T1D849 | 링커 | T1D4 | 링커 | T1D77 | 링커 | T1D717 | 링커 | T1D586 | 링커 | E6.

일 구체예에서 항원 유닛은 하기 순서로 항원 서열을 포함한다: E6 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E7. 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 SEQ ID NO: 16을 포함한다.

또 다른 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 SEQ ID NO: 16 및 SEQ ID NO: 17을 포함한다. SEQ ID NO: 17은 하기 순서로 항원 서열을 포함한다: E6 | 링커 | T1D323 | 링커 | T1D506 | 링커 | T1D12 | 링커 | T1D315 | 링커 | T1D302 | 링커 | T1D700 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D535 | 링커 | T1D358 | 링커 | T1D670 | 링커 | T1D294 | 링커 | T1D336 | 링커 | T1D499 | 링커 | T1D425 | 링커 T1D491 | 링커 | T1D314 | 링커 | T1D430 | 링커 | E7 | 링커 | T1D582.

일 구체예에서 항원 유닛은 하기 순서로 항원 서열을 포함한다: NY-ESO-1 | 링커 | E7 | 링커 | E6. 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 SEQ ID NO: 18을 포함한다.

또 다른 바람직일 구체예에서 항원 유닛은 SEQ ID NO: 18 및 SEQ ID NO: 19를 포함한다. SEQ ID NO: 19는 하기 순서로 항원 서열을 포함한다: T1D223 | 링커 | T1D164 | 링커 | T1D56 | 링커 | T1D36 | 링커 | T1D129 | 링커 | T1D274 | 링커 | T1D62 | 링커 | T1D5 | 링커 | T1D144 | 링커 | T1D441 | 링커 | T1D368 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D234 | 링커 | T1D162 | 링커 | T1D39 | 링커 | T1D272 | 링커 | E7 | 링커 | T1D328 | 링커 | T1D188 | 링커 | E6.

항원 유닛은 하나의 항원 서열을 다른 것과 분리하는 하나 이상의 링커 및 항원 유닛을 이량체화 유닛에 연결하는 링커(이하, 유닛 링커라고도 함)를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커는 각 항원 서열이 면역계에 최적의 방식으로 제시되도록 하며, 이는 항원 유닛이 본 발명의 백신에 포함되는 경우 백신의 효능을 증가시킨다.

하나 이상의 링커는 좋기로는 비-면역원성이도록 설계되고 좋기로는 또한 가요성이어서, 항원 유닛이 많은 수의 항원 서열을 포함하더라도 항원 서열이 최적의 방식으로 T 세포에 제시되도록 한다.

좋기로는, 하나 이상의 링커의 길이는 유연성을 확보하기 위해 4 내지 20개의 아미노산이다. 또 다른 바람직일 구체예에서, 하나 이상의 링커의 길이는 8 내지 20개 아미노산, 예를 들어 8 내지 15개 아미노산, 예를 들어 8 내지 12개 아미노산 또는 예를 들어 10 내지 15개 아미노산이다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 링커의 길이는 10개 아미노산이다.

특정 구체예에서, 항원 유닛은 10개의 항원 서열을 포함하고, 여기서 이들 서열 사이의 링커는 8 내지 20개 아미노산, 예를 들어 8 내지 15개 아미노산, 예를 들어 8 내지 12개 아미노산 또는 예를 들어 예를 들어 10~15개의 아미노산의 길이를 갖는다. 특정 구체예에서, 항원 유닛은 10개의 항원 서열을 포함하고 이들 서열 사이의 링커는 10개 아미노산의 길이를 갖는다.

하나 이상의 링커는 좋기로는 모두 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 항원 서열 중 하나 이상이 링커와 유사한 아미노산 모티프를 포함하는 경우, 항원 서열의 이웃하는 링커를 상이한 서열의 링커로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 항원 서열/링커 접합부가 그 자체로 면역원성 에피토프를 구성하는 것으로 예측되는 경우, 상이한 서열의 링커가 사용될 수 있다.

하나 이상의 링커는 좋기로는 세린(S)-글리신(G) 링커이거나, 또는 세린-글리신 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 GGGGS, GGGSS, GGGSG, GGGGS 또는 그의 다중 변이체, 예컨대 GGGGSGGGGS 또는 (GGGGS)_m, (GGGSS)_m, (GGGSG)_m를 포함하거나 이들로 이루어지며, 여기서, m은 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3의 정수이다. 바람직일 구체예에서, m은 2이다.

바람직한 일 구체예에서, 세린-글리신 링커는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 류신과 같은 적어도 하나의 류신(L)을 추가로 포함한다. 세린-글리신 링커는 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 류신을 포함할 수 있다. 좋기로는, 세린-글리신 링커는 1개의 류신 또는 2개의 류신을 포함한다.

일 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGGS, GLGGS, GGLGS, GGGLS 또는 GGGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSG, GLGSG, GGLSG, GGGLG 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSS, GLGSS, GGLSS, GGGLS 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.

또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGLGS, GGLLS, GLLGS, LGGLS 또는 GLGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGLSG, GLLSG, GGLSL, GGLLG 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGLSS, GGLLS, GGLLS, GLGSL 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.

또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 10개의 아미노산 길이를 갖고 1개의 류신 또는 2개의 류신을 포함하는 세린-글리신 링커이다.

일 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGGSGGGGS, GLGGSGGGGS, GGLGSGGGGS, GGGLSGGGGS 또는 GGGGLGGGGS를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSG GGGSG, GLGSGGGGSG, GGLSGGGGSG, GGGLGGGGSG 또는 GGGSLGGGSG를 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSSGGGSS, GLGSSGGGSS, GGLSSGGGSS, GGGLSGGGSS 또는 GGGSLGGGSS를 포함하거나 이로 이루어진다.

추가 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGGSLGGGS, GLGGSGLGGS, GGLGSGGLGS, GGGLSGGGLS 또는 GGGGLGGGGL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSGLGGSG, GLGSGGLGSG, GGLSGGGLSG, GGGLGGGGLG 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 링커는 서열 LGGSSLGGSS, GLGSSGLGSS, GGLSSGGLSS, GGGLSGGGLS 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 이루어진다.

일 구체예에서, 항원 유닛은 9개의 링커에 의해 분리된 10개의 항원 서열을 포함하며, 즉 말단 서열은 링커가 아니라 항원 서열이다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 14개의 링커에 의해 분리된 15개의 항원 서열 또는 19개의 링커에 의해 분리된 20개의 항원 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 링커에 의해 분리되는 10 내지 20개 또는 10 내지 25개의 항원 서열을 포함한다. 좋기로는, 상기 링커는 10개의 아미노산 길이를 갖는다. 링커는 또한 예를 들어 5 내지 12개의 아미노산과 같은 상기 본원에 정의된 바와 같은 임의의 길이를 가질 수 있다.

별법으로, 하나 이상의 링커는 GSAT 링커, 즉 하나 이상의 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌 잔기를 포함하는 링커 및 SEG 링커, 즉 하나 이상의 세린, 글루탐산 및 글리신 잔기를 포함하는 링커 또는 그의 다중 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

항원 유닛와 이량체화 유닛은 좋기로는 유닛 링커에 의해 연결된다. 유닛 링커는 폴리뉴클레오티드의 구성을 용이하게 하기 위해 제한 부위를 포함할 수 있다. 유닛 링커는 GLGGL 링커 또는 GLSGL 링커인 것이 바람직하다.

본 발명의 백신은 항원 제시 세포를 표적으로 하는 표적화 유닛을 포함한다. 표적화 유닛로 인해, 본 발명의 폴리펩타이드/이량체 단백질/백신은 수지상 세포(DC), 호중구 및 기타 면역 세포의 유인을 유도한다. 따라서, 표적화 유닛을 포함하는 폴리펩타이드/이량체 단백질/백신은 항원 유닛을 특정 세포에 표적화할 뿐만 아니라, 특정 면역 세포를 폴리뉴클레오타이드/이량체의 투여 부위로 동원(recruiting)함으로써 반응-증폭 효과(아쥬반트 효과)를 촉진할 것이다. 폴리펩티드/이량체 단백질/백신. 이러한 독특한 기전은 백신 자체가 아쥬반트 효과를 제공하기 때문에 환자가 어떠한 추가 아쥬반트 없이 본 발명의 백신을 받을 수 있는 임상 환경에서 매우 중요하다.

본원에 사용된 용어 "표적화 유닛"는 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II 제한 제시를 위해 또는 MHC 클래스 I 제한에 의한 CD8+ T 세포에 대한 교차 제시를 제공하기 위해 항원 제시 세포에 그의 항원 유닛과 함께 폴리펩티드/이량체 단백질/백신을 전달하는 유닛을 지칭한다.

표적화 유닛은 이량체화 유닛을 통해 항원 유닛에 연결되며, 여기서 후자는 폴리펩티드/이량체 단백질의 COOH-말단 또는 NH2-말단 엔드에 있다. 항원 유닛은 폴리펩티드/이량체 단백질의 COOH-말단 엔드에 있는 것이 바람직하다.

표적화 유닛은 수지상 세포(DC)의 서브세트 상에서만 발현되는 분자와 같은 관련 항원 제시 세포 상에서 발현되는 표면 분자에 대해 본 발명의 폴리펩타이드/이량체 단백질/백신을 표적화하도록 설계된다.

APC 상의 이러한 표적 표면 분자의 예는 HLA, 분화 클러스터 14(CD14), 분화 클러스터 40(CD40), 케모카인 수용체 및 Toll-유사 수용체(TLR)이다. 케모카인 수용체에는 C-C 모티프 케모카인 수용체 1(CCR1), C-C 모티프 케모카인 수용체 3(CCR3) 및 C-C 모티프 케모카인 수용체 5(CCR5) 및 XCR1이 포함된다. 톨-유사 수용체는 예를 들어 TLR-2, TLR-4 및/또는 TLR-5를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드/이량체 단백질/백신은 예를 들어 HLA, CD14, CD40 또는 Toll-유사 수용체에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 항체 결합 영역; 리간드, 예를 들어 가용성 CD40 리간드; 케모카인과 같은 천연 리간드, 예컨대, C-C모티프 리간드(CCL5 또는 RANTES)로도 칭해지는 케모카인 리간드 5 또는 대식세포 염증 단백질 알파(CCL3 또는 MIP-1a/MIP1-α); 케모카인 모티프 리간드 1 또는 2(XCL1 또는 XCL2) 또는 박테리아 항원, 예를 들어 플라겔린을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 유닛에 의해 상기 표면 분자에 표적화될 수 있다.

일 구체예에서, 표적화 유닛은 MHC 클래스 II 단백질에 대한 친화성을 갖는다. 따라서, 일 구체예에서 표적화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 항-HLA-DP, 항-HLA-DR 및 항-pan HLA 클래스 II로 이루어진 군으로부터 선택된 MHC 클래스 II 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (VL 및 VH)을 암호화한다.

또 다른 구체예에서, 표적화 유닛은 CD40, TLR-2, TLR-4 및 TLR-5로 이루어진 군으로부터 선택된 표면 분자에 대한 친화성을 갖는다. 따라서, 일 구체예에서 표적화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4 및 항-TLR-5에 대해 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (VL 및 VH)을 암호화한다. 일 구체예에서, 표적화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 플라겔린을 암호화한다. Flagellin은 TLR-5에 친화성이 있다.

좋기로는, 표적화 유닛은 CCR1, CCR3 및 CCR5로부터 선택된 케모카인 수용체에 대해 친화성이 있다. 더욱 좋기로는, 표적화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 APC의 세포 표면에서 발현되는 그의 동족 수용체 CCR1 및 CCR5에 결합하는, 케모카인 인간 대식세포 염증성 단백질 알파 (hMIP-1알파, LD78베타라고도 함, 이하 (h)MIP1α 및 LD78β로도 지칭됨)를 암호화한다.

본 발명의 폴리펩타이드/이량체 단백질/백신의 그의 동족 수용체에 대한 결합은 APC의 내재화 및 MHC 분자에 로딩되고 종양-특이적 면역반응을 유도하기 위해 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 제시되는 작은 펩타이드로의 단백질의 분해를 유도한다. 일단 자극되고 활성화된 CD4+ T 세포의 도움으로 CD8+ T 세포는 동일한 항원을 발현하는 종양 세포를 표적으로 삼고 살해할 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직일 구체예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 24-93에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93을 포함한다.

보다 바람직일 구체예에서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들어 85% 이상, 예를 들어 86% 이상, 예를 들어 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상 등 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 예컨대 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.

본원에 사용된 용어 "이량체화 유닛"은 항원 유닛와 표적화 유닛 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열을 지칭한다. 따라서, 이량체화 유닛은 항원 유닛와 표적화 유닛을 연결하는 역할을 하고 두 개의 단량체성 폴리펩타이드의 이량체 단백질로의 이량체화를 촉진한다. 더욱이, 이량체화 유닛은 또한 폴리펩타이드/이량체 단백질에 유연성을 제공하여 이들이 가변 거리에 위치하더라도 표적화 유닛이 APC의 표면 분자에 최적으로 결합할 수 있도록 한다. 이량체화 유닛은 이러한 요구 사항을 충족하는 모든 유닛일 수 있다.

따라서, 일 구체예에서 이량체화 유닛은 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 이량체화를 용이하게 하는 또 다른 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 힌지 영역 및 다른 도메인은 링커(이량체화 유닛 링커)를 통해 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이량체화 유닛은 힌지 영역, 이량체화 유닛 링커 및 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 포함하고, 여기서 이량체화 유닛 링커는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인 사이에 위치한다.

"힌지 영역"이라는 용어는 이량체화를 용이하게 하는 이량체 단백질의 펩티드 서열을 의미한다. 다시 말해서, 용어 "힌지 영역"은 2개의 폴리펩티드를 연결하는 데 기여하는, 즉 이량체 단백질의 형성에 기여하는 이량체화 유닛에 포함된 아미노산 서열을 지칭한다.

또한, 힌지 영역은 이량체 단백질의 두 표적 유닛이 가변 거리로 표현되더라도 APC의 두 표적 분자에 동시에 결합할 수 있도록 하는 유닛 사이의 유연한 스페이서 역할을 한다. 힌지 영역은 IgG3 유래와 같은 Ig 유래일 수 있다. 힌지 영역은 Ig-유래 힌지 영역의 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 공유 결합(들), 예컨대 시스테인들 간의 이황화 다리(들)의 형성을 통해 이량체화에 기여할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다. 공유 결합은 예를 들어 이황화 다리일 수 있다.

일 구체예에서,이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 94-120의 아미노산 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4(인간 힌지 영역 1 및 인간 힌지 영역 4)를 포함한다.

바람직한 일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-120에 대해 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 such as 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함한다. 바람직일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-120을 갖는 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4를 포함한다.

일 구체예에서, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 예컨대 카르복시말단 C 도메인(C 도메인), 예컨대 CH1 도메인, CH2 도메인 또는 카르복시말단 C 도메인(즉, CH3 도메인), 또는 C 도메인 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열이다.좋기로는, 이량체화를 촉진하는 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인이다. 더욱 좋기로는, 이량체화를 용이하게 하는 다른 도메인은 IgG3에서 유래된 카르복시말단 C 도메인이다.

일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 131-237에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함한다.

바람직한 일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 131-237에 대해 서열 동일성이 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98% 또는 예컨대 적어도 99%인 아미노산 서열을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함한다. 바람직일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 131-237을 갖는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인을 포함한다.

면역글로불린 도메인은 비공유(non-covalent) 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용을 통해 이량체화에 기여한다. 따라서, 일 구체예에서, 면역글로불린 도메인은 비공유 상호작용을 통해 이량체를 형성하는 능력을 갖는다. 좋기로는, 비공유 상호작용은 소수성 상호작용이다.

이량체화 유닛이 CH3 도메인을 포함하는 경우 CH2 도메인을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 이량체화 유닛이 CH2 도메인을 포함하는 경우, CH3 도메인을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

바람직한 일 구체예에서, 이량체화 유닛은 힌지 엑손 h1 및 힌지 엑손 h4로 이루어진 폴리펩티드, 제3 링커(또는 이량체화 유닛 링커) 및 인간 IgG3의 CH3 도메인으로 이루어진다.

본 발명의 일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-237에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-237에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 또는 예컨대 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

보다 바람직일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-237에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-237에 대해 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 예컨대 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.

더더욱 바람직일 구체예에서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 94-237로 이루어진다.

일 구체예에서 힌지 영역을 다른 도메인에 연결하는 링커(이량체화 유닛 링커)는 이량체화 유닛에 존재한다. 다른 구체예에서, 링커가 존재하고 G3S2G3SG 링커이다. 대안적인 구체예에서, 이량체화 유닛 링커는 글리신-세린 풍부 링커, 좋기로는 GGGSSGGGSG이고, 즉 이량체화 유닛은 글리신-세린 풍부 이량체화 유닛 링커를 포함하고 좋기로는 이량체화 유닛 링커는 GGGSSGGGSG이다.

이량체화 유닛은 항원 유닛 및 표적화 유닛에 대해 임의의 배향을 가질 수 있음을 이해해야 한다. 일 구체예에서, 항원 유닛은 이량체화 유닛의 N-말단 엔드에 표적화 유닛와 함께 (예를 들어 유닛 링커를 통해) 이량체화 유닛의 COOH-말단에 있다. 또 다른 구체예에서, 항원 유닛은 이량체화 유닛의 COOH-말단 엔드에 표적화 유닛와 함께 이량체화 유닛의 N-말단 엔드에 있다. 항원 유닛은 이량체화 유닛의 COOH 말단에 있는 것이 바람직하다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 신호 펩타이드는 폴리펩타이드의 표적화 유닛의 배향에 따라 표적화 유닛의 N-말단 엔드 또는 표적화 유닛의 C-말단 엔드에 위치한다. 신호 펩타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된 세포에서 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 허용하도록 구성된다.

임의의 적합한 신호 펩티드가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드의 예는 SEQ ID NO: 9와 같은 Ig VH 신호 펩티드, SEQ ID NO: 10과 같은 인간 TPA 신호 펩티드 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-23에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드이다. 대안적인 구체예에서, 신호 펩티드는 인간 MIP1-α 신호 펩티드이다.

바람직한 일 구체예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-23에 대해 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 예컨대 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-23을 포함한다.

더더욱 바람직일 구체예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-23에 대해 적어도 80%, 좋기로는 적어도 85%, 예컨대 적어도 86%, 예컨대 적어도 87%, 예컨대 적어도 88%, 예컨대 적어도 89%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 예컨대 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 대안적인 구체예에서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-23로 이루어진다.

서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제2 서열이 제1 서열로부터 유래될 가능성을 나타낸다. 아미노산 서열 동일성은 두 개의 정렬된 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 참조 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은 정렬 후 후보 서열의 아미노산의 70%가 참조 서열의 상응하는 아미노산과 동일해야 할 것을 요구한다. 그 정체(identity)는 비제한적인 예로서 ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램(Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: 개선 서열 가중, 위치-특정 갭 패널티 및 가중치 매트릭스 선택을 통한 점진적 다중 서열 정렬의 감도(Nucleic Acids Res. 22:4673-4680), 및 여기에 제안된 기본 매개변수와 같은 컴퓨터 분석의 도움으로 결정될 수 있다. 기본 설정으로 이 프로그램을 사용하면 쿼리의 성숙한(생체 활성) 부분과 참조 폴리펩티드가 정렬된다. 완전히 보존된 잔기의 수를 세고 이를 참조 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 할 때 쿼리 시퀀스의 일부를 형성하는 모든 태그 또는 융합 단백질 시퀀스는 정렬 및 시퀀스 동일성의 후속 결정에서 무시된다.

ClustalW 알고리즘이 뉴클레오티드 서열을 정렬하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 표시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.

서열 비교에 사용되는 또 다른 선호되는 수학적 알고리즘은 Myers and Miller, CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다(Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219). 정렬은 전역 정렬(global alignment)을 기반으로 시퀀스 ID를 계산한다. Align0은 서열 끝에 있는 간격에 불이익을 주지 않다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 및 Align0 프로그램을 사용할 때 -12/-2의 갭 개방/확장 페널티를 갖는 BLOSUM50 치환 매트릭스를 사용하는 것이 바람직한다.

본 발명의 백신은 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥인 게놈 DNA, cDNA 및 RNA 서열과 같은 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 발현하도록 종에 최적화되는 것이 바람직하고, 즉 폴리뉴클레오타이드 서열이 인간 코돈 최적화된 것이 바람직하다.

본 발명의 백신은 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 백신의 생산을 위해 시험관내에서 발현될 수 있거나, 또는 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 개체/환자에게 투여한 결과로서 생체내에서 발현될 수 있다.

이량체화 유닛의 존재로 인해, 폴리펩타이드가 발현될 때 이량체 단백질이 형성된다. 이량체 단백질은 동종이량체일 수 있으며, 즉 2개의 폴리펩티드 사슬이 동일하고 결과적으로 동일한 항원 서열을 포함하거나, 이량체 단백질은 항원 유닛에 암호화된 2개의 상이한 단량체 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체일 수 있다. 후자는 항원 서열의 양이 항원 유닛의 상한 크기를 초과하는 경우 관련될 수 있다. 그러나, 이량체 단백질은 동종이량체 단백질인 것이 바람직하다.

다섯 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 하나 이상의 부분을 포함한다 이의, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

벡터는 숙주 세포를 형질감염시키고 전술한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드/이량체 단백질의 발현을 위한 것으로, 즉 발현 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드이다.

벡터는 상기 기재된 다양한 유닛, 특히 항원 유닛의 용이한 교환을 허용하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 벡터는 pUMVC4a 벡터 또는 NTC9385R 벡터 백본을 포함하는 벡터일 수 있다. 항원 유닛은 5' 부위가 GLGGL/GLSGL 링커에 통합되고 3' 부위가 벡터의 종결 코돈 뒤에 포함되는 SfiI 제한 효소 카세트에 의해 제한되는 항원 유닛 카세트로 교환될 수 있다.

여섯 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

일곱 번째 측면에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다.

적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 바람직일 구체예에서, 숙주 세포는 인간 세포, 좋기로는 암 환자의 세포, 더더욱 좋기로는 그의 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 그의 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분이 유래되는 동일한 암 환자의 세포인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 백신은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열이 상기 백신으로 백신 접종될 환자에서, 예를 들어 환자의 종양 조직 또는 혈액과 같은 체액에서 확인된다는 의미에서 개별화된 치료용 항암 백신이다.

따라서, 여덟 번째 측면에서, 본 발명은 시험관내에서 폴리펩티드를 생산함으로써 면역학적 유효량의 이량체 단백질, 또는 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

폴리펩티드 및 단백질의 시험관내 합성은 펩티드 합성 또는 당업계에 공지된 임의의 적합한 발현 시스템에서의 폴리펩티드의 발현과 같은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이어서 정제가 수행된다.

따라서, 일 구체예에서 본 발명은:

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 이량체 단백질; 또는

(ii) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항원 유닛은 시험관내에서 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 생산함으로써 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 폴리펩타이드

의 면역학적 유효량을 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 방법은

a) 세포를 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;

b) 세포를 배양하는 단계;

c) 세포로부터 발현된 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 얻은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계

를 포함한다.

바람직한 일 구체예에서, 단계 c)로부터의 이량체 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 약학적으로 허용되는 담체에 용해된다.

약학적으로 허용가능한 담체는 좋기로는 물 또는 완충액과 같은 수성 약제학적으로 허용되는 담체이다. 일 구체예에서, 백신은 아쥬반트를 추가로 포함한다.

정제는 크로마토그래피, 원심분리 또는 차등 용해도와 같은 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있다.

아홉 번째 측면에서, 본 발명은 시험관내에서 상기 정의된 바와 같은 면역학적 유효량의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하는 개별화된 치료학적 항암 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하며, 상기 방법은

a. 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계;

b. 선택적으로 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및

c. 단계 a)로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 단계 b)로부터의 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계

를 포함한다.

폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

특히, 더 작은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및/또는 항원 유닛의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 같은 더 작은 뉴클레오티드 서열은 개별적으로 합성된 다음 결찰되어 벡터 골격에 포함시키기 위한 최종 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다.

개별화 치료용 항암 백신에 포함된 항원 유닛의 디자인을 위해, 백신을 제조하는 방법에 앞서 항원 유닛 내로 포함될 항원 서열(즉, 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열)을 확인하는 방법이 선행된다.

환자-존재 공유 항원은 다음을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 환자의 (종양) 조직 또는 체액(당업계에 공지된 방법에 의해 수득됨)에서 확인될 수 있다:

● 환자의 게놈 또는 엑솜을 시퀀싱하고 선택적으로 예를 들어 돌연변이된 종양 유전자 또는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 식별하기 위해 전체 게놈/엑솜-서열 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색;

● 돌연변이 단백질의 존재를 검출하기 위한 환자의 종양 조직의 면역조직화학;

● RT-PCR을 통해 바이러스 항원의 존재 또는 종양유전자의 알려진 돌연변이를 탐지;

● 혈청 샘플에서 돌연변이된 종양 단백질에 대한 항체를 사용하는 ELISA;

● 공유 항원의 발현/과발현을 검출하기 위해 종양 조직의 RNA-seq와 건강한 조직을 비교;

● 인트론 보유 항원을 식별하기 위해 원시 RNA 서열 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색;

● 암흑 물질 항원의 요소인 전이 요소(transposable elements)를 식별하기 위해 전체 게놈-seq 데이터에서 맞춤형 소프트웨어로 검색;

● 암흑 물질 항원을 식별하기 위해 로(raw) 전체 엑솜/RNA 서열 데이터에서 짧은 반복물(short repeats)을 검출;

● 공유 바이러스 항원을 식별하기 위한 RNA-seq 데이터; 및

● 환자의 종양 샘플의 RNA-seq를 환자 자신의 건강한 조직 또는 코호트/데이터베이스(예: TCGA) 대 GTEX/HPA 유전자 발현 데이터와 비교.

바람직한 일 구체예에서, 항원 유닛은 면역원성인 것으로 알려진 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열을 포함한다. 또 다른 바람직일 구체예에서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 하나 이상의 부분, 예를 들어, 면역원성이 있는 것으로 알려져 있거나 특정 환자의 HLA 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 환자-특이적 항원 서열이 항원 유닛에 포함되는 경우, 항원 유닛은 좋기로는 예측된 면역원성을 갖는 환자-특이적 항원 서열을 포함한다.

따라서, 동정된 환자-존재 공유 항원 및 환자-특이적 항원은 이러한 서열이 항원 유닛에 포함될 때 본 발명의 백신을 가장 효과적으로 만드는 서열을 찾기 위해 추가로 처리될 수 있다. 이러한 처리가 수행되는 방식과 순서는 해당 항원이 동정된 방법, 즉 이러한 처리의 기초를 형성하는 데이터에 따라 달라진다. 일 구체예에서, 본 발명의 백신에 포함될 항원 서열의 프로세싱 및 선택은 다음과 같이 수행된다:

1) 문헌 및/또는 하나 이상의 데이터베이스에서 검색을 수행하여 공유 항원의 서열에 대한 정보, 및 좋기로는 그의 발현 패턴, 면역원성, 에피토프 및 HLA 제시에 대한 정보를 검색한다. 이러한 검색은 동정된 항원이 환자-존재 공유 항원 또는 환자-특이적 항원인지 여부를 결정하기 위해 수행된다.

2) 동정된 항원이 환자-존재 공유 항원인 것으로 결정된 경우, 그의 서열을 연구하여 환자-특이적 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 에피토프, 좋기로는 모든 에피토프를 확인한다. 혈액 세포와 같은 정상 조직을 시퀀싱함으로써 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자가 결정된다. 예측은 NetMHCpan 및 유사한 도구와 같이, 당업계에 공지된 예측 도구, 즉 당업계에 공지된 예측 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다.

3) 가장 유망한, 즉 환자-존재 공유 항원의 환자의 HLA 클래스 I/II 대립유전자 중 하나 이상에 대해 예측된 결합을 나타내는 가장 면역원성인 서열이 항원 유닛에 포함되도록 선택된다. 일 구체예에서, 예를 들어, 2단계에서 소수의 유망한 에피토프만 확인되거나 또는 더 긴 스트레치의 비면역원성 서열이 에피토프들 간에 존재할 경우 다수의 최소 에피토프가 선택된다. 또 다른 구체예에서, 환자의 특이적 HLA 대립유전자에 결합하는 여러 에피토프를 포함하는 더 긴 서열이 선택된다. 또 다른 구체예에서, 전장 서열이 항원 유닛 내로의 포함을 위해 선택된다.

4) 선택적으로 가장 유망한 환자-특이적 항원 서열, 예컨대 에피토프가, 예측된 면역원성과 그러한 서열의 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자에 대한 결합을 기반으로 항원 유닛에 포함되도록 선택된다.

환자-특이적 항원 서열을 항원 유닛에 포함시키고자 하는 경우, 일단 이러한 항원을 동정하고 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자가 결정되면 다음 단계는 가장 유망한 그의 서열, 예컨대 에피토프를, 그러한 서열의 예측된 면역원성과 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자에 대한 결합에 기반하여 선택하는 것이다.

종양 돌연변이는 종양 및 정상 조직의 시퀀싱에 의해 발견되고 획득된 서열을 비교한다. 어떤 개체의 DNA 또는 RNA에서 특정 돌연변이 또는 대립유전자의 존재를 검출하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 동적 대립유전자-특이적 혼성화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(MADGE), 파이로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드-특이적 결찰, TaqMan 시스템 및 Affymetrix SNP 칩과 같은 다양한 DNA "칩" 기술을 포함하는 기술이 적용될 수 있다. 별법으로, 직접 단백질 시퀀싱에 의해 돌연변이를 확인하는 방법을 수행할 수 있다.

종양 엑솜에 있는 수백 또는 수천 개의 돌연변이 중에서 가장 유망한 서열이 예측 HLA-결합 알고리즘을 기반으로 인 실리코(in silico)로 선택된다. 그 의도는 모든 관련 에피토프를 식별하고 순위 지정 또는 채점 후에 항원 유닛에 포함될 서열을 결정하는 것이다.

다음 중 하나와 같은 적절한 알고리즘을 사용할 수 있다:

펩타이드-MHC 결합(IEDB 및 NetMHCpan)에 대한 사용 가능한 무료 소프트웨어 분석을 다음 웹사이트에서 다운로드할 수 있다:

http://www.iedb.org/

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/

백신 설계를 위해 최적의 서열을 예측하기 위한 상용 고급 소프트웨어는 다음에서 찾을 수 있다:

http://www.oncoimmunity.com/

https://omictools.com/t-세포-에피토프s-category

https://github.com/griffithlab/pVAC-Seq

http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php

http://www.epivax.com/tag/neoantigen/

각 돌연변이는 그의 항원성과 관련하여 점수가 매겨지며, 가장 항원성인 에피토프를 선택하여 항원 유닛에서 최적으로 배열시킨다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은:

a) 환자의 종양 조직 또는 체액에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원을 동정하는 단계

b) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자를 결정하는 단계

c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계

d) 단계 c)에서 예측된 그의 면역원성에 기초하여 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분를 선택하는 단계; 및

e) 단계 d)에서 선택된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 단계

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은:

a) 환자의 종양 조직 또는 체액에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원을 동정하고 상기 환자의 종양 조직에서 하나 이상의 환자-특이적 항원을 동정하는 단계;

b) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자를 결정하는 단계;

c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해 동정된 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 또는 그의 부분 및 동정된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계;

d) 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 적어도 하나의 환자-특이적 공유 항원 또는 그의 하나 이상의 부분 및 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계; 및

e) 단계 d)에서 선택된 적어도 하나의 환자-특이적 공유 항원 또는 그의 하나 이상의 부분 및 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 단계

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법을 제공한다.

일 구체예에서, 단계 e)에서 제조된 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 표적화 유닛 및 본원에 기재된 바와 같은 이량체화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.

바람직한 일 구체예에서, 제조된 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터로 클로닝된다. 또 다른 바람직일 구체예에서, 단계 e)의 폴리뉴클레오티드 서열은 이량체화 유닛 및 표적화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝된다.

또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된다.

최종 백신은 다음 중 하나를 포함하도록 생산된다.

- 상기 정의된 폴리뉴클레오티드

- 상기 정의된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드

- 상기 정의된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이량체 단백질

백신은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하고, 다른 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어 안정화제, 아쥬반트, 완충제 등을 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체는 염수, 완충된 염수, 예컨대 PBS, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액(들), 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 국제한되지 않는다.

특히 폴리펩타이드/단백질을 포함하는 백신의 경우, 약학적으로 허용되는 부형제의 예로는 폴리-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄염, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact EV1 P321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, 벡터 시스템, PLGA 마이크로입자, 레시퀴모드, SRL172, 바이로좀 및 기타 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF trap, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, Aquila's QS21 자극제, 바디메잔, 및/또는 AsA404 (DMXAA)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

특히 발현 벡터에 포함된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신의 경우, 백신은 면역 반응을 향상시키기 위해 케모카인 또는 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 형태로 세포 및/또는 아쥬반트의 형질감염을 용이하게 하는 분자를 포함할 수 있다.

백신은 피내 또는 근육내 주사용 액체 제제와 같이 환자에게 투여하기 위한 임의의 적합한 제제로 제제화된다.

백신은 피내, 근육내, 피하 주사 또는 비강내, 경구, 장내 또는 방광과 같은 점막 또는 상피 적용에 의해 투여되는 것과 같이 폴리펩타이드/단백질 백신 또는 폴리뉴클레오티드 백신에 적합한 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 특히 백신은 폴리뉴클레오티드 백신인 경우 근육내 또는 피내로 투여하는 것이 바람직하다.

일 구체예에서 백신은 결절내(intranodal) 주사에 의해 투여된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "결절내 주사"는 백신이 림프절에 주사되는 것을 의미한다.

상기 기술된 방법에 의해 제조된 본 발명의 개별화된 치료용 항암 백신은 12주 미만, 예를 들어, 9주 이내 또는 8주 이내 또는 6주 이내 또는 4주 이내에 수득될 수 있다.

치료되는 암은 임의의 암, 예컨대 암 세포가 공유된 암 항원 및 선택적으로 환자-특이적 암 항원을 생성하는 변경을 포함하는 암일 수 있다. 암은 원발성 종양, 전이 또는 둘 다일 수 있다. 변경을 위해 검사된 종양은 원발성 종양 또는 전이암일 수 있다. 일 구체예에서, 치료될 암은 흑색종, 폐암, 신장암, 두경부암 또는 방광암과 같이 항원 부하가 높은 것으로 알려진 암이다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 암은 고형암 또는 액상암이다. 고형암의 예는 고형 덩어리, 예컨대 종양을 형성하는 암이다. 종양. 액체 암의 예는 림프종이나 혈액암과 같은 체액에 존재하는 암이다. 본 발명의 백신으로 치료할 수 있는 암의 예로는 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 골암, 결장직장암, 위암, 림프종, 악성 흑색종, 간암, 소세포 폐암, 비소세포폐암, 세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담관암, 뇌암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 호지킨병 및 부신피질암을 들 수 있다.

바람직일 구체예에서, 치료는 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신으로 수행되며, 예를 들어 폴리뉴클레오티드는 좋기로는 벡터에 포함된 DNA 또는 RNA이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 백신을 큰 근육, 예를 들어 어깨, 엉덩이 또는 허벅지와 같은 근육내 주사하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드/이량체 단백질은 국부적으로 생산되고, 관련 면역 세포는 본질적으로 그들의 생산 부위에서 폴리펩티드/이량체 단백질을 내재화하는데, 즉 실질적으로 어떠한 폴리펩티드/이량체 단백질도 혈류에 도달하지 않는 것으로 밝혀졌다.

제트 인젝터를 사용하거나 전기천공에 의해 보조하는 것과 같이 폴리뉴클레오티드 백신을 주사하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.

백신은 1회 투여할 수도 있고 반복 투여할 수도 있다. 백신 투여를 반복할 경우 T 세포의 고갈을 방지하기 위해 최소 3주 간격으로 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 일 구체예에서 투여 요법은 환자가 임상적 이점을 갖는 한 0, 3 및 6주에 백신 접종한 다음 4주마다 백신 접종하는 것이다. 백신은 1년 동안 투여될 수 있다.

백신은 면역학적 유효량의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드/이량체 단백질을 포함한다. "면역학적 유효량"은 이러한 화합물로 백신을 접종받는 환자에서 면역 반응을 유발하는데 필요한 상기 언급된 화합물의 양을 의미한다. 이러한 면역 반응을 나타내는 비제한적 매개변수는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 종양의 성장 중지 및/또는 이의 확산 중지 및/또는 종양 크기 감소, 질병 진행 감소 또는 안정적인 질병, 즉, 암이 더 느린 속도로 진행되거나 진행되지 않을 것. 여기에는 종양이 더 느린 속도로 성장하거나 성장하지 않거나 및/또는 예컨대 림프절로 퍼지지 않거나 더 느리게 퍼지거나 또는 전이를 형성하고/하거나 더 공격적으로 되지 않는 것이 포함된다. 이러한 면역 반응을 나타내는 다른 비제한적 매개변수는 종양 수축(중량 및/또는 부피 측면에서); 개별 종양 콜로니 수의 감소; 종양 제거; 및 무진행 생존이다. 궁극적으로 의사가 용량을 결정하나 이것은 치료할 환자의 연령, 체중 및 일반적인 상태, 치료 중인 암의 중증도, 의사의 판단, 본 발명의 개별화된 백신의 특징 및 특성에 따라 달라질 수 있다. 일 구체예에서, 용량은 전형적으로 DNA 백신의 경우 0.3-6 mg 범위이고, 폴리펩티드/단백질 백신의 경우 5 ㎍-5 mg 범위이다.

열 번째 측면에서, 본 발명은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하되, 이 방법은 면역학적 유효량의:

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서 상기 항원 유닛은 상기 환자에 존재하는 적어도 하나의 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분 및 선택적으로 상기 환자에 특이적인 하나 이상의 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다); 또는

(ii) (i)에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질; 및

약학적으로 허용되는 담체

를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

따라서, 본 발명은 환자를 위해 특이적으로 제조된 본 발명에 따른 개별화된 치료용 항암 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

별법으로, 본 발명은 면역학적 유효량의:

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다); 또는

(ii) (i)에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질; 및

환자의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체

를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신을 제공하되, 여기서 상기 백신은 그 환자에 대해 특별히 제조된 것이다.

또한, 본 발명은 환자에서 암 치료용 의약의 제조를 위한,

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함한다); 또는

(ii) (i)에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질

의 용도를 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 이량체 단백질은 그 환자를 위해 특별히 제조된 것이다.

본 발명에 따른 백신 치료는 방사선 요법, 화학요법 및 외과적 치료와 같은 임의의 다른 항암 치료와 병용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 치료는 또한 체크포인트-차단 억제제 치료와도 병용될 수 있다.

도 1은 환자 1의 HPV16 E6의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 밑줄 친 2 개의 서열은 환자 1에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I 최적화된 서열을 구성한다.
도 2는 환자 1의 HPV16 E6의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 박스 안의 서열은 환자 1에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열을 구성한다.
도 3은 환자 1의 HPV16 E7의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 밑줄 친 서열은 환자 1에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I 최적화된 서열을 구성한다.
도 4는 환자 1의 HPV16 E7의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 2 개의 박스 안의 서열은 환자 1에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열을 구성한다.
도 5는 환자 2의 HPV16 E6의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 밑줄 친 2 개의 서열은 환자 2에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I 최적화된 서열을 구성한다.
도 6은 환자 2의 HPV16 E6의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 박스 안의 서열은 환자 2에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열을 구성한다.
도 7은 환자 2의 HPV16 E7의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 밑줄 친 서열은 환자 2에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I 최적화된 서열을 구성한다.
도 8은 환자 2의 HPV16 E7의 아미노산 서열과 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 모든 에피토프를 나타낸다. 2 개의 박스 안의 서열은 환자 2에 대해 개별화된 치료용 항암 백신의 항원 유닛에 포함시키기 위한 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열을 구성한다.
도 9는 음성 대조군 VB1026과 비교하여, T 세포로부터의 IFN-γ 면역 반응(총 T 세포 반응)을 측정함으로써, DNA 백신(작제물) VB4097, VB4100 및 VB4105로 백신 접종된 마우스에서의 이들 작제물의 면역원성을 나타낸다.
도 10은 음성 대조군 VB1026과 비교하여, CD8+ T 세포로부터의 IFN-γ 면역 반응을 측정함으로써 DNA 백신(작제물) VB4100, VB4101 및 VB4102로 백신 접종된 마우스에서의 이들 작제물의 면역원성을 나타낸다.
도 11은 음성 대조군 VB1026과 비교하여, A) T 세포(총 T 세포 반응), B) CD8+ T 세포 및 C) CD4+ T 세포로부터의 IFN-γ 면역 반응을 측정함으로써 DNA 백신(작제물) VB4100 및 VB4102로 백신 접종된 마우스에서의 이들 작제물의 면역원성을 나타낸다.
도 12는 음성 대조군 VB1026과 비교하여, T 세포로부터의 IFN-γ 면역 반응을 측정함으로써 DNA 백신(구성물) VB4118, VB4119, VB4121, VB4127, VB4128 및 VB4130으로 백신 접종된 마우스에서의 이들 작제물의 면역원성을 나타낸다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드/이량체 단백질 및 백신에 포함된 항원 유닛의 설계

항원 유닛은 환자-존재 공유 항원 서열에서 다음과 같은 변형으로 설계될 수 있다:

A. 전장(full-length) 서열

B. HLA-최적화된 서열. 항원 유닛에 포함되도록 선택된 서열은 가장 면역원성인 에피토프, 즉 환자의 HLA I 및/또는 HLA II 분자에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 에피토프를 포함하도록 최적화된다.

C. 환자의 HLA I 및/또는 HLA II 분자에 대한 결합이 예상되는 에피토프.

D. A+C의 조합

E. B+C의 조합

F. A+B의 조합

상기 환자-존재 공유 항원 서열은 예를 들어 HPV16일 수 있다. 전장 서열을 포함하는 사례 D 및 F의 경우, 사례 D는 예를 들어 전장 서열(A)로서의 HPV16 E7과 HPV E6의 에피토프(C)의 조합일 수 있는 반면, 사례 F는 예를 들어 전장 서열(A)로서의 HPV16 E7과 HLA-최적화 서열(B)의 조합일 수 있다. 전술한 예는 하나의 단일 환자-존재 공유 항원을 포함하지만 이의 2개의 상이한 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 사례 D 및 F는 제1 환자-존재 공유 항원, 예컨대 HPV16 E7의 전장 서열(A)와 제2 환자-존재 공유 항원, 예컨대 KRAS의 에피토프 (C) 또는 HLA 최적화 서열(B)와의 조합에 관한다.

따라서, 항원 유닛은 하나의 환자-존재 공유 항원으로부터의 A-F를 포함하거나 여러 환자-존재 공유 항원으로부터의 A-F를 포함할 수 있다.

서열 A-F는 본원에 제공된 방법에 따라 항원 유닛로 배열된다. 최적의 항원 유닛 디자인을 결정하기 위해 예컨대 실시예 3에 기술된 바와 같이 상이한 항원 유닛 디자인들을 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항원-특이적 면역원성에 대한 폭, 강도 및 동역학은 IFN-감마 ELISPOT 분석에 의해 결정될 수 있다.

항종양 효능을 종양 챌린지 실험으로 테스트할 수 있다.

실시예 2: 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 작제

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 하기 유닛과 성분을 포함하도록 설계된다:

실시예 3: 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드/이량체 펩티드 및 백신에 포함되는 항원 유닛에 포함시키기 위한 환자-존재 공유 항원의 서열 선택

두경부 편평 세포 암종을 가진 2명의 환자, 즉 환자 1과 2의 혈액 샘플과 종양 조직 샘플을 얻었다. 혈액 샘플은 건강한 세포에서 엑손을 특성화하기 위해 엑솜 시퀀싱을 위해 분석되었다. 종양 조직 샘플은 종양 조직의 엑손을 특성화하기 위한 엑솜 시퀀싱 및 각 유전자의 RNA 발현 수준을 평가하기 위한 RNA-seq에 대해 분석되었다. HPV16 공유 항원의 존재는 ELISA에서 항-HPV16 항체를 사용하여 동정되었다. 면역원성이 가장 높은 서열을 찾기 위해, 각 환자의 HLA 클래스 I 및 II 대립유전자를 정상 조직(혈액 세포)의 시퀀싱(염기서열 분석)을 통해 결정하였다. 다음 HLA 클래스 I 및 II 대립유전자가 발견되었다.

HPV는 크기가 약 8kb이고 8개의 유전자를 암호화하는 원형의 이중 가닥 DNA 게놈을 가지고 있으며, 8개의 유전자 중 E6과 E7은 변형 특성을 가지고 있다. 바이러스 E6 및 E7 단백질은 건강한 세포를 악성 세포로 전환시키는 데 관여하는 것으로 알려져 있다. HPV16 E6 및 E7 단백질이 각각 종양 억제인자 p53 및 pRB와 결합하는 능력은 이들 바이러스 단백질이 종양을 유도하는 메커니즘으로서 제안되어왔다. 따라서, HPV16의 E6 및 E7 서열은 공지된 공유 종양 항원이고 항원 유닛에 포함시키기 위한 서열을 찾기 위해 선택되었다. 환자의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 대한 결합 예측은 NetMHCpan 4.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

환자 1:

HPV 16 E6:

각각 9개 아미노산 길이인 총 16개의 에피토프가 환자 1의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었고 각각 9개 아미노산 길이인 총 16개의 에피토프가 환자 1의 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었다(도 2 및 표 3).

이에 따라, 환자 1에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되며, 이는 다음을 포함할 수 있다:

A. 전장 HPV16 E6 서열(151개 아미노산)

B. 16개의 에피토프 중 일부, 예컨대 도 1의 왼쪽에 밑줄이 그어진 12개의 에피토프를 포함하는 HLA 클래스 I 최적화된 서열. 이 서열은 65개 아미노산, 즉 전장 서열의 43%를 포함한다.

C. 2개의 HLA 클래스 I 최적화된 서열, 여기서 첫 번째 서열은 16개의 에피토프 중 12개를 포함하고 두 번째 서열은 3개의 에피토프를 포함한다(도 1). 따라서, 결합된 2개의 서열은 16개의 에피토프 중 15개를 포함하고 92개의 아미노산, 즉 전장 서열의 61%를 포함한다.

D. 16개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 12개 및 16개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 9개를 포함하여 32개의 HLA 클래스 I/클래스 II 에피토프 중 21개를 포함하는 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열(도 2, 상자). 이 서열은 65개 아미노산, 즉 전장 서열의 43%를 포함한다.

항원 유닛에 C 또는 D가 포함되는 것이 바람직하다.

HPV16 E7:

각각 9개 아미노산 길이의 총 9개의 에피토프가 환자 1의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었고 각각 9개의 아미노산 길이인 총 12개의 에피토프가 환자 1의 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었다(도 4 및 표 4).

이에 따라, 환자 1에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되며, 이는 다음을 포함할 수 있다:

E. 전장 HPV16 E7 서열(98개 아미노산)

F. 9개의 에피토프 중 예컨대 도 3에 밑줄이 그어진, 일부를 포함하는 HLA 클래스 I 최적화된 서열. 이 서열은 56개 아미노산, 즉 전장 서열의 57%를 포함한다.

G. 2개의 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열, 여기서 첫 번째 서열은 9개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 2개를 포함하고 16개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 7개를 포함하며 두 번째 서열은 9개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 4개를 포함하고 16개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 5개를 포함한다(도 4, 박스). 따라서, 결합된 2개의 서열은 9개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 6개를 포함하고 모든 HLA 클래스 II 에피토프를 포함한다. 결합된 2개의 서열은 54개의 아미노산, 즉 전장 서열의 55%를 포함한다.

항원 유닛에 F 또는 G가 포함되는 것이 바람직하다.

상기에 기초하여, C, D, F 및 G 중 적어도 하나 또는 C, D, F 및 G 모두, 또는 설명된 이들 두 가지 극한(extrema) 사이의 임의의 조합을 포함하는 환자 1에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계된다.

환자 2:

HPV16 E6

각각 9개 아미노산 길이인 총 14개의 에피토프가 환자 2의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었고 각각 9개 아미노산 길이인 총 14개의 에피토프가 환자 2의 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었다(도 6 및 표 5).

이에 따라, 환자 2에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되며, 이는 다음을 포함할 수 있다:

H. 전장 HPV16 E6 서열(151개 아미노산)

I. 14개의 에피토프 중 일부, 예컨대 도 5에 밑줄이 그어진 11개의 에피토프를 포함하는 HLA 클래스 I 최적화된 서열. 이 서열은 57개 아미노산, 즉 전장 서열의 38%를 포함한다.

J. 14개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 11개 및 14개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 8개를 포함하여 28개의 HLA 클래스 I/클래스 II 에피토프 중 19개를 포함하는 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열(도 6, 상자). 이 서열은 59개 아미노산, 즉 전장 서열의 39%를 포함한다.

항원 유닛에 J가 포함되는 것이 바람직하다.

HPV16 E7

각각 9개 아미노산 길이의 총 10개의 에피토프가 환자 2의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었고 각각 9개의 아미노산 길이인 총 11개의 에피토프가 환자 1의 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되었다(도 8 및 표 6).

이에 따라, 환자 2에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계될 수 있으며, 이는 다음을 포함한다:

A. 전장 HPV16 E7 서열(98개 아미노산)

B. 10개의 에피토프 중, 예컨대 도 7에 밑줄이 그어진 일부를 포함하는 HLA 클래스 I 최적화된 서열. 이 서열은 26개 아미노산, 즉 전장 서열의 27%를 포함한다.

C. 2개의 HLA 클래스 I/HLA 클래스 II 최적화된 서열, 여기서 첫 번째 서열은 10개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 6개를 포함하고 11개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 6개를 포함하며 두 번째 서열은 10개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 1개를 포함하고 11개의 HLA 클래스 II 에피토프 중 5개를 포함한다(도 8, 박스). 따라서, 결합된 2개의 서열은 11개의 HLA 클래스 I 에피토프 중 8개를 포함하고 모든 HLA 클래스 II 에피토프를 포함한다. 결합된 2개의 서열은 45개의 아미노산, 즉 전장 서열의 45%를 포함한다.

항원 유닛에 L 또는 M이 포함되는 것이 바람직하다.

상기에 기초하여, J, L 및 M 중 적어도 하나 또는 J, L 및 M 모두, 또는 설명된 이들 두 가지 극한(extrema) 사이의 임의의 조합을 포함하는 환자 2에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계된다.

환자 1 및 2, 즉 도 2와 6 및 도 4와 8을 비교하면, 본 발명에 따른 백신에 포함시키기 위한 최적의 서열이 두 환자 간에 상당히 다르다는 것이 명백하다.

실시예 4: 환자-특이적 항원 및 환자-존재 공유 항원을 포함하는 백신 비교

환자-특이적 항원 서열만을 포함하는 백신과 환자-존재 공유 항원 서열 및 선택적으로 환자-특이적 항원 서열을 포함하는 본 발명에 따른 백신의 효능을 비교하기 위해, 마우스 TC-2 종양 모델이 사용된다.

TC-2 종양 세포주에 존재하는 공유 항원 및 특이적 항원을 본원에 기술된 바와 같이 동정, 처리 및 선택한다. 즉, 항원 유닛에 포함시키기 위한 공유 항원 서열은 MHC 분자에 대한 결합을 기반으로 선택되는 반면 특이적 항원 서열은 인 실리코 예측된 면역원성 방법의 추가 매개변수에 기초하여 선택된다. 항원 유닛에 포함시키기 위해 선택된 공유 항원은 바이러스 항원 HPV16이고 그의 E6 및 E7 단백질의 일부를 암호화하는 서열이 선택되었다.

선택된 모든 항원 서열을 상업적 공급업체, 예컨대 Genscript(미국 뉴저지주)로부터 주문하여, LD78베타 표적화 유닛 및 hIgG3 이량체화 유닛을 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터 pUMVC4a에 클로닝하였다.

벡터 1의 항원 유닛은 공유 항원 서열만을 포함하는 반면, 벡터 2의 항원 유닛은 공유 항원 서열과 특이적 항원 서열을 모두 포함한다.

올바른 백시바디(vaccibody) 형성을 입증하기 위해, HEK293 세포를 벡터로 형질감염시키고 상등액의 백시바디 단백질을 웨스턴 블롯 및/또는 샌드위치 ELISA로 동정한다. 텅 빈(empty) pUMVC4a 벡터가 음성 대조군으로 포함된다. 온전한 동종이량체 단백질 형성은 다음과 같이 확인된다: 이량체 단백질을 단량체로 환원시키는 환원제의 존재하, 또는 환원제의 부재하에, 형질감염된 세포의 상등액에 있는 단백질을 항-hMIP-1알파 항체에 의해 웨스턴 블롯으로 검출한다.

각각 20㎍의 벡터 1과 벡터 2를 수성 완충액과 혼합하여 백신을 제조한다. 백신을 마우스의 경골 전방 근육에 근육내 주사한 후 TriGrid, Ichor, (US)를 사용하여 전기천공을 한다. 13일째에 마우스를 안락사시키고 비장을 채취한다.

T 세포 반응을 IFN-감마 ELISpot에 의해 평가한다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 백신이 특이적 항원 서열만을 포함하는 백신에 비해 더 넓은 T 세포 반응을 더 높게 유도한다는 것을 관찰하였다.

실시예 5: 본 발명에 따른 개별 치료용 항암 DNA 백신

본 발명에 따른 개별 치료용 항암 DNA 백신은 규제 당국의 지침에 따라 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 GMP 제조 및 DNA 백신의 Fill & Finish에 의해 제조될 수 있다. 벡터는 PBS와 같은 멸균 식염수 용액에 2-6 mg/ml의 농도로 용해시켜 제형화할 수 있다. 백신은 전기천공 후 또는 전기천공 없이 피내 또는 근육내로 투여될 수 있거나 대안적으로 제트 인젝터로 투여될 수 있다.

실시예 6: 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드/이량체 펩티드 및 백신에 포함된 항원 유닛에 포함시키기 위한 환자-존재 공유 항원(및 환자-특이적 항원)의 서열 선택

두경부의 편평 세포 암종을 나타내는 3명의 환자(환자 1, 2 및 3)의 혈액 샘플 및 종양 조직 샘플을 얻었다. 혈액 샘플은 건강한 세포에서 엑손을 특성화하기 위해 엑솜 시퀀싱을 위해 분석되었다. 종양 조직 샘플은 종양 조직의 엑손을 특성화하기 위한 엑솜 시퀀싱 및 각 유전자의 RNA 발현 수준을 평가하기 위한 RNA-seq에 대해 분석되었다.

HPV16 공유 항원의 존재는 PCR을 사용하여 확인되었다. NY-ESO-1의 이소성 발현(ectopic expression)은 ELISA에서 항-NY-ESO-1 항체에 의해 결정되었다. 각 환자에 대한 환자-특이적 항원 서열은 본원 및 본원에 참조 통합된 WO 2017/118695에 앞서 기재된 바와 같이 동정되었다.

NY-ESO-1(암/고환 항원 1B라고도 함)은 mRNA 및 단백질 수준에서 다양한 악성 종양에서 재발현되는 것으로 밝혀진 암-고환 항원(CTA) 계열에 속하는 단백질인 반면, 성인 조직에서의 그의 정상적인 발현은 생식 세포와 태반 세포로 국한된다. NY-ESO-1 발현은 광범위한 종양 유형에서 보고된 바 있다.

HPV의 경우, HPV16의 E6 및 E7 서열은 알려진 공유 종양 항원이며 항원 유닛에 포함시키기 위한 서열을 찾기 위해 선택되었다.

가장 면역원성인 서열을 찾기 위해 각 환자의 HLA 클래스 I 및 II 대립유전자를 정상 조직(혈액 세포)의 염기서열 분석을 통해 결정하였다. HPV16 E6/E7 서열과 NY-ESO-1 서열이 환자의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 대해 결합하는 것에 대한 예측은 NetMHCpan 4.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 문헌을 통해 양성 T 세포 반응(환자의 HLA 대립 유전자와 일치하지 않음)을 유도한 것으로 알려진 IEDB 데이터베이스의 서열들도 분석에 포함되었다.

환자 1, 2 및 3에서 발견된 HLA 클래스 I 및 II 대립유전자가 아래 표에 나열되어 있다:

환자 1

환자 1에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 다음 순서로 제시된 서열들을 포함하는, SEQ ID NO: 14를 포함한다: E7 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E6.

환자 1에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 두 번째 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 제시된 서열 및 추가로 17개의 환자-특이적 항원 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 15를 포함한다. 가장 소수성인 서열은 실질적으로 항원 유닛의 중간에 위치하였고 가장 친수성인 서열은 항원 유닛의 시작과 끝에 위치하였다. 글리신-세린 링커는 서열들 사이에 삽입되었다. 항원 유닛은 서열들을 다음 순서로 포함하며, T1D는 환자-특이적 항원 서열을 나타낸다:

T1D320 | 링커 | T1D814 | 링커 | T1D182 | 링커 | T1D689 | 링커 | E7 | 링커 | T1D339 | 링커 | T1D428 | 링커 |NY-ESO-1 | 링커 | T1D572 | 링커 | T1D359 | 링커 | T1D488 | 링커 | T1D554 | 링커 | T1D272 | 링커 | T1D210 | 링커 | T1D849 | 링커 | T1D4 | 링커 | T1D77 | 링커 | T1D717 | 링커 | T1D586 | 링커 | E6.

환자 2:

환자 2에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 다음 순서로 제시된 서열들을 포함하는, SEQ ID NO: 16을 포함한다: E6 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E7.

환자 2에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 두 번째 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 제시된 서열 및 추가로 17개의 환자-특이적 항원 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 17을 포함한다. 가장 소수성인 서열은 실질적으로 항원 유닛의 중간에 위치하였고 가장 친수성인 서열은 항원 유닛의 시작과 끝에 위치하였다. 글리신-세린 링커는 서열들 사이에 삽입되었다. 항원 유닛은 서열들을 다음 순서로 포함하며, T1D는 환자-특이적 항원 서열을 나타낸다:

E6 | 링커 | T1D323 | 링커 | T1D506 | 링커 | T1D12 | 링커 | T1D315 | 링커 | T1D302 | 링커 | T1D700 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D535 | 링커 | T1D358 | 링커 | T1D670 | 링커 | T1D294 | 링커 | T1D336 | 링커 | T1D499 | 링커 | T1D425 | 링커 T1D491 | 링커 | T1D314 | 링커 | T1D430 | 링커 | E7 | 링커 | T1D582.

환자 3

환자 3에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 다음 순서로 제시된 서열들을 포함하는, SEQ ID NO: 18을 포함한다: NY-ESO-1 | 링커 | E7 | 링커 | E6.

환자 3에 대한 개별화된 치료용 항암 백신에 포함시키기 위한 두 번째 항원 유닛이 설계되었으며, 이는 위 표의 오른쪽 열에 제시된 서열 및 추가로 17개의 환자-특이적 항원 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 19를 포함한다. 가장 소수성인 서열은 실질적으로 항원 유닛의 중간에 위치하였고 가장 친수성인 서열은 항원 유닛의 시작과 끝에 위치하였다. 글리신-세린 링커는 서열들 사이에 삽입되었다. 항원 유닛은 서열들을 다음 순서로 포함하며, T1D는 환자-특이적 항원 서열을 나타낸다:

T1D223 | 링커 | T1D164 | 링커 | T1D56 | 링커 | T1D36 | 링커 | T1D129 | 링커 | T1D274 | 링커 | T1D62 | 링커 | T1D5 | 링커 | T1D144 | 링커 | T1D441 | 링커 | T1D368 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D234 | 링커 | T1D162 | 링커 | T1D39 | 링커 | T1D272 | 링커 | E7 | 링커 | T1D328 | 링커 | T1D188 | 링커 | E6.

실시예 7: 본 발명에 따른 DNA 백신의 면역원성

공유 항원 서열 및/또는 네오에피토프를 포함하는 DNA 백신의 설계:

표 14에 나타낸 유닛/부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5개의 DNA 백신(작제물)을 설계하였다:

10개의 CT26 네오에피토프를 포함하는 DNA 백신 VB4097:

이 작제물은 환자-특이적 항원 서열, 즉 네오에피토프를 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로서 선택되었다.

이전에 설명된 마우스 결장암 세포주 CT26의 엑솜 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱은 수백에서 수천 개의 종양-특이적 비동의 돌연변이를 밝혀냈다. 인 실리코 방법을 사용하여 잠재적인 면역원성 서열, 즉 네오에피토프를 동정하고 그 중 10개(표 15)를 VB4097의 항원 유닛에 포함하기 위해 선택하였다. 동정된 10개의 네오에피토프 각각은 27개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 말단 네오에피토프를 제외한 모든 것은 서브유닛으로 배열되었고, 각 서브유닛은 하나의 네오에피토프와 하나의 유연한 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS)로 구성되었다.

VB4097은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

NY-ESO-1 서열 또는 이의 일부를 포함하는 DNA 백신 VB4100, VB4101 및 VB4102.

이들 작제물을 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로 선택하였다.

인간의 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1(NY-ESO-1)은 여러 암 유형에서 비정상적으로 발현되는 고 면역원성 암 고환 항원인 것으로 나타났다. NY-ESO-1은 CT26 암 세포주에서 내인성으로 발현되지 않지만, 인 실리코 기법을 사용하여 여러 면역원성 서열이 BALB/c 마우스에서 마우스 MHC 클래스 I 및 II에 결합하는 것으로 예측되었다. 상기 언급된 구축물은 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로서 선택되었다.

이에 따라 3개의 NY-ESO-1 작제물이 설계되었다:

● 전체 길이의 NY-ESO-1을 포함하는 항원 유닛이 있는 VB4100. VB4100은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

● MHC 클래스 I 항원으로 예측되는 NY-ESO-1 서열의 아미노산 81-88을 포함하는 항원 유닛을 갖는 VB4101. VB4101은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

● MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원으로 예상되는 여러 항원을 함유하는 NY-ESO-1 서열의 아미노산 81-126을 포함하는 항원 유닛을 갖는 VB4102. VB4102는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

작제물에 포함된 다양한 NY-ESO-1 서열을 표 16에 나타내었다.

10개의 CT26 네오에피토프 및 NY-ESO-1 서열의 전장 서열을 포함하는 DNA 백신 VB4105

이 작제물은 환자-존재 공유 항원 서열 및 환자-특이적 항원 서열(네오에피토프)을 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로 선택되었다. 이것은 NY-ESO-1의 전장 서열 및 표 1에 나타낸 10개의 CT26 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하며, 이들 각각은 유연한 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS)에 의해 하기 네오에피토프 또는 NY-ESO-1 서열과 분리되어 있다. VB4105는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

음성 대조군 VB1026:

이 작제물은 전술한 작제물과 동일하지만 유닛 링커나 항원 유닛을 포함하지 않는다. 이것은 음성 대조군 역할을 한다. VB1026은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

작제물을 포함하는 발현 벡터의 작제 및 작제물에 의해 암호화되는 온전한 이량체 단백질의 발현 및 분비 확인:

앞서 언급한 모든 작제물의 항원 유닛의 서열을 Genscript(미국 뉴저지)로부터 주문하여 상기 표 14에 기재된 신호 펩티드, 표적화 유닛 및 이량체화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마스터 플라스미드인 발현 벡터 pUMVC4a에 클로닝하였다.

HEK293 세포(ATCC)를 전술한 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히 말해서, 2x10⁵개의 세포/웰을 10% FBS 성장 배지가 있는 24웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 제조업체(Invitrogen, Thermo Fischer Scientific)가 제안한 조건에서 Lipofectamine® 2000 시약을 사용하여 각각의 DNA 플라스미드 1㎍으로 형질감염시켰다. 그런 다음 형질감염된 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 최대 5일 동안 유지시켰다. 나중에 항 hIgG(CH3 도메인), hMIP-1α 및 각각의 항원 유닛에 특이적인 항체를 사용하는 상등액의 샌드위치 ELISA에 의해 작제물에 의해 암호화된 단백질의 발현의 특성화를 위해 세포 상등액을 수확하였다.

작제물의 면역원성 평가:

작제물의 면역원성은 작제물로 백신접종된 마우스에서 생체내에서 유도된 T 세포 면역 반응을 측정함으로써 결정하였다.

6주령 암컷 BALB/c 마우스를 Janvier Labs(프랑스)에서 구입하였다. 모든 동물은 Radium Hospital(노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 Norwegian Food Safety Authority(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. 5마리의 마우스/그룹은 항원 유닛을 포함하는 작제물의 테스트에 사용된 반면, 3마리의 마우스/그룹은 음성 대조군으로 사용되었다.

20 μg의 작제물을 2회, 즉 제0일 및 제21일에 근육주사한 후 전기천공법을 시행하였다. 28일 째에 비장을 채취하였다.

비장을 세포 여과기에서 으깨어 단일 세포 현탁액을 얻었다. 테스트된 각 작제물에 대해 Dynabeads™ 고갈을 사용하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 정제하기 위해 단일 세포 현탁액의 일부를 사용하였다. 총 비장세포, CD4 고갈된 비장세포 및 CD8 고갈된 비장세포를 ELISpot 분석에서 INF-γ 생산에 대해 테스트하였다. 표 15에 제시된 10개의 네오에피토프를 사용하여 작제물 VB4097 및 VB4105로 백신 접종된 마우스로부터 수확된 비장세포를 재자극하는 한편, 아래 표 17에 제시된 NY-ESO-1 펩티드는 상기 표에 나타난 작제물로 예방접종된 마우스로부터 수확된 비장세포를 재자극하는 데 사용되었다.

작제물 VB4097, VB4100 및 VB4105의 면역원성 비교

작제물 VB4097(10개의 네오에피토프), VB4100(NY-ESO-1 전장) 및 VB4105(10개의 네오에피토프 및 NY-ESO-1 전장)를 표 15(VB4097 및 VB4105) 및 표 17(VB4100 및 VB4105)의 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응을 이끌어내는 능력에 대해 비교하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, 음성 대조군 VB1026으로 백신접종된 마우스는 네오에피토프 및 NY-ESO-펩티드 서열 모두에 대해 낮은 기초 면역원성을 나타내었다.

동일한 10개의 CT26 네오에피토프를 포함하는 VB4097 및 VB4105 양자 모두는, 항원 유닛이 10개의 네오에피토프만을 포함하는지 또는 이에 더해 NY-ESO-1(VB4105)의 전장 서열을 포함하는지 여부와 무관하게, 10개의 네오에피토프(도 9, 회색 막대)에 대해 유사한 총 T 세포 반응(INF-γ 반응)을 유도한다.

또한, NY-ESO-1의 전장 서열을 포함하는 VB4100 및 VB4105 양자 모두는 항원 유닛이 NY-ESO-1의 전장 서열(VB4100)만을 포함하는지 또는 추가로 10개의 네오에피토프(VB4105)를 포함하는지 여부와 무관하게, 표 17(도 9, 검은색 막대)에 나타난 바와 같이 재자극에 사용된 펩티드에 대해 유사한 총 T 세포 반응(INF-γ 반응)을 유도한다.

VB4105의 경우, 10개의 네오에피토프를 포함하는 VB4097의 항원 유닛에 NY-ESO-1 전장 서열을 추가하자, NY-ESO-1에 대한 추가 면역원성으로 인해, VB4097을 사용한 백신접종에 의해 유도된 것과 비교하여 더 높은 총 T 세포 반응이 유도되었다.

이들 결과는 환자-존재 공유 항원을 포함하는 본 발명에 따른 백신이 환자-특이적 항원(네오에피토프)을 포함하는 백신의 것과 유사한 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 환자-존재 공유 항원과 환자-특이적 항원(네오에피토프)을 모두 항원 유닛에 포함하는 이점이 있음을 나타낸다.

작제물 VB4100, VB4101 및 VB4102의 면역원성 비교

인 실리코 방법을 사용하여 NY-ESO-1의 아미노산 81-88로 이루어진 에피토프는 활성 CD8+ T 세포 대한 MHC 클래스 I에 강하게 결합하는 것으로 예측된 반면, NY-ESO-1의 아미노산 81-126으로 이루어진 펩티드는 여러 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원을 포함하는 것으로 예측되었다. 따라서, 작제물 VB4100(NY-ESO-1 전체 길이), VB4101(NY-ESO-1 아미노산 81-88) 및 VB4102(NY-ESO-1 아미노산 81-126)를 작제하고 T 세포 면역 반응을 이끌어내는 이들의 유도 능력을 비교하였다.

먼저, 예측된 아미노산 81-88 영역에 대해 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 3개의 작제물을 비교하였다. 이들 작제물들로 백신접종된 마우스의 비장세포로부터 분리된 CD8+ T 세포를 표 16에 나타낸 아미노산 81-88 최소 에피토프로 재자극하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 실험 결과 NY-ESO-1의 아미노산 81-88로 이루어진 에피토프는 실제로 강한 CD8+ T 세포 에피토프인 것으로 확인되었다. 더욱이, 이 영역에 대한 면역원성은 에피토프가 항원 유닛(VB4101)의 유일한 서열인지 또는 더 긴 NY-ESO-1 서열 또는 전체 NY-ESO-1 서열을 포함하는 항원 유닛인지 여부와 무관한다.

다음으로, VB4102를 VB4100과 비교하여 NY-ESO-1의 아미노산 서열 81-126에서 예측된 여러 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원이 전장 NY-ESO-1 서열과 유사한 반응을 이끌어내는지 여부를 평가하였다. 작제물로 백신 접종된 마우스의 비장세포로부터 분리된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 표 17에 나타낸 펩티드로 재자극하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, NY-ESO-1의 아미노산 서열 81-126은 양자 모두 단리된 CD8+(도 11B) 및 CD4+ T 세포(도 11C) 및 총 T 세포 반응(도 11A)의 측면에서 NY-ESO-1 전장 서열보다 더 강한 반응을 이끌어낸다.

이러한 결과는 인 실리코 방법을 사용함으로써 강력한 면역 반응을 유도할 것으로 예측되는 환자-존재 공유 항원의 짧은(더 짧은) 서열/에피토프를 식별할 수 있음을 시사한다. 환자-존재 공유 항원의 더 긴 서열 또는 전장 서열 대신에 이러한 서열/에피토프를 본 발명의 백신의 항원 유닛에 포함함으로써, 다른 환자-존재 공유 항원 및/또는 환자-특이적 항원/네오에피토프 서열을 포함하기 위한 공간이 항원 유닛에 남게 된다. 이것은 그러한 개별 항암 백신을 받은 환자가 그 백신에 대해 강한 면역 반응을 보일 가능성을 높여줄 것이다.

실시예 8: 본 발명에 따른 DNA 백신의 면역원성

공유 항원 서열 및/또는 네오에피토프를 포함하는 DNA 백신의 설계:

표 18에 나타낸 유닛/부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 6개의 DNA 백신(작제물)을 설계하였다:

10개의 B16 네오에피토프를 포함하는 DNA 백신 VB4118:

이 작제물을 환자-특이적 항원 서열, 즉 네오에피토프를 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로서 선택하였다.

이전에 설명된 마우스 흑색종 세포주 B16.F10의 엑솜 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱은 수백에서 수천 개의 종양-특이적 비동의 돌연변이를 밝혀냈다. 인 실리코 기법을 사용하여 잠재적인 면역원성 서열, 즉 네오에피토프를 동정하고 그 중 10개(표 19)를 VB4118의 항원 유닛에 포함하기 위해 선택하였다. 동정된 10개의 네오에피토프는 각각 27개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 말단 네오에피토프를 제외한 모든 것은 서브유닛으로 배열되었고, 각 서브유닛은 하나의 네오에피토프와 하나의 유연한 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS)로 구성되었다.

VB4118은 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

TRP-2 서열을 포함하는 DNA 백신 VB4119 및 프레임시프트 항원을 포함하는 VB4127

이들 작제물들은 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로서 선택되었다.

티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2)는 멜라닌 세포 계통 정상 분화 단백질이다. 이 공유 항원(분화 항원)은 생체내 C57BL/6 마우스에서 B16 흑색종 세포의 종양 거부를 유도하는 것으로 알려져 있다. 문헌에서, 표 20에 제시된 9개 아미노산 길이의 MHC 클래스 I 에피토프(TRP-2의 아미노산 180-188)는 TRP-2의 항종양 효과를 담당하는 면역원성 서열로 동정된 바 있다.

VB4119는 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

프레임시프트 돌연변이는 뉴클레오타이드의 인델(삽입 또는 결실)이 DNA 판독 프레임의 시프트로 이어질 때 발생하는 DNA 돌연변이이다. 결과적으로, 인델 다음에 이어지는 전체 DNA 서열이 부정확하게 판독되고 결과적인 단백질이 변경될 것이다. 종양 세포에서 발생하는 프레임시프트 돌연변이는 면역원성이 높을 수 있는 새로운 펩티드 서열을 생성하고, 더욱이 동일한 프레임시프트 항원이 다른 환자에 걸쳐 발생할 수 있으므로 공유 항원 암 백신에 대한 유망한 표적이 될 수 있다(예를 들어 Ballhausen et al., Nat. Commun. 11, 2020, 1-13 참조). 표 21에 나타낸 3개의 프레임시프트 항원은 인실리코 방법에 의해 면역원성으로 동정되었으며 VB4127 작제물에 암호화된다. 항원 유닛에서 이들은 유연한 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS)에 의해 서로 분리된다.

VB4127은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

10개의 B16 네오에피토프 및 TRP-2 에피토프(VB4121) 또는 10개의 B16 네오에피토프 및 3개의 프레임시프트 항원(VB4128) 또는 10개의 B16 네오에피토프, TRP-2 에피토프 및 3개의 프레임시프트 항원(VB4130)을 포함하는 DNA 백신

이들 작제물은 환자-존재 공유 항원 서열 및 환자-특이적 항원 서열(네오에피토프)을 포함하는 개별화된 DNA 백신의 모델로서 선택되었다. 각 작제물은 표 19에 나타낸 10개의 B16 네오에피토프를 포함하는 항원 유닛을 포함하며, 이들 각각은 유연한 글리신-세린 링커(GGGGSGGGGS)에 의해 다음 네오에피토프 또는 공유 항원 서열로부터 분리된다. 이러한 서열 중 몇 가지를 포함하는 작제물에서 동일한 링커를 사용하여 공유 항원을 분리하였다. VB4121은 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 구성되며; VB4128은 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 구성되고, VB4130은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열로 이루어진다.

실시예 7에 설명된 작제물 VB1026을, 음성 대조군으로 사용하였다.

작제물을 포함하는 발현 벡터의 작제 및 작제물에 의해 암호화된 온전한 이량체 단백질의 발현 및 분비 확인

전술한 작제물을 포함하는 발현 벡터들을 실시예 7에 기재된 바와 같이 작제하였다. 작제물에 의해 암호화된 온전한 이량체 단백질의 발현 및 분비는 실시예 7에 기재된 바와 같이 확인되었다.

작제물의 면역원성 평가

작제물의 면역원성은 작제물로 백신접종된 마우스에서 생체내에서 유도된 T 세포 면역 반응을 측정함으로써 결정하였다.

6주령 암컷 C57BL/6 마우스를 Janvier Labs(프랑스)에서 구입하였다. 모든 동물은 Radium Hospital(노르웨이 오슬로)의 동물 시설에 수용되었다. 모든 동물 프로토콜은 Norwegian Food Safety Authority(노르웨이 오슬로)의 승인을 받았다. 5마리의 마우스/그룹은 항원 유닛을 포함하는 구조물의 테스트에 사용된 반면, 3마리의 마우스/그룹은 음성 대조군으로 사용되었다.

20 μg의 작제물을 0일째에 근육내 투여한 후 전기천공법을 시행하였다. 백신 접종된 마우스로부터의 비장을 14일에 채취하였다. 채취된 비장을 처리하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 ELISpot 분석을 수행하였다.

표 19에 제시된 10개의 네오에피토프를 사용하여 작제물 VB4118, VB4121, VB4128 및 VB4130으로 백신접종된 마우스로부터 채취한 비장세포를 재자극하였다. 표 20의 TRP-2 펩티드를 사용하여 작제물 VB4119, VB4121 및 VB4130으로 백신접종된 마우스로부터 채취한 비장세포를 재자극하였다. 하기 표 22에 나타낸 프레임시프트 펩티드를 사용하여 작제물 VB4127, VB4128 및 VB4130으로 백신접종된 마우스로부터 수거된 비장세포를 재자극하였다.

작제물 VB4118, VB4119, VB4121, VB4127, VB4128 및 VB4130의 면역원성 비교

작제물 VB4118(10개의 네오에피토프), VB4119(TRP-2), VB4121(10개의 네오에피토프 및 TRP-2), VB4127(3개의 프레임시프트 항원), VB4128(10개의 신생항원 및 3개의 프레임시프트 항원), 및 VB4130 (10개의 네오에피토프, 3개의 프레임시프트 항원 및 TRP-2)를, 적용 가능한 경우 표 19, 20 및 22의 펩티드에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 비교하였다.

도 12에 도시된 바와 같이, 음성 대조군 VB1026으로 백신접종된 마우스는 시험된 모든 펩티드에 대해 낮은 기초 면역원성을 나타내었다.

환자-특이적 항원만을 포함하는 백신의 모델 작제물(VB4118)과 환자-존재 공유 항원(들)만을 포함하는 백신의 모델 작제물(VB4119 및 VB4127) 모두는 백신 접종된 마우스에서 면역 반응을 유도한다.

모두 동일한 10개의 B16 네오에피토프를 포함하는 VB4118, VB4121, VB4128 및 VB4130은, 항원 유닛이 10개의 네오에피토프만을 포함하는지(VB4118) 또는 이에 더해 TRP-2 에피토프를 포함하는지(VB4121), 3개의 프레임시프트 항원을 포함하는지(VB4128) 또는 TRP-2 에피토프와 3개의 프레임시프트 항원을 추가로 포함하는지(VB4130)와 무관하게, 10개의 네오에피토프에 대해 유사한 총 T 세포 반응(INF-γ 반응)을 유도한다(도 12, 검은색 막대).

추가로, 도 12는 공유 항원을 네오에피토프 작제물에 추가하면 10개의 네오에피토프, 3개의 프레임시프트 항원 및 TRP-2 에피토프를 암호화하는 작제물(VB4130)에 대해 관찰된 가장 높은 총 T 세포 반응과 함께 더 광범위하고 증가된 총 T 세포 반응을 유도한다는 것을 보여준다.

또한 이 연구 결과는 환자-존재 공유 항원을 포함하는 본 발명에 따른 백신이 환자-특이적 항원(네오에피토프)을 포함하는 백신의 것과 유사한 면역 반응을 유발할 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 이러한 결과는 상이한 유형의 공유 항원 및 환자-특이적 항원(네오에피토프)을 항원 유닛에 포함함으로써 더 광범위하고 총체적인 T 세포 반응이 증가하는 이점이 있음을 보여준다.

서열

SEQ ID NO: 1

신호 펩타이드 (aa 1-23) 및 성숙한 펩타이드 (hMIP1α/LD78-베타, aa 24-93)를 포함하는 C-C 모티프 케모카인 3-유사 1 전구체:

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA

SEQ ID NO: 2

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK | GLGGL |

SEQ ID NO: 3

링커, 아미노산 서열: GLSGL

SEQ ID NO: 4

링커, 아미노산 서열: GLGGL

SEQ ID NO: 5

힌지 영역 1 (인간 IgG3 UH 힌지), 12 아미노산: ELKTPLGDTTHT

SEQ ID NO: 6

힌지 영역 4 (인간 IgG3, MH 힌지, 15 아미노산): EPKSCDTPPPCPRCP

SEQ ID NO: 7

Gly-Ser 링커: GGGSSGGGSG

SEQ ID NO: 8

hCH3 IgG3, 아미노산 서열:

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVM H EALH N RFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 9

신호 펩타이드

MNFGLRLIFLVLTLKGVQC

SEQ ID NO: 10

신호 펩타이드

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP

SEQ ID NO: 11: HPV16 E6

MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL

SEQ ID NO: 12: HPV16 E7

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

SEQ ID NO: 13: NY-ESO-1

MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR

SEQ ID NO: 14 (302 아미노산)

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: E7 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E6.

VQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGGGGSGGGGSARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRRSGGGGSGGGGMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL

SEQ ID NO: 15 (924 아미노산)

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: T1D320 | 링커 | T1D814 | 링커 | T1D182 | 링커 | T1D689 | 링커 | E7 | 링커 | T1D339 | 링커 | T1D428 | 링커 |NY-ESO-1 | 링커 | T1D572 | 링커 | T1D359 | 링커 | T1D488 | 링커 | T1D554 | 링커 | T1D272 | 링커 | T1D210 | 링커 | T1D849 | 링커 | T1D4 | 링커 | T1D77 | 링커 | T1D717 | 링커 | T1D586 | 링커 | E6.

HNEGDDQQGSRYSLIPQIQKVCEVVDGGSSGGGSSGGSEQERMKSSLLKEHMLRKQAELESAQCSGGGGSGGGGELRENLLTYLPDSVTQLRRLEELDLGNGGGGSGGGGSQEVFSSYKFNHLVRRLVLQREKHFHYLSGGGGSGGGGVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPGGGGSGGGGSIEKNADLCYLSTVHWSLILDAVSNNYIGGGGSGGGGSLATAGEPYHDIRFKLMAVVPDRRIKYEGGGGSGGGGSARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRRSGGGGSGGGGMLRLPTVFRQIRPVSRVLAPHLTRSGGGGSGGGGIQIMENPFVQSMLWNPDLMRQLIMANPGGGGSGGGGSLLRFLFLGLSALALPSRAQLQLHLPANGGGGSGGGGSMGKNPVRPPRAFPPVPSIDDIPLSRGSGGGGSGGGGHVDFTIEVERALTVLDGAVLVLCAVGSSGGGSSGGGEYKLMYGMLFSIRLFVSKMSPLDMKDGGSSGGGSSGGSQGAGVESLDFRLYLRYEFLMLGIQPVGGGGSGGGGSAAKTLVLCVSDIILLSANISETSSNKTSGGGGSGGGGCKDLQLYLSNLANHIDRETGIGDVPLVGGGGSGGGGSQSKHTEARELMYSAALLFFSHGQQNSAGGGGSGGGGSMTLAESYAQYVYNLCNSLSIKVEESSGGGGSGGGGMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFARRDLCIVYRDGNPYAVRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL

SEQ ID NO: 16 (227 아미노산)

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: E6 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | E7

VRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLSGGGGSGGGGGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSIGGGGSGGGGSAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTL

SEQ ID NO: 17 (850 아미노산)

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: E6 | 링커 | T1D323 | 링커 | T1D506 | 링커 | T1D12 | 링커 | T1D315 | 링커 | T1D302 | 링커 | T1D700 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D535 | 링커 | T1D358 | 링커 | T1D670 | 링커 | T1D294 | 링커 | T1D336 | 링커 | T1D499 | 링커 | T1D425 | 링커 T1D491 | 링커 | T1D314 | 링커 | T1D430 | 링커 | E7 | 링커 | T1D582.

VRDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLSGGGGSGGGGKKVSKTRHTRETVFRRAKRRWAPIPCSSGGGGSGGGGNLKHENILQFLTAQERKTELGKQYWLIGGGGSGGGGSVQVFGLYFGEEFHETFDCPIKGSGGGGSGGGGQAAASQAGGARGYARGAQLWPPGSDPGGGGSGGGGSSIMQTWFTLFTPTDATSIVATTVMSNSSGGGGSGGGGQENVRFVLVRSEALLPNAGPRSAEARVGGGGSGGGGSGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSIGGGGSGGGGSDAFPNLKDFISRFQVMPPSSFLFDAPCSGGGGSGGGGPSSLQVKPETPASEAVAVAAAAAPTTTSGGGGSGGGGRFFHLADLFLSSSQLPAYLVAAFAKRLSGGGGSGGGGLVFLWLHSLRRLFGCLYVSVFSNVMIHSGGGGSGGGGWENAIAALFRRHIAVSWLIRATLSESEGGGGSGGGGSRYIFVKSAGSRIEEGVLQFLVLLVAGRSGGGGSGGGGQEIEWLPFRCIKCLKLSFSTAELLCMHGGGGSGGGGSLVARCPPCLRLLRQARDFQAARYDRHDGGGGSGGGGSALGTPEDLDSYIDLSLESLNQMILELDGGGGSGGGGSSQDMLSIMEKLEFLDFSYDLNLCGLTEGGGGSGGGGSAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGGGSGGGGSGRREQYIPNEEFLHFDLLEDSKYRKIYS

SEQ ID NO: 18 (221 아미노산):

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: NY-ESO-1 | 링커 | E7 | 링커 | E6.

GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFGGGGSGGGGSAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLSGGGGSGGGGKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMS

SEQ ID NO: 19 (831 아미노산)

항원 서열을 다음 순서로 포함하는 항원 유닛: T1D223 | 링커 | T1D164 | 링커 | T1D56 | 링커 | T1D36 | 링커 | T1D129 | 링커 | T1D274 | 링커 | T1D62 | 링커 | T1D5 | 링커 | T1D144 | 링커 | T1D441 | 링커 | T1D368 | 링커 | NY-ESO-1 | 링커 | T1D234 | 링커 | T1D162 | 링커 | T1D39 | 링커 | T1D272 | 링커 | E7 | 링커 | T1D328 | 링커 | T1D188 | 링커 | E6.

GPSYRSNSVSSLDLEGEGGGGSGGGGSLKEEKENLQGLVTHQTYIIQELEKQLNGGGGSGGGGSQRQKTAGKIFRAEVSTGQDAPRQAQARGGGSSGGGSSILRPSTVNELESGEISYDEVGERIKDFGGGGSGGGGSDTCINEDVESLRKMVQDLLAKLQEAKRSGGGGSGGGGLREEGTKYKSFVQRARLVFREEGYLAFGGGGSGGGGSHEGARPMRAIFLANGNVFTTGFSRMSEGGGGSGGGGSIPDAAFIQAARRKCELARAQDDYISLDGGGGSGGGGSMEIAKMRAGRRLWVHLIEKMFQPKNSKGGGGSGGGGSMELVSFRDVAIEFSPEEWGGGGSGGGGSTCVHEIPFHFDLMELLPQCQQLQMFFLGGGSGGGGSGGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFGGGGSGGGGSVRRVFITDDFHDMIPKYLNFVKGVVDSSGGGGSGGGGNFHAHREKAPSLFCSRILNKAVYLFYGSSGGGSSGGGDANKEGMFLFRAAHKLRQFLKMNSTGDGGGGSGGGGSLLSLGWSVDVGRHSGWTGHVSTSWSINGGGGSGGGGSAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLSGGGGSGGGGNTIFSLRKDLRQGKARRLRCMEEKEMFGGGGSGGGGSNHFNDFEGDPAMTQFLEEFEKNLEDTKGGGGSGGGGSKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINRQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMS

SEQ ID NO: 20

VB4097의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLKIYEFDYHLYGQNITMIMTSVSGHLLAGGGGSGGGGSAEYGDYQPEVHGVPYFRLEHYLPARVMGGGGSGGGGSGSLFGSSRVQYVVNPAVKIVFLNIDPSGGGGSGGGGSLWVYLRPVPRPATIYLQILRLKPLTGEGGGGSGGGGSTLAFLVLSTPAMFNRALKPFLKSCHFQGGGGSGGGGSFVSPMAHYVPGIMAIESVVARFQFIVPGGGGSGGGGSVILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSGGGGSEVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPHGGGGSGGGGSDTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLATGGGGSGGGGSKSWIHCWKYLSVQSQLFRGSSLLFRRV

SEQ ID NO: 21

VB4100 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLMQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR

SEQ ID NO: 22

VB4101 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLRGPESRLL

SEQ ID NO: 23

VB4102 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLRGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEF

SEQ ID NO: 24

VB4105 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLKIYEFDYHLYGQNITMIMTSVSGHLLAGGGGSGGGGSAEYGDYQPEVHGVPYFRLEHYLPARVMGGGGSGGGGSGSLFGSSRVQYVVNPAVKIVFLNIDPSGGGGSGGGGSLWVYLRPVPRPATIYLQILRLKPLTGEGGGGSGGGGSTLAFLVLSTPAMFNRALKPFLKSCHFQGGGGSGGGGSFVSPMAHYVPGIMAIESVVARFQFIVPGGGGSGGGGSVILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSGGGGSEVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPHGGGGSGGGGSDTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLATGGGGSGGGGSKSWIHCWKYLSVQSQLFRGSSLLFRRVGGGGSGGGGSMQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR

SEQ ID NO: 25

VB1026 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 26

VB4118 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSLKDFFFSRGRFSSALKRTLILSSGFRLGGGGSGGGGSKNILAVSFAPLVQLSKNDNGTPDSVGLGGGGSGGGGSLEAVLRYLETHPRLPKPDPVKSSSSVLGGGGSGGGGSPAADRWEPRAPMRAPRVLHAMLGAAGRGGGGSGGGGSVLSADLVHYLRLSLEYLRAWHSEDVSLGGGGSGGGGSYLPGGGAGHLDQNVFLRVRALCYVISGGGGGSGGGGSPATIEMAIETLQKFDGLSTHRSSLLNSGGGGSGGGGSAGKDHKIKQWDADTFEHIQTLEGHHQE

SEQ ID NO: 27

VB4119 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLSVYDFFVWL

SEQ ID NO: 28

VB4127 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLYISDHMKVHSPSPCLGGGGSGGGGSEGWQTCWGRSRKHWGSTWNGSARLSPGSTLWVMRICLRSLGIARTWLSCRSTSRKCSPAFPASSGGGGGSGGGGSLFRLLPSGPKVNDGHRSRRWHSLDLYPHLCSHLDLPKQSQEVIRL

SEQ ID NO: 29

VB4121 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSLKDFFFSRGRFSSALKRTLILSSGFRLGGGGSGGGGSKNILAVSFAPLVQLSKNDNGTPDSVGLGGGGSGGGGSLEAVLRYLETHPRLPKPDPVKSSSSVLGGGGSGGGGSPAADRWEPRAPMRAPRVLHAMLGAAGRGGGGSGGGGSVLSADLVHYLRLSLEYLRAWHSEDVSLGGGGSGGGGSYLPGGGAGHLDQNVFLRVRALCYVISGGGGGSGGGGSPATIEMAIETLQKFDGLSTHRSSLLNSGGGGSGGGGSAGKDHKIKQWDADTFEHIQTLEGHHQEGGGGSGGGGSSVYDFFVWL

SEQ ID NO: 30

VB4128 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLYISDHMKVHSPSPCLGGGGSGGGGSEGWQTCWGRSRKHWGSTWNGSARLSPGSTLWVMRICLRSLGIARTWLSCRSTSRKCSPAFPASSGGGGGSGGGGSLFRLLPSGPKVNDGHRSRRWHSLDLYPHLCSHLDLPKQSQEVIRLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSLKDFFFSRGRFSSALKRTLILSSGFRLGGGGSGGGGSKNILAVSFAPLVQLSKNDNGTPDSVGLGGGGSGGGGSLEAVLRYLETHPRLPKPDPVKSSSSVLGGGGSGGGGSPAADRWEPRAPMRAPRVLHAMLGAAGRGGGGSGGGGSVLSADLVHYLRLSLEYLRAWHSEDVSLGGGGSGGGGSYLPGGGAGHLDQNVFLRVRALCYVISGGGGGSGGGGSPATIEMAIETLQKFDGLSTHRSSLLNSGGGGSGGGGSAGKDHKIKQWDADTFEHIQTLEGHHQE

SEQ ID NO: 31

VB4130 의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSAELKTPLGDTTHTEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGKGLGGLYISDHMKVHSPSPCLGGGGSGGGGSEGWQTCWGRSRKHWGSTWNGSARLSPGSTLWVMRICLRSLGIARTWLSCRSTSRKCSPAFPASSGGGGGSGGGGSLFRLLPSGPKVNDGHRSRRWHSLDLYPHLCSHLDLPKQSQEVIRLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSLKDFFFSRGRFSSALKRTLILSSGFRLGGGGSGGGGSKNILAVSFAPLVQLSKNDNGTPDSVGLGGGGSGGGGSLEAVLRYLETHPRLPKPDPVKSSSSVLGGGGSGGGGSPAADRWEPRAPMRAPRVLHAMLGAAGRGGGGSGGGGSVLSADLVHYLRLSLEYLRAWHSEDVSLGGGGSGGGGSYLPGGGAGHLDQNVFLRVRALCYVISGGGGGSGGGGSPATIEMAIETLQKFDGLSTHRSSLLNSGGGGSGGGGSAGKDHKIKQWDADTFEHIQTLEGHHQEGGGGSGGGGSSVYDFFVWLGGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 32

HPV E6의 아미노산 6-15

QERPRKLPQ

SEQ ID NO: 33

HPV E6의 아미노산 8-17

RPRKLPQLC

SEQ ID NO: 34

HPV E6의 아미노산 23-32

IHDIILECV

SEQ ID NO: 35

HPV E6의 아미노산 24-33

HDIILECVY

SEQ ID NO: 36

HPV E6의 아미노산 26-35

IILECVYCK

SEQ ID NO: 37

HPV E6의 아미노산 35-44

QQLLRREVY

SEQ ID NO: 38

HPV E6의 아미노산 42-51

VYDFARRDL

SEQ ID NO: 39

HPV E6의 아미노산 43-52

YDFARRDLC

SEQ ID NO: 40

HPV E6의 아미노산 44-53

DFARRDLCI

SEQ ID NO: 41

HPV E6의 아미노산 45-54

FARRDLCIV

SEQ ID NO: 42

HPV E6의 아미노산 60-69

YAVRDKCLK

SEQ ID NO: 43

HPV E6의 아미노산 62-71

VRDKCLKFY

SEQ ID NO: 44

HPV E6의 아미노산 81-90

YSLYGTTLE

SEQ ID NO: 45

HPV E6의 아미노산 125-134

FHNIRGRWT

SEQ ID NO: 46

HPV E6의 아미노산 131-140

RWTGRCMSC

SEQ ID NO: 47

HPV E6의 아미노산 143-152

SRTRRETQL

SEQ ID NO: 48

HPV E6의 아미노산 16-31

CTELQTTIHDIILEC

SEQ ID NO: 49

HPV E6의 아미노산 17-32

TELQTTIHDIILECV

SEQ ID NO: 50

HPV E6의 아미노산 18-33

ELQTTIHDIILECVY

SEQ ID NO: 51

HPV E6의 아미노산 19-34

LQTTIHDIILECVYC

SEQ ID NO: 52

HPV E6의 아미노산 20-35

QTTIHDIILECVYCK

SEQ ID NO: 53

HPV E6의 아미노산 34-49

KQQLLRREVYDFARR

SEQ ID NO: 54

HPV E6의 아미노산 49-64

DLCIVYRDGNPYAVR

SEQ ID NO: 55

HPV E6의 아미노산 50-65

LCIVYRDGNPYAVRD

SEQ ID NO: 56

HPV E6의 아미노산 51-66

CIVYRDGNPYAVRDK

SEQ ID NO: 57

HPV E6의 아미노산 78-93

HYCYSLYGTTLEQQY

SEQ ID NO: 58

HPV E6의 아미노산 95-110

PLCDLLIRCINRQKP

SEQ ID NO: 59

HPV E6의 아미노산 96-111

LCDLLIRCINRQKPL

SEQ ID NO: 60

HPV E6의 아미노산 97-112

CDLLIRCINRQKPLC

SEQ ID NO: 61

HPV E6의 아미노산 98-113

DLLIRCINRQKPLCP

SEQ ID NO: 62

HPV E6의 아미노산 99-114

LLIRCINRQKPLCPE

SEQ ID NO: 63

HPV E6의 아미노산 121-136

KKQRFHNIRGRWTGR

SEQ ID NO: 64

HPV E7의 아미노산 7-16

TLHEYMLDL

SEQ ID NO: 65

HPV E7의 아미노산 22-31

LYGYGQLND

SEQ ID NO: 66

HPV E7의 아미노산 38-47

IDGPAGQAE

SEQ ID NO: 67

HPV E7의 아미노산 48-57

DRAHYNIVT

SEQ ID NO: 68

HPV E7의 아미노산 55-64

VTFCCKCDS

SEQ ID NO: 69

HPV E7의 아미노산 66-75

RLCVQSTHV

SEQ ID NO: 70

HPV E7의 아미노산 72-81

THVDIRTLE

SEQ ID NO: 71

HPV E7의 아미노산 73-82

HVDIRTLED

SEQ ID NO: 72

HPV E7의 아미노산 85-94

GTLGIVCPI

SEQ ID NO: 73

HPV E7의 아미노산 4-19

DTPTLHEYMLDLQPE

SEQ ID NO: 74

HPV E7의 아미노산 5-20

TPTLHEYMLDLQPET

SEQ ID NO: 75

HPV E7의 아미노산 6-21

PTLHEYMLDLQPETT

SEQ ID NO: 76

HPV E7의 아미노산 7-22

TLHEYMLDLQPETTD

SEQ ID NO: 77

HPV E7의 아미노산 8-23

LHEYMLDLQPETTDL

SEQ ID NO: 78

HPV E7의 아미노산 9-24

HEYMLDLQPETTDLY

SEQ ID NO: 79

HPV E7의 아미노산 10-25

EYMLDLQPETTDLYG

SEQ ID NO: 80

HPV E7의 아미노산 70-85

QSTHVDIRTLEDLLM

SEQ ID NO: 81

HPV E7의 아미노산 71-86

STHVDIRTLEDLLMG

SEQ ID NO: 82

HPV E7의 아미노산 72-87

THVDIRTLEDLLMGT

SEQ ID NO: 83

HPV E7의 아미노산 73-88

HVDIRTLEDLLMGTL

SEQ ID NO: 84

HPV E7의 아미노산 74-89

VDIRTLEDLLMGTLG

SEQ ID NO: 85

HPV E6의 아미노산 16-25

CTELQTTIH

SEQ ID NO: 86

HPV E6의 아미노산 42-51

VYDFARRDL

SEQ ID NO: 87

HPV E6의 아미노산 45-54

FARRDLCIV

SEQ ID NO: 88

HPV E6의 아미노산 52-61

IVYRDGNPY

SEQ ID NO: 89

HPV E6의 아미노산 54-63

YRDGNPYAV

SEQ ID NO: 90

HPV E6의 아미노산 68-77

KFYSKISEY

SEQ ID NO: 91

HPV E6의 아미노산 73-82

ISEYRHYCY

SEQ ID NO: 92

HPV E6의 아미노산 75-84

EYRHYCYSL

SEQ ID NO: 93

HPV E6의 아미노산 80-89

CYSLYGTTL

SEQ ID NO: 94

HPV E6의 아미노산 84-93

YGTTLEQQY

SEQ ID NO: 95

HPV E6의 아미노산 88-97

LEQQYNKPL

SEQ ID NO: 96

HPV E6의 아미노산 91-100

QYNKPLCDL

SEQ ID NO: 97

HPV E6의 아미노산 11-20

RHLDKKQRF

SEQ ID NO: 98

HPV E6의 아미노산 12-21

RFHNIRGRW

SEQ ID NO: 99

HPV E6의 아미노산 18-33

ELQTTIHDIILECVY

SEQ ID NO: 100

HPV E6의 아미노산 49-64

DLCIVYRDGNPYAVR

SEQ ID NO: 101

HPV E6의 아미노산 50-65

LCIVYRDGNPYAVRD

SEQ ID NO: 102

HPV E6의 아미노산 51-66

CIVYRDGNPYAVRDK

SEQ ID NO: 103

HPV E6의 아미노산 74-89

SEYRHYCYSLYGTTL

SEQ ID NO: 104

HPV E6의 아미노산 75-90

EYRHYCYSLYGTTLE

SEQ ID NO: 105

HPV E6의 아미노산 76-91

YRHYCYSLYGTTLEQ

SEQ ID NO: 106

HPV E6의 아미노산 77-92

RHYCYSLYGTTLEQQ

SEQ ID NO: 107

HPV E6의 아미노산 78-93

HYCYSLYGTTLEQQY

SEQ ID NO: 108

HPV E6의 아미노산 96-111

LCDLLIRCINRQKPL

SEQ ID NO: 109

HPV E6의 아미노산 97-112

CDLLIRCINRQKPLC

SEQ ID NO: 110

HPV E6의 아미노산 98-113

DLLIRCINRQKPLCP

SEQ ID NO: 111

HPV E6의 아미노산 99-114

LLIRCINRQKPLCPE

SEQ ID NO: 112

HPV E6의 아미노산 121-136

KKQRFHNIRGRWTGR

SEQ ID NO: 113

HPV E7의 아미노산 3-12

GDTPTLHEY

SEQ ID NO: 114

HPV E7의 아미노산 7-16

TLHEYMLDL

SEQ ID NO: 115

HPV E6의 아미노산 9-18

HEYMLDLQP

SEQ ID NO: 116

HPV E6의 아미노산 15-24

LQPETTDLY

SEQ ID NO: 117

HPV E6의 아미노산 19-28

TTDLYGYGQ

SEQ ID NO: 118

HPV E6의 아미노산 20-29

TDLYGYGQL

SEQ ID NO: 119

HPV E6의 아미노산 44-53

QAEPDRAHY

SEQ ID NO: 120

HPV E6의 아미노산 49-58

RAHYNIVTF

SEQ ID NO: 121

HPV E6의 아미노산 71-80

STHVDIRTL

SEQ ID NO: 122

HPV E6의 아미노산 79-88

LEDLLMGTL

SEQ ID NO: 123

HPV E6의 아미노산 ´03-18

GDTPTLHEYMLDLQP

SEQ ID NO: 124

HPV E6의 아미노산 4-19

DTPTLHEYMLDLQPE

SEQ ID NO: 125

HPV E6의 아미노산 5-20

TPTLHEYMLDLQPET

SEQ ID NO: 126

HPV E6의 아미노산 6-21

PTLHEYMLDLQPETT

SEQ ID NO: 127

HPV E6의 아미노산 7-22

TLHEYMLDLQPETTD

SEQ ID NO: 128

HPV E6의 아미노산 8-23

LHEYMLDLQPETTDL

SEQ ID NO: 129

HPV E6의 아미노산 70-85

QSTHVDIRTLEDLLM

SEQ ID NO: 130

HPV E6의 아미노산 71-86

STHVDIRTLEDLLMG

SEQ ID NO: 131

HPV E6의 아미노산 72-87

THVDIRTLEDLLMGT

SEQ ID NO: 132

HPV E6의 아미노산 73-88

HVDIRTLEDLLMGTL

SEQ ID NO: 133

HPV E6의 아미노산 74-89

VDIRTLEDLLMGTLG

SEQ ID NO: 134

T1D320

HNEGDDQQGSRYSLIPQIQKVCEVVDG

SEQ ID NO: 135

T1D814

SEQERMKSSLLKEHMLRKQAELESAQC

SEQ ID NO: 136

T1D182

ELRENLLTYLPDSVTQLRRLEELDLGN

SEQ ID NO: 137

T1D689

QEVFSSYKFNHLVRRLVLQREKHFHYL

SEQ ID NO: 138

T1D339

IEKNADLCYLSTVHWSLILDAVSNNYI

SEQ ID NO: 139

T1D428

LATAGEPYHDIRFKLMAVVPDRRIKYE

SEQ ID NO: 140

T1D572

MLRLPTVFRQIRPVSRVLAPHLTR

SEQ ID NO: 141

T1D359

IQIMENPFVQSMLWNPDLMRQLIMANP

SEQ ID NO: 142

T1D488

LLRFLFLGLSALALPSRAQLQLHLPAN

SEQ ID NO: 143

T1D554

MGKNPVRPPRAFPPVPSIDDIPLSR

SEQ ID NO: 144

T1D272

GHVDFTIEVERALTVLDGAVLVLCAVG

SEQ ID NO: 145

T1D210

EYKLMYGMLFSIRLFVSKMSPLDMKDG

SEQ ID NO: 146

T1D849

SQGAGVESLDFRLYLRYEFLMLGIQPV

SEQ ID NO: 147

T1D4

AAKTLVLCVSDIILLSANISETSSNKT

SEQ ID NO: 148

T1D77

CKDLQLYLSNLANHIDRETGIGDVPLV

SEQ ID NO: 149

T1D717

QSKHTEARELMYSAALLFFSHGQQNSA

SEQ ID NO: 150

T1D586

MTLAESYAQYVYNLCNSLSIKVEES

SEQ ID NO: 151

T11D323

KKVSKTRHTRETVFRRAKRRWAPIPCS

SEQ ID NO: 152

T11D506

NLKHENILQFLTAQERKTELGKQYWLI

SEQ ID NO: 153

T11D12

VQVFGLYFGEEFHETFDCPIK

SEQ ID NO: 154

T11D315

GQAAASQAGGARGYARGAQLWPPGSDP

SEQ ID NO: 155

T11D302

SIMQTWFTLFTPTDATSIVATTVMSNS

SEQ ID NO: 156

T11D700

QENVRFVLVRSEALLPNAGPRSAEARV

SEQ ID NO: 157

T11D535

DAFPNLKDFISRFQVMPPSSFLFDAPC

SEQ ID NO: 158

T11D358

PSSLQVKPETPASEAVAVAAAAAPTTT

SEQ ID NO: 159

T11D670

RFFHLADLFLSSSQLPAYLVAAFAKRL

SEQ ID NO: 160

T11D294

LVFLWLHSLRRLFGCLYVSVFSNVMIH

SEQ ID NO: 161

T11D336

WENAIAALFRRHIAVSWLIRATLSESE

SEQ ID NO: 162

T11D499

RYIFVKSAGSRIEEGVLQFLVLLVAGR

SEQ ID NO: 163

T11D425

QEIEWLPFRCIKCLKLSFSTAELLCMH

SEQ ID NO: 164

T11D491

LVARCPPCLRLLRQARDFQAARYDRHD

SEQ ID NO: 165

T11D314

ALGTPEDLDSYIDLSLESLNQMILELD

SEQ ID NO: 166

T11D430

SQDMLSIMEKLEFLDFSYDLNLCGLTE

SEQ ID NO: 167

T11D582

RREQYIPNEEFLHFDLLEDSKYRKIYS

SEQ ID NO: 168

T1D223

GPSYRSNSVSSLDLEGE

SEQ ID NO: 169

T1D164

LKEEKENLQGLVTHQTYIIQELEKQLN

SEQ ID NO: 170

T1D56

QRQKTAGKIFRAEVSTGQDAPRQAQAR

SEQ ID NO: 171

T1D36

ILRPSTVNELESGEISYDEVGERIKDF

SEQ ID NO: 172

T1D129

DTCINEDVESLRKMVQDLLAKLQEAKR

SEQ ID NO: 173

T1D274

LREEGTKYKSFVQRARLVFREEGYLAF

SEQ ID NO: 174

T1D62

HEGARPMRAIFLANGNVFTTGFSRMSE

SEQ ID NO: 175

T1D5

IPDAAFIQAARRKCELARAQDDYISLD

SEQ ID NO: 176

T1D144

MEIAKMRAGRRLWVHLIEKMFQPKNSK

SEQ ID NO: 177

T1D441

MELVSFRDVAIEFSPEEW

SEQ ID NO: 178

T1D368

TCVHEIPFHFDLMELLPQCQQLQMFFL

SEQ ID NO: 179

T1D234

VRRVFITDDFHDMIPKYLNFVKGVVDS

SEQ ID NO: 180

T1D162

NFHAHREKAPSLFCSRILNKAVYLFYG

SEQ ID NO: 181

T1D39

DANKEGMFLFRAAHKLRQFLKMNSTGD

SEQ ID NO: 182

T1D272

LLSLGWSVDVGRHSGWTGHVSTSWSIN

SEQ ID NO: 183

T1D328

NTIFSLRKDLRQGKARRLRCMEEKEMF

SEQ ID NO: 184

T1D188

NHFNDFEGDPAMTQFLEEFEKNLEDTK

SEQ ID NO: 185

C-pepM1

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP

SEQ ID NO: 186

C-pepM6

DTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLAT

SEQ ID NO: 187

C-pepM8

EVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPH

SEQ ID NO: 188

C-pepM29

GSLFGSSRVQYVVNPAVKIVFLNIDPS

SEQ ID NO: 189

C-pepM31

AEYGDYQPEVHGVPYFRLEHYLPARVM

SEQ ID NO: 190

C-pepM43

KSWIHCWKYLSVQSQLFRGSSLLFRRV

SEQ ID NO: 191

C-pepM89

TLAFLVLSTPAMFNRALKPFLKSCHFQ

SEQ ID NO: 192

C-pep149

FVSPMAHYVPGIMAIESVVARFQFIVP

SEQ ID NO: 193

C-pepM171

LWVYLRPVPRPATIYLQILRLKPLTGE

SEQ ID NO: 194

C-pepM173

KIYEFDYHLYGQNITMIMTSVSGHLLA

SEQ ID NO: 195

VB 4101 아미노산 81-88

RGPESRLL

SEQ ID NO: 196

VB4102 아미노산 81-126

RGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEF

SEQ ID NO: 197

NY-ESO_Pep-1

MQAEGRGTGGSTGDA

SEQ ID NO: 198

NY-ESO_Pep-2

TGGSTGDADGPGGPG

SEQ ID NO: 199

NY-ESO_Pep-3

ADGPGGPGIPDGPGG

SEQ ID NO: 200

NY-ESO_Pep-4

GIPDGPGGNAGGPGE

SEQ ID NO: 201

NY-ESO_Pep-5

GNAGGPGEAGATGGR

SEQ ID NO: 202

NY-ESO_Pep-6

EAGATGGRGPRGAGA

SEQ ID NO: 203

NY-ESO_Pep-7

RGPRGAGAARASGPG

SEQ ID NO: 204

NY-ESO_Pep-8

AARASGPGGGAPRGP

SEQ ID NO: 205

NY-ESO_Pep-9

GGGAPRGPHGGAASG

SEQ ID NO: 206

NY-ESO_Pep-10

PHGGAASGLNGCCRC

SEQ ID NO: 207

NY-ESO_Pep-11

GLNGCCRCGARGPES

SEQ ID NO: 208

NY-ESO_Pep-12

CGARGPESRLLEFYL

SEQ ID NO: 209

NY-ESO_Pep-13

RGPESRLLEFYLAMP

SEQ ID NO: 210

NY-ESO_Pep-14

SRLLEFYLAMPFATP

SEQ ID NO: 211

NY-ESO_Pep-15

LAMPFATPMEAELAR

SEQ ID NO: 212

NY-ESO_Pep-16

PMEAELARRSLAQDA

SEQ ID NO: 213

NY-ESO_Pep-17

RRSLAQDAPPLPVPG

SEQ ID NO: 214

NY-ESO_Pep-18

DAPPLPVPGVLLKEF

SEQ ID NO: 215

NY-ESO_Pep-19

APPLPVPGVLLKEFT

SEQ ID NO: 216

NY-ESO_Pep-20

GVLLKEFTVSGNILT

SEQ ID NO: 217

NY-ESO_Pep-21

TVSGNILTIRLTAAD

SEQ ID NO: 218

NY-ESO_Pep-22

TIRLTAADHRQLQLS

SEQ ID NO: 219

NY-ESO_Pep-23

DHRQLQLSISSCLQQ

SEQ ID NO: 220

NY-ESO_Pep-24

SISSCLQQLSLLMWI

SEQ ID NO: 221

NY-ESO_Pep-25

QLSLLMWITQCFLPV

SEQ ID NO: 222

NY-ESO_Pep-26

ITQCFLPVFLAQPPS

SEQ ID NO: 223

NY-ESO_Pep-27

VFLAQPPSGQRR

SEQ ID NO: 224

NY-ESO_Pep-28

RGPESRLL

SEQ ID NO: 225

B-pepM2

REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD

SEQ ID NO: 226

B-pepM7

SSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYM

SEQ ID NO: 227

B-pepM36

KNILAVSFAPLVQLSKNDNGTPDSVGL

SEQ ID NO: 228

B-pepM78

PAADRWEPRAPMRAPRVLHAMLGAAGR

SEQ ID NO: 229

B-pepM79

VLSADLVHYLRLSLEYLRAWHSEDVSL

SEQ ID NO: 230

B-pepM82

LEAVLRYLETHPRLPKPDPVKSSSSVL

SEQ ID NO: 231

B-pepM83

LKDFFFSRGRFSSALKRTLILSSGFRL

SEQ ID NO: 232

B-pepM84

AGKDHKIKQWDADTFEHIQTLEGHHQE

SEQ ID NO: 233

B-pepM85

PATIEMAIETLQKFDGLSTHRSSLLNS

SEQ ID NO: 234

B-pepM86

YLPGGGAGHLDQNVFLRVRALCYVISG

SEQ ID NO: 235

VB4119 아미노산 180-188

SVYDFFVWL

SEQ ID NO: 236

B-pepM108

YISDHMKVHSPSPCL

SEQ ID NO: 237

B-pepM115-M122

EGWQTCWGRSRKHWGSTWNGSARLSPGSTLWVMRICLRSLGIARTWLSCRSTSRKCSPAFPASS

SEQ ID NO: 238

B-pepM141-M142

LFRLLPSGPKVNDGHRSRRWHSLDLYPHLCSHLDLPKQSQEVIRL

SEQ ID NO: 239

B-pepM108

YISDHMKVHSPSPCL

SEQ ID NO: 240

B-pepM115

EGWQTCWGRSRKHWG

SEQ ID NO: 241

B-pepM116

GRSRKHWGSTWNGSA

SEQ ID NO: 242

B-pepM117

GSTWNGSARLSPGST

SEQ ID NO: 243

B-pepM118

ARLSPGSTLWVMRIC

SEQ ID NO: 244

B-pepM119

TLWVMRICLRSLGIA

SEQ ID NO: 245

B-pepM120

CLRSLGIARTWLSCR

SEQ ID NO: 246

B-pepM121

ARTWLSCRSTSRKCS

SEQ ID NO: 247

B-pepM122

RSTSRKCSPAFPASS

SEQ ID NO: 248

B-pepM141

LFRLLPSGPKVNDGHRSRRWHSLDLYP

SEQ ID NO: 249

B-pepM142

SRRWHSLDLYPHLCSHLDLPKQSQEVIRL

구체예 A:

1. (i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드의 면역학적 유효량; 또는

(ii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 면역학적 유효량, 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질의 면역학적 유효량; 및

약학적으로 허용되는 담체

를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신.

2. 구체예 A1에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 암 고환 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자 및 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유된 융합 항원, 공유된 인트론 보유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이세오좀 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 공유항원인 것인, 백신.

3. 구체예 A1 또는 A2 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 인간 세포 단백질, 좋기로는 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질 또는 분화 항원인 공유 항원인, 백신.

4. 구체예 A1 내지 A3 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 면역원성으로 알려져 있거나 또는 그의 하나 이상의 부분은 면역원성인 것으로 알려져 있거나 또는 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자, 좋기로는 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인, 백신.

5. 구체예 A1 내지 A4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이, 좋기로는 7 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 백신.

6. 구체예 A1 내지 A5 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 초과의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는, 백신.

7. 구체예 A6에 있어서, 여러 환자-존재 공유 항원의 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 좋기로는 여러 환자-존재 공유 항원의 서열의 여러 부분, 더욱 좋기로는 여러 환자-존재 공유 항원의 여러 에피토프를 포함하되, 상기 에피토프는 특정 환자의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예상되거나 면역원성이 있는 것으로 알려진 에피토프인, 백신.

8. 구체예 A1 내지 A7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 전장의 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 서열, 좋기로는 전장의 1 내지 10개의 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 것인 백신.

9. 구체예 A1 내지 A7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 긴 펩티드 서열 형태, 좋기로는 약 28 내지 100개 아미노산의 펩티드 서열 형태의 환자-존재 공유 항원 서열의 1 내지 30개 부분을 포함하는 것인 백신.

10. 구체예 A9에 있어서, 긴 펩티드 서열은 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 복수개의 에피토프를 포함하는 것인 백신.

11. 구체예 A1 내지 A7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 짧은 펩티드 서열/에피토프 형태의 환자-존재 공유 항원 서열 1 내지 50개 부분을 포함하는 것인 백신.

12. 구체예 A11에 있어서, 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 짧은 펩티드 서열/에피토프인 백신.

13. 구체예 A11 내지 A12 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 짧은 펩티드 서열/에피토프는 7 내지 30개, 예컨대 7 내지 10개 또는 13 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인 백신.

14. 구체예 A1 내지 A13 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는, 백신.

15. 구체예 A14에 있어서, 여러 개의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는, 백신.

16. 구체예 A15에 있어서, 상기 환자-특이적 항원 서열, 좋기로는 하나 이상의 환자-특이적 에피토프의 하나 이상의 부분을 포함하는, 백신.

17. 구체예 A16에 있어서, 7 내지 30개 아미노산, 예컨대 7 내지 10개 또는 13 내지 30개 아미노산 길이를 갖는 하나 이상의 환자-특이적 에피토프를 포함하는, 백신.

18. 구체예 A14 내지 A17 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 적어도 10개의 환자-특이적 에피토프, 좋기로는 적어도 15개의 환자-특이적 에피토프, 예컨대 적어도 20개의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.

19. 구체예 A1 내지 A18 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 21 내지 2000개의 아미노산, 좋기로는 약 30개의 아미노산 내지 약 1500개의 아미노산, 더욱 좋기로는 약 50 내지 약 1000개의 아미노산, 예컨대 약 100 내지 약 500개의 아미노산 또는 약 100 내지 약 400개의 아미노산 또는 약 100 내지 약 300개의 아미노산을 포함하는 것인 백신.

20. 구체예 A1 내지 A19 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 링커, 좋기로는 하나 이상의 비면역원성 및/또는 가요성 링커를 포함하는, 백신.

21. 구체예 A20에 있어서, 하나 이상의 링커의 길이는 4 내지 20개 아미노산인, 백신.

22. 구체예 A20 내지 A21 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 링커는 항원 서열를 상호 분리시키는, 백신.

23. 구체예 A1 내지 A22 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 힌지 영역 및 선택적으로 링커를 통해 연결된, 이량체화를 용이하게 하는 또 다른 도메인을 포함하는 것인 백신.

24. 구체예 A23에 있어서, 힌지 영역은 Ig-유래된 것인 백신.

25. 구체예 A23 및 A24 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합, 좋기로는 이황화 가교 형태의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 것인 백신.

26. 구체예 A23 내지 A25 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화를 용이하게 하는 또 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 좋기로는 카르복시말단 C 도메인, 또는 상기 C 도메인 또는 그의 변이체와 실질적으로 동일한 서열인, 백신.

27. 구체예 A26에 있어서, 카르복시말단 C 도메인은 IgG로부터 유래된 것인, 백신.

28. 구체예 A26 및 A37 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛의 면역글로불린 도메인은 좋기로는 비공유 상호작용을 통해, 더욱 좋기로는 소수성 상호작용인 비공유 상호작용을 통해 동종이량체화하는 능력을 갖는 것인 백신.

29. 구체예 A23 내지 A28 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 이량체화 유닛은 CH2 도메인을 포함하지 않는 것인 백신.

30. 구체예 A23 내지 A29 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 상기 제3 링커를 통해 인간 IgG3의 C_H3 도메인에 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4로 이루어진 것인 백신.

31. 구체예 A23 내지 A30 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

32. 구체예 A1 내지 A31 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛 및 이량체화 유닛은 링커, 좋기로는 제한 부위를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것인 백신.

33. 구체예 A1 내지 A32 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적화 유닛은 CCR1, CCR3 및 CCR5로부터 선택된 케모카인 수용체에 대해 친화성을 갖는 것인 백신.

34. 구체예 A1 내지 A33 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 표적화 유닛은 HLA, CD14, CD40 또는 Toll-유사 수용체에 대해 특이성을 갖는 항체 결합 영역, 또는 가용성 CD40 리간드와 같은 리간드, 또는 RANTES 또는 MIP-1a와 같은 케모카인, 또는 플라겔린과 같은 박테리아 항원을 포함하는 것인 백신.

35. 구체예 A1 내지 A33 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 기 표적화 유닛은 MHC 클래스 II 단백질, 좋기로는 항-HLA-DP, 항-HLA-DR 및 안티 팬 HLA 클래스 II로 이루어진 군으로부터 선택된 MHC 클래스 II 단백질에 대해 친화성을 갖는 것인 백신.

36. 구체예 A1 내지 A33 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 백신.

37. 구체예 A1 내지 A36 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩타이드를 추가로 암호화하는 것인 백신.

38. 구체예 A1 내지 A37 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 펩티드 내의 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛의 N-말단에서 C-말단의 순서로 존재하는 것인 백신.

39. 구체예 A1 내지 A38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 최적화된 인간 코돈인 것인 백신.

40. 구체예 A1 내지 A39 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 뉴클레오타이드 서열 또는 RNA 뉴클레오타이드 서열인 것인 백신.

41. 구체예 A1 내지 A40 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드.

42. 구체예 A41에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.

43. 구체예 A1 내지 A40 중 어느 하나의 구체예에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 구체예 A42에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.

44. 구체예 A41에 있어서, 환자에서의 이량체 단백질의 생산을 유도하기 위해 상기 환자에게 투여되도록 제형화된 폴리뉴클레오티드.

45. 구체예 A1 내지 A40 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암화화된 폴리펩티드.

46. 구체예 A45에 따른 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질.

47. 구체예 A46에 있어서, 동종이량체 단백질인 이량체 단백질.

48. 약제로서 사용하기 위한, 구체예 A41에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 구체예 A45에 따른 폴리펩티드 또는 구체예 A46 내지 A47 중 어느 하나에 따른 이량체 단백질.

49. 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 개별화된 치료용 항암 백신은:

(i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 이량체 단백질의 면역학적 유효량; 또는

(ii) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 폴리펩타이드의 면역학적 유효량

을 포함하고, 상기 제조방법은

a) 세포를 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;

b) 세포를 배양하는 단계;

c) 세포로부터 발현된 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 얻은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계

를 포함하는 것인, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

50. 개별화된 치료학적 항암 백신의 제조방법으로서,

상기 개별화된 치료학적 항암 백신은 적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하고, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분, 및 선택적으로 하나 이상의 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하며, 상기 방법은

a. 폴리뉴클레오티드를 준비하는 단계;

b. 선택적으로 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및

c. 단계 a)로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 단계 b)로부터의 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계

를 포함하는 것인, 개별화된 치료학적 항암 백신의 제조방법.

51. 구체예 A49 또는 A50에 있어서, 환자-존재 공유 항원 및 환자-특이적 항원을 동정하는 단계, 환자의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자를 동정하는 단계, 폴리뉴클레오티드를 제조하기 전에 면역원성에 기초하여, 환자-존재 공유 항원 서열, 선택적으로 환자-특이적 항원 서열을 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.

52. 구체예 A1 내지 A40 중 어느 하나의 구체예에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 암을 치료하는 방법.

53. 구체예 A52에 있어서, 백신은 폴리뉴클레오티드를 포함하고 피내 또는 근육내 투여되는 것인 방법.

54. 구체예 A53에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 방법.

55. 구체예 A53에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA인 방법.

56. A52 내지 A55 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 투여는 제트 인젝터로 수행되는 것인 방법.

57. 청구항 A52 내지 A56 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 투여는 전기천공에 의해 보조되는 것인 방법.

구체예 B

1. (i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드의 면역학적 유효량; 또는

(ii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 면역학적 유효량, 또는

(iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질의 면역학적 유효량; 및

약학적으로 허용되는 담체

를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신.

2. 구체예 B1에 있어서, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 더 포함하는 것인 백신.

3. 구체예 B1 또는 B2 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 암 고환 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유된 융합 항원, 공유된 인트론 보유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이세오좀 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 공유항원의 서열인 것인, 백신.

4. 구체예 B1 내지 B3 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 인간 세포 단백질인 공유 항원의 서열인, 백신.

5. 구체예 B4에 있어서, 상기 인간 세포 단백질은 과발현되거나 비정상적으로 발현된 인간 세포 단백질 또는 분화 항원인 백신.

6. 구체예 B1 내지 B5 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 면역원성으로 알려져 있거나 또는 그의 하나 이상의 부분은 면역원성인 것으로 알려져 있거나 또는 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자, 좋기로는 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인, 백신.

5. 구체예 B1 내지 B4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이, 좋기로는 7 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 백신.

6. 구체예 B1 내지 B5 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분은 면역원성인 것으로 공지되어 있거나 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.

7. 구체예 B6에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분은 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.

8. 구체예 B1 내지 B7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 하나 이상의 그의 일부는 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이를 갖는 것인 백신.

9. 구체예 B8에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 하나 이상의 그의 일부는 7 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 것인 백신.

10. 구체예 B1 내지 B9 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 1개 초과의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 백신.

11. 구체예 B10에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 서열을 포함하는 것인 백신.

12. 구체예 B11에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원의 서열의 여러 부분을 포함하는 것인 백신.

13. 구체예 B12에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원의 여러 에피토프를 포함하고, 상기 에피토프는 면역원성인 것으로 알려져 있거나 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.

14. 구체예 B1 내지 B13 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 서열을 전장으로 포함하는 것인 백신.

15. 구체예 B14에 있어서, 항원 유닛은 1 내지 10개의 환자-존재 공유 항원 서열을 전장으로 포함하는 것인 백신.

16. 구체예 B1 내지 B15 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 1 내지 30개 부분을 포함하는 것인 백신.

17. 구체예 B16에 있어서, 상기 1 내지 30개의 부분은 28 내지 100개의 아미노산 길이를 갖는 것인 백신.

18. 구체예 B17에 있어서, 상기 부분은 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 복수개의 에피토프를 포함하는 것인 백신.

19. 구체예 B1 내지 B18 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 에피토프 형태로 1 내지 50개의 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 것인 백신.

20. 구체예 B19에 있어서, 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.

21. 구체예 B19 내지 B20 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 에피토프는 7 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 것인 백신.

22. 구체예 B2 내지 B21 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 백신.

23. 구체예 B22에 있어서, 항원 유닛은 상기 여러 환자-특이적 항원 서열의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 백신.

24. 구체예 B2 내지 B23 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.

25. 구체예 B24에 있어서, 하나 이상의 환자-특이적 에피토프는 7 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 것인 백신.

26. 구체예 B24 내지 B25 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 적어도 5개의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.

27. 구체예 B24 내지 B25 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 적어도 10개의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.

28. 구체예 B24 내지 B25 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 적어도 15개의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.

29. 구체예 B1 내지 B28 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 7 내지 2000개의 아미노산을 포함하는 것인 백신.

30. 구체예 B29에 있어서, 항원 유닛은 30 내지 1500개의 아미노산을 포함하는 것인 백신.

31. 구체예 B29에 있어서, 항원 유닛은 50 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 것인 백신.

32. 구체예 B1 내지 B31 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 링커를 포함하는 것인 백신.

33. 구체예 B32에 있어서, 하나 이상의 링커는 비면역원성 및/또는 가요성 링커인 백신.

34. 구체예 B32 또는 B33 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 링커의 길이는 4 내지 20개 아미노산인 백신.

35. 구체예 B32 내지 B34 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 하나 이상의 링커는 항원 서열을 서로 분리시키는 것인 백신.

36. 구체예 B1 내지 B35 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 힌지 영역을 포함하는 것인 백신.

37. 구체예 B36에 있어서, 힌지 영역은 좋기로는 이황화 가교 형태로 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 것인 백신.

38. 구체예 B36 또는 3B7 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 힌지 영역은 Ig 유래인 백신.

39. 구체예 B36 내지 B38 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인을 추가로 포함하는 것인 백신.

40. 구체예 B39에 있어서, 다른 도메인은 면역글로불린 도메인, 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인인 백신.

41. 구체예 B39 또는 B40 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 다른 도메인은 IgG로부터 유래된, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인 백신.

42. 구체예 B36 내지 B41 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 링커, 좋기로는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 링커를 추가로 포함하는 것인 백신.

43. 구체예 B36 내지 B42 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 링커를 통해 인간 IgG3의 CH3 도메인에 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4를 포함하는 것인 백신.

44. 구체예 B36 내지 B43 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

45. 구체예 B36 내지 B44 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 이량체화 유닛은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237로 이루어진 것인 백신.

46. 구체예 B1 내지 B45 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 항원 유닛 및 이량체화 유닛은 링커, 좋기로는 제한 부위를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것인 백신.

47. 구체예 B1 내지 B46 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적화 유닛은 항원 제시 세포를 표적화하는 것인 백신.

48. 구체예 B47에 있어서, 표적화 유닛은 항원 제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하는 것인 백신.

49. 구체예 B48에 있어서, 표면 분자는 HLA, CD14, CD40, 케모카인 수용체 및 Toll-유사 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.

50. 구체예 B47 내지 B49 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 표적화 유닛은 가용성 CD40 리간드, RANTES, MIP-1α, XCL1, XCL2, 플라겔린, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR, 항-pan HLA 클래스 II 또는 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4 또는 항-TLR-5에 대해 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 것인 백신.

51. 구체예 B50에 있어서, 표적화 유닛은 MIP-1을 포함하거나 이로 이루어진 것인 백신.

52. 구체예 B51에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

53. 구체예 B52에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93에 대해 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인 백신.

54. 구체예 B53에 있어서, 표적화 유닛은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93으로 이루어진 것인 백신.

55. 구체예 B1 내지 B54 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 백신은 폴리뉴클레오티드, 좋기로는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 백신.

56. 구체예 B55에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 최적화된 인간 코돈인 것인 백신.

57. 구체예 B55 또는 B56 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 백신.

58. 구체예 B57에 있어서, 신호 펩타이드는 Ig VH 신호 펩티드, 인간 TPA 신호 펩티드 및 인간 MIP1-α 신호 펩티드로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 백신.

59. 구체예 B57 내지 B58 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

60. 구체예 B59에 있어서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인 백신.

61. 구체예 B60에 있어서, 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23으로 이루어진 것인 백신.

62. 구체예 B1 내지 B61 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드에서 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛의 N-말단에서 C-말단의 순서로 존재하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드에서 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛의 5'에서 3' 순서로 존재하는 것인 백신.

63. 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, PBS, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.

64. 구체예 B1의 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 방법은:

a) 환자의 종양 조직 또는 체액에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원을 동정하는 단계;

b) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자를 결정하는 단계;

c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계;

d) 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계;

e) 단계 d)에서 선택된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 단계;

f) 표적화 유닛 및 이량체화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 단계; 및

g) 단계 f)에서 수득된 발현 벡터를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

65. 구체예 B2의 개별화된 항암 백신을 제조하기 위일 구체예 B64에 있어서, 상기 방법은 추가로:

단계 a)에서 환자의 종양 조직에서 하나 이상의 환자-특이적 항원을 동정하는 단계

단계 c)에서 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계

단계 d)에서 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계;

를 더 포함하고, 여기서 단계 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단계 d)에서 선택된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 이의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 것인, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

66. 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나의 구체예서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드.

67. 구체예 B66에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.

68. 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 구체예 B67에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.

69. 구체예 B66에 있어서, 환자에서 이량체 단백질의 생산을 유도하기 위해 상기 환자에게 투여되도록 제형화된 폴리뉴클레오티드.

70. 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩타이드.

71. 구체예 B70에 정의된 바와 같은 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질.

72. 구체예 B71에 있어서 동종이량체 단백질인 이량체 단백질.

73. 의약으로서 사용하기 위한, 구체예 B66에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 구체예 B70에 따른 폴리펩티드 또는 구체예 B71 또는 B72 중 어느 하나의 구체예에 따른 이량체성 단백질.

74. 구체예 B1 내지 B54 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 이량체 단백질의 면역학적 유효량 또는 구체예 B1 내지 B54 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리펩티드의 면역학적 유효량을 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 방법은:

a) 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나의 구체예에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시키는 단계;

b) 세포를 배양하는 단계;

c) 세포로부터 발현된 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계, 및

d) 단계 c)에서 얻은 이량체 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계

를 포함하는 것인, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

75. 구체예 B1 내지 B62 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 방법은:

a) 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;

b) 선택적으로 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계 및

c) 단계 a)로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 단계 b)로부터의 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계

를 포함하는 것인, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

76. 환자를 위해 특이적으로 제조된 구체예 B1 내지 B63 중 어느 하나의 구체예에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.

77. 구체예 B76에 있어서, 백신은 폴리뉴클레오티드를 포함하고 피내 또는 근육내 투여되는 것인 방법.

78. 구체예 B77에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA인 방법.

79. 구체예 B78에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA인 방법.

80. 구체예 B76 내지 B79 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 투여는 제트 인젝터로 수행되는 방법.

81. 구체예 B76 내지 B80 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 투여는 전기천공에 의해 보조되는 방법.

82. 구체예 B1 내지 B63 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 환자의 암을 치료하는 방법에 사용되기 위한 백신으로서, 상기 백신은 환자를 위해 특이적으로 제조된 것인 백신.

83. 환자에서 암 치료용 약제의 제조를 위한, 구체예 B66에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 구체예 7B0에 따른 폴리펩티드 또는 구체예 B71 또는 B72 중 어느 하나의 구체예에 따른 이량체성 단백질의 용도로서, 여기서 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이량체 단백질은 환자를 위해 특이적으로 제조된 것인, 용도.??

84. 구체예 B66의 폴리뉴클레오타이드의 제조방법으로서, 상기 방법은:

a) 환자의 종양 조직 또는 체액에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원을 동정하는 단계;

b) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자를 결정하는 단계;

c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계;

d) 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계;

e) 단계 d)에서 선택된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 단계; 및

f) 표적화 유닛 및 이량체화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 단계

를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.

85. 구체예 B84에 있어서, 상기 방법은 추가로:

단계 a)에서 환자의 종양 조직에서 하나 이상의 환자-특이적 항원을 동정하는 단계

단계 c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 이의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계

단계 d)에서 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계

를 더 포함하고, 여기서 단계 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단계 d)에서 선택된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 이의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.

SEQUENCE LISTING <110> Vaccibody AS <120> Individualized therapeutic anticancer vaccine <130> P5629PC00 <160> 249 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Assembly of protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(242) <223> vaccibody sequence <400> 2 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala 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Claims (44)

1. (i) 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 상기 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 폴리뉴클레오타이드의 면역학적 유효량; 또는
   (ii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 면역학적 유효량, 또는
   (iii) (i)에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질의 면역학적 유효량; 및
   약학적으로 허용되는 담체
   를 포함하는 개별화된 치료용 항암 백신.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 더 포함하는 것인 백신.
3. 청구항 1 또는 2 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 과발현된 세포 단백질, 비정상적으로 발현된 세포 단백질, 암 고환 항원, 바이러스 항원, 분화 항원, 돌연변이된 종양유전자, 돌연변이된 종양 억제 유전자, 종양태아 항원, 공유된 융합 항원, 공유된 인트론 보유 항원, 암흑 물질 항원 및 스플라이세오좀 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이로 인한 공유 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 공유항원의 서열인 것인, 백신.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 인간 세포 단백질인 공유 항원의 서열인, 백신.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나의 구체예에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열은 면역원성으로 알려져 있거나 또는 그의 하나 이상의 부분은 면역원성인 것으로 알려져 있거나 또는 환자의 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 대립유전자, 좋기로는 환자의 HLA 클래스 I 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인, 백신.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열 또는 하나 이상의 그의 일부는 환자의 HLA 대립유전자에 의한 제시에 적합한 길이, 좋기로는 7 내지 30개의 아미노산의 길이를 갖는 것인 백신.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 서열을 포함하는 것인 백신.
8. 청구항 7에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원의 서열의 여러 부분을 포함하는 것인 백신.
9. 청구항 8에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-존재 공유 항원의 여러 에피토프를 포함하고, 상기 에피토프는 면역원성인 것으로 알려져 있거나 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-존재 공유 항원 서열을 전장으로 포함하는 것인 백신.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원 서열의 1 내지 30개 부분을 포함하는 것인 백신.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 부분은 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 복수개의 에피토프를 포함하는 것인 백신.
13. 청구항 1 내지 12 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 에피토프 형태로 1 내지 50개의 환자-존재 공유 항원 서열을 포함하는 것인 백신.
14. 청구항 13에 있어서, 에피토프는 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 것인 백신.
15. 청구항 13 내지 14 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 에피토프는 7 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 것인 백신.
16. 청구항 2 내지 15 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 여러 환자-특이적 항원 서열 또는 그의 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 백신.
17. 청구항 2 내지 16 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.
18. 청구항 17에 있어서, 하나 이상의 환자-특이적 에피토프는 7 내지 30개의 아미노산 길이를 갖는 것인 백신.
19. 청구항 17 내지 18 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 적어도 5개의 환자-특이적 에피토프를 포함하는 것인 백신.
20. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 7 내지 2000개의 아미노산을 포함하는 것인 백신.
21. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛은 하나 이상의 링커, 좋기로는 항원 서열을 서로 분리시키는 하나 이상의 링커를 포함하는 것인 백신.
22. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 이량체화 유닛은 힌지 영역, 좋기로는 Ig 유래의 힌지 영역을 포함하는 것인 백신.
23. 청구항 22에 있어서, 이량체화 유닛은 이량체화를 촉진하는 또 다른 도메인, 좋기로는 면역글로불린 도메인, 및 더욱 좋기로는 면역글로불린 불변 도메인을 더 포함하는 것인 백신.
24. 청구항 22 또는 23 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 다른 도메인은 IgG로부터 유래된, 좋기로는 IgG3으로부터 유래된 카르복시말단 C 도메인인 백신.
25. 청구항 22 내지 24 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 이량체화 유닛은 링커, 좋기로는 힌지 영역과 이량체화를 촉진하는 다른 도메인을 연결하는 링커를 추가로 포함하는 것인 백신.
26. 청구항 22 내지 25 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 이량체화 유닛은 링커를 통해 인간 IgG3의 CH3 도메인에 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4를 포함하는 것인 백신.
27. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 항원 유닛 및 이량체화 유닛은 링커, 좋기로는 제한 부위를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것인 백신
28. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 표적화 유닛은 항원 제시 세포를 표적화하고, 좋기로는 여기서 표적화 유닛은 항원 제시 세포 상의 표면 분자와 상호작용하는 모이어티이거나 이를 포함하고 좋기로는, 표면 분자는 HLA, CD14, CD40, 케모카인 수용체 및 Toll-유사 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
29. 청구항 28에 있어서, 표적화 유닛은 가용성 CD40 리간드, RANTES, MIP-1α, XCL1, XCL2, 플라겔린, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR, 항-pan HLA 클래스 II 또는 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4 또는 항-TLR-5에 대해 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 포함하거나 이로 이루어지고, 좋기로는 MIP-1α를 포함하거나 이로 이루어진 것인 백신.
30. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 백신은 폴리뉴클레오티드, 좋기로는 RNA 또는 DNA를 포함하는 것인 백신.
31. 청구항 30에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 백신.
32. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 폴리펩티드에서 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛의 N-말단에서 C-말단의 순서로 존재하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드에서 상기 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛은 표적화 유닛, 이량체화 유닛 및 항원 유닛의 5'에서 3' 순서로 존재하는 것인 백신.
33. 선행하는 청구항들 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 완충 식염수, PBS, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
34. 청구항 1의 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법으로서, 상기 방법은:
    a) 환자의 종양 조직 또는 체액에서 적어도 하나의 환자-존재 공유 항원을 동정하는 단계;
    b) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자를 결정하는 단계;
    c) 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계;
    d) 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계;
    e) 단계 d)에서 선택된 적어도 하나의 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항원 유닛을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 단계;
    f) 표적화 유닛 및 이량체화 유닛을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 단계; 및
    g) 단계 f)에서 수득된 발현 벡터를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계
    를 포함하는, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.
35. 청구항 2의 개별화된 항암 백신을 제조하기 위한 청구항 34에 있어서, 상기 방법은 추가로:
    단계 a)에서 환자의 종양 조직에서 하나 이상의 환자-특이적 항원을 동정하는 단계
    단계 c)에서 환자의 HLA 클래스 I 및/또는 II 대립유전자에 대한 예측된 결합에 의해, 동정된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분의 면역원성을 예측하는 단계
    단계 d)에서 단계 c)에서 예측된 면역원성에 기초하여 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 그의 하나 이상의 부분을 선택하는 단계;
    를 더 포함하고, 여기서 단계 e)의 폴리뉴클레오타이드 서열은 단계 d)에서 선택된 하나 이상의 환자-특이적 항원 또는 이의 하나 이상의 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 것인, 개별화된 치료용 항암 백신의 제조방법.
36. 청구항 1 내지 32 중 어느 하나의 청구항서 정의된 폴리뉴클레오타이드.
37. 청구항 36에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
38. 청구항 1 내지 32 중 어느 하나의 청구항에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 청구항 37에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
39. 청구항 1 내지 32 중 어느 하나의 청구항에 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
40. 청구항 39에 정의된 2개의 폴리펩티드로 이루어진 이량체 단백질.
41. 청구항 40에 있어서 동종이량체 단백질인 이량체 단백질.
42. 의약으로서 사용하기 위한, 청구항 36에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 39에 따른 폴리펩티드 또는 청구항 40 또는 41 중 어느 하나의 청구항에 따른 이량체성 단백질.
43. 암 환자의 치료방법으로서, 상기 방법은 환자를 위해 특이적으로 제조된, 청구항 1 내지 33 중 어느 하나의 청구항에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
44. 청구항 43에 있어서, 백신은 폴리뉴클레오티드를 포함하고 피내 또는 근육내 투여되는 것인 방법.

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