CN1233187A - HIVp－17肽片段、含有该片段的组合物及其制造和使用方法 - Google Patents

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Abstract

来自分化单位C的HIV－1的pl7 gag蛋白的约30至50个氨基酸的肽片段,包括从位置75延伸至位置129的区域,能诱导识别其它亚型包括分化单位A分化单位B、分化单位E及非共延伸但翼盖p17 gag蛋白部分的肽的抗体。DNA序列能用来编码目标肽。本发明的分化单位C肽的一个例子是具有取自右面序列部分或全体的约30至约32个连续氨基酸的肽,其中位置 4的 Xaa是 Tyr;位置 5的 Xaa是 Cys或 Ser;位置8的 Xaa是Lys、Glu或Ala;位置9的Xaa是Gly、 Lys、AsP、Glu或Arg;位置 11的 Xaa是 Glu;位置 12的 Xaa是 Val;位置 13的 Xaa是 Arg;位置21的Xaa是Lys;位置22的Xaa是Ile;位置23的Xaa是Glu或Lys;位置29的Xaa是Ile、Ser或Cys;位置33的Xaa是一个直接的键;位置34的Xaa是一个直接的键。

Description

HIV p-17肽片段、含有该片段 的组合物及其制造和使用方法
发明背景
(1)发明领域
本发明涉及人免疫缺陷病毒(HIV)p-17gag蛋白的特定肽片段、含有该片段的组合物、及其治疗用途包括疫苗和诊断用途、编码该片段的DNA、制造和使用该片段及编码该片段的DNA的方法。
更具体地说，本发明涉及含有p-17gag蛋白的约30至50氨基酸(即根据特定的株，延伸包括了位置75至129的氨基酸，这些氨基酸对应于共同序列C分化单位(亚型))的肽片段和编码该区域的DNA片段。
(2)现有技术的讨论
在过去几年，人们已经进行了广泛的研究，首先是确定爱滋病的原因，接着在确定了通常被称为HIV的逆转录病毒是病原有机体后，人们的努力集中在有关遗传组成、分子生物学、病理学、生物化学、发展高灵敏度的病毒检测方法以及抗体和治疗方法的详细分析上，虽然在以上所有领域都有了长足的进展，但仍需要做很多工作来有效地防止爱滋病的扩散。前不久使用蛋白酶抑制剂的组合疗法作为治疗方法已取得了显著的进步，但它仍然是十分昂贵，而且并不总是有效。因此，控制高感染性的HIV病毒扩散和在已感染个体中治疗疾病的基本方法仍然是发展能够刺激免疫系统的合适组分的有效疫苗和免疫治疗试剂。基于表位识别的保护性抗体的鉴定能够为显示和/或诊断爱滋病或前爱滋病提供一种更为有效的机制，而血清阳性个体的这种显示和早期诊断就可接种疫苗来为治疗血清阳性个体提供合适的保护性免疫应答。
美国专利4,983,387中介绍了一种抗原肽，该肽至少从HIV-1的p17gag蛋白的约92位置延伸至109位置，其中特别是介绍了一个三十肽通式：Tyr Ser Val His Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Asp ThrLys Glu Ala Leu Glu Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys LysLys Ala(SEQ ID NO:3)，这个三十肽在以下称为HGP-30，该肽在某些临床实验中和在SCID小鼠中进行的体内HIV免疫攻击研究中，在作为对抗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原有机体HIV的治疗试剂时，能显示阳性结果。一般来说，HGP-30以及p-17的一个优点是，这种HIV蛋白在HIV的亚型和毒株之间比诸如被膜蛋白显得更为保守。事实上，已经发现，接种个体中抗HGP-30的抗体，在用并不是由HGP-30序列代表的毒株多肽序列试验时，也能识别。
改变多肽的本质，例如增加或删除或替换一个或几个氨基酸，像在不同亚型中发生的一样，是否能够或将会影响由此产生的识别该表位的抗体亚类，作出这种预测是困难的，即使已经知道这样的操作能够诱导不同的应答，例如B和T细胞的刺激、细胞毒和淋巴增殖应答。而且，抗来自一种特定毒株或亚型的肽片段的抗体与抗其它毒株或亚型的相应肽区域的抗体相比，通常显示不同的免疫原性。
令人惊奇的是，现在已有如下发现，这也是本发明的基础：与HGP-30相应但衍生自共有序列C分化单位的肽能够显示比HGP-30更强和更广泛的免疫应答，具体地说，对共有序列C产生的抗体与针对HGP-30的抗体相比，能够识别来自不同亚型和毒株的HIV的肽，并能提供高滴度。
相应地，本发明提供一种新型肽，该肽可用作检测HIV有机体的诊断辅助手段，和/或用作治疗爱滋病或阻止爱滋病形成的预防或治疗性试剂。该肽具有一个T细胞表位并优选还含有一个B细胞表位，这些表位具有被HIV不同亚型和毒株产生的抗体识别的能力。
发明简述
因此，本发明在一个方面提供含有取自如下序列的一个部分或该序列全部的约30至约50连续氨基酸的肽：1               5                   10Xaa Ser Leu Xaa Asn Thr Val Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Val His15                  20                   25Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa
30                   35                  40Xaa Xaa Glu Glu Gln Asn Lys Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr
    45                   50                  55Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Xaa Gly Xaa Val Ser Gln (SEQ ID NO:1)
其中位置1的Xaa是Arg、Lys或Ile；
位置4的Xaa是Tyr、Phe或His；
位置8的Xaa是Ala或Val；
位置9的Xaa是Thr或Val；
位置11的Xaa是Tyr或Trp；
位置12的Xaa是Cys或Ser；
位置15的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置16的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置18的Xaa是Glu或Thr；
位置19的Xaa是Val或Ile；
位置20的Xaa是Arg或Gln；
位置28的Xaa是Lys、Arg或Glu；
位置29的Xaa是Ile或Leu；
位置30的Xaa是Glu或Lys
位置36的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置40的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置41的Xaa是Lys或一个直接的键；
位置43的Xaa是Gln或一个直接的键；
位置44的Xaa是Gln、Lys或一个直接的键；
位置45的Xaa是Ala或一个直接的键；
位置46的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置47的Xaa是Thr、Ala或Glu；
位置50的Xaa是Lys、Asn或一个直接的键；
位置52的Xaa是Lys或Gln。
在一个具体的优选实施方案中，抗原多肽具有SEQ ID NO:2的序列。
本发明还提供包含具有通式(Ⅰ):C*-X-P*的肽-载体结构的免疫活性肽。
其中C*代表一种免疫载体物质
P*代表具有SEQ ID NO:1的肽
X代表连接免疫载体物质C*和肽P*的直接键或共价键。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，该组合物在给药于有需要的病人时，能有效地诱导TH1免疫应答，该组合物含有前述通式C*-X-P*的免疫活性肽和一种免疫应答佐剂。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，该组合物含有有效药学剂量的SEQ ID NO:1的肽和可药用载剂。
在一个具体的方面，本发明提供含有编码SEQ ID NO:1肽的核酸序列的分离核酸分子。
在本发明此方面的优选实施方案中，分离核酸分子含有具有SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQID NO:23的核酸序列。
本发明还提供一种重组表达载体，该载体至少含有一个编码SEQ IDNO:1肽的核酸序列。表达载体可以是真核表达载体或原核表达载体。
在另一个方面，本发明还提供含有上述重组载体的宿主细胞。
附图简述
图1是B分化单位免疫的动物对各种肽的ELISA试验的图示。
图2是C分化单位免疫的动物对各种肽的ELISA试验的图示。
图3是E分化单位免疫的动物对各种肽的ELISA试验的图示。
发明详述和优选实施方案
由有潜力的HIV疫苗诱导的抗体或T细胞识别其它亚型(也称为分化单位)的HIV-1的能力直至今天仍是一个难题。例如，使用被膜序列的疫苗诱导的抗体仅仅能识别密切相近的毒株，部分原因是因为被膜蛋白的高度多形性。因此，在毒株和分化单位之间具有较高保守性的gag蛋白特别是p-17作为在世界范围内使用的疫苗抗原和诊断工具，将是十分有用的。
最近的研究表明，HGP-30能同时诱导细胞和体液免疫应答，虽然在亚型和分化单位之间氨基酸序列能见到一些变异，但在相当于HGP-30的p17区域所见到的变异明显少于在被膜序列中见到的变异(10-30％对约50％)。在下面将要介绍的试验中，HGP-30的明矾佐剂制剂诱导的抗血清能识别来自B和C亚型的HIV，并能在低一些的程度上识别来自亚型E的HIV-1，其它的佐剂甚至能产生更好的种间识别。
令人非常惊奇的是，现已发现，在进行相似的试验但使用来自共有序列C的HGP-30同系物的抗血清时，能够获得对HIV亚型的所有类型和族的非常强的识别。
附带地说，“相当于”和“类似物”及类似的词汇，在指来自不同毒株或亚型的肽片段或与之连用时，是用来指这样的肽片段序列，当含有肽片段的蛋白株的相应氨基酸序列比较时，按照本领域熟知的技术，能够最大程度地适合。
下面的试验用于按以下说明确定抗p17的抗血清对HGP-30(SEQ IDNO:3)或对来自分化单位C(SEQ ID NO:5)、分化单位B(SEQ ID NO:4)、分化单位E(SEQ ID NO:6)的相应共有序列的同源30聚体肽、或对修饰的HGP-30(SEQ ID NO:7)、或对一个对照肽的免疫反应性。
具体地说，为证明在人免疫缺陷病毒(HIV)的不同毒株和亚型(分化单位)之间有交叉反应性，进行以下试验。
A肽合成
在这些试验中使用的肽由Quality Controlled Biochemicals Inc(QCB)(Hopkinton，MA)使用固相FMOC程序合成，并且前8个残基使用双偶联程序。肽一般用羧基端作为酰胺类型进行制备。所有的肽都在QCB用制备HPLC纯化，并用分析HPLC和质谱仪进行分析，肽按HPLC标准纯度大于95％，一般大于98％，而抽样与预期值之间相差在两个原子质量单位之内。从QCB获得的干肽与干燥剂一起在-20℃贮存在玻璃小瓶中。肽                    肽序列(位置85-115)分化单位B         Y C V H Q K I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K(泰国B)   S K K K A(SEQ ID NO:4)C         Y C V H K G I E V R D T K E A L D K I E E E Q N K(乌干达C) I Q Q K T(SEQ ID NO:5)E         W C V H Q R I E V K D T K E A L D K I E E V Q N K(泰国E)   S Q Q K T(SEQ ID NO:6)HGP-30    Y S V H Q R I D V K D T K E A L E K I E E E Q N K
      S K K K A(SEQ ID NO:3)
(注：泰国A共有序列与泰国E共有序列在至少包括位置85至114氨基酸的p17的该区域一致)。
对于上面和下面公开的肽和这里介绍的实验中所用的肽，其氨基酸序列用下面的单个表示字母符号列出：
氨基酸         三字母符号  单字母缩写
丙氨酸            Ala          A
精氨酸            Arg          R
天冬酰胺          Asn          N
天冬氨酸          Asp          D
半胱氨酸          Cys          C
谷氨酰胺          Gln          Q
谷氨酸            Glu          E
甘氨酸            Gly          G
组氨酸            His          H
异亮氨酸          Ile          I
亮氨酸            Leu          L
赖氨酸            Lys          K
甲硫氨酸          Met          M
苯丙氨酸          Phe          F
脯氨酸            Pro          P
丝氨酸            Ser          S
苏氨酸            Thr          T
色氨酸            Trp          W
酪氨酸            Tyr          Y
缬氨酸            Val          V
B接合物的制备
用戊二醛接合法将匙孔血蓝蛋白(KLH)(例如来自Pierce,Rockford,IL)接合至肽抗原上(Naylor等，1987《美国科学院院报》84卷，2951-5页)。
将接合的KLH-肽溶于磷酸缓冲盐(PBS)中，用BCA蛋白分析法对肽进行分析，并将其调为200-400ug/ml总肽，等份贮存于4℃，以备与佐剂一起使用。
C免疫、抗血清收集和加工
按如下方案对10-16周龄BALB/c雌性小鼠(Taconic FarmsGermantown,NY)组(每组5-10只)进行免疫和采血检测，在第0天、14天免疫小鼠，在第28天和第42天采血检测。
抗原用明矾(Pierce Rockford,Ill)佐剂按照厂商指示进行制备。接种量为含25ug的肽(KLH接合物)。
小鼠用MetofaneTM(Pitman-Moore,Mundelein,IL)麻醉进行眼窝放血和耳朵标记，在特定的日期从单个小鼠采集血样，并加工以收集抗血清，并冻存以备ELISA分析。
D ELISA试验
血清用Zimmerman等1996，《疫苗研究》5卷，103页介绍的间接ELISA检测抗体的存在，在一个ELISA程序中检测样品中与HGP-30(SEQ ID NO:3)、分化单位B(SEQ ID NO:4)、分化单位E(SEQ ID NO:6)、分化单位C(SEQ ID NO:5)或修饰的分化单位B HGP-30(A T L Y S V H QR I D V K D T K E A L E K I E E E Q N K S)(SEQ ID NO:7)(按照上面的介绍制备)特异性结合的抗体的存在。对照肽A来自HIV被膜gp120 V3ⅢB环肽303-313(见Palker等，1988，《美国科学院院报》85卷，1932-36)。所有的肽都以1ug/ml的浓度包被。
所获结果示于下表C和D，由此数据可明显看出，由HGP-30诱导产生的抗体识别不同亚型(分化单位)的肽。
表C
用HGP-30-KLH和明矾佐剂在第0和1天免疫，在第28天收集的抗-HGP-30抗血清(1∶200稀释)对代表不同HIV分化单位的肽的免疫反应性
                                               包被肽
HGP-30 分化单位B 分化单位E 分化单位C 对照
小鼠#
    854     0.950     0.927     0.135    0.840     0.069
    855     0.396     0.308     0.083    0.724     0.057
    856     0.940     0.894     0.220    0.949     0.066
    857     0.780     0.642     0.146    0.820     0.065
    858     0.686     0.612     0.200    0.804     0.059
    859     0.724     0.617     0.303    0.854     0.073
    860     0.832     0.801     0.159    0.905     0.077
    组标准差     0.134     0.161     0.054    0.052     0.005
    组均值     0.758     0.686     0.178    0.842     0.066
表D
用HGP-30-KLH免疫后在顺序时间收集的抗-HGP-30抗血清(1∶200稀释)对代表不同HIV分化单位的免疫反应性
                                           应答者数量
测试小鼠的数量(免疫) 血液检测时间(天)  分化单位B 分化单位E 分化单位C HGP-30
    7     14  3(43％) 1(14％) 6(85％) 5(71％)
    7     28  7(10％) 3(43％) 7(100％) 7(100％)
    6     42  6(100％) 4(67％) 6(100％) 6(100％)
*反应性定义为在1/200稀释时，信号至少比背景(对照)高2倍，并≥0.2。
为进一步证明不同HIV毒株之间的交叉反应，进行以下的额外试验。
使用与上面介绍的相同程序，但所用的KLH是获自biosynArzneimittel GmbH,Fellbach,Germany的Immacothel。将KLH-肽接合物溶于PBS，并调至含有1至5mg/ml总肽，贮存于4℃。用上面介绍的与KLH按上述方法接合的分化单位B、分化单位C和分化单位E，以明矶作为佐剂进行免疫以产生抗体，用1/200稀释的样品进行ELISA试验，来检测每种抗原肽以及修饰的HGP-30(mHGP-30)(SEQ ID NO:7)的交叉反应。结果用条图示于图1、图2和图3，分别表示B分化单位免疫小鼠、C分化单位免疫小鼠和E分化单位免疫小鼠。在每个场合，都取得不同同种型的结果，并显示IgG1和IgG2a。
如前面获自HGP-30的抗血清一样，针对这些不同分化单位的抗血清可识别来自不同亚型的各种抗原肽，并且在用修饰HGP-30的场合识别HIV的不同部分。
但是，非常奇怪，在将图2的结果与图1和图3的结果相比较时，可以发现，C分化单位肽免疫的小鼠显示非常强的免疫应答。
基于上述试验结果，很明显，似乎在非洲和印度特别占优势的C分化单位共有序列很可能可以为对付HIV的武器库提供一个广泛使用治疗性或预防性试剂，以及提供一种能在世界范围内使用的、诊断试验中使用的有力诊断工具。因此，包含开始于HIV-1的p17gag蛋白的共有序列C分化单位的75至85范围内的氨基酸残基、终止于114至128范围内的氨基酸残基的序列、并含有至少约30和高至约50氨基酸序列的任何抗原性多肽，都可在一种疫苗中用作免疫原；或在目标为诱导免疫或降低爱滋病相关的病毒血症的疫苗中产生有用的抗体或抗独特型抗体和/或针对病毒或病毒感染细胞的免疫细胞应答；或用作一种检测HIV病毒的诊断试验或分析试剂盒的一种组分。
根据本发明的肽来自HIV-1的p17gag肽的共有序列C序列，并含有取自下列SEQ ID NO:1序列的一部分或全体的约30至约50连续氨基酸序列：1               5                   10Xaa Ser Leu Xaa Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His15                  20                   25Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa
30                   35                  40Xaa Xaa Glu Glu Gln Asn Lys Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr
     45                  50                  55Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Xaa Gly Xaa Val Ser Gln
其中位置1的Xaa是Arg、Lys或Ile；
位置4的Xaa是Tyr、Phe或His；
位置8的Xaa是Ala或Val；
位置9的Xaa是Thr或Val；
位置11的Xaa是Tyr或Trp；
位置12的Xaa是Cys或Ser；
位置15的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置16的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置18的Xaa是Glu或Thr；
位置19的Xaa是Val或Ile；
位置20的Xaa是Arg或Gln；
位置28的Xaa是Lys、Arg或Glu；
位置29的Xaa是Ile或Leu；
位置30的Xaa是Glu或Lys
位置36的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置40的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置41的Xaa是Lys或一个直接的键；
位置43的Xaa是Gln或一个直接的键；
位置44的Xaa是Gln、Lys或一个直接的键；
位置45的Xaa是Ala或Glu；
位置46的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置47的Xaa是Thr、Ala或Glu；
位置50的Xaa是Lys、Asn或一个直接的键；
位置52的Xaa是Lys或Gln。
优选地，本发明的肽含有相当于如下序列的约30至约33连续氨基酸，1                5                   10Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp15                  20                  25Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa Xaa Xaa Glu Glu Gln ASn Lys
30                  35Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr
其中位置8的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置9的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置11的Xaa是Glu或Thr；
位置12的Xaa是Val或Ile；
位置13的Xaa是Arg或Gln；
位置21的Xaa是Lys、Arg或Glu；
位置22的Xaa是Ile或Leu；
位置23的Xaa是Glu或Lys
位置29的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置33的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置34的Xaa是Lys或一个直接的键(SEQ ID NO:2)。
更优选的是含有SEQ ID NO:2并含有30-32个氨基酸的肽，其中序列中的第一个氨基酸开始于位置1至4的氨基酸，尤其是位置1或2，并且其中
位置11的Xaa是Glu；
位置12的Xaa是Val；
位置13的Xaa是Arg；
位置21的Xaa是Lys；
位置22的Xaa是lle；
位置33的Xaa是一个直接的键；
位置34的Xaa是一个直接的键。
HIV-1的p17的七个特殊共有序列C毒株的始于位置75(共有序列C的编号)或位置76(HIV UG268的编号)直至位置125至129的合适C分化单位肽片段的特殊例子示于下表1，表1和表2中报道的序列取自报告《人逆转录病毒和AIDS,1994，核酸和氨基酸序列汇编及分析》，G Myers等编辑，理论生物学和生物物理，编组T-10,Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，New Mexico。
                                        表1共有序列C    r S L ? N t V a t L y C V H ? ? I e v r D T K E A L D k i e E E Q N K ?HIVUG268     - - - Y - - - - - - - - - - K G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - IHIVSM145     - - - F - - - - - - - - - - E K - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SHIVZAM18     K - - F - - - V - - W - - - E D - T - - - - - - - - - R L - - - - - - SHIVZAM19     K - - H - A - - V - - - - - K X - T - - - - - - - - - R - - - - - - - CHIVZAM20     - - - Y - - - - - - - - - - A G - - - - - - - - - - - E - - - - - - - CHIVDJ259     - - - Y - - - - - - - - - - A R - - I Q - - - - - - - - - - - - - - - CHIVVI313     I - - H - - - - - - - - - - E K - - I - - - - - - - - - K - - - - - - S
                                      表1-1(续)共有序列C    Q Q K ? ? T q q . . a k ? A D ? G K V S Q    (SEQ ID NO:8)HIVUG268     - - - . . - . . . . . E T - - K - - - - -    (SEQ ID NO:9)HIVSM145     - - - . . - - - . . - - A - - . - - - - -    (SEQ ID NO:10)HIVZAM18     - - - T K - - - . . - - A - - . - - - - -    (SEQ ID NO:11)HIVZAM19     - - - . . - - - . . - - E - - . Q - - - -    (SEQ ID NO:12)HIVZAM20     - - - . . - - - . . - - T - - . - - - - -    (SEQ ID NO:13)HIVDJ259     - - - . . - - K . . - E T - - K - - - - -    (SEQ ID NO:14)HIVVI313     - - - . . - - - . . - A A - - N - - - - -    (SEQ ID NO:15)
在上表1中，小写字母表示特定的共有序列由等位变异、遗传漂变和突变导致的氨基酸变异位点；“？”符号的存在反映共有序列的该位置没有共同认可的氨基酸，“划”(-)代表与共有序列中列出的相同氨基酸；“点”(.)代表该位置缺少氨基酸。
而且，在上表的序列中，特别优选的是始于位置8的Ala或氨基酸位置9的Thr、并向C末端延伸约30个氨基酸的部分片段，因为这些30聚体肽片段包括了CTL以及T和B细胞表位。
如上所述，肽SEQ ID NO:1衍生于HlV-1的p17蛋白的C分化单位亚型，其中SEQ ID NO:1中的第一个氨基酸残基相当于位置75或位置76的氨基酸残基。在这点上，应当指出后一编号是基于分化单位C的毒株HIV UG268的序列，而前者基于共有序列。但是，不仅在gag蛋白的序列中HIV亚型有一些变异，在同一亚型的不同HIV毒株之间氨基酸残基的特殊编号也有差异。因此应当理解是氨基酸自身而不是天然序列的特定编号能够产生在HIV亚型之间观察到的变异，这一点非常重要。
还应当理解，在上述任何氨基酸序列中，不会对所需生物活性产生不利影响的特殊氨基酸变异，例如保守的氨基酸替换，都预期包含在本发明的范围内。特别地，上述序列基于HIV的一个特殊分化单位，即分化单位C，共有序列C中的其它天然发生和自发产生的变异体都包含在本发明的抗原肽范围内。这种天然和自发产生的氨基酸变异特别有希望在本发明中使用。而且，在某些场合，使用肽的混合物更为优越，其中在肽的混合物中，至少一个序列符合上述准则，而另一个或其它的肽相当于HIV的其它天然和自发产生的变异体、HIV的其它亚型和p17gag的其它区域或HIV的其它片段。能与本发明的抗原肽一起使用的这样的其它肽的例子包括，诸如HGP-30、修饰HGP-30、具有以下序列的：来自HIV-1的p24蛋白的片段、被膜蛋白或肽片段如gp120、gp160、gp41等。
本领域中已知道的还有，在使用两种或更多的肽片段的混合物时，不同的肽可直接相互连接或通过一个已经知道的连接基团或间隔子相连，或者连接到一个共同的载体上，等等。而且，两个或更多的相同肽片段可直接相互连接或通过一个共同的载体连接也是众所周知的，这一点也包括在本发明的范围内。
而且，在本领域还认识到，为诸如提供特殊的结合位点或为了对肽进行放射性或荧光标记，进行特殊的氨基酸替换也是有利的。这类“设计的”氨基酸序列也包括在本发明的抗原肽的范围内。
除了不同的HIV毒株之间氨基酸的差异，我们还知道N-末端和C末端的氨基酸可以以游离酸(氨基或羧基基团)的形式存在或它们的盐、酯、醇或酰胺形式存在。特别地是，C末端的酰胺末端基团和N-或C-末端的酰基化如豆蔻酰化等通常是有用的，并且不会影响肽的免疫学特性。与此相似，只要所需的活性能够维持或通过化学衍生的逆反应能够恢复，一个或多个氨基酸由功能侧链基团反应而化学衍生的“化学衍生物”一般也包含在“保守替换”的范围内。
本发明的肽能够用合成蛋白的传统方法进行制备，例如，举例来说，固相肽合成，介绍于Merrifield RB 1963《美国化学协会杂志》85卷，2149-2154。用遗传工程技术生产本发明的新型肽也包含在本发明的范围内并属于本领域的技术。
在本发明中任何一个抗原性分化单位C肽片段都可用来与一种免疫原性载体物质偶联，来生产一种抗原性肽-载体结构，一般来说，常规用于抗原制备的具有高分子量的天然和合成蛋白都可用作免疫原载体物质，但除此之外，小的肽或分子诸如吞噬细胞增强激素(一种四肽)、吞噬细胞增强激素的类似物和胞壁酰二肽及其类似物也可用作“免疫原性载体物质”。在这里“免疫原性载体物质”一词的意思是包括具有在一个宿主动物中独立诱导免疫原应答的特性并能与肽共价偶联的物质，共价偶联可直接通过多肽中游离羧基、氨基或羟基与免疫原载体物质上的相应基团之间形成肽键或酯键，或者通过一种传统的双功能连接基团连接。这种载体的例子包括动物血清的白蛋白例如马血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、羊血清白蛋白等；动物的球蛋白如马血清球蛋白、牛血清球蛋白、兔血清球蛋白、人血清球蛋白、羊血清球蛋白等；动物的甲状腺球蛋白如马甲状腺球蛋白、人甲状腺球蛋白、羊甲状腺球蛋白等；动物的血红蛋白(hemoglobulin)如马血红蛋白、牛血红蛋白、兔血红蛋白、人血红蛋白、羊血红蛋白等；动物的血蓝蛋白如匙孔血蓝蛋白(KLH)等；由蛔虫抽提的蛋白；聚赖氨酸、聚谷氨酸、赖氨酸-谷氨酸共聚物；含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物，等等。最近，已经生产了用白喉类毒素或破伤风类毒素作为免疫原载体物质的疫苗，这些类毒素物质也可在这里使用。此外其它合适的类毒素物质包括霍乱、PPD、百日咳等。其它的合适载体公开于诸如美国专利No.4,575,495，包括疫苗、有机聚合物等。
就半抗原-载体连接试剂来说，那些在抗原制备中传统使用的试剂可广泛地应用，这些试剂的特例包括用于交联酪氨酸、组氨酸、色氨酸等的重氮化合物如双重氮化联苯胺(BDB)等；用于交联一个氨基基团和另一个氨基基团的脂族二醛，例如C2-C7烷醛诸如乙二醛、丙二醛、戊二醛、琥珀醛、己二醛等；用于交联一个硫基和另一个硫基的二马来酰亚胺，例如N,N’-邻苯基二马来酰亚胺、N,N’-间苯基二马来酰亚胺等；用于交联一个氨基基团和一个硫基基团的马来酰亚胺羧基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-N’-羟基琥珀酰亚胺酯等；传统用于肽键形成反应的试剂，该反应中酰胺键由一个氨基基团和一个羧基基团形成，例如脱水和缩合试剂如碳二亚胺，诸如N、N’-二环己基碳二亚胺、N-乙基-N’-二甲基胺-碳二亚胺、1-乙基-3-二异丙基氨基碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉-4-乙基)碳二亚胺；等等。对于前面所述的半抗原-载体连接试剂，也可将重氮芳族羧酸如对重氮苯乙酸等与传统的肽键形成试剂如上述脱水和缩合试剂组合使用。
本发明的肽与免疫原载体物质的偶联可用本领域熟知的方式进行。因此，举例来说，对于直接的共价偶联，可以使用碳二亚胺，更优选用二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺作为偶联试剂。在这样的直接偶联时，需要在这一步使用微酸的反应介质，例如pH在3至6.5范围的介质，更优选为4至6.5的范围。
用中性或碱性的肽作为半抗原制备抗原的偶联反应可用相似的方式进行，但要在pH为7至10的水溶液或传统的缓冲溶液中进行，更优选在pH为8至9的缓冲溶液中进行；温度要在约0℃至40℃，优选为室温附近。反应一般在约1至约24小时内完成，优选为13至15小时。可在上面的过程中使用的缓冲溶液的代表性例子包括：
0.2M氢氧化钠-0.2M硼酸0.2M氯化钾缓冲溶液；
0.2M碳酸钠-0.2M硼酸0.2M氯化钾缓冲溶液；
0.05M四硼酸-0.2M硼酸0.2M氯化钠缓冲溶液；
0.1M磷酸二氢钾0.05M四硼酸钠缓冲溶液。
在上面，半抗原、半抗原-载体连接试剂和载体的比例可以恰当地确定，但半抗原的量优选采用约1至约10倍，更优选为约1至约5倍半抗原重量，半抗原-载体连接试剂可采用半抗原摩尔数的约5至10倍量。通过上述反应，载体通过半抗原-载体连接试剂与半抗原结合，从而获得所需的由肽-载体复合物组成的抗原。
在反应完成后，这样获得的抗原可方便地用透析方法、凝胶过滤方法、分步沉淀方法等方法进行分离和纯化。
这样获得的抗原每摩尔蛋白平均含有50至600摩尔的肽，从而能随后制备对该抗原有高度特异性的抗体。特别地，优选每摩尔蛋白平均结合有50至200、更优选为80至200摩尔的抗原，因为它们具有更高的特异性并能获得高活性和灵敏性的抗体。
根据本发明的肽-载体结构可用通式(Ⅰ)来广泛代表：
C*-X-P*    (Ⅰ)
其中C*代表如上定义的免疫原载体物质；
P*代表相当于SEQ ID NO:1的、约30至约50氨基酸的分化单位C肽片段；
X代表连接免疫原载体C*和肽P*的直接键或共价键。
任何已知的形成肽结构的方法都可用于本发明。例如，使用根据Ziegers等，1990，《免疫学方法》130卷，195-200页的改进方法，通过活化KLH将抗原性分化单位C肽偶联至KLH或其它合适的免疫原载体物质上，KLH的活化通过在PBS中对0.2％戊二醛在4℃透析16小时、接着对PBS透析(3次，每次500 ml)来进行。将肽加入活化的KLH中(100∶1摩尔比)，混合物在4℃搅拌16小时。加入赖氨酸至终浓度20mM以封闭未反应活化的KLH并在4℃搅拌2小时，多余的肽和赖氨酸在4℃对PBS透析除去(2次，每次200ml)。
除了上面介绍的肽结构，还可使用“异功能免疫接合物”形式的抗原性分化单位C肽，即一种是能诱导TH1相关抗体的抗原性肽的T细胞特异结合性配体与能结合T细胞的特殊类或亚类的不同T细胞特异性结合配体相共价偶联。这样的“异功能免疫接合物”更详细介绍于诸如WO89/12458。
尽管肽-载体结构可不用任何其它的抗原化合物或免疫系统生物应答改善剂，但通常在爱滋病治疗中采用“鸡尾酒”方法更为有利，不管这种治疗是预防性的还是治疗性的。因此，将这样的SEQ ID NO:1的抗原肽、通式(Ⅰ)的肽-载体结构、或异功能免疫接合物与其它的抗原物质组合也包含在本发明的范围内。这样的其它抗原性物质可选自任何已知或以下发现的抗原性物质，这些抗原性物质含有一个或多个能有效地诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答或T辅助(Th)应答的表位，并衍生自或基于HIV-1的任何gag诸如p7、p17、p24；env诸如gp120、gp160、gp41；或pol蛋白，其中许多对本领域的技术人员来说是熟知的。
在这样的组合物中，本发明的分化单位C抗原肽或肽-载体结构或异功能免疫结构可与其它的抗原性物质以一个单一的组合物给药，或在联用中作为单独的制剂进行给药。而且，分化单位C抗原肽或肽-载体结构或异功能接合物还可直接相互连接或通过合适的连接基团连接，这也是本领域熟知的。
在本发明的另一个方面，除了上面介绍的肽片段、或肽-载体结构、或异功能免疫接合物、或肽片段或肽-载体结构或异功能免疫接合物与另一种抗原性物质结合的混合物，还提供编码这种肽或其结构或接合物或混合物的相应DNA序列。而这些DNA序列，如同本领域熟知的那样，与合适的起始、终止、启动子序列等连接。就此而言，在某些治疗策略中对有需要的病人给予编码SEQ ID NO:1或任何SEQ ID NO:2至15的肽的DNA序列是有利的。当然，如同本领域所熟知的，DNA序列可用于使用任何传统的遗传工程技术产生相应的编码肽。
因此，本发明包含一种分离的核酸分子(DNA)，它包括编码根据本发明的肽的核酸序列。
SEQ ID NO:8的分化单位C肽的DNA共有序列列于如下及下表2：
aga tca tta tat aac aca gta gca act ctc tat tgt gta   39
cat gaa ?ag ata gag gta cga gac acc aag gaa gcc tta   78
gac aag ata gag gaa gaa caa aac aaa agt cag caa aaa   117
??? ??? aca cag cag gca aaa gcg gct gac ??? gga aag   156
gtc agt caa                                           165
                                       (SEQ ID NO:16)
下表2列出了编码鉴定为SEQ ID NO:9至15以及SEQ ID NO:8的共有序列的DNA序列。但是本领域的技术人员应当理解，在遗传密码中有简并性，即在多数情况下密码子是充分的，下表2中列出的大多数密码子都可被相应于特定氨基酸的另外的密码子替代。例如，亮氨酸(Leu或L)由下列三核苷酸(密码子)编码：TTT和TTC；苏氨酸(Thr或T)被ACT、ACC、ACA和ACG编码；赖氨酸(Lys或K)被AAA和AAG编码，等等，其中核苷酸碱基A、C、G和T分别代表腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。在核酸序列中含有一个或多个变异但产生仍能编码这里介绍的抗原肽的DNA序列的这种DNA序列在功能上等价于下面列出的序列，它们也将包含在本发明的范围内。
                                    表2共有序列C    AgA TCA TTA tat AAc aCA GTA GcA act CTc Tat TGT GTA CAT gaa ?ag ATA gag gTAHIVUG268     --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- A-- GG- --- --- A--HIVSM145     --- --- --- -TC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- A-- --- --- ---HIVZAM18     -A- --- --- -TC --- --- --- -T- --- --A -GG --- --- --- --- G-T --- ACA ---HIVZAM19     -A- --- --- C-C --- G-- --- --- GTC --- --- --- --- --- A-- N-T --- ACA ---HIVZAM20     --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- -C- GG- --- --- ---HIVDJ259     --- --- --- --- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --C -AG --- --- A--HIVVI313     -T- --- --- C-- --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --G A-- --- --- A--
                                        表2-1(续)共有序列C    CgA GAC ACC AAg GAA GCc tTA GAC aag aTA gAG GAA GAA CAA AAC AAa agT CAG CAAHIVUC268     --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --G -T- --- ---HIVSM145     --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---HIVZAM18     --- --- --- --- --- --- --- --- -G- T-- --- --- --- --- --- --- --- --- ---HIVZAM19     --- --- --- --- --- --N --- --- -G- --- --- --- --- --- --- --G T-- --- ---HIVZAM20     --- --- --- --- --- --- --- --- G-- --- --- --- --- --- --- --- T-- --- ---HIVDJ259     -A- --- --- --A --- --A C-- --- --- --- --- --- --- --- --- --- T-- --- ---HIVVI313     --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- A-- --- --- --- --- --- --- --- ---
                    表2-2(续)共有序列C   AAA ??? ??? ACA cag cag GcA aaA gcg gct GAC ???HIVUG268    --- ... ... --- ... ... -A- -C- --T ... --- AAAHIVSM145    --- ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- ...HIVZAM18    --- ACA AAA --- --- --- --- --- --- --- --- ...HIVZAM19    --- ... ... --- --- --- --- --- -A- --- --- ...HIVZAM20    --- ... ... --- --- --- --- --- A-- --- --- ...HIVDJ259    --- ... ... --- --- A-- --- G-- A-A --- --- AAGHIWI313     --- ... ... --- --- --- --- GC- --- --- --- AAT
               表2-3(续)共有序列C    GGA aAg GTC AGT CAA    (SEQ ID NO:16)HIVUG268     --- --- --- --- ---    (SEQ ID NO:17)HIVSM145     --- --- --- --- ---    (SEQ ID NO:18)HIVZAM18     --- C-- --- --- ---    (SEQ ID NO:19)HIVZAM19     --- --A --- --- ---    (SEQ ID NO:20)HIVZAM20     --- --- --- --- ---    (SEQ ID NO:21)HIVDJ259     --- --- --- --- ---    (SEQ ID NO:22)HIVVI313     --- --- --- --- ---    (SEQ ID NO:23)
在上表2中，与表1相似，小写字母代表由特定共有序列的等位变异、遗传漂变和突变导致的核酸变异位点；“？”符号的存在反映在共有序列的该位点上没有共有核苷酸；“划”(-)代表与共有序列中列出的相同核苷酸；“点”(.)代表在该位置缺少核苷酸。应当理解，上述序列是基于HIV的特殊分化单位即分化单位C，共有序列C其它天然产生和自发产生的变异体也包含在编码本发明的抗原肽和肽-载体结构的核酸序列的范围内。
编码本发明的肽的DNA序列可用任何熟知的重组基因技术进行制备，例如，参见美国专利5,142,024中重组HIV(HTLV-Ⅲ)蛋白和肽的内容和其中提到的文献。
因此，本发明还提供含有编码本发明的抗原肽或通式(Ⅰ)的肽-载体结构或异功能免疫接合物的核酸序列的全部或部分的重组DNA分子以及载体。适用于本发明的表达载体至少包含一个操纵连接于核酸序列的表达控制元件。表达控制元件被插入到载体中以控制和调节核酸序列的表达。表达控制元件的例子包括但不限于lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区域、酵母启动子和衍生自多形瘤、腺病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其它优选或需要的操纵元件包括但不限于引导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号和其它在宿主细胞中核酸序列适当转录并随后翻译所必需的或优选的序列。本领域的技术人员应当理解，必需的和优选的表达控制元件的正确组合依赖于所选的宿主系统。还应当理解，表达载体应含有对含有核酸序列的表达载体在宿主细胞中转移和随后复制所必需的其它元件。这样的元件的例子包括但不限于复制起始位点和选择标记。本领域的技术人员还应当理解，这样的载体可用传统方法很方便地构建或购买。
本发明的另一个方面涉及插入了含有编码本发明的抗原肽、或通式(Ⅰ)的肽-载体结构或异功能接合物的核酸序列的全部或部分的重组表达载体的宿主有机体。用本发明包含的核酸序列转化的宿主细胞包括真核细胞诸如动物、植物、昆虫和酵母细胞和原核细胞诸如大肠杆菌。将携带基因的载体导入细胞的方法包括但不限于显微注射、电转化、转导、或用DEAE-葡聚糖、脂转染试剂、磷酸钙转染、或者其它本领域的技术人员熟知的方法转染。
在这一方面的一个优选实施方案中，使用了在真核细胞中有功能的真核表达载体。这种载体的例子包括但不限于逆转录病毒载体、空疱病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒载体、质粒诸如pCDNA3(Invitrogen,San Diego,CA)或杆状病毒转移载体。优选的真核细胞系包括但不限于COS细胞、CHO细胞、Hela细胞、NIH/3T3细胞、293细胞(ATCC#CRL1573)、T2细胞、树突细胞、单核细胞或Epstein-Barr病毒转化的B细胞。一般优选使用哺乳动物细胞如NIH/3T3、COS7、CHO、293细胞以保证蛋白的合适加工和修饰。
宿主细胞表达的重组蛋白可以是粗裂解物或用本领域熟知的标准蛋白纯化程序纯化，这些过程可包括差别沉淀、分子筛色谱、离子交换色谱、等电聚焦、凝胶电泳、亲和和免疫亲和色谱等等。在使用免疫亲和色谱时，重组蛋白可通过一个装有其上接合了对抗原肽特异的抗体的树脂的柱纯化。分离的蛋白可进一步用HPLC或其它纯化方法进行纯化。
本发明的抗原肽或其肽-载体结构可用作预防性或治疗性的疫苗。在用作预防时，疫苗在出现病毒感染的任何证据之前提供。本发明的疫苗的预防性给药应用来在哺乳动物中阻止或缓解爱滋病，在一个优选实施方案中，用本发明的疫苗对一个有高度爱滋病危险的人进行了预防性处理。当进行预防性给药时，疫苗被用来增强病人自身对HIV抗原的免疫应答。用作抗原的疫苗可以是细胞、来自转染了编码抗原肽或肽-载体结构的重组表达载体的细胞的细胞裂解物、或含有表达蛋白的培养物上清。此外，抗原可以是部分或基本上纯的重组蛋白、肽或编码本发明的肽或肽-载体结构的类似物。
虽然可以用纯的或基本上纯形式的免疫原进行给药，但优选使用药物组合物、制剂或制备物。
临床和人用的本发明的制剂包含上面介绍的免疫原以及一种或多种可药用载剂，并可选用其它的治疗成分。载剂必须是可药用的，其含义是与制剂的其它成分匹配并且不会对受体有害。制剂可常规地以单位药剂形式提供，并可用药学领域熟知的任何方法制备。
所有的方法都包括将活性成分加入由一种或多种附加成分组成的载剂。一般来说，制剂统一制备，并最终将活性成分加入液体载剂或精细分散于固体载剂或者两者，然后在需要时，将产品定型为所需要的制剂。
适用于静脉、肌肉、皮下或腹腔常规给药的制剂包含活性成分的无菌水溶液，其中溶液优选与受体的血液等渗。这样的制剂可按传统方法制备，即将固体的活性成分在水中悬浮或溶解，水中含有生理匹配性物质如氯化钠(例如0.1-2.0M)、甘氨酸等，并具有与生理环境匹配的缓冲pH，从而制备了水溶液或悬液，并将溶液除菌。这些可用一个单位或多剂量的容器提供，例如封口的安瓶或小瓶。
本发明的制剂可加入稳定剂，稳定剂的例子是聚乙二醇、蛋白、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，它们可单独或混合使用。在使用时，这些稳定剂优选加入的量为按重量每份免疫原约0.1至10000份。如果使用两个或多个稳定剂，它们的总量优选在上面的范围内。这些稳定剂在合适的浓度和pH的水溶液中使用。这样的水溶液的具体渗透压一般在约0.1至约3.0渗透压摩尔的范围内，优选在约0.8至约1.2的范围内。水溶液的pH调至约5.0至9.0的范围内，优选在6-8的范围内。在配制本发明的免疫原时，可以使用抗吸收试剂。
可以采用另外的药学方法来控制作用的持续性。受控释放的制备物可用聚合物复合或吸收蛋白或其衍生物来获得。受控释放可通过选择合适的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)和大分子的浓度以及整合的方法以控制释放来进行。通过受控释放制备物来控制作用时间的另一种可能方法是将肽或肽-载体结构装入一种聚合物例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)、聚葡萄糖酸、这些酸的共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物的颗粒中。另外，除了将这些试剂整合进聚合物颗粒，还可以将这些物质装入微囊，微囊用例如共堆积技术或表面共聚作用制备，例如分别用羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(methlmethacrylate)微囊，或者装入胶体药物释放系统，例如，脂质体、白蛋白微球体、小乳剂、毫微颗粒和毫微小囊或大乳剂。
当需要口服制备物时，组合物可用典型的载剂例如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石、硬脂酸镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、藻酸钠、或阿拉伯胶等与其混合。
本发明的肽可以试剂盒的形式、单独、或按上面介绍的药物组合物形式提供。
接种可按传统的方法进行。例如，免疫原可在合适的稀释剂如盐水或水、或完全或不完全佐剂中使用。而且，免疫原可以也可以不与载剂结合来使蛋白具有免疫原性或增强蛋白的免疫原性。这种载剂分子的例子包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素等。免疫原也可与脂蛋白、脂或脂肪酸偶联，或以脂质体形式或与佐剂一起给药。免疫原可经任何能产生抗体、活化辅助T细胞和/或产生细胞毒T淋巴细胞的途径给药，例如静脉、腹腔、肌肉、皮下、鼻、口等。免疫原可一次或分期间隔给药直至诸如获得针对HIV抗原的明显滴度的CD4+或CD8+T细胞或抗体。特别地，在本发明的一个特别优选的实施方案中，如上所述，本发明的抗原肽诱导了TH1相关的抗体和TH1免疫应答的其它特征。细胞的存在可用测量在用免疫原脉冲的抗原递呈细胞的应答中细胞因子的分泌来进行。抗体可在血清中用传统免疫分析技术进行检测。
如上所述，本发明的疫苗或免疫原的给药可用于预防性和治疗性目的。在预防性给药时，免疫原在出现HIV感染的任何证据之前或爱滋病导致的任何症状出现前给药，特别是对高危个体。免疫原的预防性给药用来在人中阻止或缓解爱滋病。当治疗性给药时，免疫原在疾病发生(或之后)或者在疾病的任何症状出现时给药。免疫原的治疗性给药用来刺激宿主的免疫应答。
举例来说，可以使用用重组表达载体制备的疫苗，为给一个个体提供疫苗，如上所述，将编码全部或部分抗原肽或肽-载体结构的遗传序列插入一个表达载体，并导入准备免疫的哺乳动物。可用于前述疫苗中的载体的例子包括但不限于缺陷型逆转录病毒载体、腺病毒载体、CMV载体、空疱病毒载体、痘病毒载体或其它病毒载体(参见例如Mulligan RC(1993)《科学》260卷，926-932页)。携带核酸的病毒载体可在爱滋病或前爱滋病的任何证据出现前导入哺乳动物或在患有爱滋病或前爱滋病的哺乳动物中缓和疾病的进程。
病毒载体给药于哺乳动物的方法的例子包括但不限于将细胞自体内暴露于细胞、或将逆转录病毒或病毒的生产细胞注射进感染的组织或静脉给药病毒。预备给药的携带编码抗原肽或肽-载体结构的合适核酸序列的病毒载体的量依赖于病毒颗粒的滴度。举例来说，免疫原给药的范围可以是每个哺乳动物大约106至大约1011病毒颗粒，优选对人。接种后，疫苗的效果可用抗体或识别抗原的免疫细胞的产生来评价，这可用特殊细胞因子的产生或疾病的消退来评价。本领域的技术人员应当知道评价前面所说参数的传统方法。如果将要免疫的个体已经患有爱滋病或前爱滋病，疫苗可与其它治疗手段一起给药。其它治疗手段的例子包括但不限于蛋白酶抑制剂、逆转录酶、整合酶、和基于以上的药物组合治疗，如同目前治疗爱滋病使用的或以下将要发展的这种治疗。
而且，本发明的肽和肽-载体结构和编码它们的DNA序列可用于遗传免疫技术，例如美国专利5,593,972公开的。根据遗传免疫技术，核酸序列操纵连接于调节序列从而使之在给予了核酸分子的个体的细胞中表达。所产生的细胞接着可用于预防性或治疗性接种。相似地，裸露的DNA可用来诱导免疫应答，例如参见，诸如最近授权的美国专利5,580,859和5,589,466。
本发明还涉及治疗或预防获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的方法，即给予有需要的病人有效治疗剂量的通式(Ⅰ)的肽-载体结构。
根据本发明，针对来自HIV p17蛋白的SEQ ID NO:1分化单位C肽的免疫应答可至少导致所需的TH1应答，其证据为TH1特征性抗体IgG2a(小鼠)和因此推测的IgG3(人)。但这些肽除了TH1诱导的免疫应答，还诱导TH2免疫应答，特别地，诱导混合的TH1/TH2免疫应答。
因此，本发明的抗原肽为防止HIV感染或治疗HIV感染细胞提供有潜力的强疫苗。这种疫苗组合物可用于免疫有爱滋病危险或接触HIV特别是HIV-1的病人以及治疗有爱滋病相关综合征或明显爱滋病的病人。
当用作疫苗时，疫苗可非常常规地通过注射、肌肉、皮内、胃肠外、鼻内、口服或皮下导入宿主。可以使用任何普通的液体或固体载剂来释放疫苗，这些疫苗必须对宿主是可接受的，并且不会对宿主有任何有害的副作用或不会对疫苗产生损害作用。具有生理pH的磷酸缓冲盐水(PBS)，例如pH6.8至7.2，优选7，可单独或与合适的佐剂一起用作载剂。免疫原抗原的浓度可在约0.5至200ug/kg的范围内变化，例如每次注射约25ug/kg，临床溶剂的体积一般从约0.1ml至约1ml，例如约0.2ml，就临床前研究的动物来说，自约0.5ml至约2ml，例如在人中为约1ml。初次注射后可能需要多次注射，间隔期可为约2周至约12周。例如当进行多次注射时，对动物约2周，对人约8周。可以给予加强免疫，或者这样较为有利，例如从约6个月至2年或更长。
在用含有肽的CTL表位免疫的人志愿者中已经发现了细胞毒性T细胞应答，但是CTL应答似乎至少部分依赖于疫苗中免疫原性抗原的浓度。接受剂量从10至25ug/kg的gag肽疫苗比接受较高剂量的50至100ug/ml的疫苗显示高的CTL应答，这些结果说明与细胞介导的免疫有关的TH-1型细胞在较低剂量的含CTL肽疫苗时被诱导，用较高剂量的肽免疫的疫苗的CTL应答较低，说明较高剂量的疫苗主要诱导参与体液免疫应答的TH-2型细胞。因此，本发明的疫苗中的优选免疫原性抗原的浓度在10至25ug/ml的范围内，但也可根据需要给予低一些或高一些的剂量。
下面是本发明的抗原肽和结构和组合物的不同实施方案的应用举例，但应当理解，本发明并不限于下面介绍的实施例。
实施方案1：使用KLH接合物作为本发明的肽序列的载体，作为预防性疫苗诱导免疫应答，以诱导TH1/TH2的免疫应答来阻止HIV感染。
实施方案2：使用KLH接合物作为本发明序列的载体，作为治疗性疫苗诱导免疫应答，在被HIV感染的个体中诱导TH1/TH2的免疫应答，它可与其它的治疗结合使用，来减少病毒荷载并控制或治愈HIV感染。
实施方案3：使用人IgG、牛或人血清白蛋白或其它载体蛋白，用来在接合物中作为本发明的肽序列的载体，来作为预防性疫苗诱导免疫应答，从而诱导TH1/TH2免疫应答，阻止HIV感染。
实施方案4：使用人IgG、牛或人血清白蛋白或其它载体蛋白，用来在接合物中作为本发明的肽序列的载体，来作为治疗性疫苗诱导免疫应答，从而在HIV感染人体中诱导TH1/TH2免疫应答，单独或与其它治疗一起使用，减少病毒荷载和控制或治愈HIV感染。
实施例：
使用与前面图1、2和3介绍的相同免疫小鼠，小鼠在第42天放血，将各血样进行EILSA试验检测分化单位B、分化单位C和分化单位E每种免疫小鼠对包被在ELLSA板上的用于接种的每种相应的抗原肽的交叉识别(多价应答)。试验中使用1/200、1/2000和1/20000稀释的抗血清，结果示于下表3。如前所述，表3中报告的结果表示为在490nm光波长处的吸收值。
                               表3免疫的分化单位                包被用于ELISA评价的分化单位肽KLH结合物               B(SEQ ID No:4)             C(SEQID No:5)                  E(SEQ ID No:6)
                    1/200    1/20000   1/20000  1/200    1/2000   1/20000  1/200    1/2000   1/20000
          小鼠#B               1038    0.448     0.137    0.133    1.027    0.234    0.153    0.232    0.192    0.129(SEQ ID NO:4)   1039    0.995     0.187    0.157    0.905    0.187    0.158    0.753    0.147    0.142
            1040    0.432     0.194    0.183    0.760    0.221    0.180    0.222    0.177    0.148
            1041    0.223     0.164    0.167    0.412    0.175    0.177    0.229    0.173    0.131
            1042    0.598     0.172    0.168    1.014    0.311    0.188    0.286    0.161    0.144
            1043    0.428     0.188    0.166    0.634    0.221    0.181    0.239    0.156    0.133
            1044    0.276     0.174    0.166    0.402    0.209    0.181    0.193    0.162    0.159
组均值              0.486     0.174    0.163    0.736    0.223    0.174    0.308    0.167    0.141E               1045    0.337     0.202    0.191    1.027    0.234    0.153    1.786    1.288    0.470SEQ ID NO:6)    1046    0.248     0.141    0.170    1.560    0.441    0.147    1.640    0.458    0.153
            1047    0.292     0.164    0.133    1.997    0.978    0.270    2.136    0.800    0.964
            1048    0.235     0.172    0.146    1.625    1.195    0.409    1.677    1.112    0.318
            1049    0.261     0.181    0.143    2.187    1.193    0.348    2.254    1.165    0.323
            1050    0.491     0.223    0.180    1.678    1.186    0.397    1.817    1.155    0.361
            1051    0.972     0.265    0.168    1.919    1.389    0.438    1.969    1.414    0.424
组均值              0.405     0.193    0.162    1.713    0.945    0.309    1.897    1.056    0.430C               1052    1.942     0.424    0.178    2.083    0.736    0.216    1.705    0.561    0.197(SEQ ID NO:5)   1053    0.512     0.201    0.170    1.404    0.494    0.193    1.341    0.435    0.211
            1054    0.377     0.132    0.137    1.695    0.587    0.266    1.423    0.349    0.145
            1055    1.545     0.230    0.242    2.208    1.613    0.680    0.493    0.135    0.102
            1056    0.557     0.181    0.146    1.708    0.775    0.401    1.337    0.408    0.156
            1057    1.530     0.288    0.146    2.262    1.313    0.526    1.622    0.574    0.183
组均值              1.077     0.243    0.170    1.893    0.920    0.380    1.320    0.410    0.166
由表3中报告的结果，我们再次发现衍生于分化单位C亚型并含有始于位置75至85区域的氨基酸、延伸约30至50氨基酸、直至位置114至128区域的氨基酸的抗原肽，能够诱导强烈识别来自不同亚型的HIV肽的抗体。
                     序列表
(1)一般信息(ⅰ)申请人：DANIEL H.ZIMMERMAN AND PREM S.SARIN(ⅱ)发明题目：HIV p-17肽片段、含有该片段的组合物及其制造和使用方法(ⅲ)序列数：23(ⅳ)联系地址：
(A)联系人：Law Office of Sherman and Shalloway
(B)街道：413 N.Washington Street
(C)城市：Alexandria
(D)州：Virginia
(E)国家：USA
(F)ZIP:22314(ⅴ)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘，5.25inch,360kb存储量
(B)计算机：Dell System 210；Intel 80 286 Microprocessor
(C)操作系统：MS DOS 6.2
(D)软件：Word Perfect,Version 5.1(ⅵ)当前申请资料：
(A)申请号：未知
(B)提交日期：与此同时(ⅶ)律师/代理人信息：
(A)姓名：Richard A.Steinberg
(B)登记号：26,588
(C)参考/文档号：VT-8(ⅸ)电信信息：
(A)电话：(703)549-2282
(B)传真：(703)836-0106
(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：55氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：p17蛋白的共有序列C
(B)位置：1-55
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：残基75 to 129(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Xaa Ser Leu Xaa Asn Thr Val Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Val His Xaa Xaa
            5                   10                  15Ile Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa Xaa Xaa Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala
    35                  40                  45Asp Xaa Gly Xaa Val Ser Gln
50                  55
(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：35氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：p17蛋白的共有序列C
(B)位置：1-35
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：残基82-116(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys
            5                   10                  15Glu Ala Leu Asp Xaa Xaa Xaa Glu Glu Gln Ash Lys Xaa Gln Gln Lys
        20                  25                  30Xaa Xaa Thr
    35
(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV SF2(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HGP-30
(B)位置：1-3
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：共有序列A,gag蛋白p17位置86-115的残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Tyr Ser Val His Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu
            5                   10                  15Glu Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala
        20                  25                  30
(3)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：泰国B共有序列
(B)位置：1-30
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：共有序列C,gag蛋白p17位置86-115的残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu
            5                   10                  15Glu Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala
        20                  25                  30
(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：乌干达共有序列C
(B)位置：1-30
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：共有序列C,gag蛋白p17位置86-115的残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Tyr Cys Val His Lys Gly Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu
            5                   10                  15Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ile Gln Gln Lys Thr
      20                25                30
(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：泰国E共有序列
(B)位置：1-30
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：共有序列E,gag蛋白p17位置86-115的残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:Trp Cys Val His Gln Arg Ile Glu Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu
            5                   10                  15Asp Lys Ile Glu Glu Val Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr
        20                  25                  30
(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：29氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV SF2(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：修饰的HGP-30
(B)位置：1-29
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：共有序列A,gag蛋白p17位置83-111的残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ala Thr Leu Tyr Ser Val His Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys
            5                   10                  15Glu Ala Leu Glu Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser
        20                  25
(3)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：55氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：共有序列C
(B)位置：1-55
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的75-129残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Arg Ser Leu Xaa Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Xaa Xaa
            5                   10                  15Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr Gln Gln Ala Lys Xaa Ala
    35                  40                  45Asp Xaa Gly Lys Val Ser Gln
50                  55
(3)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：50氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV UG268(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV UG268
(B)位置：1-3
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-125残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Lys Gly
            5                   10                  15lle Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Ile Gln Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asp Lys Gly Lys Val
    35                  40                  45Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：52氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV SM145(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV SM145
(B)位置：1-52
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-127残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Arg Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys
            5                   10                  15Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly
    35                  40                  45Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：54氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV ZAM18(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV ZAM18
(B)位置：1-54
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-128残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Val Thr Leu Trp Cys Val His Glu Asp
            5                   10                  15Ile Thr Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Arg Leu Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala
    35                  40                  45Asp Gly Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：52氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV ZAM19(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV ZAM19
(B)位置：1-52
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-127残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Lys Ser Leu His Asn Ala Val Ala Val Leu Tyr Cys Val His Lys Xaa
            5                   10                  15Ile Thr Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Arg Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Glu Ala Asp Gln
    35                  40                  45Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:13的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：52氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV ZAM20(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV ZAM20
(B)位置：1052
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-127残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Ala Gly
            5                   10                  15Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Thr Ala Asp Gly
    35                  40                  45Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:14的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：53氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV DJ259(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV DJ259
(B)位置：1-53
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-128残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Ala Arg
            5                   10                  15Ile Glu Ile Gln Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Lys Ala Glu Thr Ala Asp Lys
    35                  40                  45Gly Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:15的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：53氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部片段(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV VI313(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：HIV VI313
(B)位置：1-53
(C)鉴定方法：已知共有序列
(D)其它信息：p17蛋白的76-128残基(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:Ile Ser Leu His Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys
            5                   10                  15Ile Glu Ile Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Lys Glu Gly Glu
        20                  25                  30Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Ala Asp Asn
    35                  40                  45Gly Lys Val Ser Gln
50
(2)SEQ ID NO:16的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：165碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的226至380(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-165
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:AGA TCA TTA TAT AAC ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT GAA NAG    48Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Xaa
            5                   10                  15ATA GAG GTA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC AAG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Va1 Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAA AGT CAG CAA AAA NNN NNN ACA CAG CAG GCA AAA GCG GCT    144Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala
    35                  40                  45GAC NNN GGA AAG GTC AGT CAA                                        165Asp Xaa Gly Lys Val Ser Gln
50                  55
(2)SEQ ID NO:17的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：150碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV-1
(B)毒株：HIV UG268(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至375(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-150
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:AGA TCA TTA TAT AAC ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT AAA GGG    48Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Lys Gly
            5                   10                  15ATA GAG ATA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC AAG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Ile Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAG ATT CAG CAA AAA ACA GAA ACA GCT GAC AAA GGA AAG GTC    144Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Glu Thr Ala Asp Lys Gly Lys Val
    35                  40                  45AGT CAA                                                            150Ser Glu
50
(2)SEQ ID NO:18的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：156碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV SM145(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至381(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-156
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:AGA TCA TTA TTC AAC ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT GAA AAG    48Arg Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys
            5                   10                  15ATA GAT GTA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC AAG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                   30CAA AAC AAA AGT CAG CAA AAA ACA CAG CAG GCA AAA GCG GCT GAC GGA    144Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly
    35                  40                  45AAG GTC AGT CAA                                                    156Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:19的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：162碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV ZAM18(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至381(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-162
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:AAA TCA TTA TTC AAC ACA GTA GTA ACT CTA TGG TGT GTA CAT GAA GAT    48Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Val Thr Leu Trp Cys Val His Glu Asp
            5                   10                  15ATA ACA GTA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC AGA TTA GAC GAA GAA    96Ile Thr Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Arg Leu Glu Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAA AGT CAG CAA AAA ACA AAA ACA CAG CAG GCA AAA GCG GCT    144Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala
    35                  40                  45GAC GGA CAG GTC AGT CAA                                            162Asp Cly Gln Val Ser Gln
50
(2)SEQ ID NO:20的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：156碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV ZAM19(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至381(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-156
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:AAA TCA TTA CAC AAC GCA GTA GCA GTC CTC TAT TGT GTA CAT AAA NAT    48Lys Ser Leu His Asn Ala Val Ala Val Leu Tyr Cys Val His Lys Xaa
            5                   10                  15ATA ACA GTA CGA GAC ACC AAG GAA GCN TTA GAC AGG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Arg Ile Glu Glu Glu
        20                  25                   30CAA AAC AAG TGT CAG CAA AAA ACA CAG CAG GCA AAA GAG GCT GAC GGA    144Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Glu Ala Asp Gly
    35                  40                  45AAA GTC AGT CAA                                                    156Asn Val Ser Gln
50
(2)SEQ ID NO:21的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：156碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV ZAM20(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至381(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-156
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:AGA TCA TTA TAT AAC ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT GCA GGG    44Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Ala Gly
            5                   10                  15ATA GAG GTA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC GAG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAA TGT CAG CAA AAA ACA CAG CAG GCA AAA ACG GCT GAC GGA   144Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Thr Ala Asp Gly
    35                  40                  45AAG GTC AGT CAA                                                   156Lys Val Ser Gln
50
(2)SEQ ID NO:22的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：159碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(C)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV DJ259(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至384(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-159
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:AGA TCA TTA TAT AAT ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT GCA AGG    44Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Ala Arg
            5                   10                  15ATA GAG ATA CAA GAC ACC AAA GAA GCA CTA GAC AAG ATA GAG GAA GAA    96Ile Glu Ile Gln Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAA TGT CAG CAA AAA ACA CAG AAG GCA GAA ACA GCT GAC AAG    144Gln Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Lys Ala Glu Thr Ala Asp Lys
    35                  40                  45GGA AAG GTC AGT CAA                                                159Gly Lys Val Ser Gln
50
(3)SEQ ID NO:23的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：159碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑构型：线形(ⅱ)分子类型：基因组DNA(ⅵ)原始来源
(A)有机体：HIV VI313(ⅷ)基因组中的位置：p17gag蛋白的213至384(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：
(B)位置：1-159
(C)鉴定方法：已知共有序列(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:ATA TCA TTA CAT AAT ACA GTA GCA ACT CTC TAT TGT GTA CAT GAG AAG    48Ile Ser Leu His Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys
            5                   10                  15ATA GAG ATA CGA GAC ACC AAG GAA GCC TTA GAC AAA ATA AAG GAA GAA    96Ile Glu Ile Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Lys Glu Glu
        20                  25                  30CAA AAC AAA AGT CAG CAA AAA ACA CAG CAG GCA GCA GCG GCT GAC AAT    144Gln Asn Lys Ser Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Ala Asp Asn
    35                  40                  45GGA AAG GTC AGT CAA                                                159Gly Lys Val Ser Gln
50

Claims (20)

1．一种含有取自如下序列的部分或全部的约30至50连续氨基酸的肽：1                 5                  10Xaa Ser Leu Xaa Asn Thr Val Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Val His15                  20                   25Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa
30                   35                  40Xaa Xaa Glu Glu Gln Asn Lys Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr
     45                  50                  55Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Asp Xaa Gly Xaa Val Ser Gln (SEQ ID NO:1)
其中位置1的Xaa是Arg、Lys或Ile；
位置4的Xaa是Tyr、Phe或His；
位置8的Xaa是Ala或Val；
位置9的Xaa是Thr或Val；
位置11的Xaa是Tyr或Trp；
位置15的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置16的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置18的Xaa是Glu或Thr；
位置19的Xaa是Val或Ile；
位置20的Xaa是Arg或Gln；
位置28的Xaa是Lys、Arg或Glu；
位置29的Xaa是Ile或Leu；
位置30的Xaa是Glu或Lys
位置36的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置40的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置41的Xaa是Lys或一个直接的键；
位置43的Xaa是Gln或一个直接的键；
位置44的Xaa是Gln、Lys或一个直接的键；
位置45的Xaa是Ala或Glu；
位置46的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置47的Xaa是Thr、Ala或Glu；
位置50的Xaa是Lys、Asn或一个直接的键；
位置52的Xaa是Lys或Gln。
2．一种含有取自如下序列的部分或全部的约30至33连续氨基酸的肽：1                 5                  10Ala Thr Leu Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp15                  20                   25Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa Xaa Xaa Glu Glu Gln Asn Lys
30                   35Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr         (SEQ ID NO:2)
其中位置4的Xaa是Tyr或Trp；
位置5的Xaa是Cys或Ser；
位置8的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置9的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置11的Xaa是Glu或Thr；
位置12的Xaa是Val或Ile；
位置13的Xaa是Arg或Gln；
位置21的Xaa是Lys、Arg或Gln；
位置22的Xaa是Ile或Leu；
位置23的Xaa是Glu或Lys
位置29的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置33的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置34的Xaa是Lys或一个直接的键。
3．一种含有SEQ ID NO:2并含有约30至32氨基酸的肽，其中序列起始于位置1至4的氨基酸，并且其中：
位置4的Xaa是Tyr；
位置11的Xaa是Glu；
位置12的Xaa是Val；
位置13的Xaa是Arg；
位置21的Xaa是Lys；
位置22的Xaa是Ile；
位置33的Xaa是一个直接的键；
位置34的Xaa是一个直接的键。
4．具有SEQ ID NO:9的通式的肽。
5．具有SEQ ID NO:5的通式的肽。
6．含有通式(Ⅰ)肽-载体结构的免疫活性肽：
C*-X-P*(Ⅰ)
其中
C*代表免疫原性载体物质；
P*代表SEQ ID NO:1的肽；
X代表连接免疫原性载体物质C*和肽P*的直接键或共价键。
7．含有有效药学剂量的根据权利要求1的肽和有效载体的药物组合物。
8．权利要求7的组合物，其中肽具有从下面序列取得的约30至33个连续氨基酸：1                5                   10Ala Thr Leu Xaa Xaa Val His Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Asp15                  20                   25Thr Lys Glu Ala Leu Asp Xaa Xaa Xaa Glu Glu Gln Asn Lys
30                  35Xaa Gln Gln Lys Xaa Xaa Thr           (SEQ ID NO:2)
其中位置4的Xaa是Tyr或Trp；
位置5的Xaa是Cys或Ser；
位置8的Xaa是Lys、Glu或Ala；
位置9的Xaa是Gly、Lys、Asp、Glu或Arg；
位置11的Xaa是Glu或Thr；
位置12的Xaa是Val或Ile；
位置13的Xaa是Arg或Gln；
位置21的Xaa是Lys、Arg或Gln；
位置22的Xaa是Ile或Leu；
位置23的Xaa是Glu或Lys
位置29的Xaa是Ile、Ser或Cys；
位置33的Xaa是Thr或一个直接的键；
位置34的Xaa是Lys或一个直接的键。
9．权利要求8的组合物，其中肽是含有约30至32氨基酸的SEQ IDNO:2的肽，其中序列中的第一个氨基酸始于位置1至位置4的氨基酸，并且其中：
位置4的Xaa是Tyr；
位置11的Xaa是Glu；
位置12的Xaa是Val；
位置13的Xaa是Arg；
位置21的Xaa是Lys；
位置22的Xaa是Ile；
位置33的Xaa是一个直接的键；
位置34的Xaa是一个直接的键。
10．权利要求9的组合物，其中肽是具有SEQ ID NO:9的肽。
11．权利要求9的组合物，其中肽是具有SEQ ID NO:5的肽。
12．一种有效预防或治疗爱滋病的组合物，包含列于权利要求6的通式(Ⅰ)的免疫活性肽-载体结构和含有至少一个CTL表位或Th表位，并衍生自HIV-1的env、gag或pol蛋白的抗原肽。
13．含有编码根据权利要求1的肽的核酸序列的分离核酸序列。
14．含有如下核苷酸序列的分离核酸分子：
aga tca tta tat aac aca gta gca act ctc tat tgt gta    39
cat gaa ?ag ata gag gta cga gac acc aag gaa gcc tta    78
gac aag ata gag gaa gaa caa aac aaa agt cag caa aaa    117
??? ??? aca cag cag gca aaa gcg gct gac ??? gga aag    156
gtc agt caa                                            165
                                       (SEQ ID NO:16)
15．一种能有效预防或治疗HIV-1感染的组合物，包含根据权利要求13的分离核酸分子和编码一个抗原肽的核酸分子，其中抗原肽含有至少一个CTL表位或Th表位，并衍生自HIV-1的env、gag或pol蛋白。
16．含有选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的核苷酸序列的分离核酸分子。
17．至少含有一个权利要求12的核苷酸序列的重组表达载体。
18．一种能有效预防或治疗HIV-1感染的组合物，包含权利要求17的载体和含有编码至少一个CTL表位或Th表位并衍生自HIV-1的env、gag或pol蛋白的核酸序列的重组表达载体。
19．权利要求15的载体，其中表达载体是真核表达载体或原核表达载体。
20．含有根据权利要求16的重组表达载体的宿主细胞。
CN97198681A 1996-08-09 1997-08-08 HIVp－17肽片段、含有该片段的组合物及其制造和使用方法 Pending CN1233187A (zh)

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