CN1118474C - 合成肽及包含其的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合肽，所述的嵌合肽包括一或多个处于能进行免疫学相互作用构象中的保护性表位，本发明还涉及包括嵌合肽的疫苗。本发明特别涉及能诱导针对A类链球菌的保护性抗体的嵌合肽。

Description

合成肽及包含其的疫苗
本发明涉及处于能进行免疫学相互作用的构象的含有一个或多个保护性表位的嵌合肽及包含其的疫苗组合物。本发明尤其指的是一种能诱导抗A类链球菌的保护性抗体的嵌合肽。
此说明书中引用作者的文献的著录项目详见说明书最后部分。说明书中所述氨基酸序列号(SEQ ID NOs.)附后表明。
在本说明书中，除非另有说明，术语“包括”是指包括所列的组分或组分组，也包括其它的组分或组分组。
许多能用作抗一些疾病的疫苗候选者的蛋白质具有一种卷曲螺旋结构，其是在各种各样的蛋白质中发现的一种重要的结构和生物学高丰度的基序(Cohen and Parry，1990，1986)。已预计有200多种蛋白质含有卷曲螺旋区域(Lupas et al.，1991)，其中包括一些细菌的表面蛋白如链球菌A蛋白和M蛋白；病毒如流感血凝素和人免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白gp45；及原生动物如锥虫的VSG。所有卷曲螺旋基序均有特征性的7个氨基酸残基重复(a-b-c-d-e-f-g)n。一些卷曲螺旋区域的x线结构已经清楚，其包括酵母转录因子GCN4二聚体的亮氨酸拉链部分(O′Shea et al.，1991)，α-spectrin的重复基序(Yan，1993)，及GCN4亮氨酸拉链三聚体(Harburyet al.，1994)和四聚体(Harbuty et al.，1993)突变体。
在基于这些蛋白质的亚单位疫苗的开发中，通常很难将表位定位在卷曲螺旋结构中。而且保护性表位需要以恰当的构象存在用以免疫识别，如与抗体结合。这一点在确定一个最小的稳定表位并用它作为疫苗中尤其重要。
A类链球菌(此后称作“GAS”)是人体一些疾病的致病因素，能导致引起严重心脏疾患的急性风湿热。风湿热是一种由链球菌M蛋白与心脏抗原间的交叉相互作用引起的自身免疫疾病(Beachey et al.，1988)。M蛋白含周期性出现的7个残基强烈地暗示该分子的中心杆区呈一个卷曲螺旋构象(Manula and Ficshetti，1980)。跨越此区域的重叠肽已生产出(见国际专利申请PCT/AU93/00131[WO 93/21220])，抗来自高度保守的C-末端区的-20mer合成肽(记作p145)的小鼠抗体能调理及杀死GAS的多倍分离物(Pruksakorn et al.，1994)。另外，p145能抑制人血清介导的体外杀伤。重要的是p145也可刺激诱导心脏交叉反应T细胞(Pruksakornet al.，1992；1994b)。p145中的B细胞表位被认为是参与构象的，因为截短的肽不能引起保护性抗体反应(Pruksakorn，1994)。因此就需要确定诱导调理抗体所需的p145的最小区域；其随后能构成疫苗的基础。此方法能从病原体的一系列蛋白质中识别出最小表位。
定位抗原中的最小表位的一种已知方法是PEPSCAN法(Geysenet al.，1987)，但使用的短肽只能指示出顺序或连续表位。其它确定构象表位即由蛋白质的三级结构形成的表位的方法依赖于模拟表位(mimotope)法。模拟表位是能诱导抗体的表位模拟物。可在含有使用20个通用氨基酸生产的八肽的全部组成成份(即208肽)的聚丙烯小管中合成肽(Geyysen et al.，1987)。或者，可用抗体识别法测定由丝状噬菌体克隆的大量混合物组成的、每个成员在病毒颗粒表面显示一种肽序列的表位文库(Scott and Smith，1990)。
根据本发明，衍生自一种构象表位的重叠肽被包含在一种具有相似天然构象的肽中。该方法能潜在用于定位一系列的构象表位，以及用于设计最小表位作为抗GAS和许多其它病原体的疫苗候选者。
因此，根据本发明的一个方面，本发明涉及一种嵌合肽，其包括插入第二个氨基酸序列内的含一个构象表位的第一个氨基酸序列，其中所述的第一个和第二个氨基酸序列衍生自具有相似天然构象的肽、多肽或蛋白质。
根据本发明的这一方面，第二个氨基酸序列组成一“构架肽”并为嵌合肽提供一种适当构象。选择的或遗传工程化的构架肽为第一个氨基酸序列提供一种相似构象如其天然存在的形式。在最优选的实施例中，构架肽呈一种α-螺旋卷曲螺旋构象，因此能用于使存在于第一氨基酸序列中的表位呈一种相似构象，如一种α-螺旋卷曲螺旋构象。
根据本发明的优选方面，提供了一种嵌合肽，包括插入第二个氨基酸序列内的含一个构象表位的第一个氨基酸序列，其中所述的第二个氨基酸序列折叠成一种α-螺旋卷曲螺旋构象。
本文中特别举例说明的是第一个氨基酸序列衍生自链球菌M蛋白并特别包括来自下列氨基酸序列(用单字母缩写表示氨基酸残基)的一个B细胞构象表位：
LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO：1)或一个或多个这些氨基酸残基的功能和/或化学等价物。
因此本发明的一个特别优选实施方案涉及一种嵌合肽，其包括至少有三个氨基酸选自下列序列的第一个氨基酸序列，
LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO：1)其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自链球菌M蛋白的构象B细胞表位；其中所述的第一个氨基酸序列被插入能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中。优选地，第一个氨基酸序列包括至少5个，更优选至少10个，最优选至少15个相邻的氨基酸残基。
或者，可选择例如那些位于螺旋的外表面且为活性所需或能满足活性需要的非相邻的氨基酸。
构架肽的结构基于7个氨基酸残基重复：
(a -b -c -d -e -f -g)n其中a和d位优选大的非极性残基，b、c及f位是极性和荷电的，e和g位一般适于链间离子的相互作用。一特别优选的构架肽基于与GCN4亮氨酸拉链(O′shea et al.，1989；1991)或其三聚体(Harbury et al.，1994)或四聚体(Harbury et al.，1993)及α-spectrin的重复基序(Yan，1993)相对应的肽的结构。GCN4亮氨酸拉链是较优选的，衍生自GCN4亮氨酸拉链肽的共有特征的模型七元重复包括以下序列：
VKQLEDK (SEQ ID NO：2)其给出了一种4个七元重复的构架肽(GCN4)4。如果需要，该构架肽可以或需要比4个重复长一些。
然后将第一个氨基酸序列嵌入卷曲螺旋构架肽形成嵌合肽。
本发明的嵌合肽可通过重组方法生产或通过如使用固相肽合成技术以规定顺序分步添加一个或多个氨基酸残基而化学合成。肽可与其它蛋白质联合合成，然后经化学裂解而分离，或者肽或多价肽可经多个重复单位而合成。肽可包含天然存在的氨基酸残基也可含有非天然存在的氨基酸残基如某些D-异构体或经化学修饰的天然存在的残基。后述这些残基可以是例如促进或提供对肽的构象约束和/或限制所需的。生产本发明的肽的方法的选择取决于例如所需类型，肽的量和纯度以及生产的容易性和方便性等因素。
本发明的嵌合肽在体内应用时首先需化学修饰，因为肽本身没有足够长的血清和/或组织半寿期。本发明的肽的化学修饰对改进其抗原性包括肽的某一区域作为B和/或T细胞表位的能力也有重要作用。这种经化学修饰的嵌合肽在此称为“类似物”。术语“类似物”包括本发明的嵌合肽的任何功能化学或重组等价物，其特征在于(在一最优选实施案中)其至少有一个来自GAS的M蛋白的B细胞表位且其中与B细胞表位反应的抗体与人心肌组织的反应性是最低程度的。术语“类似物”在本文中也包括任何上述的肽的氨基酸衍生物。
本文涉及的嵌合肽类似物包括但不限于对侧链的修饰、在肽合成期间非天然氨基酸和/或其衍生物的掺入、使用交联剂及赋予肽或其类似物构象约束的其它方法。
本发明涉及的侧链修饰包括氨基的修饰，如经与醛反应后用NaBH4还原的还原烷基化、用甲基乙酰亚暗的脒化；用醋酸酐的酰化；用氰酸盐对氨基的氨甲酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基的三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢化酞酸酐对氨基的酰化；以及用吡哆醛-5′-磷酸酯对赖氨酸的吡哆醛化后用NaHB4的还原化。
精氨酸残基的胍基可通过与如2，3-丁二酮、苯基乙二醛和乙二醛反应形成杂环缩合物而加以修饰。
羧基可经形成O-酰基异脲的碳化二亚胺活化然后例如衍化至相应的酰胺而加以修饰。
巯基基团可通过例如下述方法修饰，与碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基反应；过甲酸氧化至磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺，马来酐或其它取代的马来酰亚胺的反应；使用4-氯汞基苯甲酸酯，4-氯汞基苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞基-4-硝基苯酚及其它汞制剂形成汞衍生物；在碱性pH下与氰酸酯的氨基甲酰反应。
色氨酸残基的修饰可通过例如用N-溴化丁二亚胺的氧化作用或用2-羟基-5-硝基苄溴化物或硫苯基卤对吲哚的烷化而进行。另一方面酪氨酸残基可经与四硝基甲烷的硝化反应形成3-硝基酪氨酸衍生物加以改变。
组氨酸咪唑环的修饰可通过与碘乙酸衍生物的烷化作用或与二乙基焦碳酸盐的N-乙酯基化来完成。
在肽合成期间非天然氨基酸和衍生物的掺入包括但不限于使用4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻嗯基丙氨酸和/或氨基酸的D-同分异构体。
可使用交联剂例如用于稳定3D构象，可使用同型双官能交联剂如具有(CH2)n间隔基团(n＝1-6)的双官能亚胺酯，戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及通常含氨基反应基如N-羟基琥珀酰亚胺以及另一种基团特异性反应基如马来酰亚胺或二硫代基(SH)或碳化二亚胺(COOH)的异型双官能试剂。另外，通过如Cα和Nα-甲基氨基酸的掺入，氨基酸的Cα和Cβ原子之间双键的导入，以及经导入共价键如在N和C末端之间，两侧链之间或一侧链与N或C末端之间形成酰胺键后环肽或类似物的形成，肽可被构象限制。
因此，本发明提供了一种位于杂交分子内的例如来自链球菌M蛋白的构象表位，如此的表位处于功能构象状态从而具有免疫学相互作用能力。
因此，本发明涉及一种在抗原肽、多肽或蛋白质中确定最小表位的方法，所述方法包括确定所述肽、多肽或蛋白质或其携带推定表位的部分的天然构象；制备所述肽、多肽或蛋白质的肽片段；将所述肽片段插入或置入衍生自或基于与所述的第一次提及的肽、多肽或蛋白质具有相似天然构象的另一种肽、多肽或蛋白质的第二种肽中，使得肽片段中推定的表位存在于能够进行免疫学相互作用的构象中；然后筛选所述肽片段的免疫学相互作用。
根据本发明的一个相关方面，提供了一种在被抗体识别的肽、多肽或蛋白质中定位两亲性螺旋区域的方法，所述方法包括确定所述肽、多肽或蛋白质或其携带推定表位的部分的天然构象；制备所述肽、多肽或蛋白质的肽片段；将所述肽片段插入或置入衍生自或基于与所述的第一次提及的肽、多肽或蛋白质具有相似天然构象的另一种肽、多肽或蛋白质的第二种肽中，使得肽片段中推定的表位存在于能够进行免疫学相互作用的构象中；然后筛选所述肽片段的免疫学相互作用。
被抗体识别的两亲性螺旋可成为合适的疫苗候选者。两亲性螺旋是蛋白质中一较普遍的结构组成且可以是表面暴露的(抗原性)或在与其它蛋白质的相互作用中起作用。螺旋卷曲螺旋是更复杂的螺旋结构，其相互作用形成同源二聚体、三聚体和四聚体。
“免疫学相互作用”是指任何形式的与免疫细胞或免疫效应细胞的相互作用和/或任何形式的免疫应答。通常免疫学相互作用的测定是通过抗体与肽片段的结合或相互作用能力测得。但免疫学相互作用也包括测定细胞免疫应答。
确定能提供免疫学相互作用且治疗时能诱导保护性免疫应答的最小表位对治疗剂及诊断剂的开发是很重要的。由此本发明的嵌合肽及其生产方法特别适用于疫苗的开发。再者，在其例证及优选的形式中，本发明提供了一种用于抗GAS疫苗内的嵌合肽。但需理解的是，本发明包括用于诱导保护性免疫应答以抗包括细菌、寄生虫、酵母、真菌及原生动物等的致病微生物或抗如逆转录病毒、流感病毒、肝炎病毒及免疫缺陷病毒尤其是HIV等的病毒的嵌合肽。
因此，根据本发明的一个优选方面，提供了用于抗A类链球菌的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一种至少有三个氨基酸选自以下序列的第一个氨基酸序列，
LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO：1)其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自链球菌M蛋白的构象B细胞表位，其中所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。疫苗还可包括一种佐剂和/或其它免疫刺激分子。优选地，第二个氨基酸序列形成一衍生自GCN4的构架肽。可如以上所述筛选来自SEQ ID NO：1的相邻的或不相邻的氨基酸。
根据本发明的又一方面，涉及一种用于对M蛋白的体液免疫但很少与心肌组织起交叉反应的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，所述的嵌合肽包括携带至少一个来自M蛋白的B细胞表位的第一个氨基酸序列，其中与所述B细胞表位反应的抗体与心肌组织的反应性非常小，所述第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
该疫苗可包括一种单肽类型或含不同或相似表位的一系列肽。另外，或者包括提供多表位的一种单一多肽。后一类型的疫苗可称作多价疫苗。多表位包括两个或多个重复表位。
本领域人员已知疫苗的组成且可参考Remington′s Pharmaceutical Sciences，17版，Mack Publishing Co.，Easton，宾夕法尼亚州，美国。
因此，本发明涉及一种药物组合物或疫苗组合物，其包括发挥体液免疫有效量的一种嵌合肽(如上所述)或其衍生物，类似物或同源物和/或其与其它活性分子的结合物，及一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。当依不同情况而给予一定量时，含嵌合肽的药物组合物的活性成分例如在抗体对链球菌M蛋白的作用过程中呈现优异的治疗效用，但所述抗体与心肌组织的反应性为最低程度。例如给药量可以为每天每公斤体重0.5μg至20mg。可调整剂量模式以提供最适度的治疗应答。例如，将一日剂量分数次给予或根据治疗情况要求均匀减少剂量。该活性化合物可依合适方式给予，如口服、静脉(当溶于水时)、肌肉、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(如使用慢释放分子)等方式。根据不同给药途径，包括嵌合肽的活性成分可以被某一物质包覆以保护所述成分不受酶、酸及其它使所述成分失活的因素的作用。例如，嵌合肽的低亲脂性使其在胃肠道被能裂解肽键的酶破坏及在胃中被酸水解。为了经肠道给予嵌合肽，其将被某一物质包覆或与某一物质同时给予以防止其失活。例如，可将嵌合肽含在佐剂内给予，与酶抑制剂一起给予，以脂质体给予。应用的佐剂是最广泛意义的，并包括任何免疫刺激化合物如干扰素。本文涉及的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活化剂如聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFP)和trasylol。脂质体包括水包油包水乳液及常规脂质体。
也可经非肠道或腹膜内给予活性化合物。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物及在油中制备分散体系。在一般贮存及使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射用的药物形式包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散体系和为临时制备无菌注射溶液或分散体系的无菌粉末。在所有情况下，药物形式必须是无菌的且必须是易于注射的流体。在生产和贮存条件下其必须是稳定的且必须加以保护以抗微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是一种溶剂或分散介质，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇及类似物)及其合适的混合物和植物油。适当的流动性可通过如使用包衣如licithin，保持分散体系所需合适粒径，及使用superfactant来加以保持。防止微生物的作用可使用各种抗细菌及抗真菌制剂如对羟苯甲酸酯，氯代丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等。在许多情况下，优选包括等渗剂如糖、氯化钠。延长注射用组合物的吸收可通过在组合物中使用延缓吸收制剂如单硬脂酸铝和明胶来进行。
无菌注射溶液的制备是将所需量的活性化合物与上述列举的所需的各种其它成分在适当溶剂中混合然后经过滤灭菌。通常制备分散体系是将各种无菌活性成分混入含有基本分散介质和上述列举的所需的其它成分的无菌赋形剂中。至于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从前述无菌过滤的溶液中生产出活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
当嵌合肽被如上述方法适当保护，如使用惰性稀释剂或一种可吸收食用载体，或被包含入硬或软壳胶囊中，或被压缩成药片，或直接与患者食物混合时，该活性化合物可经口服给予。在口服治疗时，活性化合物可与赋形剂混合并以可咽下的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬胶体、糖浆、干糊片(wafer)等类型使用。如此的组合物及制备物需含至少1％(重量)的活性化合物。该组合物及制备物的百分比是可变化的，较适于在每单位大约5-80％(重量)之间。在这种治疗有用的组合物中活性化合物的量是能得到合适剂量的量。制备本发明的优选组合物或制备物以使每口服剂量单位形式含有大约0.1μg至2000mg的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下物质：粘合剂如黄蓍胶、金合欢胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；分解剂如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；增甜剂如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味品。当剂量单位形式是胶囊时，其除了上述各类物质外还可含有一种液体载体。有许多物质可作为剂量单位的包衣或改变其物理结构。例如，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或两者一起包覆。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为增甜剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和丙酯，染料及调味剂如樱桃或桔味调味剂。当然用于制备任何剂量单位形式的任何物质必须是药物纯的并且在使用量内是确实无毒的。另外可将活性化合物混入缓释的制备物或配制物中。
本文所用的“药用合适载体和/或稀释剂”包括任何及所有溶剂，分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌制剂、等渗剂及延缓吸收制剂等。本领域人员已熟知这些介质和制剂在药用活性物质中的使用。除了目前一些常规介质或制剂不能与活性成分相容之外，将其用在治疗组合物中是可行的。补加的活性成分也可混入到组合物中。
配制非肠道的剂量单位形式的组合物对便于服用及剂量的均匀是很有益处的。本文中“剂量单位形式”指的是适于作为被治疗哺乳动物实验对象的单位剂量的物理分离的单位，每单位含有预定量的计算上与所需药用载体结合能产生所需治疗效果的活性物质。本发明的新剂量单位形式的用量规格按照并直接根据(a)该活性物质的独特特点及需获得的特定治疗效果，(b)本领域中复合该活性物质以治疗损害身体健康的的活体的疾病的限制因素而定。
上文已描述了将主要活性成分以有效量与适当药用载体复合成单位剂量形式，以方便并有效地给药。单位剂量形式可含有0.5μg至2000mg的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物一般在每毫升载体中为约0.5μg-2000mg。组合物含有增补的活性成分时，剂量的确定则参考通常剂量及所述成分的给药方式。
根据本发明的又一方面，提供了一种嵌合肽的抗体，该抗体可以是单克隆或多克隆的并可以选自M蛋白的天然存在抗体或是特别针对嵌合肽而产生的。对于后者，肽则首先需与一载体分子偶联。本发明的抗体和/或嵌合肽特别适用于免疫疗法和进行预防接种，也可用作感染的诊断工具或用作预防接种进程或疗程监控的诊断工具。
例如，嵌合肽可用于筛选M蛋白的天然存在抗体。或者，特异抗体能被用于筛选M蛋白。本领域人员已熟知此分析技术，例如包括“夹心”分析及ELISA。
根据本发明的这一方面，嵌合肽尤其有用于筛选M蛋白的抗体，因而本发明提供了一种检测链球菌感染的诊断方法。或者，应用针对嵌合肽产生的抗体可直接从诸如血清、唾液、组织和组织提取物等的生物样品中筛选M蛋白。
据此，提供了一种诊断实验对象体内链球菌感染的方法，其包括在适于形成抗体-嵌合肽复合物的条件下，将来自所述实验对象的生物学样品与一种抗体结合有效量的嵌合肽接触一段时间，然后检测所述复合物。
在患者血清、组织、组织提取物或其它体液中M蛋白抗体的存在与否可应用许多免疫分析技术如美国专利4,016,043，4,424,279和4,018,653所述技术加以检测。这包括非竞争型的单位点或2位点分析或“夹心”分析，及传统的竞争结合分析。夹心分析是其中最实用及通用的分析，且尤其适用于本发明。夹心分析存在许多变化形式，其全包含在本发明内。简而言之，在一典型正向分析中，嵌合肽被固定在一固体基质上形成第一种复合物，将用于检测M蛋白抗体的样品与结合的分子接触。适当温育过一段时间，即足以形成一种嵌合肽-抗体的二级复合物的温育时间后，加入一种用能产生可检测信号的报道分子标记的免疫球蛋白抗体并温育，经过足够时间以形成嵌合肽-抗体-标记抗体的三级复合物。洗去任何未反应物，通过观察由报道分子产生的信号确定第一种抗体的存在与否。结果可以是只观察可见信号的定性分析或经与含已知量半抗原的对照样品比较测定的定量分析。正向分析的变化形式包括一种同时分析，其中同时将样品和标记的抗体加入到结合抗体；或一种反向分析，其中标记的抗体与样品先结合、温育然后同时加入到结合抗体。本领域技术人员熟知这些技术，一些细微变化的可能性是显而易见的，可采纳类似方法检测M蛋白。上述应用的抗体可以是单克隆或多克隆的。
固体基质代表性的是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管状、珠状、盘状或微板或其它任何适于进行免疫分析的表面。本领域熟知结合方法且通常包括交联共价结合或将分子物理吸附到不溶载体。
本说明书中所用的“报道分子”指的是一种通过其化学性质产生一种可分析鉴定的信号以对与抗原结合的抗体进行检测的分子。检测方法可以是定性或定量分析。该类型分析中最常用的报道分子是酶或者是带荧光或放射核素(即放射性同位素)的分子。在酶免疫分析中，酶与第二抗体的缀合一般用戊二醛或高碘酸法。然而正如所公知的，有许多易于本领域技术人员应用的不同的缀合技术。常使用的酶包括辣根过氧化物酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，及碱性磷酸酶等。随酶的不同而使用的底物通常选用通过相应酶水解可产生可检测的颜色变化的那些底物。也可使用产生荧光产物的荧光底物。
或者，荧光化合物如荧光素和碱性蕊香可与抗体化学缀合而不改变其结合能力。当用特殊波长的光照射活化时，荧光染料标记的抗体吸收光能，诱导分子的激发态，随后发出可用光学显微镜目视检测的特殊颜色的光。在EIA方法中，将荧光标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合，在洗去未结合试剂后，将余下的三元复合物在适当波长光线下曝光，观测到的荧光代表所关注的半抗原的存在。免疫荧光与EIA技术都是本领域十分认同的技术且是本发明尤其优选的方法。但其它诸如放射性同位素，化学发光或生物发光分子等的报道分子也可使用。如何改变程序以适应所需目的对本领域技术人员是显而易见的。如上所述的方法可用于标记嵌合肽并直接用于检测M蛋白抗体这一点也是显而易见的。
根据本发明的又一方面，还涉及本文所述嵌合肽在制备用作抗GAS的疫苗的药物中的应用。
在相关实施例中，本发明提供了一种包括本文所述嵌合肽用作抗GAS的疫苗的制剂。
本发明进一步参考以下非限制性附图及实施例加以阐述。
图1：嵌合肽的氨基酸序列，所有序列均参考示于下边的α-螺旋卷曲螺旋七元重复序列(a-b-c-d-e-f-e-g)。A：衍生自α-螺旋卷曲螺旋GCN4亮氨酸拉链肽的模型GCN4肽序列(O′Shea et al.，1991)。B：与推定的卷曲螺旋七元重复序列对比的链球菌M蛋白肽p145的序列(Pruksakorn et al.，1992)。C：嵌合J肽(J1-9)的序列，黑体字所示为p145肽的重叠12mer片段，划线处所示为保守的氨基酸残基置换。D：对照GCN4模型肽Jcon(G)的序列。
图2：抗p145小鼠血清对J肽的反应性，绘制的反应性是在405nm波长的平均吸收值。血清以1∶100稀释并示出代表样品，血清与白喉毒素(DT)缀合。NMS：正常鼠血清
图3：高效价的抗p145人血清对J肽的反应性。用平均吸收值(405nm)与1∶100稀释的血清作图。示出代表性样品(GBD，MT，MY，FL，TB，MG)。NHS-正常人血清。
图4是在α-螺旋结构的诱导溶剂50％的三氟乙醇(TFE)中的肽的圆二色谱图。A，JI1；B，J2；C，Jcon；D，p145。θ，摩尔椭率。在水溶液中肽不能显示出α-螺旋构型。还测试了肽J1，J3及J4，其呈与J2相似的曲线。
图5是用ELISA定位的天然表位示意图。用C.elegans unc-15的合成肽片段(表7B)包被微滴定板(2μg/孔)，与单克隆抗体(mAb)NE1-6B2温育并用抗小鼠抗体检测结合抗体，在450nm经OPD比色分析。
图6是用ELISA定位的嵌合表位示意图。用嵌入模型螺旋肽中的C.elegans unc-15的重叠片段(表8)包被微滴定板(2μg/孔)，与mAb NE1-6B2温育并用抗小鼠抗体检测结合抗体，在450nm用OPD比色分析。肽bd10，bd11，bd18，bd23，bd14，bd15以5个残基偏移。肽bc17-bc25以1个残基偏移。对照组肽av85、av86及ba48只包含模型螺旋肽残基。
图7A是由ELISA定位的嵌合最小表位示意图。用嵌人模型螺旋肽中的C.elegans unc-15的截短片段(表9A)包被微滴定板(2μg/孔)，与mAb NE1-6B2温育并用抗小鼠抗体检测结合抗体，在450nm用OPD比色分析。肽c1仅由15mer表位组成。对照组肽av85，av86及ba48只含模型螺旋肽残基。
图7B是由ELISA定位的嵌合表位取代图。用衍生自bc20且每个残基依次由保守置换物取代的嵌合肽(表9B)包被微滴定板(2μg/孔)，与mAb NE1-6B2温育并用抗小鼠抗体检测结合抗体，在450nm用OPD比色分析。
图8A是由MAb NE1-6B2识别的C elegans  unc-15表位的图。推定的七元重复位置a和d在天然unc-15序列之上示出。黑体字为由mAb NE1-6B2识别的表位。
图8B是示出极性面的每圈为3.5个残基的C.elegans unc-15螺旋的柱面网图，螺旋方向由左至右，阴影残基与mAb NE1-6B2相互作用；实线圆代表关键残基，虚线圆代表次关键残基。
图9是抗体对嵌合肽应答的ELISA分析图。用嵌合肽bc20，ba39，bd1，bd2及肽c1包被微滴定板(2μg/孔)，与小鼠抗bd1或抗bd2抗血清，或放血前(pre-bleed)血清温育。结合抗体用抗小鼠抗体检测并在450nm用OPD比色分析。
以下以单字母及三字母缩写代表氨基酸残基氨基酸             三字母缩写          单字母代码丙氨酸                Ala                  A精氨酸                Arg                  R天冬酰胺              Asp                  N天冬氨酸              Asp                  D半胱氨酸              Cys                  C谷氨酰胺              Gln                  Q谷氨酸                Glu                  E甘氨酸                Gly                  G组氨酸                His                  H异亮氨酸              Ile                  I亮氨酸                Leu                  L赖氨酸                Lys                  K甲硫氨酸              Met                  M苯丙氨酸              Phe                  F脯氨酸                Pro                  P丝氨酸                Ser                  S苏氨酸                Thr                  T色氨酸                Trp                  W酪氨酸                Tyr                  Y缬氨酸                Val                  V任何残基              Xaa                  X
实施例1  化学药品
以下实施例中使用的所有化学药品及溶剂除另有说明外都是分析试剂级。聚苯乙烯(1％v/v二乙烯苯)对甲基二苯甲基胺盐酸树脂(0.81meq/g或树脂取代物)，叔丁氧羰基(t-Boc)氨基酸，1，3-二异丙基碳化二亚胺(DIC)，N-羟基苯并三唑(HOBT)，三氟乙酸(TFA)购置于Auspep(澳大利亚)。
实施例2  试验对象
研究的是土著患者，其中一些患有RF/RHD或过去有患病史，是澳大利亚北部的链球菌流行病区的居民。已发现90％以上的这些试验对象具有天然存在的抗p145抗体(Pruksakorn et al.，1994a)。将供体血清在-20℃下贮存直至使用。
实施例3  小鼠
B1O.BR小鼠(Animal Resources Centre，Willetton，西澳大利亚)已显示出能对p145应答而被用于免疫研究。
实施例4  肽合成
肽的合成是应用Houghten(1985)的同时多重肽合成的“茶叶袋”法利用人工固相技术合成的。起始树脂是对甲基二苯甲基胺盐酸树脂，并使用常规N-叔丁氧羰基(t-Boc)化学法(Merrifield，1963)。所有氨基酸基团在α氨基位用t-Boc基团保护，使用了以下侧链保护基团：苄基酯(Glu，Asp)、2-氯苄氧基羰基(Lys)，苄基(Ser)，甲苯磺酰(Arg)。
氨基酸偶联用在二氯甲烷中的1，3-二异丙基碳化二亚胺进行，且用55％(v/v)TFA/二氯甲烷在每个循环中除去t-Boc基团。N-羟基苯并三唑用在Asn和Glu的偶联中。经用氟化氢处理使肽从树脂中分裂出，用二乙醚使其沉淀且从10％(v/v)醋酸中冻干。
粗肽的提纯是在一个半制备C18反相HPLC柱(Biorad)中利用从2％(v/v)乙腈水溶液至100％(v/v)乙腈(各溶液中均含0.1％(v/v)TFA)的线性梯度进行。提纯的肽经反相HPLC及flight质谱的激光解吸时间检测是均匀的。
根据本发明合成的肽示于表1A，1B和1C。肽144，145和146是包含在M蛋白的保守的C-末端区内的重叠肽。Jcon是基于酵母蛋白GCN4的七元重复序列的模型肽。肽J1-J9是基于Jcon肽的杂交肽，p145.145.1-145.5和JI1-JI9代表p145序列中较短的序列。肽169和171分别衍生自人心肌肌球蛋白(Liew et al.，1990)和人骨骼肌肌球蛋白(Saez et al.，1986)，且显示出这些蛋白质与p145之间的最高同源性。
实施例5  T细胞增殖分析
为致敏小鼠T细胞，在动物尾根用30μg乳化的肽接种，在第8天取出导流淋巴结细胞并如前所述用抗原进行体外刺激(Pruksakorn etal 1994b)。4天后，用0.5μCi的3H-胸苷脉冲培养物以检测增殖程度。淋巴细胞的活化通过估算刺激指数[SI]加以测定(刺激指数：有特异肽存在的增殖/无特异肽存在的增殖)。
人肽特异性T细胞增殖的检测是通过用肽(或无肽对照)培养人外周血淋巴细胞(PBL)并在6天后估算淋巴细胞的增殖(如Pruksakorn et al，1994b所述)而进行。淋巴细胞的活化测定以同上述对小鼠的分析方式进行。
实施例6  蛋白质序列的对比
使用GCG(Wisconsin)程序BESTFIT检索人心肌肌球蛋白的蛋白质序列和人骨骼肌肌球蛋白的蛋白质序列与p145的20个氨基酸序列之间的同源性。与p145同源的区域用肽169和肽171代表(表1C)。
实施例7  圆二色谱(CD)
这些是在室温下用Aviv 62DS CD分光光度计记录下来的(Lakewood，NJ)。在10mM磷酸钠缓冲液pH＝7.0，50％(v/v)三氟乙醇中的肽浓度为20mM或40mM。以1nm间隔从250nm至190nm收集数据。所报道的椭率是平均残基椭率[Θ]。
实施例8  小鼠抗血清的生产
将B1O.BR和B1O.D2小鼠在尾根皮下接种(Pruksakorn et al.，1992)。给予的50μl总容量包含30μg溶于PBS且在完全Freurd′s佐剂中乳化的肽。将肽145.1-145.5在接种之前利用戊二醛固定法与白喉毒素(DT)缀合，而所有其它的肽均是未缀合给予。用30μgPBS中的缀合肽加强免疫小鼠。
实施例9  ELISA
ELISA方法已在前面阐述(Pruksakorn et al.，1992；1994a)。除了肽145.1-145.5和JI1-JI9以1μg/ml浓度包被外，将肽以0.5μg/ml浓度包被。
计算出的小鼠和人血清效价如果超过正常小鼠血清平均值或人血清背景(无血清)三个标准偏差则认为是显著的。肽特异性抗体的耗竭分析是将人血清在肽(p145)包被的板中温育直至特异结合几乎完全耗尽。作为阴性对照，将血清在不相关的血吸虫肽包被板中进行类似温育。然后将缺乏p145的血清或缺乏血吸虫的血清转移至用试验肽包被的板中以检测针对试验肽的抗体是否存在。所有反应都使用OPD底物试剂盒(Sigma Chemical Co)显色并在450nm读取吸收值。
实施例10  调理作用的肽抑制
将人血清在60℃加热15分钟使其失活。然后在加入GAS和供体新鲜全肝素化血之前将血清用100μg肽或PBS温育30分钟。通过比较含肽及不含肽生长的集落形成单位并以与未加入血清的对照为基础计算出抑制百分比。
实施例11  嵌合肽设计原理
如果已知表位存在于一特定蛋白质结构构象如α-螺旋卷曲螺旋中，那么可合成模型肽以折叠成该构象，该肽将成为构架肽，已研究出折叠成α-螺旋卷曲螺旋的模型肽。在平行两股卷曲螺旋基序的设计中，重要的是一些总的考虑原则(Cohen and Parry，1990)。a和d位有大的非极性残基，b、c和f位一般是极性及带电荷的，e和g位通常是有利于链间离子相互作用(如Glu/Lys的酸/碱配对)。也注意到当a和d位被V和L或I和L占据时，有利于一种卷曲螺旋型二聚体，而I和I有利于三聚体的结构，L和I有利于四聚体相互作用(Harbury et al.，1994)。
一种α-螺旋卷曲螺旋模型肽是基于对应于GCN4亮氨酸拉链的肽的结构设计的(O′Shea et al.，1989；1991)。该肽有一个7个残基的亮氨酸重复(在d位)和在a位的共有Val。第一个七元物含有如下序列：
MKQLEDK(SEQ ID No：3)其具有一些发现于稳定的卷曲螺旋型七元重复序列中的特征。这些特征包括在e和g位的酸/碱配对(Gly/Lys)，在b、c和f位的极性基团(与Lupas et al(1991)的预期相一致)。一种模型七元重复序列是从如下GCN4亮氨酸拉链肽的共有特征衍生的：
VKQLEDK(SEQ ID NO：2)当其重复时将给出具有形成α-螺旋卷曲螺旋能力的模型肽(VKQLEDK)n。这种由4个七元重复组成的模型肽表示为(GCN4)4[图1A]。然后将构象表位的重叠片段嵌入卷曲螺旋模型肽中与七元重复相接，以提供一种嵌合肽。
实施例12  链球菌M蛋白肽
如前所述制备链球菌M蛋白肽p145(Pruksakorn et al.，1992，国际专利申请PCT/AU93/00131[WO93/21220])及截短的片段145.1，145.2，145.4，145.5，145.12，145.13，145.14 (Pruksakorn，1994)，示于表1A和1B。
分析链球菌M蛋白在肽p145区域的序列中的卷曲螺旋七元重复序列并排出推定的七元重复序列的a-g位置(图1B)。将肽p145分成9个有1个残基重叠的12mer肽，经加入侧翼GCN4肽，将其嵌入(GCN4)4构架肽以形成9个J嵌合肽(J1-J9)，示于图1C。每当在GCN4模型肽和p145序列中发现相同的残基，则将保守氨基酸取代掺入到J肽中。基于图1A所示的GCN4模型肽合成的对照肽(Jcon)也含有所有这些保守氨基酸取代(图1D)。
经HPLC提纯嵌合肽J1-4和对照肽Jcon。肽J5-9合成后即使用。
实施例13  肽p145中的优势免疫表位是构象性的
最初尝试使用位于p145中的重叠8mer和12mer肽(肽145.1-145.5，JI1，JI5，JI7 (图1A，1B)去定位p145中的最小表位。尽管用2个较短的肽(145.1，145.5)与白喉毒素缀合能在小鼠体内产生一种p145特异性免疫应答，但小鼠抗p145抗血清即不能识别重叠的p145(表1C)也不能识别p145内的任何较短的肽(表2)。将免疫的肽与白喉毒素缀合或不缀合结果是相似的。尽管90％以上生活在GAS高发区的人具有抗p145的抗体，但大多数对p145有高效价(＞6400)的人群血清不能与较短的肽(JI1-JI9)反应(表1B，表3)。这些结果表明尽管p145内有一或多个线性表位，但也有一个优势构象表位，其在p145免疫接种后或天然接触GAS后能被识别。圆二色谱显示尽管p145有螺旋倾向(在50％TFE中)，但较短的12mer肽(JI1：LRRDLDASREAK[SEQ ID No：23])没有该倾向(图4)，进一步提示由p145表达的优势免疫表位是构象的。
实施例14  定位构象表位
随后开发的一个策略是使用一种带有疏水的、螺旋促进残基的也呈现与M蛋白相似的七元重复周期性的不相关蛋白质，并将来自p145的序列嵌入该肽中。所选的肽基于酵母的DNA结合蛋白GCN4中的亮氨酸拉链基序(O′Shea et al.，1991)。GCN4中的七元重复的共有序列是Val-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys，基于该重复序列设计的一个28氨基酸肽带有少量取代并命名为肽“Jcon”(表1B)。肽p145序列的一个12氨基酸窗被插入Jcon肽中，以便能保护任何潜在的螺旋结构。一次将窗口位移一个残基以得到代表全部p145序列的9个肽(J1-J9)。还合成了对应的12氨基酸插入序列(JI1-JI9)以供对照(表1B)。
p145小鼠抗体与J嵌合肽呈系列反应性(图2)。一些J肽(即J7、J8)含有如上述同样的12mer序列(分别为145.12，145.13，145.14)，但却存在于GCN4构架中(即J1，J5，J7)。一些血清与代表p145N-末端残基的J肽反应(即J1，J2)，一些与C-末端残基反应，一些与两者都反应(即J1，J2，J4，J7，J8)(图2)。没有血清与Jcon序列反应。
含高效价145抗体的人血清显示出对J肽相似的特异性谱带，从而给出肽特异性抗体的“指纹”。所有人血清都与J2反应(图3)。有2种血清与所有J肽及Jcon肽反应。在这些情况下，对J肽的特异性应答也许被与GCN4类似结构的交叉反应所掩盖。所有其余的人血清都不能与G肽反应，指示对p145序列的特异性应答。
然后检验生活在链球菌高发区的人血清及用p145接种后的小鼠血清与这些嵌合肽的结合能力。检验了23个对p145的效价超过6,400的人血清(表3)。19个这些血清中的抗体可以以相似的高效价与一种或多种嵌合肽结合，但却不能识别任何重叠8mer肽145.1-145.5。有4个血清以＞3,200的效价与被检验的9种重叠12mer肽(JI1-JI9)中的一个(JI3)反应(表3)。被检验的不含抗p145抗体的11个血清没有一个含有抗任何嵌合肽的抗体，提示与p145反应的抗体也与嵌合肽反应。最通常被抗p145+ve抗血清识别的嵌合肽是J2，对J1和J3有一些识别(表3)。为证实p145特异抗体可识别J2，进行p145吸收研究，并且可以证明p145耗竭的人血清不能与原来能识别的J2嵌合肽结合(表4)。因此，尽管对一些个体(识别J2但不识别J1或J3)来说核心残基是RDLDASREAK[SEQ ID NO：25]，但识别的核心残基由RRDLDASREAKK[SEQ ID NO：24]组成。这一长度相当于一个α螺旋的3-3.3圈。抗体足迹易于识别由肽的螺旋折叠带到一起的不连续残基。圆二色谱表明嵌合肽J1-J4在50％TFE中有形成螺旋结构的倾向(图4)
由于肌球蛋白也是卷曲螺旋状分子并且衍生自人肌肉的肽与p145有相似的序列(表1B)，所以这些人血清具有识别交叉反应表位的能力。只有两个血清与这些肽(169和171)反应(表3)，但识别p145和J2以及p169和p171的抗体之间很少交叉反应。
实施例15  保持构象的肽能结合调整抗体
为检测特异于肽J2的人抗体是否介导调理作用，研究了游离J2肽能否通过人抗血清抑制调理作用。该分析用于证实p145本身是人调理抗体的靶。将J2(100μg/ml)加入含高效价的p145抗体的血清中以检测其对调理作用的影响，发现其通过三个含J2抗体的血清抑制调理作用(表5)，而不含J2抗体的血清不能抑制。由非链球菌序列拷贝的一种无关20mer肽不能抑制调理作用。
实施例16  肽145上的T细胞表位能与B细胞表位区分开
为检测T细胞是否能识别与关键的抗体结合肽相同的肽区域，将应答小鼠B10.BR用p145接种并用p145，J2和JI2刺激导流淋巴结细胞。结果对J2和JI2的识别明显较少(表6)。同样也试验了来自21个RHD原生患者及8个原生实验对象的外周血T细胞对J2肽的应答。对照组经检测未有对肽的应答也未有对J2肽的应答。
实施例17  抗p145，J2和J3的人抗体在人嗜中性白细胞存在下能调理A类链球菌
p145抗体用带多拷贝p145的层析柱亲和纯化。然后将A蛋白纯化的抗体经过层析柱，洗脱p145特异性抗体。在经过层析柱之前。识别p145和破伤风毒素的抗体存在于免疫球蛋白制备物中。经过层析柱后，p145抗体仍存在，但破伤风毒素抗体未再检测出。然后将这些抗体与同样数量的不与p145反应的人抗体对照用于调理作用分析。如表10所示，与对照免疫球蛋白相比，纯化的p145抗体能减少58-94％(平均80％)的A类链球菌菌落数。
然后将各种合成肽加放到这些纯化的抗体中并检测其对调理作用的影响(表11)。使用的肽是p145，J2，J7和拷贝血吸虫序列的一非特异性肽。与非特异性肽相比，游离p145能抑制73-88％(平均83％)的调理作用，游离J2能抑制89-93％(平均92％)调理作用，J7能抑制82-86％(平均84％)调理作用。这些数据表明特异于p145，J2和J7的人抗体能调理A类链球菌。
实施例18
为举例说明定位α-螺旋卷曲螺旋型蛋白质内表位的方法，详细研究了C.aenorhabditis elegans副肌球蛋白内的一个区域。与其它含卷曲螺旋结构的蛋白一样，线虫副肌球蛋白也含有七个残基周期重复，提示该分子大部分处于卷曲螺旋构象。副肌球蛋白是许多无脊椎动物粗肌丝的核心蛋白，其在C.elegans内由单基因unc-15编码(Waterston et al.，1977)。一些une-15突变体具有改变的表型，导致产生结构高度破坏的肌肉。其中之一等位基因e1215显示具有弱的不协调表型，对该基因的分析表明一个单氨基酸809Q取代了R(Gengyo-Ando and Kagawa，1991)。由单克隆抗体(mAb)NE1-6B2(其不能与e1215突变体的副肌球蛋白反应)识别的表位被定位于该点突变。
所使用的方法是使用衍生自α-螺旋卷曲螺旋构象表位的重叠肽并将这些肽嵌入衍生自一完全无关的具有相似天然构象的蛋白质的螺旋型侧翼肽之间。测试所得嵌合肽的免疫学活性即抗原性(mAb的识别)或免疫原性(适当抗体应答的产生)。在C.elegans副肌球蛋白une-15的情况下，结构被认为是α-螺旋卷曲螺旋型的且此构象可能对由mAb识别的表位的最佳免疫应答是必需的。一系列基于unc-15的嵌合肽使得能精确定位由Mab NE1-6B2识别的最小B细胞表位。这一方法能用来定位构象表位及设计最小表位用作疫苗候选者。
(i)嵌合肽的设计原理
如果已知表位存在于一特定蛋白质结构构象如α-螺旋卷曲螺旋中，那么可合成模型肽以折叠成该构象，该肽将成为构架肽，已研究出折叠成α-螺旋卷曲螺旋的模型肽。在平行两股卷曲螺旋基序(a-b-c-d-e-f-g)n的设计中，重要的是一些总的考虑原则(Cohen and Parry，1990)。a和d位有大的非极性残基，b、c和f位一般是极性及带电荷的，e和g位通常是有利于链间离子相互作用(如Glu/Lys的酸/碱配对)。也注意到当a和d位被V和L或I和L占据时，有利于一种卷曲螺旋型二聚体，而I和I有利于三聚体的形成，L和I有利于四聚体相互作用(Harburyet al.，1994)。
一种α-螺旋卷曲螺旋模型肽是基于对应于GCN4亮氨酸拉链的肽的结构设计的(O′Shea et al.，1989；1991)。该肽有一个7个残基的亮氨酸重复(在d位)和在a位的共有Val。第一个七元物含有如下序列：MKQLEDK(SEQ ID No：3)，其具有一些发现于稳定的卷曲螺旋型七元重复序列中的特征。这些特征包括在e和g位的酸/碱配对(Gly/Lys)，在b、c和f位的极性基团。一种模型七元重复序列是从如下GCN4亮氨酸拉链肽的共有特征衍生的：VKQLEDK(SEQ ID NO：2)，当其重复时将给出具有形成α-螺旋卷曲螺旋能力的模型肽(VKQLEDK)n。构象表位的重叠片段可以嵌入卷曲螺旋模型肽以提供一种嵌合肽。
(ii)unc-15重叠片段的天然肽表位定位
分析C.elegans unc-15副肌球蛋白的被mAb NE1-6B2识别的表位区的序列是否有卷曲螺旋型七元重复序列并给出推定的七元物a-g位置(表7A)。
在最初试图定位unc-15蛋白中的mAb NE1-6B2表位中，合成了位移1个氨基酸残基的重叠21mer肽(表7B)，并经ELISA分析。ba39肽具有最高ELISA反应性，提示21mer肽的长度足以用于表位的识别。单克隆抗体反应性被限于ba37至c9肽(图5)。mAb对ba36肽的阴性反应性说明了表位靠近蛋白质C末端的程度并证实表位中需要809Q残基(Gengyo-Ando and Kagawa，1991)。随着肽从N-末端的截短，抗体反应性降低，肽c9仅微弱识别，提示最小表位位于肽ba37和c8的重叠之间，即14mer肽，ADRLTEKLNIQKRQ[SEQ ID NO：26]。然而发现肽ba39，一种较长的21mer肽MAQDTADRLTEKLNIQKRQLS[SEQ ID NO：43]的反应性最大，其被认为是最佳天然表位。
(iii)unc-15的嵌合肽表位定位
将unc-15蛋白含mAb NE1-6B2表位的区域分成6个位移5个残基的15mer肽，经加入六聚体螺旋状侧翼肽，将其嵌入α-螺旋卷曲螺旋型构架以形成嵌合肽bd10，bd11，bc18，bc23，bd14和bd15(表8A)。15个残基的滑动窗含有α-螺旋的超过4个完整圈(每圈3.5个残基)。肽bc18，bc23和bd14含有必需残基809Q。螺旋型侧翼肽基于α-螺旋卷曲螺旋模型肽(VKOQLEDK)n，并与unc-15的卷曲螺旋蛋白七元重复周期一起加入框架中。一旦发现在螺旋型模型肽和unc-15序列中有相同残基时，将保守氨基酸取代掺入到嵌合肽中。这些置换物设计用于保证适当的螺旋卷曲螺旋状构象(Cohen and Parry，1990)。取代方法如下：a位，V→I(疏水残基，利于二聚体)；b位，K→R(相似荷电的官能团)；c位，Q→N(相同官能团)；d位，L→A(疏水性残基)；e位，E→Q(相似大小的残基)；f位，D→E(同样荷电的官能团)；g位，K→R(相似荷电的官能团)。所有这些替换残基通常均在卷曲螺旋型蛋白质中其各自的位置上发现(Lupas et al.，1991)。只有嵌合肽bc18在ELISA中被mAb NE1-6B2识别(图6)。该表位的粗略定位提示衍生自肽bd11和bc23的在790V和814E之间重叠的25mer肽含有该表位。基于(VKQLEDK)n模型肽和(VKQLEDK)3(肽ba48)的对照肽av85和av86不被mAb NE1-6132识别。
现在将unc-15蛋白分成位移1个残基的15mer肽以更精确地定位mAb NE1-6B2表位。同样，将每个片段嵌入螺旋型侧翼肽以形成嵌合肽，目录见表8B。获得bc20肽与mAb NE1-6B2的ELISA反应性最大(图6)。在除去嵌入嵌合肽中的unc-15肽的C末端的809Q残基(肽bc17)及N末端的798R残基(肽bc22)之后，活性最小。这表明最小表位位于798R和809Q残基之间，即12mer肽：RLTEKLNIQKRQ[SEQ ID NO：27]之间。该表位比经上述天然表位定位的表位短2个残基(图5)。
(iv)unc-15的嵌合肽最小表位定位
利用嵌合肽方法，将含在肽bc20内的最佳表位截短以更好地确定由mAb NE1-6B2识别的最小表位。合成的嵌合肽列于表9A。从嵌入表位的C末端截短(肽bd3，bd4)与从N末端截短(肽be39)一样都降低了ELISA反应性(图7A)。进一步从表位的N或C末端截短残基(肽bd5，bd6，c4，c5)是不行的。但含801E至811A残基的肽c6仍是ELISA反应性的。这样，尽管重叠片段表位定位提示RLTEKLNIQKRQ是最小表位，但截短定位表明在该区侧翼的残基797D，810L和811A是关键的。这确定了序列DRLTEKLNIQKRQLA(SEQID NO：95)是最小的最佳表位。另外，由最佳表位的797D至811A组成的15mer肽(肽c1)被识别的程度比嵌入嵌合肽bc20中的相同肽低。这强调了需要侧翼区以确保最大反应性的必要性。
在mAb NE1-6B2表位内为ELISA反应性所需的关键残基的定位通过单个残基的保守替换来完成。取代定位基于嵌合肽bc20(含最佳表位)，合成的肽列于表9B。根据以上模型肽的规则将螺旋构架残基用表位残基取代：a位V；b，K；c，Q；d，L；e，E；f，D；g，K。在构架肽和表位序列之间相同位置发现相同残基时，则将保守替换残基取代(见以上嵌合肽表位定位)。当取代分别是在肽be40，be43，be47，be50和be51中的残基798R，801E，805I.808R.和809Q中进行时，ELISA反应性测不到(图7B)。表位反应性的降低也在两种其它取代即在肽be39和be53中的取代797D和811A中发现。感兴趣的是，在802K(K-D)和810L(L→V)的取代可提高反应性。这些结果示于图8A。当含mAb NE1-6B2表位的unc-15序列绘成一种圆柱状网时(图8B)，所有关键残基均发现位于螺旋的亲水面。
(v)嵌合肽的免疫原性
用嵌合肽接种Quackcnbush小鼠以检测其诱导表位特异性抗体应答的能力。合成带有N-末端半胱氨酸残基的嵌合肽bc20并与白喉毒素通过MCS连接偶联(肽bd1，CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK[SEQ ID NO：28])。将小鼠用125μg当量的在Freund′s完全佐剂中乳化的与白喉毒素偶联的肽在腹膜内接种。四周后给予125μg当量的在Freund′s不完全佐剂中的肽-白喉毒素缀合物强化免疫。针对肽bd1产生的抗血清可识别肽bc20而不识别肽ba39或肽c1(图9)。而针对基于螺旋模型肽并具有适当氨基酸取代的对照嵌合肽(肽bd2，CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK)产生的抗血清可识别肽bc20而不识别ba39或c1肽。因此，针对嵌合肽bd1产生的抗体应答是针对仅在肽bc20和ba39中发现的构象表位。
本领域技术人员应理解本文所述的发明除了那些特别的描述外可做一些变动及修改，本发明包括所有如此变动及修改。本发明也包括本说明书中分别或集中所指或表明的步骤，特征，组合物及化合物，及两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
                       表1A
                p145的重叠合成片段肽                序列                      SEQ ID NO：
      337                                   356145       L R R D L D A S R E A K K Q V E K A L E                        1145.1     L R R D L D A S                                                4145.2         R D L D A S R E                                            5145.3             L D A S R E A K                                        6145.4                 A S R E A K K Q                                    7145.5                     R E A K K Q V E                                8145.12    L R R D L D A S R E A K                                        9145.13            L D A S R E A K K Q V E                               10145.14                A S R E A K K Q V E K A                           11重叠的肽代表A类链球菌M蛋白的p145区，氨基酸位置为337-356位。表1B合成肽
Figure C9519664400311
注：单字母氨基酸代码：A，丙氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；
G，甘氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；N，天冬酰胺；Q，谷氢酰胺；
R，精氨酸；S，丝氨酸；V，缬氨酸；黑体字残基代表M蛋白序列表1C合成肽
Figure C9519664400321
表2抗p145衍生肽的p145衍生肽抗血清的反应性注：B10.BR小鼠用所给免疫原接种，用未缀合的肽作为捕获抗原通过ELISA检测抗体，
血清稀释度为1∶100。
NMS：正常小鼠血清；DT，白喉毒素；ND，未进行，黑体数字表示ELISA测定的
O.D.比对照NMS血清高(平均值+3SD)
表3人血清对嵌合肽的特异性
Figure C9519664400341
+++，效价≥12800  ++，12800＞效价≥6400  +，.6400＞效价≥3200-，效价≤1600
                        表4
      用p145或血吸虫肽预温育后J2效价的变化
血清   温育前J2效价   用血吸虫肽吸收后J2效价   用p145吸收后J2效价
  Gumb   ＞12,800     6400     400
  TB   ＞12,800     3200     ＜400
  ME   ＞12,800     3200     400
  GW   ＞12,800     800     ＜400
注：将血清以1∶200稀释并在用p145或不相关的血吸虫肽包被的
ELISA平板上温育。从五轮依次耗竭中取血清并发现p145
特异性抗体效价每轮依次下降。然后将血清转移至用J2包被
的平板上并检测效价
                      表5
                   抗肽J2效价
  患者(病情) 抗pJ2效价    CFU1无肽    CFU肽J2   ％抑制
  JL(RHD)     12800     230     940   76
  NH(RHD)     6400     90     355   75
  ME(RHD)     6400     45     245   82
  注：1CFU，2个板的平均集落计数×稀释倍数
  M5 GAS培养物大小＝27.5
            表6衍生自用p145免疫接种的B10.BR小鼠的淋巴结细胞的刺激指数(S1)
刺激肽   刺激指数
 p145     29
 J2     7.8
 J12     6.45
 Tet tox(-ve对照)     0.69
 PPD(+ve对照)     22
注：用p145将小鼠免疫接种，并用抗原以在我们发现的
最佳浓度在体外攻击导流淋巴结细胞。对于合成肽，
使用的浓度为30μg/ml。
表7衍生自天然C.elegans unc-15的合成肽
Figure C9519664400371
推定的七元重复位置a和g在天然unc-15序列之上示出。根据Gengyo-Ando and Kagawa(1991)给氨基酸残基编号。必需的gln残基809 Q以黑体字表示
表8含C.elegans unc-15片段的合成嵌合肽天然肽片段以黑体字示出，螺旋型侧翼区以正常字示出，螺旋侧翼区保守替换以下划线示出。推定的七元重复位置a和d在嵌合肽序列之上示出
表9含C.elegans unc-15的截短的或取代的片段的合成嵌合肽天然肽片段以黑体字示出，螺旋型侧翼区以正常字体示出。下划线处为螺旋侧翼区内保守替换。推定的七元重复位置a和d在嵌合肽序列之上示出
表10
145亲和纯化的动物(对P145的效价) 平均CFU 非调理的供体IgG(对p145效价) 平均CFU CFU间的差异百分率，％ 总IgG效价
 P101(3200) 540  C1(＜100) 4880  89  3200
 P101(3200) 540  C2(＜100) 9000  94  3200
 P105(3200) 2040  C1(＜100) 4880  58  3200
 P105(3200) 2040  C2(＜100) 9000  77  3200
表11用亲和纯化的抗原生患者肽p145的抗体进行抗M5GAS的调理肽抑制分析
患者 有非特异性肽(NS)的平均CFU1 无肽(NP)的平均CFU     肽145     肽J2     肽J7
 平均CFUp145 ％12对MS ％13对MP 平均CFUpJ2 ％1对MS ％1对MP 平均CFUpJ7 ％1对MS ％1对MP
 A17(C)°  3050  3450  11400  73  70  42500  93  92  nt  nt  nt
 A101(OHD)t  940  540  7360  87  93  13800  93  96  6920  86  92
 A105(RHD)t  1120  2040  9400  88  76  10520  89  81  6200  82  67
 C1t  3790  4100  2440  ni  ni  3980  ni  ni  5600  32  27
 C1  5120  4880  3200  ni  ni  nt  nt  nt  nt  nt  nt
 C2t  4800  4000  3200  ni  ni  4600  ni  13  4400  ni  9
 C2  9690  9000  9840  8  9  nt  nt  nt  nt  nt  nt
表11(续)
患者  有非特异性肽(NS)的平均CFU1 无肽(NP)的平均CFU     ELISA效价
  p145   pJ2   pJ7   TT   总IgG
  A17(C)°   3050   3450   6400   3200   nt   ＜200   6400
  A101(OHD)t   940   540   3200   800   3200   ＜200   3200
  A105(RHD)t   1120   2040   3200   1600   3200   ＜200   3200
  C1t   3780   4100   400   ＜200   ＜200   ＞26500   6784000
  C1   5120   4880   ＜100   nt   nt   nt   3200
  C2t   4800   4000   800   400   400   ＞26500   1696000
  C2   9690   9000   ＜100   nt   nt   nt   3200
  1、CFU，2个板中的平均集落计数×稀释倍数；nt＝未测试
 M5GAS接种物大小实验＝73，M5GAS接种物大小实验+＝362、％NS：由平均CFU非特异性肽计算的杀菌力的抑制百分率ni＝没有抑制3、％1NP：由CFU无肽计算的抑制百分率
著录项目：
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                        序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(除美国外的国家)
昆士兰医学研究所
(美国)
库珀，JA；雷尔夫，WA；古德，MF；索尔AJ(ii)发明名称：嵌合肽及包含其的疫苗(iii)序列数目：94(iv)通讯地址：
(A)收信人：DAVIES COLLISON CAVE
(B)街道：1  LITTLE COLLINS STREET
(C)城市：墨尔本
(D)州：维多利亚州
(E)国家：澳大利亚
(F)邮编：3000(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PateneIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：1995年10月16日(vii)在先申请资料：
(A)申请号：PM8851
(B)申请日：1994年10月14日(vii)律师/代理人信息：
(A)姓名：HUGHESDR，E JOHN L
(B)案号/文档号：EJH/EK(ix)电讯信息：
(A)电话：+61392542777
(B)传真：+61392542770(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：20个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu1               5                   10                  15Lys Ala Leu Glu
        20(2)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：7个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys1               5(2)SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：7个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys1               5(2)SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser1               5(2)SEQ ID NO：5的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu1               5(2)SEQ ID NO：6的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys1               5(2)SEQ ID NO：7的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln1               5(2)SEQ ID NO：8的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：8个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu1               5(2)SEQ ID NO：9的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9Leu Arg Arg Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys1           5                   10(2)SEQ ID NO：10的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu1               5                   10(2)SEQ ID NO：11的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala1               5                   10(2)SEQ ID NO：12的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys1               5                   10                  15Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：13的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser1                5                  10                  15Arg Glu Ala Lys Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：14的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Ala Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg1               5               10                      15Glu Ala Lys Lys Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln
        20                  25(2)SEQ ID NO：15的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15Glu Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu1               5                   10                  15Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu
        20                  25(2)SEQ ID NO：16的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala1               5                   10                  15Lys Lys Gln Val Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：17的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys1               5                   10                  15Lys Gln Val Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp
        20                  25(2)SEQ ID NO：18的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys1               5                   10                  15Gln Val Glu Lys Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：19的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys1               5                   10                  15Gln Val Glu Lys Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val
        20                  25(2)SEQ ID NO：20的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val1               5                   10                  15Glu Lys Ala Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：21的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu1               5                   10                  15Lys Ala Leu Glu Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln
        20                  25(2)SEQ ID NO：22的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys1               5                   10                  15Val Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：23的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO：24的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO：25的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln1               5                   10(2)SEQ ID NO：26的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：14个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln1               5                   10(2)SEQ ID NO：27的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln1               5                   10(2)SEQ ID NO：28的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：30个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28Cys Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn1               5                   10                  15Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：29的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val1               5                   10(2)SEQ ID NO：30的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu1               5                   10(2)SEQ ID NO：31的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO：32的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala1               5                   10(2)SEQ ID NO：33的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu1               5                   10(2)SEQ ID NO：34的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：12个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Glu1               5                   10(2)SEQ ID NO：35的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：20个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35Leu Arg Arg Asp Ile Asp Asp Leu Glu Leu Thr Leu Ala Lys Val Glu1               5                   10                  15Lys Glu Lys His
        20(2)SEQ ID NO：36的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：20个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36Leu Arg Ser Asp Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Ser Glu Arg Leu1               5                   10                  15Glu Glu Ala Val
        20(2)SEQ ID NO：37的信息
(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37Asn Lys Ile ser Glu Ala Ser Arg Lys Gly Leu Arg Arg Asp Leu Asp1               5                   10                  15Ala Ser Arg Glu
        20(2)SEQ ID NO：38的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：20个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38Ala Lys Lys Gln Val Glu Lya Ala Leu Glu Glu Ala Asn Ser Lys Leu1               5                   10                  15Ala Ala Leu Glu
        20(2)SEQ ID NO：39的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：35个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39Asn Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu1               5                   10                  15Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser Glu Sar Val Thr Mat Gln
        20                  25                  30Asn Leu Gln
    35(2)SEQ ID NO：40的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40Asn Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu1               5                   10                  15Asn Ile Gln Lys Arg
        20(2)SEQ ID NO：41的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn1               5                   10                  15Ile Gln Lys Arg Gln
        20(2)SEQ ID NO：42的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu
        20(2)SEQ ID NO：43的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln1               5                   10                  15Lys Arg Gln Leu Ala
        20(2)SEQ ID NO：44的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys1               5                   10                  15Arg Gln Leu Ala Glu
        20(2)SEQ ID NO：45的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg1               5                   10                  15Gln Leu Ala Glu Ser
        20(2)SEQ ID NO：46的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln1               5                   10                  15Leu Ala Glu Ser Glu
        20(2)SEQ ID NO：47的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu1               5                   10                  15Ala Glu Ser Glu Ser
        20(2)SEQ ID NO：48的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：48Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala1               5                   10                  15Glu Ser Glu Ser Val
        20(2)SEQ ID NO：49的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu1               5                   10                  15Ser Glu Ser Val Thr
        20(2)SEQ ID NO：50的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser1               5                   10                  15Glu Ser Val Thr Met
        20(2)SEQ ID NO：51的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51Leu Glu Asp Lys Ile Lys Gln Glu His Lys Asn Phe Val Met Ala Gln1               5                   10                  15Asp Thr Ala Asp Arg Leu Glu Asp Arg Val Lys Gln Leu
        20                  25(2)SEQ ID NO：52的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg1               5                   10                  15Leu Thr Glu Lys Leu Asn Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：53的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：53Lys Val Lys Gln Leu Glu G1u Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu1               5                   10                  15Asn Ile Gln Lyg Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：54的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg1               5                   10                  15Gln Leu Ala Glu Ser Glu Asp Lys Val Lys Asn Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：55的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55Gln Ala Glu Asp Arg Val Lys Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser1               5                   10                  15Glu Ser Val Thr Met Gln Leu Glu Asp Lys Ile Lys Gln
        20                  25(2)SEQ ID NO：56的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Leu Ala Glu Ser Glu Ser Val Thr Met1               5                   10                  15Gln Asn Leu Gln Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val
        20                  25(2)SEQ ID NO：57的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys1               5                   10                  15Leu Asn Ile Gln Lys Arg Lys Val Lys Gln Leu Gln Asp
        20                  25(2)SEQ ID NO：58的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58Lys Val Lys Gln Leu Glu Glu Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu1               5                   10                  15Asn Ile Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：59的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59Val Lys Gln Leu Glu Glu Lys Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn1               5                   10                  15Ile Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val
        20                  25(2)SEQ ID NO：60的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：60Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                   15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：61的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61Gln Leu Glu Glu Lys Val Lya Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln1               5                   10                  15Lys Arg Gln Leu Ala Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln
        20                  25(2)SEQ ID NO：62的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：62Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys1               5                   10                  15Arg Gln Leu Ala Glu Ser Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu
        20                  25(2)SEQ ID NO：63的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg1               5                   10                  15Gln Leu Ala Glu Ser Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：64的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln1               5                   10                  15Leu Ala Glu Ser Glu Ser Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp
        20                  25(2)SEQ ID NO：65的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：65Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu1               5                   10                  15Ala Glu Ser Glu Ser Val Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：66的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：66Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys1               5                   10                  15Val Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：67的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：28个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：67Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala1               5                   10                  15Lys Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu
        20                  25(2)SEQ ID NO：68的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：21个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：68Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys1               5                   10                  15Gln Leu Glu Asp Lys
        20(2)SEQ ID NO：69的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：69Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：70的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：70Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：71的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：72的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：73的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：74的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：75的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：76的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：77的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：78的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：79的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：80的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：15个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：81的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：81Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：82的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：82Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：83的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：83Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：84的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：84Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Glu Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：85的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：85Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Asp Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：86的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：86Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Arg Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：87的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：87Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Val Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：88的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：88Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Lys Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：89的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：89Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Gln1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：90的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：90Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Leu Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：91的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：91Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Glu Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：92的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：92Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Asp Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：93的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：93Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25(2)SEQ ID NO：94的信息
(i)序列特征：
  (A)长度：29个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链性：单链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：94Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile1               5                   10                  15Gln Lys Arg Gln Val Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys
        20                  25

Claims (18)

1、一种嵌合肽，包括
(i)第一个氨基酸序列，其在天然状态下代表一个构象表位，所述构象表位
不存在于分离状态下的所述第一个氨基酸序列中；和
(ii)第二个氨基酸序列，其具有与所述第一个氨基酸序列的天然构象相似的构象；
其中所述第一个氨基酸序列插入所述第二个氨基酸序列，以使所述第一个氨基酸序列代表所述构象表位。
2、如权利要求1所述的嵌合肽，其中第二个氨基酸序列呈一种α-螺旋卷曲螺旋构象。
3、如权利要求1或2所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列衍生自链球菌M蛋白。
4、如权利要求3所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列包括来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE或者这些氨基酸残基中的一和多个残基的类似物内的一个B细胞构象表位。
5、如权利要求4所述的嵌合肽，其中至少三个氨基酸选自SEQ ID NO：1所列氨基酸序列，其组成一种构象B细胞表位。
6、如权利要求4所述的嵌合肽，其中至少五个氨基酸选自SEQ ID NO：1所列氨基酸序列，其组成一种构象B细胞表位。
7、如权利要求1或2所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列衍生自Caenorhabditis elegans副肌球蛋白unc-15。
8、如权利要求7所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列包括来自SEQ ID NO：28的氨基酸序列CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK或者这些氨基酸残基中的一和多个残基的类似物内的一个构象B细胞表位。
9、如权利要求7所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列包括来自SEQ ID NO：43的氨基酸序列MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA的一个构象B细胞表位。
10、如权利要求7所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列包括来自SEQ IDNO：26的氨基酸序列ADRLTEKLNIQKRQ或者这些氨基酸残基中的一和多个残基的类似物内的一个构象B细胞表位。
11、如权利要求7所述的嵌合肽，其中第一个氨基酸序列包括来自SEQ IDNO：27的氨基酸序列RLTEKLNIQKRQ或者这些氨基酸残基中的一和多个残基的类似物内的一个构象B细胞表位。
12、一种在抗原肽、多肽或蛋白质中确定最小表位的方法，所述方法包括确定所述肽、多肽或蛋白质或其携带推定表位的部分的天然构象；制备所述肽、多肽或蛋白质的肽片段；将所述肽片段插入或置入衍生自或基于与所述的第一次提及的肽、多肽或蛋白质具有相似天然构象的另一种肽、多肽或蛋白质的第二种肽中，使得肽片段中推定的表位以能够进行免疫学相互作用的构象存在；然后筛选所述肽片段的免疫学相互作用。
13、一种用于抗A类链球菌的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一个至少有三个氨基酸选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE的第一个氨基酸序列，其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自链球菌M蛋白的构象B细胞表位，所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
14、一种用于抗Caenorhabditis elegans的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一个至少有三个氨基酸选自SEQ ID NO：28的氨基酸序列CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK的第一个氨基酸序列，其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自C.elegans unc-15蛋白的构象B细胞表位，所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
15、一种用于抗Caenorhabditis elegans的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一个至少有三个氨基酸选自SEQ ID NO：43的氨基酸序列MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA的第一个氨基酸序列，其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自C.elegans unc-15蛋白的构象B细胞表位，所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
16、一种用于抗Caenorhabditis elegans的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一个至少有三个氨基酸选自SEQ ID NO：26的氨基酸序列ADRLTEKLNIQKRQ的第一个氨基酸序列，其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自C.elegans unc-15蛋白的构象B细胞表位，所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
17、一种用于抗Caenorhabditis elegans的疫苗，所述疫苗包括一种嵌合肽，该嵌合肽包括一个至少有三个氨基酸选自SEQ ID NO：27的氨基酸序列RLTEKLNIQKRQ的第一个氨基酸序列，其中所述的至少三个氨基酸组成一个来自C.elegans unc-15蛋白的构象B细胞表位，所述的第一个氨基酸序列被插入到能折叠成α-螺旋卷曲螺旋构象的第二个氨基酸序列中，所述疫苗还包括一种或多种药用合适的载体和/或稀释剂。
18、一种定位由抗体识别的肽、多肽或蛋白质上两亲性螺旋区域的方法，所述的方法包括确定所述肽、多肽或蛋白质或其携带推定表位的部分的天然构象；制备所述肽、多肽或蛋白质的肽片段；将所述肽片段插入或置入衍生自或基于与所述的第一次提及的肽、多肽或蛋白质具有相似天然构象的另一种肽、多肽或蛋白质的第二种肽中，使得肽片段中推定的表位存在于能够进行免疫学相互作用的构象中；然后筛选所述肽片段的免疫学相互作用。
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