ES2281900T3

ES2281900T3 - Peptidos sinteticos y vacunas que los contienen.

Info

Publication number: ES2281900T3
Application number: ES95933991T
Authority: ES
Inventors: Juan Anton Cooper; Wendy Anne Relf; Michael Frances Good; Allan James Saul
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research; Queensland Institute of Medical Research QIMR; CSL Ltd; University of Melbourne
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research; CSL Ltd; University of Melbourne; QIMR Berghofer Medical Research Institute
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: ATE350390T1; AU3645595A; JP2009067810A; CN1118474C; CA2202504A1; AU704688B2; CN1168674A; JPH10512543A; WO1996011944A1; US6174528B1; EP0787139A4; EP0787139B1; CA2202504C; JP4463877B2; DE69535360D1; EP0787139A1; DE69535360T2; AUPM885194A0

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE GENERALMENTE A PEPTIDOS QUIMERICOS QUE COMPRENDEN UNO O MAS PEPTIDOS PROTECTORES EN UNA CONFORMACION QUE PERMITE INTERACTIVIDAD INMUNOLOGICA Y A COMPOSICIONES DE VACUNA QUE COMPRENDEN LOS MISMOS. LA PRESENTE INVENCION ESTA PARTICULARMENTE DIRIGIDA A UN PEPTIDO QUIMERICO CAPAZ DE INDUCIR ANTICUERPOS PROTECTORES CONTRA ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO A.

Description

Péptidos sintéticos y vacunas que los contienen.

La presente invención se refiere, en general, a péptidos quiméricos que comprenden uno o más epitopos protectores en una conformación que permite la interactividad inmunológica, y a composiciones de vacunas que los comprenden. La presente invención está particularmente dirigida a un péptido quimérico capaz de inducir anticuerpos protectores contra estreptococos del grupo A.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas en esta memoria descriptiva por el autor se recogen al final de la descripción. Los números identificativos de secuencia (SEQ ID NO:) para las secuencias de aminoácidos mencionadas en la memoria descriptiva se definen después de la bibliografía.

A lo largo de la memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprendido" o "que comprende", implican la inclusión de un elemento o número entero mencionado, o grupo de elementos o números enteros mencionados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero, o grupo de elementos o números enteros.

Muchas proteínas que pueden ser candidatos de vacuna útiles contra varias enfermedades tienen una estructura helicoidal, un importante motivo estructural y biológicamente abundante que se encuentra en un grupo diverso de proteínas (Cohen y Parry, 1990, 1986). Se predice que más de 200 proteínas contienen dominios helicoidales (Lupas et al., 1991). Éstas incluyen proteínas de la superficie de ciertas bacterias, tales como las proteínas A y M estreptocócicas; de virus, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe, y la glicoproteína gp45 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); y de protozoos, tales como VSG de tripanosomas. Todos los motivos helicoidales comparten una repetición de siete restos aminoácidos característica (a-b-c-d-e-f-g)_{n}. Se ha resuelto la estructura de rayos X de varios dominios helicoidales, y éstos incluyen la porción de cremallera de leucina del dímero GCN4 del factor de transcripción de levaduras (O'Shea et al., 1991), el motivo de repetición de \alpha-espectrina (Yan, 1993), junto con los mutantes de trímero (Harbury et al., 1994) y tetrámero de la cremallera de leucina de GCN4 (Harbury et al.,
1993).

En el desarrollo de una vacuna de subunidad basada en estas proteínas, en general resulta difícil cartografiar epitopos dentro de la estructura helicoidal. Además, puede que sea necesario presentar epitopos protectores en la conformación correcta para el reconocimiento inmunológico, tal como la unión a anticuerpos. Esto es especialmente importante en la definición de un epitopo mínimo estable y su utilización como una vacuna.

Los estreptococos del grupo A (denominados en lo sucesivo "EGA") son el agente causativo de varias enfermedades humanas, y pueden conducir a una fiebre reumática aguda que provoca una grave enfermedad cardíaca. La fiebre reumática puede representar una enfermedad autoinmunológica iniciada por la reactividad cruzada entre la proteína M estreptocócica y antígenos cardíacos (Beachey et al., 1988). La proteína M contiene una periodicidad de siete restos que sugiere, con gran fuerza, que la región de varilla central de la molécula está en una conformación helicoidal (Manula y Fischetti, 1980). Se han fabricado péptidos solapantes que abarcan esta región (véase la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/AU93/00131 [documento WO 93/21220]), y anticuerpos de ratón generados contra un péptido 20-mero sintético (denominado "p145") de la región C-terminal altamente conservada pueden opsonizarse y matar múltiples aislados de EGA (Pruksakorn et al., 1994a). Además, el p145 puede inhibir la muerte in vitro mediada por sueros humanos. Resulta preocupante que el p145 también puede estimular a células T cardíacas de reactividad cruzada (Pruksakorn et al., 1992; 1994b). Se cree que el epitopo de células B dentro de p145 es conformacional, porque los péptidos truncados no pueden producir una respuesta de anticuerpos protectora (Pruksakorn, 1994). Por tanto, es necesario definir la región mínima de p145 necesaria para inducir anticuerpos opsónicos; después, esto podría establecer las bases de una vacuna. Este método permitiría la identificación de las regiones epitópicas mínimas de una variedad de proteínas procedentes de patógenos.

Un método que se ha utilizado para cartografiar epitopos mínimos de antígenos es el método PEPSCAN (Geysen et al., 1987). Sin embargo, los péptidos cortos utilizados sólo indican epitopos secuenciales o continuos. Otros métodos para determinar epitopos conformacionales, es decir, epitopos formados por la estructura terciaria de la proteína, se basan en estrategias de mimotopos. Un mimotopo es una imitación del epitopo que induce el anticuerpo. Pueden sintetizarse péptidos en varillas de polipropileno que cubran el repertorio total de octapéptidos que pueden fabricarse utilizando los 20 aminoácidos habituales, es decir, 20^{8} péptidos (Geysen et al., 1987).

Como alternativa, puede estudiarse un banco de epitopos que consiste en una vasta mezcla de clones de fagos filamentosos, presentando cada uno una secuencia peptídica sobre la superficie del virión, para el reconocimiento de anticuerpos (Scott y Smith, 1990).

Según la presente invención, péptidos solapantes derivados de un epitopo conformacional se introducen en un péptido que tiene una conformación nativa similar. Este enfoque tiene el potencial de poder utilizarse en el cartografiado de una gama de epitopos conformacionales, y en el diseño de epitopos mínimos como candidatos de vacuna contra EGA y una diversidad de otros patógenos.

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El documento WO 94/06465 se refiere a una proteína de fusión que comprende una proteína portadora adecuada y uno o más epitopos capaces de evocar anticuerpos opsónicos contra serotipos específicos de Streptococcus del grupo A. El documento WO 94/06421 se refiere a una vacuna de proteína M híbrida multivalente contra múltiples serotipos de Streptococcus del grupo A. Pruksakorn et al. (1992) identifica epitopos conservados dentro de la región N-terminal de la proteína M estreptocócica, que son capaces de producir anticuerpos con una mínima reactividad cruzada con tejido cardíaco humano. Además, Relf et al. (1994) describen la diversidad antigénica dentro de una familia de proteínas M de estreptococos del grupo A. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe métodos para cartografiar una gama de epitopos conformacionales proporcionando medios para asegurar que se mantenga la conformación nativa del epitopo.

El documento WO 93/21220 se refiere a péptidos sintéticos que comprenden al menos un epitopo de células B procedente del carboxi-terminal de la proteína M de estreptococos, en los que un anticuerpo reactivo con el epitopo de células B sólo es mínimamente reactivo con tejido cardíaco humano. Charalambos et al. (Eur. J. Immunol., 1992, 22, 2675-2680) se refieren a la influencia de la orientación y el número de copias de epitopos de células T y B sobre la especificidad y afinidad de anticuerpos inducidos por péptidos quiméricos. Se describe la fusión de epitopos de células T y B, que pueden proceder de la proteína M de Streptococcus pyrogenes.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención contempla un péptido quimérico que comprende:

(i): una primera secuencia de aminoácidos que, en su estado nativo, presenta un epitopo conformacional, no estando presente dicho epitopo conformacional en la primera secuencia de aminoácidos en un estado aislado; y

(ii): una segunda secuencia de aminoácidos que es capaz de plegarse en una conformación helicoidal de marco de trabajo similar a la conformación nativa de la primera secuencia de aminoácidos;

en el que la primera y segunda secuencia de aminoácidos se derivan o se basan en diferentes péptidos, polipéptidos o proteínas, y la primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de la conformación helicoidal dentro de la segunda secuencia de aminoácidos, de forma que la primera secuencia de aminoácidos presenta el epitopo conformacional, y en el que dicha segunda secuencia de aminoácidos se pliega en una conformación helicoidal en \alpha-hé-
lice.

Según este aspecto de la presente invención, la segunda secuencia de aminoácidos constituye un "péptido de marco de trabajo" y proporciona una conformación apropiada para el péptido quimérico. Un péptido de marco de trabajo se selecciona, o bien se modifica, para proporcionar una conformación similar a la primera secuencia de aminoácidos, tal como en la forma que aparece en la naturaleza. En su realización más preferida, el péptido de marco de trabajo adopta una conformación helicoidal en \alpha-hélice y, por tanto, es útil para presentar epitopos que están presentes en la primera secuencia de aminoácidos en una conformación similar, es decir, una conformación helicoidal en \alpha-hé-
lice.

Según este aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un péptido quimérico que comprende una primera secuencia de aminoácidos que comprende un epitopo conformacional insertado dentro de una segunda secuencia de aminoácidos, en el que la segunda secuencia de aminoácidos se pliega en una conformación helicoidal en \alpha-hélice.

La presente invención se ejemplifica, en particular, en la presente por la primeras secuencia de aminoácidos que se deriva de la proteína M estreptocócica y comprende, en particular, un epitopo conformacional de células B del interior de la siguiente secuencia de aminoácidos (utilizando la abreviatura de una sola letra para restos aminoáci-
dos).

L R R D L D A S R E A K K Q V E K A L E

(SEQ ID NO: 1),

o los equivalentes funcionales y/o químicos de uno o más de estos restos aminoácidos.

\vskip1.000000\baselineskip

Por consiguiente, una realización particularmente preferida de la presente invención está dirigida a un péptido quimérico que comprende:

en el que la primera y segunda secuencia de aminoácidos se derivan o se basan en diferentes péptidos, polipéptidos o proteínas, y la primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de la conformación helicoidal dentro de la segunda secuencia de aminoácidos, de forma que la primera secuencia de aminoácidos presenta el epitopo conformacional, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos tres aminoácidos seleccionados dentro de la siguiente secuencia:

L R R D L D A S R E A K K Q V E K A L E

(SEQ ID NO: 1),

en el que dichos al menos 3 aminoácidos constituyen un epitopo conformacional de células B procedente de la proteína M estreptocócica, y en el que dicha primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de una segunda secuencia de aminoácidos capaz de plegarse en una conformación helicoidal en \alpha-hélice. Preferiblemente, la primera secuencia de aminoácido comprende al menos cinco, más preferiblemente al menos diez, y aún más preferiblemente al menos quince restos aminoácidos contiguos.

Como alternativa, los aminoácidos no contiguos pueden seleccionarse tales como los que se encuentran en la cara externa de la hélice, y que sean necesarios o suficientes para la actividad.

La construcción de un péptido de marco de trabajo se basa en la repetición de siete restos aminoácidos:

(a-b-c-d-e-f-g)_{n}

en la que las posiciones a y d preferiblemente tienen restos apolares grandes, las posiciones b, c y f son generalmente polares y cargados, y las posiciones e y g generalmente favorecen las interacciones iónicas intercatenarias. Un péptido de marco de trabajo particularmente preferido se basa en la estructura de un péptido que se corresponde a la cremallera de leucina de GCN4 (O'Shea et al., 1989; 1991), o su trímero (Harbury et al., 1994) o tetrámero (Harbury et al., 1993), y el motivo de repetición de \alpha-espectrina (Yan, 1993). La cremallera de leucina de GCN4 se prefiere particularmente, y un modelo de repetición de héptadas derivado de las características consenso del péptido de cremallera de leucina de GCN4 comprende la secuencia:

V K Q L E D K

(SEQ ID NO: 2),

que produce un péptido de marco de trabajo de cuatro repeticiones de héptadas denominado en la presente (GCN4)_{4}. Cuando sea necesario, el péptido de marco de trabajo puede o debe ser más largo que las cuatro repeticiones.

La primera secuencia de aminoácidos entonces se introduce dentro del péptido helicoidal de marco de trabajo para producir un péptido quimérico.

Los péptidos quiméricos de la presente invención pueden producirse mediante medios recombinantes o pueden sintetizarse de modo químico, por ejemplo, mediante la adición discontinua de uno o más restos aminoácidos en un orden definido utilizando técnicas sintéticas de péptidos en fase sólida. Cuando sea necesario, los péptidos se pueden sintetizar en combinación con otras proteínas y después aislarse mediante ruptura química o, como alternativa, los péptidos o péptidos polivalentes pueden sintetizarse en múltiples unidades de repetición. Los péptidos pueden comprender restos aminoácidos que aparecen en la naturaleza, o también pueden contener restos aminoácidos que no aparecen en la naturaleza, tales como ciertos D-isómeros o restos que aparecen en la naturaleza que están químicamente modificados. Estos últimos restos pueden ser necesarios, por ejemplo, para facilitar o proporcionar limitaciones y/o restricciones conformacionales a los péptidos. La selección de un método para producir los péptidos sujeto dependerá de factores tales como el tipo, la cantidad y la pureza requeridos de los péptidos, así como la facilidad de producción y conveniencia.

Los péptidos quiméricos de la presente invención pueden requerir, en primer lugar, una modificación química para su uso in vivo, puesto que los péptidos, en sí mismos, pueden no tener una semivida sérica y/o tisular lo suficientemente larga. La modificación química de los péptidos sujeto también puede ser importante para mejorar su antigenicidad, incluyendo la capacidad de ciertas regiones de los péptidos para actuar como epitopos de células B y/o T. Estos péptidos quiméricos químicamente modificados se denominan en la presente "análogos". El término "análogos" se extiende a cualquier equivalente químico o recombinante funcional de los péptidos quiméricos de la presente invención que se caracterizan, en la realización más preferida, porque poseen al menos un epitopo de células B procedente de la proteína M de EGA, y porque un anticuerpo reactivo con el epitopo de células B sólo es mínimamente reactivo con tejido cardíaco humano. El término "análogo" también se utiliza en la presente para abarcar cualquier derivado de aminoácidos de los péptidos como se describió anteriormente.

Los análogos de los péptidos quiméricos contemplados en la presente incluyen, pero no se limitan a modificaciones de cadenas laterales, la incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis peptídica, y el uso de reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales sobre los péptidos o sus análogos.

Los ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino, tales como mediante alquilación reductora por medio de una reacción con un aldehído, seguido de una reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5'-fosfato, seguido de una reducción con NaBH_{4}.

El grupo guanidida de los restos arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butandiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede modificarse mediante activación de carbodiimidas a través de la formación de O-acilisourea, seguido de la posterior derivatización, por ejemplo, para producir la correspondiente amida.

Los grupos sulfihidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación con ácido perfórmico para producir ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos de tiol; reacción con maelimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercúricos utilizando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercúricos; carbamoilación con cianato a pH alcalino.

Los restos triptófano pueden modificarse, por ejemplo, mediante oxidación con N-bromosuccinimida, o alquilación del anillo indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los restos tirosina, por otra parte, pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo de imidazol de un resto histidina puede realizarse mediante alquilación con derivados del ácido yodoacético, o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.

Los ejemplos de incorporación de aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis peptídica incluyen, pero no se limitan al uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienilalanina y/o D-isómeros de los aminoácidos.

Pueden utilizarse reticulantes, por ejemplo, para estabilizar conformaciones tridimensionales, utilizando reticulantes homobifuncionales tales como los imido ésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH_{2})_{n} con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, y reactivos heterobifuncionales que normalmente contienen un resto aminorreactivo, tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo, tal como un resto maleimido o ditio (SH) o una carbodiimida (COOH). Además, los péptidos se pueden restringir conformacionalmente, por ejemplo, mediante la incorporación de ácidos C_{\alpha}- y N_{\alpha}-metilamino, la introducción de dobles enlaces entre los átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de los aminoácidos, y la formación de péptidos cíclicos o análogos mediante la introducción de enlaces covalentes, tal como la formación de un enlace amida entre los N- y C-terminales, entre dos cadenas laterales, o entre una cadena lateral y el N- o C-terminal.

La presente invención proporciona, por tanto, un epitopo conformacional, por ejemplo procedente de la proteína M estreptocócica, en una molécula híbrida, de forma que el epitopo se proporciona en un estado conformacional funcional, de modo que sea capaz de ser inmunológicamente interactivo.

En un aspecto relacionado de la presente invención, se proporciona un método para cartografiar regiones de hélices anfipáticas en un péptido, polipéptido o proteína, que son reconocidas por anticuerpos y/o para determinar un epitopo mínimo sobre un péptido, polipéptido o proteína, comprendiendo dicho método determinar la conformación nativa de dicho péptido, polipéptido o proteína, o una porción de éstos, que porta un epitopo putativo; preparar fragmentos peptídicos de dicho péptido, polipéptido o proteína; insertar, o presentar de otra forma, dichos fragmentos peptídicos en un segundo péptido derivado o basado en otro péptido, polipéptido o proteína, que es capaz de plegarse en una conformación helicoidal de marco de trabajo de conformación similar a la nativa de dicho péptido, polipéptido o proteína mencionados en primer lugar, estando insertados los fragmentos peptídicos dentro de la conformación helicoidal del segundo péptido, de forma que el epitopo putativo sobre el fragmento peptídico se presenta en una conformación capaz de una interactividad inmunológica, y después seleccionar dichos fragmentos peptídicos para la interactividad inmunológica.

Las hélices anfipáticas que son reconocidas por anticuerpos pueden ser valiosos candidatos de vacuna. Una hélice anfipática es un elemento estructural muy común en proteínas, y puede estar expuesto sobre la superficie (antigénico) o desempeñar un papel en las interacciones con otras proteínas. Una estructura helicoidal es una forma más compleja de hélice que interacciona para formar homodímeros, trímeros y tetrámeros.

Una "interactividad inmunológica" significa cualquier forma de interacción con células inmunológicas o células efectoras inmunológicas y/o cualquier forma de respuesta inmunológica. En general, la interactividad inmunológica se mide mediante la unión a anticuerpos o la interactividad con el fragmento peptídico. Sin embargo, la interactividad inmunológica también se extiende a medir las respuestas inmunológicas celulares.

Es importante en el desarrollo terapéutico y de diagnóstico determinar el epitopo mínimo capaz de proporcionar interactividad inmunológica y, para terapia, capaz de inducir una respuesta inmunológica protectora. Por consiguiente, los péptidos quiméricos de la presente invención, incluyendo sus métodos de producción, son particularmente útiles en el desarrollo de vacunas. De nuevo, en esta forma ejemplificada y preferida, la presente invención proporciona un péptido quimérico para uso en una vacuna contra EGA. Sin embargo, esto se realiza con la comprensión de que la presente invención se extiende a péptidos quiméricos útiles para inducir una respuesta inmunológica protectora contra microorganismos patógenos, incluyendo bacterias, parásitos, levaduras, hongos y protozoos, o contra virus, tales como retrovirus, virus de la gripe, virus de la hepatitis y virus de la inmunodeficiencia, y en particular VIH.

Por consiguiente, un aspecto preferido de la presente invención proporciona una vacuna útil contra estreptococos del grupo A, comprendiendo dicha vacuna un péptido quimérico que comprende:

en el que la primera y segunda secuencia de aminoácidos se derivan o se basan en diferentes péptidos, polipéptidos o proteínas, y la primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de la conformación helicoidal dentro de la segunda secuencia de aminoácidos, de forma que la primera secuencia de aminoácidos presenta el epitopo conformacional, y en el que dicha primera secuencia de aminoácidos tiene al menos tres aminoácidos seleccionados dentro de la siguiente secuencia:

L R R D L D A S R E A K K Q V E K A L E

(SEQ ID NO: 1),

en el que dichos al menos 3 aminoácidos constituyen un epitopo conformacional de células B procedente de la proteína M estreptocócica, y en el que dicha primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de una segunda secuencia de aminoácidos capaz de plegarse en una conformación helicoidal en \alpha-hélice, y dicha vacuna comprende además uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La vacuna puede comprender también un adyuvante y/o otras moléculas de estimulación inmunológica. Preferiblemente, la segunda secuencia de aminoácidos forma un péptido de marco de trabajo derivado de GCN4. Los aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID NO: 1 pueden seleccionarse como se analizó anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención contempla una vacuna útil en el desarrollo de inmunidad humoral contra la proteína M, pero de mínima reacción cruzada con tejido cardíaco, comprendiendo dicha vacuna un péptido quimérico que comprende una primera secuencia de aminoácidos que porta al menos un epitopo de células B procedente de la proteína M, en la que un anticuerpo reactivo contra dicho epitopo de células B sólo es mínimamente reactivo con tejido cardíaco, dicha primera secuencia de aminoácidos está insertada en una segunda secuencia de aminoácidos capaz de plegarse en una formación helicoidal en \alpha-hélice, y dicha vacuna comprende además uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

La vacuna puede contener un único tipo de péptido o una diversidad de péptidos que cubren epitopos diferentes o similares. Además, o como alternativa, puede proporcionarse un único polipéptido con múltiples epitopos. Este último tipo de vacuna se denomina vacuna polivalente. Un epitopo múltiple incluye dos o más epitopos de repetición.

La formación de vacunas se conoce en general en la técnica, y se puede hacer una referencia conveniente a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, EEUU.

La presente invención, por tanto, contempla una composición farmacéutica o composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz para desarrollar inmunidad humoral de un péptido quimérico (como se definió anteriormente en la presente) o sus derivados, análogos u homólogos y/o sus combinaciones, incluyendo otras moléculas activas y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Se contempla en la presente que los ingredientes activos de una composición farmacéutica que comprende el péptido quimérico muestren una excelente actividad terapéutica, por ejemplo, en el desarrollo de anticuerpos contra la proteína M de estreptococos, pero que dichos anticuerpos sólo sean mínimamente reactivos con tejido cardíaco cuando se administran en una cantidad que depende del caso particular. Por ejemplo, pueden administrarse de aproximadamente 0,5 ug a aproximadamente 20 mg por kilogramo de peso corporal diarios.

El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente, o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo puede administrarse de una manera conveniente, tal como mediante la vía oral, intravenosa (cuando sea hidrosoluble), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o por supositorio o implante (por ejemplo, utilizando moléculas de liberación lenta). Dependiendo de la vía de administración, puede ser necesario que los ingredientes activos que comprenden un péptido quimérico sean revestidos con un material para proteger a dichos ingredientes de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar dichos ingredientes. Por ejemplo, la baja lipofilicidad de los péptidos quiméricos les permiten ser destruidos en el tracto gastrointestinal por enzimas capaces de romper enlaces peptídicos, y en el estómago por hidrólisis ácida. Para administrar péptidos quiméricos mediante una administración diferente a la administración parenteral, se revestirán o se administrarán con un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, los péptidos quiméricos pueden administrarse en un adyuvante, coadministrarse con inhibidores enzimáticos, o en liposomas. Adyuvante se emplea en su sentido más amplio, e incluye cualquier compuesto de estimulación inmunológica, tal como interferón. Los adyuvantes contemplados en la presente incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos, tales como polioxietilén oleil éter y n-hexadecil polietilén éter. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales.

Los compuestos activos también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y sus mezclas, y en aceites. Bajo condiciones habituales de conservación y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando sean hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de dispersiones o disoluciones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que sea fácil de inyectar. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y conservación, y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), sus mezclas adecuadas y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como licitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de una esterilización mediante filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y la técnica de liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier otro ingrediente deseado a partir de una disolución de éstos previamente esterilizada mediante filtración.

Cuando los péptidos quiméricos están protegidos de forma adecuada como se describió anteriormente, el compuesto activo puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede introducirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o puede comprimirse en comprimidos, o puede incorporarse directamente con la comida de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Estas composiciones y preparaciones deben contener al menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, puede variarse y, de forma conveniente, puede ser de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtiene una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas según la presente invención se preparan de forma que una forma de dosificación unitaria oral contiene entre aproximadamente 0,1 ug y 2000 mg del compuesto activo.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un ligante, tal como goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tales como fosfato de dicalcio; un agente disgregante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, aceite de gualteria, o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula puede contener, además de los materiales de los tipos anteriores, un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como revestimientos o para modificar, de otra manera, la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden revestirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil- y propilparabenos como conservantes, un tinte y un aromatizante, tal como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Tal como se utiliza en la presente, "vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares. El uso de estos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas es muy conocido en la técnica. Excepto si cualquiera de los medios o agentes son incompatibles con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para una administración más fácil y una uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para los sujetos mamíferos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas de dosificación unitaria de la invención viene dictada y es directamente de dependiente de (a) las características exclusivas del material activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho material activo para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto vivo que tiene un trastorno patológico en el que la salud corporal está deteriorada, como se describe en detalle en la presente.

El principal ingrediente activo se compone para una administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado en una forma de dosificación unitaria, como se ha descrito previamente en la presente. Una forma de dosificación unitaria puede contener, por ejemplo, el principal compuesto activo en cantidades que varían de 0,5 \mug a aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo está presente, en general, desde aproximadamente 0,5 \mug a aproximadamente 2000 mg/ml de vehículo. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos suplementarios, las dosificaciones se determinan haciendo referencia a la dosis y forma de administración habituales de dichos ingredientes.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a anticuerpos contra los péptidos quiméricos. Estos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden seleccionarse de anticuerpos que aparecen en la naturaleza contra la proteína M, o pueden generarse de forma específica contra los péptidos quiméricos. En el caso de estos últimos, puede que sea necesario, en primer lugar, asociar los péptidos con una molécula portadora. Los anticuerpos y/o péptidos quiméricos de la presente invención son particularmente útiles para inmunoterapia y vacunación, y también pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico para la infección o para el control del avance de una vacunación o régimen terapéutico.

Por ejemplo, los péptidos quiméricos pueden utilizarse para seleccionar anticuerpos que aparecen en la naturaleza contra la proteína M. Como alternativa, pueden utilizarse anticuerpos específicos para una selección de la proteína M. Las técnicas para estos ensayos son muy conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos "sándwich" y ELISA.

Según este aspecto de la presente invención, los péptidos quiméricos son particularmente útiles para seleccionar anticuerpos contra la proteína M y, por tanto, proporcionar un protocolo de diagnóstico para detectar una infección estreptocócica. Como alternativa, pueden seleccionarse directamente muestras biológicas, tales como suero sanguíneo, esputo, tejido y extractos tisulares, para la proteína M utilizando anticuerpos generados contra los péptidos quiméricos.

Por consiguiente, se proporciona un método para el diagnóstico de un infección estreptocócica en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica procedente de dicho sujeto con un cantidad eficaz para unirse a un anticuerpo de un péptido quimérico, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-péptido quimérico, y después detectar dicho complejo.

La presencia de anticuerpos contra la proteína M en el suero sanguíneo, tejido, extracto tisular u otro fluido corporal de un paciente puede detectarse utilizando una amplia gama de técnicas de inmunoensayo, tales como las que se describen en las Patentes de EEUU N^{os} 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Esto incluye ensayo de sitio único y de dos sitios, o de tipo "sándwich" de tipo no competitivo, así como los ensayos de unión competitiva tradicionales. Los ensayos de "sándwich" se encuentran entre los ensayos más útiles y habitualmente utilizados, y la presente invención prefiere su uso. Existe una serie de variaciones en la técnica del ensayo de "sándwich", y se pretende que todas se incluyan en la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un péptido quimérico se inmoviliza sobre un sustrato sólido para formar un primer complejo, y la muestra que se va a ensayar para anticuerpos contra la proteína M se pone en contacto con la molécula unida. Después de un periodo de incubación adecuado y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo secundario de péptido quimérico-anticuerpo, se añade un anticuerpo antiinmunoglobulina, marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable, y se incuba durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo terciario de péptido quimérico-anticuerpo-anticuerpo marcado. Cualquier material sin reaccionar se lava, y la presencia del primer anticuerpo se determina mediante la observación de la señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, mediante la simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse mediante la comparación con una muestra control que contiene cantidades conocidas de hapteno. Las variaciones del ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en el que la muestra y el anticuerpo marcado se añaden de forma simultánea al anticuerpo marcado, o un ensayo inverso en el que el anticuerpo marcado y la muestra que se va a ensayar primero se combinan, se incuban, y después se añaden de forma simultánea al anticuerpo unido. Estas técnicas son muy conocidas por los expertos en la técnica, y es evidente la posibilidad de pequeñas variaciones. Se adopta un enfoque similar para detectar la proteína M. Los anticuerpos utilizados anteriormente pueden ser monoclonales o policlo-
nales.

El sustrato sólido es, de forma típica, vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente utilizados la celulosa, la poliacrilamida, el nailon, el poliestireno, el poli(cloruro de vinilo) o el polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, esferas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a cabo un inmunoensayo. Los procesos de unión son muy conocidos en la técnica y consisten, en general, en el entrecruzamiento mediante unión covalente o adsorción física de la molécula con el portador insoluble.

Una "molécula indicadora", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, significa una molécula que, por su naturaleza química, produce una señal analíticamente identificable que permite la detección de un anticuerpo unido a un antígeno. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas indicadoras que se utilizan más habitualmente en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (es decir, radioisótopos). En el caso de un inmunoensayo de enzimas, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, en general mediante glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, como se comprenderá rápidamente, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes que están disponibles con facilidad para un experto en la técnica. Las enzimas que se emplean habitualmente incluyen la peroxidasa de rábano, la glucosa oxidasa, la \beta-galactosidasa y la fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que se utilizan con las enzimas específicas se eligen, en general, para la producción, después de la hidrólisis de la correspondiente enzima, de un cambio de color detectable. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente.

Como alternativa, los compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activa mediante iluminación con luz de una longitud de onda concreta, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energía lumínica, induciendo un estado de excitación en la molécula, seguido de la emisión de luz de un color característico que es visualmente detectable con un microscopio óptico. Como en el EIA, se permite que el anticuerpo marcado fluorescente se una al primer complejo de anticuerpo-hapteno. Después de lavar el reactivo no unido, el complejo terniario remanente entonces se expone a luz de una longitud de onda apropiada, y la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas bien establecidas en la técnica, y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras, tales como radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. A los expertos en la técnica les resultarán evidentes las variaciones del procedimiento para adaptarse al objetivo requerido. También resultará evidente que lo anterior puede utilizarse para marcar péptidos quiméricos y para utilizarlos directamente en la detección de anticuerpos de pro-
teína M.

Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de péptidos quiméricos como se describe en la presente, en la fabricación de un medicamento para uso como vacuna contra EGA.

En una realización relacionada, la presente invención proporciona un agente que comprende un péptido quimérico como se describe en la presente, útil como vacuna contra EGA.

La presente invención se describe más a fondo haciendo referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.

En las Figuras:

Figura 1. Secuencias de aminoácidos de péptidos quiméricos. Todas las secuencias mostradas se refieren a la repetición de la héptada helicoidal en \alpha-hélice (a-b-c-d-e-f-g) mostrada a continuación. A. Secuencia del péptido modelo de GCN4 derivado del péptido de cremallera de leucina de GCN4 helicoidal en \alpha-hélice (O'Shea et al., 1991). B. Secuencia del péptido p145 de la proteína M estreptocócica (Pruksakorn et al., 1992), alineada con la repetición de la héptada helicoidal putativa. C. Secuencias de los péptidos J quiméricos (J1-9). Los fragmentos 12-meros solapantes del péptido p145 se muestran en negrita. Las sustituciones de restos aminoácidos conservadoras se muestran subrayadas. D. Secuencia del péptido control Jcon del modelo de GCN4 (G).

Figura 2. Reactividad de sueros de ratón anti-p145 contra péptidos J; la reactividad se representa como el valor medio de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. Los sueros se diluyeron 1:100 y se muestran los representativos. Se indican los sueros conjugados con el toxoide de difteria (DT). NMS, suero de ratón normal.

Figura 3. Reactividad de sueros humanos anti-p145 de alta valoración contra péptidos J. El valor medio de absorbancia (405 nm) se representa para sueros diluidos 1:100. Se muestran las muestras representativas (GBD, MT, MY, FL, TB, MG). NHS, suero humano normal.

Figura 4. Representación gráfica de espectros de dicroismo circular de péptidos en presencia del disolvente inductor de \alpha-hélice trifluoretanol (TFE) al 50%. A, J_{l}1; B, J2; C, Jcon; D, p145. \theta, elipticidad molar. Los péptidos no mostraron formación de \alpha-hélice en disolución acuosa. También se ensayaron los péptidos J1, J3 y J4, y éstos mostraron perfiles similares a J2.

Figura 5. Representación gráfica que muestra un ELISA de cartografiado de epitopos nativos. Fragmentos de péptidos sintéticos de C. elegans unc-15 (tabla 7B) se revistieron sobre una placa de microvaloración (2 \mug por pocillo), se incubaron con anticuerpo monoclonal (mAb) NE1-6B2, y el anticuerpo marcado se detectó con anticuerpo anti-ratón y ensayo colorimétrico OPD a 450 nm.

Figura 6. Representación gráfica que muestra un ELISA de cartografiado de epitopos quiméricos. Fragmentos solapantes de C. elegans unc-15 introducidos en un péptido helicoidal modelo (Tabla 8) se revistieron sobre una placa de microvaloración (2 \mug por pocillo), se incubaron con anticuerpo mAb NE1-6B2, y el anticuerpo marcado se detectó con anticuerpo anti-ratón y ensayo colorimétrico OPD a 450 nm. Los péptidos bd10, bd11, bc18, bc23, bd14 y bd15 estaban compesados por 5 restos. Los péptidos bc17 a bc25 estaban compensados por 1 resto. Los péptidos control av85, av86 y ba48 contienen sólo restos del péptido helicoidal modelo.

Figura 7A. Representación gráfica que muestra un ELISA de cartografiado de epitopos mínimos quiméricos. Fragmentos truncados de C. elegans unc-15 introducidos en un péptido helicoidal modelo (Tabla 9A) se revistieron sobre una placa de microvaloración (2 \mug por pocillo), se incubaron con anticuerpo mAb NE1-6B2, y el anticuerpo marcado se detectó con anticuerpo anti.ratón y ensayo colorimétrico OPD a 450 nm. El péptido c1 consiste en el epitopo 15-mero solo. Los péptidos control av85, av86 y ba48 contienen sólo restos del péptido helicoidal modelo.

Figura 7B. Representación gráfica que muestra un ELISA de cartografiado de sustitución de epitopos quiméricos. Péptidos quiméricos, derivados de bc20 con cada resto sustituido a su vez por una sustitución conservadora (Tabla 9B) se revistieron sobre una placa de microvaloración (2 \mug por pocillo), se incubaron con anticuerpo mAb NE1-6B2, y el anticuerpo marcado se detectó con anticuerpo anti-ratón y ensayo colorimétrico OPD a 450 nm.

Figura 8A. Mapa del epitopo de C. elegans unc-15 reconocido por mAb NE1-6B2. Las posiciones de repetición de héptadas putativas a y d indican la anterior secuencia nativa unc-15. El epitopo reconocido por mAb NE1-6B2 se muestra en negrita.

Figura 8B. Representación de red cilíndrica de la hélice de C. elegans unc-15 con 3,5 restos por vuelta que muestran la cara polar. La hélice avanza de izquierda a derecha. Los restos sombreados interaccionan con mAb NE1-6B2; un círculo de trazo continuo es un resto crítico; un círculo de trazo discontinuo es un resto menos crítico.

Figura 9. Representación gráfica que muestra un ensayo ELISA de respuesta de anticuerpos a péptidos quiméricos. Los péptidos quiméricos bc20, ba39, bd2 y el péptido c1 se revistieron sobre una placa de microvaloración (2 \mug por pocillo), y se incubaron con antisueros de ratón contra bd1 (anti-bd1) o bd2 (anti-bd2), o sueros de presangrado de ratón (presangrado). El anticuerpo unido se detectó con anticuerpo anti-ratón y ensayo colorimétrico OPD a
450 nm.

Se usaron las siguientes abreviaturas de una sola letra y de tres letras para los restos aminoácidos:

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1

Ejemplo 1 Compuestos químicos

Todos los compuestos químicos y disolventes utilizados en los siguientes ejemplos fueron de calidad de reactivo analítica, a menos que se indique lo contrario. El poliestireno (divinilbenceno al 1% v/v), la resina de hidrocloruro de p-metilbenzihidrilamina (0,81 meq/g o sustitución de resina), los aminoácidos de terc-butiloxicarbonilo (t-BOC), la 1,3-diisopropilcarbodiimida (DIC), el N-hidroxibenzotriazol (HOBT), y el ácido trifluoroacético (TFA) se adquirieron en Auspep (Australia).

Ejemplo 2 Sujetos

Se estudiaron sujetos aborígenes, algunos con historia presente o pasada de RF/RHD, residentes en comunidades endémicas de estreptococos en el Territorio del Norte, Australia. Se descubrió que más de 90% de estos sujetos presentaban anticuerpos que aparecen en la naturaleza contra p145 (Pruksakorn et al., 1994a). El suero de los donantes se conservó a -20ºC hasta su uso.

Ejemplo 3 Ratones

Para los estudios de inmunización se usaron ratones B10.BR (Animal Resources Centre, Willetton, Australia Occidental) que se había demostrado que respondían a p145.

Ejemplo 4 Síntesis peptídica

Se sintetizaron péptidos mediante una técnica en fase sólida manual utilizando el método de "bolsita de té" de múltiples síntesis peptídicas simultáneas de Houghten (1985). La resina de partida era hidrocloruro de p-metilbenzihidril-
amina y se empleó la química de N-terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) convencional (Merrifield, 1963). Todos los grupos aminoácidos se protegieron en la posición \alpha-amino con el grupo t-Boc, y se utilizaron los siguientes grupos protectores de cadenas laterales: éster bencílico (Glu, Asp), 2-clorobenciloxicarbonilo (Lys), bencilo (Ser), tosilo (Arg).

El acoplamiento de aminoácidos se realizó con 1,3-diisopropilcarbodiimida en diclorometano y los grupos t-Boc se retiraron en cada ciclo con TFA al 55% v/v/diclorometano. Se incluyó N-hidroxibenzotriazol en los acoplamientos con Asn y Gln. Los péptidos se escindieron de la resina mediante un tratamiento con fluoruro de hidrógeno, se precipitaron con éter dietílico y se liofilizaron en ácido acético al 10% v/v.

Los péptidos brutos se purificaron en una columna de HPLC de fase inversa C18 semipreparativa (Biorad) utilizando un gradiente lineal desde acetonitrilo al 2% v/v en agua hasta acetonitrilo al 100% v/v (ambos disolventes contenían TFA al 0,1% v/v). Los péptidos purificados eran homogéneos, según se determinó mediante HPLC de fase inversa y espectrometría de masas de desorción de láser de tiempo de vuelo (LaserMat, FinniganMat, RU).

Los péptidos sintetizados según la presente invención se muestran en las Tablas 1A, 1B y 1C. Los péptidos 144, 145 y 146 son péptidos solapantes contenidos dentro de la región C-terminal conservada de la proteína M. Jcon es un péptido modelo basado en la repetición de héptadas de la proteína de levadura GCN4. Los péptidos J1-J9 son péptidos híbridos basados en el péptido Jcon, y p145, 145.1-145.5 y J_{l}1-J_{l}9 representan secuencias más cortas dentro de la secuencia p145. Los péptidos 169 y 171 se derivan de la miosina de músculo cardíaco humana (Liew et al., 1990) y la miosina de músculo esquelético humana (Saez et al., 1986), respectivamente, y muestran la mayor homología entre estas proteínas y p145.

Ejemplo 5 Ensayos de proliferación de células T

Para la sensibilización de células T murinas, los animales se inmunizaron en la base de la cola con 30 \mug de péptido emulsionado, se tomaron células de nodo linfático de drenaje en el día 8 y se estimularon in vitro con antígeno como se ha descrito previamente (Pruksakorn et al., 1994b). Después de cuatro días, los cultivos se pulsaron con 0,5 \mug de ^{3}H-timidina para determinar el grado de proliferación. La activación de linfocitos se midió estimando el índice de estimulación [SI] (proliferación en presencia de un péptido específico/proliferación en ausencia del péptido).

Se determinó la proliferación de células T específicas de un péptido humano cultivando linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos con péptido (o sin péptido para el control) y estimando la proliferación de linfocitos después de seis días, como se describió (Pruksakorn et al., 1994b). La activación de los linfocitos se determinó como se describió anteriormente para los ensayos murinos.

Ejemplo 6 Comparación de secuencias de proteínas

Se realizó una búsqueda en secuencias de proteínas para la miosina de músculo cardíaco humana y la miosina de músculo esquelético humana para determinar homologías con la secuencia de 20 aminoácidos de p145 utilizando el programa BESTFIT de GCG (Wisconsin). Las regiones de homología con p145 están representadas por los dos péptidos 169 y 171 (Tabla 1C).

Ejemplo 7 Espectros de dicroismo circular (CD)

Éstos se registraron a temperatura ambiente con un espectrómetro Aviv 62DS CD (Lakewood, NJ). Los péptidos se usaron a una concentración de 20 mM o 40 mM en tampón fosfato de Na 10 mM, pH 7,0, trifluoroetanol al 50% v/v. Los datos se recogieron a intervalos de 1 nm desde 250 nm hasta 190 nm. La elipticidad se indica como elipticidad media de resto (\theta).

Ejemplo 8 Producción de antisueros murinos

Se inmunizaron ratones B1O.BR y B1O.D2 por vía subcutánea en la base de la cola (Pruksakorn et al., 1992). Se administró un volumen total de 50 \mul, que contenía 30 \mug de péptido disuelto en PBS y emulsionado en adyuvante de Freund completo. Los péptidos 145.1-145.5 se conjugaron con el toxoide de difteria (TD) utilizando fijación con glutaraldehído antes de la inmunización, mientras que todos los demás péptidos se administraron sin conjugar. Los ratones se reforzaron con 30 \mug de péptido conjugado en PBS.

Ejemplo 9 ELISA

Los protocolos para el ELISA se han descrito previamente (Pruksakorn et al., 1992; 1994a). Los péptidos se revistieron a una concentración de 0,5 \mug/ml, excepto para los péptidos 145.1-145.5 y J_{l}1-J_{l}9, en los que se utilizó 1 \mug/ml.

Las valoraciones para los sueros de ratón y humano se calcularon como significativas si se observaban más de tres desviaciones estándar por encima de la media para el suero de ratón normal o por encima del fondo (sin suero) para sueros humanos. Los ensayos de disminución de anticuerpos específicos de péptido se realizaron con sueros humanos mediante incubación en placas revestidas con péptido p145 hasta que la unión específica casi se agotó. Como control negativo, los sueros se incubaron de forma similar en placas revestidas con un péptido de esquistosoma irrelevante. Los sueros deficientes en p145 o deficientes en esquistosoma entonces se trasladaron a placas revestidas con un péptido de ensayo para determinar la presencia de anticuerpos contra el péptido de ensayo. Todas las reacciones se revelaron con kit de sustrato OPD (Sigma Chemical Co) y la absorbancia se leyó a 450 nm.

Ejemplo 10 Inhibición peptídica de la opsonización

Sueros humanos se inactivaron con calor a 60ºC durante 15 minutos. El suero entonces se incubó con 100 \mug de péptido o PBS durante 30 minutos antes de la adición de EGA y sangre heparinizada completa fresca de donante. Se calculó el porcentaje de inhibición comparando las unidades formadoras de colonias que crecen con y sin péptido, y en relación con el control al que no se le añadieron sueros humanos.

Ejemplo 11 Base lógica para el diseño de péptidos quiméricos

Si se sabe que un epitopo reside dentro de una conformación estructural particular de una proteína, tal como una estructura helicoidal en \alpha-hélice, entonces puede sintetizarse un péptido modelo para que se pliegue en esta conformación. Esta péptido será el péptido de marco de trabajo. Los péptidos modelo que se pliegan en una estructura helicoidal en \alpha-hélice se han estudiado. En el diseño de un motivo helicoidal bicatenario paralelo, varias consideraciones son importantes (Cohen y Parry, 1990). Las posiciones a y d tienen restos apolares grandes, las posiciones b, c y f en general son polares y cargados, y las posiciones e y g normalmente favorecen interacciones iónicas intercatenarias (es decir, el par ácido/base de Glu/Lys). También se ha advertido que cuando las posiciones a y d están ocupadas por V y L, o I y L, se favorece un dímero helicoidal, mientras que I e I favorecen la formación de trímeros, y L e I favorecen interacciones de tetrámeros (Harbury et al., 1994).

Se diseño un péptido helicoidal en \alpha-hélice modelo basándose en la estructura de un péptido que se corresponde con la cremallera de leucina de GCN4 (O'Shea et al., 1989; 1991). Este péptido tiene una repetición de leucina de siete restos (en la posición d) y una Val consenso en la posición a. La primera héptada contiene la secuencia:

M K Q L E D K

(SEQ ID NO: 3),

que incluye varias de las características que se encuentran en una repetición de héptadas helicoidal estable. Éstas incluyen un par ácido/base (Gly/Lys) en las posiciones e y g, grupos polares en las posiciones b, c y f (coherentes con la predicción de Lupas et al. (1991)). Se derivó una repetición de héptadas modelo a partir de las características consenso del péptido de cremallera de leucina de GCN4:

V K Q L E D K

(SEQ ID NO: 2),

que cuando se repite produce un péptido modelo, (VKQLEDK)_{n}, con el potencial de formar una estructura helicoidal en \alpha-hélice. Este péptido modelo formado por cuatro repeticiones de héptadas se denomina (GCN4)_{4} (Figura 1A). Los fragmentos solapantes del epitopo conformacional que se está estudiando entonces se introducen en el péptido helicoidal modelo, para registrarse con la repetición de héptadas, para producir un péptido quimérico.

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Ejemplo 12 Péptidos de la proteína M estreptocócica

El péptido p145 de la proteína M estreptocócica se preparó como se ha descrito previamente (Pruksakorn et al., 1992, Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU93/00131 [documento WO 93/21220]), así como los fragmentos truncados 145.1, 145.2, 145.4, 145.5, 145.12, 145.13 y 145.14 (Pruksakorn et al., 1994), que se muestran en las Tablas 1A y 1B.

La secuencia de la proteína M estreptocócica, en la región del péptido p145, se analizó para descubrir repeticiones de héptadas helicoidales y se asignaron las posiciones a a g de héptadas putativas (Figura 1B). El péptido p145 se rompió en nueve péptidos 12-meros que se solapan en un resto y, mediante la adición de péptidos de GCN4 flanqueantes, se introducen en el péptido de marco de trabajo (GCN4)_{4} para producir nueve péptidos quiméricos J (J1-J9), como se muestra en la Figura 1C. Se incorporaron sustituciones de aminoácidos conservadoras en los péptidos J cuando se encontraba un resto idéntico en el péptido modelo de GCN4 y la secuencia p145. Se sintetizó un péptido control (Jcon), basado en el péptido modelo de GCN4 mostrado en la Figura 1A, que también contenía todas estas sustituciones de aminoácidos conservadoras (Figura 1D).

Los péptidos quiméricos J1-4 y el péptido control Jcon se purificaron mediante HPLC. Los péptidos J5-9 se utilizaron según se sintetizaron.

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Ejemplo 13 El epitopo inmunodominante sobre el péptido 145 es conformacional

En un principio se intentó cartografiar el epitopo mínimo dentro de p145 utilizando péptidos 8-meros y 12-meros solapantes dentro de p145 (péptidos 145.1-145.5, J_{l}1, J_{l}5, J_{l}7) (Tablas 1A y 1B). Antisueros anti-p145 de ratón no reconocieron el p145 solapante (Tabla 1C) ni ninguno de los péptidos más cortos dentro de p145, aunque pudo generarse una respuesta inmunológica específica de p145 en ratones utilizando dos de los péptidos más cortos (145.1, 145.5) conjugados con el toxoide de difteria (Tabla 2). Los resultados fueron similares tanto si los péptidos inmunizantes se conjugaron con el toxoide de difteria como si no estaban conjugados. Mientras que más de 90% de los seres humanos que viven en áreas de alta exposición a EGA tienen anticuerpos contra p145, la mayoría de estos sueros humanos con altas valoraciones (>6.400) contra p145 no reaccionan con los péptidos más cortos (J_{l}1-J_{l}9) (Tablas 1B, 3). Estos resultados indican que aunque existen uno o más epitopos lineales dentro de p145, también existe un epitopo conformacional dominante que es reconocido después de la inmunización con p145, o después de una exposición natural a EGA. El dicroismo circular indica que aunque p145 tiene una propensión helicoidal (en TFE al 10%), un péptido 12-mero más corto (J_{l}1: LRRDLDASREAK [SEQ ID NO: 23]) no la tiene (Figura 4), lo cual sugiere también que el epitopo inmunodominante expresado por p145 es conformacional.

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Ejemplo 14 Cartografiado del epitopo conformacional

Entonces se desarrolló una estrategia para utilizar una proteína no relacionada que también muestra una periodicidad de héptadas similar a la proteína M con restos hidrófobos y estimulantes de hélice, y para introducir secuencias de p145 dentro de este otro péptido. El péptido elegido se basa en el motivo de cremallera de leucina en GCN4, la proteína de unión a ADN de levadura (O'Shea et al., 1991). La secuencia consenso de la repetición de héptadas presente en GCN4 es Val-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys, y se diseño un péptido de 28 aminoácidos basado en esta repetición con una pocas sustituciones, para producir un péptido denominado "Jcon" (Tabla 1B). Se insertó una ventana de 12 aminoácidos de la secuencia del péptido p145 en el péptido Jcon, de tal manera que se conserva cualquier estructura helicoidal potencial. La ventana se desplazó un resto cada vez para producir nueve péptidos (J1\rightarrowJ9) que representan la secuencia de p145 completa. Las secuencias de inserto de 12 aminoácidos correspondientes (J_{l}1\rightarrowJ_{l}9) también se sintetizaron con fines de control (Tabla 1B).

Los anticuerpos de ratón p145 muestran una gama de reactividad frente a los péptidos quiméricos J (Figura 2). Algunos de estos péptidos J (es decir, J7, J8) contienen las mismas secuencias 12-meras que anteriormente (145.12, 145.13, 145.14, respectivamente), pero presentes dentro del marco de trabajo de GCN4 (es decir, J1, J5, J7). Algunos sueros reaccionaron con los péptidos J que representan los restos N-terminales de p145 (es decir, J1, J2), algunos con restos C-terminales, y algunos con ambos (es decir, J1, J2, J4, J7, J8) (Figura 2). Ninguno de los sueros reaccionó con la secuencia Jcon.

Los sueros humanos que contienen anticuerpos 145 con alta valoración muestran un espectro similar de especificidad para los péptidos J, produciendo una "huella" de anticuerpos específicos de péptido. Todos los sueros humanos reaccionaron con J2 (Figura 3). Dos sueros reaccionaron con todos los péptidos J, así como con el péptido Jcon. En estos casos, las respuestas específicas a los péptidos J pueden estar enmascaradas por una reactividad cruzada con una estructura de tipo GCN4. El resto de los sueros humanos no reaccionaron con el péptido G, indicando unas respuestas específicas a las secuencias de p145.

Los sueros procedentes de seres humanos que viven en áreas de alta exposición a estreptococos y procedentes de ratones inmunizados con p145 se ensayaron entonces para su capacidad de unir estos péptidos quiméricos. Se ensayaron 23 sueros humanos con valoraciones para el péptido 145 mayores que 6.400 (Tabla 3). Los anticuerpos en 19 de estos sueros unieron uno o más péptidos quiméricos con una valoración similarmente alta, pero no reconocieron a ninguno de los péptidos 8-meros solapantes 145.1\rightarrow145.5. Cuatro sueros reaccionaron con uno (J_{l}3) de los 9 péptidos 12-meros solapantes ensayados (J_{l}1\rightarrowJ_{l}9) con una valoración de >3.200 (Tabla 3). Ninguno de los 11 sueros ensayados que no contenían anticuerpos contra p145 contenía anticuerpos contra cualquiera de los péptidos quiméricos, lo cual sugiere con bastante certeza que los anticuerpos que reaccionan con p145 también reaccionan con los péptidos quiméricos. El péptido quimérico que fue reconocido más habitualmente por los antisueros antipéptido 145+ve es J2, con algún reconocimiento de J1 y J3 (Tabla 3). Para confirmar que los anticuerpos específicos de p145 estaban reconociendo a J2, se realizaron estudios de absorción de p145 y pudo demostrarse que sueros humanos sin p145 perdían la capacidad de unirse al péptido quimérico J2 que fue reconocido en un principio (Tabla 4). Por tanto, los restos centrales reconocidos consistían en RRDLDASTEAKK (SEQ ID NO: 24), aunque para algunos individuos (que reconocen a J2, pero no a J1 o J3), los restos centrales son RDLDASREAK (SEQ ID NO: 25). Esta gama corresponde a entre 3 y 3,3 vueltas de una \alpha-hélice. La huella de anticuerpos reconoce probablemente restos discontinuos que se han juntado por el plegamiento helicoidal del péptido. El dicroismo circular indica que los péptidos quiméricos J1\rightarrowJ4 tienen propensión a la formación de hélices en TFE al 50% (Figura 4).

Como la miosina también es una molécula helicoidal y los péptidos derivados de músculo humano tienen una similitud de secuencia con p145 (Tabla 1B), estos sueros humanos tienen el potencial de reconocer epitopos de reactividad cruzada. Sólo dos sueros reaccionaron con estos péptidos (169 y 171) (Tabla 3) y, por tanto, existe poca reactividad cruzada entre los anticuerpos que reconocen p145 y J2 con p169 y p171.

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Ejemplo 15 El péptido J2 conformacionalmente mantenido puede unir anticuerpos opsónicos

Para determinar si anticuerpos humanos específicos del péptido J2 pueden mediar en la opsonización, se investigó si el péptido J2 libre puede inhibir la opsonización por antisueros humanos. Este ensayo se ha utilizado para demostrar que p145, en sí mismo, es la diana de anticuerpos humanos opsónicos. Por tanto, se añadió J2 (100 \mug/ml) a sueros que contenían altas valoraciones de anticuerpos contra p145 para determinar su efecto sobre la opsonización, y se descubrió que inhibía la opsonización en tres de los tres sueros que contienen anticuerpos contra J2 (Tabla 5), pero no en sueros sin anticuerpos anti-J2. Un péptido 20-mero irrelevante que copia una secuencia no estreptocócica no inhibía la opsonización.

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Ejemplo 16 El epitopo de células T sobre el péptido 145 puede distinguirse del epitopo de células B

Para determinar si las células T reconocen la misma región del péptido que los péptidos de unión a anticuerpos críticos, se inmunizaron ratones B10.BR respondedores con p145 y las células de nodo linfático de drenaje se estimularon con p145, J2 y J_{l}2. Se produjo un reconocimiento significativamente menor de J2 y J_{l}2 (Tabla 6). También se ensayaron células T de sangre periférica procedentes de 21 pacientes aborígenes RHD y 8 sujetos aborígenes control para
su respuesta al péptido J2. No se detectó respuesta del grupo control al péptido, y ninguno respondió al péptido J2.

Ejemplo 17 Anticuerpos humanos contra P145, J2 Y J7 pueden opsonizar estreptococos del grupo A en presencia de neutrófilos humanos

Anticuerpos contra p145 se purificaron por afinidad utilizando una columna que muestra múltiples copias de p145. Los anticuerpos purificados de proteína A entonces se hicieron pasar sobre la columna, y los anticuerpos específicos de p145 eluyeron. Antes de pasar sobre la columna, los anticuerpos que reconocen a p145 y el toxoide del tétanos estaban presentes en la preparación de inmunoglobulinas. Después de pasar, los anticuerpos contra p145 aún estaban presentes, pero los anticuerpos contra el toxoide del tétanos ya no podían detectarse. Estos anticuerpos y una preparación control con la misma cantidad de anticuerpos humanos sin reactividad contra p145 se utilizaron entonces en un ensayo de opsonización. Como se muestra en la Tabla 10, los anticuerpos anti-p145 purificados pueden reducir el número de colonias de estreptococos del grupo A de tipo 5 entre 58% y 94% (media: 80%), comparados con inmunoglobulinas control.

Entonces se añadieron diversos péptidos sintéticos a estos anticuerpos purificados y se determinó su efecto sobre la opsonización (tabla 11). Los péptidos utilizados fueron p145, J2, J7 y un péptido no específico que copia una secuencia de esquistosoma. El p145 libre podía inhibir la opsonización en 73-88% (media: 83%), comparado con el péptido no específico; el J2 libre podía inhibir la opsonización en 89-93% (media: 92%); y el J7 libre podía inhibir la opsonización en 82-86% (media: 84%). Estos datos indican que anticuerpos humanos específicos de p145, J2 y J7 son capaces de opsonizar estreptococos del grupo A.

Ejemplo 18

Para ilustrar un enfoque al cartografiado de epitopos dentro de proteínas helicoidales en \alpha-hélice, se estudió en detalle una región dentro de la proteína de paramiosina de Caenorhabditis elegans. Como es habitual en otras proteínas que contienen estructuras helicoidales, la paramiosina de nematodo contiene una periodicidad de siete restos que sugiere, en gran medida, que una gran proporción de la molécula está en una conformación helicoidal. La paramiosina, una proteína central del filamento grueso en muchos invertebrados, está codificada en C. elegans por un único gen, unc-15 (Waterston et al., 1977). Varios mutantes unc-15 tienen fenotipos alterados que producen una estructura muscular muy desorganizada. Se demostró que uno de éstos, el alelo e1215, tiene un fenotipo débilmente descoordinado, y el análisis del gen indicó una única sustitución de aminoácido ^{809}Q a R (Gengyo-Ando y Kagawa, 1991). El epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal (mAb) NE1-6B2, que no reacciona con la paramiosina del mutante e1215, se cartografió en esta mutación puntual.

El enfoque empleado fue utilizar péptidos solapantes derivados de un epitopo conformacional helicoidal en \alpha-hélice, y se introdujeron estos péptidos entre los péptidos flanqueantes helicoidales derivados de una proteína sin relación alguna, con una conformación nativa. Los péptidos quiméricos resultantes pueden ensayarse para la actividad inmunológica, es decir, antigenicidad (reconocimiento por un mAb) o inmunogenicidad (producción de una respuesta de anticuerpos apropiada). En el caso de la proteína de paramiosina de C. elegans, unc-15, se piensa que la estructura es helicoidal en \alpha-hélice, y es posible que sea necesario que esta conformación esté presente para una respuesta inmunológica óptima con respecto al epitopo reconocido por mAb. Una serie de péptidos quiméricos basados en unc-15 han permitido un cartografiado preciso del epitopo mínimo de células B reconocido por mAb NE1-6B2. Este enfoque tiene el potencial de cartografía epitopos conformacionales y de diseñar epitopos mínimos para su uso como candidatos de vacunas.

(i) Base lógica para el diseño de péptidos quiméricos

Si se sabe que un epitopo reside dentro de una conformación estructural particular de una proteína, es decir, una \alpha-hélice, entonces puede sintetizarse un péptido modelo para que se pliegue en esta conformación. Este péptido será el péptido de marco de trabajo. Los péptidos modelo que se pliegan en una estructura helicoidal en \alpha-hélice han sido bien estudiados. En el diseño de un motivo helicoidal bicatenario paralelo (a-b-c-d-e-f-g)_{n}, varias consideraciones son importantes (Cohen y Parry, 1990). Las posiciones a y d tienen restos apolares grandes, las posiciones b, c y f en general son polares y cargados, y las posiciones e y g normalmente favorecen interacciones iónicas intercatenarias (es decir, el par ácido/base de Glu/Lys). También se ha advertido que cuando las posiciones a y d están ocupadas por V y L, o I y L, se favorece un dímero helicoidal, mientras que I e I favorecen la formación de trímeros, y L e I favorecen interacciones de tetrámeros (Harbury et al., 1994).

Se diseño un péptido helicoidal en \alpha-hélice modelo basándose en la estructura de un péptido que se corresponde con la cremallera de leucina de GCN4 (O'Shea et al., 1989; 1991). Este péptido tiene una repetición de leucina de siete restos (en la posición d) y una valina consenso (en la posición a). La primera héptada contiene la secuencial: MKQLEDK (SEQ ID NO: 3), que incluye varias de las características que se encuentran en una repetición de héptadas helicoidal estable. Éstas incluyen un par ácido/base (Gly/Lys) en las posiciones e y g, y grupos polares en las posiciones b, c y f. Se derivó una repetición de héptadas modelo a partir de las características consenso del péptido de cremallera de leucina de GCN4: VKQLEDK (SEQ ID NO: 3), que cuando se repite produce un péptido modelo, (VKQLEDK)_{n}, con el potencial de formar una estructura helicoidal en \alpha-hélice. Los fragmentos solapantes del epitopo conformacional que se está estudiando entonces se introducen en el péptido helicoidal modelo, para producir un péptido quimérico.

(ii) Cartografiado de epitopos de péptidos nativos de fragmentos solapantes de unc-15

La secuencia de la proteína de paramiosina de C. elegans unc-15, en la región del epitopo reconocido por mAb NE1-6B2, se analizó para detectar repeticiones de héptadas helicoidales y se asignaron las posiciones de héptadas a a g putativas (Tabla 7A).

En un intento inicial de cartografiar el epitopo de mAb NE1-6B2 dentro de la proteína unc-15, se sintetizaron péptidos 21-meros solapantes compensados por 1 resto aminoácidos (Tabla 7B) y se ensayaron mediante ELISA. El péptido ba39 tiene la mayor reactividad en ELISA, lo cual sugiere que un péptido 21-mero es lo suficientemente largo para el reconocimiento del epitopo. La reactividad del anticuerpo monoclonal se restringió a los péptidos ba37 a c9 (Figura 5). La reactividad negativa de mAb por el péptido ba36 delinea la extensión del epitopo hacia el C-terminal de la proteína y confirma el requerimiento del resto ^{809}Q dentro del epitopo (Gengyo-Ando y Kagawa, 1991). La reactividad del anticuerpo disminuye a medida que los péptidos se truncan desde el N-terminal, siendo el péptido c9 sólo débilmente reconocido, sugiriendo que el epitopo mínimo reside entre el solapamiento del péptido ba37 y c8: el péptido 14-mero ADRLTEKLNIQKRQ (SEQ ID NO: 26). Sin embargo, la reactividad máxima se encuentra con el péptido ba39, un péptido 21-mero mucho más largo, MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA (SEQ ID NO: 43), que puede considerarse el epitopo nativo óptimo.

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(iii) Cartografiado de epitopos de péptidos quiméricos de unc-15

La región de la proteína unc-15 que contiene el epitopo de mAb NE1-6B2 se cortó en seis péptidos 15-meros compensados por 5 restos y, mediante la adición de péptidos flanqueantes helicoidales hexámeros, se insertaron en el marco de trabajo helicoidal en \alpha-hélice para producir los péptidos quiméricos bd10, bd11, bc18, bc 23, bd14 y bd15 (tabla 8A). Esta ventana de desplazamiento de 15 restos contiene más de 4 vueltas completas de un \alpha-hélice (3,5 restos por vuelta). Los péptidos bc18, bc23 y bd14 contienen el resto esencial ^{809}Q. Los péptidos flanqueantes helicoidales se basaron en el péptido helicoidal en \alpha-hélice modelo (VKQLEDK)_{n} y se añadieron dentro de marco con la periodicidad de repetición de héptadas de la proteína helicoidal de unc-15. Se incorporaron sustituciones de aminoácidos conservadoras en los péptidos quiméricos cuando se encontró un resto idéntico en el péptido helicoidal modelo y en la secuencia unc-15. Estas sustituciones se diseñaron para asegurar conformaciones helicoidales correctas (Cohen y Parry, 1990). Se utilizaron las siguientes sustituciones: posición a, V a I (resto hidrófobo, favorece los dímeros); b, K a R (grupo funcional cargado similar); c, Q a N (mismo grupo funcional); d, L a A (resto hidrófobo); e, E a Q (resto de tamaño similar); f, D a E (mismo grupo funcional cargado); g, K a R (grupo funcional cargado similar). Todos estos restos de sustitución se encuentran habitualmente en su posición respectiva en proteínas helicoidales (Lupas et al., 1991). Sólo el péptido quimérico bc18 fue reconocido en ELISA por mAb NE1-6B2 (figura 6). Este cartografiado de epitopos bruto sugiere que el péptido 25-mero solapante entre ^{790}V y ^{814}E derivado de los péptidos bd11 y bc23 contiene el epitopo. Los péptidos control, av85 y av86, basados en el péptido modelo (VKQLEDK)_{n} y (VKQLEDK)_{3} (péptido ba48) no fueron reconocidos por mAb NE1-6B2.

La proteína unc-15 entonces se rompió en péptidos 15-meros compensados por 1 resto para cartografiar el epitopo de mAb NE1-6B2 con más precisión. De nuevo, cada fragmento se introdujo dentro de los péptidos flanqueantes helicoidales para producir los péptidos quiméricos listados en la Tabla 8B. La máxima reactividad de ELISA con mAb NE1-6B2 se obtuvo para el péptido bc20 (Figura 6). La actividad fue mínima después de la eliminación del resto ^{809}Q (péptido bc17) al C-terminal y del resto ^{798}R (péptido bc22) al N-terminal de los péptidos unc-15 introducidos dentro de los péptidos quiméricos. Esto indica que el epitopo mínimo se encuentra entre los restos ^{798}R y ^{809}Q, un péptido12-mero: RLTEKLNIQKRQ (SEQ ID NO: 27). Este epitopo es 2 restos más corto que el definido a partir del cartografiado de epitopos nativo anterior (Figura 5).

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(iv) Cartografiado del epitopo mínimo del péptido quimérico de unc-15

Utilizando el enfoque de péptidos quiméricos, el epitopo óptimo contenido dentro del péptido bc20 se truncó para definir mejor el epitopo mínimo reconocido por mAb NE1-6B2. Los péptidos quiméricos sintetizados se listan en la Tabla 9A. El truncamiento del epitopo introducido desde el C-terminal (péptidos bd3, bd4) disminuye la reactividad de ELISA, al igual que el truncamiento desde el N-terminal (péptido be39) (Figura 7A). Un mayor truncamiento de restos desde el N- y C-terminal del epitopo (péptidos bd5, bd6, c4, c5) no fue bien tolerado. Sin embargo, el péptido c6, que contiene los restos ^{801}E a ^{811}A, aún fue reactivo en ELISA. Por tanto, aunque el cartografiado de epitopos de fragmentos solapantes sugiere que RLTEKLNIQKRQ es el epitopo mínimo, el cartografiado de truncamiento indica que los restos ^{797}D, ^{810}L y ^{811}A que flanquean esta región son críticos. Esto define la secuencia
DRLTEKLNIQKRQLA (SEQ ID NO: 95) como el epitopo óptimo mínimo. Además, un péptido 15-mero que consiste en el epitopo óptimo de ^{797}D a ^{811}A (péptido cI) fue reconocido en un grado menor que el mismo péptido introducido en el péptido quimérico bc20. Esto enfatiza la necesidad de regiones flanqueantes para asegurar una reactividad
máxima.

El cartografiado de restos críticos requeridos en el epitopo de mAb NE1-6B2 para reactividad de ELISA se logró mediante la sustitución conservadora de restos individuales. El cartografiado de sustitución se basa en el péptido quimérico bc20 (que contiene el epitopo óptimo) y los péptidos sintetizados se listan en la Tabla 9B. Los restos de marco de trabajo helicoidal se sustituyeron por restos de epitopo según las reglas del péptido modelo anteriores; posición a, V; b, K, c, Q; d, L; e, E; f, D; g, K. En el caso de encontrar restos idénticos en la misma posición entre el péptido de marco de trabajo y la secuencia del epitopo, se sustituyen entonces los restos con sustitución conservadora (véase el cartografiado de epitopos de péptidos quiméricos anterior). Se abrogó la reactividad de ELISA cuando se realizaron sustituciones en los restos ^{798}R, ^{801}E, ^{805}I, ^{808}R y ^{809}Q en los péptidos be40, be43, be47, be50 y be51, respectivamente (Figura 7B). También se encontró una disminución en la reactividad del epitopo para otras dos sustituciones, ^{797}D y ^{811}A en los péptidos be39 y be53, respectivamente. De forma interesante, la sustitución en ^{802}K (K a D) y ^{810}L (L a V) aumentó la reactividad. Estos resultados se muestran en la Figura 8A. Cuando la secuencia de unc-15 que contiene el epitopo de mAb NE1-6B2 se muestra pictóricamente como una red cilíndrica (Figura 8B), todos los restos críticos se encuentran en la cara hidrófila de la hélice.

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(v) Inmunogenicidad de péptidos quiméricos

Se inmunizaron ratones Quackenbush con péptidos quiméricos para determinar la capacidad para inducir una respuesta de anticuerpos específica de epitopo. El péptido quimérico bc20 se sintetizó con un resto cisteína N-terminal para acoplarse al toxoide de difteria a través de un enlace MCS (péptido bd1, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQ
LAQLQDKVK [SEQ ID NO: 28]). Los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal con el equivalente de 125 \mug de péptido, conjugado con el toxoide de difteria emulsionado en adyuvante de Freund completo. Se administró un refuerzo de 125 \mug de equivalentes de conjugado de péptido-difteria en adyuvante de Freund incompleto después de 4 semanas. Los antisueros generados contra el péptido bd1 reconocieron al péptido bc20, pero no al péptido ba39 ni al péptido c1 (Figura 9), mientras que los antisueros generados contra un péptido quimérico control basado en el péptido helicoidal modelo, con sustituciones de aminoácidos adecuadas (péptido bd2, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK) reconocieron al péptido bc20 pero no al péptido ba39 ni al péptido c1. Por tanto, la respuesta de anticuerpo generada con el péptido quimérico bd1 fue contra un epitopo conformacional que sólo se encuentra en los péptidos bc20 y
ba39.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible de variaciones y modificacionas distintas de las que se describen de modo concreto. Debe entenderse que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta memoria descriptiva, de modo individual o colectivo, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquier dos o más de dichas etapas o características.

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TABLA 1A Lista de fragmentos sintéticos solapantes de p145

2

Los péptidos solapantes representan la región p145 de la proteína M de estreptococos del grupo A; posiciones de aminoácidos 337 a 356.

TABLA 1B Péptidos sintéticos

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{160mm} Nota: código de aminoácidos de una
sola letra: A, alanina; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; G,
glicina; K, lisina; L, leucina; N, asparagina; Q, glutamina; R,
arginina; S, serina; V, valina; los restos en negrita representan la
secuencia de la proteína M.
\end{minipage} \cr}

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TABLA 1C Péptidos sintéticos

4

5

6

7

TABLA 4

8

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TABLA 5

9

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TABLA 6

10

TABLA 7 Lista de péptidos sintéticos derivados de C. elegans unc-15 nativo

11

TABLA 8 Lista de péptidos quiméricos sintetizados que contienen fragmentos de C. elegans unc-15

12

TABLA 9 Lista de péptidos sintéticos quiméricos que contienen fragmentos truncados o sustituidos de C. elegans unc-15

13

TABLA 10

14

15

16

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\hskip1cm (en países que no son EEUU)

\hskip1cm THE COUNCIL OF THE QUEENSLAND INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH

\hskip1cm (sólo en EEUU)

\hskip1cm COOPER, J.A., RELF, W.A., GOOD, M.F. y SAUL, A.J.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS SINTÉTICOS Y VACUNAS QUE LOS COMPRENDEN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 94

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE

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(B): CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET

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(C): CIUDAD: MELBOURNE

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(D): ESTADO: VICTORIA

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(E): PAÍS: AUSTRALIA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 3000

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(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT INTERNACIONAL

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-OCT-1995

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PM8851

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-OCT-1994

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: HUGHES DR., E. JOHN L.

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: EJH/EK

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: +61 3 9254 2777

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: +61 3 9254 2770

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu}

\sac{Lys Ala Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys}

\sac{Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser}

\sac{Arg Glu Ala Lys Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Ala Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg}

\sac{Glu Ala Lys Lys Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu}

\sac{Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala}

\sac{Lys Lys Gln Val Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys}

\sac{Lys Gln Val Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys}

\sac{Gln Val Glu Lys Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys}

\sac{Gln Val Glu Lys Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val}

\sac{Glu Lys Ala Leu Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu}

\sac{Lys Ala Leu Glu Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\sac{Val Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn}

\sac{Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Asp Ile Asp Asp Leu Glu Leu Thr Leu Ala Lys Val Glu}

\sac{Lys Glu Lys His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ser Asp Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Ser Glu Arg Leu}

\sac{Glu Glu Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Lys Ile Ser Glu Ala Ser Arg Lys Gly Leu Arg Arg Asp Leu Asp}

\sac{Ala Ser Arg Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala Leu Glu Glu Ala Asn Ser Lys Leu}

\sac{Ala Ala Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu}

\sac{Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser Glu Ser Val Thr Met Gln}

\sac{Asn Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu}

\sac{Asn Ile Gln Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn}

\sac{Ile Gln Lys Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln}

\sac{Lys Arg Gln Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys}

\sac{Arg Gln Leu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg}

\sac{Gln Leu Ala Glu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln}

\sac{Leu Ala Glu Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu}

\sac{Ala Glu Ser Glu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala}

\sac{Glu Ser Glu Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu}

\sac{Ser Glu Ser Val Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser}

\sac{Glu Ser Val Thr Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Asp Lys Ile Lys Gln Gln His Lys Asn Phe Val Met Ala Gln}

\sac{Asp Thr Ala Asp Arg Leu Glu Asp Arg Val Lys Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Asp Arg}

\sac{Leu Thr Glu Lys Leu Asn Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Lys Gln Leu Glu Glu Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu}

\sac{Asn Ile Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg}

\sac{Gln Leu Ala Glu Ser Glu Asp Lys Val Lys Asn Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Glu Asp Arg Val Lys Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala Glu Ser}

\sac{Glu Ser Val Thr Met Gln Leu Glu Asp Lys Ile Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Leu Ala Glu Ser Glu Ser Val Thr Met}

\sac{Gln Asn Leu Gln Arg Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys}

\sac{Leu Asn Ile Gln Lys Arg Lys Val Lys Gln Leu Gln Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Lys Gln Leu Glu Glu Thr Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu}

\sac{Asn Ile Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Leu Glu Glu Lys Ala Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn}

\sac{Ile Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln}

\sac{Lys Arg Gln Leu Ala Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys}

\sac{Arg Gln Leu Ala Glu Ser Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg}

\sac{Gln Leu Ala Glu Ser Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln}

\sac{Leu Ala Glu Ser Glu Ser Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu}

\sac{Ala Glu Ser Glu Ser Val Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys}

\sac{Val Glu Glu Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Val Lys Gln Ala Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ser Arg Glu Ala}

\sac{Lys Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Lys}

\sac{Gln Leu Glu Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Val Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Gln Ala Glu Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile Gln Lys Arg Gln Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Gln Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Ala Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Glu Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Asp Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Arg Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Val Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Lys Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Gln}

\sac{Gln Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Leu Lys Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Glu Arg Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Asp Gln Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Leu Glu Glu Lys Val Asp Arg Leu Thr Glu Lys Leu Asn Ile}

\sac{Gln Lys Arg Gln Val Ala Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys}

Claims

1. Un péptido quimérico, que comprende:

en el que la primera y segunda secuencia de aminoácidos se derivan o se basan en diferentes péptidos, polipéptidos o proteínas, y la primera secuencia de aminoácidos está insertada dentro de la conformación helicoidal dentro de la segunda secuencia de aminoácidos, de forma que la primera secuencia de aminoácidos presenta el epitopo conformacional.

2. Un péptido quimérico según la reivindicación 1, en el que dicha segunda secuencia de aminoácidos asume una conformación helicoidal en \alpha-hélice.

3. Un péptido quimérico según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos se deriva de la proteína M estreptocócica.

4. Un péptido quimérico según la reivindicación 3, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos comprende un epitopo conformacional de células B procedente del interior de la secuencia de aminoácidos LRRDLDASREAKKQ
VEKALE [SEQ ID NO: 1] o un equivalente funcional y/o químico de uno o más de estos restos aminoácidos.

5. Un péptido quimérico según la reivindicación 4, en el que al menos tres aminoácidos se seleccionan de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO: 1, que constituye un epitopo conformacional de células B.

6. Un péptido quimérico según la reivindicación 4, en el que al menos cinco aminoácidos se seleccionan de la secuencia de aminoácidos que aparece en SEQ ID NO: 1, que constituye un epitopo conformacional de células B.

7. Un péptido quimérico según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos se deriva de Caenorhabditis elegans.

8. Un péptido quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos se deriva de la proteína unc-15 de paramiosina de Caenorhabditis elegans.

9. Un péptido quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos comprende un epitopo conformacional de células B procedente del interior de la secuencia de aminoácidos CKQLEEKVDRL
TEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID NO: 28] o un equivalente funcional y/o químico de uno o más de estos restos aminoácidos.

10. Un péptido quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos comprende un epitopo conformacional de células B procedente del interior de la secuencia de aminoácidos MAQDTADRLTEKL
NIQKRQLA [SEQ ID NO: 43].

11. Un péptido quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos comprende un epitopo conformacional de células B procedente del interior de la secuencia de aminoácidos ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 26] o un equivalente funcional y/o químico de uno o más de estos restos aminoácidos.

12. Un péptido quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha primera secuencia de aminoácidos comprende un epitopo conformacional de células B procedente del interior de la secuencia de aminoácidos RLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 27] o un equivalente funcional y/o químico de uno o más de estos restos aminoácidos.

13. Una vacuna útil contra estreptococos del grupo A, que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 5, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en la que los al menos tres aminoácidos seleccionados del interior de la secuencia de aminoácidos LRRDLDASREAKKQVEKALE [SEQ ID NO: 1] constituyen un epitopo conformacional de células B de la proteína M estreptocócica.

14. Un vacuna útil contra Caenorhabditis elegans, que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 8, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en la que la primera secuencia de aminoácidos tiene al menos tres aminoácidos seleccionados del interior de la secuencia de aminoácidos CKQLEEKVDRLTEKL
NIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID NO: 28] que constituyen un epitopo conformacional de células B de la proteína unc-15 de C. elegans.

\newpage

15. Un vacuna útil contra Caenorhabditis elegans, que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 10, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en la que al menos tres aminoácidos seleccionados del interior de la secuencia de aminoácidos MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID NO: 43] constituyen un epitopo conformacional de células B de la proteína unc-15 de C. elegans.

16. Un vacuna útil contra Caenorhabditis elegans, que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 11, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en la que al menos tres aminoácidos seleccionados del interior de la secuencia de aminoácidos ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 26] constituyen un epitopo conformacional de células B de la proteína unc-15 de C. elegans.

17. Un vacuna útil contra Caenorhabditis elegans, que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 12, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, en la que los al menos tres aminoácidos seleccionados del interior de la secuencia de aminoácidos RLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 27] constituyen un epitopo conformacional de células B de la proteína unc-15 de C. elegans.

18. Un método para cartografiar regiones de hélices anfipáticas sobre un péptido, polipéptido o proteína, que son reconocidas por anticuerpos, y/o para determinar un epitopo mínimo sobre un péptido, polipéptido o proteína, comprendiendo dicho método:

determinar la conformación nativa de dicho péptido, polipéptido o proteína, o una porción de éstos, que porta un epitopo putativo;

preparar fragmentos peptídicos de dicho péptido, polipéptido o proteína;

insertar, o presentar de otra forma, dichos fragmentos peptídicos en un segundo péptido derivado o basado en otro péptido, polipéptido o proteína, que es capaz de plegarse en una conformación helicoidal de marco de trabajo de conformación similar a la nativa de dicho péptido, polipéptido o proteína mencionados en primer lugar, estando insertados los fragmentos peptídicos dentro de la conformación helicoidal del segundo péptido, de forma que el epitopo putativo sobre el fragmento peptídico se presenta en una conformación capaz de una interactividad inmunológica, y después seleccionar dichos fragmentos peptídicos para la interactividad inmunológica.