BR112016023915B1

BR112016023915B1 - Usos de fragmento de proteína m e composição

Info

Publication number: BR112016023915B1
Application number: BR112016023915-6A
Authority: BR
Inventors: Manisha Pandey; Michael Batzloff; Michael Good
Original assignee: Griffith University
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2024-03-12
Also published as: US20170037087A1; NZ725212A; JP2021042247A; MY191217A; JP2017513849A; US10301362B2; AU2015246654B2; CA2945052C; CA2945052A1; WO2015157820A1; JP7072921B2; EP3131575B1; KR20230039751A; US20190256562A1; AU2015246654A1; BR112016023915A2; CN106794236A; EP3131575A1; SG11201608380PA; US10513544B2

Abstract

usos de fragmento, uso de uma proteína m, composições, peptídeo isolado, anticorpo, ácido nucleico isolado, construção genética e célula hospedeira são fornecidos método e composição para permitir reação imunológica a bactérias estreptocócicas do grupo a em mamíferos, que incluem a administração ao mamífero de fragmento de proteína m, sua variante ou derivado e uma proteína spycep ou fragmento de peptídeo, ou um anticorpo à proteína spycep ou fragmento para facilitar a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos. também é fornecido um fragmento de peptídeo imunodominante de spycep.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à prevenção e tratamento de doenças infecciosas. Particularmente, a presente invenção refere-se a uma vacina de tratamento ou prevenção de doenças e condições associadas a estreptococos de estreptococos do grupo A.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] São procuradas há muito tempo vacinas contra Streptococcus pyogenes (o estreptococo do grupo A Lancefield; GAS) devido a doenças debilitantes causadas pela bactéria, particularmente febre reumática e doença reumática cardíaca. Febre reumática é atualmente uma doença incomum na maioria dos países desenvolvidos, mas permanece sendo a principal causa de doenças cardíacas adquiridas em crianças, adolescentes e jovens adultos no mundo em desenvolvimento. Além disso, doença GAS invasiva é uma causa frequente de sepsia em crianças e adultos e possui alta taxa de mortalidade. Adiciona-se ainda ao encargo de doenças GAS glomerulonefrite pós-estreptocócica, que provavelmente contribui com as altas taxas de parada renal em estágio final em muitas regiões endêmicas de GAS. Faringite e impetigo GAS são responsáveis pelo maior número absoluto de infecções GAS todos os anos. Faringite GAS afeta cerca de 8%-15% de crianças em idade escolar por ano e impetigo GAS é uma infecção muito comum, com prevalência em crianças de 10-50%. Doenças associadas a GAS severas não são apenas um problema em países em desenvolvimento, mas, até em países desenvolvidos, surgiram linhagens de GAS particularmente virulentas que são resistentes a terapias com antibióticos padrão e causam doenças debilitantes, como fasciíte necrosante severa.

[003] Um fator de virulência importante de GAS é proteína M, que é fortemente antifagocitária e liga-se ao fator de soro H, destrói convertase C3 e evita a opsonização por C3b. Foram desenvolvidas vacinas que contêm peptídeos imunogênicos da porção de repetição C conservada da proteína M, como epítopos de células T e B da região de repetição C ou as vacinas de peptídeo J8 e J14 que contêm epÍtopos de células B mínimas isolados dessa região de repetição C.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[004] Surpreendentemente, os inventores do presente descobriram que um fator importante em imunidade induzida por peptídeo J8 ao estreptococo do grupo A é atividade de neutrófilos. Embora testes de opsonização in vitro utilizem sangue integral como fonte de neutrófilos e complemento, não se sabia que neutrófilos eram necessários para proteção in vivo. Além disso, testes de opsonização demonstram reduções relativamente modestas de CFU (tipicamente, menos de dez vezes), enquanto proteção induzida por J8 in vivo pode resultar em reduções em várias ordens logarítmicas do encargo biológico bacteriano. Mais especificamente, os inventores do presente demonstram agora que inibidores de neutrófilos como SpyCEP, que inativa o agente quimiotático de neutrófilos interleucina 8, funcionam contra J8 na indução de imunidade a estreptococo do grupo A.

[005] De forma ampla, a presente invenção refere-se, portanto, à restauração ou aprimoramento de atividade de neutrófilos, de forma a auxiliar na imunidade induzida por proteína M a estreptococos do grupo A.

[006] Um aspecto da presente invenção fornece um método para permitir reação imunológica a bactérias estreptocócicas do grupo A em mamíferos, em que o mencionado método inclui a etapa de administração ao mamífero de: um fragmento de proteína M, sua variante ou derivado; e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos; de forma a permitir reação imunológica a bactérias estreptocócicas do grupo A no mamífero.

[007] Outro aspecto da presente invenção fornece um método de imunização de mamíferos contra bactérias estreptocócicas do grupo A, em que o mencionado método inclui a etapa de administração ao mamífero de: uma proteína M, seu fragmento, variante ou derivado; e um agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos, de forma a imunizar o mamífero contra bactérias estreptocócicas do grupo A.

[008] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de infecções bacterianas de estreptocócicos do grupo A em mamíferos, em que o mencionado método inclui a etapa de administração ao mamífero de um fragmento, variante ou derivado de proteína M, ou um anticorpo ou seu fragmento a ele; e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos; de forma a tratar ou evitar a infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

[009] Outro aspecto da presente invenção fornece uma composição adequada para administração a mamíferos, em que a mencionada composição compreende: um fragmento, variante ou derivado da proteína M, ou um anticorpo ou seu fragmento; e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos.

[0010] Aspectos relacionados da presente invenção fornecem administração de um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam um fragmento, variante ou derivado de proteína M e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos ou uma composição que os compreende.

[0011] Em uma realização específica, o fragmento de proteína M é ou compreende uma região conservada da proteína M. Em uma realização, o fragmento é um fragmento imunogênico que compreende ou é contido dentro de um peptídeo p145. Em uma realização específica, o fragmento imunogênico compreende ou está dentro de um peptídeo J8 ou sua variante. Em certas realizações, a variante compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID N° 59); SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC (SEQ ID N° 60); SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 61); e SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 62); ou seu fragmento ou variante.

[0012] Em uma realização ampla, o agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos é uma proteína, ou seu fragmento, que normalmente inibe ou suprime direta ou indiretamente neutrófilos ou a atividade de neutrófilos. Adequadamente, a administração da proteína ou seu fragmento permite reação imunológica à proteína e/ou estreptococo do grupo A.

[0013] Em outra realização ampla, o agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga uma proteína, ou seu fragmento, que normalmente inibe ou suprime, direta ou indiretamente, neutrófilos ou a atividade de neutrófilos.

[0014] Em uma realização particular, a proteína é SpyCEP, ou um de seus fragmentos.

[0015] Em uma realização preferida, o fragmento compreende a sequência de aminoácidos NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID N° 18).

[0016] Outro aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo isolado que compreende, consiste ou consiste essencialmente da sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID N° 18); SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID N° 59); SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC (SEQ ID N° 60); SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 61); e SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 62); ou um de seus fragmentos ou variantes.

[0017] Um aspecto relacionado fornece um ácido nucleico isolado que codifica o peptídeo isolado do aspecto acima mencionado, uma construção genética que compreende o ácido nucleico isolado e/ou uma célula hospedeira que compreende a construção genética.

[0018] Outro aspecto relacionado fornece um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga ou é criado contra o peptídeo isolado do aspecto acima mencionado.

[0019] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece uma composição que compreende o peptídeo isolado, o ácido nucleico isolado, a construção genética, a célula hospedeira e/ou o anticorpo ou fragmento de anticorpo dos aspectos anteriores.

[0020] Conforme utilizado neste documento, os artigos indefinidos “um” e “uma” são empregados no presente para indicar ou englobar elementos ou características no singular ou no plural e não deverão ser interpretados com significando ou definindo “um” ou um “único” elemento ou característica.

[0021] A menos que o contexto exija em contrário, os termos “compreende”, “compreendem” e a expressão “que compreende(m)” ou similares destinam-se a indicar inclusão não exclusiva, de forma que uma lista indicada de elementos ou características não inclui apenas aqueles elementos mencionados ou relacionados, mas sim pode incluir outros elementos ou características que não são mencionados ou relacionados.

[0022] “Consiste essencialmente de”, no contexto de uma sequência de aminoácidos, indica a sequência de aminoácidos indicada em conjunto com um, dois ou três aminoácidos adicionais no terminal N ou C.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] Figura 1: eficácia protetora de vacinação com J8- DT/Alúmen.

[0024] Figura 2: neutrófilos em imunidade mediada por J8-DT. E: Epiderme. D: Derme. SC: Camada subcutânea.

[0025] Figura 3: esgotamento de neutrófilos e eficácia da vacinação com J8-DT.

[0026] Figura 4: visão geral da expressão genética elevada no mutante de CovR/S GAS de um isolado de M1T1.

[0027] Figura 5: eficácia de J8-DT em proteção contra 5448AP.

[0028] Figura 6: degradação de IL-8 por várias linhagens de GAS.

[0029] Figura 7: degradação de MIP-2 por várias linhagens de GAS.

[0030] Figura 8: degradação de KC por várias linhagens de GAS.

[0031] Figura 9: efeito de vários isolados de GAS sobre a capacidade quimiotática de quimiocinas.

[0032] Figura 10: proteção contra linhagem de GAS 5448AP por meio de imunização com J8-DT-rSpyCEP/Alum.

[0033] Figura 11: imunogenicidade de J8-DT-SpyCEP conforme medido por meio da produção de IgG específica de antígenos.

[0034] Figura 12: inibição da atividade de degradação de IL-8 de SpyCEP por antissoro rSpyCEP.

[0035] Figura 13: mapeamento de epítopos de peptídeos 20 mer sobrepostos (sobreposição de 10 aminoácidos) que abrangem os resíduos 35587 de SpyCEP (SEQ ID N° 1-55 em ordem decrescente). Peptídeos em negrito são os peptídeos que foram selecionados por meio de mapeamento de epítopos.

[0036] Figura 14: realizou-se reatividade de antissoro SpyCEP antirrecombinante com epítopos de peptídeos individuais. Mapeamento de epítopos de células B de SpyCEP (553 aminoácidos) utilizando um teste de peptídeos. Peptídeos 20 mer com sobreposição em dez aminoácidos conforme exibido na Figura 13 foram sondados com antissoro rSpyCEP.

[0037] Figura 15: identificação de 6 (seis) epítopos que demonstram forte reatividade com antissoro SpyCEP antirrecombinante. S1 = SEQ ID N° 15; S2 = SEQ ID N° 18; S3 = SEQ ID N° 19; S4 = SEQ ID N° 24; S5 = SEQ ID N° 30; e S6 = SEQ ID N° 54.

[0038] Figura 16: imunogenicidade e reconhecimento de peptídeo parental por antissoro de epítopo SpyCEP.

[0039] Figura 17: inibição de degradação de IL-8 por antissoro de epítopo SpyCEP.

[0040] Figura 18: títulos α-p145-DT e α-J8-DT murinos para autopeptídeos e ELISAs de reconhecimento cruzado.

[0041] Figura 19: títulos α-J8i DT variantes murinos para autopeptídeos.

[0042] Figura 20: ELISAs de reconhecimento cruzado.

[0043] Figura 21: identificação de epítopo imunodominante em recSpyCEP. Para identificar o epítopo imunodominante em recSpyCEP, realizou-se ELISA de inibição de peptídeos. Coortes de camundongos BALB/c (4-6 semanas) foram imunizados por via subcutânea com conjugados de epítopo SpyCEP-DT ou SpyCEP nos dias 0, 21 e 28. Uma semana após o último impulso, os camundongos foram sangrados por meio de sangramento submandibular e coletou-se antissoro. Antissoro de epítopo foi incubado com concentração de autopeptídeo de 5 ou 0,5 μg/ml e determinou-se a inibição do reconhecimento de autopeptídeo (A). O antissoro de peptídeo também foi incubado com concentração de SpyCEP de 5 ou 0,5 μg/ml. O soro foi utilizado em seguida em ELISA contra peptídeos imobilizados (B). Por fim, antissoro SpyCEP foi incubado com concentração de 5 ou 0,5 μg/ml de cada um dos peptídeos (S1-S6) ou com recSpyCEP e determinou-se sua ligação a cada peptídeo individual correspondente ou SpyCEP (C). Dados para cada barra são média ± desvio padrão. Realizou-se análise estatística utilizando ANOVA bidirecional com teste de comparação múltipla de Bonferroni para determinar o significado entre os grupos. * p<0,05 e **p<0,01, ***p<0,001. ns é p<0,05.

[0044] Figura 22: eficiência de ligação de SpyCEP e antissoro de epítopo SpyCEP para várias linhagens de GAS. Para determinar a especificidade de antissoro de epítopo SpyCEP ou recSpyCEP para várias linhagens de GAS, realizou-se citometria de fluxo. O teste mediu a ligação de antissoro de epítopo (S1-S6) através de IgG conjugado a FITC em comparação com antissoro SpyCEP. Ligação de 5448 e seu derivado subcultivado animal (A), BSA10 e seu derivado subcultivado (B) e isolado de garganta (pM1) e isolado de pele (88/30) são exibidos (C). Os dados para cada barra são média ± desvio padrão. Realizou-se análise estatística utilizando um teste t bicaudal para determinar o significado em comparação com o controle PBS. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

[0045] Figura 23: eficácia protetora de J8-DT+S2-DT em proteção contra GAS. Grupos de camundongos BALB/c (4-6 semanas) foram imunizados por via subcutânea com formulação J8-DT, J8-DT+SpyCEP, J8- DT+S2-DT, SpyCEP ou PBS nos dias 0, 21 e 28. Duas semanas após o último impulso, os camundongos foram infectados por via dérmica de infecção com GAS 5448AP (A e B). No dia 6 após a infecção, cinco camundongos/grupos foram sacrificados e amostras foram coletadas para determinar a carga biológica de GAS na pele (A) e sangue (B). Os dados são representativos de dois ou mais experimentos independentes e os resultados são exibidos como média ± desvio padrão para 4-5 camundongos em cada grupo. Utilizou-se ANOVA bidirecional para determinar o significado entre coorte vacinada e controle. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ns é p<0,05.

[0046] Figura 24: eficácia protetora de J8-DT+S2-DT em proteção contra GAS. Coortes de camundongos BALB/c (4-6 semanas) foram imunizados por via subcutânea com formulação J8-DT, J8-DT+SpyCEP, J8- DT+S2-DT, SpyCEP ou PBS nos dias 0, 21 e 28. Duas semanas após o último impulso, os camundongos foram infectados por via dérmica de infecção com GAS NS22.8 (A, B e C). Nos dias 3 e 6 após a infecção, cinco camundongos/grupos foram sacrificados e amostras foram coletadas para determinar o encargo biológico de GAS na pele (A), sangue (B) e baço (C). Os resultados são exibidos como média ± desvio padrão para 4/5 camundongos em cada grupo. Utilizou-se ANOVA bidirecional para determinar o significado entre coorte vacinada e controle. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ns é p<0,05.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0047] A presente invenção é baseada, ao menos parcialmente, na descoberta de que a atividade de neutrófilos é importante para imunização bem sucedida com peptídeo J8 contra estreptococos do grupo A. Mais especificamente, percebeu-se que certas proteases de estreptococos do grupo A, tais como SpyCEP, exercem efeito prejudicial ou supressivo em neutrófilos ao inativar proteoliticamente o agente quimiotático de neutrófilos interleucina 8. Propõe-se, portanto, que, ao imunizar-se com peptídeo J8 ou outro fragmento de proteína M e também SpyCEP, permitir-se-á reação imunológica a SpyCEP que reduz ao menos parcialmente a capacidade de SpyCEP de inativar interleucina 8 e, portanto, suprimir a reação de neutrófilos. Consequentemente, isso aprimorará de forma sinérgica o efeito imunológico de imunização J8. Em uma realização relacionada, anticorpos anti-SpyCEP podem ser administrados para permitir reação imunológica aprimorada ao peptídeo J8. Além disso, foi identificado um epítopo imunodominante de SpyCEP. Em uma forma específica, a presente invenção pode ser adequada para tratar ou prevenir infecções por linhagens particularmente virulentas ou isolados de estreptococos do grupo A que são resistentes aos tratamentos com antibiótico típicos empregados para infecções estreptocócicas do grupo A. Estas linhagens ou isolados normalmente causam infecções sérias da pele (por exemplo, fasciíte necrosante) e, em alguns casos, pode abrigar uma mutação de CovR/SCovR/S.

[0048] Consequentemente, certos aspectos da presente invenção referem-se à administração de um fragmento, variante ou derivado de proteína M e um agente que possibilita restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos a mamíferos, de forma a permitir reação imunológica no mamífero.

[0049] Para os propósitos da presente invenção, “isolado” indica material que foi removido de seu estado natural ou foi submetido de outra forma à manipulação humana. Material isolado pode ser substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado natural ou podem ser manipulados para que fiquem em estado artificial em conjunto com componentes que normalmente o acompanham em seu estado natural. Material isolado pode encontrar-se em sua forma nativa, química sintética ou recombinante.

[0050] “Proteína” indica um polímero de aminoácido. Os aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou não naturais, aminoácidos D ou L, conforme bem compreendido na técnica.

[0051] O termo “proteína” inclui e engloba “peptídeo”, que é normalmente utilizado para descrever uma proteína com não mais de 50 (cinquenta) aminoácidos, e “polipeptídeo”, que é normalmente utilizado para descrever uma proteína com mais que 50 (cinquenta) aminoácidos.

[0052] “Fragmento” é um segmento, domínio, porção ou região de uma proteína (como proteína M, p145, J14 ou J8, SpyCEP ou um peptídeo ou epitopo de SpyCEP), que constitui menos de 100% da sequência de aminoácidos da proteína. Apreciar-se-á que o fragmento pode ser um único fragmento ou pode ser repetido isoladamente ou com outros fragmentos.

[0053] Geralmente, fragmentos podem compreender, consistir ou consistir essencialmente de até 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou 1600 aminoácidos da proteína com comprimento total.

[0054] Adequadamente, o fragmento é um fragmento imunogênico. No contexto da presente invenção, o termo “imunogênico”, da forma utilizada neste documento, indica a capacidade ou potencial de gerar ou permitir reação imunológica tal como a estreptococos do grupo A ou seus componentes moleculares, como proteína M, mediante administração do fragmento imunogênico a mamíferos. Preferencialmente, a reação imunológica permitida pelo fragmento imunogênico é protetora.

[0055] “Permitir reação imunológica” significa gerar ou estimular a produção ou atividade de um ou mais elementos do sistema imunológico, incluindo o sistema imunológico celular, anticorpos e/ou sistema imunológico nativo. Adequadamente, um ou mais elementos do sistema imunológico incluem linfócitos B, anticorpos e neutrófilos.

[0056] Conforme utilizado geralmente neste documento, os termos “imunizar”, “vacinar” e “vacina” designam métodos e/ou composições que permitem reação imunológica protetora contra estreptococos do grupo A, por meio da qual a infecção subsequente por estreptococos do grupo A é ao menos parcialmente evitada ou minimizada.

[0057] Da forma utilizada no presente, as expressões “estreptococo do grupo A”, “estreptococos do grupo A”, “estreptocócico do grupo A” e a abreviação “GAS” designam bactérias estreptocócicas do sorogrupo Lancefield A, que são bactérias β hemolíticas gram-positivas da espécie Streptococcus pyogenes. Um fator importante de virulência de GAS é a proteína M, que é fortemente antifagocítica e liga-se ao fator de soro H, que destrói C3 convertase e evita opsonização por C3b. Estes também incluem “mutantes” virulentos, como mutantes CovR/S ou CovRS, conforme descrito em Graham et al 2002, PNAS USA 99, 13855, embora sem limitações.

[0058] Doenças e condições causadas por estreptococos do grupo A incluem celulite, erisipela, impetigo, escarlatina, infecções na garganta como faringite aguda (“faringite estreptocócica”), bacteremia, síndrome do choque tóxico, fasciíte necrosante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitações.

[0059] Conforme utilizado neste documento, “neutrófilos” ou granulócitos de neutrófilos são células que fazem parte da família de células polimorfonucleares (PMNs) em conjunto com basófilos e eosinófilos. Neutrófilos são células fagocíticas com vida relativamente curta formadas a partir de células tronco da medula óssea e normalmente constituem 40% a 75% de glóbulos brancos do sangue em mamíferos. Além de serem antimicrobianos solúveis de liberação de neutrófilos fagocíticos (por exemplo, proteínas em grânulos) e geram armadilhas extracelulares de neutrófilos. Neutrófilos são sensíveis a moléculas como interleucina 8 (IL-8), C5a, fMLP e leucotrieno B4, que promovem quimiotaxia de neutrófilos para locais de lesões e/ou inflamações agudas.

[0060] Conforme utilizado neste documento, um “agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos” é uma molécula que, direta ou indiretamente, aumenta, aprimora ou restaura ao menos parcialmente a produção, migração e/ou quimiotaxia de neutrófilos e/ou uma ou mais atividades imunológicas de neutrófilos. Em uma realização, o agente permite reação imunológica a um inibidor de neutrófilos. Em outra realização, o agente liga-se ao inibidor de neutrófilos e o inativa ao menos parcialmente. O inibidor de neutrófilos pode ser uma molécula derivada ou originária da bactéria estreptocócica do grupo A. Em uma forma específica, o inibidor de neutrófilos é serina protease ou seu fragmento, que divide proteoliticamente interleucina 8. Em uma realização específica, o inibidor de neutrófilos é SpyCEP ou seu fragmento. SpyCEP é uma serina protease com múltiplos domínios de 170 kDa expressa sobre a superfície do patógeno humano Streptococcus pyogenes, que cumpre papel importante na infecção ao catalisar a divisão e inativação do quimioatrativo de neutrófilos interleucina 8. Exemplos não limitadores de sequências de aminoácidos SpyCEP podem ser encontrados sob números de acesso YP597949.1 (S. pyogenes MGAS10270) e YP596076.1 (S. pyogenes MGAS9429). Consequentemente, em uma realização específica, o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos é SpyCEP ou um de seus fragmentos imunogênicos. Em outra realização, o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo que liga SpyCEP. Realizações específicas de fragmentos de SpyCEP são descritas na Figura 13 (SEQ ID N° 1-55). Um fragmento de SpyCEP preferido é, ou compreende, a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID N° 18 (NSDNIKENQFEDFDEDWENF). Como será descrito com mais detalhes a seguir, um antissoro de peptídeo anti-SEQ ID N° 18 pode bloquear a degradação de IL8 tão efetivamente quanto anticorpos anti-rSpyCEP. Assim, propõe-se que SEQ ID N° 18 é, ou compreende, o epitopo dominante sobre SpyCEP que pode induzir anticorpos funcionais.

[0061] Conforme utilizado neste documento, um “fragmento de proteína M” é qualquer fragmento de uma proteína M GAS que é imunogênica e/ou é capaz de ser ligada por um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Normalmente, o fragmento é, compreende ou está contido no interior de uma sequência de aminoácidos de uma região de repetição C de uma proteína M GAS, ou um de seus fragmentos. Exemplos não limitadores incluem p145, que é um 20 mer com a sequência de aminoácidos LRRDLDASREAKKQVEKALE (SEQ ID N° 56). Neste particular, fragmentos da sequência de aminoácidos p145 podem estar presentes em peptídeos J14 ou J8.

[0062] Conforme utilizado neste documento, um “peptídeo J14” pode compreender a sequência de aminoácidos KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDRVK (SEQ ID N° 57) ou um de seus fragmentos ou variantes, um peptídeo com epÍtopos de células B e T mínimos dentro de p145 foi identificado como um peptídeo de região C de proteína M GAS isento de autoepÍtopos de células T potencialmente prejudiciais, mas que continham um epitopo de células B opsônico. J14 é um peptídeo quimérico que contém 14 aminoácidos da região C de proteína M (exibido em negrito) e é ladeado por sequências GCN4 derivadas de levedura, o que foi necessário para manter a dobra helicoidal correta e estrutura de conformação do peptídeo.

[0063] Conforme utilizado neste documento, “peptídeo J8” é um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos parcialmente derivada de um peptídeo de região C de proteína M GAS ou dele correspondente. Peptídeo J8 compreende adequadamente um epitopo de célula B de conformação e carece de autoepÍtopos de célula T potencialmente prejudiciais. Uma sequência de aminoácidos de peptídeo J8 preferida é QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID N° 58) ou um de seus fragmentos ou variantes, em que os resíduos em negrito correspondem aos resíduos 344 a 355 da proteína M GAS. Nesta realização, J8 é um peptídeo quimérico que compreende adicionalmente sequências de proteína de ligação de DNA GCN4 laterais que ajudam na manutenção da dobra helicoidal correta e estrutura de conformação do peptídeo J8.

[0064] Conforme utilizado neste documento, uma proteína “variante” compartilha um nucleotídeo que pode ser definido ou uma relação de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de referência. A sequência de aminoácidos de referência pode ser uma sequência de aminoácidos de proteína M, SpyCEP ou seus fragmentos, conforme descrito acima. A proteína “variante” pode ter um ou uma série de aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência excluída ou substituída por diferentes aminoácidos. Será bem entendido na técnica que alguns aminoácidos podem ser substituídos ou excluídos sem alterar a atividade do fragmento imunogênico e/ou proteína (substituições conservadoras). Preferencialmente, variantes de proteína compartilham pelo menos 70% ou 75%, preferencialmente pelo menos 80% ou 85% ou, de maior preferência, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequências com uma sequência de aminoácidos de referência.

[0065] Em uma realização específica, uma proteína variante ou peptídeo pode compreender um ou uma série de resíduos de lisina em um de seus terminais N e/ou C. A série de resíduos de lisina (por exemplo, polilisina) pode ser uma sequência linear de resíduos de lisina ou pode ser uma sequência de cadeia ramificada de resíduos de lisina. Estes resíduos adicionais de lisina podem possibilitar a solubilidade aumentada de peptídeo.

[0066] Exemplos não limitadores de variantes de peptídeo J8 incluem: SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID N° 59), SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC (SEQ ID N° 60), SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 61) e SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 62).

[0067] Outras variantes podem ser baseadas em sétuplos, conforme descrito em Cooper et al, 1997.

[0068] Caso um epitopo seja conhecido por residir no interior de uma conformação estrutural de proteína em hélice α, por exemplo, um peptídeo modelo pode ser sintetizado para dobrar nesta conformação. Nós projetamos um peptídeo com espiral bobinada helicoidal α com base na estrutura do fecho de leucina GCN4 (O’Shea et al, 1991). O primeiro sétuplo contém a sequência MKQLEDK (SEQ ID N° 63), que inclui várias das características encontradas em um motivo de repetição de sétuplos com espiral bobinada estável (a-b-c-d- e-f-g)n (Cohen & Parry, 1990). Estes incluem resíduos apolares grandes nas posições a e d, um par de ácido e base (Glu/Lys) nas posições e e g (normalmente favorecendo interações iônicas intercadeias) e grupos polares nas posições b, c e f (de forma consistente com a previsão de Lupas et al (1991)). O peptídeo GCN4 também contém uma valina de consenso na posição a. Também se observou que, quando as posições a e d são ocupadas por V e L, um dímero de espiral bobinada é favorecido (Harbury et al, 1994). Um modelo de repetição de sétuplos foi derivado dessas características de consenso do peptídeo de fecho de leucina GCN4 (VKQLEDK; SEQ ID N° 64) com o potencial de formar uma espiral bobinada helicoidal α. Este peptídeo tornou-se o peptídeo de armação. Fragmentos sobrepostos de um epitopo de conformação em estudo foram incorporados no interior do peptídeo de espiral bobinada modelo para gerar um peptídeo quimérico. Substituições de aminoácidos, projetadas para garantir as conformações de espiral bobinada helicoidal corretas (Cohen & Parry, 1990) foram incorporadas aos peptídeos quiméricos sempre que um resíduo idêntico foi encontrado no peptídeo modelo helicoidal e na sequência de epÍtopos. Foram tipicamente utilizadas as substituições a seguir: posição a, V a I; b, K a R; c, Q a N; d, L a A; e, E a Q; f, D a E; g, K a R. Todos esses resíduos de substituição são comumente encontrados em sua posição correspondente em proteínas de espiral bobinada (Lupas et al, 1991).

[0069] Expressões geralmente utilizadas neste documento para descrever relações de sequência entre proteínas e ácidos nucleicos correspondentes incluem “janela de comparação”, “identidade de sequências”, “percentual de identidade de sequências” e “identidade substancial”. Como ácidos nucleicos/proteínas correspondentes podem compreender (1) apenas uma ou mais porções de uma sequência completa de ácidos nucleicos/proteínas que são compartilhadas pelos ácidos nucleicos/proteínas, e (2) uma ou mais porções que são divergentes entre os ácidos nucleicos/proteínas, comparações de sequência são geralmente realizadas comparando-se sequências em uma “janela de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequências. “Janela de comparação” designa a um segmento conceitual, normalmente com seis, nove ou doze resíduos contíguos que é comparado com uma sequência de referência. A janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, lacunas) de cerca de 20% ou menos em comparação com a sequência de referência para alinhamento ideal das sequências correspondentes. Alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido por meio de implementações computadorizadas de algoritmos (programa Geneworks da Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, Estados Unidos, incorporado ao presente como referência) ou por meio de inspeção e melhor alinhamento (ou seja, resultando em homologia com percentual mais alto em comparação com a janela de comparação) gerado por qualquer um dos diversos métodos selecionados. Pode-se também fazer referência à família de programas BLAST, conforme descrito, por exemplo, por Altschul et al, 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, que é incorporado ao presente como referência. Discussão detalhada de análise de sequências pode ser encontrada na Unidade 19.3 de Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al (John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque, 1995-1999).

[0070] A expressão “identidade de sequências” é utilizada neste documento no seu sentido mais amplo para incluir o número de equivalências exatas de nucleotídeos ou aminoácidos, considerando alinhamento apropriado utilizando um algoritmo padrão, levando em conta a medida em que as sequências são idênticas ao longo de uma janela de comparação. Assim, “percentual de identidade de sequências” é calculado por meio de comparação de duas sequências idealmente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, I) ocorre nas duas sequências para gerar o número de posições coincidentes, divisão do número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicação do resultado por 100 para gerar o percentual de identidade de sequências. “Identidade de sequências” pode ser compreendido, por exemplo, como significando o “percentual de coincidência” calculado pelo programa de computador DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponível por meio da Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califórnia, Estados Unidos).

[0071] Conforme utilizado neste documento, “derivados” são moléculas tais como proteínas, seus fragmentos ou variantes, que foram alteradas, por exemplo, por meio de conjugação ou formação de complexo com outras porções químicas, modificação pós-tradução (por exemplo, fosforilação, acetilação e similares), modificação de glicosilação (por exemplo, adição, remoção ou alteração da glicosilação), lipidação e/ou inclusão de sequências de aminoácidos adicionais, como será compreendido na técnica. Em uma realização específica, uma sequência de aminoácidos adicional pode compreender um ou uma série de resíduos de lisina no seu terminal N e/ou C. A série de resíduos de lisina (por exemplo, polilisina) pode ser uma sequência linear de resíduos de lisina ou pode ser uma sequência de cadeias ramificada de resíduos de lisina. Esses resíduos de lisina adicionais podem possibilitar o aumento de solubilidade de peptídeos.

[0072] Um derivado de peptídeo J8 específico descrito em Olive et al, 2002, Infect. & Immun. 70 2734 é um “peptídeo central de lipídio”. Em uma realização, um peptídeo central de lipídio pode compreender uma série de peptídeos J8 (por exemplo, quatro peptídeos J8) sintetizados diretamente em dois grupos amino de cada lisina de um núcleo de polilisina ramificado acoplado a uma âncora lipofílica.

[0073] Sequências de aminoácidos adicionais podem incluir sequências de aminoácidos parceiras de fusão que criam uma proteína de fusão. Sequências de aminoácidos parceiras de fusão podem, por exemplo, auxiliar na detecção e/ou purificação da proteína de fusão isolada. Exemplos não limitadores incluem parceiros de fusão de ligação de metal (por exemplo, póli-histidina), proteína de ligação de maltose (MBP), proteína A, glutationa S- transferase (GST), sequências de proteína fluorescente (por exemplo, GFP), marcas de epitopo, como myc, FLAG e hemaglutinina.

[0074] Outros derivados contemplados pela presente invenção incluem, mas sem limitações, modificação nas cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese de proteínas ou peptídeos e o uso de reticulantes e outros métodos que impõem restrições de conformação sobre as proteínas imunogênicas, fragmentos e variantes de acordo com a presente invenção.

[0075] Neste particular, indica-se ao técnico no assunto o Capítulo 15 de Current Protocols in Protein Science, Eds. Coligan et al (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1995-2008) para metodologia mais extensiva com relação à modificação química de proteínas.

[0076] As proteínas imunogênicas isoladas, fragmentos e/ou derivados de acordo com a presente invenção podem ser produzidas por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitações, síntese química, tecnologia de DNA recombinante e divisão proteolítica para produzir fragmentos de peptídeo.

[0077] Síntese química inclui síntese de fase sólida e fase de solução. Estes métodos são bem conhecidos na técnica, embora se faça referência a exemplos de métodos de síntese química conforme fornecido no Capítulo 9 de Synthetic Vaccines, Ed. Nicholson (Blackwell Scientific Publications) e Capítulo 15 de Current Protocols in Protein Science, Eds. Coligan et al (John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 19952008). Neste particular, faz-se também referência à Patente Internacional WO 99/02550 e à Patente Internacional WO 97/45444.

[0078] Proteínas recombinantes podem ser convenientemente preparadas pelo técnico no assunto utilizando protocolos padrão conforme descrito, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989), particularmente Capítulos 16 e 17; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al (John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, Estados Unidos, 1995-2008), particularmente Capítulos 10 e 16; e Current Protocols in Protein Science, Eds. Coligan et al (John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1995-2008), particularmente Capítulos 1, 5 e 6. Normalmente, a preparação de proteínas recombinantes inclui a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína em uma célula hospedeira adequada.

[0079] Certos aspectos e realizações referem-se à administração de um ou mais ácidos nucleicos que codificam um fragmento, variante ou derivado de proteína M e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos ou uma composição que o compreende para permitir, desta forma, reação imunológica a GAS e/ou imunização contra uma infecção de GAS.

[0080] A expressão “ácido nucleico”, da forma utilizada neste documento, designa DNA e RNA de fita simples ou dupla. DNA inclui DNA genômico e cDNA. RNA inclui mRNA, RNA, RNAi, siRNA, cRNA e RNA autocatalítico. Ácidos nucleicos podem também ser híbridos de DNA-RNA. Um ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que normalmente inclui nucleotídeos que compreendem uma base A, G, C, T ou U. Sequências de nucleotídeos podem, entretanto, incluir outras bases, como purinas modificadas (por exemplo, inosina, metilinosina e metiladenosina) e pirimidinas modificadas (por exemplo, tiouridina e metilcitosina).

[0081] Em uma forma preferida, um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam um fragmento, variante ou derivado de proteína M e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos encontram-se na forma de construção genética adequada para a administração a mamíferos, como seres humanos. Em uma forma preferida, a construção genética é adequada para vacinação de DNA de mamíferos, como seres humanos.

[0082] Adequadamente, a construção genética compreende ou encontra-se na forma de componentes genéticos de um plasmídeo, bacteriófago, cosmídeo, levedura ou cromossomo artificial bacteriano, como é bem compreendido na técnica. Construções genéticas podem também ser apropriadas para manutenção e propagação do ácido nucleico isolado em bactérias ou outras células hospedeiras, para manipulação por meio de tecnologia de DNA recombinante.

[0083] Para fins de expressão de proteínas, a construção genética é uma construção de expressão. Adequadamente, a construção de expressão compreende um ou mais ácidos nucleicos ligados de forma operativa a uma ou mais sequências adicionais em um vetor de expressão. “Vetor de expressão” pode ser um vetor extracromossômico autorreprodutor, como um plasmídeo, ou um vetor que se integra a um genoma hospedeiro.

[0084] “Ligado de forma operativa” significa que sequência(s) de nucleotídeo(s) adicional(is) é(são) posicionada(s) com relação ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção, preferencialmente para iniciar, regular ou controlar de outra forma a transcrição.

[0085] Sequências de nucleotídeos reguladoras geralmente serão apropriadas para a célula hospedeira ou tecido onde a expressão é necessária. Vários tipos de vetores de expressão apropriados e sequências reguladoras adequadas são conhecidos na técnica para uma série de células hospedeiras.

[0086] Normalmente, as mencionadas uma ou mais sequências de nucleotídeos reguladoras podem incluir, mas sem limitações, sequências promotoras, sequências líderes ou de sinal, locais de ligação ribossômica, sequências de início e de término de transcrição, sequências de início e de término de tradução e sequências intensificadoras ou ativadoras. Promotores constitutivos ou induzíveis conhecidos na técnica são contemplados pela presente invenção. A construção de expressão pode também incluir uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica um parceiro de fusão (normalmente fornecido pelo vetor de expressão) para que a proteína recombinante de acordo com a presente invenção seja expressa na forma de proteína de fusão, conforme descrito acima.

[0087] Será compreendido que os ácidos nucleicos isolados que codificam uma proteína M, seu fragmento, variante ou derivado e o agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilo (por exemplo, SpyCEP ou um de seus fragmentos imunogênicos) podem ser administrados por meio de construções de expressão separadas ou podem estar presentes na mesma construção de expressão (por exemplo, uma construção de expressão multicistrônica).

[0088] Adequadamente, vacinação de DNA é realizada por meio de uma ou mais construções de expressão de DNA de plasmídeo. Os plasmídeos geralmente compreendem um promotor viral (como promotores SV40, RSV ou CMV). Intron A pode ser incluído para aprimorar a estabilidade de mRNA e, portanto, aumentar a expressão de proteína. Plasmídeos podem incluir adicionalmente um local de clonagem múltipla, um forte sinal de término de poliadenilação/transcrição, tal como hormônio de crescimento bovino ou sequências de poliadenilação de betaglobulina de coelhos. O plasmídeo pode compreender ainda elementos de transcrição com ação cis de vírus de macaco Mason-Pfizer (MPV-CTE) com ou sem expressão de envelope aumentada de rotação de HIV. Modificações adicionais que podem aprimorar a expressão incluem a inserção de sequências intensificadoras, íntrons sintéticos, sequências líderes tripartites de adenovírus (TPL) e/ou modificações de sequências de término de poliadenilação e/ou transcrição. Um exemplo não limitador de plasmídeo de vacina de DNA é pVAC, que é disponível comercialmente por meio da Invivogen.

[0089] Uma referência útil que descreve vacinologia de DNA é DNA Vaccines, Methods and Protocols, Segunda Edição (Volume 127 da série Methods in Molecular Medicine, Humana Press, 2006).

[0090] Conforme descrito anteriormente, a presente invenção fornece composições e/ou métodos de prevenção ou tratamento de doenças, distúrbios ou condições associadas a estreptococos do grupo A em mamíferos.

[0091] Conforme utilizado neste documento, “tratar” ou “tratamento” refere-se a intervenção terapêutica que, ao menos parcialmente, melhora, elimina ou reduz um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associada a estreptococos do grupo A após o início do seu desenvolvimento. O tratamento não necessita ser absoluto para que seja benéfico para o paciente. O efeito benéfico pode ser determinado utilizando quaisquer métodos ou padrões conhecido pelo técnico comum no assunto.

[0092] Conforme utilizado neste documento, “prevenir” ou “prevenção” designa uma ação iniciada antes da infecção por estreptococos do grupo A ou exposição a eles, e/ou antes do início de um sintoma ou sinal patológico de uma doença, distúrbio ou condição associada a estreptococos do grupo A, de forma a evitar infecções e/ou reduzir sintomas ou sinais patológicos. Deve-se compreender que essa prevenção não necessita ser absoluta para que seja benéfica a um paciente. Tratamento “profilático” é um tratamento administrado a um paciente que não exibe sinais de doença, distúrbio ou condição associada a estreptococos do grupo A, ou exibe apenas sinais iniciais para fins de redução do risco de desenvolvimento de sintomas ou sinais patológicos de doenças, distúrbios ou condições associadas a estreptococos do grupo A.

[0093] No contexto da presente invenção, “doença, distúrbio ou condição associada a estreptococos do grupo A” indica qualquer patologia clínica resultante da infecção por estreptococos do grupo A e inclui celulite, erisipela, impetigo, escarlatina, infecções na garganta como faringite aguda (“faringite estreptocócica”), bacteremia, síndrome de choque tóxico, fasciíte necrosante, febre reumática aguda e glomerulonefrite aguda, embora sem limitações.

[0094] Conforme descrito anteriormente, os métodos de tratamento e/ou imunização descritos neste documento incluem a administração do fragmento, variante ou derivado de proteína M e do agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilo a mamíferos separadamente, ou em combinação, de forma a permitir reação imunológica do mamífero. Alternativamente, conforme descrito anteriormente, os métodos de tratamento e/ou imunização incluem a administração de um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam um fragmento, variante ou derivado de proteína M e de um agente que facilite a restauração ou p aprimoramento da atividade de neutrófilos separadamente ou em combinação, de forma a permitir reação imunológica do mamífero.

[0095] Conforme descrito neste documento, outros aspectos e realizações específicas da presente invenção referem-se ao uso de anticorpos ou fragmentos de anticorpos para tratar terapeuticamente infecções de GAS, como dirigir-se a SpyCEP no local de infecção (por exemplo, a pele). Isso pode ser realizado em combinação com imunização de fragmentos de proteína M e/ou administração de anticorpos antifragmento de proteína M ou fragmentos de anticorpos.

[0096] Os anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, nativos ou recombinantes. Fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fc, Fab ou F(ab)2 e/ou podem compreender anticorpos Fv de fita simples (scFvs). Esses scFvs podem ser preparados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos, respectivamente, na Patente Norte-Americana n° 5.091.513, Patente Europeia n° 239.400 ou no artigo de Winter & Milstein, 1991, Nature 349: 293. Os anticorpos podem também incluir fragmentos de anticorpos recombinantes multivalentes, como diacorpos, triacorpos e/ou tetracorpos, que compreendem uma série de scFvs, bem como demicorpos ativados por dimerização (por exemplo, WO/2007/062466). Esses anticorpos podem ser preparados, por exemplo, de acordo com os métodos descritos em Holliger et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 6444; ou em Kipriyanov, 2009, Methods Mol. Biol. 562 177. Protocolos bem conhecidos aplicáveis à produção, purificação e uso de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, no Capítulo 2 de Coligan et al, Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1991-1994) e Harlow, E. & Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

[0097] Métodos de produção de anticorpos policlonais são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Exemplos de protocolos que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, em Coligan et al, Current Protocols in Immunology, acima, e em Harlow & Lane, 1988, acima. Em uma realização específica, anticorpos policlonais anti-SpyCEP podem ser obtidos ou purificados a partir de soro humano de indivíduos expostos a estreptococos do grupo A ou por eles infectados. Alternativamente, anticorpos policlonais podem ser elevados contra SpyCEP purificado ou recombinante ou um de seus fragmentos imunogênicos, em espécies de produção como cavalos e subsequentemente purificados antes da administração.

[0098] Anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando- se o método padrão, por exemplo, conforme descrito originalmente em um artigo de Kohler & Milstein, 1975, Nature 256, 495, ou suas modificações mais recentes, conforme descrito, por exemplo, em Coligan et al, Current Protocols in Immunology, acima, imortalizando-se baço ou outras células de produção de anticorpos derivadas de uma espécie de produção que tenha sido inoculada com uma ou mais das proteínas isoladas, seus fragmentos, variantes ou derivados de acordo com a presente invenção. Consequentemente, anticorpos monoclonais podem ser elevados contra um fragmento, variante ou derivado de proteína M e/ou o agente que facilita a restauração ou o aprimoramento da atividade de neutrófilos (por exemplo, SpyCEP) para uso de acordo com a presente invenção. Em certas realizações, o anticorpo monoclonal ou seu fragmento pode encontrar-se em forma recombinante. Isso pode ser particularmente vantajoso para “humanizar” o anticorpo monoclonal ou fragmento se o anticorpo monoclonal for produzido inicialmente por células do baço de um mamífero não humano.

[0099] Para realizações relacionadas a anticorpos terapêuticos, um fragmento de proteína M preferido pode ser peptídeo p145.

[00100] Um fragmento preferido de SpyCEP pode compreender ou consistir da sequência de aminoácidos NSDNIKENQFEDFDEDWENF (SEQ ID N° 18).

[00101] Em certos aspectos e realizações, o fragmento, variante ou derivado de proteína M e o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos, incluindo de anticorpos ou fragmentos de anticorpos conforme descrito neste documento, podem ser administrados a mamíferos separadamente ou em combinação, na forma de composição.

[00102] Em uma forma preferida, a composição compreende um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

[00103] “Veículo, diluente ou excipiente aceitável” indica uma carga, substância diluente ou de encapsulamento sólida ou líquida, que pode ser utilizada com segurança na administração sistêmica. Dependendo da via específica de administração, pode-se utilizar uma série de veículos, diluentes e excipientes bem conhecidos na técnica. Estes podem ser selecionados a partir de um grupo que inclui açúcares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, óleos sintéticos, polióis, ácido algínico, soluções tamponadas com fosfato, emulsificantes, solução salina isotônica e sais como sais de ácidos minerais, incluindo cloridratos, brometos e sulfatos, ácidos orgânicos como acetatos, propionatos e malonatos, água e água livre de pirogênio.

[00104] Uma referência útil na descrição de veículos, diluentes e excipientes aceitáveis é Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. Estados Unidos, 1991), que é incorporado ao presente como referência.

[00105] Preferencialmente, para fins de permitir reação imunológica, certos agentes imunológicos podem ser utilizados em combinação com o peptídeo J8, seu fragmento, variante ou derivado e o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos, ou com uma ou mais construções genéticas que os codificam.

[00106] A expressão “agente imunológico” inclui, dentro do seu escopo, veículos, agentes de fornecimento, imunoestimulantes e/ou adjuvantes bem conhecidos na técnica. Como será compreendido na técnica, imunoestimulantes e adjuvantes designam ou incluem uma ou mais substâncias que aprimoram a imunogenicidade e/ou eficácia de uma composição. Exemplos não limitadores de imunoestimulantes e adjuvantes adequados incluem esqualano e esqualeno (ou outros óleos de origem vegetal ou animal); copolímeros de bloco; detergentes, como Tween® 80; Quil® A, óleos minerais como Drakeol ou Marcol, óleos vegetais como óleo de amendoim; adjuvantes derivados de Corynebacterium como Corynebacterium parvum; adjuvantes derivados de Propionibacterium como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacille Calmette e Guerin ou BCG); antígenos de Bordetella pertussis; toxoide de tétano, toxoide de difteria; substâncias ativas na superfície como hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecila, lisolecitina, brometo de dimetildioctadecilamônio, N,N-dicoctadecil- N’,N’-bis(2-hidroxietilpropanodiamina), metóxi-hexadecilglicerol e polióis plurônicos; poliaminas tais como pirano, sulfato de dextrano, póli IC carbopol; peptídeos, tais como dipeptídeo de muramila e derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsões de óleo; e géis minerais como fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou alúmen; interleucinas como interleucina 2 e interleucina 12; monocinas como interleucina 1; fator de necrose de tumores; interferonas como gama interferona; DNA imunoestimulante como DNA CpG, combinações como saponina-hidróxido de alumínio ou hidróxido de alumínio Quil-A; lipossomos; adjuvante de ISCOM® e ISCOMATRIX®; extrato de parede celular micobacteriana; glicopeptídeos sintéticos, como dipeptídeos de muramila ou outros derivados; avridina; derivados de lipídio A; sulfato de dextrano; DEAE- Dextrano isolado ou com fosfato de alumínio; carboxipolimetileno como Carbopol’ EMA; emulsões de copolímero acrílico como Neocryl A640 (por exemplo, Patente Norte-Americana n° 5.047.238); água em emulsificantes de óleo como Montanide ISA 720; poliovírus, proteínas de poxvírus animal ou vaccinia; ou suas misturas.

[00107] Agentes imunológicos podem incluir veículos como tiroglobulina; albuminas como albumina de soro humano; toxinas, toxoides ou qualquer material reativo cruzado mutante (CRM) da toxina de tétano, difteria, coqueluche, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus e Streptococcus; poliaminoácidos como póli(lisina:ácido glutâmico); influenza; Rotavírus VP6, Parvovírus VP1 e VP2; proteína central do vírus da hepatite B; vacina recombinante de vírus da hepatite B e similares. Alternativamente, pode-se utilizar um fragmento ou epitopo de uma proteína veículo ou outra proteína imunogênica. Pode-se utilizar, por exemplo, um epitopo de célula T de toxina bacteriana, toxoide ou CRM. Neste particular, pode-se fazer referência à Patente Norte-Americana n° 5.785.973, que é incorporada ao presente como referência.

[00108] Qualquer procedimento adequado é contemplado para a produção de composições de vacina. Exemplos de procedimentos incluem, por exemplo, os descritos em New Generation Vaccines (1997, Levine et al, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, Basileia e Hong Kong), que é incorporado ao presente como referência.

[00109] Em algumas realizações, composições e vacinas podem ser administradas a mamíferos na forma de bactérias atenuadas ou inativadas que podem ser geneticamente modificadas para expressar o peptídeo J8, seu fragmento, variante ou derivado e/ou o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos. Exemplos não limitadores de bactérias atenuadas incluem espécies de Salmonella, tais como Salmonella enterica var. Typhimurium ou Salmonella typhi. Alternativamente, outros patógenos entéricos, como espécies de Shigella ou E. coli, podem ser utilizados em forma atenuada. Linhagens de Salmonella atenuadas foram construídas inativando-se genes no caminho biossintético de aminoácidos aromáticos (Alderton et al, Avian Diseases 35 435), introduzindo-se mutações em dois genes no processo biossintético de aminoácidos aromáticos (conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 5.770.214) ou em outros genes como htrA (conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 5.980.907) ou em genes que codificam proteínas de membrana exterior, como ompR (conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 5.851.519).

[00110] Qualquer via segura de administração pode ser empregada, incluindo administração oral, retal, parenteral, sublingual, bocal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradérmica, subcutânea, inalatória, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, tópica, via mucosa e transdérmica. embora sem limitações.

[00111] Formas de dosagem incluem pastilhas, dispersões, suspensões, injeções, soluções, xaropes, pastilhas expecturantes, cápsulas, sprays nasais, supositórios, aerossóis, adesivos transdérmicos e similares. Estas formas de dosagem podem também incluir injeção ou implante de dispositivos de liberação controlada projetados especificamente para este propósito ou outras formas de implantes modificados para agir adicionalmente desta forma. Liberação controlada pode ser realizada por meio de revestimento com polímeros hidrofóbicos, que incluem resinas acrílicas, ceras, álcoois alifáticos superiores, ácidos polilácticos e poliglicólicos e certos derivados de celulose, como hidroxipropilmetil celulose. Além disso, a liberação controlada pode ser realizada utilizando outras matrizes de polímero, lipossomos e/ou microesferas.

[00112] Composições podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, sachês, comidas/alimentos funcionais ou pastilhas, cada qual contendo uma quantidade pré-determinada de um ou mais agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção, como pó ou grânulos ou como uma solução ou suspensão em líquido aquoso, líquido não aquoso, emulsão de óleo em água ou emulsão líquida de água em óleo. Essas composições podem ser preparadas por meio de qualquer um dos métodos farmacêuticos, mas todos os métodos incluem a etapa de trazer em associação um ou mais agentes conforme descrito acima com o veículo que constitui um ou mais ingredientes necessários. Geralmente, as composições são preparadas por meio de mistura uniforme e completa dos agentes de acordo com a presente invenção com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e então, se necessário, modelagem do produto na apresentação desejada.

[00113] As composições acima podem ser administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em quantidade efetiva. A dose administrada a pacientes, no contexto da presente invenção, deverá ser suficiente para realizar reação benéfica em pacientes ao longo de um período de tempo apropriado. A quantidade de agente(s) a ser administrada pode depender do paciente a ser tratado, incluindo sua idade, sexo, peso e condição de saúde geral, fatores que dependerão do julgamento do praticante da medicina.

[00114] Conforme utilizado geralmente neste documento, os termos “paciente”, “indivíduo” e “sujeito” são empregados no contexto de qualquer mamífero que recebe um tratamento ou composição descrito no presente. Consequentemente, os métodos e composições descritos neste documento podem ter aplicações médicas e/ou veterinárias. Em uma forma preferida, o mamífero é ser humano.

[00115] Para que a presente invenção possa ser completamente compreendida e colocada em prática, faz-se referência aos exemplos não limitadores a seguir.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS

[00116] Animais: camundongos BALB/c (fêmeas, 4-6 semanas de idade) originários do Animal Resource Centre (ARC, Perth, Austrália Ocidental). Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Griffith University de acordo com as diretrizes do National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália.

[00117] Linhagens bacterianas e meio de cultivo: uma série de isolados de GAS obtidos de várias fontes foi utilizada no estudo. S. pyogenes M1 (emm 1), 88/30 (emm 97), BSA10 (emm 124) e NS27 (emm 91), NS1 (emm 100) e 90/31 (emm 57) foram obtidos por meio da Menzies School of Health Research, Darwin, Austrália. A linhagem 5448AP (emm 1) foi obtida por meio do laboratório do Prof. Mark Walker (University of Queensland, Brisbane, Austrália). Todas as linhagens passaram por camundongos e tornaram-se resistentes contra estreptomicina (200 μg/ml) por meio de troca de placa contínua sob concentrações crescentes de estreptomicina. Para preparar inoculado de desafio, as linhagens de GAS foram cultivadas a 37 °C em meio líquido contendo caldo de Todd-Hewitt (THB; Oxoid, Austrália) suplementado com 1% de neopeptona (Difco). Para determinação da carga biológica bacteriana após a infecção, as amostras foram colocadas em placas com agar e sangue que consistiam do meio líquido descrito acima com 2% de agar, 200 μg/ml de estreptomicina e 2% de sangue de cavalo.

[00118] Síntese de peptídeos e formulação de vacina: peptídeo J8 foi sintetizado e conjugado a DT pela Auspep Pty Ltd. (Austrália) conforme descrito em outro documento (Batzloff et al, 2003). O SpyCEP recombinante foi expresso e purificado pela GenScript USA, Inc. Todos os peptídeos foram armazenados liofilizados ou em solução a -80 °C. Camundongos foram vacinados com J8-DT ou SpyCEP recombinante em dose de 30 μg/camundongo. Para vacinação com vacina conjugada de proteína e peptídeo combinados, 30 μg do conjugado de peptídeo J8-DT e 30 μg de SpyCEP recombinante por camundongo foram misturados e adsorvidos em hidróxido de alumínio (Alhydrogel, alúmen) em razão de 1:1 (v/v).

[00119] Estabelecimento de modelo de infecção superficial da pele: para desenvolver um modelo de infecção superficial da pele para GAS, foram utilizados BALB/c fêmeas consanguíneas e camundongos suíços não consanguíneos (4-6 semanas de idade). Camundongos foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal (IP) (100 μl/10 g de camundongo) de Cetamina (100 mg/ml de estoque)/Xylazil-20 (20 mg/ml de estoque)/água em razão de 1:1:10. Os pelos da coxa posterior dos camundongos foram removidos com o uso de aparadores e barbeadores. A pele foi limpa com um chumaço com etanol e escarificada mecanicamente em seguida com a ajuda de uma lima metálica. Após abrasão da pele, os camundongos foram infectados com GAS. Um inóculo (20 μl) contendo contagens de CFU conhecidas de GAS foi aplicado de forma tópica sobre a pele escarificada. Após a absorção completa do inóculo sobre a pele, foi aplicada uma cobertura temporária sobre o local machucado e os camundongos foram abrigados em gaiolas individuais. Além dos grupos infectados superficialmente, uma coorte de camundongos infectados por sacos aéreos foi utilizada como controle positivo. Estes camundongos foram infectados de acordo com o método de Raeder e Boyle (1993). Os camundongos foram monitorados diariamente em busca de lesões infectadas, bem como sinais de doença de acordo com a tabela de classificação aprovada. O local machucado foi monitorado de perto para avaliar o estado da infecção.

[00120] Seções de histologia: no dia 3 após a infecção, os camundongos escarificados (n = 3 por grupo) com ou sem infecção da pele GAS foram sacrificados. Uma amostra da pele do tecido do local de infecção foi coletada, fixada com formalina tamponada e incorporada em parafina para coloração com haematoxilina e eosina (H&E). Seções de tecido com espessura de 5 μm foram fatiadas em seguida e manchadas com H & E, bem como com coloração Giemsa e Gram para visualizar o organismo Gram-positivo. As seções sofreram varredura e foram lidas com alta ampliação, utilizando o software ImageScope. Para imuno-histoquímica, as amostras foram congeladas em OCT. Também se realizou histologia em vários momentos após o esgotamento de neutrófilo e macrófago. Células positivas foram contadas em cinco áreas de fatias que sofreram varredura e expressas como o número médio de células positivas por 10.000 μm2 com o uso de ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos).

[00121] Protocolo de imunização e desafio de camundongos: Camundongos BALB/c foram imunizados por via subcutânea na base da cauda no dia 0 com 30 μg de J8-DT, 30 μg de rSpyCEP ou formulação de 60 μg contendo 30 μg de J8-DT e 30 μg de rSpyCEP. Todos os preparados de antígeno em PBS foram formulados em Alhidrogel como adjuvante. Os camundongos foram impulsionados nos dias 21 e 28. Camundongos controle receberam apenas o adjuvante. Duas semanas após a imunização final, os camundongos foram desafiados com GAS utilizando via dérmica de infecção. Após a infecção, os camundongos foram monitorados de perto e qualquer camundongo que exibisse sinais de doença (com base na tabela de classificação, aprovada pelo GU Animal Ethics Committee) era sacrificado.

[00122] Coleta de amostras e determinação de CFU: em momentos específicos após a infecção (dias 3, 6 e 9), cinco camundongos de cada grupo foram sacrificados. Amostras de sangue foram coletadas via punção cardíaca e tecido da pele foi extirpado das lesões infectadas no quadril traseiro dos camundongos infectados. As amostras de pele foram pesadas e homogeneizadas em solução salina. Diluições apropriadas foram colocadas em placas em seguida em réplicas sobre placas de agar-sangue-estreptomicina para determinar a carga bacteriana na lesão infectada. Amostras de sangue foram diluídas em PBS e diluições apropriadas foram colocadas em placas em réplicas sobre placas de agar-sangue-estreptomicina para determinar a carga bacteriana no sangue.

[00123] Estudos de esgotamento celular: macrófagos foram esgotados por meio de administração IP de carragena (CGN) conforme descrito anteriormente (Goldmann et al, 2004). Para esgotamento de macrófagos da pele, CGN foi injetado por via subcutânea a cada 72 horas, o que resultou em esgotamento de >95% de macrófagos residentes na pele. A dose e o curso temporal para injeção de CGN foram otimizados utilizando análise citométrica de fluxo de células do baço após a marcação com F4/80 conjugado a Mac-1 e APC anticamundongo conjugado a FITC (BD Biosciences, Nova Jérsei, Estados Unidos). Para esgotar os neutrófilos, mAb anti-Ly6G (clone 1A8) foram utilizados conforme descrito anteriormente (Eyles et al, 2008). O esgotamento de neutrófilos foi confirmado por meio de análise citométrica de fluxo do sangue, medula óssea e células do baço, utilizando CD11b-perCp-cy5.5 e Gr-1-APCmAbs.

[00124] Teste de degradação de quimiocina in vitro: Degradação de IL-8, MIP-2 e KC foi realizada e quantificada por meio de ELISA, utilizando o kit Quantikine (R & D Systems, Mineápolis, MN, Estados Unidos) conforme descrito anteriormente (Hidalgo-Grass et al, 2004). Utilizando este método, as quantidades de quimiocinas não degradadas (IL-8, MIP-2 e KC) após a incubação com sobrenadantes de cultivo GAS (S/N) foram medidas. Resumidamente, para coletar S/N de cultivo, várias linhagens de GAS foram cultivadas até fase log médio (OD600 0,5), reinoculadas em THB fresco e cultivadas durante a noite a 37 °C. S/Ns de cultura GAS livre de células de cada linhagem foram incubados em seguida a 37 °C com concentração conhecida de quimiocina recombinante (IL-8, MIP-2 e KC). Amostras foram coletadas após 2, 4, 8 ou 24 h e a quantidade de quimiocina não degradada foi determinada por meio de ELISA (R & D Systems) conforme descrito acima.

[00125] Testes de isolamento de neutrófilos e migração transcavidades: neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongo utilizando o kit de isolamento de neutrófilos (Miltenyi Biotech, Alemanha). Neutrófilos (2,5x105 em 100 μl de meio) foram adicionados à câmara superior do sistema transcavidades (transcavidades com 24 cavidades Costar, Corning NY), que foi colocado em seguida na câmara inferior que contém apenas meio ou quimiocinas intactas ou degradadas. Como controle positivo, cavidades contendo concentração conhecida de cada quimiocina recombinante também foram utilizadas. Após duas horas de incubação a 37 °C, as células foram coletadas das câmaras superior e inferior e o número de neutrófilos viáveis transmigrados foi determinado utilizando exclusão com azul de tripano. O percentual de neutrófilos em migração foi calculado dividindo-se o número de neutrófilos migrantes pelo número total de neutrófilos presentes.

[00126] Testes de neutralização de SpyCEP: Para avaliar a capacidade de neutralização de SpyCEP do antissoro rSpyCEP, soro híper- imune para rSpyCEP foi criado em camundongos BALB/C. Um painel de linhagens GAS que inclui 90/31, BSA10 e 5448AP foi cultivado até a fase estacionária. Os sobrenadantes de cultivo de GAS livres de células foram coincubados com quimiocinas recombinantes e soro normal ou anti-SpyCEP a 50% por 16 h a 37 °C. IL-8 não dividido foi medido utilizando um kit ELISA Quantikine (R & D Systems).

[00127] Mapeamento de epÍtopos SpyCEP: um teste de peptídeos que engloba 553 aminoácidos da região terminal N de SpyCEP foi sintetizado em GenScript (Genscript USA, Inc). Ao todo, 55 peptídeos (SEQ ID N° 1-55), cada qual com 20 mer em sobreposição por 10, foram manchados sobre a membrana. Após protocolo ELISA, a membrana foi sondada com antissoro de camundongos imunizados três vezes com 30 μg/dose de preparação de rSpyCEP/Alúmen. Seis peptídeos que foram reconhecidos mais fortemente com antissoro SpyCEP foram retirados para estudos adicionais (SEQ ID N° 15, 18, 19, 24, 30 e 54).

[00128] Síntese de peptídeos e formulação de vacina: seis peptídeos (20 mer cada) identificados por meio de mapeamento de epÍtopos (conforme discutido acima) foram sintetizados em GenScript como peptídeo livre ou com um resíduo de cisteína adicional no terminal C. Os peptídeos com terminal C foram conjugados em seguida a DT e utilizados em camundongos para estudos de imunogenicidade in vivo. Todos os peptídeos foram armazenados liofilizados ou em solução a -20 °C. Os camundongos foram vacinados três vezes com conjugados de rSpyCEP ou conjugados de peptídeo SpyCEP (S1-S6)-DT em dose de 30 μg/camundongo.

[00129] Determinação da imunogenicidade de peptídeos individuais: Amostras de soro foram coletadas antes e depois de cada impulso para determinar títulos de anticorpo para os peptídeos imunizadores, bem como para a proteína mãe (rSpyCEP). Para determinar títulos de IgG específicos de peptídeos, placas foram revestidas com 5 μg/ml de cada um dos seis peptídeos (S1-S6). Realizou-se ELISA utilizando diluições em série duas vezes de antissoro criado contra cada peptídeo. Para determinar o reconhecimento de peptídeo SpyCEP por rSpyCEP, utilizou-se diluição em série duas vezes de antissoro rSpyCEP. Por fim, para determinar o reconhecimento de peptídeo mãe do antissoro de peptídeo, as placas foram revestidas com rSpyCEP e antissoro de peptídeo foi utilizado para determinar sua ligação/reconhecimento de rSpyCEP.

[00130] Teste de proteção de IL-8 in vitro: para determinar a capacidade de antissoro de peptídeo na inibição da degradação de IL-8, realizou-se um teste de proteção de IL-8 in vitro. Sobrenadantes (S/N) de cultivo de GAS foram incubados com concentração conhecida de IL-8 recombinante e diluição 1:2 de antissoro de peptídeo (S1-S6). A quantidade de IL-8 não degradado na mistura de reação foi quantificada por meio de ELISA utilizando o kit Quantikine (R & D Systems, Mineápolis, MN, Estados Unidos) conforme descrito anteriormente (Hidalgo-Grass et al, 2004). Resumidamente, para coletar S/N de cultivo, várias linhagens de GAS foram cultivadas até fase de log médio (OD600 0,5), reinoculadas em THB fresco e cultivadas por uma noite a 37 °C. S/Ns de cultivo de GAS livres de célula de cada linhagem foram incubados em seguida a 37 °C com concentração conhecida de quimiocina recombinante (IL-8), com ou sem antissoro de cada peptídeo. Amostras foram coletadas após 16 h de incubação e a quantidade de quimiocina não degradada determinada por meio de ELISA (R & D Systems) conforme descrito acima.

[00131] ELISA de inibição de peptídeo: para os testes de ELISA de inibição de peptídeos, as placas com microtítulos foram revestidas com 100 μl de peptídeo S1 a S6 ou recSpyCEP em concentração final de 5 μg/ml em 75 mM de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6, a 4 °C por uma noite. Placas foram lavadas com tampão (PBS com 0,05% Tween 20, pH 7,2) e bloqueadas por 90 min a 37 °C com tampão suplementado com 5% de leite desnatado (tampão bloqueado). Soro antipeptídeo ou recSpyCEP foi pré-incubado com 5 ou 2,5 μg/ml de cada um dentre o autopeptídeos ou recSpyCEP por trinta minutos a 37 °C. Antissoro de teste foi adicionado em seguida às placas bloqueadas e incubado por 90 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes e IgG anticamundongo de cabra conjugado a HRP (Biorad, Austrália) foi adicionado e incubado por mais 90 minutos a 37 °C. Após lavagem adicional, as placas foram desenvolvidas conforme acima e mediu-se OD450.

[00132] Teste de citometria de fluxo: A ligação dos anticorpos de epitopo SpyCEP ou recSpyCEP à superfície da célula GAS foi analisada por meio de citometria de fluxo. As bactérias foram cultivadas em THB com 1% neopeptona por uma noite e lavadas em PBS. Em seguida, bactérias (1x107 unidades de formação de colônias; cfu) foram pré-incubadas com 100 μl de bloqueador Fc por quinze minutos à temperatura ambiente para bloquear os locais de ligação não específicos. Isso foi seguido pela adição do antissoro de peptídeo em diluição de 1 em 20. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, as bactérias foram lavadas duas vezes em PBS seguido por incubação com um IgG anticamundongo conjugado a FITC (diluído 1/50 em PBS com 2% de BSA). Por fim, as bactérias foram lavadas e incubadas em formaldeído a 1% (em PBS) por quinze minutos à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas em um Analisador CyAn ADP (Beckman Coulter, Inc.). O IgG anticamundongo conjugado a FITC foi adicionado separadamente como controle negativo para cada linhagem analisada e, além disso, IgG de camundongo não específico foi incluído como controle.

[00133] Modelo de desafio para determinação da eficácia da vacina: fêmeas de camundongos BALB/c consanguíneas (4-6 semanas de idade) foram anestesiadas com uma injeção intraperitoneal (IP) (100 μl/10 g de camundongo) de cetamina (100 mg/ml de estoque)/Xylazil-20 (20 mg/ml de estoque)/água em razão de 1:1:10. O pelo da nuca dos camundongos foi removido com o uso de aparadores e um barbeador. Após a escarificação superficial da pele, um inóculo (20 μl) de GAS contendo 1x106 contagens de CFU foi aplicado por via tópica. Após a absorção completa do inóculo pela pele, uma cobertura temporária foi aplicada sobre o local machucado e os camundongos foram abrigados em gaiolas individuais. Os camundongos foram alimentados com água com estreptomicina (200 μl/ml) 24 horas antes da infecção e permaneceram desta forma ao longo do curso do estudo. Os camundongos foram monitorados diariamente para determinar lesões infectadas, bem como sinais de doença de acordo com a tabela de classificação aprovada pelo IBC da Griffith University. O local machucado foi monitorado de perto para avaliar o estado da infecção.

[00134] Coleta de órgãos e determinação de CFU: Em vários momentos após a infecção (dias 3, 6 e 9), um número definido de camundongos de cada grupo foi sacrificado. Amostras de sangue foram coletadas por meio de punção cardíaca, os baços foram removidos e foram obtidas amostras de biópsia da pele da lesão infectada na nuca. As amostras de pele e do baço foram homogeneizadas e diluições apropriadas foram então colocadas em placas em réplicas sobre placas de agar-sangue-estreptomicina. Após a infecção, os camundongos foram monitorados de perto e qualquer camundongo que exibisse sinais de doença (com base em uma tabela de classificação) era sacrificado.

RESULTADOS

[00135] Na Figura 1, a eficácia protetora de vacinação J8- DT/Alúmen é exibida comparando-se diferentes linhagens de GAS M1 (um isolado de garganta) e isolados da pele 88/30 e BSA10. Vacinação de J8- DT/Alúmen foi menos eficaz para os dois isolados da pele em comparação com M1. A presença de neutrófilos (PMN) na pele de camundongos infectados com GAS está associada com a eficácia da imunização J8, conforme exibido na Figura 2.

[00136] Consequentemente, foram realizados experimentos para medir o efeito do esgotamento de neutrófilos mediante reações a J8- DT/Alúmen, cujos resultados são exibidos na Figura 3. O esgotamento de neutrófilos apresentou efeito prejudicial sobre a eficácia da vacinação com J8- DT/Alúmen.

[00137] Os dados nas Figuras 1-3 sugeriram que neutrófilos podem desempenhar papel na determinação da eficácia da imunização com J8 contra infecções de GAS. A Figura 4 fornece uma visão geral dos genes bacterianos que são expressos regulados para cima em isolados de GAS como 5448AP (isolado M1T1) que possuíam uma mutação CovR/S. Conforme exibido na Figura 5, a eficácia de proteção de J8-DT/Alúmen contra isolado de GAS 5448AP foi relativamente baixa. Considerando que neutrófilos parecem auxiliar as reações imunológicas ao peptídeo J8, um possível gene bacteriano que é altamente expresso em isolado de GAS 5448AP foi SpyCEP, uma serino protease com 70 kD que divide e inativa o quimioatrativo de neutrófilo interleucina 8 (ver Figura 4). A Figura 6 exibe os resultados de experimentos nos quais 5448AP exibiu degradação de IL-8 particularmente forte. O isolado de 5448AP também exibiu forte atividade de degradação para com os homólogos funcionais murinos de IL-8: CXCL1/MIP-2 (Figura 7) e CXCL1/KC (Figura 8). Funcionalmente, essa degradação estava correlacionada a quimiotaxia de neutrófilos de inibição conforme exibido na Figura 9.

[00138] Os dados nas Figuras 1-9 sugeriram que SpyCEP, uma serino protease, foi altamente expressa por bactérias GAS mutantes CovR/SCovR/S que regula negativamente IL-8 por meio de degradação proteolítica, de forma a inibir ou suprimir a quimiotaxia de neutrófilos. Foram, portanto, realizados experimentos para determinar se o direcionamento a SpyCEP melhoraria, restauraria ou aprimoraria a reação imunológica ao peptídeo J8. Os resultados exibidos na Figura 10 indicaram que imunização com SpyCEP/Alúmen recombinante de J8-DT foi muito mais eficaz que a imunização com SpyCEP recombinante isolado ou conjugado com peptídeo J8- DT, em que a combinação de peptídeo J8 e SpyCEP recombinante age de forma sinérgica para proteger contra infecção por bactérias GAS 5448AP. Além disso, a Figura 11 demonstra que imunização com J8-DT-rSpyCEP resulta em reação de anticorpo IgG muito mais forte que J8-DT ou SpyCEP isolados. Estes dados aumentaram a possibilidade de que anticorpos para SpyCEP podem ser agentes terapêuticos úteis que podem ser administrados diretamente a um local de infecção de GAS (a pele), de forma a tratar a infecção. Conforme exibido na Figura 12, anticorpos anti-SpyCEP (na forma de antissoro de camundongos imunizados com SpyCEP recombinante) inibiram a atividade de degradação de IL-8 de SpyCEP.

[00139] Fizemos uma série de peptídeos 20 mer sobrepostos (conjunto de peptídeos sobre membrana de nitrocelulose) dos resíduos 35-587 de SpyCEP (SEQ ID N° 1-55 na Figura 13) para determinar quais foram reconhecidos pelo antissoro recSpyCEP. A partir dos dados da Figura 14, identificamos seis supostos epÍtopos de peptídeo com as sequências de aminoácidos descritas na Figura 15 (S1-S6; SEQ ID N° 15, 18, 19, 24, 30 e 54). Elaboramos em seguida os peptídeos sintéticos individuais e conjugamos cada um deles a DT. Os camundongos foram imunizados e demonstramos que o antissoro poderia reconhecer recSpyCEP, embora alguns tenham sido mais fortes que outros (Figura 16). Realizamos em seguida um teste de proteção de IL-8 e demonstramos que os anticorpos antipeptídeo podem bloquear a degradação de IL-8 por SpyCEP em graus variáveis, mas um antissoro de peptídeo (S2; SEQ ID N° 18) pode bloquear a degradação de IL-8 tão efetivamente quanto anti-recSpyCEP (Figura 17). Desta forma, identificamos o epitopo dominante sobre SpyCEP (SEQ ID N° 18) que pode induzir anticorpos funcionais.

[00140] Os dados exibidos nas Figuras 18-20 testaram a imunogenicidade de p145, J8 e variantes de peptídeo J8 designados conforme segue: - p145 LRRDLDASREAKKQVEKALE (SEQ ID N° 56); - J8 QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ (SEQ ID N° 58); - J8i V1 SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID N° 59); - J8i V2 SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC (SEQ ID N° 60); - J8i V3 SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 61); - J8i V4 SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 62).

[00141] Soro hiperimune foi gerado em camundongos Balb/c fêmeas com 4-6 semanas de idade após um protocolo de imunização de 28 dias. Camundongos foram imunizados por via subcutânea com 30 μg de peptídeo conjugado a DT (J8, p145, J8iV1, J8iV2, J8iV3 ou J8iV4) em PBS e Alúmen. As imunizações ocorreram nos dias 0, 21, 28. Sangramentos submandibulares para coleta de sangue/soro foram realizados nos dias 35, 42 e 49.

[00142] Observamos anteriormente que, em camundongos e seres humanos, anticorpos induzidos por meio de vacinação com J8-DT reconhecem apenas pobremente a sequência nativa, p145. Desta forma, projetamos quatro peptídeos variantes com base na sequência de inserção J8 12 mer e projetamos de forma que a periodicidade de septetos de aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos fosse mantida para preservar a estrutura alfa- helicoidal do peptídeo. Estes são peptídeos J8iV1, J8iV2, J8iV3 e J8iV4 relacionados acima.

[00143] A Figura 18 (painel direito) demonstra que o título de anticorpos específicos de p145 induzidos por meio de vacinação de J8-DT é muito baixo (média de cerca de 2000, com alguns camundongos abaixo de 200). Por outro lado, o título de anticorpos específicos de J8 é de cerca de 600.000 após a vacinação de J8-DT. O alto título de J8 deve significar que a maioria dos anticorpos reconhece as sequências laterais não estreptocócicas nos segmentos com terminal amino e terminal carboxila de J8, embora isso não tenha sido provado formalmente.

[00144] A Figura 19 demonstra que todos dentre J8iV1, J8iV2, J8iV3 e J8iV4 induziram anticorpos com alto título para si mesmos (cerca de 100.000). É importante ressaltar que todos induzem altos títulos para p145 (>10.000), em que J8iV3-DT induz títulos de cerca de 30.000 (Figura 20, painel direito). É provável que os títulos dos novos peptídeos para si próprios sejam mais altos que os títulos para p145, pois p145 contém aminoácidos adicionais não encontrados nos novos peptídeos e alguns deles podem mascarar os epÍtopos reconhecidos pelo antissoro para as novas variantes. Os altos títulos dos peptídeos J8 variantes para si próprios (cerca de 100.000) são significativos, pois eles são derivados exclusivamente da sequência estreptocócica. Os novos variantes induzem, portanto, títulos de 100.000, em que todos os anticorpos reconhecem sequências de estreptococos, enquanto J8 induz títulos estreptocócicos de cerca de 2.000.

[00145] A imunodominação de S2 também foi avaliada utilizando um teste de inibição de peptídeos. Antissoro para recSpyCEP e os epÍtopos individuais foram pré-incubados com cada um dos antígenos imunizantes e, em seguida, sua ligação ao antígeno foi analisada. A ligação de antissoro de epitopo aos autopeptídeos imobilizados foi grandemente reduzida após a pré- incubação com autopeptídeo (40-80% de inibição) (Figura 21 A). Pré-incubação de antissoro de epitopo com recSpyCEP também levou à inibição do reconhecimento por autopeptídeos imobilizados com a inibição mais alta observada quando antissoro S2-DT foi incubado com recSpyCEP (Figura 21 B), o que indica que o epitopo reconhecido pela imunização de S2-DT foi exibido sobre a superfície de recSpyCEP. Além disso, quando o antissoro para SpyCEP foi incubado com cada um dos seis peptídeos, observamos que o peptídeo S2 (SEQ ID N° 18) inibiu a ligação ao máximo e de forma comparável com a inibição causada por recSpyCEP (Figura 21 C). Estes dados indicam que, em termos de ELISA, a reação imunológica a SpyCEP é predominantemente definida pelo reconhecimento de anticorpo de S2 (SEQ ID N° 18) e que S2 (SEQ ID N° 18) pode permitir reação imunológica similar a todo o recSpyCEP. Portanto, S2 (SEQ ID N° 18) é o epitopo imunodominante de SpyCEP.

[00146] Testamos em seguida a eficiência de ligação de SpyCEP e antissoro de epitopo para várias linhagens de GAS. SpyCEP é expresso sobre a superfície de GAS e também eliminado. Para avaliar o reconhecimento de antígeno nativo, a ligação dos diferentes anticorpos específicos de epÍtopos a várias linhagens de GAS foi comparada utilizando teste FACS. A linhagem de GAS 5448 foi utilizada em conjunto com seu derivado passado em animal 5448AP (uma linhagem mutante CovR/S conhecida por expressar altos níveis de SpyCEP). De forma similar, BSA10 do tipo selvagem foi utilizado em paralelo com seu derivado passado por animal pBSA10 (também um mutante de CovR/S). Uma linhagem de referência 2031 (emm1) e um isolado de pele do Território do Norte da Austrália, 88/30, também foram incluídos. Nossos dados demonstraram que, em todos os casos, houve ligação comparável a isolados de GAS de anticorpos induzidos por vacinação com recSpyCEP a anticorpos induzidos por imunização com S2-DT. Anticorpos para outros epÍtopos demonstraram níveis variáveis de ligação a GAS (Figura 22 A, B e C). Além disso, a expressão de superfície de SpyCEP, bem como S2, foi considerada a mais alta dentre todas as linhagens testadas, conforme medido pelos dados de intensidade de fluorescência média (MFI) (dados não exibidos). Estes dados demonstram a imunodominação do epitopo S2 sobre SpyCEP nativo. Os dados não demonstram, entretanto, que anticorpos para o epitopo S2 prejudicariam funcionalmente a quimiocina protease CXC de SpyCEP.

[00147] Nós então perguntamos se S2-DT poderia aprimorar a eficácia da vacina J8-DT. Demonstramos anteriormente que recSpyCEP em combinação com J8-DT resulta em proteção significativamente melhor contra infecções invasivas com linhagens mutantes CovR/S de GAS que J8-DT isolado ou recSpyCEP isolado (manuscrito submetido). J8-DT e recSpyCEP ou S2-DT foram misturados em razão de 1:1 em peso e testados em um modelo de desafio da pele que desenvolvemos recentemente (manuscrito submetido). Camundongos controle foram vacinados com antígenos individuais ou com PBS. Camundongos após a vacinação foram desafiados com GAS 5448AP. Vacinação com J8-DT+S2-DT resultou em bioencargo bacteriano significativamente reduzido na pele, bem como no sangue de camundongos infectados com 5448AP (Figura 23 A e B). O nível de proteção oferecido pela vacinação com J8-DT+S2-DT também foi considerado comparável com o da vacinação com J8-DT+SpyCEP. Para confirmar essas descobertas, os experimentos de desafio foram repetidos com outra linhagem mutante de CovR/S NS88.2 (Figura 24 A e B). Aqui, novamente descobrimos que a vacinação com J8-DT+SpyCEP ou J8-DT+S2-DT resulta em eficácia protetora significativamente aprimorada em comparação com J8-DT isolado. Vacinação com J8-DT ou SpyCEP isolado não ofereceu nenhuma proteção em comparação com os controles de PBS.

CONCLUSÃO

[00148] A atividade de neutrófilos parece ser um fator chave na eficácia de vacinação com peptídeo J8. SpyCEP é uma protease degradante de IL- 8 altamente expressa por bactérias GAS virulentas, como aquelas com a mutação de CovR/S. Imunização com peptídeo J8 e rSpyCEP em combinação apresentou efeito sinérgico contra infecção de GAS pelo mutante de GAS CovR/S 5448AP em comparação com o peptídeo J8 ou SpyCEP isolado. Também é evidente que anticorpos anti-SpyCEP podem neutralizar efetivamente a atividade degradante de IL-8 de SpyCEP, de forma a fornecer intervenção terapêutica para infecções de GAS existentes. Além disso, identificamos o epitopo dominante sobre SpyCEP (SEQ ID N° 18) que pode induzir anticorpos funcionais. Estamos atualmente planejando estudos de vacina ativa e passiva com desafio de GAS. A vantagem deste epitopo é que ele nos permite evitar o uso de proteína SpyCEP recombinante inteira na vacina, o que aprimora o perfil de segurança. Acreditamos que a vacina ideal será uma mistura de J8 e este epitopo. Confirmando esta previsão, vacinação com J8-DT+SpyCEP ou J8-DT+S2-DT resulta em eficácia protetora significativamente aprimorada em comparação com J8-DT isolado. Além disso, foram desenvolvidos peptídeos J8 variantes que induzem altos títulos para si mesmos e o peptídeo estreptocócico p145, presumivelmente porque eles são exclusivamente derivados da sequência de aminoácidos p145 estreptocócica.

[00149] Ao longo de todo o presente relatório descritivo, o objetivo foi descrever as realizações preferidas da presente invenção sem limitar a presente invenção a nenhuma realização ou coleção específica de características. Várias mudanças e modificações podem ser realizadas às realizações descritas e ilustradas neste documento sem abandonar o espírito e escopo amplos da presente invenção.

[00150] Todos os programas de computador, algoritmos, patentes e literatura científica indicados neste documento são integralmente incorporados ao presente como referência.

Claims

1. USO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA M compreendendo ou contido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, e de um agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para permitir a reação imunológica à bactéria estreptocócica do grupo A no mamífero.

2. USO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA M compreendendo ou contido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, e de um agente que facilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para imunizar o mamífero contra bactérias estreptocócicas do grupo A.

3. USO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA M, compreendendo ou contido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56; e um agente possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilos compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar ou evitar infecção bacteriana estreptocócica do grupo A no mamífero.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por incluir um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam o fragmento de proteína M compreendendo ou contido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56, e um ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam o agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.

5. COMPOSIÇÃO, adequada para administração a mamíferos, caracterizada por compreender um fragmento de proteína M compreendendo ou contido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56; e um agente que possibilita a restauração ou aprimoramento da atividade de neutrófilo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.

6. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por uma sequência de aminoácidos do fragmento de proteína M estar presente em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.

7. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por uma sequência de aminoácidos do fragmento da proteína M estar presente em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDRVK (SEQ ID NO:57); SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC (SEQ ID N° 59); SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC (SEQ ID N° 60); SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 61); e SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC (SEQ ID N° 62).

8. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fragmento da proteína M compreender um ou uma série de resíduos de lisina em seu terminal N e/ou C.

9. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo agente compreender um ou uma série de resíduos de lisina em seu terminal N e/ou C.

10. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fragmento da proteína M ser conjugado a uma molécula.

11. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo agente ser conjugado a uma molécula.

12. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pela molécula compreender um toxoide.

13. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo toxoide ser toxoide de difteria.

14. USO OU COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo mamífero ser um ser humano.