KR20080005260A

KR20080005260A - 알츠하이머 질환의 예방 및 치료를 위한 펩티드 접합체조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20080005260A
Application number: KR1020077025682A
Authority: KR
Inventors: 빅토르 엠 가스키; 조셉 지 조이스; 폴 엠 켈러; 진 키니; 샤오핑 리앙; 존 더블류 쉬버
Original assignee: 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 2005-05-05
Filing date: 2006-05-01
Publication date: 2008-01-10
Also published as: US7850973B2; CN101171031A; NZ562434A; US20110052611A1; AU2006246382A1; BRPI0610093A2; WO2006121656A2; CA2607868A1; EP1879613B1; IL186793A0; ZA200708635B; NO20076239L; JP2008540417A; EP2269633A1; EP1879613A2; RU2406529C2; US20090098155A1; CN101171031B; ATE535252T1; RU2007145052A

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환과 같은 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침적과 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이 방법은 T-세포 에피토프가 결여되고 Aβ에 대한 항체의 형태로 유익한 면역 반응을 유도할 수 있는 Aβ의 면역원성 단편의 투여를 수반한다. 면역원성 단편은 선형 또는 다가의 Aβ펩티드를 포함한다. 약제학적 조성물은 아쥬반트와 함께 투여될 담체 분자와 화학적으로 결합된 면역원성 단편을 포함한다.

알츠하이머 질환, Aβ, Aβ의 면역원성 단편

Description

알츠하이머 질환의 예방 및 치료를 위한 펩티드 접합체 조성물 및 방법 {Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of Alzheimer's disease}

본 발명은 아밀로이드 형성 (amyloidogenic) 질환, 구체적으로, 알츠하이머 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

알츠하이머 질환(AD)은 점진적인 기억 손상 및 인지 기능의 저하를 특징으로 한다. 이의 특징적인 병리학적 병변은 뇌의 특정 지역에서의 아밀로이드 침적물 (노인성 플라크), 신경원섬유다발 (neurofibrillary tangle) 및 신경 세포의 상실이다. 아밀로이드의 침적물은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질 분해 생성물인 40 내지 43개의 아미노산 잔기의 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ)로 구성된다. 신경원섬유다발은 과인산화된 타우(tau) 단백질의 세포 내 필라멘트성 응집체이다 (Selkoe, Science, 275:630-631, 1997).

AD 질환의 발병은 충분히 이해되지 않았지만, 다요인에 의한 결과로 예상된다. 뇌조직에서 Aβ의 축적 및 응집이 질환의 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고, 이는 또한 아밀로이드 연쇄 반응 (cascade) 가설로 공지되었다 (Golde, Brain Pathol ., 15: 84-87, 1995). 이 가설에 따르면, Aβ, 특히 Aβ₄₂는 작은 올리고머 내지 큰, 신장된 프로피브릴 구조 범위의 다양한 형태의 응집체를 형성하는 경향이 있다. 이들 응집체는 신경독성이고, 당해 질환의 초기 단계에서 기억 상실 및 인지 기능의 저하와 관련된 시냅스 병리학에 관여한다 (Klein et al., Neurobiol . Aging, 25:569-580, 2004). 최근 논문은 삼중 유전자 도입 마우스 모델에서 Aβ의 감소가 또한 세포 내의 타우 축적을 방지함을 시사했다(Oddo et al., Proc. Neuron, 43:321-332, 2004). 이 발견은 세포 외 아밀로이드의 침적이 후속 신경원섬유다발 형성의 원인이 되어 연이어 신경 세포의 소실을 유도할 수 있음을 시사한다.

Aβ항원을 이용한 APP 유전자 도입 마우스의 면역화는 뇌의 Aβ 침적물을 감소시킬 수 있고 병의 진행을 완화시킬 수 있다. 이는 처음 문헌 [Shenk et al., Nature, 400: 173-177, 1999]에 보고되었고, 현재 상이한 유전자 도입 동물 모델, 다양한 활성 백신 및 Aβ특이적 모노클로날 항체를 이용한 수동 면역화와 관련된 다수의 연구에 의해 확증되고 있다 (Bard et al., Nature Med, 6: 916-919,2000; Janus et al., Nature, 408:979-982,2000; Morgan et al., Nature, 408:982-985, 2000; DeMattos et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 98:8850-8855, 2001; Bacskai et al., J. Neurosci ., 22:7873-7878, 2002; Wilcock et al, J. Neuroscie ., 23: 3745-3751, 2003). 이들 동물 데이터와 일치하게, 응집 전 Aβ(1-42) 면역원 (AN1792, Betabloc)으로 이전에 능동 면역 접종을 받은 환자로부터의 사후 사람 뇌조직의 3가지 공개된 평가는 노인성 플라크의 지역적 제거를 보였다 (Nicoll et al., Nature Med ., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol ., 14: 11-20, 2004; Masliah et al., Neurology, 64: 129-131, 2005). 이 데이터는 Aβ항원에 대한 항체 반응을 효과적으로 유도하는 백신이 AD에서 발견되는 병리학적 노인성 플라크에 대해 효과가 있다는 것을 종합적으로 나타낸다. 그러나, 백신 또는 항체 효능의 기작은 규명되지 않았다.

공공 영역(public domain)에서 가장 진전된 면역 치료-기반의 AD 프로그램은 아쥬반트, QS-21^TM(Antigenics, New York, NY)을 동시투여하는, 응집 전 Aβ(1-42)로 구성된 백신인 AN1792(Betabloc)를 이용하는 능동 면역화 제Ⅱ기 백신 임상 시험이었다. 2002년 1월, 이 연구는 4명의 환자가 수막 뇌염과 일치하는 증상을 보이면서 종결되었다 (Senior, Lancet Neurol ., 1:3, 2002). 결국, 298명의 치료한 환자 중 18명이 수막 뇌염 증상으로 발전했다 (Orgogozo et al., Neurology, 61:46-54, 2003). 뇌염과 항체 역가 사이에는 관계가 없었고, 이 효과의 원인 기작이 자가-면역원, 특히 Aβ₄₂ 펩티드 중간 및 카복시-말단 부분에 대한 T-세포의 활성화인 것으로 보고되었다 (Monsonego et al., J.Clin. Invest., 112:415-422, 2003). 이 결론을 지지하는 것으로서, 뇌염이 발병된 두 백신 수혜자로부터의 뇌 조직의 사후 검사는 한 환자에게서 CD4+ T 세포(Nicoll et al., Nature Med., 9:448-452, 2003) 및 다른 환자에게서 CD4+, CD8+, CD3+, CD5+, CD7+ T 세포(Ferrer et al., Brain Pathol., 14:11-20, 2004)의 실질적인 뇌막 침윤을 밝혔다.

현재의 증거는 수동 또는 능동 면역화 후 혈장 Aβ수준의 증가가 연이은 뇌 의 Aβ감소의 전조로서 말초 싱크 (peripheral sink)의 개시를 반영하는 것을 나타낸다. 말초 싱크는 뇌와 혈장의 Aβ저장의 평형이 변화하여 중추 신경의 Aβ가 말초로 최종 유출됨을 의미한다 (예를 들어, Deane et al., J. Neurosci ., 25: 11495-11503, 2005; DeMattos et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8931-8932, 2001). 다른 연구는 항-Aβ면역 치료 후에 관찰된 혈장 Aβ의 이러한 증가가 실현될 중추 신경의 Aβ의 연이은 감소를 위해 필요하다는 것을 제안했다 (Cribbs et al., 제7회 AD/PD에 대한 국제 회담, 소렌토, 이탈리아, 2005). 그러므로, Aβ내의 두 개의 아미노산이 치환되면 (예를들어, 네덜란드 및 아이오와 돌연변이에서 나타나는 것처럼), 펩티드는 더 이상 중추에서 말초 구획으로 넘어갈 수 없다 (Davis et al., Neurobiol . Aging, in press, 2005년 8월 18일 온라인에서 볼 수 있음). 이러한 Aβ의 돌연변이 형 및 스웨덴 돌연변이를 발현하는 마우스가 면역화되면, 혈장 Aβ의 증가가 발견되지 않고 연이어 뇌 Aβ의 감소도 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 야생형 사람의 Aβ 서열과 스웨덴 돌연변이를 발현하는 마우스는 능동 면역화에 반응하여 혈장 Aβ는 증가하고 연이어 중추 신경의 Aβ는 감소했다 (Cribbs et al., 제7회 AD/PD에 대한 국제 회담, 소렌토, 이탈리아, 2005). 따라서, 면역 반응을 일으킬 수 있어 혈장 Aβ의 수준을 증가시키는 모든 활성 백신 면역원이 뇌의 Aβ수준의 증가를 특징으로 하는 알츠하이머 질환 및 관련 장애의 치료를 위해 유용할 것으로 예상된다.

본 출원인은 놀랍게도 자가 T-세포 반응을 피하기 위해 T-세포 에피토프를 제거한 항원이 면역원성(immunogenic)이고 혈장 Aβ수준을 증가시킨다는 것을 밝혔 다. 이는 안전하고 효과적인 AD 백신의 제조를 위한 가능성 있는 수단을 나타낸다. 본 출원인은 AD 백신으로서의 용도를 위한 항원 및 제형을 제공한다.

발명의 요약

일 양태에서, 본 발명은 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있는, T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 이 조성물은 Aβ의 선형의 8개의 아미노산 펩티드 (8-량체)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 하나 이상의 스페이서를 갖는 산재된 다가의 선형 8-량체 또는 다가의 분지된 다중 항원성 펩티드(MAP; multiple antigenic peptide)를 포함한다. 당해 약제학적 조성물은 AD 및 관련 아밀로이드 질환에 대한 백신으로서 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 혈장 Aβ수준을 상승시키는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있는, T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 Aβ혈장 상승제이다. 당해 약제학적 조성물은 증가된 뇌의 Aβ의 수준을 특징으로 하는 AD 및 관련 아밀로이드 질환을 위한 백신으로서 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 Aβ단편에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 유도하도록 돕는 담체 분자와 결합하여 접합체를 형성한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 담체는 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitides)의 외막 단백질 복합체(OMPC)이다.

본 발명의 추가적인 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 아쥬반트와 함께 투여된다. 바람직한 양태에서, 아쥬반트는 알루미늄 아쥬반트 (Merck 알룸 아쥬반트, MAA) 또는 사포닌-기반 아쥬반트 (ISCOMATRIX^R, CSL Ltd., Parkville, 호주)이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침적과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이들 질환은 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 인지 능력의 손상 또는 노인성 치매의 다른 형태를 포함한다. 당해 방법은 선형의 8개의 아미노산 펩티드(8-량체), 하나 이상의 스페이서가 산재된 다가의 선형 펩티드 및 다가의 분지된 다중 항원성 펩티드 (MAP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 면역원성 단편은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 스페이서를 가진 다가의 선형 펩티드를 포함한다. 더욱 바람직한 양태에서는, 면역원성 단편이 OMPC에 접합된 다가의 분지된 MAP, Aβ(3-10)/(21-28) 접합체 (작제물 번호 12, 도 6A)를 포함한다.

그러한 방법은 당해 치료가 필요한 환자에게 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있는, T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편의 유효량의 투여를 수반한다. 상기 항체 반응은 혈장 Aβ의 수준을 상승시킬 수 있다. 이 양태의 다른 면에서는, 투여될 면역원성 단편이 담체 분자와 결합된다. 이 양태의 또 다른 면에서는, 면역원성 단편이 아쥬반트와 함께 투여된다.

도 1은 Aβ의 에피토프를 동정하기 위한 선형 펩티드 스캔을 수행하기 위해 Aβ(1-42) (서열번호 1)로부터 유래하고 선택된 합성 8-아미노산 펩티드(8-량체)(서열번호 2-36)를 도시한 것이다.

도 2는 KLH (도 2A) 및 OMPC (도 2B)에 접합하기 위해 선택된 8-량체를 도시한 것이다.

도 3은 제 1 (PD1), 제 2 (PD2) 및 제 3 (PD3)의 투여 후, 도 2에서 기술한 선택된 Aβ접합체의 면역원성을 도시한 것이다.

도 4는 사람의 AD 뇌 조직에 대한 앞선 Aβ(3-10)-KLH 접합체 (서열번호 40)를 면역 접종한 기니피그로부터 추출된 혈청의 교차-반응성을 도시한 것이다. 도 4A는 항-Aβ모노클로날 항체 6F3D (Aβ의 8번 내지 17번 아미노산을 인식함)의 면역반응성을 도시한 것이다. 염색 패턴은 당해 사람의 뇌에서 광범위 아밀로이드 병리를 나타낸다. 도 4B는 당해 동일한 뇌가 면역화 전의 기니피그로부터의 면역 전 혈청에 대해 면역반응성이 없다는 것을 증명했다. 도 4C는 면역화 후 면역화된 기니피그로부터의 혈청의 면역원성을 도시한 것이다.

도 5는 기니피그 연구(실시예 3)에서, 각각의 8-량체의 면역원성에 근거하여 선택된, 대표적인 다가의 선형 8-량체 펩티드를 도시한 것이다. 이들 접합체는 상기한 바와 같이 합성되고, OMPC에 접합된다 (실시예 1.J 및 1.K).

도 6은 기니피그 연구(실시예 3)에서, 각각의 8-량체의 면역원성에 근거하여 선택된 대표적인 다가의 분지된 MAP 접합체를 도시한 것이다. 도 6A는 대표적인 2 가의 MAP를 도시한 것이고, 도 6B는 대표적인 브로모아세틸-시스테인 MAP를 도시한 것이다. 이들 접합체는 상기한 바와 같이 합성되고 OMPC에 접합되었다 (실시예 2).

도 7은 아쥬반트로서 머크 알룸 단독으로 또는 머크 알룸 및 IMX (ISCOMATRIX^R, CSL, Ltd., Parkville, 호주) 중에 제형화된, OMPC에 접합된 Aβ(1-18) 펩티드를 이용하여 제 1 (PD1) 또는 제 2 (PD2) 주사 후의 붉은 털 원숭이로부터 수집된 혈청의 항-Aβ₄₀ 의 역가를 도시한 것이다.

도 8은 Aβ접합체의 투여 후 혈장의 Aβ수준의 증가를 도시한 것이다. 도 8A는 단량체 작제물 Aβ(3-10) (서열번호 69) 및 Aβ(21-28)(서열번호 73)(□, 작제물 번호 12, 도 6A; ●, Aβ(3-10)(서열번호 69),▲,Aβ(21-28)(서열번호 73),에 비해 Aβ(3-10)/(21-28) (작제물 번호 12, 도 6A)을 포함하는 MAP 작제물의 투여 후 3배 초과의 증가를 도시한 것이다. 도 8B는 혈장 Aβ의 수준이 역가 수준에 무관함을 도시한 것이다 (□, 작제물 번호 12, 도 6A; ●, Aβ(3-10)(서열번호 69),▲,Aβ(21-28)(서열번호 73);

정의

용어 "8-량체"는 Aβ의 단편, 천연 Aβ 펩티드의 유사체 또는 펩티드 모사체에 상응하는 8개의 아미노산 펩티드를 지칭한다. 하나 이상의 8-량체는 하나 이상의 스페이서와 결합되어 다가의 선형 펩티드를 형성하거나 다가의 분지된 MAP를 형성한다.

용어 "Aβ접합체"는 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin) 또는 네이세리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체(OMPC)와 같은 담체와 화학적으로 또는 생물학적으로 결합한 Aβ의 8-량체 또는 면역원성 단편을 의미한다.

용어 "Aβ 펩티드"는 선형의 8-량체, 하나 이상의 스페이서를 함유한 다가의 선형의 펩티드 및 다가의 분지된 다중 항원성 펩티드 (MAP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에서 상기한 모든 Aβ펩티드를 의미한다.

용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원상의 부위를 지칭한다. B-세포의 에피토프는 연속적인 아미노산 또는 단백질의 3차원 폴딩에 의해 인접된 연속하지 않는 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속된 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상 변성 용매에 노출된 상태에서도 유지되지만, 3차원 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 통상 변성 용매의 처리시 소실된다. T-세포 에피토프는 숙주의 MHC 분자와 복합체를 형성할 수 있는 펩티드로 이루어진다. CD8+ T-세포 반응을 유도하는 사람의 제Ⅰ형 MHC 분자에 대한 T-세포 에피토프는 통상 9 내지 11개의 아미노산 잔기를 포함하고, CD4+ T-세포 반응을 유도하는 사람의 제Ⅱ형 MHC 분자에 대한 에피토프는 통상 12개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다 (Bjorkman et al. Nature 329:506-512, 1987; Madden et al. Cell 75:693-708; Batalia and Collins; Engelhard Annu Rev Immunol ., 12: 181-207-622. 1995; Madden, Annu Rev Immunol ., 13:587-622. 1995). T 세포와는 달리, B 세포는 4개의 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 인식할 수 있다. T-세포 에피토프/MHC 복합체는 T-세포 수용 체에 의해 인식되어 T-세포를 활성화시킨다.

본원에서 이용된 용어 "Aβ의 면역원성 단편" 또는 "T-세포 반응이 결여된 Aβ의 면역원성 단편"은 자가 항원 Aβ에 대한 T-세포 반응을 포함하지 않고 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역반응을 유도할 수 있는 8-량체 또는 Aβ단편을 지칭한다.

용어 "면역학적" 또는 "면역" 또는 면역원성" 반응은 척추동물 개체의 항원에 대한 체액성 (항체 매개되는) 및/또는 세포성 (항원-특이적 T 세포 또는 그들의 분비 생성물에 의해 매개되는) 반응의 발생을 지칭한다. 그러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도되는 능동 반응 또는 항체의 투여에 의해 유도되는 수동 반응이 될 수 있다.

용어 "다가의 펩티드"는 하나 이상의 항원 결정기 (antigenic determinant)를 가진 펩티드를 지칭한다.

용어 "약제학적 조성물"은 포유류 개체에 투여하기에 적합한 화학적 또는 생물학적 조성물을 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 약제학적 조성물은 상기한 바와 같이 본원에서 기술한 8-량체, Aβ의 면역원성 단편 및 Aβ 접합체를 포함하는, 임의로 아쥬반트가 있거나 없는 상태로 투여될 조성물을 지칭한다.

상기한 바와 같이, 임상 전 연구는 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 유전자 도입 마우스에서 항-Aβ폴리클로날 항체 반응을 생성하는 능동 면역화가 AD와 관련된 병리학적인 인지 증상에 대한 효능을 제공한다는 것을 제안한다 (Bard et al., Nature Med., 6: 916-919, 2000; Janus et al, Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos et al, Proc . Natl . Acad . Sci., 98: 8850-8855, 2001; Bacskai et al, J. Neurosci ., 22: 7873-7878, 2002; Wilcoc, et al, J. Neurosci ., 23: 3745-3751, 2003). 이들 임상 전 연구는 Aβ₄₂의 응집 형태가 활성 면역원으로서 이용된 단일 임상 시험에 의해 지지된다. 이 연구로부터의 예비적인 증거는 치료 후에 병리학적(Nicoll et al, Nature Med ., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al, Brain Pathol ., 14: 11-20, 2004; Masliah et al, Neurology, 64:129-131, 2005) 및 인지적 증상이 개선(Gilman et al, Neurology, 64 (9): 1553-1562, 2005)됨을 제시한다. 이들 발견이 고무적이고 임상 전 연구와 일치하지만, 치료는 안전하지 않은 것으로 입증되어 치료된 환자의 약 6%에서 수막뇌염의 출현 후에 종료되었다 (Orgogozo et al, Neurology, 61: 46-54, 2003). 그러므로 효능이 있는 면역 반응을 유도할 수 있고 유해 안전 문제를 피할 수 있는 능동 면역화 절차가 필요하다.

이러한 예비적인 임상 시험에서 역효과의 특성을 이해하는데 있어서 진전이 있었다. 몇몇 연구자는 사후 평가 (Nicoll, et al, Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol ., 14: 11-20, 2004)에서 자가-펩티드 Aβ₄₂에 대한 T-세포 반응을 암시하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ 양성 뇌막 침투를 보고했다. 그러나, 당업자는 적절한 항체 반응(B-세포 매개)을 유지하면서 자가-지시된 T-세포 반응을 피하는 것의 필요성을 인식하고 있지만, 이러한 특성을 지닌 제제를 생산하는 방법은 공지되지 않았다. 이러한 어려움은 예측 동물 모델 부재 또는 이들의 활성을 위한 예측 타당성을 지닌 다른 임상 전 분석의 부재에 의해 심화된다.

이를 위해, 본 출원인은 본 발명을 위해 이용되는 펩티드를 고안하기 위해 상이한 특성의 T 및 B 세포를 에피토프를 이용하였다. 백신 작제물은 선형의 펩티드 크기를 8개의 아미노산으로 제한함으로써 또한, 필요하다면, 모든 가능한 C-말단 T-세포 에피토프 앵커 잔기를 제거함으로써 고안되었다.

따라서, 본 발명의 양태는 AD 백신으로서의 용도를 위한 T-세포 에피토프가 결여된 면역원성인 Aβ단편의 동정이다. 본 출원 이전에는, T-세포 에피토프가 또한 결여된 Aβ펩티드의 어느 아미노산 단편이 면역원성 반응을 유도할 것인지 명백하게 공지되지 않았다. 당업자는 선행기술 분야의 교시로부터, 예를들어, 8-량체가 면역원성 반응을 유도할 수 있는지 예상할 수 없으며, Aβ 펩티드의 상이한 영역으로부터의 단편의 유용성을 밝힐 수 없음을 이해하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,808,712호 및 제6,787,144호를 참조한다.

본 발명의 추가적인 양태는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역반응을 유도하고 혈장 Aβ수준을 상승시키는, T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 Aβ혈장 상승제의 동정을 포함한다. 이러한 제제는 AD 백신으로서 이용될 수 있고, 뇌 Aβ 수준의 증가를 특징으로 하는 관련 아밀로이드 질환에 대해 이용될 수 있다. 출원인의 발명 이전에, Aβ의 어느 면역원성 단편이 혈장 Aβ의 수준을 상승시킬 수 있는지 공지되지 않았으며 예측할 수 없었다. 이론적으로 국한되지 않으면서, 본원에서 기술한 Aβ 혈장 상승제가 Aβ제거의 말초 싱크 이론에 따라, 혈장의 Aβ의 수준을 증가시켜 뇌 Aβ를 감소시키는, Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도하는 작용을 한다고 사료된다. 또한, Aβ의 개개의 8-량체 또는 면역원성 단편이 혈장 Aβ 수준을 증가시키는 것과 같은 면역 반응을 유도할 수 있고, 본 출원인들은 OMPC에 접합된 다가의 분지된 MAP, Aβ(3-10)/(21-28)(작제물 번호 12, 도 6A)이 이의 성분인 단량체 작제물 Aβ(3-10)(서열번호 69) 또는 Aβ(21-28)(서열번호 73)에 비해 혈장 Aβ수준을 증가시키는데 특히 효과적이라는 것을 밝혔다.

아밀로이드 질환

본 발명은 아밀로이드 침적물의 축적을 특징으로 하는 질환의 예방학적 및 치료적 처치를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 아밀로이드 침적물은 불용성의 덩어리로 응집된 펩티드를 포함한다. 펩티드의 특성은 상이한 질환에 따라 다양하지만, 대부분의 경우, 응집체는 β-병풍 (β-pleated sheet)구조를 가지며, 콩고 레드 염료 (Congo Red Dye)로 염색된다. 아밀로이드 침적물을 특징으로 하는 질환은 알츠하이머 질환(AD)의 후기 및 초기 개시를 포함한다. 두 질환에서, 아밀로이드 침적물은 아밀로이드 베타(Aβ)로 불리는 펩티드를 포함하며, 이는 병에 걸린 개인의 뇌에 축적된다. 따라서, 용어 "아밀로이드 질환"은 또한 뇌의 상승된 Aβ수준을 특징으로 하는 질환을 지칭한다.

치료제

본 발명의 용도를 위한 치료제는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역반응을 유도한다. 면역반응의 유도는 면역원이 투여되어 개체의 Aβ와 반응하는 항체 또는 T 세포를 유도할 때 능동이 되거나, 개체의 Aβ에 결합하는 항체 자체가 투여되었을 때 수동이 될 수 있다.

AD와 같은 아밀로이드 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 치료제는 Aβ의 펩티드 단편을 포함하고, 이는 천연적으로 존재하는 모든 형태 (예를 들어, Aβ39, Aβ40, Aβ42, Aβ42 또는 Aβ43)가 될 수 있다. 이들 서열은 당 업계에 공지되어 있다 (Hardy et al., TINS 20: 155-158, 1997 참조).

본원에 이용된 바와 같이, 바람직한 양태에서, 치료제는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있는, T-세포 에피토프가 결여된 면역원성 단편이다. Aβ의 면역원성 단편은 8-량체, 하나 이상의 PEG 스페이서를 가진 다가의 선형 Aβ 접합체 또는 다가의 분지된 MAP Aβ접합체의 형태가 될 수 있다. 치료제는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 치료제는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있고, 개인에게서 혈장 Aβ의 수준을 상승시키는 Aβ혈장 상승제이다. 이러한 제제는 천연적으로 존재하는 펩티드 단편을 포함할 수 있거나 하나 이상의 치환, 첨가 또는 결실을 포함할 수 있고, 합성 또는 비천연적으로 존재하는 아미노산을 포함할 수 있다. 단편 및 작제물은 본원의 실시예에서 기술한 분석에서 예방 및 치료적 효능에 대해 스크리닝될 수 있다.

바람직한 양태에서, 치료제는 Aβ의 펩티드 단편을 포함하고, 이들 제제는 또한 Aβ와 주요 아미노산 서열 유사성을 반드시 가질 필요는 없지만, Aβ의 모사체로 작용하며 유사한 면역 반응을 유도하는 펩티드 및 다른 화합물을 포함한다. 예를 들어, β-병풍 구조를 형성하는 펩티드 및 단백질은 본 발명의 적합성을 위해 스크리닝 될 수 있다. 유사하게, 조합 라이브러리 및 다른 화합물이 본 발명의 적합성을 위해 스크리닝될 수 있다.

이러한 동정된 치료제는 면역원으로서의 이들의 이용을 쉽게 하기 위해 화학적으로 또는 생물학적으로 담체에 결합될 수 있다. 이러한 담체는 혈청 알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH), 면역글로불린 분자, 난알부민, 파상풍 독소 단백질, 또는 디프테리아, 이. 콜라이, 콜레라 또는 에이치. 파이로리 (H.pylori)와 같은 다른 병원성 세균으로부터의 독소 또는 약독화된 독소 유도체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 양태에서 담체는 네이세리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체 (OMPC)이다.

본원의 발명은 담체와 결합하여, 임의적으로 아쥬반트와 함께 투여될, Aβ의 8-량체 또는 면역원성 단편을 포함하는 약제학적 조성물에서 이러한 치료제의 용도를 또한 고려한다. 적합한 아쥬반트는 알루미늄염(알룸), 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (MPL)와 같은 지질 또는 사포닌-기반의 아쥬반트를 포함한다. 바람직한 양태에서 아쥬반트는 알루미늄 아쥬반트 (머크 알룸 아쥬반트, MAA) 또는 사포닌-기반 아쥬반트 (ISCOMATRIX^R, CSL Ltd, Parkville, 호주)이다.

치료 계획

AD 및 다른 아밀로이드 질환의 예방 또는 치료적 처치를 위한 본 발명의 조성물의 유효량은, 제한되지 않지만, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 투여된 다른 약물 및 처치가 치료 (예, 발병 후) 또는 예방을 (예, 발병의 억제) 위한 것인지를 포함하는 다수의 인자에 따라 다양할 수 있다. 바람직한 양태에서 환자는 사람이고 치료제가 주사에 의해 투여된다.

이용될 면역원 또는 치료제의 양은 또한 아쥬반트가 동시에 또는 순차적으로 주사될 것인지에 따라 결정되고, 아쥬반트가 없는 경우 고용량으로 이용될 것이다.

투여될 면역원 또는 치료제의 양은 다양할 수 있지만, 주사 당 0.5 내지 50㎍ 범위의 펩티드의 양 (Aβ펩티드 함량에 근거하여)이 사람용으로 고려된다. 당 업자라면 본원에서 기술한 형태의 항원을 포함하는 조성물을 제형화하는 방법을 알 것이다.

투여 계획은 1차 면역화 후 설정 간격에서 부스터 주사하는 것으로 구성된다. 1차 면역화와 부스터 면역화 사이의 간격, 부스터 주사 사이의 간격 및 부스터 면역화의 횟수는 백신에 의해 유도되는 항체 역가 및 지속 기간에 따라 결정된다. 이는 또한 항체 반응의 기능적 효능, 즉, AD 발병을 억제하거나 AD 환자에게서 치료적 효과를 유도하기 위해 필요한 항체 역가의 수준에 따른다. 전형적인 계획은 1, 2, 및 6개월에서 초기 설정의 주사로 구성된다. 다른 계획은 1 및 2개월에서 초기 주사로 구성된다. 각 계획은, 부스터 주사가 항체 역가 및 지속 기간에 따라 6개월 또는 1년에 한번 씩 주어진다. 투여 계획은 또한 환자의 면역 반응을 모니터함으로써 결정되어 필요할 때마다 이루어질 수 있다.

AD 백신 에피토프의 동정

Aβ펩티드의 어떤 8개 아미노산 단편 ("8-량체")이 면역원성 반응을 생산하는데 충분한지를 결정하기 위해, 본 출원인은 도 1(서열번호 2-37)에서 도시한 천연적으로 존재하는 Aβ서열(서열번호 1)로부터 유래된 짧은 (8개의 아미노산) 중복 합성 펩티드를 이용하여 Aβ₄₂의 전체 길이를 체계적으로 스크리닝하였다. Aβ₄₂의 전체 길이에 걸쳐서, 29개의 중복된 8개의 아미노산 펩티드가 항원으로서의 사용하기 위해 합성되었다 (도 2A). 가용성을 개선하기 위해, 몇몇 펩티드가 트리플 리신 (KKK) (서열번호 52, 53, 54, 56, 59, 60, 62, 64 및 65) 또는 글루타민 (EEE) (서열번호 50, 51 및 61) 잔기의 첨가 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(서열번호 55 및 63) 스페이서의 이용에 의해 변형되었다. 이러한 이유로, 잔기 (11 번 내지 18번) 및 (13번 내지 20번)에 상응하는 Aβ의 서열에 걸친 펩티드는 우선, 6-아미노헥산산 (Aha) 스페이서 및 N-말단에서 화학적 교차-결합을 위한 작용기와 Aha 및 C-말단에서의 작용기를 가진 다른 형태와의 다중 형태로 제조된다. 대조군으로서, 출원인은 더 긴 펩티드, Aβ(1-18)을 포함시켰다.

본원에서 이용된 바와 같이, 면역원성 단편은 천연적으로 존재하는, 즉, 야생형, 또는 합성 Aβ(서열번호 1) 또는 이의 모든 돌연변이 또는 이변형체로부터 유래된 8-량체 펩티드(8개의 아미노산 잔기)가 될 수 있다. 그러한 돌연변이 또는 변형체는 당 업자에게 공지된 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형체의 일 예는 야생형 Aβ의 1 및 2 부위가 다양한 Aβ(1-42)에 상응하는 펩티드인 EV 기질 (EVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)(서열번호 66)이다.

백신 제형에 사용하기 위한 Aβ접합체

백신을 제형화하는데 사용하기 위한 Aβ접합체의 선택은 8-량체의 면역원성에 근거한다. 사람의 Aβ서열과 동일한 서열을 가진 종에서 8-량체의 면역원성을 결정하기 위해, 29개의 펩티드 (도 2A)를 KLH에 접합시켜 Aβ접합체를 형성하고 기니피그에서 시험했다(도 3). 대조군 면역원으로서, Aβ(1-18)-KLH (서열번호 37)이 이 분석에 포함되었다.

기니피그는 실시예 3.B에서 기술한 바와 같이 알룸 및 50㎍의 ISCOMATRIX^R(CSL, LTd., Parkville, 호주) 중에 제형화된 접합된 면역원으로 면역화하였다. 비면역원성 Aβ₄₂ 단편으로부터 면역원성 Aβ₄₂ 단편을 구분하기 위해, 기니피그는 4주의 간격으로 3회 면역화하였다. 각 면역화 3주 후, 혈액 샘플을 수집하였고 Aβ₄₀ 펩티드에 대한 항체 역가를 ELISA에 의해 검사하였다. 이들 역가는 각각 제 1 투여 후(PD1), 제 2 투여 후(PD2), 제 3 투여 후(PD3)로 도 3에 도시하였다.

제 1 주사 후 (PD1), 몇몇 펩티드 영역이 18-량체 대조군과 같이 명백한 항체 역가를 유발했다. 특히, Aβ아미노산 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 및 33-40 에 상응하는 Aβ접합체는 모두 1:800을 초과하는 항체 역가를 나타냈다. 제 2 주사 후 (PD2), 15개의 Aβ접합체가 1:1000을 초과하는 항체 역가를 유발했다. 제 3 투여 후 (PD3)에서의 분석으로 Aβ의 특정 영역이 다른 것들에 비해 더 면역원성이라는 것을 추가로 확인했다. 11개의 영역이 1:6000을 초과하는 역가임이 증명되었다. 이들은 Aβ아미노산 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 및 29-36에 해당하는 영역을 포함한다. 이들 영역 중, 5개 영역은 고도로 면역원성 (1:10000 초과)이고 다음 영역을 포함한다: 영역 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 및 29-36. 이 데이터는, Aβ의 특정한 8-아미노산 영역이 고도로 면역원성이지만, 다른 영역 (예, 5-12, 25-32, 31-38 및 35-42)은 비면역원성이라는 것(역가 1:300 미만)을 제시했다. 당해 결과는 또한 Aβ 접합체가 Aβ₄₀ 펩티드-특이적 항체 반응을 유도할 수 있지만, 모든 Aβ단편이 동등하게 면역원성은 아니라는 것을 증명했다.

Aβ펩티드-KLH 접합체의 면역반응성

Aβ펩티드-KLH 접합체를 이용한 면역화한 후에 기니피그로부터 생성된 면역 혈청이 사람의 AD와 관계가 있다는 것을 증명하기 위해, Aβ(3-10)-KLH (서열번호 40) 접합체로 면역화한 기니피그로부터 폴리클로날 혈청의 면역반응성을 평가하는 연구를 수행하였다. 기니피그로부터 Aβ(3-10)-KLH (서열번호 40) 접합체의 제 2 주사 후 4주째에 수집된 혈청 샘플을 면역 조직 화학에 의한 사람의 AD 뇌조직과의 반응성에 대해 시험하였다 (실시예 4).

도 4에서 도시한 바와 같이, Aβ(3-10)-KLH (서열번호 40) 접합체에 의해 생성된 면역원성 반응은 사람 AD 뇌조직에 대한 항체 반응을 생성했다. 도 4A는 모노클로날 항-Aβ 항체 6F3D (Vector Laboratories)의 면역반응성을 증명하였다. 도시한 바와 같이, 이 뇌는 전형적인 사람 AD에서 예측되는 방식으로 광대한 Aβ 침적물을 갖는다. 도 4B는 면역화 전 기니피그로부터의 혈청의 면역반응성의 결여를 증명한다. 도 4C는 Aβ(3-10)-KLH (서열번호 40) 접합체의 2회 주사 후 이 동일한 기니피그로부터의 혈청의 면역반응성이 양성임을 보여준다. 종합적으로, 이 데이터는 ELISA에 의해 밝혀진 면역원성이 당해 AD 조직에서 발견된 사람의 Aβ에 대해 상당한 항체 반응을 포함한다는 것을 증명한다. 이들 결과는 Aβ의 특정 단편에 의해 부여된 상이한 면역원성의 예기치 못한 발견을 확인시켜주고, 추가로 이 반응이 치료학적 적용과 일치하는 방식으로 나타난다는 것을 증명했다.

OMPC 접합체 및 다중 항원성 접합체의 생성

기니피그에서의 면역원성, Aβ₄₂아미노산 서열 내의 펩티드 단편의 상대적 위치, Aβ단편의 가용성 및 담체 단백질로서 OMPC의 이용 가능성에 근거하여, 출원인은 OMPC 접합을 위한 7개의 8-량체 (도 2B)를 선택했다. 이들 펩티드 단편은 다음의 Aβ의 아미노산 지역에 상응한다: 1-8, 2-9, 3-10, 7-14, 17-24, 21-28 및 33-40.

본원에서 기술한 발명은 도 5, 6A 및 6B에서 도시한 것들과 같은 다가의 펩티드 접합체를 포함한다. 다가의 분지된 MAP-OMPC 접합체(도 6A 및 6B)는 리신-기반 스캐폴드를 이용함으로써 생성되는 반면, 다가의 선형의 8-량체-OMPC 접합체 (도 5)는 PEG 링커를 이용하여 제조된다. 당업자는 여기서 또한 이용될 수 있는 통상의 아미노산 링커와 비교했을 때, PEG 링커가 낮은 면역원성 및 높은 펩티드 가용성의 이점을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 면역원성 단편은 OMPC에 접합된 다가의 MAP이다. 당업자는 그러한 접합이 펩티드와 담체의 비율이 1:1이 아니라는 것을 이해해야만 한다. 오히려, 다수의 펩티드는 각 OMPC 분자에 구형 방식으로 부착된다. 당업자는 다가의 선형 작제물 및 MAP의 사용이 가용성, 제형의 안정성, 면역원성 및 폴리클로날 반응의 다양성을 증진시킨다는 것을 추가로 이해한다.

OMPC 접합체 백신의 면역원성

Aβ펩티드-OMPC 접합체의 면역성을 평가하고 추가로 이 백신 작제물과 함께 아쥬반트의 이점을 평가하기 위한 시도에서, 출원인은 붉은 털 원숭이의 연구를 시작했다. 붉은 털 월숭이는 머크 알룸 아쥬반트 (MAA) 또는 MAA 및 ISCOMATRIX^R(CSL, Ltd., Parkville, 호주) 중에서 제형화된 Aβ(1-18)-OMPC 접합체 (Aβ펩티드 함량에 기반한 용량)로 백신 접종되었다. 혈액 샘플을 수집하였고 Aβ₄₀에 대한 항체 역가를 결정하는데 이용되었다. 이 진행중인 연구의 잠정 분석에서 제 1 투여 후 (PD1)에 알룸 중의 5㎍의 백신을 투여받은 원숭이가 검출 가능한 역가를 생성하는 데 실패했지만, 알룸 중의 30㎍의 백신을 투여받은 원숭이는 낮은 Aβ₄₀특이적 역가를 생성하는 것으로 입증되었다. 알룸 및 ISCROMATRIX^R 제형을 투여받은 모든 원숭이는 상당한 항체 역가를 생성하였다. 제 2 투여 후 (PD2)에서는, 단독 알룸 중의 Aβ접합체의 두 용량이 유사한 역가 수준을 생성하였으나, 알룸 및 ISCOMATRIX^R를 투여받은 집단은 알룸 단독 집단에 비해 10 배 높은 역가를 생성하였다. 이 연구의 결과는 Aβ-OMPC 접합체가 비사람 영장류에서 면역원성이라는 것을 확인시켜 주었다. 데이터는 그러한 접합체 백신의 효능이 ISCOMATRIX^R과 같은 사포닌-기반의 아쥬반트에 의해 상당히 증진된다는 것을 추가로 증명하였다.

실시예 1

Aβ접합체의 제조

당해 실시예는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도하기 위한 Aβ접합체로 연이어 이용될 Aβ펩티드 단편의 제조를 기술한다.

A. Aβ(8-량체) 펩티드 (서열번호 37-65; 도 2A)의 제조

말레이미드 (maleimide) 유도체화된 담체 단백질에 접합될 펩티드를 카복시 말단에서 시스테인 잔기를 갖도록 합성했다. 스페이서(spacer)인 Aha(6-아미노헥산산)를 접합 동안 담체 단백질로의 공간적 접근성을 최소화하기 위한 구조적 요소로서 주요 펩티드 서열과 카복시 말단의 시스테인 사이에 도입했다. 추가로, EEE, KKK 또는 PEG로 나타내는 가용화 잔기를 서열 내 14번, 15번, 16번, 17번, 18번, 19번, 20번, 23번, 24번, 25번, 26번, 27번, 28번, 29번의 C-말단에 도입했다. PEG 단위를 O-(N-Fmoc-2-아미노에틸)-O'-(2-카복시에틸)-운데카에틸렌글리콜 [Fmoc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₁₀CH₂CH₂O CH₂CH₂CO₂H]로서 도입했다.

Rink 아미드 MBHA 수지를 시작으로, Aβ펩티드를 제조 업자 (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 제공되는 Fmoc 화학 프로토콜을 이용한 자동화 펩티드 합성기 상에서 고체상 합성에 의해 제조했다. 어셈블리 후에 수지와 결합한 펩티드를 탈보호하였고, 94.5% 트리플루오로아세트산, 2.5% 1,2-에탄디티올, 1% 트리이소프로필실란 및 2.5%의 H₂O의 혼합액을 이용하여 수지로부터 절단하였다. 2 시간의 처리 후에 반응물을 여과하여 농축하고, 생성된 오일을 에틸 에테르를 이용하여 분말로 만들었다. 고체 생성물을 여과하고, 50% 아세트산/H₂O 중에 용해시켰고, 동결건조하였다. 반순수 생성물의 정제는 C-18 지지체 상에서 0.1% TFA/H₂O/아세토니트릴 농도 구배를 이용하는 RPHPLC에 의해 이루어졌다. 분획을 분석 HPLC에 의해 평가했다. 순수 분획(98% 초과)은 모아서 동결건조하였다. 아미노산 분석 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 실체를 확인하였다.

B. Aβ펩티드-KLH 접합체 (서열번호 37-65; 도2A)의 제조

KLH 접합체를 제조하기 위해, C-말단의 시스테인을 함유한 Aβ펩티드 (8-량체), 2mg을 1mL의 시판용 말레이미드 접합 완충액 (83mM 인산 나트륨, 0.1M EDTA, 0.9M NaCl, 0.02% 아지드 나트륨, pH 7,2 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 중에 현탁시켰다. 시판용 말레이미드-활성화된 KLH (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)의 샘플 2mg을 펩티드에 첨가하고 25℃에서 4시간 동안 반응하도록 했다. 접합체를 100,000Da 투석 튜빙을 이용하는 PBS 완충액에 대한 완전 투석 (exhaustive dialysis)에 의해 반응하지 않은 펩티드 및 시약으로부터 분리했다. 접합체로 도입된 펩티드의 양을 70시간의 산성 가수분해 후에 아미노산 분석에 의해 평가했다. 펩티드 농도는 0.24 내지 0.03mg/mL 인 것으로 측정되었다.

C. 브로모아세틸화된 Aβ펩티드 (서열번호 67-77; 도 2B)의 합성

브로모아세틸화된 펩티드를 Applied Biosystems 모델 430A 자동화 합성기 상에서 아미노산의 도입을 위한 이중 결합 프로토콜을 이용하여, 표준 t-BOC 고체상 합성에 의해 제조했다. ρ-메틸벤즈하이드릴아민 수지로 시작하여, 카복시 말단 아미노산 t-Boc-Lys (Fmoc)-OH를 도입했고 순서대로 아미노산을 연속적으로 도입했다. Aha를 스페이서로서 이들 모든 서열에 도입했고 수용성을 제공하기 위해 PEG 단위를 서열번호 35 및 37 내에 도입했다. PEG 단위를 O-(N-Boc-2-아미노에틸)-O'-(N-디글리콜릴-2-아미노에틸) 헥사에틸렌글리콜 [Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₆CH₂ CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H]로서 도입했다. 아미노 말단을 아세트산 결합으로 캡핑했다. 주요 서열의 어셈블리 이후에 카복시 말단 리신의 엡실론 아미노 그룹상의 Fmoc 보호 그룹을 피페리딘 처리에 의해 제거했다. 연속하여, N^ε 아미노 그룹을 용매로서 메틸렌 클로라이드 중의 무수 브로모아세트산과 30분 동안 반응시켰다. 수지 지지체로부터의 펩티드의 탈보호 및 제거는 스캐빈저 (scavenger)로서 액체 불화수소산 및 10% 아니솔을 처리함으로써 수행했다. 펩티드를 0.1% TFA/아세토니트릴 농도 구배를 이용하는 역상 C-18 실리카 컬럼상에서 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. 펩티드의 실체 및 균일성을 분석 HPLC 및 중량 스펙트럼 분석을 통해 확인하였다.

D. 브로모아세틸화된 2가의 MAP (작제물 번호 8, 도 6A)의 합성

브로모아세틸화된 분지된 다중 항원성 펩티드 (MAP)의 합성은 실시예 1.C.에서 기술한 것과 유사하다. 카복시 말단 Fmoc-Lys(ivDde)-OH[ivDde=1,(4,4-디메틸-2,6-디옥소-사이클로헥실리덴)-3-메틸-부틸]를 MBHA 수지에 결합시킨 후에, α-아미노 Fmoc 보호기를 피페리딘을 이용하여 제거하였고, 합성을 t-Boc-Lys(Fmoc)-OH의 도입으로 계속하였다. t-Boc 그룹의 탈보호 후에, 서열을 다음의 t-Boc 보호된 아미노산으로 연장하였다: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E 및 ABI 합성기 상에서 아세트산 결합에 의해 캡핑된 아미노 말단. 측쇄 리신 Fmoc 보호 그룹을 피페리딘으로 제거하고 리신의 N^ε암(arm)을 ABI 합성기 상에서 다음의 보호된 아미노산의 도입으로 연장하였다: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D 및 아세트산 결합에 의해 캡핑된 아미노 말단. ivDde 보호 그룹을 디메틸포름아미드 중의 5% 하이드라진을 5분 동안 처리함으로써 제거하여 카복시 말단 리신 상의 차단되지 않은 N^ε아미노 그룹을 수득하고, 추가로 실시예 1.C.에서 기술한 바와 같이 무수 브로모아세트산으로 마무리하였다. 수지로부터의 펩티드의 절단, 이의 연이은 정제 및 특성 규명은 실시예 1.C.에서 기술한 바와 같다.

E. 브로모아세틸화 된 MAP (작제물 번호 11 및 12, 도 6A)의 합성

MAP 작제물 번호 11 및 12를 실시예 1.D.에서 기술한 바와 같이 제조하였다.

F. 시스테인 다가의 MAP (작제물 번호 9, 도 6A)의 합성

MBHA 수지를 시작으로, 다음의 t-Boc 보호된 아미노산 (Lys(Fmoc), Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E) 을 ABI 자동화 합성기 C 상에서 어셈블리 후 아세트산과 결합시켰다. 리신의 N^ε아미노 Fmoc 보호 그룹/을 제거하고, 다음의 t-Boc 보호된 아미노산을 계속 도입하여 합성했다: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D. 이어서, 아세트산을 결합시켰다. 수지가 결합된 펩티드를 분리하여, 정제하였고, 실시예 1.C.에서와 같이 특성을 규명했다. 주의: HF 절단 동안에 실시예 1.C에서의 10% 아니솔을 대신해 스캐빈저로서 ρ-크레졸: ρ-티오크레졸의 1:1 혼합물을 이용하였다.

G. 시스테인 2가의 MAP (작제물 번호 10, 13 및 14, 도 6A)의 합성.

2가의 MAP (작제물 번호 10, 13 및 14, 도 6A)를 실시예 6.F에서 기술한 바와 같이 제조하였다. PEG 단위를 O-(N-Boc-2-아미노에틸)-O'-(N-디글리콜릴-2-아미노에틸)-헥사에틸렌글리콜 (t-Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₆CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H)로서 도입하였다.

H. 브로모아세틸화된 다가의 MAP (작제물 번호 16, 도 6B)의 합성

ABI 자동화 합성기를 이용하여 Fmoc-Lys(t-Boc)-OH를 MBHA 수지와 결합시켰 다. 리신의 N^ε아미노 그룹상의 t-Boc 보호 그룹을 제거한 후에, 서열을 다음의 t-Boc 보호된 아미노산의 도입으로 연장시켰다: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E. 이후 아세트산과 결합시켰다. 리신 상의 NαFmoc 보호 그룹을 피페리딘의 수동 처리에 의해 제거했다. 서열을 ABI 합성기 상에서 Fmoc-Lys (t-Boc)-OH에 도입으로 추가 마무리한 후 다음의 t-Boc 보호된 아미노산을 도입하였다: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D 및 아세트산 결합. 리신의 Fmoc N^α 아미노 보호 그룹을 상기한 바와 같이 제거하고 Fmoc-Lys(t-Boc)-OH에 이어서 다음의 t-Boc 보호된 아미노산을 연속으로 도입하여 합성했다: Aha, K, N, S, G, V, D, E, A 및 아세트산 결합. 리신 상의 N^αFmoc 보호를 제거하고 Fmoc-Lys(t-Boc)-OH에 이어서 다음의 t-Boc 보호된 아미노산을 연속으로 도입하여 합성했다: Aha, V, V, G, G, V, M, L, G 및 아세트산 결합. 리신의 NαFmoc 보호 그룹의 제거 후에, 수지에 결합한 펩티드를 실시예 1.C.와 같이 무수 브로모아세트산과 반응시켰다. 최종 생성물의 분리 및 특성 규명은 실시예 1.C.과 같다.

I. 다가의 MAP (작제물 번호 15 및 17, 도 6B)의 합성.

MAP Aβ접합체의 합성 (작제물 번호 15 및 17, 도 6B)은 실시예 1.F. 및 1.H.에서 기술한 바와 같다.

J. 브로모아세틸화된 다가의 선형 펩티드 (작제물 번호 1, 도 5)의 합성.

MBHA 수지를 시작으로, 주요 서열을 ABI 자동화 합성기 상에서 실시예 6.A.에서 기술한 바와 같이 t-Boc 화학을 이용하여 합성했다. 공간 사이의 PEG 단위를 BOP 시약을 결합 시약으로서 이용하여 Fmoc-1-아미노-4, 7, 10-트리옥사 13-트리데칸아민 숙신산 [Fmoc-NHCH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CO₂H]으로서 수동으로 도입했다. 피페리딘을 Fmoc 그룹의 탈보호를 위해 사용했다. 아미노 말단의 브로모아세틸화는 실시예 1.C.에서 기술한 바와 같다. 원하는 생성물의 분리 및 특성 규명은 실시예 1.C.와 같다.

K. 다가의 선형 Aβ펩티드 (작제물 번호 2, 5, 6, 및 7, 도5)의 합성

다가의 선형 Aβ펩티드 (작제물 번호 2, 5, 6, 및 7)의 합성은 실시예 1.J.에서 기술한 바와 같다.

실시예 2.

OMPC와 Aβ펩티드의 화학적 접합

이 실시예는 네이세리아 메닌기티디스 B 형의 정제된 외막 단백질 복합체 (OMPC)와 사람의 Aβ₄₂로부터 유래한 펩티드의 화학적 접합을 제공한다. 결합의 화학적 특성은 막 복합체의 할로아세틸-유도체화된 펩티드와 티올-유도체화된 단백질 사이의 반응이다. 아밀로이드 펩티드는 상기한 바와 같이 2가의 선형 에피토프 펩티드에 대해 N-말단 또는 C-말단 상에서 브로모아세틸 작용기 또는 1가의 선형이며 분지된 MAP 형태에 대해 리신 잔기의 엡실론 아미노 그룹을 통해 부착된 브로모아세틸 작용기를 사용하여 합성하였다. BrAc 그룹을 6-아미노헥산산 (Aha)로 이루어진 스페이서에 의해 성숙한 단백질로부터 분리하였다. 상기한 서열을 참조한다. 접합을 대표적인 펩티드 Aβ(3-10)에 대해 기술할 것이다. OMPC-함유 용액의 모든 조작은 표준 멸균 기술에 따르는 층류 환경에서 수행했다.

A. OMPC의 티올화

PedvaxHIB^R 및 폐렴구균 접합 백신의 제조를 위해 이용된 문헌 [Fu, 미국 특허 제5,494,808호]에서 기술한 바와 같은 공정으로부터 수득 가능한 정제된, 멸균 OMPC를 N-아세틸호모시스테인티올락톤(NAHT, Aldrich, St. Louis, MO) 시약을 이용하여 표면-접근 가능한 리신 잔기의 부분상에서 티올화했다. 물 중의 OMPC 117mg을 289,000 x g에서 60분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화하고 상청액을 버렸다. N2-살포 활성화 완충액 (0.11M 붕산화 나트륨, pH 11)을 원심분리 튜브에 첨가하고, 펫렛을 유리 교반 막대로 제거했다. 현탁액을 유리 Dounce 균질화기로 옮기고 30 스트로크로 재현탁시켰다. 원심분리 튜브를 세척하고 30 스트로크로 세척 다운스했다. 재현탁된 펠렛 및 세척을 세척 관에서 조합하여 10mg/mL 농도의 OMPC를 수득하였다. 고체 DTT 및 EDTA를 N2-살포 활성화 완충액 중에 용해시키고, 0.106mg DTT/mg OMPC 및 0.57mg EDTA/mg OMPC의 비율로 반응 용기에 충전시켰다. 가볍게 혼합한 후, NAHT를 N2-살포 물 중에 용해시키고 0.89mg NAHT/mg OMPC의 비율로 반응 용기에 충전시켰다. 반응을 주위온도에서 3시간 동안 N2 후드에서 빛을 차단하며 진행시켰다. 완료 후, OMPC를 상기한 바와 같이 펠렛화하고, 펠렛을 세척하기 위해, N2-살포 접합 완충액 (25mM 붕산 나트륨, pH 8.5, 0.15M NaCl) 중에서 Dounce 균질화에 의해 6mg/mL로 재현탁했다. 마지막 재현탁을 위해, OMPC를 상기한 바와 같이 펠렛화하고, N2-살포 접합 완충액에서 Dounce 균질화에 의해 10mg/mL로 재현탁했다. 분취량을 Ellman 분석에 의한 유리 티올 측정을 위해 제거하였고, 대량의 생성물을 어두운 곳의 빙상에서 이용할 때까지 보관했다. 측정된 티올 함량은 0.2 내지 0.3μmol/mL였다.

B. OMPC와 Aβ펩티드의 접합

펩티드의 기능적 BrAc 함량을 몰을 기준으로 하여 1:1로 예상했다. 충분한 펩티드를 정량하여 전체 티올에 대해 1.6 몰을 초과하는 BrAc를 수득했다. 각 접합을 위한 표적 전체 OMPC 단백질은 15mg이었다. 펩티드를 N2-살포 접합 완충액 중에 2.6mg/mL로 재현탁하고, 티올화한 OMPC 용액을 천천히 첨가했다. 반응물을 빛과 차단하고 약 22시간 동안 실온에서 항온처리했다. 잔여 유리 OMPC 티올 그룹을 실온에서 18시간 동안 5배 몰과량의 N-에틸말레이미드로 켄칭시켰다. 티올화한 OMPC-단독 대조군에 대해서 접합 프로토콜 전반에서 병행하여 수행했다. 켄칭이 완료되면, 접합체 및 대조군을 100,000Da 분자량 컷-오프 투석 유니트에 옮기고, 접합 완충액을 5회 이상 교환하면서 완전히 투석시켰다. 투석이 완료되면, 샘플을 15mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 옮기고 2,280 x g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리 하여 응집된 물질을 제거한다. 분취량을 분석을 위해 제거하고 대용량은 4℃ 에서 보관한다.

C. Aβ펩티드-OMPC 접합체의 분석

전체 단백질을 변형된 로우리 (Lowry) 분석에 의해 측정하고, 접합체 및 대조군의 샘플을 정량적인 아미노산 분석 (AAA)에 의해 분석했다. OMPC에 대한 펩티드의 몰비를 초기 결합된 펩티드-OMPC의 산 가수분해시 방출되는 특이적 잔기, S-카복시메틸호모시스테인을 정량하여 측정했다. OMPC-특이적 농도를 펩티드 서열에는 없으므로 OMPC 단백질에 독특한 가수분해-안정 (hydrolysis-stable) 잔기로부터 측정했다. SCMHC 몰 당 1몰의 펩티드로 가정하면, SCMHC/OMPC의 비율은 펩티드/OMPC 함량에 상응한다. 펩티드의 질량 부하는 이 비율로부터 펩티드 분자량 및 40,000,000Da의 평균 OMPC 중량을 이용하여 계산될 수 있다.

접합의 공유 특성을 4-20% 트리스-글리신 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 SDS-PAGE 분석에 의해 정성적으로 확인하였고, 대조군에 비해 쿠마시-염색된 접합체의 밴드에서 이동성의 상향 변화를 관찰했다.

모든 접합된 BrAc 펩티드에 대한 계산된 몰의 부하 비율 (몰 펩티드/몰 OMPC)은 다음과 같다:

실시예 3

Aβ접합체의 면역원성

이 실시예는 Aβ에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있는 Aβ접합체의 제형 및 투여를 기술한다.

A. 백신 접합체의 제형화

Aβ펩티드-KLH 접합체 백신을 ISCOMATRIX^R (CSL, Ltd., Parkville, 호주) 중에서 제형화했다. 모든 Aβ펩티드-OMPC 접합체 백신을 사포닌-기반의 아쥬반트, ISCOMATRIX^R (CSL, Ltd., Parkville, 호주)과 같은 제 2 아쥬반트의 존재 또는 부재하에 알룸 중에 제형화했다. 모든 샘플 변형을 멸균 상태에서 수행했다.

알룸 제형에 대해, 접합체는 지정된 펩티드 농도에서 염수로 1배 희석하였고, 멸균 염수 (150mM 멸균 염화 나트륨 용액) 중에서 제조된 머크 알룸 900㎍/mL에 상응하는, 2배의 알룸 (머크, 제조 번호. 39943)과 혼합하였다. 그러므로, 백 신 중의 표적 농도는 450㎍/mL 머크 알룸 또는 1배 머크 알룸이다. 동물 연구를 위한 표적 펩티드 (항원) 농도는 다음과 같다: 마우스에 대해-12.1㎍/mL(용량 0.1mL); 원숭이에 대해-10㎍/mL 또는 60㎍/mL(용량 0.5mL) 및 기니피그에 대해-12.5㎍/mL(용량 0.4mL). 혼합물을 두 시간 동안 실온에서 항온처리했다. 주사 용량을 수득하기 위해, 알룸-흡수된 접합체를 표적 펩티드 농도에 도달하도록 알룸과 1배 희석하였다. 제 2 아쥬반트, 예를 들어 ISCOMATRIX^R가 필요한 경우 표적 농도는 쥐 연구의 경우 10㎍/mL, 원숭이 연구의 경우 0, 100 또는 200㎍/mL이고 기니피그의 경우 125㎍/mL이다.

1.ISCOMATRIX^R의 제조

카세트 막 (Slide-A-Lyzer^R 투석 카세트, 10K MWCO, Pierce, Rockford, IL)을 이용하여, ISCOMATRIX^R을 2-8℃에서 멸균 염수액으로 투석하였다. 멸균 염수액을 투석하는 동안 2-3회 교환했다. 투석이 완료된 후, ISCOMATRIX^R을 주사 여과기(0.22μM Millex-GV 주사 여과기, Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 여과 멸균했다. 멸균, 투석된 ISCOMATRIX^R의 농도를 RP-HPLC에 의해 결정했다. ISCOMATRIX^R을 2-8℃에서 이용할 때까지 멸균 저장했다.

2. Aβ펩티드-OMPC 접합체 및 머크 알룸 제조

Aβ펩티드-OMPC 접합체 스톡을 1X 멸균 염수액으로 희석하였다. 그 후 희석된 AD 펩티드-OMPC 접합체 스톡을 1X 멸균 염수액 중의 2X 머크 알룸에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 회전 휠상에서 혼합했다. 혼합물을 실온의 벤치 위에서 15분간 정치한 후, 1500rmp에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 조심스럽게 버리고(상청액의 UV 분석을 수행하여 알룸과 결합한 Aβ펩티드-OMPC 접합체의 %를 결정했다) 펠렛을 멸균 1X 염수 중에 재현탁했다. 혼합물을 멸균 3mL의 튜빙 유리 바이알에 분취한 후 ISCOMATRIX^R과의 최종 제형화 때까지 2-8℃에서 보관했다.

3. Aβ펩티드-OMPC/알룸 및 ISCOMATRIX^R 백신의 제형화

ISCOMATRIX^R 과의 최종 제형화 전에, 염수 중의 Aβ펩티드-OMPC/알룸의 입자 크기를 정적 광산란법에 의해 결정하여 결합을 확인하고 입자의 안정성을 모니터했다. 1X 염수 중의 멸균, 희석한 ISCOMATRIX^R 을 멸균 150mM NaCl 중의 Aβ펩티드-OMPC/알룸에 와동시키면서 첨가했다. 바이알의 마개를 막고, 캡핑하고 당겨서 완전히 밀봉했다. 백신을 2-8℃에서 주사 전에 저장했다. 주사 전에, 각 백신을 3-5분 동안 와동시켰다.

B. 기니피그에서의 접합체 백신의 면역원성.

6 내지 10주령의 암컷 기니피그를 Harlan Inc. (인디아나폴리스, IA 소재)로 부터 수득하고 기관의 가이드라인에 따라 머크 연구 실험실의 동물 시설에서 유지하였다. 모든 동물 실험을 머크 연구 실험 기관의 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)에서 승인했다. 항원은 인산염-완충 염수 중에서 제조되었고 지정된 아쥬반트 중에서 제형화되었다.

그룹 당 두 마리의 동물을 도 2A에서 도시한 Aβ펩티드-KLH 접합체를 이용하여 40㎍의 ISCOMATRIX^R 의 존재하에서 400㎕의 접합체 백신 (8㎍의 펩티드 함량 또는 50㎍의 전체 접합체)과 함께 근육 내로 면역화했다. 면역화를 4주 간격으로 3회 수행했다. 혈청 샘플을 제 1 면역화 전 (채혈 전) 및 각 면역화 후 3째주에 수집하여 항체 역가 결정 전에 4℃에서 저장하였다. 항체 역가를 표적 항원으로서 Aβ₄₀을 이용하는 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 결정하였다.

ELISA 기반한 분석은 다음과 같다: 4℃에서 96-웰(well) 플레이트를 50mM 중탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 4㎍/mL의 농도의 Aβ를 웰 당 50㎕로 밤새 피복했다. 플레이트를 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척하고 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS (milk-PBST) 중의 3% 탈지유로 차단했다. 시험 샘플을 PBST 중에 4-배 연속으로 희석하였다. 100㎕의 희석된 샘플을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 24℃에서 2시간 동안 항온처리한 후 PBST로 6회 세척했다. milk-PBST 중에 1:5000으로 희석한 50㎕의 HRP-접합된 제 2 항체를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 1시간 동안 24℃에서 항온처리했다. 플레이트를 3회 세척하고, 100mM 나트륨 시트레이트 (pH 4.5) 중의 1mg/mL의 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 100㎕를 각 웰에 첨가했다. 24℃ 에서 30분 항온처리 후, 반응을 100㎕의 1N H₂SO₄를 각 웰에 첨가함으로써 정지시키고, 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서 판독했다. 항체 역가를 접합체 대조군 웰의 표준 표차가 2 이상 차이가 나는 주어진 OD490nm 값의 평균 중 가장 높은 희석값의 역수로 정의한다.

도 3에서 도시한 이 분석의 결과는 처음 주사 후 (PD1)에 몇몇 펩티드 영역이 18-량체 대조군이 그러하듯 상당한 항체 역가를 유도하는 것을 증명했다. 특히, Aβ아미노산 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 및 33-40에 상응하는 모든 Aβ펩티드 단편이 1:800을 초과하는 역가를 생성했다. 제 2 주사 후 (PD2), 15개의 8-량체 접합체가 1:1000을 초과하는 항체 역가를 유도했다. 제 3 투여(PD3) 후에서의 분석은 Aβ펩티드의 특정 영역이 다른 것에 비해 더 면역원성이라는 것을 추가로 확인했다. 11개의 영역이 1:6000을 초과하는 역가를 증명했다. 이들은 Aβ아미노산 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 및 29-36에 상응하는 영역을 포함한다. 이들 영역 중, 5개의 영역 (1-8, 15-22, 21-28, 23-30 및 29-36을 포함하는 영역)이 고도로 면역원성(1:10000 초과)이다. 당해 결과는 8-량체 접합체가 Aβ₄₀특이적 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 증명했다. 예상 밖으로, 이전의 교시와는 반대로, Aβ의 모든 단편이 동일하게 면역원성은 아니었다. 사실, 이들 데이터는 특정 8-량체는 고도로 면역원성이지만 Aβ의 다른 영역 (예, 5-12, 25-32, 31-38 및 35-42)은 면역원성이 아니라는 것(1:300 미만)을 제안한다.

C. 붉은 털 원숭이에서 접합체 백신의 면역원성

연구를 기니피그에서 수행한 것에 필적할 수 있는 사람이 아닌 영장류 (예, 붉은털 원숭이)에서 수행하여 Aβ펩티드-OMPC 접합체 및 알룸 및 ISCOMATRIX^R 아쥬반트가 면역 반응을 제공하는지의 여부를 결정했다. 붉은 털 원숭이 ( Mocaca mulatta)를 머크 연구 실험 및 신규한 이베리아 연구 센터 (루이지애나 대학 at Lafayette, New Iberia, LA)의 기관의 동물 관리 프로토콜에 따라 유지하였다.

출원인은 OMPC에 접합된 Aβ펩티드를 도 2B에서 도시한 8-량체: Aβ(1-8) (서열번호 67), Aβ(3-10) (서열번호 69), Aβ(7-14) (서열번호 70), Aβ(17-24) (서열번호 72), Aβ(21-28) (서열번호 73), Aβ(33-40) (서열번호 74); 도 5에서 도시한 2가의 선형 펩티드: Aβ(3-10)(7-14)(작제물 번호 1), Aβ(3-10)(21-28) (작제물 번호 2), Aβ(1-8)(21-28)(작제물 번호 5): 및 도 6A에서 도시한 다가의 분지된 MAP: Aβ(3-10)(7-14)(작제물 번호 8), Aβ(1-8)(21-28) (작제물 번호 11), Aβ(3-10)(21-28) (작제물 번호 12)를 포함하는 모델 항원으로 이용했다.

붉은 털 원숭이 (N=3)를 머크 알룸 아쥬반트 (MAA) 및 100㎍의 ISCOMATRIX^R중에 제형화된 각 백신 5㎍으로 4주 마다 면역화했다. 혈청 샘플을 각 주사 4주 후에 수집했고 ELISA에 의해 Aβ특이적 항체 반응을 결정했다. 기니피그 연구로부터의 결과와 일치하게, 모든 접합체가 원숭이에서 면역원성임을 밝혔다. Aβ특이적 항체 역가가 1회 주사 후에 검출가능했고, 후속 주사에 의해 추가로 부스트되었다. 통상적으로 검사된 접합체의 경우, 최고 역가는 제 2 또는 제 3 면역화 후에 도달했고 기하 평균 역가는 25,000 내지 500,000의 범위였다. 이들 결과는 본원에서 기술한 Aβ접합체가 Aβ특이적 항체 반응을 유도할 수 있다는 발견을 확인했다.

D. 붉은 털 원숭이에서 접합체 백신의 면역원성에 대한 아쥬반트의 효과

추가적인 연구가 사람이 아닌 영장류 (예, 붉은 털 원숭이)에서 수행되어 Aβ펩티드-OMPC 접합체 및 ISCOMATRIX^R와 같은 사포닌-기반의 아쥬반트가 개선된 면역 반응을 제공할 수 있는지의 여부를 결정했다. 출원인은 OMPC에 접합된 Aβ(1-18) 펩티드를 모델 항원으로서 사용했다. 붉은 털 원숭이를 머크 연구 실험 및 신규한 이베리아 연구 센터 (루이지애나 대학 at Lafayette, New Iberia, LA)의 기관의 동물 관리 프로토콜에 따라 유지하였다.

그룹 당 3 마리인 5개 그룹의 원숭이에게 다음의 Aβ(1-18)-OMPC 접합체를 투여하였다: (1) 알룸 중의 5㎍ 접합체 (펩티드 함량에 근거함), (2) 알룸 중의 5㎍의 접합체 + 100㎍ ISCOMTRIX^R, (3) 알룸 중의 5㎍ 의 접합체 + 50mg ISCOMTRIX^R, (4) 알룸 중의 30㎍의 접합체, (2) 알룸 중의 30㎍의 접합체 + 100㎍ ISCOMATRIX^R. 면역화를 0, 8 및 24주에서 투베르쿨린 주사기(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 0.5mL 분취량을 근육 내 주사에 의해 수행했다. 혈장 샘플을 0주(채혈전)부터 시작하여 4주 간격으로 수집하고 앞선 실시예에서 기술한 바와 같이 수행한 ELISA에 의한 Aβ₄₀에 대한 항체 역가에 대해 시험했다.

현재 진행중인 연구의 잠정 분석에서 PD1에서 알룸 중의 5mcg 접합체 백신을 투여받은 원숭이가 어떠한 검출 가능한 역가를 생성시키는 것은 실패했지만, 알룸 중의 30㎍의 접합체 백신을 투여받은 원숭이는 낮은 Aβ₄₀특이적 역가를 생성함을 증명했다. 알룸 과 ISCOMTRIX^R 제형을 투여받은 모든 원숭이가 상당한 항체 역가를 생성했다. PD2에서, 알룸 단독 중의 면역원의 두 용량이 유사한 역가 수준을 생성하였고, 알룸 과 ISCOMTRIX^R을 투여받은 그룹은 알룸 단독의 상태에 비해 10-배 높은 항체 역가를 생성하였다. 이 연구의 결과는 이 Aβ펩티드-OMPC 접합체가 사람이 아닌 영장류에서 면역원성이라는 것을 확인시켜 주었다. 당해 데이터는 이러한 접합체 백신의 효능이 ISCOMATRIX^R과 같은 사포닌-기반의 아쥬반트에 의해 상당히 증진된다는 것을 추가로 증명했다.

실시예 4

기니피그의 폴리클로날 혈청의 면역반응성

8-량체 KLH 접합체로 면역화한 후 상기 기니피그(실시예 3.B)로부터 생성된 면역 혈청이 사람의 AD와 관련이 있다는 것을 증명하기 위해, 연구를 수행하여 Aβ(3-10)-KLH 면역원으로 면역화한 기니피그로부터의 폴리클로날 혈청의 면역반응성을 평가했다. 이 작제물을 제 2 주사한 후 4주째에 다음의 방법에 따라 대표적인 기니피그로부터 혈액을 수집했다.

폴리클로날 혈청의 반응성을 사람 AD 뇌 분절(BioChain Institute, Inc., Hayward, CA)에서 평가했다. 사람의 뇌 분절을 60℃에서 30분 동안 항온처리 한 후 실온에서 자일렌으로 5분간 2회 세척하여 제조했다. 연이어 분절을 100% EtOH에서 5분동안 2회 담가놓은 후, 각 단계마다 dd H₂O에 5분 동안 담갔다. 분절을 3분 동안 99%의 포름산에 담가 놓은 후에 ddH₂O로 간단히 세척한 후 5분 동안 인산염 완충액 (PBS)에 담갔다. 그 후 분절을 퍼옥시다제 저해제로 10분간 항온처리 한 후 5분간 PBS로 세척하였다. 분절을 10% 염소 혈청에 10분간 노출에 의해 차단한 후 5분간 PBS로 세척했다. 그 후 분절을 희석한 기니피그 혈청과 4℃에서 밤새도록 또는 실온에서 한 시간 동안 항온처리했다. 5분의 PBS 세척 후, 분절을 희석한 비오티닐화된 염소 항-기니피그 IgG 또는 비오티닐화된 말 항-마우스 항체 (1 방울이 5mL PBS)와 10분 동안 항온 처리하였다. 분절을 5분 동안 PBS 중에 세척하고 연이어 ABC 용액 (Vectorstain ABC kit; Vector Laboratories, Inc.)과 30분 동안 항온처리했다. 분절을 PBS로 5분 동안 세척했다. 분절을 그 후 DAB (DakoCytomation)으로 5분 동안 염색하고 dd H₂O로 세척했다. 그 후 분절을 헤마토자일린에서 30초 동안 대비 염색하고 농도구배된 EtOH 및 자일렌 (70% EtOH에서 5분, 80% EtOH에서 5분, 100% EtOH에서 5분 및 자일렌에서 5분)에서 탈수화시켰다. 분절을 커버슬립으로 덮고 광학 현미경에 의해 평가했다.

Aβ(3-10)-KLH 접합체에 의해 생성된 면역원성 반응은 사람 AD 뇌 조직에 대한 항체 반응을 생성하였다. 도 4에서 도시한 바와 같이, 이 사람의 뇌 분절은 사 람 AD에서 통상적으로 예측되는 방식으로 Aβ의 방대한 침적물을 가진다. 비면역화된 기니피그 혈청이 이 조직에 노출되었을 때 면역반응성의 결여를 보인 반면, Aβ(3-10)=-KLH 작제물의 2회 주사 후에 이 동일한 기니피그로부터의 혈청의 양성 면역 반응성에 주목했다. 이들 데이터는 ELISA에 의해 밝혀지고 도 3에서 도시한 면역원성이 당해 AD 조직에서 발견된 사람 Aβ에 대한 상당한 항체 반응을 함유한다는 것을 증명했다. 따라서, 결과는 몇몇 Aβ단편에 의한 상이한 면역원성의 예상치못한 발견으로, 이 반응이 치료학적 응용과 일치하는 방식으로 나타난다는 것을 추가로 증명했다.

실시예 5

T-세포 에피토프가 결여된 면역원성 단편의 동정

본 발명의 용도를 위한 T-세포 에피토프가 결여된 면역원성 단편을 동정하기 위해, 다음의 효소-결합 ImmunoSpot(ELISpot; Enzyme-Linked Immunospot) 분석법이 특정 항원에 대한 T-세포 반응을 평가하기 위한 방법으로 이용될 수 있다. T-세포 에피토프를 가공하는 면역원 단편은 흰색 막의 표면에 어두운 점의 존재에 의해 동정된다; 각 점은 항원 (예, 면역원성 단편)에 대한 반응으로 인터페론 감마 (IFN-γ)를 분비하는 T-세포의 존재를 나타낸다. 백신 및 면역학 분야의 당업자는 이 분석법에 친숙하다 [문헌 Larsson et al, AIDS 3: 767-777, 1999, 및 Mwau et al, AIDS Research and Human Retroviruses 18: 611-618, 2002 참조. 최신 논평을 A.E. Kalyuzhny, Method Mol Biol . 302: 15-31, 2005]

출원인은 펩티드 Aβ1-40 (A량체ican Peptide Co., Sunnyvale, CA) (아미노산 서열 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVV) (서열번호 78) 및 Aβ1-20 (Synpep, Dublin, CA) (아미노산 서열 DAEFRHDSG YEVHHQKLVFF) (서열번호 79)에 대한 반응을 위해 붉은 털 원숭이 (New Iberia Research Center, The University of Louisiana at Lafayette, New Iberia, LA)로부터의 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 이용했다.

정제된 모노클로날 마우스 항-원숭이 IFN-γ(클론 MD-1, Cat No. CT 525, U-CyTech biosciences, Utrecht, 네덜란드)를 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 설페이트 (Gibco^R Penicillin-Streptomycin, Cat. No. 15140-122, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 함유한 인산염 완충 염수 (PBS)중에 희석한 후, 96-웰 HTS IP 멸균 플레이트 (Cat, No. MSIPS4W10, Millipore, Billerica, MA)에 가하고, 4℃에서 12시간 초과 항온 처리했다. 플레이트를 세척하고, R1O [RPMI 배지 1640 (GIBCO^R Cat. No. 11875-093), 10% 우태혈청 (HyClone SH30070.03, Logan, UT), 0.1 % 50 mM 2-머캅토에탄올 (GIBCO^R Cat. No. 21985-023), 1 % 1M HEPES 완충액 (GIBCO^R 15630-080), 1 % 20OmM L-글루타민 (GIBCO^R Cat. No. 25030-081), 1 % 10OmM MEM 나트륨 피루베이트 용액 (GIBCO^R Cat. No. 11360-070), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (GIBCO^R Cat. No. 15140-122)] 을 첨가한 후 37℃에서 2시간 이상 항온처리했다. PBMC를 원심분리하고 R10중에 재현탁했다. PBMC를 Z2 Coulter 계수기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) 상에서 계수하였다. 흡인된 플레이트의 각 웰에 0.4㎍의 Aβ1-40, Aβ1-20, PHA (피토헤마글루티닌, Cat No. L-8902, Sigma, St. Louis, MO, 양성 대조군) 또는 희석된 DMSO (Sigma, 음성 대조군)를 첨가함에 이어서 400000 PBMC를 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 18-24시간 동안 37℃의 습한 CO₂ 배양기에서 항온처리 했다. 플레이트를 5% FBS 및 0.005% Tween을 함유한 PBS로 세척하고; 비오틴-접합 항-원숭이 IFN-γ폴리클로날 항체 (U-CyTech biosciences, Utrecht, 네덜란드)를 동일한 배지에서 희석하고 각 플레이트에 첨가했다; 플레이트를 4℃에서 18-24시간 동안 항온처리했다. 스트렙타비딘-AP (Cat. No. 13043E, BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ)를 동일한 배지에서 희석하고 세척한 플레이트에 첨가하고; 플레이트를 2시간 동안 어두운 곳의 실온에서 항온처리했다. 여과한 1-단계 NBT/BCIP 기질 (Pierce, Rockford, IL, Cat. No. 34042)을 첨가하고 어두운 곳의 실온에서 10분 동안의 추가의 항온처리를 수행했다. 세척 후, CCD 카메라로 이미지화하기 전에 플레이트를 건조시켰고, 각 웰 내의 스팟을 컴퓨터로 자동으로 계수하였다.

출원인은 100만 개의 PBMC 당 스팟 형성 세포 (SFC/10⁶ PBMCs)가 55를 초과하며 음성 대조군의 4배를 넘어야 양성 결과로 정의하기로 하고 이들 두 가지 기준을 모두 충족하지 못하는 경우 음성 결과로 정의했다. 붉은 털 원숭이를 OMPC 접합된 Aβ(3-10)/(21-28) (작제물 번호 12, 도 6A)를 포함하는 MAP 작제물 또는 두 가지 단량체 작제물, OMPC 접합된 Aβ(3-10) (서열번호 69) 및 Aβ(21-28) (서열번 호 73) 둘 다로 백신 접종하였다. 각 짧은 꼬리 원숭이를 백신 접종 계획 동안에 1개월 간격으로 3개월 또는 4개월 동안 분석했다; Aβ1-40 또는 Aβ1-20에 대해 가장 높게 기록된 시그날은 55 SFC/10⁶PBMC 기준보다 훨씬 낮은 단지 18 SFC/10⁶PBMC였다. 그러므로, 모두가 음성 점수를 기록했으며, 이는 백신이 T-세포 반응을 유도하지 않으며, 그 자체가 T-세포 에피토프를 포함하지 않는다는 강력한 증거를 제공했다.

실시예 6

혈장 Aβ의 상승

붉은 털 짧은 꼬리 원숭이 비사람 영장류 (N=3)를 MAP Aβ(3-10)/(21-28) 접합체 (작제물 번호 12, 도 6A) 또는 이의 단량체 성분 접합체, 담체로서 OMPC와 결합한 5㎍의 Aβ(3-10)(서열번호 69) 및 Aβ(21-28) (서열번호 73)로 면역화하였고, MAA 및 100㎍ ISCOMATRIX^R 중에서 제형화했다. 붉은 털 원숭이는 4주마다 백신 접종을 받았고 각 주사 후 4주째에 혈액을 수집하여 분석했다. 항-Aβ₄₀ 역가 및 전체 Aβ_1-40 수준을 결정했다.

혈장 Aβ_1-40 수준을 이들 면역화한 동물들에서 6E10/G210 ELISA를 이용하여 결정했다. 이 분석은 알칼리성 포스파타제가 접합된 N-말단 포획 항체 6E10 (Aβ1-8)(Signet Laboratories, Dedham, MA) 및 C-말단 Aβ₄₀ 신생-에피토프 항체 (G210) (The Genetics Company, Inc., 취리히, 스위스)를 포함하는 샌드위치 ELISA를 사용하여 Aβ_1-40을 측정했다. 항체인 6E10을 5㎍/mL의 농도로 플레이트에 피복시켰다. 희석한 혈장 샘플 (1:3)을 3개의 50㎕/웰에 이용하였다. Aβ_1-40 표준액을 6E10 면역결여 짧은 꼬리 원숭이 혈장 매트릭스에서 400pM-3pM로부터 제조하였다. 이 분석은 약 5 내지 20의 시그날 대 노이즈 비를 가진다. CDP-star 알칼린 포스파타제 기질을 제조원 [Applied Biosystems, Foster City, CA]으로부터 수득했다. SuperBlock^R의 미리 제형화된 블로킹 완충액을 제조원 [Pierce Biotechnology, Rockford, IL (Cat#37515)]으로부터 수득했다. 3개로 전개한 각 샘플로부터의 계수를 기준에 맞는 3차 스플라인을 이용하여 실제 분석물 농도로 전환했다. QC 샘플을 플레이트 간의 시그날의 다양성을 평가하기 위해 전개했다.

도 8A에서 도시한 바와 같이, 이들 분석의 결과는 MAP Aβ(3-10)/(21-28) 작제물 (작제물 번호 12, 도 6A)로 면역 접종한 후 PD3에서 혈장 Aβ₄₀이 3배 초과로 증가함을 증명했다. Aβ₄₀에서 이러한 증가는 단량체 Aβ접합체/OMPC 백신 작제물로 면역화한 동물에서는 관찰되지 않았다. 자세하게는, Aβ(3-10) (서열번호 69) 또는 Aβ(21-28) (서열번호 73)을 이용한 면역화는 이 측정에서 결여되거나 충분히 낮은 반응을 나타냈다. 이들 차이가 도 8B에서 기술한 바와 같이, 역가 수준과는 무관하다는 것이 주목할만하다.

종합적으로, 이들 데이터는 몇몇 작제물이 혈장 Aβ수준을 높이는 능력면에 서 다른 면역원성 작제물에 비해 이점을 가진다는 것을 증명했다. 당업자는 면역원성 단편의 선택성, 즉, 혈장 Aβ의 수준을 높이는 능력이 본원 이전의 발명에서는 보여지지 않았으며 이전의 기술로부터 예측할 수 없었다는 것을 이해한다. 이와같이, 면역화 후 혈장 Aβ를 증가시키는 면역원인, T-세포 에티토프가 결여된 8-량체 또는 MAP의 동정이 백신 작제물에 사용하기 위한 8-량체 또는 MAP를 선택하는 방법을 제공한다. 본 발명의 결과로서, 당업자는 이제 정량적 (예, 면역원성)으로 및 정성적(예, 폴리클로날 항체 반응의 특성- 혈장 Aβ수준을 증가시키는 능력)으로 상기 백신 작제물의 특성을 규명할 수 있다. 당업자는 본 발명이 8개 아미노산 Aβ 단편에 제한되지 않으며, 숙주 유기체에서 Aβ에 반응하는 폴리클로날 항체 반응을 생산할 수 있는 모든 항원이 포함된다는 것을 추가로 알 수 있다.

<110> Merck & Co., Inc. <120> PEPTIDE CONJUGATE COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE <130> 21868Y-PCT <150> US 60/677,886 <151> 2005-05-05 <160> 79 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 79 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe 20

Claims

Aβ 단편에 대한 항체의 형태로 면역 반응을 유도할 수 있고 T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
혈장 Aβ의 수준을 증가시킬 수 있는, 제1항에 따른 면역원성 단편.
제2항에 있어서, 상기 면역원성 단편이 Aβ의 선형의 8개 아미노산 펩티드 (8-량체), 하나 이상의 스페이서가 산재된 다가의 선형 펩티드 및 다가의 분지된 다중 항원 펩티드 (MAP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
제3항에 있어서, 조성물과 결합하여 접합체를 형성하고, Aβ단편에 대한 항체를 포함하는 면역반응을 촉진하는 담체 분자를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 담체 분자가 혈청 알부민, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 면역글로불린 분자 및 네이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitidies) 외막 단백질 복합체 (OMPC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 담체 분자가 OMPC인 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트가 수산화 알루미늄 및 사포닌-기반 아쥬반트의 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트가 사포닌-기반 아쥬반트인 약제학적 조성물.
Aβ단편에 대한 항체의 형태로 면역반응을 유도할 수 있고 T-세포 에피토프가 결여된 Aβ의 면역원성 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 뇌에서 Aβ의 아밀로이드 침적과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
제10항에 있어서, 면역원성 단편이 혈장의 Aβ수준을 증가시킬 수 있는 방법.
제11항에 있어서, 면역원성 단편이 Aβ의 선형의 8개 아미노산 펩티드 (8-량체), 하나 이상의 스페이서가 산재된 다가의 선형의 펩티드 및 다가의 분지된 다중 항원 펩티드 (MAP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제12항에 있어서, 면역원성 단편이 Aβ단편에 대한 항체를 포함하는 면역 반응을 촉진하는 담체 분자와 결합하여 접합체를 형성하는 방법.
제13항에 있어서, 담체 분자가 혈청 알부민, 열쇠 구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 면역글로불린 분자 및 네이세리아 메닌기티디스 외막 단백질 복합체 (OMPC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제14항에 있어서, 담체 분자가 OMPC인 방법.
제13항에 있어서, 접합체가 약제학적으로 허용되는 아쥬반트와 함께 투여되는 방법.
제14항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트가 수산화 알루미늄 및 사포닌-기반 아쥬반트의 그룹으로부터 선택되는 방법.
제179항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 아쥬반트가 사포닌-기반 아쥬반트인 방법.