ITMI20071975A1 - Prodotti e loro uso per la diagnosi prevenzione e-o cura di patologie umane e-o animali caraterizzate dalla anomala deposizione di sostanza b-amiloide e-o similamiloide in organi e tesstui umani e-o animali e metodo di screening per la determinazione - Google Patents

Prodotti e loro uso per la diagnosi prevenzione e-o cura di patologie umane e-o animali caraterizzate dalla anomala deposizione di sostanza b-amiloide e-o similamiloide in organi e tesstui umani e-o animali e metodo di screening per la determinazione Download PDF

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Description

Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale
DESCRIZIONE
La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza nell’anziano. Si tratta di una malattia degenerativa caratterizzata clinicamente dal progressivo declino delle funzioni cognitive, e neuropatologicamente dall’accumulo di aggregati insolubili di β-amiloide (Αβ) e proteina tau, nella corteccia cerebrale e in strutture grigie sottocorticali. L’Aβ si deposita sotto forma di amiloide extracellulare nel neuropilo ( placche senili ) e nei vasi cerebrali ( angiopatia congof ), mentre la proteina tau forma filamenti anomali intraneuronali ( degenerazioni neurofìbrillari) ( Love S. Neuropathological investigation of dementia: a guide for neurologists. J Neurol Neurosurg Psychiatry 76, Suppl 5:v8-14, 2005) (Figura 1).
Nel 95% dei casi la malattia di Alzheimer è sporadica, mentre nel 5% circa dei casi ha un carattere familiare ed è associata a mutazioni a carico di 3 geni; presenilina 1 (PSEN1) sul cromosoma 14, presenilina 2 (PSEN2) sul cromosoma 1 e precursore della β-amiloide (APP) sul cromosoma 21. In questi casi la malattia ha spesso un esordio più precoce della forma sporadica ed è trasmessa con meccanismo di tipo autosomico dominante ad alta penetranza.
L’etiopatogenesi dell’ AD non è ancora del tutto chiara, ma nell’ultimo decennio è andata progressivamente affermandosi l’ipotesi della “ amyloid cascade ” ( Wilquet et al Amyloid-beta precursor protein processing in neurodegenerati on. Curr Opin Neurobiol 14:582-8, 2004; Lee et al. Perspectives on the amyloid-beta cascade hypothesis. J Alzheimers Dis 6:137-45, 2004) che attribuisce alla Αβ un ruolo centrale tanto nelle forme familiari (FAD) che in quelle sporadiche.
L'Αβ deriva dal suo precursore βΑΡΡ attraverso una via catabolica denominata “ pathway amiloidogenico ” (Figura 2). Questo pathway prevede il clivaggio della molecola a monte e a valle della β-proteina per opera di due proteasi, la beta- e la gamma-secretasi. Il taglio della beta-secretasi (BACE) genera un lungo frammento solubile (sΑΡΡβ) N-terminale ed un peptide C-terminale di 99 aminoacidi (C99). Questi viene ulteriormente tagliato dalla gamma-secretasi in due frammenti che corrispondono ad Αβ ed a un piccolo peptide C-terminale (AICD) (Selkoe DJ. Deciphering thè genesis and fate of amyloid β-protein yields novel therapies for Alzheimer disease. J Clin Invest 110:1375-81, 2002). La gamma-secretasi, in realtà, ha due principali siti di clivaggio che conducono alla formazione di una forma “breve” e una forma “lunga” di Αβ (Αβ1-40 e Αβ1-42), le quali, in condizioni normali hanno un rapporto di 10:1. Analogamente, BACE può agire in corrispondenza di diversi punti del peptide generando forme tronche nella regione N terminale (e.g. Αβ 11-40, Αβ 11 -42 e Αβ3-42), le quali risultano spesso aumentate nell’ AD (Liu et al Characterization of Αβ1 1-40/42 peptide deposition in Alzheimer’s disease and young Down’s syndrome brains: implication of N-terminally truncated Αβ species in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol 112:163-74, 2006). βΑΡΡ può andare incontro ad un pathway catabolico alternativo denominato “non amiloidogenico” in quanto la proteina viene tagliata da un’altra proteasi (l' alfa-secretasi) in corrispondenza dei residui 16-17 di Αβ. L’azione di quest’ultimo enzima preclude pertanto la formazione di β-amiloide.
L'amyloid cascade hypothesis è supportata da molteplici evidenze:
mutazioni nel gene APP determinano forme familiari di AD ( Rademakers et al. Genetics of Early-Onset Alzheimer Dementia. Scientific WorldJournal 16:497-5 19, 2003);
la presenza di un’extra-copia del gene APP, come si verifica nella sindrome di Down, è sufficiente a determinare un quadro clinico-patologico di AD;
la maggior parte delle forme geneticamente determinate di AD è associata ad un aumento della produzione di Αβ, con incremento del rapporto Αβ42/Αβ40 ( Kahle et al. Attack on amyloid. EMBO Rep 4:747-51, 2003);
l' Αβ, particolarmente la forma “lunga” a 42 residui, mostra una spiccata tendenza ad aggregarsi in oligomeri e a formare fibrille amiloidi che rappresentano il costituente principale delle placche senili (Armstrong RA. Plaques and tangles and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Folta Neuropathol 44:1-1 1, 2006);
l'Αβ, specie la forma a 42 aminoacidi, è neurotossica ( Butterfìeld et al. Amyloid beta-peptide(1-42) contributes to the oxidative stress and neurodegeneration found in Alzheimer disease brain. Brain Pathol 14:426-32, 2004);
topi transgenici portatori di mutazioni del gene APP associate ad AD, accumulano β-amiloide nel sistema nervoso centrale e manifestano deficit della sfera cognitivocomportamentale che si aggravano in funzione dell’età (Kurt et al. Neurodegenerative changes associated with beta-amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes. Exp Neurol 171:59-71, 2001);
l’immunizzazione verso Αβ di topi transgenici esprimenti APP umana, riduce la formazione di placche amiloidi e ne migliora i deficit neurologici ( Lemere et al Amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease transgenic mouse models and wildtype mice. Neurochem Res 28:1017-27, 2003).
Per quanto riguarda le forme geneticamente determinate, circa l'80% dei casi di AD familiare è associato a mutazioni in PSEN1 e PSEN2 ( Rocchi et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer’s disease: a review. Brain Res Bull 61:1 — 24, 2003). Entrambe le preseniline sono coinvolte nella generazione di Αβ, essendo parte del complesso macromolecolare della gamma-secretasi, e loro mutazioni determinano un incremento della produzione di Αβ, soprattutto di Αβ 1 -42, la quale ha una elevata tendenza a formare aggregati neurotossici.
Il 5% circa delle FAD sono causate da mutazioni localizzate nel gene APP {Rocchi et al Causative and susceptibility genes for Alzheimer’s disease: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003) (Figura 2). Alcune di queste mutazioni esercitano il loro effetto patogenico favorendo conformazioni di Αβ ricche in struttura secondaria beta-sheet, con conseguente riduzione della solubilità e tendenza all’aggregazione. Altre mutazioni, invece, interferirebbero col processing dell’ APP, in virtù della loro localizzazione nei siti della molecola ove agiscono le secretasi (e.g . “Swedish mutation" KM670/671NL). Altre ancora, con meccanismo tuttora ignoto, provocano la produzione e l' accumulo delle forme lunghe ed insolubili di Αβ (Αβ1-42 e Αβ1-43). Nei casi di AD associati a mutazioni dell’ APP o delle preseniline, ΡΑβ1-42 aumenta fino a costituire il 15-40% dei peptidi Αβ secreti, mentre in condizioni normali essa ne rappresenta solo il 5-10% ( Rocchi et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer’s disease: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003; Lieo et al Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum of Alzheimer Disease Associated With PS- 1 Mutations, Am J Geriatr Psychiatry 12: 146-56, 2004). Compito tecnico della presente invenzione è quello di fornire dei prodotti e un loro uso per la diagnosi e/o prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali, ed un metodo di screening per la determinazione del rischio di tali patologie.
Il compito tecnico, nonché altri scopi secondo la presente invenzione, vengono raggiunti tramite quanto rivelato nelle rivendicazioni indipendenti di seguito riportate.
Altre caratteristiche dell’invenzione sono definite dalle rivendicazioni successive.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione che segue supportata dalle figure da 1 a 19 allegate.
La presente invenzione si riferisce alla recente scoperta di una nuova mutazione puntiforme nel gene APP umano. La mutazione è caratterizzata dalla sostituzione di una Citosina con una Timidina al codone 673 della sequenza codificante del gene APP umano (D8765), corrispondente al nucleotide 2212 (transizione C.22120T) dell’ isoforma di APP770 umana (NM_ 000484.2) secondo !a nomenclatura del database GenBank , accessibile al sito web http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Ai fini di questo brevetto, per sostanza simil-amiloide si intendono aggregati proteici di Αβ che non possiedono le caratteristiche tintoriali e/o ultrastrutturali dell'amiloide stessa. Tale mutazione, che induce nella sequenza proteica la sostituzione di un’alanina con una valina nella posizione 673 (Ala673Val) dell'APP770, corrispondente al residuo aminoacidico 2 di Αβ, è stata identificata in omozigosi in un paziente affetto da una grave forma di demenza ad esordio presenile. L’analisi del liquido cefalo-rachidiano del paziente ha evidenziato una notevole diminuzione di Αβ1-42 e un aumento della proteina tau totale e tau fosforilata, come si osserva nella malattia di Alzheimer. D’altra parte, i livelli plasmatici di Αβ1-40 e Αβ1-42 risultavano aumentati rispetto a soggetti di controllo e anche a soggetti portatori della stessa mutazione in eterozigosi. Inoltre, i fìbroblasti ottenuti da biopsia cutanea del paziente rilasciavano nel proprio medium di coltura quantità di Αβ1-40 e Αβ1-42 più elevate rispetto a fìbroblasti di controllo. Nel loro insieme questi dati, i cui dettagli sono riportati in alcuni degli esempi elencati successivamente, indicano che la mutazione Ala673Val, in stato di omozigosi, si associa ad una demenza inquadrabile come malattia di Alzheimer e, analogamente ad altre mutazioni nel gene APP, influenza il processing dell' APP incrementando la produzione di Αβ.
Lo studio genetico di diversi membri della famiglia ha dimostrato la presenza di un altro familiare portatore della mutazione Ala673Val in omozigosi. Questo familiare, più giovane del paziente, è stato sottoposto a valutazione neuropsicologica, la quale ha rivelato iniziali segni di compromissione di diverse funzioni cognitive. L’analisi genetica ha consentito, inoltre, di identificare numerosi soggetti portatori della stessa mutazione in eterozigosi i quali, sorprendentemente, non avevano sviluppato nessuna malattia neurologica pur essendo, alcuni di loro, in età avanzata (IX decade di vita) (Figura 4). Studi di espressione genica eseguiti sull’RNA trascritto a partire dal gene APP, hanno dimostrato che in questi soggetti entrambi gli alleli (i.e., quello wild type e quello mutato) vengono trascritti. Dunque l’assenza di malattia negli eterozigoti non può essere imputato ad un meccanismo di repressione genica (inibizione della trascrizione dell’allele “patologico”). E’ pertanto ipotizzabile che la mutazione Ala673Val, contrariamente a quelle finora descritte nel gene APP, tutte autosomiche dominanti a penetranza completa, abbia un’espressione di tipo autosomico recessivo. Ne consegue che alcune forme apparentemente sporadiche di AD potrebbero essere forme geneticamente determinate a trasmissione autosomica recessiva.
Per indagare le basi molecolari di questo fenomeno abbiamo sintetizzato 2 peptidi Αβ1-40, uno wild-type (DAEFRHDSG YEVHH QKL VFFAED VGSNKGA IIGLMVGG W ) , l’altro contenente una valina al posto dell’alanina in posizione 2
(DVEFRHDSGYEVHHQKL VFFAED VGSNKGAIIGLMVGG VV) . I due peptici sono stati sottoposti ad analisi chimico-fisiche e morfologiche volte a valutare la loro struttura secondaria, la cinetica di aggregazione, e la morfologia e la natura degli aggregati. Queste indagini hanno dimostrato che il peptide mutato ha una propensione a formare fibrille amiloidi molto maggiore di quello wild-type. Del tutto sorprendentemente, la miscela costituita da quantità equimolari dei due peptidi non solo aggrega meno del mutato ma anche del peptide wild-type da solo. Questo effetto ‘‘inibitorio” sull’amiloidogenesi è in sintonia con l’osservazione clinica che la malattia si manifesta esclusivamente nei soggetti omozigoti per la mutazione Ala673Val mentre gli eterozigoti, che co-esprimono a livello cellulare entrambi i peptidi ( wild-type e mutato) non si ammalano. Sulla base di questi dati è addirittura ipotizzabile che gli individui eterozigoti possano essere protetti dalla malattia di Alzheimer grazie alla scarsa tendenza fìbrillogenica del peptide Αβ mutato in presenza del suo corrispettivo wild-type .
Per verificare l' ipotesi che la regione N-terminale di Αβ, sede della mutazione, giochi un ruolo importante nell’aggregazione e che la mutazione Ala673Val abbia un effetto inibitorio, sono stati sintetizzati due peptidi corrispondenti ai primi sei aminoacidi di Αβ, uno con la sequenza wild-type (DAEFRH ) e l’altro contenente una valina al posto dell’alanina in posizione 2 (DVEFRH). I due esapeptidi sono stati quindi co-incubati con l' Αβ1-40 wild-type ed esaminati a tempi successivi. Lo studio ha dimostrato che entrambi gli esapeptidi inibiscono la spontanea tendenza alla fibrillogenesi di Αβ1-40 e che l’effetto dell’esapeptide mutato è maggiore di quello del corrispettivo wild-type.
Questi dati aprono nuove prospettive nell’ambito delle strategie terapeutiche dell’ AD e, più in generale, delle malattie caratterizzate da accumulo di proteine in forma di aggregati insolubili e tossici nel sistema nervoso centrale o in altri tessuti.
Una prima applicazione della nostra invenzione consiste nella produzione, secondo metodiche note agli esperti in materia, di un vettore contenente il cDNA dell’APP umana con mutazione Ala673Val, e l'uso di detto vettore per transfettare linee cellulari utilizzabili per studi di patogenesi e terapia.
Una seconda applicazione consiste nell’uso del costrutto di cui alla precedente applicazione come vettore per la produzione, secondo metodiche note agli esperti del settore, di mammiferi non-umani transgenici capaci di esprimere APP umana con mutazione Ala673Val, come unica forma di APP (animali omozigoti) o in combinazione con APP umana wild-type o contenente un’altra mutazione (doppi transgenici). Tali animali possono essere utilizzati come modelli per lo studio della patogenesi, diagnosi, prevenzione e cura di patologie dell’ uomo e/o di animali, caratterizzate dalla anomala formazione e deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti. Nella nostra attuazione l' animale preferito è il topo, ed in particolare il ceppo murino C57BL6 knock-out per la APP endogena, e la patologia preferita è la AD.
Considerando la potenziale capacità del peptide mutato di interferire con l’aggregazione e la fibrillogenesi di Αβ, un’altra possibile applicazione della nostra invenzione è rappresentata dalla generazione di un costrutto contenente APP con mutazione Ala673Val da utilizzare nella terapia genica in vivo (il DNA viene trasferito direttamente nelle cellule o nei tessuti del paziente) o ex vivo (il DNA viene dapprima trasferito in cellule isolate dall’organismo e cresciute in laboratorio, le quali, così modificate, possono essere reintrodotte nel paziente) di patologie caratterizzate da anomala deposizione di sostanza βamiloide in organi e tessuti. Il trasferimento del costrutto nelle cellule bersaglio è realizzabile mediante vettori di tipo virale come ad esempio (a) retrovirus che hanno la capacità di integrare il loro DNA all’ interno dei cromosomi di cellule in proliferazione, (b) lentivirus che permettono di trasferire materiale genetico anche in cellule che non proliferano, (c) virus adenoassociati che integrano il loro DNA nei cromosomi della cellula ospite ma sono utilizzabili solo per geni di piccole dimensioni, (d) adenovirus che possono trasportare geni di grosse dimensioni ma garantiscono tuttavia la loro espressione per periodi di tempo limitati, o (e) il virus del'herpes simplex che infetta soltanto alcuni tipi di cellule, in particolare i neuroni. In alternativa è possibile utilizzare vettori non virali come i liposomi. L’introduzione di APP con mutazione Ala673Val in organismi affetti da patologie con accumulo abnorme di Αβ potrebbe dunque fornire una fonte di β-proteina mutata in grado di inibire l accumulo dì sostanza β-amiloide nei tessuti.
Un’altra possibile applicazione è rappresentata dall’uso di mRNA antisenso, contenente la mutazione in oggetto, per inibire la traduzione del messaggero in soggetti omozigoti per la mutazione Ala673Val, secondo metodiche note agli esperti in materia (RNA interference, RNAi). L’inibizione della traduzione ha lo scopo di determinare un blocco della produzione di peptidi mutati i quali hanno spiccata tendenza all’aggregazione. Gli esperimenti basati sulla tecnologia dell’RNAi applicata alla nostra invenzione possono inoltre essere utili nello studio della patogenesi di malattie caratterizzate da anomala formazione e deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti.
Un’altra applicazione della nostra invenzione prevede l’uso della APP umana con mutazione Ala673Val e di peptidi, naturali o dì sintesi, contenenti la mutazione stessa per la diagnosi, prevenzione e cura di patologie, dell’uomo e/o di animali, caratterizzate dalla anomala formazione e deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti, La nostra attuazione preferita prevede l’uso di peptidi di basso peso molecolare, come l’esapeptide DVEFRH, opportunamente formulato per la somministrazione per via orale e/o parenterale, compresa la somministrazione intratecale. La patologia preferita è la AD. Il trattamento prevede la somministrazione di singoli peptidi o la associazione di più peptidi, utilizzati come unico trattamento o in associazione con altri farmaci.
Una ulteriore applicazione della nostra invenzione prevede la produzione, mediante tecniche note agli esperti del settore, di anticorpi verso le proteine e/o i peptidi di cui alla applicazione precedente, da utilizzare nella diagnosi, prevenzione e/o cura delle patologie dell’uomo e/o di animali, caratterizzate dalla anomala formazione e deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti.
La nostra attuazione preferita prevede un anticorpo monoclonale capace di riconoscere la mutazione Ala673Val nella APP umana e in peptidi da essa derivati e contenenti tale mutazione. Tale anticorpo può essere utilizzato a scopo diagnostico per riconoscere la APP con mutazione Ala673Val o, opportunamente formulato, per il trattamento di amiloidosi caratterizzate dalla presenza di tale APP mutata. La amiloidosi preferita è la AD.
Le applicazioni sopra descritte vengono riportate a titolo di esempio e non sono in alcun modo limitative degli sviluppi della nostra invenzione.
ESEMPI
Esempio I: Identificazione di una nuova mutazione del gene APP e descrizione del fenotipo clinico del paziente portatore di tale mutazione.
L’identificazione della mutazione è stata condotta mediante estrazione del DNA genomico dai linfociti del paziente, amplificazione degli esoni 16 e 17 del gene APP mediante polymerase chain reaction (PCR), utilizzando i primers 5’-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3’ e 5’-GGCAAGACAAACAGTAGTGG-3’ e sequenziamento del prodotto di amplificazione (Figura 5) secondo tecniche già descritte ( Wakutani et al. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation (D678N) in probable familial Alzheimer’s disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75:1039-42, 2004).
Poiché la mutazione abolisce un sito di taglio specifico per l’enzima di restrizione HpYCH4V allinterno dell’esone 16, la presenza di Ala673Val è stata evidenziata anche mediante amplificazione dell’esone 16 mediante PCR (primers: 5’-GGCAAGACAAACAGTAGTGG-3' e 5’-TACTTTAATTATGATGTAATA-3’ ), digestione del prodotto di PCR con HpYCH4V, e separazione dei frammenti su gel di agarosio al 2.5%. Nell’allele wild-type la digestione con HpYCH4 produce due frammenti di 91 e 78 paia di basi (bp), mentre nell’allele mutato genera un unico frammento di 169 bp (Figura 6).
La mutazione Ala673Val è stata identificata in omozigosi in un paziente senza familiarità per demenza, affetto da una sindrome psicorganica evolutiva esordita all’età di 36 anni con ingravescenti deficit di memoria, difficoltà di pianificazione e disturbi del comportamento (Figura 4, III 18). Il quadro clinico è evoluto verso una grave decadimento cognitivo plurisettoriale, al quale si sono associati movimenti involontari di tipo mioclonico, parkinsonismo e tetraparesi spastica.
Lo studio genetico della famiglia ha consentito di identificare un secondo soggetto omozigote per la mutazione Ala673Val (Figura 4, III 20) e diversi soggetti eterozigoti (Figura 4, II 10, III 1, III 2, III 8, III 12, IV 1). L’omozigote (Le., la sorella del paziente, più giovane di 5 anni) presenta attualmente segni iniziali di deterioramento cognitivo compatibili con un esordio della malattia; al contrario, nessuno dei soggetti eterozigoti ha manifestato segni di patologia neurologica, nemmeno in età avanzata. Questa osservazione suggerisce che la mutazione Ala673Val sia autosomica recessiva, risultando l’unica tra quelle finora descritte in associazione con AD, che esprime un fenotipo patologico solo quando si presenta in omozigosi.
Occorre segnalare che lo stesso codone del gene APP è sede di un polimorfismo Ala673Thr. Questo polimorfismo è stato riscontrato in eterozigosi in un soggetto senza segni clinici o alterazioni neuropatologiche suggestivi di AD (Peacock et al Novel polymorphism in the A4 region of the amyloid precursor protein gene in a patient without Alzheimer’s disease. Neurology 43: 1254-56, 1993).
Le indagini di laboratorio e strumentali eseguite sul paziente hanno evidenziato:
• un quadro di atrofia cerebrale diffusa con prevalente coinvolgimento delle regioni anteriori, alla RM dell’encefalo; • incremento significativo dei peptidi Αβ1-40 e Αβ1-42 nel plasma (426 ± 93 pg/ml e 46 ± 7 pg/ml, rispettivamente) in confronto con un gruppo di controllo rappresentato da soggetti non affetti da demenza (Αβ1-40 = 109 ± 12 pg/ml, p=0.003; Αβ1-42 = 20 ± 6 pg/ml, p=0.004) (Figura 7);
• incremento di Αβ nel medium di coltura dei fìbroblasti prelevati dal paziente mediante biopsia cutanea (Αβ1-40 = 87.3 ± 9.5 pg/ml; Αβ1-42 = 8,8 ± 0.2 pg/ml) rispetto ai controlli negativi (Αβ1-40 = 34.4 ± 3.8 pg/ml; Αβ1-42 = 4.4 ± 0.6 pg/ml) (Figura 8);
diminuzione di Αβ 1-42 (151 ± 43 pg/ml versus 392 ± 115 pg/ml di un gruppo di controllo, p=0.0004) (Figura 9), e incremento della proteina tau (420 pg/ml; range di normalità: 90-150 pg/ml) e fosfo-tau (63.3 pg/ml; concentrazione media nei controlli: 19.1 pg/ml) (Figura 10) nel liquido cerebro-spinale. Le alterazioni descritte sono del tutto simili a quelle osservate nella malattia di Alzheimer.
Esempio 2: Analisi delle caratteristiche chimico-fìsiche di peptidi Αβ contenenti la mutazione Ala673Val.
Allo scopo di stabilire gli effetti della mutazione Ala673Val e verificare il suo ruolo nella patogenesi della AD, abbiamo sintetizzato 2 peptidi Αβ1-40, uno con la sequenza wild-type (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG VV) e l’altro contenente la sostituzione alanina>valina in posizione 2 (DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG VV). I peptidi sono stati prodotti mediante sintesi in fase solida utilizzando un sintetizzatore 433A (Applied Biosystems). I peptidi legati alla resina sono stati quindi derivatizzati all’N-terminale con un probe lipofilico (4-dodecylaminocarbonylfluorene-9-ylmetilsuecinimidyl carbonate) secondo il metodo descritto da Ball et al. {Int J Pept Prot Res 40:370-9, 1992) con le modificazioni introdotte da Bonetto et al. (J Biol Chem 277: 31327-34, 2002). Dopo distacco della resina, i peptidi sono stati purificati mediante HPLC utilizzando una colonna in fase inversa C4 (Waters), ottenendo una purezza >95%. L’identità dei peptidi è stata determinata mediante spettrometria MALDI-TOF (Modello Reflex III Brucker).
Per gli studi fisico-chimici riportati di seguito (se non diversamente specificato) i peptidi Αβ1-40 wild-type, Αβ1-40 mutato e campioni contenenti miscele equimolari dei due sono stati dissolti in 10 mM NaOH e successivamente diluiti in 50 mM Tris HCl, pH 7.0, alla concentrazione finale di 0.25 e 0.125 mM. / campioni sono stati quindi incubati a 37°C per 1, 4, 8, 24 ore e 3, 5, 10, 15 e 20 giorni. Ad ogni tempo, aliquote dei campioni sono stati analizzate per determinare la struttura secondaria, l’aggregazione, l’ultrastruttura e le proprietà ottico-tintorali degli aggregati.
Struttura secondaria
Le variazioni indotte dalla mutazione sulla struttura secondaria di Αβ sono state indagate mediante Dicroismo Circolare secondo la tecnica descritta da Clippingdale et al. (J Pepi Sci 5:227-49, 2001). I peptidi sono stati diluiti in tampone fosfato 150 mM, pH 7.4, alla concentrazione finale di 100 μΜ, e le misure sono state eseguite con uno spettropolarimetro Jasco-810 a temperatura costante di 37°C. Gli spettri sono stati acquisiti usando una cuvetta da 1 mm e una velocità di scansione di 20 nm/min. Dopo aver sottratto lo spettro della soluzione tampone, il rumore è stato ridotto, quando richiesto, utilizzando il metodo del “moving average”.
L’analisi ha dimostrato che il peptide mutato ha una marcata tendenza ad assumere una conformazione secondaria ricca in βsheet. A tutti i tempi esaminati, il contenuto LS-sheet è risultato molto più elevato non solo rispetto a quello del peptide wildtype ma anche della miscela equimolare costituita da peptide wild-type: peptide mutato (Figura 11).
Questo dato indica che la mutazione Ala673Val condiziona il folding di Αβ determinando un notevole incremento della struttura secondaria β-sheet.
Aggregazione
L’aggregazione di Αβ1-40 wild-type, Αβ1-40 mutato e della loro miscela equimolare è stata valutata determinando la quantità di peptide sedimentabile con centrifugazione. Ai diversi tempi di incubazione, aliquote di 30 μl dei campioni sono state centrifugate a 15,000 g per 15 minuti a 4°C. Il pellet è stato solubilizzato in 25 μl di acido formico puro, e la soluzione è stata iniettata in HPLC dotato di colonna PRLP-S 100À, 4.6 x 150 mm (Labservice Analytica, Polymer Laboratories). L’eluizione è stata fatta utilizzando come fase mobile un eluente A costituito da 0.1% TFA in acqua e un eluente B costituito da 0.08% TFA in acetonitrile, ad una velocità di flusso di 0.7 ml/min, applicando un gradiente lineare 15-60% dell’eluente B in 20 min. Il picco corrispondente al peptide è stato monitorato misurando lassorbanza dell’eluato a 214 nm.
La quantità di peptide sedimentatale è stata calcolata come percentuale della quantità totale di peptide presente nella soluzione iniziale.
Questi esperimenti hanno dimostrato che il peptide mutato aggrega molto di più e molto più rapidamente del peptide wildtype e che, sorprendentemente, la miscela formata dai due peptidi sedimenta meno non solo del peptide mutato ma anche di quello wild-type (Figura 12).
Ultrastruttura e proprietà tintoriali degli aggregati
Le caratteristiche ultrastrutturali e le proprietà ottico-tintoriali degli aggregati sono state studiate rispettivamente mediante microscopia elettronica e microscopia a luce polarizzata dopo colorazione con Rosso Congo.
Per l’indagine ultrastrutturale, 5 μl di sospensione di Αβ1-40 wild-type, Αβ1-40 mutato e della loro miscela equimolare sono stati prelevati a tempi d’incubazione compresi fra 1 ora e 20 giorni, depositati su retini di nickel ricoperti di Formvar-Carbon per 5 minuti, colorati negativamente con una soluzione sovrasatura di acetato di uranile e osservati al microscopio elettronico (EM109 Zeiss). Al ventesimo giorno di incubazione, aliquote dei campioni sono state centrifugate a 15,000 g per 15 minuti. 1 pellet così ottenuti sono stati fissati in glutaraldeide al 2.5% in tampone fosfato, pH 7.4, post-fissati in 1% osmio tetrossido, disidratati in acetone e inclusi in resina epossidica (Spurr, Electron Microscopy Sciences). Sezioni ultrafìni (500 À) sono state raccolte su retini di rame, colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate al microscopio elettronico.
Per verificare se e in quale misura gli aggregati fossero costituiti da amiloide, 5 μl di soluzione di ciascun campione, per i diversi tempi di incubazione, sono stati raccolti su vetrini polilisinati (Bio-Optica), colorati con Congo Rosso ed esaminati con microscopio a luce polarizzata (Nikon Eclipse E-800).
L’analisi ultrastrutturale ha mostrato che nei primi due giorni d’incubazione il peptide Αβ1-40 wild-type forma aggregati amorfi, oligomeri e rare strutture filamentose. Dopo 48 ore compare materiale fibrillare corto, non ramificato, irregolare (protofibrille), e solamente dopo 72 ore di incubazione si osservano fibrille lunghe, rettilinee, di circa 8 nm di diametro, intramezzate a materiale amorfo e protofibrille. Successivamente la densità delle fibrille aumenta e la quantità di materiale amorfo e protofibrille si riduce proporzionalmente. Solo dopo 15 giorni di incubazione la maggior parte del materiale è costituito da dense reti di fibrille.
Per contro, la cinetica di aggregazione del peptide Αβ1-40 mutato è risultata molto rapida. Infatti, già a partire da 24 ore di incubazione erano presenti fibrille lunghe, regolari, prive di ramificazioni (Figura 13), e già dopo 5 giorni il campione era costituito da dense reti di fibrille, senza protofibrille e materiale amorfo.
Sorprendentemente, la miscela equimolare dei due peptidi forma meno fibrille non solo rispetto al peptide mutato ma anche a quello wild-type , e anche dopo 20 giorni di incubazione la maggior parte degli aggregati era costituita da materiale amorfo (Figura 14).
L’osservazione in luce polarizzata dei preparati colorati con Congo Rosso ha dimostrato che il peptide Αβ1-40 mutato è molto più amiloidogenico di Αβ1-40 wild-type e che la miscela dei due peptidi ha una bassa propensione a formare amiloide. Infatti, piccoli aggregati di materiale birifrangente erano presenti già dopo 24 ore di incubazione (Figura 13) nei campioni di Αβ1-40 mutato, dopo 72 ore nei campioni di AG 1-40 wild-type e solamente dopo 5 giorni nella miscela dei due peptidi. Nei tempi successivi era osservabile un progressivo incremento di materiale birifrangente nei campioni di AG 1-40 mutato e AG 1-40 wild-type, mentre l’incremento era molto modesto nella miscela dei due peptidi, anche dopo 20 giorni di incubazione (Figura 14).
Questi dati confermano i risultati degli studi di aggregazione dimostrando che (i) il peptide AG 1-40 mutato è molto più amiloidogenico del wild-type , e (ii) la miscela dei due peptidi ha una bassa propensione a formare fibrille amilodi.
Esempio 3. Inibizione dell’amiloidogenesi mediante peptidi sintetici omologhi alla regione N-terminale di A □ contenente la mutazione Ala673Val.
Poiché lo studio fisico-chimico della miscela dei peptidi AD1-40 mutato e AD 1-40 wild-type suggeriva che la mutazione Ala673Val potesse avere un effetto inibitorio sull’aggregazione di AD, abbiamo verificato questa ipotesi utilizzando due peptidi sintetici corrispondenti ai primi sei aminoacidi di Αβ, uno con la sequenza wild-type (DAEFRH) e l’altro contenente una valina al posto dell’alanina in posizione 2 (DVEFRH ), I due esapeptidi sono stati co-incubati con Αβ1-40 wild-type a concentrazione equimolare o in eccesso (esapeptide:Αβ1-40 = 5:1). Le miscele sono state preparate per lo studio ultrastrutturale e istochimico come descritto nell’esempio 2. Lo studio ha rivelato che entrambi gli esapeptidi (sia il mutato che il wild-type) inibiscono la fibrillogenesi di Αβ1-40, indicando che la regione N-terminale di Αβ sede della mutazione gioca un ruolo importante nell’aggregazione (Figura 15). Tuttavia, l’esapeptide mutato è risultato più attivo del corrispettivo wild-type , sottolineando l’importanza della mutazione Ala673Val per l’effetto inibitorio sulla fibrillogenesi.
Esempio 4: Transfezione di linee cellulari con APP umana wild-type o contenente la mutazione Ala> Val in posizione 2 di AD.
Mediante tecniche di ingegneria genetica (Teseo et al. APP substitutions V715F and L720P alter PS1 conformation and differentially affect Αβ and AICD generation. J Neurochem 95: 446-56, 2005; Sudhir et al. Release of Amino-terminal Fragments from Amyloid Precursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in Cultured Cell. J Biol Chern 267:25602-08, 1992) sono stati generati due vettori contenenti rispettivamente il cDNA di APP751 umana wild-type e il cDNA di APP751 umana con la mutazione Ala>Val in posizione 2 di Αβ. Con questi vettori sono state transfettate due linee cellulari (COS7 e CHO), sulle quali sono stati successivamente eseguiti dosaggi di Αβ nel medium con metodo ELISA.
La mutazione Ala>Val in posizione 2 di Αβ è stata inserita nel cDNA dell’APP75 l umana mediante mutagenesi sito-specifica (QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) utilizzando gli oligonucleotidi
5 ’ -GATCTCTG AAGTG A AGATGG ATGTAG A ATTCC-3 ’ e 5 ’-GTCATGTCGGAATTCTACATCCATCTTC ACTT 37 Sia la forma wild-type che quella mutata di APP sono state quindi amplificate mediante PCR utilizzando i primers
5’-CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3’ e 5<,>-ACCGAAGCTTTGTGGCGGGGGTCTAGTTC-3’
(il primo contenente un sito riconosciuto dall’enzima di restrizione EcoRV, il secondo con sito per l’enzima HindIII), e clonate nel vettore pcDNA 3.1, in corrispondenza dei siti di restrizione EcoRV e HindIII. I costrutti così prodotti sono stati amplificati ulteriormente mediante trasformazione di cellule Top Ten One Shot (Invitrogen), purificati mediante kit Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen), e utilizzati per transfettare cellule COS7 e CHO mediante elettroporazione. L’efficienza delle transfezioni è stata valutata attraverso la quantificazione di APP su lisati cellulari mediante Western blot, utilizzando l’anticorpo 22C11 (Chemicon International Inc.) diretto contro la regione N-terminale della proteina (residui 61-88). Il livello di espressione di APP è stato usato per poter confrontare i livelli di produzione di Αβ da parte delle cellule transfettate con i due costrutti. Sul medium di coltura delle COS7 e delle CHO esprimenti APP umana wild-type e mutata è stato quindi eseguito il dosaggio di peptidi Αβ1-40, Αβ1-42 e forme troncate all’N-terminale con metodo ELISA (Immuno-Biological Laboratories Gunma).
Lo studio ha dimostrato:
• un marcato incremento di Αβ1-40 e Αβ1-42 nel medium delle cellule COS7 transfettate con APP mutata (116.8 ± 90.5 pg/ml e 20 ± 12.3 pg/ml, rispettivamente) rispetto a cellule transfettate con APP wild-type (21.9 ± 8.6 pg/ml e 4 ± 0.8 pg/ml) (Figura 16);
• un marcato incremento incremento di Αβ1-40 e Αβ1-42 nel medium di CHO transfettate con APP mutata (84.6 ± 9 pg/ml e 9.6 ± 3.4 pg/ml, rispettivamente) rispetto a cellule transfettate con APP wild-type (49.8 ± 1 1.8 pg/ml e 4.2 ± 0.8 pg/ml) (Figura 17);
• un significativo incremento delle forme tronche all' N-terminale di AD, in particolare Αβ3-42, nel medium delle cellule COS7 transfettate con APP mutata (2.5 ± 0.3 pg/ml) rispetto a cellule transfettate con APP wild-type (1.1 ± 0.3 pg/ml).
Questi dati indicano che la mutazione Ala>Val in posizione 2 di AD modifica il processing dì APP favorendo la via amiloidogenica, con aumento della produzione di Αβ1-40, Αβ1-42 e forme troncate all'N-terminale.
Esempio 5; Generazione di topi transgenici portatori della mutazione Ala>Val in posizione 2 di A ,
Abbiamo prodotto un costrutto veicolante APP umana con mutazione Ala>Val in posizione 2 di AD per la generazione di topi transgenici sui quali eseguire valutazioni comportamentali, neurofisiologiche, neuroradiologiche, neuropatologiche, biochimiche e molecolari per definire le caratteristiche fenotipiche della malattia associata a questo difetto genetico, e condurre studi di patogenesi e terapia.
Il cDNA di APP751 wild-type è stato clonato nel vettore pTSC21, contenente il promotore Thy 1.2 murino (siti di restrizione HindIII ed EcoRV) (Figura 18). Il costrutto è stato quindi sottoposto a mutagenesi sito-specifica con inserimento della mutazione Ala>Val in posizione 2 di Αβ (Stratagene) mediante lo stesso protocollo riportato per le transfezioni cellulari (v. Esempio 4), ed è stato utilizzato per generare topi transgenici a partire dal ceppo C57Bl/6.
Sono stati ottenuti 6 fondatori (3 maschi e 3 femmine) positivi per il transgene, i quali hanno dato vita a tre linee che overesprimono APP umana con mutazione Ala>Val in posizione 2 di AD nel sistema nervoso centrale. Le due linee migliori verranno incrociate con una linea di topi C57B1/6 knock-out per APP endogena -linea già disponibile- al fine di ottenere animali esprimenti APP umana mutata in assenza di APP murina (huAPPmut/moAPP<0/0>, Figura 19). Questi verranno infine incrociati con topi transgenici per APP umana wild-type per ottenere animali eterozigoti (huAPPt/huAPPt).
I topi esprimenti APP umana con mutazione 2 di AD in omozigosi e eterozigosi saranno utilizzati per studi di patogenesi, diagnosi, prevenzione e cura della malattia di Alzheimer e, più in generale, di malattie umane e/o animali caratterizzate una anomala deposizione di sostanza amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti.

Claims (38)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo di screening effettuato su materiale biologico umano, per la determinazione del rischio di patologie caratterizzate da anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide formata da qualsiasi isoforma di Αβ, basato sulla ricerca della sostituzione in forma omo- o eterozigotica di una Citosina con una Timidina al codone 673 della sequenza codificante il gene APP umano ( D87675 ), corrispondente al nucleotide 2212 (transizione c.2212C>T) dell’isoforma di APP770 {NM_ 000484.2), la mutazione risultando nella sostituzione di Alanina con Vaiina al residuo 673 di APP77G, o al residuo analogo di altre isoforme di APP, che corrisponde alla posizione 2 di Αβ.
  2. 2. Metodo di screening secondo la rivendicazione 1, basato sulla ricerca di RNA messaggeri (mRNA) trascritti dal gene codificante le varie isoforme dell’APP umana con la mutazione di cui al punto 1 o con altre mutazioni al codone 673 di APP770.
  3. 3. Metodo di screening secondo la rivendicazione l, basato sulla ricerca della proteina APP e/o di sue isoforme contenenti la mutazione Ala673Val, corrispondente alla posizione 2 di Αβ o altre mutazioni al codone 673 di APP770.
  4. 4. Metodo di screening secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto di comprenderel l' isolamento del DNA genomico e/o dell’RNA da qualsiasi materiale biologico e il loro sequenziamento.
  5. 5. Metodo di screening secondo una o più rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere la ricerca di detta mutazione mediante analisi non-isotopica del DNA.
  6. 6. Metodo di screening secondo una o più rivendicazioni precedenti, in cui la ricerca di detta mutazione viene effettuata mediante analisi con enzimi di restrizione e/o DHPLC ( Denaturing High Performance Liquid Chromatography) e/o SSCP ( Single Strand Conformation Polymorphism) eo ibridazione in situ.
  7. 7. Metodo di screening secondo una o più rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il DNA viene ottenuto da leucociti isolati dal sangue del paziente.
  8. 8. Metodo di screening secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che una di dette patologie è la AD nella sua forma tipica o esprimentesi in fenotipi atipici.
  9. 9. Costrutto caratterizzato dal fatto di veicolare le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, sotto il controllo di qualsiasi promotore non endogeno.
  10. 10. Costrutto secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto di veicolare l’APP umana o suoi frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, sotto il controllo del promotore Thy1.1 o Thy1.2.
  11. 11. Costrutto secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto di veicolare lAPP umana o suoi frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, sotto il controllo del promotore del Cytomegalovirus (Pcmv).
  12. 12. Qualsiasi linea cellulare caratterizzata dal fatto di essere transfettata in modo stabile o transiente con i costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11.
  13. 13. Mammifero non umano transgenico caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma etero- o omo-zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti contenenti la mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti.
  14. 14. Mammifero non umano transgenìco reso knock-out per lΑΡΡ endogena, caratterizzato dal fatto di essere portatore della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala673Val (APP673v) o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, in forma omozigotica (genotipo APP673v/ APP673v) O emizigotica (genotipo APP0/APP673v) o eterozigotica (genotipo APP673A/APP673v).
  15. 15. Mammifero non umano transgenico secondo le rivendicazioni 13 e 14, caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma omo- o emi- o etero-zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti in cui la mutazione Ala673Val (o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti) è associata ad altre mutazioni.
  16. 16. Mammifero non umano transgenico secondo le rivendicazioni 13-15, caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma omo- o emi- o etero -zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, associati a mutazioni nel gene codificante la presenilina 1 (PSEN1).
  17. 17. Mammifero non umano transgenico secondo le rivendicazioni 13-15, caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma omo- o emi- o etero-zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, associati a mutazioni nel gene codificante la presenilina 2 (PSEN2).
  18. 18. Mammifero non umano transgenico secondo le rivendicazioni 13-15, caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma omo- o emi- o etero-zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, associati a mutazioni nel gene codificante la proteina tau (MAPT).
  19. 19. Mammifero non umano transgenico secondo le rivendicazioni 13-15, caratterizzato dal fatto di essere portatore, in forma omo- o emi- o etero-zigotica, della sequenza di DNA o di suoi frammenti che codificano le diverse isoforme di APP umana o loro frammenti con mutazione Ala6 73Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, associati a combinazioni di mutazioni nei geni PSEN1 e/o PSEN2 e/o MAPT.
  20. 20. Mammifero non umano transgenico secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto di essere un knock-in in cui l’APP endogena è sostituita mediante ricombinazione omologa da APP umana o da suoi frammenti con mutazione Ala673Val o con altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, sotto il controllo del promotore endogeno.
  21. 21. Mammifero transgenico secondo le rivendicazioni 13-20, caratterizzato dal fatto di essere un roditore.
  22. 22. Mammifero transgenico secondo le rivendicazioni 13-20, caratterizzato dal fatto di essere un topo di qualsiasi ceppo.
  23. 23. Animale transgenico caratterizzato dal fatto di essere un qualsiasi organismo animale che esprima l’APP umana o suoi frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, con le caratteristiche genotipiche descritte nelle rivendicazioni 13-20 (ad esempio C. Elegans, Drosophila Melanogaster, Zebrafish , etc.).
  24. 24. Organismo transgenico caratterizzato dal fatto di essere un qualsiasi micro-organismo eu- o pro-cariotico che esprima l’APP umana o suoi frammenti con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770 o loro frammenti, con le caratteristiche genotipiche descritte nelle rivendicazioni 13-20 (ad esempio batteri quali Escherichia Coli, lieviti, muffe, etc.).
  25. 25. RNA messaggero (mRNA) o frammenti di esso contenenti la sequenza nucleotidica corrispondente (mRNA “senso”) o complementare (mRNA “antisenso”) al DNA codificante PAPP umana con mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770.
  26. 26. Uso di RNA o di suoi frammenti, conformi alla rivendicazione precedente da utilizzare nell’ambito della tecnologia nota come RNA interference ( RNAì ), in tutte le sue possibili applicazioni.
  27. 27. Uso di RNA o di suoi frammenti, conformi alle rivendicazioni 25 e 26, nella diagnosi, prevenzione e terapia di patologie umane e/o animali esprimenti una anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide formata da qualsiasi iso forma di Αβ, in organi e tessuti umani e/o animali.
  28. 28. Uso di sostanze conformi alla rivendicazione precedente, in cui una delle patologie è rappresentata da forme sporadiche o genetiche di AD con fenotipo tipico o atipico.
  29. 29. Isoforme dellAPP umana caratterizzate dal fatto di presentare mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770.
  30. 30. Frammenti dell’APP umana, comprese tutte le isoforme di Αβ incluse quelle troncate alPN-terminale e/o estese al C-terminale, caratterizzati dal fatto di presentare mutazione Ala673Val o altre mutazioni al codone 673 di APP770.
  31. 31. Frammenti delFAPP umana come nella rivendicazione precedente, rappresentati da Αβ1-40, Αβ1-42, forme troncate all’N-terminale di Αβ1-40 e Αβ1-42 e forme estese al C-terminale di Αβ1-40 e Αβ1-42 o sequenze parziali degli stessi.
  32. 32. Peptidi sintetici caratterizzati dal fatto di essere analoghi a frammenti della APP umana conformi alle rivendicazioni 30 e 31.
  33. 33. Peptidi secondo le rivendicazioni 30-32, caratterizzati dal fatto di contenere almeno un residuo di amminoacido in forma destrogira.
  34. 34. Peptidi secondo le rivendicazioni 30-33, caratterizzati dal fatto di contenere uno o più residui amminoacidici modificati mediante coniugazione con gruppi chimici di qualsiasi tipo.
  35. 35. Strutture chimiche mimetiche non proteiche o solo parzialmente proteiche conformi alle rivendicazioni 30-34, per la preparazione di farmaci finalizzati alla diagnosi, prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali.
  36. 36. Sostanze conformi alle rivendicazioni 30-35, caratterizzate dal fatto di essere coniugate con molecole che fungono da carriers in grado di veicolare tali sostanze al sito specifico ove esercitare funzioni utili alla diagnosi, prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali.
  37. 37. Uso di sostanze conformi alle rivendicazioni 30-36, per la preparazione di farmaci finalizzati alla diagnosi, prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali.
  38. 38. Uso di sostanze conformi alla rivendicazione precedente in cui una delle patologie è rappresentata da forme sporadiche o genetiche di AD con fenotipo tipico o atìpico, 39. Uso di sostanze conformi alle rivendicazioni 30-36, caratterizzate dal fatto di essere carriers in grado di veicolare composti chimici di qualsiasi tipo al sito specifico ove esercitare funzioni utili alla diagnosi, prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali. 40. Uso di sostanze conformi alle rivendicazioni 25 e 30-36, per lo studio della patogenesi di malattie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali. 41. Uso di sostanze conformi alla rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che una di dette patologie è rappresentata da forme sporadiche o genetiche di AD con fenotipo tipico o atipico. 42. Anticorpi policlonali verso proteine e/o peptidi conformi alle rivendicazioni 29-34. 43. Anticerpi monoclonali o loro frammenti ( single-chain antibodies, nanobodies) diretti verso proteine e/o peptidi conformi alle rivendicazioni 29-34. 44. Uso di anticorpi conformi alle rivendicazioni 42 e 43, per la preparazione di farmaci finalizzati alla diagnosi, prevenzione e/o cura di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali. 45. Uso di anticorpi verso proteine e/o peptidi secondo la rivendicazione precedente, in cui una delle patologie è rappresentata da forme sporadiche o genetiche di AD con fenotipo tipico o atipico. 46. Uso dei costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11, per la terapia genica somatica di patologie umane e/o animali caratterizzate dalla anomala deposizione di sostanza β-amiloide e/o simil-amiloide in organi e tessuti umani e/o animali. 47. Uso dei costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11, in cui la terapia genica somatica conforme alla rivendicazione 46 è realizzata utilizzando come vettori carriers lipidici o polimeri naturali o sintetici. 48. Uso dei costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11, in cui la terapia genica somatica conforme alla rivendicazione 46 è realizzata utilizzando come vettori agenti biologici. 49. Uso dei costrutti di cui alla rivendicazione precedente, in cui la terapia genica somatica conforme alla rivendicazione 46 è realizzata utilizzando come vettori agenti virali (Adenovirus, Adeno-associated virus, SV40, Retrovirus, etc..). 50. Uso dei costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11 per la transfezione di cellule autologhe di persone affette da patologie di cui alle rivendicazioni 37 e 38, da utilizzare nella terapia cellulare di dette patologie. 51. Uso dei costrutti di cui alle rivendicazioni 9-11 per la transfezione di cellule eterologhe o xenologhe da utilizzare nella terapia cellulare delle patologie di cui alle rivendicazioni 37 e 38. 52. Uso delle cellule di cui alla rivendicazione 12 e degli organismi geneticamente modificati secondo le rivendicazioni 13-24 come modelli per lo studio della patogenesi e per la diagnosi, prevenzione e cura delle patologie di cui alle rivendicazioni 37 e 38. 53. Uso delle cellule di cui alla rivendicazione 12 e degli organismi geneticamente modificati secondo le rivendicazioni 13-24 per la produzione di proteine e/o peptidi di cui alle rivendicazioni 29-3 1. GLOSSARIO AD = Malattia di Alzheimer AICD = Frammento C-teminale che deriva dal taglio di APP da parte della □ -secretasi APP = Proteina Precursore della ■-amiloide APPo/o = Animale knock-out per APP endogena ΑΡΡ673Α= APP wild-type APP673v= APP con mutazione Ala>Val al codone 673 Αβ = β-amiloide, peptide derivante dal catabolismo dell’APP BACE = β-secretasi bp = paia di basi Cellule COS = cellule di rene di maschio adulto di cercopiteco etiope trasformate con un mutante difettivo del virus SV40 Cellule CHO = Cellule derivate da ovaio di Hamster cinese DHPLC = Denaturing high performance liquid chromatography DNA = acido deossi-ribonucleico FAD = Forma familiare della malattia di Alzheimer HPLC = High performance liquid chromatography huAPP = APP umana normale huAPPmut= topi transgenici esprimenti APP umana con mutazione Ala>Val in posizione 2 di Αβ huAPPwt- topi transgenici esprimenti APP umana witld-type MAPT = gene codificante la proteina tau moAPP = APP murina moAPP<+/+ =>topi con normale espressione di APP moAPP<0/0>= topi knock-out per la APP endogena mRNA = RNA messaggero Mut = mutato PCMV- Promotore del Citomegalovirus PCR = Polymerase chain reaction PSEN1 = Presenilina 1 PSEN2 = Presenilina 2 RM = Risonanza magnetica RNA = acido ribonucleico RNAi = RNA interference sAPPβ = Frammento solubile che deriva dal taglio di APP da parte della β-secretasi SSCP = single strand conformation polymorphism Wt = wild-type Il tutto come sostanzialmente descritto, illustrato, rivendicato e per gli scopi ivi specificati.
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CN2008801213173A CN102037136A (zh) 2007-10-12 2008-10-10 用于诊断、预防和/或护理特征为β-淀粉和/或淀粉样物质在人和/或动物器官和组织中异常沉积的人和/或动物病理的产物及它们的应用、和用于确定这种病理风险的筛选方法
US12/682,578 US20110010785A1 (en) 2007-10-12 2008-10-10 Products and their use for the diagnosis, prevention and/or care of human and/or animal pathologies characterised by the anomalous deposition of b-amyloid and/or amyloid-like substance in human and/or animal organs and tissues, and screening method for determining the risk of such pathologies
ES08838209.8T ES2607897T3 (es) 2007-10-12 2008-10-10 Procedimiento para el diagnóstico de patologías caracterizadas por los depósitos anómalos de amiloide en órganos y tejidos mediante la detección de una mutación en la posición 673 en APP770, y vector y péptido para su uso en el tratamiento de dichas patologías
EP08838209.8A EP2220251B1 (en) 2007-10-12 2008-10-10 Method for the diagnosis of pathologies characterised by the anomalous deposition of amyloid in organs and tissues by detecting a mutation at position 673 in app770, and vector and peptide for use in the therapy of said pathologies
JP2010528323A JP2011500007A (ja) 2007-10-12 2008-10-10 βアミロイドおよび／またはアミロイド状物質のヒトおよび／または動物の臓器および組織への異常堆積を特徴とするヒトおよび／または動物の病理の診断、予防、および／または、処置のための製品およびその利用法、および、病理の危険性を判定するスクリーニング方法

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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010001198A1 (de) * 2010-01-26 2011-07-28 Robert Bosch GmbH, 70469 Verfahren zur Identifikation von Verbrauchern bzw. Erzeugern in einem pneumatischen, hydraulischen oder elektrischen Netz
US9238796B2 (en) 2010-06-04 2016-01-19 Toagosei Co. Ltd. Cell growth-promoting peptide and use thereof
US9309307B2 (en) 2011-01-07 2016-04-12 Seiko Epson Corporation Antibody against amyloid precursor protein signal peptide
WO2013180011A1 (ja) 2012-05-28 2013-12-05 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US9480727B2 (en) 2012-10-18 2016-11-01 Toagosei Co. Ltd. Synthetic peptide for inhibiting expression of type 2 TNF receptor and use thereof
CN102943126A (zh) * 2012-12-12 2013-02-27 芮屈生物技术（上海）有限公司 老年性痴呆病变前期APP基因mRNA水平原位杂交筛查试剂盒及筛查方法和应用
DE102013201324B4 (de) 2013-01-28 2024-05-16 Aktiebolaget Skf Verfahren zum Bestimmen einer Lagervorspannung
EP3540441A1 (en) * 2014-05-22 2019-09-18 Shimadzu Corporation Surrogate biomarker for evaluating intracerebral amyloid ss peptide accumulation and method for analysis thereof
US20160011616A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Microsoft Technology Licensing, Llc Power management
EP3290525B1 (en) * 2015-04-30 2022-02-23 Jiangsu Nuo-Beta Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Method for screening drug and therapeutic target used for treating alzheimer's disease
CN109776665B (zh) * 2019-02-02 2021-02-05 首都医科大学宣武医院 阿尔茨海默病新突变、其稳转细胞模型及医药用途
IT201900010722A1 (it) * 2019-07-02 2021-01-02 Fondazione Irccs St Neurologico Carlo Besta Composto e composizione per il trattamento multi-obiettivo di disturbi legati alla proteina tau

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7196163B2 (en) * 2001-05-22 2007-03-27 Merk & Co., Inc. Assays using amyloid precursor proteins with modified β-secretase cleavage sites to monitor β-secretase activity
US20050106731A1 (en) * 2002-08-05 2005-05-19 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing with viral vectors
ATE535252T1 (de) * 2005-05-05 2011-12-15 Merck Sharp & Dohme Peptid-konjugat-zusammensetzungen und -verfahren zur prävention und behandlung von alzheimer- krankheit
US8263558B2 (en) * 2005-11-30 2012-09-11 Abbott Laboratories Methods of preparation of recombinant forms of human beta-amyloid protein and uses of these proteins

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