ES2607897T3 - Procedimiento para el diagnóstico de patologías caracterizadas por los depósitos anómalos de amiloide en órganos y tejidos mediante la detección de una mutación en la posición 673 en APP770, y vector y péptido para su uso en el tratamiento de dichas patologías - Google Patents

Procedimiento para el diagnóstico de patologías caracterizadas por los depósitos anómalos de amiloide en órganos y tejidos mediante la detección de una mutación en la posición 673 en APP770, y vector y péptido para su uso en el tratamiento de dichas patologías Download PDF

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Abstract

Procedimiento de cribado in vitro llevado a cabo sobre material biológico humano para determinar el riesgo de patologías caracterizadas por depósitos anómalos de amiloide ß y/o sustancia similar a amiloide formados por cualquier isoforma de Aß, basado en la determinación de la sustitución, en forma homocigota o heterocigota, de una citosina con una timidina en el codón 673 de la secuencia que codifica el gen de APP humano (D87675), correspondiente con el nucleótido 2212 (transición c.2212C>T) de la isoforma de APP770 (NM_000484.2), la mutación dando como resultado la sustitución de alanina con valina en el residuo 673 de APP770, o en el residuo análogo de otras isoformas de APP, que se corresponden con la posición 2 del Aß.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para el diagnostico de patolog^as caracterizadas por los depositos anomalos de amiloide en organos y tejidos mediante la deteccion de una mutacion en la posicion 673 en APP770, y vector y peptido para su uso en el tratamiento de dichas patolog^as
La enfermedad de Alzheimer es la forma mas comun de demencia en las personas ancianas. Es una enfermedad degenerativa caracterizada clmicamente por el deterioro progresivo de las funciones cognitivas y caracterizada neuropatologicamente por la acumulacion de agregados insolubles de amiloide p (Ap) y protema tau en la corteza cerebral y en la sustancia gris subcortical. El Ap se deposita en forma de amiloide extracelular en el neuropilo (placa senil) y en los vasos cerebrales (angiopatfa congofila), mientras que la forma tau de la protema forma filamentos intraneuronales anomalos (degeneraciones neurofibrilares) (Love S. Neuropathological investigation of dementia: a guide for neurologists. J Neurol Neurosurg Psychiatry 76, Suppl 5:v8-14, 2005) (figura 1).
En un 95 % de los casos, la enfermedad de Alzheimer es esporadica, mientras que en aproximadamente un 5 % de los casos tiene un caracter familiar y se asocia con las mutaciones de 3 genes: presenilina 1 (PSEN1) en el cromosoma 14, presenilina 2 (PSEN2) en el cromosoma 1 y el precursor del amiloide p (APP) en el cromosoma 21. En estos casos, la enfermedad a menudo tiene un inicio mas temprano que la forma esporadica y se transmite con un mecanismo de tipo autosomico dominante con penetracion alta. La etiopatogenia de la Ea todavfa no se comprende completamente, pero en la ultima decada se ha confirmado cada vez mas la hipotesis de la "cascada amiloide" (Wilquet et al. Amyloid-beta precursor protein processing in neurodegeneration. Curr Opin Neurobiol 14:582-8, 2004; Lee et al. Perspectives on the amyloid-beta cascade hypothesis. J Alzheimers Dis 6:137-45, 2004) que atribuye un papel central al Ap tanto en las formas familiar (EAF) como esporadica.
El Ap deriva de su precursor pAPP a traves de una via catabolica llamada "via amiloidogenica" (figura 2). Esta via proporciona la escision de la molecula en direccion 5' y en direccion 3' de la protema p por dos proteasas, la beta- secretasa y la gamma-secretasa. El corte de la beta-secretasa (BACE) genera un largo fragmento soluble terminal del extremo N (sAPPp) y un peptido terminal del extremo C de 99 aminoacidos (C99). Este se corta adicionalmente por la gamma-secretasa en dos fragmentos que corresponden con el Ap y un pequeno peptido terminal del extremo C (AICD) (Selkoe DJ. Deciphering the genesis and fate of amyloid p-protein yields novel therapies for Alzheimer disease. J Clin Invest 110:1375-81, 2002). En realidad, la gamma-secretasa tiene dos sitios de escision principales que dan lugar a la formacion de una forma "corta" y una "larga" del Ap (Ap1-40 y Ap1-42), que, en condiciones normales, tienen una proporcion de 10:1. De manera analoga, la BaCe puede actuar en diferentes puntos del peptido, generando formas truncadas en la region terminal del extremo N (por ejemplo, Ap11-40, Ap11-42 y Ap3-42), que a menudo dan como resultado una EA incrementada (Liu et al. Characterization of Ap11-40/42 peptide deposition in Alzheimer's disease and young Down's syndrome brains: implication of Alzheimer's disease. Acta Neuropathol 112:163-74, 2006). La pAPP puede encontrar una via catabolica alternativa llamada "no amiloidogenica", puesto que la protema se corta por otra proteasa (alfa-secretasa) en los residuos 16-17 del Ap. De esta manera, la accion de la ultima enzima impide la formacion del amiloide p.
La hipotesis de la cascada amiloide esta respaldada por multiples pruebas:
• las mutaciones del gen APP determinan las formas familiares de la EA (Rademakers et al, Genetics of Early- Onset Alzheimer Dementia. ScientificWorldJournal 16:497-519, 2003);
• la presencia de una copia adicional del gen APP, como se verifica en el smdrome de Down, es suficiente para determinar una descripcion clmica-patologica de la EA;
• la mayor parte de las formas determinadas geneticamente de la EA se asocian con un incremento de la produccion del Ap, con un incremento de la proporcion Ap42/Ap40 (Kahle et al. Attack on amyloid. EMBO Rep 4:747-51,2003);
• el Ap, particularmente en la forma "larga" de 42 residuos, muestra una fuerte tendencia a agregarse en oligomeros y a formar fibrillas de amiloide, que representan el principal constituyente de las placas seniles (Armstrong RA. Plaques and tangles and the pathogenesis of Alzheimer's disease. Folia Neuropathol 44:1-11, 2006);
• el Ap, especialmente la forma de 42 aminoacidos, es neurotoxico (Butterfield et al. Amyloid beta-peptide (1-42) contributes the oxidative stress and neurodegeneration found in Alzheimer disease brain. Brain Pathol 14:42632, 2004);
• los ratones transgenicos, portadores del gen de APP asociado con la EA, acumulan amiloide p en el sistema nervioso central y muestran deficiencias en la esfera conductual-cognitiva que se acentuan como una funcion de la edad (Kurt et al. Neurodegenerative changes associated with beta-amyloid deposition in the brains of mice carrying mutant amyloid precursor protein and mutant presenilin-1 transgenes Exp Neurol 171:59-71,2001);
• la inmunizacion hacia el Ap de ratones transgenicos que expresan el APP humano reduce la formacion de placas amiloides y mejora sus deficiencias neurologicas (Lemere et al. Amyloid-beta immunization in Alzheimer's disease transgenic mouse models and wildtype mice. Neurochem Res 28:1017-27, 2003).
En relacion con las formas determinadas geneticamente, aproximadamente un 80 % de los casos de EA familiar se asocian con mutaciones en PSEN1 y PSEN2 (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003). Ambas presenilinas estan implicadas en la generacion del Ap,
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formando parte del complejo macromolecular de la gamma-secretasa, y sus mutaciones provocan un incremento de la produccion del Ap, sobre todo de Ap1-42, que tiene una alta tendencia a formar agregados neurotoxicos.
Aproximadamente un 5 % de las EAF estan provocadas por mutaciones ubicadas en el gen de APP (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003) (figura 2). Algunas de estas mutaciones ejercen su efecto patogeno favoreciendo las conformaciones del Ap ricas en estructura secundaria de lamina beta, con la consiguiente reduccion de la solubilidad y tendencia hacia la agregacion. Por otro lado, otras mutaciones interfieren con el procesamiento del APP debido a su ubicacion en los sitios de la molecula donde actuan las secretasas (por ejemplo, la "mutacion sueca" KM670/671NL). Aun asf, otras, con un mecanismo completamente desconocido, provocan la acumulacion por produccion de formas largas e insolubles del Ap (Ap1-42 y Ap1-43). En los casos de EA asociados con mutaciones del APP o de las presenilinas, se incrementa el Ap1-42 hasta que constituye un 15-40 % de los peptidos Ap secretados, mientras que, en condiciones normales, representa unicamente un 5-10 % de los mismos (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res Bull 61:1-24, 2003; Lied et al. Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum of Alzheimer Disease Associated with PS-1 Mutations. Am J Geriatr Psychiatry 12:146-56. 2004).
La entrada en DATABASE EBI [en lmea] EMBL; 26 de febrero de 2004 (), DIAS NETO E. ET AL: “RC0- HT0505-010200-012-h02 HT0505 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence”, con numero de acceso en la base de datos BG877527, divulga una secuencia que contiene un polimorfismo de C por T en una posicion que se corresponde con el residuo 2212 del gen de APP770. El documento WO 2004/099376 divulga vectores de expresion con sitios de escision de beta-secretasa con mutacion en los que uno de los vectores contiene la secuencia NLDV, que unicamente difiere de la isoforma sueca de APP en la sustitucion A673V.
La tarea tecnica de la presente invencion es la de proporcionar procedimientos para el diagnostico de y productos para su uso en la prevencion y/o cuidado de patologfas animales y/o humanas caracterizadas por los depositos anomalos de la sustancia amiloide p y/o sustancia similar a amiloide en tejidos y/u organos animales y/o humanos, y un procedimiento de cribado para determinar el riesgo de dichas patologfas.
La tarea tecnica, asf como otros objetivos de acuerdo con la presente invencion, se logra por medio de lo revelado en las reivindicaciones independientes expuestas a continuacion.
Se definen otras caractensticas de la invencion por las reivindicaciones posteriores.
Las caractensticas y ventajas adicionales de la presente invencion son mas evidentes a partir de la siguiente descripcion respaldada por las figuras adjuntas 1-19.
La presente invencion se refiere al reciente descubrimiento de una nueva mutacion puntiforme del gen de APP humano. La mutacion se caracteriza por la sustitucion de una citosina con una timidina en el codon 673 de la secuencia codificante del gen de aPp humano (D8765), correspondiente con el nucleotido 2212 (transicion c.2212>TJ de la isoforma de APP770 humano (NM_000484.2) de acuerdo con la nomenclatura de la base de datos GenBank, accesible en el sitio web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Para los propositos de esta patente, por sustancias similares a amiloide se pretenden agregados de protemas del Ap que no tengan las caractensticas tintoreas y/o ultraestructurales del propio amiloide. Dicha mutacion, que, en la secuencia de protemas, induce la sustitucion de una alanina con una valina en la posicion 673 (Ala673Val) de APP770, correspondiente con el residuo aminoaddico 2 del Ap, se identifico en homocigosis de un paciente afectado con una forma grave de demencia con inicio presenil. El analisis del lfquido cefalorraqrndeo del paciente mostro una disminucion considerable de la protema tau total y tau fosforilada, como se observa en la enfermedad de Alzheimer. Por otro lado, se incrementan las concentraciones plasmaticas de Ap1-40 y Ap1-42 con respecto a los sujetos de control y tambien con respecto a los sujetos que tienen la misma mutacion en heterocigosis. Ademas, los fibroblastos obtenidos a partir de biopsia de piel del paciente liberaron, en su medio de cultivo, cantidades mas altas de Ap1-40 y Ap1-42 con respecto a los fibroblastos de control. En general, estos datos, cuyos detalles se exponen en varios de los ejemplos enumerados a continuacion, indican que la mutacion Ala673Val, en estado de homocigosis, se asocia con una demencia que se puede describir como enfermedad de Alzheimer y es analoga a otras mutaciones del gen de APP, influye en el procesamiento del APP incrementando la produccion del Ap.
El estudio genetico de diferentes familiares demostro la presencia de otro portador familiar de la mutacion Ala673Val en homocigosis. Este pariente, mas joven que el paciente, se sometio a una evaluacion neuropsicologica, que detecto signos iniciales de alteracion de diferentes funciones cognitivas. Por otra parte, el analisis genetico permitio identificar numerosos sujetos portadores de la misma mutacion en heterocigosis que, de manera sorprendente, no habfan desarrollado ningun desarrollo neurologico, incluso si algunos de ellos eran de edad avanzada (IX decada de la vida) (figura 4). Los estudios de expresion genica llevados a cabo en el ARN transcrito partiendo del gen APP demostraron que en estos sujetos se transcriben ambos alelos (es decir, silvestre y mutado). Por lo tanto, la ausencia de enfermedad en los heterocigotos no se puede deber a un mecanismo de represion genica (inhibicion de la transcripcion del alelo "patologico"). Por lo tanto, se puede plantear la hipotesis de que la mutacion Ala673Val, a diferencia de lo descrito hasta ahora en el gen de APP, totalmente autosomica dominante con penetracion completa, tenga una expresion de tipo autosomica recesiva. De esto se deduce que varias formas aparentemente esporadicas de la EA podnan estar provocadas geneticamente con transmision autosomica recesiva.
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A fin de investigar las bases moleculares de este fenomeno, se han sintetizado 2 peptidos Ap1-40, uno silvestre (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW), el otro que contiene una valina en lugar de la alanina en la posicion 2 (DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV). Se sometieron los dos peptidos a analisis morfologico y qmmico-ffsico dirigido a evaluar su estructura secundaria, la cinetica de agregacion y la morfolog^a y naturaleza de los agregados. Estas investigaciones mostraron que el peptido mutado tema propension a formar fibrillas de amiloide que eran mucho mas grandes que en el silvestre. De manera bastante sorprendente, la mezcla compuesta de cantidades equimolares de los dos peptidos no solo se agrega menos que el peptido mutado, sino tambien menos que el peptido silvestre por sf solo. Este efecto "inhibidor" en la amiloidogenesis coincide con la observacion clmica de que la enfermedad se manifiesta exclusivamente en los sujetos homocigotos para la mutacion Ala673Val, mientras que los heterocigotos, que coexpresan ambos peptidos a nivel celular (silvestre y mutado), no caen enfermos. Basandose en estos datos, incluso se puede suponer que se puede proteger a las personas heterocigotas de la enfermedad de Alzheimer debido a la pequena tendencia fibrilogena del peptido Ap mutado en presencia de su correspondiente silvestre.
A fin de verificar la hipotesis de que la region terminal del extremo N del Ap, que alberga la mutacion, desempena un papel importante en la agregacion y que la mutacion Ala673Val tiene un efecto inhibidor, se sintetizaron dos peptidos correspondientes con los primeros seis aminoacidos del Ap, uno con la secuencia silvestre (DAEFRH) y el otro que contiene una valina en lugar de la alanina en la posicion 2 (DVEFRH). Entonces, se coincubaron los dos hexapeptidos con Ap1-40 silvestre y se examinaron en tiempos posteriores. El estudio demostro que ambos hexapeptidos inhiben la tendencia espontanea para la fibrilogenia del Ap1-40 y que el efecto del hexapeptido mutado es mayor que el del silvestre correspondiente.
Estos datos abren nuevas posibilidades en el alcance de estrategias terapeuticas para la EA, y, mas en general, de las enfermedades caracterizadas por la acumulacion de protemas en forma de agregados insolubles y toxicos en el sistema nervioso central o en otros tejidos.
Una primera aplicacion de la divulgacion consiste en la produccion, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, de un vector que contenga el ADNc del APP humano con Ala673Val y el uso de dicho vector a fin de transfectar lmeas celulares que se puedan usar para estudios de patogenia y tratamiento.
Una segunda aplicacion consiste en el uso de la construccion, de acuerdo con la aplicacion previa, como vector para la produccion, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica, de mairnferos no humanos transgenicos que puedan expresar APP humano con mutacion Ala673Val, como forma unica de APP (animales homocigotos) o en combinacion con APP humano silvestre o que contenga otra mutacion (transgenico doble). Se pueden usar dichos animales como modelos para el estudio de la patogenia, diagnostico, prevencion y cuidado de patologfas animales y/o humanas, caracterizadas por la formacion y depositos anomalos de la sustancia similar a amiloide y/o amiloide p en organos y tejidos. En el modo de realizacion actual, el animal preferente es el raton, y, en particular, la cepa murina con genes suprimidos C57BL6 para el APP endogeno, y la patologfa preferente es la Ea.
Considerando la capacidad potencial del peptido mutado para interferir con la agregacion y la fibrilogenia del Ap, otra posible aplicacion de la invencion esta representada por la generacion de una construccion que contenga APP con mutacion Ala673Val en el tratamiento genico in vivo (el ADN se transfiere directamente en las celulas o tejidos del paciente) o tratamiento genico ex vivo (el ADN se transfiere en primer lugar en celulas aisladas a partir del organismo y cultivadas en el laboratorio, que, modificadas de esta manera, se pueden reintroducir en el paciente) de patologfas caracterizadas por depositos anomalos de la sustancia amiloide p en tejidos y organos. Se puede lograr la transferencia de la construccion en las celulas diana por medio de vectores de tipo vmco, tales como, por ejemplo, (a) retrovirus, que tienen la capacidad de integrar su ADN dentro de los cromosomas de la celula de proliferacion, (b) lentivirus, que tambien permiten la transferencia de material genetico en celulas que no proliferan, (c) virus adenoasociados, que no integran su ADN en los cromosomas de la celula, pero se pueden usar unicamente para genes de pequeno tamano, (d) adenovirus, que pueden transportar genes de gran tamano, pero, no obstante, garantizan su expresion durante periodos de tiempo limitados o (e) virus del herpes simple, que unicamente infecta a varios tipos de celulas, en particular, las neuronas. De forma alternativa, es posible usar vectores no vmcos, como los liposomas. La introduccion de APP con la mutacion Ala673Val en organismos afectados de patologfas con acumulaciones anomalas del Ap puede proporcionar una fuente de protema p mutada que pueda inhibir la acumulacion de sustancias amiloides p en los tejidos.
Otra aplicacion posible se representa mediante el uso de ARNm de sentido negativo, que contiene la presente mutacion, para inhibir la traduccion del mensajero en sujetos homocigotos para la mutacion Ala673Val, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica (interferencia por ARN, iARN). La inhibicion de la traduccion tiene el objetivo de provocar un bloqueo de la produccion de los peptidos mutados, que tienen la fuerte tendencia hacia la agregacion. Los experimentos basados en la tecnologfa de iARN aplicados a la divulgacion tambien pueden ser utiles en el estudio de la patogenia de enfermedades caracterizadas por la formacion y depositos anomalos de sustancias similares a amiloide y/o amiloide p en los tejidos y organos. Otra aplicacion de la divulgacion proporciona el uso del APP humano con mutacion Ala673Val y peptidos naturales o de smtesis que contengan la mutacion por sf misma para el diagnostico, prevencion y cuidado de patologfas animales y/o humanas caracterizadas por la formacion y depositos anomalos de sustancias similares a amiloide y/o amiloide p en los tejidos y organos.
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El modo de realizacion preferente proporciona el uso de peptidos de bajo peso molecular, como el hexapeptido DVEFRH, formulado adecuadamente para la administracion oral y/o parenteral, incluyendo la administracion intratecal. La patolog^a preferente es la EA. El tratamiento proporciona la administracion de peptidos unicos o la asociacion de varios peptidos, usados como tratamiento unico o en asociacion con otros farmacos.
Una aplicacion adicional de la divulgacion proporciona la produccion, por medio de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, de anticuerpos hacia las protemas y/o peptidos de conformidad con la aplicacion previa, que se van usar en el diagnostico, prevencion y/o cuidado de patologfas animales y/o humanas caracterizadas por la formacion y depositos anomalos de sustancias similares a amiloide y/o amiloide p en los tejidos y organos.
La divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal que pueda reconocer la mutacion Ala673Val en el APP humano y en peptidos derivados del mismo y que contengan dicha mutacion. Se puede usar dicho anticuerpo para propositos de diagnostico a fin de reconocer el APP con la mutacion Ala673Val, o formular adecuadamente, para el tratamiento de la amiloidosis caracterizada por la presencia de este APP mutado. La amiloidosis preferente es la EA.
Las aplicaciones descritas anteriormente se exponen como un ejemplo y de ninguna manera son limitantes de los desarrollos de la invencion que se define por las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Identificacidn de una nueva mutacion del gen de APP y descripcion del fenotipo ctfnico del paciente portador de dicha mutacion.
Se realizo la identificacion de la mutacion por medio de la extraccion del ADN genomico a partir de linfocitos de pacientes, amplificacion de los exones 16 y 17 del gen APP por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), usando los cebadores 5'-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3 y 5'-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3' y secuenciacion del producto de amplificacion (figura 5) de acuerdo con las tecnicas ya descritas (Wakutani et al. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation (D678N) in probably familial Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75:1039-42, 2004).
Puesto que la mutacion elimina un sitio de corte espedfico para la enzima de restriccion HpYCH4V dentro del exon 16, tambien se muestra la presencia de Ala673Val por medio de amplificacion del exon 16 a traves de PCR (cebadores: 5 '-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3' y 5'-TACTTTAATTATGATGTAATA-3'), digestion del producto de PCR con HpYCH4V y separacion de los fragmentos en gel de agarosa al 2,5 %. En el alelo silvestre, la digestion con HpYCH4 produce dos fragmentos de 91 y 78 pares de bases (pb), mientras que el alelo mutado genera un unico fragmento de 169 pb (figura 6).
Se identifico la mutacion Ala673Val en homocigosis en un paciente sin componente familiar para demencia, afectado de un smdrome psicoorganico evolutivo con inicio a los 36 anos, con deficiencias en la memoria con empeoramiento, dificultades de planificacion y problemas conductuales (figura 4, III 18). La descripcion clmica evoluciono hacia un importante declive cognitivo multisectorial, al que se asocian movimientos involuntarios de tipo mioclonico, parkinsonismo y tetraparesia espastica.
El estudio genetico de la familia permitio identificar un segundo sujeto homocigoto para la mutacion Ala673Val (figura 4, III 20) y diferentes sujetos heterocigotos (figura 4, II 10, III 1, III 2, III 8, III 12, iV 1). El homocigoto (es decir, la hermana del paciente, cinco anos mas joven) tiene actualmente signos iniciales de deterioro cognitivo compatibles con un inicio de la enfermedad; por otro lado, ninguno de los sujetos heterocigotos ha mostrado signos de patologfa neurologica, ni incluso en edad avanzada. Esta observacion sugiere que la mutacion Ala673Val es autosomica recesiva, dando como resultado que es la unica de las descritas hasta ahora en asociacion con la EA que expresa unicamente un fenotipo patologico cuando esta presente en homocigosis.
Se debe senalar que el mismo codon del gen de APP alberga un polimorfismo Ala673Thr. Se encontro este polimorfismo en heterocigosis en un sujeto sin signos clmicos o alteraciones neuropatologicas indicativas de la EA (Peacock et al. Novel polymorphism in the A4 region of the amyloid precursor protein gene in a patient without Alzheimer's disease. Neurology 43:1254-56, 1993).
La investigacion instrumental y en el laboratorio llevada a cabo en el paciente mostro:
• atrofia cerebral generalizada, con afectacion predominante de las regiones frontales, en la RM del encefalo;
• incremento significativo de los peptidos Ap1-40 y Ap1-42 en el plasma (426 ± 93 pg/ml y 46 ± 7 pg/ml,
respectivamente) en comparacion con un grupo de control representado por sujetos no afectados de demencia (Ap1-40=109 ± 12 pg/ml, p=0,003; Ap1-42=20 ± 6 pg/ml, p=0,004) (figura 7);
• incremento del Ap en el medio de cultivo de los fibroblastos extrafdos del paciente por medio de biopsia de piel
(Ap1-40=87,3 ± 9,5 pg/ml; Ap1-42=8,8 ± 0,2 pg/ml) con respecto a los controles negativos (Ap1-40=34,4 ± 3,8 pg/ml; Ap1-42=4,4 ± 0,6 pg/ml) (figura 8);
• disminucion del Ap1-42 ± 43 pg/ml frente a 392 ± 115 pg/ml de un grupo de control, p=0,0004) (figura 9) e incremento de la protema tau (420 pg/ml; intervalo de normalidad de 90-150 pg/ml) y tau fosforilada (63,3 pg/ml, concentracion promedio en los controles: 19,1 pg/ml) (figura 10) en el lfquido cefalorraqrndeo.
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Las alteraciones descritas son completamente similares a las observadas en la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplo 2: Analisis de las caractensticas qu^mico-f^sicas de los peptidos Ap que contienen la mutacion Ala673Val.
A fin de averiguar los efectos de la mutacion Ala673Val y verificar su papel en la patogenia de la EA, se sintetizaron 2 peptidos Ap-40, uno con la secuencia silvestre (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV) y el otro que contema alanina>valina en la posicion 2 (DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV). Se produjeron los peptidos por medio de smtesis en fase solida usando un sintetizador 433A (Applied Biosystems). Entonces, los peptidos unidos a la resina se derivatizaron en el lado terminal del extremo N con una sonda lipofila (carbonato de 4-dodecilaminocarbonilfluoreno-9-ilmetilsuccinimidilo) de acuerdo con el procedimiento descrito por Ball et al. (Int J Pept Prot Res 40:370-9, 1992) con las modificaciones introducidas por Bonetto et al. (J Biol Chem 277: 31327-34, 2002). Despues de la separacion de la resina, se purificaron los peptidos por medio de HPLC, usando una columna de fase inversa C4 (Waters), obteniendo una pureza > un 95 %. Se determino la identidad de los peptidos por medio de espectrometna MALDI-TOF (Reflex III Brucker Model).
Para los estudios ffsico-qmmicos expuestos a continuacion (a menos que se especifique de otro modo), los peptidos silvestres Ap1-40, mutados Ap1-40 y muestras que conteman mezclas equimolares de los dos se disolvieron en NaOH 10 mM y posteriormente se diluyeron en Tris HCl 50 mM, pH 7,0, a la concentracion final de 0,25 y 0,125 mM. Entonces, se incubaron las muestras a 37 °C durante 1, 4, 8, 24 horas y 3, 5, 10, 15 y 20 dfas. Para cada tiempo, se analizaron alfcuotas de las muestras a fin de determinar la estructura secundaria, la agregacion, la ultraestructura y las propiedades opticas-tintoreas del agregado.
Estructura secundaria
Se investigaron las variaciones inducidas por la mutacion de la estructura secundaria del Ap por medio de dicrofsmo circular de acuerdo con la tecnica descrita por Clippingdale et al. (J Pept Sci 5:227-49, 2001). Se diluyeron los peptidos en tampon fosfato 150 mM, pH 7,4, hasta la concentracion final de 100 pM y se realizaron las mediciones con un espectropolanmetro Jasco-810 a una temperatura constante de 37 °C. Se consiguieron los espectros usando un tubo de ensayo de 1 mm y una velocidad de barrido de 20 nm/min. Despues de haber obtenido el espectro de la solucion tampon, se redujo el ruido, cuando se requirio, usando el procedimiento de la media movil.
El analisis demuestra que el peptido mutado tema una fuerte tendencia a asumir una conformacion secundaria abundante en laminas p. En todos los tiempos examinados, el contenido en laminas p fue mucho mas alto, no solo con respecto al del peptido silvestre, sino tambien con respecto al de la mezcla equimolar constituida por peptidos silvestres y mutados (figura 11).
Esto indica que la mutacion Ala673Val condiciona el plegamiento del Ap, lo que provoca un incremento considerable de la estructura secundaria de lamina p.
Agregacion
Se evaluo la agregacion de Ap1-40 silvestre, Ap1-40 mutado y su mezcla equimolar determinando la cantidad de peptido que puede sedimentar con centrifugacion. Se centrifugaron alfcuotas de 30 pl de las muestras a 15.000 g durante 15 minutos a 4 °C en los diferentes tiempos de incubacion. Se solubilizo el sedimento en 25 pl de acido formico puro y se inyecto la solucion en HPLC provista de columna PRLP-S 100A, 4,6 x 150 mm (Labservice Analytica, Polymer Laboratories). Se realizo la elucion usando como fase movil un eluyente A compuesto de TFA al 0,1 % en agua y un eluyente B constituido por TFA al 0,08 % en acetonitrilo, a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min, aplicando un gradiente lineal de 15-60% del eluyente B en 20 min. Se modifico el maximo correspondiente al peptido midiendo la absorbancia del eluato a 214 nm.
Se calculo la cantidad de peptido que se puede sedimentar como porcentaje de la cantidad total de peptido presente en la solucion inicial.
Estos experimentos demostraron que el peptido mutado se agrego mucho mas y mucho mas rapidamente que el peptido silvestre y que, de manera sorprendente, la mezcla formada por los dos sedimentos de peptidos menos que el peptido mutado, asf como el peptido silvestre (figura 12).
Ultraestructura y propiedades tintoreas de los agregados
Se estudiaron las caractensticas ultraestructurales y las propiedades opticas-tintoreas de los agregados, respectivamente, por medio de microscopio electronico y microscopio de luz polarizada despues de la coloracion con rojo Congo.
Para la investigacion ultraestructural, se extrajeron 5 pl de suspension de Ap1-40 silvestre, Ap1-40 mutado y su mezcla equimolar en los tiempos de incubacion en el intervalo de 1 hora-20 dfas, se depositaron sobre una pantalla de mquel cubierta con formvar-carbono durante 5 minutos, se colorearon negativamente con una solucion sobresaturada de uranilo y se observaron bajo el microscopio electronico (EM109 Zeiss). En el vigesimo dfa de incubacion, se centrifugaron alfcuotas de las muestras a 15.000 g durante 15 minutos. Los granulos obtenidos de
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esta manera se fijaron en glutaral al 2,5 % en tampon fosfato, pH 7,4, se posfijaron en tetroxido de osmio al 1 %, se deshidrataron en acetona y se incluyeron en resina epoxi (Spurr, Electron Microscopy Sciences). Se recogieron las secciones ultrafinas (500 A) sobre pantallas de cobre, se colorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron bajo el microscopio electronico.
A fin de verificar si, y en que medida, los agregados estaban constituidos por amiloide, se recogieron 5 pl de solucion de cada muestra, para los diferentes tiempos de incubacion, sobre portaobjetos polilisinados (Bio-Optical), se colorearon con rojo Congo y se examinaron con microscopio de luz polarizada (Nikon Eclipse E-800).
El analisis ultraestructural mostro que, en los primeros dos dfas de incubacion, el peptido Ap1-40 silvestre forma agregados amorfos, oligomeros y estructuras filamentosas infrecuentes. Despues de 48 horas, aparece un material de fibrillas cortas, no ramificado, irregular (protofibrillas) y unicamente despues de 72 horas de incubacion se observan fibrillas rectilmeas largas, de diametros de aproximadamente 8 nm, interpuestas con material amorfo y de protofibrillas. Posteriormente, se incrementa la densidad de las fibrillas y se incrementa proporcionalmente la cantidad de material amorfo y de protofibrillas. Unicamente despues de 15 dfas de incubacion, la mayor parte del material se compone de redes de fibrillas densas.
Por otro lado, la cinetica de agregacion del peptido mutado Ap1-40 fue muy rapida. De hecho, a partir de las 24 horas de incubacion, estaban presentes las fibrillas regulares largas que caredan de ramificaciones (figura 13) y, despues de 5 dfas, la muestra estaba constituida por redes de fibrillas densas, sin material amorfo y de protofibrillas.
De manera sorprendente, la mezcla equimolar de los dos peptidos forma menos fibrillas, no solo con respecto al peptido mutado, sino tambien con respecto al silvestre, y, despues de 20 dfas de incubacion, la mayor parte de los agregados estaban compuestos de material amorfo (figura 14).
La observacion en luz polarizada de las preparaciones coloreadas con rojo Congo mostro que el peptido mutado Ap1-40 es mucho mas amiloidogeno que el Ap1-40 silvestre y que la mezcla de los dos peptidos tiene una baja tendencia a formar amiloide. De hecho, ya estaban presentes pequenos agregados de material birrefringente despues de 24 horas de incubacion (figura 13) en las muestras de Ap1-40 mutado, despues de 72 horas en las muestras de Ap1-40 silvestre y, unicamente despues de 5 dfas, en la mezcla de los dos peptidos. En un tiempo posterior, fue observable un incremento progresivo de material birrefringente en las muestras de Ap1-40 mutado y Ap1-40 silvestre, mientras que el incremento fue muy pequeno en la mezcla de los dos peptidos, incluso despues de 20 dfas de incubacion (figura 14).
Estos datos confirman los resultados de los estudios de agregacion, lo que demuestra que (i) el peptido mutado Ap1- 40 es mucho mas amiloidogeno que el silvestre y (ii) la mezcla de los dos peptidos tiene una baja tendencia a formar fibrillas de amiloide.
Ejemplo 3. Inhibicidn de la amiloidogenesis por medio de peptidos sinteticos, homologos de la region terminal del extremo N del Ap que contiene la mutacion Ala673Val.
Puesto que el estudio ffsico-qmmico de la mezcla de los peptidos Ap1-40 mutado y Ap1-40 silvestre sugirio que la mutacion Ala673Val podna tener un efecto inhibidor sobre la agregacion del Ap, se verifico esta hipotesis usando dos peptidos sinteticos correspondientes a los primeros seis aminoacidos del Ap, uno con la secuencia silvestre (DAEFRH) y el otro que contema una valina en lugar de la alanina en la posicion 2 (DVEFRH). Se coincubaron los dos hexapeptidos con Ap1-40 silvestre a una concentracion equimolar o en exceso (hexapeptido:Ap1-40 = 5:1). Se prepararon las mezclas para el estudio ultraestructural e histoqmmico como se describe en el ejemplo 2. El estudio ha demostrado que ambos hexapeptidos (tanto el mutado como el silvestre) inhiben la fibrilogenia de Ap1-40, lo que indica que la region terminal del extremo N del Ap, el sitio de la mutacion, desempena un papel importante en la agregacion (figura 15). No obstante, el hexapeptido mutado resulto ser mas activo que el silvestre correspondiente, lo que senala la importancia de la mutacion Ala673Val debido al efecto inhibidor sobre la fibrilogenia.
Ejemplo 4: Transfeccion de lineas celulares con APP humano silvestre o que contiene la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap.
Se generaron dos vectores, por medio de procedimientos de ingeniena genetica (Tesco et al. APP substitutions V715F and L720P alter PS1 conformation and differentially affect Ap and AICD generation. J Neurochem 95: 446-56, 2005; Sudhir et al. Release of Amino-terminal Fragments from Amyloid Precursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in Cultured Cell. J Biol Chem 267:25602-08, 1992), que conteman respectivamente el ADNc de APP751 humano silvestre y el ADNc de APP751 humano con la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap. Con estos vectores, se transfectaron dos lineas celulares (COS7 y CHO), en las que se llevo a cabo la medicion del Ap en el medio con el procedimiento de ELISA.
Se inserto la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap en el ADNc de APP751 humano por medio de mutagenesis espedfica de sitio (QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) usando los oligonucleotidos 5'- GATCTCTGAAGTGAAGATGGATGTAGAATTCC-3' y 5'-GTCATGTCGGAATTCTACATCCATCTTCACTT-3'. Entonces, se amplifican tanto la forma silvestre como mutada de APP por medio de PCT, usando los cebadores 5'- CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3' y 5'-ACCGAAGCTTTGTGGCGGGGGTCTAGTTC-3' (el
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primero que contema un sitio reconocido por la enzima de restriccion EcoRV, el segundo con el sitio para la enzima Hindlll) y se clonaron en el vector pcDNA 3.1, en los sitios de restriccion EcoRV y HindIII. Se amplificaron adicionalmente las construcciones producidas de esta manera por medio de transformacion de celulas Top Ten One Shot (Invitrogen), se purificaron por medio del kit Endofree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) y se usaron para transfectar celulas COS7 y CHO por medio de electroporacion. Se evaluo la eficiencia de las transfecciones a traves de la cuantificacion de APP en lisados celulares por medio de inmunoelectrotransferencia, usando el anticuerpo 22C11 (Chemicon International Inc.) dirigido frente a la region terminal del extremo N de la protema (residuos 61-88). Se uso el nivel de expresion de APP para comparar las concentraciones de produccion del Ap por las celulas transfectadas con dos construcciones. Entonces, en el medio de cultivo de las COS7 y las CHO que expresan APP humano silvestre y mutado, se llevo a cabo la medicion de los peptidos Ap1-40, Ap1-42 y las formas truncadas en el lado terminal del extremo N con ELISA (Immuno-Biological Laboratories Gunma).
El estudio demostro:
• un fuerte incremento de Ap1-40 y Ap1-42 en el medio de las celulas COS7 transfectadas con APP mutado (116,8 ± 90,5 pg/ml y 20 ± 12,3 pg/ml, respectivamente) con respecto a las celulas transfectadas con APP silvestre (21,9 ± 8,6 pg/ml y 4 ± 0,8 pg/ml) (figura 16);
• un fuerte incremento de Ap1-40 y Ap1-42 en el medio de las CHO transfectadas con APP mutado (84,6 ±
9 pg/ml y 9,6 ± 3,4 pg/ml, respectivamente) con respecto a las celulas transfectadas con APP silvestre (49,8 ±
11,8 pg/ml y 4,2 ± 0,8 pg/ml) (figura 17);
• un incremento significativo de las formas truncadas en el lado terminal del extremo N del Ap, en particular Ap3-
42, en el medio de las celulas COS7 transfectadas con APP mutado (2,5 ± 0,3 pg/ml) con respecto a las celulas
transfectadas con APP silvestre (1,1 ± 0,3 pg/ml).
Estos datos indican que la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap modifica el procesamiento de APP, favoreciendo la via amiloidogenica, con un incremento de la produccion del Ap1-40, Ap1-42 y las formas truncadas en el lado terminal del extremo N.
Ejemplo 5: Generacion de ratones transgenicos, portadores de la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap.
Se hizo una construccion que portaba APP humano con mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap para la generacion de ratones transgenicos en los que se realizaron pruebas conductuales, neurofisiologicas, neurorradiologicas, neuropatologicas, bioqmmicas y moleculares a fin de definir las caractensticas fenotfpicas de la enfermedad asociadas con este defecto genetico y realizar estudios de patogenia y tratamiento.
Se clono el ADNc de APP751 silvestre en el vector pTSC21, que contema el promotor Thy 1.2 murino (sitios de restriccion HindIII y EcoRV) (figura 18). Entonces, se sometio la construccion a mutagenesis espedfica de sitio con insercion de la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap (Stratagene) por medio del mismo protocolo expuesto para las transfecciones celulares (vease el ejemplo 4) y se uso para generar ratones transgenicos partiendo de la cepa C57BI/6.
Se obtuvieron 6 resultados (3 hombres y 3 mujeres) positivos para el transgen, que dio vida a tres lmeas que sobreexpresan APP humano con mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap en el sistema nervioso central. Las dos mejores lmeas se cruzan con una lmea de ratones con genes suprimidos C57B1/6 para APP endogeno -lmea ya disponible- a fin de obtener animales que expresan APP humano mutado en ausencia de APP murino (huAPPmut/moAPP0/0, figura 19). Por ultimo, estos se cruzan con ratones transgenicos para APP humano silvestre a fin de obtener animales heterocigotos (huAPPmut/huAPPwt).
Los ratones que expresan APP humano con la mutacion en 2 del Ap en homocigosis y heterocigosis se usan para estudios de patogenia, diagnostico, prevencion y cuidado de la enfermedad de Alzheimer y, mas en general, de enfermedades animales y/o humanas caracterizadas por depositos anomalos de sustancia similar a amiloide y/o amiloide en tejidos y organos.
GLOSARIO
EA = enfermedad de Alzheimer
AICD = fragmentos terminales del extremo C que derivan del corte de APP por la Y-secretasa
APP = precursor de protema de amiloide p
APP0/0 = animal con genes suprimidos para APP endogeno
APP673A = APP silvestre
APP673v = APP con mutacion Ala>Val en el codon 673 Ap = amiloide p, peptido que deriva del catabolismo de APP
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BACE = p-secretasa pb = par de bases
Celulas COS = celulas de rinon de Cercopithecus aethiops macho adulto transformadas con un mutante defectuoso del virus SV40
Celulas CHO = celulas derivadas del ovario de hamster chino
DHPLC = cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento desnaturalizante
ADN = acido desoxirribonucleico
EAF = forma familiar de la enfermedad de Alzheimer
HPLC = cromatograffa de ffquidos de alto rendimiento
huAPP = APP humano normal
huAPPmut = ratones transgenicos que expresan APP humano con mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap huAPPwt = ratones transgenicos que expresan APP humano silvestre MAPT = gen que codifica la protema tau moAPP = APP murino
moAPP+/+ = ratones con expresion de APP normal
moAPP0/0 = ratones con genes suprimidos para el APP endogeno
ARNm = ARN mensajero
Mut = mutado
Pcmv = promotor de citomegalovirus
PCR = reaccion en cadena de la polimerasa
PSEN1 = presenilina 1
PSEN2 = presenilina 2
RM = resonancia magnetica
ARN = acido ribonucleico
iARN = interferencia por ARN
sAPPp = fragmento soluble que deriva del corte de APP por la p-secretasa SSCP = polimorfismo de conformacion de cadena unica Wt = silvestre

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de cribado in vitro llevado a cabo sobre material biologico humano para determinar el riesgo de patolog^as caracterizadas por depositos anomalos de amiloide p y/o sustancia similar a amiloide formados por cualquier isoforma de Ap, basado en la determinacion de la sustitucion, en forma homocigota o heterocigota, de una citosina con una timidina en el codon 673 de la secuencia que codifica el gen de APP humano (D87675), correspondiente con el nucleotido 2212 (transicion c.2212C>T) de la isoforma de APP770 (NM_000484.2), la mutacion dando como resultado la sustitucion de alanina con valina en el residuo 673 de APP770, o en el residuo analogo de otras isoformas de APP, que se corresponden con la posicion 2 del Ap.
  2. 2. Procedimiento de cribado in vitro de acuerdo con la reivindicacion 1, basado en la investigacion del ARN mensajero (ARNm) transcrito por el gen.
  3. 3. Procedimiento de cribado in vitro de acuerdo con la reivindicacion 1, basado en la investigacion de la protema APP y/o sus isoformas.
  4. 4. Procedimiento de cribado in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que una de dichas patologfas es la enfermedad de Alzheimer en su forma tfpica o expresada en fenotipos atipicos.
  5. 5. Vector que porta acidos nucleicos que codifican isoformas de APP humano o un fragmento que contiene la mutacion Ala673Val, bajo el control de un promotor no endogeno, para su uso en el tratamiento genico somatico de patologfas animales y/o humanas caracterizadas por los depositos anomalos de la sustancia amiloide p y/o sustancia similar a amiloide en tejidos y organos animales y/o humanos.
  6. 6. Vector para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que se logra el tratamiento somatico usando como vectores portadores, lfpidos o polfmeros, naturales o sinteticos, o agentes biologicos incluyendo agentes vmcos, opcionalmente adenovirus, virus adenoasociado, virus SV40 o retrovirus.
  7. 7. Vector para su uso de conformidad con la reivindicacion 5, para la transfeccion de celulas autogenas, heterogenas o xenogenas para su uso en el tratamiento celular de formas esporadicas o geneticas de la enfermedad de Alzheimer con fenotipo tfpico o atfpico.
  8. 8. Hexapeptido sintetico DVEFRH que contiene al menos un residuo aminoaddico en forma dextrogira para su uso en el tratamiento de patologfas caracterizadas por los depositos anomalos de la sustancia amiloide p y/o sustancia similar a amiloide en tejidos y organos animales y/o humanos.
  9. 9. Peptidos sinteticos para su uso en el tratamiento de patologfas caracterizadas por los depositos anomalos de la sustancia amiloide p y/o sustancia similar a amiloide en tejidos y organos animales y/o humanos, en el que el peptido sintetico contiene al menos un residuo aminoaddico en forma dextrogira, es analogo a un fragmento de APP, incluyendo isoformas de Ap que incluyen las truncadas en el lado terminal del extremo N y/o extendidas en el lado terminal del extremo C y comprende la mutacion Ala673Val.
    imagen1
    Figura 1. Alteraciones neuropatologicas de la enfermedad de Alzheimer: placas seniles (indicadas mediante flechas) y degeneraciones neurofibrilares (en marron oscuro). Las placas seniles estan formadas por amiloide p y por una corona de neuritas distroficas. Las degeneraciones neurofibrilares estan formadas de tau hiperfosforilada. (Corteza cerebral; impregnacion con plata).
    Protema precursora de amiloide p ------------------------------------------------------------------------------------------
    Amiloide p (Ap)

    P Pa 7 Y
    AfJ1 AP11 AP17 Ap40 Ap42

    • I • . II

    -IdAEFGHDSGFIEVRHQKIiVFFAEDVGSKKGAI IGLMVGGVVlU --------------------C

    itt it
    Bicapa lip^dica
    Diagrama esquematico de la protema precursora de amiloide p (pAPP)
    Expert Reviews in Molecular Medicine ©2001 Cambridge University Press
    Figura 2. Diagrama que ilustra el catabolismo del APP por la secretasa.
    *
    Secretasa:
    Sitio de escision:
    N---------
    imagen2
    Ap
    JL <1
    H677R
    A
    D678N
    )
    KM670/NL671
    (sueco)
    A692G
    (flamenco)
    D694N
    (Iowa)
    E693Q (holandes) E693K (Italiano 1) E693G (Artico)
    imagen3
    KMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIATVrVITLVML
    imagen4
    Figura 3. Mutaciones del gen de APP asociado con la enfermedad de Alzheimer y amiloidosis cerebrovascular (indicada en rojo). El Ap 1-42 se indica en amarillo y la lmea discontinua en rojo divide la parte del Ap codificada por el exon 16 y por el exon 17 del gen APP. El aminoacido alanina (A) en la posicion 2 del Ap se corresponde con el residuo 673 de APP770.
    Familia M Familia S
    imagen5
    ■
    Homocigoto sintomatico
    •
    Homocigoto actualmente paucisintomatico
    Heterocigoto
    □
    Genotipo estandar o desconocido
    Figura 4. Arbol genealogico del objeto.
    Familia M = rama materna; Familia S = rama paterna. Los dos sujetos dentro de un drculo en rojo son la misma persona. El objeto se indica mediante la flecha. Los numeros en negrita indican la edad actual de los sujetos.
    Normal Heterocigoto Ala673Val H°mocig°to A|a673Va|
    imagen6
    imagen7
    5'-....AAGATGGAT GfClA G A A T T C......3’
    111
    Figura 5. Secuencia del exon 16 del gen APP.
    Los tres paneles exponen la secuencia normal, la secuencia de un sujeto heterocigoto para la mutacion Ala673Val y la de un sujeto homocigoto (objeto).
    imagen8
    Figura 6. Analisis por medio de digestion con enzimas de restriccion de un fragmento de ADN que contiene el exon 16 del gen APP.
    El fragmento de ADN se amplifico por medio de PCR. El producto de amplificacion se sometio a digestion con la enzima HpYCH4V y los productos de digestion se separaron por medio de electroforesis en gel de agarosa. Wt = sujeto normal; A = sujeto con mutacion heterocigota Ala673Val; B = sujeto con mutacion homocigota Ala673Val.
    Concentraciones plasmaticas de Ap
    600
    500
    imagen9
    A673V Ctrl-
    Figura 7. Comparacion entre los valores de Aj31-40, A/31-42 encontrados en el plasma del probando y en un grupo de controles negativos.
    Concentraciones de Ap en el medio de cultivo de fibroblastos
    120 ■ ;------------------------------------’---------------------------—--------
    100-------------;---------------------------------------------:----------------
    imagen10
    A673V wt
    Figura 8. Comparacion entre los valores de Aj31-40, Ap1-42 en el medio de cultivo de los fibroblastos extra^dos del probando y de los fibroblastos que pertenecen a un control negativo.
    Concentraciones de Api-42 en el llquido
    600
    500
    imagen11
    A673V Ctrl-
    Figura 9. Comparacion entre los valores de A/31-42 detectados en el Hquido del probando (A673V) y en un grupo de control normal (Ctrl-).
    Concentraciones de tau y tau fosforilada en el liquido
    imagen12
    □ tau
    H tau fosforilada
    Figura 10. Comparacion entre los valores de prote^na tau total y valores de protena tau fosforilada en el Hquido del probando (A673V) y en un grupo de control normal (CTRL-).
    Dicroismo circular
    imagen13
    Figura 11. Comparacion entre la estructura secundaria del peptido silvestre (WT), el peptido mutado (MT) y la mezcla de los dos (WT+MT), evaluada despues de 7 d^as de incubacion.
    % de peptido sedimentable
    Ensayo de sedimentacion
    imagen14
    Figura 12. Comparacion entre la capacidad de sedimentacion del peptido silvestre (WT), el peptido mutado (MT) y la mezcla de los dos (WT+MT).
    Microscopio electronico Coloracion negativa
    imagen15
    Rojo Congo (luz polarizada)
    WT MT WT + MT
    Figura 13. Ultraestructura y propiedades tintoreas de los agregados formados por el peptido silvestre (WT), por el peptido mutado (MT) y por la mezcla de los dos (WT+MT) despues de 24 horas de incubacion.
    El examen ultraestructural demuestra que unicamente el peptido mutado forma agregados de fibrillas despues de 24 horas de incubacion. Los datos tambien se confirman mediante el examen de la luz polarizada, que demuestra la presencia de birrefringencia unicamente en las muestras de peptido mutado.
    Wt
    Microscopio electronico Coloracion positiva
    imagen16
    imagen17
    Figura 14. Ultraestructura y propiedades tintoreas de los agregados formados por el peptido silvestre (WT), por el peptido mutado (MT) y por la mezcla de los dos (WT+mT) despues de 20 d^as de incubacion.
    Tras el examen ultraestructural, se puede observar que la mayor parte del material presente en la mezcla de los dos peptidos es amorfo. El examen de la luz polarizada despues de la coloracion con rojo Congo confirma que la mezcla de los dos peptidos forma agregados congofilos en un grado mucho mas bajo que el peptido silvestre y el peptido mutado.
    en ausencia o presencia de un hexapeptido que contiene la mutacion
    imagen18
    Figura 15. Ultraestructura y propiedades tintoreas de los agregados formados a partir del Ap1-40 silvestre incubados durante 5 d^as en ausencia o presencia de hexapeptido mutado, en una proporcion molar de 1:5.
    Se puede observar que, en presencia de hexapeptido mutado en exceso, la capacidad de formar fibrillas de amiloide por el peptido Ap1-40 esta practicamente suprimida por completo.
    Concentraciones de Ap en el medio de las COS7
    transfectadas con APP
    imagen19
    A673V wt
    Figura 16. Comparacion entre los valores de A/31-40 y A/31-42 en el medio de las COS7 transfectadas con APP A673Vy las COS7 transfectadas con APP silvestre.
    imagen20
    Figura 17. Comparacion entre los valores de Ap1-40 y Ap1-42 en el medio de las CHO transfectadas con APP A673Vy las CHO transfectadas con APP silvestre.
    imagen21
    Figura 18. Diagrama de la construccion que porta APP humano, silvestre o con mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Aft, usada para la produccion de ratones transgenicos.
    Se introdujo el APP humano silvestre en el plasmido pTSC21, bajo el control del promotor murino Thy1.2. La mutacion se introdujo posteriormente por medio de mutagenesis.
    imagen22
    Figura 19. Diagrama de "reproduccion" de los ratones transgenicos C57BI, portadores de la mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap.
    Los ratones transgenicos que expresan APP humano con mutacion Ala>Val en la posicion 2 del Ap y APP endogeno (Tg moAPP+/+ huAPPmut) se cruzan con ratones con genes suprimidos para el APP endogeno (Tg moAPP0/0) para obtener asf ratones (Tg moAPP0/0 huAPPmut) que expresen unicamente APP humano con la mutacion. Los ultimos se cruzan por ultimo con ratones transgenicos para APP humano silvestre a fin de obtener animales heterocigotos (huAPPwt/huAPPmut).
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