KR20120024741A - 신경변성 질환과 알츠하이머병을 치료하고 정상 기억을 향상시키기 위한 방법과 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전반적으로, 신경변성 질환에 관계하고, 더욱 구체적으로, 일군의 프리세닐린/G-단백질/c-src 결합 폴리펩티드 및 알츠하이머병의 신호전달(signaling)과 진행(progression)을 조절하기 위한 이용 방법에 관계한다.

Description

신경변성 질환과 알츠하이머병을 치료하고 정상 기억을 향상시키기 위한 방법과 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISORDERS AND ALZHEIMER'S DISEASE AND IMPROVING NORMAL MEMORY}

관련된 출원의 교차 참조

본원은 일부 계속 출원이고, 그리고 2009년 5월 12일자 제출된 U.S. 특허 출원 No. 12/464,850에 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.

정부 후원된 연구에 관한 진술

미국 정부는 National Institutes of Health에 의한 Grant No. AG07888, NS027580과 NS044768에 따른 특정 권리를 주장한다.

본 발명의 배경 기술

본 발명은 전반적으로, 신경변성 질환의 치료에 관계하고, 더욱 구체적으로, β-아밀로이드(Aβ)의 생산에 필요한 폴리펩티드의 생리학적 상호작용을 조절하도록 설계된 일군의 프리세닐린(presenilin)/G-단백질/c-src 결합 폴리펩티드 및 소형 분자 약제에 관계한다.

알츠하이머병(AD)은 중년기 내지 말년기 동안 점진적인 기억 손상 및 인식과 지적 감퇴로 특성화되는 인간 중추신경계(central nervous system)의 변성 질환이다. 상기 질환은 다양한 신경병증 특징을 동반하는데, 이들 중에서 첫 번째 특징은 뇌에서 아밀로이드 플라크의 존재 및 뉴런(neuron)의 신경섬유 변성(neurofibrillary degeneration)이다. 상기 질환의 병인(etiology)은 복합적인데, 다만 AD 사례의 대략 10%는 가족성(familial)이고 상염색체 우성 형질(autosomal dominant trait)로서 유전되는 것으로 생각된다. 이들 유전된 형태의 AD 사이에, 최소한 4가지 상이한 유전자가 존재하는데, 이들 변이체 중에서 일부는 상기 질환에 대한 유전된 취약성(susceptibility)을 공여한다. 아포리포단백질 E(Apolipoprotein E, ApoE) 유전자의 σ4(Cys112Arg) 대립유전자 다형성(allelic polymorphism)은 말년에 발병하는 상당한 비율의 AD 사례와 연관하였다. 65세 이전에 발병하는 극히 낮은 비율의 가족성 사례는 염색체 21 상에서 β-아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전자에서 돌연변이와 연관하였다. 더욱 높은 비율의 조기 발병 AD 사례와 연관된 세 번째 좌위는 최근에, 염색체 14q24.3 상에서 확인되었다. 대부분(70-80%)의 유전성 조기 발병 AD 유전자는 염색체 14 상에 위치하고, 단백질 프리세닐린-1(PS1) 내에서 20개 이상의 상이한 아미노산 치환 중에서 하나로부터 기인하는 것으로 생각된다. 염색체 1 상에서 유사하지만 빈도가 덜한 AD-위험 좌위는 단백질, 프리세닐린-2(PS-2, PS-1에 매우 상동함)를 인코딩한다. mRNA 탐지에 기초하여, 이들 프리세닐린은 편재성으로 발현되는 단백질인 것으로 생각되는데, 이는 이들 단백질이 많은 세포형에 의해 요구되는 정상적인 하우스키핑 단백질(housekeeping protein)임을 암시한다.

프리세닐린 1은 43-45 kDa 폴리펩티드이고, 프리세닐린 2는 53-55 kDa 폴리펩티드이다. 프리세닐린은 세제 민감한(detergent sensitive) 고분자량 복합체로 존재하는 막 통과 단백질이다. 프리세닐린 이외에, 이들 복합체의 3가지 단백질 성분이 알려져 있다.

본 발명의 요약

본 발명에서는 프리세닐린의 활성을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 방법과 조성물을 제시한다. 따라서 본 발명에서 제시된 방법과 조성물은 (1): β-APP의 세포외 N-말단 도메인과 PS-1 또는 PS-2의 결합을 간섭함으로써; 또는 (2) 저해제(inhibiting agent)로서 소형 펩티드모방체 분자, 또는 β-APP 또는 PS 분자의 상호작용 표면(interacting surface) 상에서 에피토프(epitope)를 지향하는 항체 분자의 소형 단편을 이용함으로써 뇌에서 Aβ의 생산을 조절하는데 이용될 수 있다. 한 측면에서, 펩티드는 PS-1 또는 -2의 가용성 N-말단 도메인이다.

한 구체예에서, 프리세닐린(presenilin) G-단백질 결합된 수용체(GPCR) 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: a) 프리세닐린에 G-단백질의 결합을 가능하게 하는 조건하에 프리세닐린 또는 이의 단편을 G-단백질과 접촉시키는 단계; b) a) 단계 이전에, a) 단계와 동시에, 또는 a) 단계 이후에, 프리세닐린 또는 이의 단편을 작용제와 접촉시키는 단계; c) G-단백질에 프리세닐린-매개된 결합을 모니터링하는 단계; d) 상기 작용제가 G-단백질에 프리세닐린 결합을 조절하는 지를 결정하고, 따라서 프리세닐린 G-단백질 결합된 수용체(GPCR) 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 단계. 일부 측면에서, 조절은 G-단백질에 프리세닐린 결합의 저해에 의해 달성된다. 다른 측면에서, 조절은 G-단백질에 프리세닐린 결합을 활성화시킴으로써 달성된다. 프리세닐린은 프리세닐린-1(PS-1) 또는 프리세닐린-2(PS-2)일 수 있다. G-단백질은 G_o, G_s, G_i, G_z, 또는 G_q일 수 있다.

본 발명에서는 알츠하이머병을 치료하거나, 또는 알츠하이머병의 발병을 저해하는 방법을 더욱 제시하고, 이들 방법은 개체를 앞서 기술된 방법에 의해 확인된 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 측면에서, 작용제에는 자연 발생 또는 합성 폴리펩티드 또는 올리고펩티드, 펩티드모방체, 소형 유기 분자, 폴리사카라이드, 지질, 지방산, 폴리뉴클레오티드, RNAi 또는 siRNA, asRNA, 또는 올리고뉴클레오티드가 포함된다.

본 발명에서 제시된 방법은 시험관내에서 또는 생체내에서 달성된다. 일부 측면에서, 이들 방법에는 프리세닐린을 G-단백질과 접촉시키는 단계 이전에, 이러한 단계와 함께, 또는 이러한 단계 이후에 프리세닐린을 β-APP와 접촉시키는 단계가 더욱 포함된다.

다른 구체예에서, 프리세닐린-매개된 Src 단백질 키나아제 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: a) 프리세닐린에 β-APP의 결합을 가능하게 하는 조건하에 프리세닐린 또는 이의 단편을 β-APP와 접촉시키는 단계; b) a) 단계 이전에, a) 단계와 동시에, 또는 a) 단계 이후에, 프리세닐린 또는 이의 단편을 작용제와 접촉시키는 단계; c) 프리세닐린-매개된 Src 단백질 키나아제 활성을 모니터링하는 단계; d) 상기 작용제가 프리세닐린-매개된 Src 단백질 키나아제 활성을 조절하는 지를 결정하는 단계.

또한, 본 발명에서는 신경변성 질환을 치료하기 위한 조성물과 방법, 더욱 구체적으로, β-아밀로이드(Aβ)의 생산에 필요한 폴리펩티드의 생리학적 상호작용을 조절하도록 설계된 일군의 프리세닐린(presenilin)/G-단백질/c-src 결합 폴리펩티드 및 소형 분자 약제가 제시된다. 상기 올리고펩티드는 알츠하이머병(AD)에서 일차 신경독성제(neurotoxic agent)이다. 본 발명에서는 AD에서 신경독성(neurotoxicity)을 현저하게 감소시키거나, 또는 상기 질환의 발병을 지연시키거나, 또는 상기 질환의 심각도(severity)를 감소시키는 정도까지 뇌에서 Aβ의 양을 감소시키는 방법과 조성물을 제시한다. 이런 방법과 조성물은 알츠하이머병의 신호전달(signaling)과 진행(progression)을 조절하고 기억을 향상시키는데 유용하다.

본 발명에서는 또한, PS-1 또는 PS-2와 G-단백질 G_oA와 G_oB의 상호작용을 저해하는 소형 분자 작용제로 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시한다. PS-1 또는 PS-2의 세포질 C-말단과 다른 도메인은 G_oA 및/또는 G_oB와 PS의 상호작용 부위인 것으로 밝혀졌고, 또한 이러한 G_o-PS 세포내 결합은 아마도, 이러한 결합 과정의 하류 결과(downstream result)를 통하여 차후 Aβ 생산에 필요한 것으로 밝혀졌다.

유사하게, 본 발명에서는 PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포를 G_o에 PS-1 및/또는 PS-2 결합의 하류 결과, 예를 들면, 인지질가수분해효소 C로 G_o 활성화를 간섭하는 작용제와 접촉시킴으로써 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시한다.

또한, 본 발명에서는 Src 계통의 티로신 키나아제의 구성원의 활성을 간섭하도록 선택된 소형 분자, 펩티드 또는 항체의 이용으로 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시한다.

또한, 본 발명에서는 PS-1 및/또는 PS-2와 β-APP 사이에 상호작용을 간섭하도록 선택된 소형 분자, 펩티드 또는 항체의 이용으로 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시한다.

게다가, 본 발명에서는 β-APP를 발현하지만 PS를 발현하지 않는 첫 번째 형질감염된 세포형과 PS를 발현하지만 β-APP를 발현하지 않는 두 번째 세포형으로 구성되는 세포 배양계(cell culture system)에서 Aβ 생산의 저해물질을 평가하는 방법을 제시한다. 이러한 혼합된 세포 배양액에 추가된 작용제의 저해 효과는 (a) PS-1과 PS-2 및 G_oA와 G_oB의 상호작용, (b) Src 계통의 티로신 키나아제, 또는 (c) βAPP의 N-말단 도메인 및 PS-1 및/또는 PS-2의 N-말단 도메인의 상호작용의 여러 가능한 하류 효과의 활성으로부터 측정될 것이다.

본 발명에서는 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드의 N-말단 단편의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 단리된 폴리펩티드를 제시한다. 한 구체예에서, 단리된 폴리펩티드는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성된다: (i) DEEEDEEL(서열 번호 5), (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (iii) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6), (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)의 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (vi) RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7), (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, 그리고 (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합한다. 한 구체예에서, 펩티드는 대략 5-80 아미노산 길이의 N-말단 단편의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 아미노산 1에서부터 대략 아미노산 80까지 서열 번호 2 또는 4에서 기재된 바와 같은 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, 펩티드는 정제, 또는 올리고머의 형성에 유용한 두 번째 펩티드에 연결될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 제약학적으로 허용되는 담체 내에 상기 확인된 단리된 폴리펩티드 중에서 2개 이상을 포함하는 조성물을 제시한다. 펩티드는 아세틸화 또는 글리코실화될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 프리세닐린 또는 β-APP와 상호작용하는 최소한 2개의 펩티드를 포함하는 올리고머를 제시한다. 최소한 2개의 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있고, 또는 직접적으로 융합/연결되거나 연결 도메인 또는 펩티드에 의해 융합/연결될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 펩티드 또는 올리고머를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 함입(incorporation)될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 숙주 세포 내로 형질감염(transfection) 또는 형질전환(transformation)될 수 있다.

본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 발현시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에서는 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 β-APP와 프리세닐린-1(PS-1) 및/또는 프리세닐린-2(PS-2)의 세포간 결합, 또는 G-단백질의 활성화를 간섭하는 간섭제(interfering agent)를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 간섭제는 프리세닐린-1 또는 -2의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 세포외 도메인은 PS-1 또는 PS-2의 N-말단 영역, 또는 이의 올리고머를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 간섭제는 PS-1 또는 -2의 가용성 N-말단 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 간섭제는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: (i) DEEEDEEL(서열 번호 5), (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (iii) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6), (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)의 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (vi) RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7), (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, 그리고 (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합한다.

또한, 본 발명에서는 Aβ의 생산을 저해하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 프리세닐린-1 또는 -2의 세포외 도메인을 포함하는 펩티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포외 도메인은 PS-1 또는 PS-2의 N-말단 영역, 또는 이의 올리고머를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 펩티드는 PS-1 또는 -2의 가용성 N-말단 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 펩티드는 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: (i) DEEEDEEL(서열 번호 5), (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (iii) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6), (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)의 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (vi) RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7), (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, 그리고 (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 제약학적 조성물 내에 전술한 펩티드 중에서 2개 이상의 조합을 포함한다.

또한, 본 발명에서는 PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포를 PS-1 및/또는 PS-2와 G-단백질의 상호작용을 저해하는 작용제와 접촉시킴으로써 Aβ의 생산을 저해하거나, 또는 PS-1 및/또는 PS-2의 활성을 변경함으로써 G-단백질의 활성화를 저해하는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 상기 작용제는 G_oA, G_oB, G_s 및/또는 G_q와 함께 PS-1 및/또는 2의 C-말단 꼬리 및/또는 기타 세포질 도메인과 상호작용한다. 더욱 특정한 구체예에서, 펩티드는 PS-2의 세포내 루프 3 또는 PS-1과 PS-2의 C-말단 영역(가령, 아미노산 1-20 및/또는 21-39, 또는 이들 서열에 최소한 95% 동일성을 갖는 펩티드)을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 인식 기능(cognitive function) 및/또는 기억을 향상시키는 방법을 제시한다. 상기 방법은 PS-1 및/또는 PS-2 및 G-단백질, G_oA와 G_oB의 상호작용을 저해하는 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 접근법에서, 작용제는 G_oA 및/또는 G_oB와 상호작용하는 PS-1 및/또는 PS-2의 C-말단 꼬리 및/또는 다른 세포질 도메인과 상호작용한다. 작용제는 또한, PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포를 G_o에 PS-1 및/또는 PS-2 결합의 하류 결과, 예를 들면, 인지질가수분해효소 C로 G_o 활성화를 간섭한다. 다른 접근법에서, 작용제는 PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포 내에서 Src 계통의 티로신 키나아제의 구성원의 활성을 저해한다. 각 사례에서, 작용제는 대조 개체와 비교하여, 인식 기능 및/또는 기억 유지를 향상시키는 양으로 투여될 것이다.

상세한 설명

본 명세서에서, 단수 형태는 달리 명시하지 않는 경우에 복수 대상을 포괄한다. 따라서 가령, "단백질"에 대한 언급은 이런 단백질의 복수 대상을 포괄하고, "세포"에 대한 언급은 당분야에 공지된 한 가지 이상의 세포를 포괄한다.

또한, "또는"의 이용은 달리 명시되지 않으면, "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다", "포함하는", "보유한다", "보유하는", "갖는다", 그리고 "갖는"은 동의어로서 이용되고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

또한, 다양한 구체예의 설명에서 용어 "포함하는"이 이용되는 경우에, 당업자는 일부 특정한 경우에, 구체예가 술어"본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"을 이용하여 대안적으로 기술될 수 있음을 이해할 것이다.

달리 정의하지 않는 경우에, 본 명세서에 이용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 인지되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 물질이 본 발명의 방법과 조성물의 실시에 이용될 수 있긴 하지만, 전형적인 방법, 장치, 물질이 아래에 기술된다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원의 출원일에 앞서 그들의 공개를 위하여 제공된다. 본원에 언급된 어떤 간행물도 본 출원을 앞서는 선행 기술로서 간주되지 않는다.

본 발명에서는 알츠하이머병과 장애의 치료, 그리고 프리세닐린과 β-APP의 상호작용에 의해 조절된 뉴런 발달과 활성에 유용한 방법과 조성물을 제시한다. 본 발명은 프리세닐린 -1 및/또는 -2와 β-APP의 상호작용이 Aβ의 생산을 유발한다는 것을 증명하고, 또한 프리세닐린이 β-APP에 결합 시에 G-단백질을 활성화시킨다는 것을 증명한다.

본 발명에서는 β-아밀로이드 전구체 단백질, β-APP, 그리고 PS-1 또는 -2가 세포간 신호전달 시스템의 성분이라는 것을 증명한다. β-APP의 하나 이상의 형태는 그들의 개별 세포 막으로부터 돌출되는 세포외 도메인을 통해 PS-1, 또는 PS-2에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 생체내 결합은 정상적인 신경 생리 또는 발달에 유의한 세포간 신호전달 사건을 유도한다. Aβ의 형성과 세포 방출, 그리고 뇌 영역에서 이의 느린 축적을 유발하는 이러한 체강 분자 결합(transcellular molecular binding)의 부산물, 소포 형성(vesicle formation)의 과정, 세포 내재화(cellular internalization), 그리고 단백분해성 분해(proteolytic degradation)가 추진된다.

본 발명에서는 PS-1, PS-2 및 β-APP가 세포간 신호전달에서 일정한 역할을 한다는 것을 증명한다. 이들 3가지 단백질은 PS 단백질을 직접적으로 또는 간접적으로 필요로 하는 β-APP의 Aβ로의 단백분해 단편화(proteolytic fragmentation)에서 그들의 개별 역할에 대하여 조사되었다. 이에 더하여, 한 세포 표면 상에서 하나 이상의 형태의 β-APP 및 다른 세포 표면 상에서 PS-1(또는 PS-2)은 정상적인 생리에서 일정한 역할을 갖는 세포간 신호전달 시스템의 특정한 리간드와 수용체 성분일 수 있다. 본 발명에서는 PS 단백질에 β-APP의 세포간 표면 결합이 정상 생리에서 부착 세포 중의 한쪽 또는 양쪽 내에서 신호전달 과정을 유도하는 기능을 하고, 궁극적으로 생물체에 중요한 발달적 결과(developmental outcome)를 유도한다는 증거를 제시한다.

용어 "아밀로이드 베타 펩티드"는 아밀로이드 베타 전구체 단백질(APP)로부터 가공된 아밀로이드 베타 펩티드를 의미한다. 가장 일반적인 펩티드에는 아밀로이드 베타 펩티드 1-40, 1-42, 11-40과 11-42가 포함된다. 덜 우세한 다른 아밀로이드 베타 펩티드 화학종(species)은 x-42(여기서, x는 2-10 및 12-17 범위이다) 및 1-y(여기서, y는 24-39 및 41 범위이다)로 기술된다. 기술 설명의 목적으로, "x"는 2-17의 값을 갖고, "y"는 24 내지 41의 값을 갖는다.

프리세닐린은 한 가지 이상의 상이한 예측 알고리즘에 의해, 또는 실험적 단백분해 용해 실험, 용해도 분석평가 등에 의해 확인될 수 있는 다수의 도메인을 보유한다. 프리세닐린-1(PS-1)은 하기에 설명된 바와 같은 다수의 도메인을 보유한다. 이들 도메인은 폴리펩티드를 발현하는 생물체에 따라, 어느 한쪽 단부에서 1개 내지 5개 아미노산이 변할 수 있을 것으로 인식될 것이다. 한 구체예에서, PS-1 N-말단 도메인은 서열 번호 2의 잔기 x1 내지 대략 x2를 포함하고, 여기서 x1은 서열 번호 2의 아미노산 1, 2, 3, 4 또는 5를 포함하고, 그리고 x2는 서열 번호 2의 아미노산 79, 80, 81, 82 또는 83을 포함한다. 한 구체예에서, N-말단 도메인 단편은 5 내지 81개 아미노산 길이(가령, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80개 아미노산 길이)의 펩티드를 포함한다. 이런 펩티드 단편(가령, 가용성 단편)은 βAPP 결합제로서, 또는 프리세닐린-1의 N-말단 세포외 도메인에 특이적인 항체의 개발에 유용하다. N-말단 도메인은 아미노산 82-100을 포함하는 첫 번째 막통과 도메인(TM-1)의 전체 또는 단편을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, TM-1 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 x2 내지 대략 아미노산 x3을 포함하고, 여기서 x2는 서열 번호 2의 아미노산 79, 80, 81, 82, 또는 83을 포함하고, 그리고 x3은 서열 번호 2의 아미노산 98, 99, 100, 101 또는 102를 포함한다. 프리세닐린-1의 첫 번째 TM 도메인의 단편을 더욱 포함하는 프리세닐린 1의 N-말단 단편은 활성 G-단백질 도메인이 없는 막 결합된 경쟁적 저해물질을 생산하는데 이용될 수 있다. 프리세닐린-1의 첫 번째 세포질 루프 1은 서열 번호 2의 아미노산 x3 내지 대략 x4를 포함하고, 여기서 x3은 서열 번호 2의 아미노산 98, 99, 100, 101, 또는 102를 포함하고, 그리고 x4는 아미노산 130, 131, 132, 133 또는 134를 포함한다. 프리세닐린-1의 두 번째 막통과 루프(TM-2)는 서열 번호 2의 아미노산 x4 내지 대략 x5를 포함하고, 여기서 x4는 서열 번호 2의 아미노산 130, 131, 132, 133 또는 134를 포함하고, 그리고 x5는 서열 번호 2의 아미노산 152, 153, 154, 155 또는 156을 포함한다. 프리세닐린-1 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 x5 내지 대략 x6을 포함하는 두 번째 세포외 도메인(형질외 1)을 더욱 포함하고, 여기서 x5는 서열 번호 2의 아미노산 152, 153, 154, 155 또는 156을 포함하고, 그리고 x6은 서열 번호 2의 아미노산 161, 162, 163, 164, 또는 165를 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 아미노산 x6 내지 대략 x7을 포함하는 세 번째 막통과 도메인(TM-3)을 더욱 포함하고, 여기서 x6은 서열 번호 2의 아미노산 161, 162, 163, 164 또는 165를 포함하고, 그리고 x7은 아미노산 182, 183, 184, 185, 또는 186을 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 아미노산 x7 내지 대략 x8을 포함하는 두 번째 세포질 루프(루프 3/세포질 루프 2)를 포함하고, 여기서 x7은 서열 번호 2의 아미노산 182, 183, 184, 185 또는 186을 포함하고, 그리고 x8은 서열 번호 2의 아미노산 192, 193, 194, 195 또는 196을 포함한다. 프리세닐린-1의 네 번째 막통과 도메인(TM-4)은 일반적으로, 서열 번호 2의 아미노산 x8 내지 대략 x9를 포함하는 것으로 기술될 수 있는데, 여기서 x8은 서열 번호 2의 아미노산 192, 193, 194, 195 또는 196을 포함하고, 그리고 x9는 서열 번호 2의 아미노산 211, 212, 213, 214 또는 215를 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 대략 x9 내지 대략 x10을 포함하는 세 번째 세포외 도메인(루프 4/형질외 루프 2)을 포함하고, 여기서 x9는 서열 번호 2의 아미노산 211, 212, 213, 214 또는 215를 포함하고, 그리고 x10은 서열 번호 2의 아미노산 217, 218, 219, 220 또는 221을 포함한다. 프리세닐린-1의 다섯 번째 막통과 도메인(TM-5)은 일반적으로, 서열 번호 2의 아미노산 x10 내지 대략 x11을 포함하는 것으로 기술될 수 있고, 여기서 x10은 서열 번호 2의 아미노산 217, 218, 219, 220 또는 221을 포함하고, 그리고 x11은 서열 번호 2의 아미노산 236, 237, 238, 239 또는 240을 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 아미노산 x11 내지 x12를 포함하는 세 번째 세포질 도메인(루프 5/세포질 3)을 더욱 포함하고, 여기서 x11은 서열 번호 2의 아미노산 236, 237, 238, 239 또는 240을 포함하고, 그리고 x12는 서열 번호 2의 아미노산 241, 242, 243, 244 또는 245를 포함한다. 여섯 번째 막통과 도메인(TM-6)은 일반적으로, 서열 번호 2의 x12 내지 대략 x13을 포함하는 서열에 의해 지칭되고, 여기서 x12는 서열 번호 2의 아미노산 241, 242, 243, 244 또는 245를 포함하고, 그리고 x13은 서열 번호 2의 아미노산 260, 261, 262, 263 또는 264를 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 서열 x13 내지 대략 x14를 포함하는 세 번째 세포질 도메인(루프 6/형질외 3)을 더욱 포함하고, 여기서 x13은 서열 번호 2의 아미노산 260, 261, 262, 263 또는 264를 포함하고, 그리고 x14는 서열 번호 2의 아미노산 405, 406, 407, 408 또는 409를 포함한다. 프리세닐린-1은 서열 번호 2의 서열 x14 내지 대략 x15를 포함하는 일곱 번째 막통과 도메인(TM-7)을 더욱 포함하고, 여기서 x14는 서열 번호 2의 아미노산 405, 406, 407, 408 또는 409를 포함하고, 그리고 x15는 서열 번호 2의 아미노산 427, 428, 429, 430 또는 431을 포함한다. C-말단 세포질 꼬리(C-꼬리/세포질)는 서열 번호 2의 서열 x15 내지 대략 x16을 포함하고, 여기서 x15는 서열 번호 2의 아미노산 427, 428, 429, 430 또는 431을 포함하고, 그리고 x16은 서열 번호 2의 아미노산 462, 463, 464, 465, 466 또는 467을 포함한다.

PS-1

도메인 잔기 번호* 서열

NH2 1-81 MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHLSNTVR

SQNDNRERQEHNDRESLGHPEPLSNGRP

QGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAKH

TM-1 82-100 VIMLFVPVTLCMVVVVATI

루프 1(세포질 1) 101-132 KSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHS

TM-2 133-154 ILNAAIMISVIVVMTILLVVLY

루프 2(형질외 1) 155-163 KYRCYKVIH

TM-3 164-184 AWLIISSLLLLFFFSFIYLGE

루프 3(세포질 2) 185-194 VFKTYNVAVD

TM-4 195-213 YITVALLIWNFGVVGMISI

루프 4(형질외 2) 214-219 HWKGPL

TM-5 220-238 RLQQAYLIMISALMALVFI

루프 5(세포질 3) 239-243 KYLPE

TM-6 244-262 WTAWLILAVISVYDLVAVL

루프 6(형질외 3) 263-407 CPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIYSS

TMVWLVNMAEGDPEAQRRVSKNSKYN

AESTERESQDTVAENDDGGFSEEWEAQR

DSHLGPHRSTPESRAAVQELSSSILAGEDP

EERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASATASGDWNTT

TM-7 408-429 IACFVAILIGLCLTLLLLAIF

C-꼬리(세포질) 430-467 KKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQ

*서열 번호 2를 지칭한다

프리세닐린-2(PS-2)는 하기에 열거된 바와 같은 다수의 도메인을 보유한다. 이들 도메인은 폴리펩티드를 발현하는 생물체에 따라, 어느 한쪽 단부에서 1개 내지 5개 아미노산이 변할 수 있을 것으로 인식될 것이다. 한 구체예에서, PS-2 N-말단 도메인은 서열 번호 4의 잔기 x1 내지 대략 x2를 포함하고, 여기서 x1은 서열 번호 4의 아미노산 1, 2, 3, 4 또는 5를 포함하고, 그리고 x2는 서열 번호 4의 아미노산 85, 86, 87, 88 또는 90을 포함한다. 한 구체예에서, N-말단 도메인 단편은 5 내지 87개 아미노산 길이(가령, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 또는 80개 아미노산 길이)의 펩티드를 포함한다. 이런 펩티드 단편(가령, 가용성 단편)은 βAPP 결합제로서, 또는 프리세닐린-2의 N-말단 세포외 도메인에 특이적인 항체의 개발에 유용하다. N-말단 도메인은 아미노산 87-106을 포함하는 첫 번째 막통과 도메인(TM-1)의 전체 또는 단편을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, TM-1 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 x2 내지 대략 아미노산 x3을 포함하고, 여기서 x2는 서열 번호 4의 아미노산 85, 86, 87, 88 또는 90을 포함하고, 그리고 x3은 서열 번호 4의 아미노산 104, 105, 106, 107 또는 108을 포함한다. 프리세닐린-2의 첫 번째 TM 도메인의 단편을 더욱 포함하는 프리세닐린 1의 N-말단 단편은 활성 G-단백질 도메인이 없는 막 결합된 경쟁적 저해물질을 생산하는데 이용될 수 있다. 프리세닐린-2의 첫 번째 세포질 루프 1은 서열 번호 4의 아미노산 x3 내지 대략 x4를 포함하고, 여기서 x3은 서열 번호 4의 아미노산 104, 105, 106, 107 또는 108을 포함하고, 그리고 x4는 서열 번호 4의 아미노산 136, 137, 138, 139 또는 140을 포함한다. 프리세닐린-2 (TM-2)의 두 번째 막통과 루프는 서열 번호 4의 아미노산 x4 내지 대략 x5를 포함하고, 여기서 x4는 서열 번호 4의 아미노산 136, 137, 138, 139 또는 140을 포함하고, 그리고 x5는 서열 번호 4의 아미노산 158, 159, 160, 161 또는 162를 포함한다. 프리세닐린-2 폴리펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 x5 내지 대략 x6을 포함하는 두 번째 세포외 도메인(형질외 1)을 더욱 포함하고, 여기서 x5는 서열 번호 4의 아미노산 158, 159, 160, 161 또는 162를 포함하고, 그리고 x6은 서열 번호 4의 아미노산 167, 168, 169, 170 또는 171을 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 아미노산 x6 내지 대략 x7을 포함하는 세 번째 막통과 도메인 (TM-3)을 더욱 포함하고, 여기서 x6은 서열 번호 4의 아미노산 167, 168, 169, 170 또는 171을 포함하고, 그리고 x7은 서열 번호 4의 아미노산 187, 188, 189, 190 또는 191을 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 아미노산 x7 내지 대략 x8을 포함하는 두 번째 세포질 루프 (루프 3/세포질 루프 2)를 포함하고, 여기서 x7은 서열 번호 4의 아미노산 187, 188, 189, 190 또는 191을 포함하고, 그리고 x8은 서열 번호 4의 아미노산 198, 199, 200, 201 또는 202를 포함한다. 프리세닐린-2의 네 번째 막통과 도메인(TM-4)은 일반적으로, 서열 번호 4의 아미노산 x8 내지 대략 x9를 포함하는 것으로 기술될 수 있고, 여기서 x8은 서열 번호 4의 아미노산 198, 199, 200, 201 또는 202를 포함하고, 그리고 x9는 서열 번호 4의 아미노산 217, 218, 219, 220 또는 221을 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 대략 x9 내지 대략 x10을 포함하는 세 번째 세포외 도메인(루프 4/형질외 루프 2)을 포함하고, 여기서 x9는 서열 번호 4의 아미노산 217, 218, 219, 220 또는 221을 포함하고, 그리고 x10은 서열 번호 4의 아미노산 223, 224, 225, 226 또는 227을 포함한다. 프리세닐린-2의 다섯 번째 막통과 도메인(TM-5)은 일반적으로, 서열 번호 4의 아미노산 x10 내지 대략 x11을 포함하는 것으로 기술될 수 있고, 여기서 x10은 서열 번호 4의 아미노산 223, 224, 225, 226 또는 227을 포함하고, 그리고 x11은 서열 번호 4의 아미노산 242, 243, 244, 245 또는 246을 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 아미노산 x11 내지 x12를 포함하는 세 번째 세포질 도메인 (루프 5/세포질 3)을 더욱 포함하고, 여기서 x11은 서열 번호 4의 아미노산 242, 243, 244, 245 또는 246을 포함하고, 그리고 x12는 서열 번호 4의 아미노산 247, 248, 249, 250 또는 251을 포함한다. 여섯 번째 막통과 도메인(TM-6)은 일반적으로, 서열 번호 4의 x12 내지 대략 x13을 포함하는 서열에 의해 지칭되고, 여기서 x12는 서열 번호 4의 아미노산 247, 248, 249, 250 또는 251을 포함하고, 그리고 x13은 서열 번호 4의 아미노산 266, 267, 268, 269 또는 270을 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 서열 x13 내지 대략 x14를 포함하는 세 번째 세포질 도메인(루프 6/형질외 3)을 더욱 포함하고, 여기서 x13은 서열 번호 4의 아미노산 266, 267, 268, 269 또는 270을 포함하고, 그리고 x14는 서열 번호 4의 아미노산 385, 386, 387, 388 또는 389를 포함한다. 프리세닐린-2는 서열 번호 4의 서열 x14 내지 대략 x15을 포함하는 일곱 번째 막통과 도메인(TM-7)을 더욱 포함하고, 여기서 x14는 서열 번호 4의 아미노산 385, 386, 387, 388 또는 389를 포함하고, 그리고 x15는 서열 번호 4의 아미노산 407, 408, 409, 410 또는 411을 포함한다. C-말단 세포질 꼬리(C-꼬리/세포질)는 서열 번호 4의 서열 x15 내지 대략 x16을 포함하고, 여기서 x15는 서열 번호 4의 아미노산 407, 408, 409, 410 또는 411을 포함하고, 그리고 x16은 서열 번호 4의 아미노산 443, 444, 445, 446, 447 또는 448을 포함한다.

PS-2

도메인 잔기 번호* 서열

NH2 1-87 MLTFMASDSEEEVCDERTSLMSAESPTPRS

CQEGRQGPEDGENTAQWRSQENEEDGEED

PDRYVCSGVPGRPPGLEEELTLKYGAKH

TM-1 88-106 VIMLFVPVTLCMIVVVATI

루프 1(세포질 1) 107-138 KSVRFYTEKNGQLIYTTFTEDTPSVGQRLLNS

TM-2 139-160 VLNTLIMISVIVVMTIFLVVLY

루프 2(형질외 1) 161-169 KYRCYKFIH

TM-3 170-189 GWLIMSSLMLLFLFTYIYLG

루프 3 (세포질 2) 190-200 EVLKTYNVAMD

TM-4 201-219 YPTLLLTVWNFGAVGMVCI

루프 4(형질외 2) 220-225 HWKGPL

TM-5 226-244 VLQQAYLIMISALMALVFI

루프 5 (세포질 3) 245-249 KYLPE

TM-6 250-268 WSAWVILGAISVYDLVAVL

루프 6(형질외 3) 269-387 CPKGPLRMLVETAQERNEPIF

PALIYSSAMVWTVGMAKLDPSSQGALQLPYDPE

MEEDSYDSFGEPSYPEVFEPPLTGYPGEELEEEEE

RGVKLGLGDFIFYSVLVGKAAATGSGDWNT

TM-7 388-409 TLACFVAILIGLCLTLLLLAVF

C- 꼬리(세포질) 410-448 KKALPALPISITFGLIFYFSTDNL

VRPFMDTLASHQLYI

*서열 번호 4를 지칭한다

당업자는 이들 도메인의 경계가 근사값이고, 그리고 이런 도메인의 정확한 경계, 예를 들면, 막통과 도메인의 경계가 예측된 것들로부터 1-5개 아미노산에서 상이할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

프리세닐린 폴리펩티드의 세포질 꼬리 도메인의 최대 C-말단 잔기(다른 세포질 도메인과 함께)는 G-단백질과의 상호작용에 관련되는 것으로 생각되고, 따라서 이들 잔기의 치환은 변경된 G-단백질 활성화 또는 결합 기능, 또는 폴리펩티드의 경우에 기능의 부재와 연관될 가능성이 많다.

본 명세서에서, "β-APP 결합 폴리펩티드 또는 펩티드"에는 인간 프리세닐린-1(서열 번호 2), 변이체(가령, 프리세닐린-2; 서열 번호 4) 및 종 상동체, 예를 들면, 뮤린 프리세닐린-1, 이들 프리세닐린 폴리펩티드의 단편, 그리고 그들의 종 상동체가 포함된다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드는 다른 프리세닐린 패밀리 폴리펩티드의 것들과 일치하는 생물학적 활성과 기능을 갖는다. 프리세닐린 패밀리의 폴리펩티드는 발달 동안 뉴런 세포를 비롯한 세포 유형에서 발현된다. 이러한 계통의 폴리펩티드와 연관된 전형적인 생물학적 활성 또는 기능은 β-APP 결합, G-단백질 활성화 및 Aβ 펩티드 형성이다. β-APP 결합 활성은 프리세닐린 폴리펩티드의 N-말단 도메인 및 세포외 루프에서 관찰된다. G-단백질 활성화는 프리세닐린 폴리펩티드의 C-말단 세포질 꼬리 도메인 및 기타 세포질 도메인과 연관된다.

프리세닐린 폴리펩티드, 예를 들면, 인간 프리세닐린-1은 이형타입(heterotypic) 결합 활성을 갖는다; 이들 각 결합 활성은 프리세닐린 폴리펩티드의 세포외 루프 도메인과 연관된다. 따라서 이형타입 결합을 요구하는 용도의 경우에, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에는 최소한 하나의 세포외 루프 도메인을 보유하고 최소한 한 가지 이와 같은 결합 활성을 나타내는 것들이 포함될 것이다. 프리세닐린 폴리펩티드는 또한, 프리세닐린 폴리펩티드의 세포질 도메인(세포질 꼬리 도메인 포함)과 연관된 G-단백질 결합 활성을 갖는다. 따라서 G-단백질 활성화 또는 결합을 요구하는 용도의 경우에, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에는 세포질 꼬리 도메인을 보유하고 G-단백질 결합 활성을 나타내는 것들이 포함될 것이다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에는 또한, 본 발명의 하나 이상의 프리세닐린 폴리펩티드의 최소한 하나의 세포외 루프 도메인 및/또는 세포질 꼬리 도메인, 그리고 이형타입 결합 및/또는 G-단백질 도메인 결합 활성을 갖는 이들 폴리펩티드 중에서 하나의 단편을 포함하는 올리고머 또는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 인간 프리세닐린-1 및 종 상동체, 그리고 다른 프리세닐린 계통 폴리펩티드의 결합 활성(들)은 예로써, 효모 이중-하이브리드 검사법(yeast two-hybrid assay), 또는 프리세닐린 폴리펩티드 및 β-APP 및/또는 G-단백질 도메인-보유 결합 상대 사이에 결합을 측정하는 시험관내 검사법에서 결정될 수 있는데, 여기서 프리세닐린 폴리펩티드 또는 이의 결합 상대는 결합이 탐지될 수 있도록 방사성, 형광, 또는 생물발광 단백질로 표지된다.

본 명세서에서, 용어 "인간 프리세닐린 폴리펩티드 활성"에는 β-APP 결합과 상호작용, 그리고 G-단백질 결합 또는 활성화가 포함된다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 단편, 그리고 이들 폴리펩티드의 다른 유도체가 이들 활성을 나타내는 정도는 표준 검사 방법에 의해 결정될 수 있다. 전형적인 검사법은 본 명세서에서 개시된다; 당업자는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 다른 프리세닐린 계통 구성원의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 다른 유사한 유형의 검사법이 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

인간 프리세닐린-1을 비롯한 프리세닐린 폴리펩티드의 생물학적 활성의 한 가지 측면은 예로써, β-APP에 결합하는 세포외 루프 도메인, 그리고 G-단백질 도메인-보유 폴리펩티드에 결합하는 세포질 꼬리 도메인으로, 특정 결합 상대, 예를 들면, 이형타입 폴리펩티드(β-APP 포함) 및 G-단백질 도메인-보유 폴리펩티드에 결합하는 이러한 폴리펩티드 계통의 구성원의 능력이다. 본 명세서에서, 용어 "결합 상대"에는 리간드, 수용체, 기질, 항체, 기타 프리세닐린 폴리펩티드, 그리고 결합 상대의 특정 부분 및 인간 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 사이에 접촉 또는 근접을 통하여 인간 프리세닐린-1 폴리펩티드와 상호작용하는 임의의 다른 분자가 포함된다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 세포외 N-말단과 루프 도메인이 이형타입 폴리펩티드에 결합하기 때문에, N-말단 80 아미노산 및/또는 하나 이상의 세포외 루프 도메인의 f 단편을 포함하는 유도체 폴리펩티드는 인간 프리세닐린-1 폴리펩티드의 레스트(rest)로부터 별개의 단편으로서, 또는 예로써, 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 가용성 폴리펩티드로서 발현될 때, 결합 상대(가령, β-APP)에 대한 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 결합을 파괴할 것으로 예상된다. 하나 이상의 결합 상대에 결합함으로써, 별개의 세포외 도메인(들) 폴리펩티드는 고유 인간 프리세닐린-1 폴리펩티드(들)에 의한 결합을 예방하고, 따라서 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 이형타입 폴리펩티드(가령, β-APP)의 결합에 의해 매개된 생물학적 활성을 저해하는데 현저한 부정적인 방식으로 작용하고, 따라서 한 측면에서, Aβ의 형성을 예방한다. 인간 프리세닐린-1 및 기타 프리세닐린 계통 폴리펩티드의 생물학적 활성과 상대-결합 특성은 본 명세서에서 기술된 표준 방법과 분석평가에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서에서, 프리세닐린-1과 -2는 활성화될 때 Aβ의 생산 펩티드를 유발하는 GPCR 관련된 막통과 단백질인 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 프리세닐린-1과 -2는 장애와 질환, 예를 들면, 알츠하이머병 발생, 그리고 기억 변형(memory modification)을 비롯한 이와 관련된 장애에 관련된다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 그들의 기질, 리간드, 수용체, 결합 상대, 및/또는 다른 상호작용 폴리펩티드 사이에 상호작용의 차단 또는 저해는 본 발명의 한 측면이고, 그리고 인간 프리세닐린-1과 -2 활성의 저해물질의 이용을 통해 이들 질환과 장애를 치료하거나 완화시키는 방법을 제공한다. 이런 저해물질 또는 길항약의 실례는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.

한 구체예에서, 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 정상적인 기억 및 알츠하이머병 발생과 진행에서 일정한 역할을 수행한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법과 조성물은 프리세닐린과 β-App 또는 G-단백질의 활성화의 상호작용을 예방하는 펩티드, 펩티드유사체, 소형 분자 또는 기타 작용제를 포함하는 프리세닐린-1 또는 -2 활성의 길항약을 함유한다.

인간 프리세닐린-1 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 2에서 기재된 바와 같은 서열을 갖고; (b) 서열 번호 2에서 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 프리세닐린-1 폴리펩티드에 충분한 정도의 아미노산 동일성 또는 유사성을 공유하고; (c) 서열 번호 2의 프리세닐린-1 폴리펩티드와 특정한 구조 도메인을 공유할 것으로 생각되는 폴리펩티드로서 당업자에 의해 확인되고; (d) 프리세닐린 폴리펩티드와 공통의 생물학적 활성을 갖고; 및/또는 (e) 서열 번호 2에서 기재된 바와 같은 서열을 갖는 프리세닐린-1 폴리펩티드에도 특이적으로 결합하는 항체에 결합하는 폴리펩티드이다. 인간 프리세닐린-2 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 4에서 기재된 바와 같은 서열을 갖고; (b) 서열 번호 4에서 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 프리세닐린-1 폴리펩티드에 충분한 정도의 아미노산 동일성 또는 유사성을 공유하고; (c) 서열 번호 4의 프리세닐린-2 폴리펩티드와 특정한 구조 도메인을 공유할 것으로 생각되는 폴리펩티드로서 당업자에 의해 확인되고; (d) 프리세닐린 폴리펩티드와 공통의 생물학적 활성을 갖고; 및/또는 (e) 서열 번호 4에서 기재된 바와 같은 서열을 갖는 프리세닐린-2 폴리펩티드에도 특이적으로 결합하는 항체에 결합하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드는 자연 발생 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있고, 따라서 재조합 프리세닐린 폴리펩티드는 자연 발생 프리세닐린 폴리펩티드와 동일한 구조를 갖거나, 또는 자연 발생 프리세닐린 폴리펩티드와 상이한 구조를 갖도록 생산될 수 있다. 임의의 유형의 변형(가령, 예로써 1-10개 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환; 폴리펩티드의 글리코실화의 상태에서 변화; 3-차원 구조 또는 자기-결합 상태를 변화시키는 재접힘(refolding) 또는 이성화(isomerization); 그리고 다른 폴리펩티드 또는 분자와의 결합에 대한 변화가 포함되지만 이들에 국한되지 않음)에 의해 임의의 인간 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 역시 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드이다. 이런 이유로, 본 발명에 의해 제공된 폴리펩티드에는 본 명세서에서 기술된 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 것들과 유사하지만 변형이 자연적으로 제공되거나 의도적으로 계획된 아미노산 서열로 특징되는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드와 공통으로 생물학적 활성을 공유하는 폴리펩티드는 프리세닐린-1 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 프리세닐린 폴리펩티드 계통의 구성원에 의해 나타나는 생물학적 활성의 실례에는 제한 없이, β-APP와 G-단백질 활성화가 포함된다.

단리된 폴리펩티드 또는 펩티드는 아미노산 서열을 포함하는 분자를 지칭하고, 그리고 상기 아미노산 서열 이외에, 이러한 폴리펩티드 또는 펩티드의 한쪽 또는 양쪽 단부에 공유 연결된 추가 물질을 보유할 수 있고, 1-10개, 10-20개, 20-30개 또는 40-50개의 추가 아미노산 사이에 상기 추가 물질은 폴리펩티드의 한쪽 단부, 각 단부, 또는 양쪽 단부에 공유 연결되고, 그리고 상기 폴리펩티드는 자연 상태로부터 이전되거나, 또는 분자 생물학 또는 펩티드 합성 기술을 이용하여 재조합 방식으로 생산된다.

본 발명에서는 전장 및 성숙 형태의 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드를 모두 제시한다. 전장 폴리펩티드는 최초 번역된 폴리펩티드의 완전한 일차 아미노산 서열을 갖는 것들이다. 전장 폴리펩티드의 아미노산 서열은 예로써, cDNA 분자의 완전한 개방 해독 틀(open reading frame, "ORF")의 번역에 의해 획득될 수 있다. 복수의 mRNA 형태가 대안적 절단접합(alternative splicing)에 의해 또는 복수 번역 개시 부위의 이용에 의해 단일 유전자 좌위(single genetic locus)로부터 생산되면, 여러 전장 폴리펩티드가 단일 유전자 좌위에 의해 인코딩될 수 있다. "성숙 형태"의 폴리펩티드는 번역후 가공(post-translational processing) 단계, 예를 들면, 신호 서열의 절단 또는 프로도메인을 제거하는 단백분해 절단을 겪은 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 전장 폴리펩티드의 복수의 성숙 형태는 예로써, 복수 부위에서 신호 서열의 절단에 의해, 또는 폴리펩티드를 절다하는 프로테아제의 상이한 조절에 의해 생산될 수 있다. 이런 폴리펩티드의 성숙 형태(들)는 적절한 포유동물 세포 또는 기타 숙주 세포에서, 전장 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 의해 획득될 수 있다. 성숙 형태의 폴리펩티드의 서열은 또한, 신호 서열 또는 프로테아제 절단 부위의 확인을 통해, 전장 형태의 아미노산 서열로부터 결정될 수 있다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에는 또한, 전사후 또는 번역후 가공 사건, 예를 들면, 절두되지만 생물학적 활성 폴리펩티드, 예를 들면, 폴리펩티드의 자연 발생 가용성 형태를 산출할 수 있는 대안적 mRNA 가공으로부터 발생하는 것들이 포함된다. 또한, 단백분해(proteolysis), 예를 들면, 폴리펩티드로부터 하나 이상의 말단 아미노산(일반적으로, 1개 내지 5개 말단 아미노산)의 단백분해 제거에 따른 상이한 유형의 숙주 세포에서 발현후 N- 또는 C-말단에서 차이에 기인한 변이체가 본 발명 내에 포함된다.

또한, 본 발명에는 연관된 고유-패턴 글리코실화가 존재하거나 존재하지 않는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드가 포함된다. 효모 또는 포유동물 발현 시스템(가령, COS-1 또는 CHO 세포)에서 발현된 폴리펩티드는 발현 시스템의 선택에 따라, 분자량 및 글리코실화 패턴에서 고유 폴리펩티드와 유사하거나 현저하게 상이할 수 있다. 세균 발현 시스템, 예를 들면, 대장균(E. coli)에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현은 비-글리코실화 분자를 제공한다. 게다가, 소정의 제조물은 폴리펩티드의 복수의 차별적 글리코실화 종류를 포함할 수 있다. 글리코실 기는 전통적인 방법, 특히 글리코펩티다아제(glycopeptidase)를 이용하는 방법을 통해 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 글리코실화 폴리펩티드는 과잉몰(molar excess)의 글리코펩티다아제(Boehringer Mannheim)와 함께 항온처리될 수 있다. 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 종 상동체(가령, 프리세닐린-1 인간과 뮤린 형태)는 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서, "종 상동체"는 소정의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 기원과 상이한 종으로부터 기원하지만 당업자에 의한 측정에서, 소정의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 현저한 서열 유사성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 종 상동체는 단리되고, 그리고 본 명세서에서 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 적절한 프로브 또는 프라이머를 만들고 원하는 종으로부터 적절한 핵산 공급원을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 본 발명에는 또한, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대립형질 변이체(allelic variant); 다시 말하면, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 차이가 유전자 다형성(genetic polymorphism)(개체군내 개체 간에 대립형질 변이)에 기인하는 이런 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 자연-발생 대안적 형태가 포함된다.

본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 단편은 선형이거나, 또는 공지된 방법, 예를 들면, H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) 및 R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114 9245-9253 (1992)에서 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 고리화될 수 있고, 이들 문헌은 본 발명에 참조로서 편입된다. 본 발명의 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편, 그리고 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에는 프리세닐린-1 폴리펩티드 길이의 최소한 25%(가령, 최소한 50%, 또는 최소한 60%, 또는 최소한 70%, 또는 최소한 80%)이고 프리세닐린-1 폴리펩티드 또는 인코딩 폴리뉴클레오티드와 최소한 60% 서열 동일성(가령, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 97.5%, 또는 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%)을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 길이의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드가 포함되고, 여기서 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 정렬될 때 중복 및 동일성이 최대화되도록 이들 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정된다. 또한, 최소한 8개, 또는 최소한 10개, 또는 최소한 15개, 또는 최소한 20개, 또는 최소한 30개, 또는 최소한 40개의 연속 아미노산을 전형적으로 포함하는 분절을 내포하거나 인코딩하는 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편, 그리고 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 포함된다. 이런 폴리펩티드와 폴리펩티드 단편은 또한, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 중에서 한 가지의 임의의 이와 같은 분절과 최소한 70% 서열 동일성(또는 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 97.5%, 최소한 99%, 또는 최소한 99.5%)을 공유하는 분절을 내포할 수 있고, 여기서 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 정렬될 때 중복 및 동일성이 최대화되도록 이들 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 결정된다. 동일성 %는 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정될 수 있다. 대안으로, 2개 아미노산 또는 2개 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 %는 Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)에서 기술되고 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)로부터 입수가능한 GAP 컴퓨터 프로그램, version 6.0을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. GAP 프로그램에 대한 전형적인 디폴트 파라미터(default parameter)에는 (1) Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979에서 기술된 바와 같이, 뉴클레오티드에 대한 1진법 비교 매트릭스(unary comparison matrix)(동일의 경우에 1의 값 및 비-동일의 경우에 0의 값 내포), 그리고 Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986의 가중된 비교 매트릭스(weighted comparison matrix); (2) 각 갭에 대한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호에 대한 추가의 0.10 페널티; 그리고 (3) 엔드 갭(end gap)에 대한 페널티 없음이 포함된다. 서열 비교의 분야에서 평균적 기술자에 의해 이용되는 다른 프로그램, 예를 들면, National Library of Medicine website ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi를 통해 입수가능한 BLASTN 프로그램 version 2.0.9, 또는 UW-BLAST 2.0 알고리즘 역시 이용될 수 있다. UW-BLAST 2.0에 대한 표준 디폴트 파라미터 설정은 아래의 인터넷 웹페이지: blast.wustl.edu/blast/README.html#References에서 기술된다. 이에 더하여, BLAST 알고리즘은 BLOSUM64 아미노산 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하고, 그리고 이용될 수 있는 선택적 파라미터(optional parameter)는 아래와 같다: (A) 낮은 조성 복잡성(compositional complexity)(Wootton & Federhen (Computers and Chemistry, 1993)의 SEG 프로그램에 의해 결정됨; 또한 Wootton J C and Federhen S, 1996, Analysis of compositionally biased regions in sequence databases, Methods Enzymol. 266: 554-71 참조)을 갖는 쿼리 서열의 분절, 또는 짧은-주기성 내부 반복(short-periodicity internal repeat)(Claverie & States (Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정됨)으로 구성되는 분절을 감추는 필터의 포함, 그리고 (B) 데이터베이스 서열에 대한 정합(match)을 보고하기 위한 통계학적 유의성 역치(statistical significance threshold), 또는 Karlin and Altschul (1990)의 확률 모형(stochastic model)에 따른 E-스코어(단지 우연히 발견되는 정합의 예측 확률(expected probability); 정합에 기인한 통계학적 유의성이 이러한 E-스코어 역치보다 크면, 상기 정합은 보고되지 않을 것이다); 전형적인 E-스코어 역치 값은 0.5, 또는 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75, 또는 1e-100이다.

본 발명에서는 또한, 이들 폴리펩티드의 일정한 단편 또는 도메인을 포함하는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 가용성 형태, 특히 본 발명의 7-TM 모형에 기초된 세포외 도메인 또는 세포외 도메인의 하나 이상의 단편을 포함하는 것들을 제시한다. 가용성 폴리펩티드는 그들이 발현되는 세포로부터 분리될 수 있는 폴리펩티드이다. 이런 형태에서 폴리펩티드의 세포내와 막통과 도메인의 전부 또는 일부는 결실되고, 따라서 상기 폴리펩티드는 그 자신이 발현되는 세포로부터 완전히 분비된다. 본 발명의 폴리펩티드의 세포내와 막통과 도메인은 서열 정보로부터 이런 도메인의 결정을 위한 공지된 기술에 따라서 확인될 수 있다. 본 발명의 가용성 프리세닐린 폴리펩티드에는 또한, 막통과 영역의 일부를 포함하는 폴리펩티드가 포함되고, 단서로써 상기 가용성 프리세닐린-1 폴리펩티드는 세포로부터 분비될 수 있고, 그리고 전형적으로, 인간 프리세닐린-1 활성(가령, β-APP에 결합하거나, 또는 β-APP와 상호작용하는 능력)을 유지한다. 본 발명의 가용성 프리세닐린 폴리펩티드에는 최소한 하나의 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드의 세포외 부분, 그리고 프리세닐린-1 또는 -2 활성을 갖는 단편을 포함하는 올리고머 또는 융합 폴리펩티드가 더욱 포함된다. 분비된 가용성 폴리펩티드는 예로써, 원심분리에 의해 배양 배지로부터 원하는 폴리펩티드를 발현하는 본래 세포를 분리하고, 그리고 원하는 폴리펩티드의 존재에 대하여 배지(상층액)를 평가함으로써 확인될 수 있다(그리고, 비-가용성 막-결합된 대응물로부터 구별될 수 있다). 배지 내에서 원하는 폴리펩티드의 존재는 상기 폴리펩티드가 세포로부터 분비되었고, 따라서 상기 폴리펩티드의 가용성 형태라는 것을 지시한다. 재조합 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 정제가 조장되는데, 그 이유는 가용성 폴리펩티드가 이들 세포로부터 분리되기 때문이다. 게다가, 가용성 폴리펩티드는 일반적으로, 비경구 투여 및 많은 효소 절차를 위하여 막-결합된 형태보다 적합하기 때문이다.

본 발명의 다른 측면에서, 폴리펩티드는 프리세닐린-1 폴리펩티드 도메인의 다양한 조합, 예를 들면, 세포질 꼬리 도메인 및 세포외 루프 도메인 또는 세포질 꼬리 및 세포질 루프 도메인을 포함한다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에는 세포질 꼬리 도메인과 같은 도메인의 2개 이상의 사본, 세포외 루프 도메인과 같은 도메인의 2개 이상의 사본, 또는 각 도메인의 최소한 하나의 사본을 포함하거나 인코딩하는 것들이 포함되고, 그리고 이들 도메인은 이런 폴리펩티드 내에서 임의의 순서로 존재할 수 있다.

펩티드 또는 DNA 서열 내에서 추가의 변형은 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 폴리펩티드 서열에서 목적되는 변형에는 선별된 아미노산의 변형, 치환, 대체, 삽입 또는 결실일 포함될 수 있다. 가령, 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나, 또는 다른 아미노산으로 대체되어 분자의 형태가 변경되고, 이러한 변경은 접힘(folding) 또는 탈변성(renaturation) 시에 부정확한 분자내 이황화 가교의 형성을 예방할 수 있다. 이런 변경, 치환, 대체, 삽입 또는 결실을 위한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(참조: U.S. Pat. No. 4,518,584). 다른 실례로써, 폴리펩티드 세포외 도메인 내에서 N-당화 부위는 글리코실화가 배제되어 포유동물 및 효모 발현 시스템에서 환원된 탄수화물 유사체의 발현이 가능하도록 변형될 수 있다. 진핵 폴리펩티드에서 N-당화 부위는 아미노산 삼중항 Asn-X-Y로 특징되고, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고, 그리고 Y는 Ser 또는 Thr이다. 이들 삼중항을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 치환, 부가, 또는 결실은 Asn 측쇄에서 탄수화물 잔기의 부착을 예방을 결과할 것이다. Asn이 상이한 아미노산에 의해 대체되도록 선택된 단일 뉴클레오티드의 변경은 예로써, N-당화 부위를 비활성화시키는데 충분하다. 대안으로, Ser 또는 Thr은 다른 아미노산, 예를 들면, Ala로 대체될 수 있다. 폴리펩티드에서 N-당화 부위를 비활성화시키기 위한 공지된 절차에는 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 5,071,972 및 EP 276,846에서 기술된 것들이 포함된다. 본 발명의 범위 내에서 추가의 변이체에는 다른 화학적 모이어티, 예를 들면, 글리코실 기, 지질, 인산염, 아세틸 기 등과의 공유 또는 집합 접합체(conjugate)를 형성함으로써 그들의 유도체가 산출되도록 변형될 수 있는 폴리펩티드가 포함된다. 공유 유도체는 화학적 모이어티를 폴리펩티드의 아미노산 측쇄 상에 또는 N-말단 또는 C-말단에서 기능기에 화학적 모이어티를 연결함으로써 만들어질 수 있다. 그들에 부착된 진단제(검출가능) 또는 치료제를 포함하는 접합체가 본 발명에서 예기된다. 바람직하게는, 이런 변경, 치환, 대체, 삽입 또는 결실은 폴리펩티드 또는 이의 실질적인 등가물의 원하는 활성을 유지한다. 한 가지 실례는 고유 형태와 실질적으로 동일한 결합 친화성으로 결합하는 변이체이다. 결합 친화성은 예로써, U.S. Pat. No. 5,512,457 및 본 명세서에서 기술된 바와 같은 전통적인 절차에 의해 측정될 수 있다.

다른 변이체에는 예로써, N-말단 또는 C-말단 융합체로서 재조합 배양 동안 합성에 의한, 상기 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 공유 또는 집합 접합체가 포함된다. 융합 폴리펩티드의 실례는 올리고머와 관련하여 하기에 논의된다. 게다가, 융합 폴리펩티드는 정제 및 확인을 용이하게 하기 위하여 부가된 펩티드를 포함할 수 있다. 이런 펩티드에는 예로써, poly-His, 또는 U.S. Pat. No. 5,011,912 및 Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988에서 기술된 항원성 확인 펩티드가 포함된다. 이와 같은 한 가지 펩티드는 FLAG？ 펩티드인데, 이는 고도로 항원성이고 특정한 단일클론 항체에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하고, 발현된 재조합 폴리펩티드의 신속한 분석평가 및 용이한 정제를 가능하게 한다. 4E11로 명명된 뮤린 하이브리도마는 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 5,011,912에서 기술된 바와 같이, 일정 이가 금속 양이온의 존재에서 FLAG？ 펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생산한다. 4E11 하이브리도마 세포주는 accession no. HB 9259 하에 American Type Culture Collection에 기탁되었다. FLAG？ 펩티드에 결합하는 단일클론 항체는 Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Conn로부터 구입가능하다.

본 발명에는 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 하나 이상의 단편, 또는 본 명세서에서 개시된 바와 같은 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 임의의 유도체 또는 변이체 형태를 포함하는 올리고머 또는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 특정 구체예에서, 올리고머는 가용성 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드를 포함한다. 올리고머는 이합체, 삼합체, 또는 고등 올리고머를 비롯한 공유 연결된 또는 비-공유-연결된 다합체의 형태일 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 올리고머는 폴리펩티드 성분의 결합 능력을 유지하고, 따라서 이가, 삼가 등의 결합 부위를 제공한다. 대안적 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에 융합된 펩티드 모이어티 사이에 공유 또는 비-공유 상호작용에 의해 연결된 복수의 폴리펩티드를 포함하는 올리고머에 관계하고, 이들 펩티드는 올리고머화를 촉진하는 특성을 갖는다. 류신 지퍼 및 항체로부터 유래된 일정한 폴리펩티드는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 그들에 부착된 폴리펩티드의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩티드에 포함된다.

본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 변이체가 막-전장(membrane-spanning) 도메인을 포함하도록 작제되는 구체예에서, 이들은 막-전장 폴리펩티드를 형성할 것이다. 본 발명의 막-전장 프리세닐린 폴리펩티드는 리간드가 공지되어 있는 수용체 폴리펩티드의 세포외 도메인과 융합될 수 있다. 이런 융합 폴리펩티드는 이후, 막-전장 프리세닐린-1 폴리펩티드에 의해 촉발된 세포내 신호전달 경로를 제어하도록 조작될 수 있다. 세포 막에 걸치는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드는 또한, 프리세닐린-1 세포내 효과를 더욱 조절하기 위하여 세포-표면 수용체의 작동약 또는 길항약, 또는 세포 부착 분자와 융합될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 인터류킨은 프리세닐린-1 폴리펩티드 단편 및 다른 융합 폴리펩티드 도메인 사이에 위치될 수 있다.

면역글로불린-기초된 올리고머. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 단편은 폴리펩티드 결합 부위의 결합가(valency)를 증가시키는 것을 비롯한 많은 목적으로 면역글로불린과 같은 분자에 융합될 수 있다. 가령, 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드의 단편은 (a) 면역글로불린의 Fc 부분에 직접적으로, 또는 링커 펩티드를 통해 융합되거나, 또는 (b) 다른 프리세닐린-1 폴리펩티드에 직접적으로, 또는 링커 펩티드를 통해 융합될 수 있다. 이가 형태의 폴리펩티드의 경우에, 이런 융합은 IgG 분자의 Fc 부분에 이루어질 수 있다. 다른 면역글로불린 아이소타입(isotype) 역시 이런 융합체를 산출하는데 이용될 수 있다. 가령, 폴리펩티드-IgM 융합은 본 발명의 폴리펩티드의 10가(decavalent) 형태를 산출할 것이다. 본 명세서에서 용어 "Fc 폴리펩티드"에는 Fc 영역의 CH 도메인 중에서 하나 또는 전체를 포함하는 항체의 Fc 영역으로 구성되는 폴리펩티드의 고유 및 뮤테인 형태가 포함된다. 이합체화를 촉진하는 힌지 영역을 보유하는 이런 폴리펩티드의 절두된 형태 역시 포함된다. 유용한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체로부터 유래된 Fc 폴리펩티드를 포함한다. 한 가지 대안으로서, 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩티드를 이용하여 올리고머가 제조된다. 항체-유래된 폴리펩티드의 다양한 부분(Fc 도메인 포함)에 융합된 일정한 이종기원성 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조는 예로써, Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:677, 1990); 그리고 Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Polypeptides", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992)에서 기술되었다. 제조 방법 및 면역글로불린-기초된 올리고머의 용도는 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 한 구체예는 본 발명의 폴리펩티드를 항체로부터 유래된 Fc 폴리펩티드에 융합함으로써 산출된 2개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이합체에 관계한다. 폴리펩티드/Fc 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 융합체는 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 폴리펩티드/Fc 융합 폴리펩티드는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 내에서 발현되고, 그리고 항체 분자와 매우 유사하게 조립되고, 그 결과로써 Fc 모이어티 간에 사슬간 이황화 결합이 형성되고 이가 분자가 산출된다. PCT application WO 93/10151(본 발명에 참조로서 편입됨)에서 기술된 한 가지 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 고유 C-말단에 N-말단 힌지 영역으로부터 연장되는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 5,457,035 및 in Baum et al., (EMBO J. 13:3992-4001, 1994)에서 기술된 Fc 뮤테인이다. 이러한 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 변경되고, 아미노산 20이 Leu에서 Glu로 변경되고, 그리고 아미노산 22가 Gly에서 Ala로 변경되는 점을 제외하고, WO 93/10151에서 제공된 고유 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 뮤테인은 Fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 나타낸다. Fc 모이어티를 포함하는 앞서 기술된 융합 폴리펩티드(및 이들로부터 형성된 올리고머)는 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 G 칼럼에 비하여 친화성 크로마토그래피에 의한 용이한 정제의 이점을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 부분을 대체할 수 있다. 융합 폴리펩티드가 항체의 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터 만들어지면, 많게는 4개의 프리세닐린-1 세포외 영역을 보유하는 올리고머를 형성하는 것이 가능하다.

대안으로, 올리고머는 펩티드 링커(스페이서 펩티드)와 함께 또는 이러한 펩티드 링커 없이, 본 발명의 복수의 프리세닐린 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 적절한 펩티드 링커에는 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 4,751,180 및 4,935,233에서 기술된 것들이 포함된다. 원하는 펩티드 링커를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 적절한 전통적인 기술을 이용하여, 본 발명의 프리세닐린 폴리뉴클레오티드 사이에, 그리고 본 발명의 프리세닐린 폴리뉴클레오티드와 동일한 해독 틀 내에 삽입될 수 있다. 가령, 펩티드 링커를 인코딩하는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드는 서열 간에 결찰될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 분리된 본 발명의 2개 내지 4개의 가용성 프리세닐린 폴리펩티드를 포함한다. 적절한 펩티드 링커, 다른 폴리펩티드와 이들의 조합, 그리고 이들의 용도는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 올리고머를 제조하는 다른 방법은 류신 지퍼의 이용을 수반한다. 류신 지퍼 도메인은 그들이 발견되는 폴리펩티드의 올리고머화를 촉진하는 펩티드이다. 류신 지퍼는 여러 DNA-결합 폴리펩티드에서 최초 확인되었고(Landschulz et al., Science 240:1759, 1988), 이후 다양한 상이한 폴리펩티드에서 확인되었다. 공지된 류신 지퍼에는 이합체화 또는 삼합체화되는 자연 발생 펩티드 및 이들의 유도체가 포함된다. 지퍼 도메인(본 명세서에서, 올리고머화, 또는 올리고머-형성 도메인으로 지칭됨)은 종종, 4개 또는 5개 류신 잔기에 다른 아미노산이 산재되는 반복성 헵타드 반복(repetitive heptad repeat)을 포함한다. 류신 지퍼의 용도 및 류신 지퍼를 이용한 올리고머의 제조는 당분야에 널리 공지되어 있다.

폴리펩티드 활성을 전체적으로 또는 부분적으로 유지할 것으로 예상되고 따라서, 스크리닝 또는 다른 면역학적 방법에 유용한 폴리펩티드의 서열의 다른 단편과 유도체 역시 본 명세서를 고려할 때 당업자에 의해 만들어질 수 있다. 이런 변형은 본 발명에 포함된다.

본 발명에서는 β-APP에 결합하고 β-APP의 전장 고유 프리세닐린-1 또는 -2와의 상호작용을 예방함으로써 AD를 치료하는데 유용한 가용성 펩티드 단편을 제시한다. 다른 구체예에서, 가용성 펩티드 단편은 Aβ 생산을 저해함으로써 AD를 치료하는데 유용하다. 이런 가용성 단편은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 프리세닐린의 7-TM 모형에 기초하여 확인되고 개발될 수 있고, 그리고 여기에는 본 발명의 앞서 확인된 임의의 세포외(exoplasmic) 도메인, 단편 및 접합된 형질외 단편이 포함될 수 있다. 유용한 단편에는 아래가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: (i) DEEEDEEL(서열 번호 5)로 구성되는 서열, (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 β-APP에 결합할 수 있고, (iii) 서열 RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6), (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6으로 구성되는 서열, (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)로 구성되는 서열, (vi) 서열 RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7), (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7로 구성되는 서열, (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 그리고 (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 β-APP에 상호작용하거나 결합할 수 있다. 본 발명에서는 80개 아미노산 N-말단 단편 내에서 PS-1 도메인이 β-APP 및 PS-1 발현 세포의 공동-배양액에 첨가될 때, Aβ의 생산을 특이적으로 저해할 수 있다는 것을 증명한다. 이들 펩티드 모두 β-APP 유전자도입 생쥐에서 Aβ 생산을 저해한다. 본 발명에서는 또한, 세포-세포 상호작용이 저해되면, G-단백질 활성화 및 Aβ 생산 역시 저해된다는 것을 증명한다.

본 발명에서는 또한, β-APP 및 PS-1 또는 PS-2의 상호작용에 의해 유도된 G-단백질 활성화의 저해물질을 제시한다. 가령, G-단백질 활성화가 저해되면(β-APP:PS-1 공동-배양액에서 PTx의 존재에 의해), Aβ 생산 역시 저해된다. 따라서 본 발명에서는 G-단백질 활성화 및 GoA 결합에 요구되는 PS-1 세포내 도메인의 서열을 제시한다. 한 구체예에서, 본 발명에서는 PS-1의 첫 20개 아미노산을 포함하는 C-말단 꼬리 서열(N-KKALPALPISITFGLVFYFA-COOH; 서열 번호 8)을 제시한다. 이에 더하여, 본 발명에서는 PS-1의 세포내 루프 3(KYLPE; 서열 번호 2 아미노산 239-243)(이는 PS-2에서 상응하는 도메인에 동일성을 갖는다), 그리고 예로써, N-MALVFIKYLPE-COOH; 서열 번호 9를 비롯한, Go_A에 결합하는 펩티드를 확인한다.

본 발명에는 본 발명의 이런 프리세닐린 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 적절한 공급원으로부터 게놈 또는 cDNA 분자의 분리를 비롯한 여러 방식으로 확인될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 분리를 위한 프로브 또는 프라이머로서, 또는 데이터베이스 검색을 위한 쿼리 서열로서 이용되는, 본 명세서에서 기술된 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 이들 아미노산 서열로부터 "역-번역(back-translation)"에 의해, 또는 코딩 DNA 서열이 확인된 폴리펩티드로 아미노산 동일성의 영역의 확인에 의해 획득될 수 있다. 인간 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드, 또는 인간 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 단편의 원하는 조합을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하고 증폭하기 위하여 널리 공지된 중합효소 연쇄 반응(PCR) 절차가 이용될 수 있다. DNA 단편의 조합의 원하는 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드가 5'와 3' 프라이머로서 이용된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 DNA 단편의 증폭된 조합의 삽입을 용이하게 하는 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)에 대한 인식 부위를 부가적으로 보유할 수 있다. PCR 기술은 Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)에서 기술된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태 둘 모두에서 DNA와 RNA, 그리고 상응하는 상보성 서열이 포함된다. DNA에는 예로써, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 그리고 이들의 조합이 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에는 전장 유전자 또는 cDNA 분자, 그리고 이들의 단편의 조합이 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 공급원으로부터 유래될 수 있지만, 본 발명에는 비-인간 종으로부터 유래된 것들 역시 포함된다.

"단리된 폴리뉴클레오티드"는 자연 발생 공급원으로부터 단리된 폴리뉴클레오티드의 경우에, 상기 폴리뉴클레오티드가 단리된 생물체의 게놈 내에 존재하는 인접한 유전자 서열로부터 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오티드의 경우에, 이런 과정으로부터 발생하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드인 것으로 이해된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 별개의 단편의 형태에서, 또는 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 구조체의 한 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 한 구체예에서, 본 발명은 오염성 내인성 물질이 실질적으로 없는 일정한 단리된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태로, 그리고 표준 생화학적 방법(가령, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에서 개설된 것들)에 의한 성분 뉴클레오티드 서열의 확인, 조작, 그리고 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도로 최소한 1회 단리된 DNA 또는 RNA로부터 유래된다. 이들 서열은 전형적으로, 진핵 유전자 내에 전형적으로 존재하는 내부 비-번역 서열, 또는 인트론(intron)에 의한 끊김없는 개방 해독 틀(open reading frame)의 형태로 제공되고 및/또는 작제된다. 비-번역 DNA의 서열은 개방 해독 틀로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있고, 여기서 상기 서열은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 간섭하지 않는다.

본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드를 제조하는 방법은 하기에 기술된다. 본 발명의 폴리펩티드와 단편의 발현, 단리, 그리고 정제는 아래의 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 적절한 기술에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 발현 제어 서열, 예를 들면, pDC409 벡터(Giri et al., 1990, EMBO J. 13: 2821) 또는 유도체 pDC412 벡터(Wiley et al., 1995, Immunity 3: 673)에 작동가능하게 연결될 수 있다. pDC400 시리즈 벡터는 일시적인 포유동물 발현 시스템, 예를 들면, CV-1 또는 293 세포에 유용하다. 대안으로, 본 발명의 단리된 핵산은 발현 벡터, 예를 들면, pDC312, pDC316, 또는 pDC317 벡터에 연결될 수 있다. pDC300 시리즈 벡터 모두 SV40 복제 기점, CMV 프로모터, 아데노바이러스 3부분 리더, 그리고 SV40 polyA와 종결 신호를 포함하고, 그리고 안정적인 포유동물 발현 시스템, 예를 들면, CHO 세포 또는 이들의 유도체에 유용하다. 다른 발현 제어 서열 및 클로닝 기술, 예를 들면, pMT2 또는 pED 발현 벡터(Kaufman et al., 1991, Nucleic Acids Res 19: 4485-4490; 그리고 Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors. A Laboratory Manual, Elsevier, New York) 및 GATEWAY 벡터(Life Technologies; Rockville, Md.) 역시 폴리펩티드를 재조합 방식으로 생산하는데 이용될 수 있다. attB 서열이 측면에 위치하는 본 발명의 단리된 핵산은 인테그라아제(integrase) 반응을 통해 GATEWAY 벡터, 예를 들면, attP 서열을 포함하는 pDONR201와 재조합되어 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 GATEWAY 시스템에 대한 엔트리 벡터를 제공할 수 있다. 이러한 엔트리 벡터는 다른 적절하게 제조된 발현 제어 서열, 예를 들면, 앞서 기술된 pDC400과 pDC300 시리즈의 것들과 더욱 재조합될 수 있다. 많은 적절한 발현 제어 서열은 당분야에 공지되어 있다. 재조합 폴리펩티드를 발현하는 일반적인 방법 역시 Kaufman, 1990, Methods in Enzymology 185, 537-566에서 기술된다. 본 명세서에서, "작동가능하게 연결된"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 발현 제어 서열이 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 적절한 분자(가령, 중합효소)가 존재할 때 발현되도록 하는 방식으로 구조체, 벡터, 또는 세포 내에 위치된다는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예로서, 최소한 하나의 발현 제어 서열은 재조합 숙주 세포 또는 이의 자손 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되고, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 제어 서열은 예로써, 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection)에 의해, 또는 임의의 다른 적절한 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입되었다. 본 발명의 다른 구체예로서, 최소한 하나의 발현 제어 서열은 재조합 숙주 세포의 게놈 내로 함입되고, 따라서 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 최소한 하나의 발현 제어 서열은 시험관내에서 또는 재조합 숙주 세포 내에서 트란스-작용 인자(trans-acting factor), 예를 들면, 전사 인자(transcription factor)의 작용을 통해 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.

이에 더하여, 적절한 신호 펩티드(고유 또는 이종기원성)를 인코딩하는 서열은 발현 벡터 내로 함입될 수 있다. 신호 펩티드 또는 리더의 선택은 재조합 폴리펩티드가 생산되는 숙주 세포의 유형과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 숙주 세포에서 기능성인 이종기원성 신호 펩티드의 실례에는 U.S. Pat. No. 4,965,195에서 기술된 인터류킨-7(IL-7)에 대한 신호 서열; Cosman et al., Nature 312:768 (1984)에서 기술된 인터류킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 367,566에서 기술된 인터류킨-4 수용체 신호 펩티드; U.S. Pat. No. 4,968,607에서 기술된 타입 I 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드; 그리고 EP 460,846에서 기술된 타입 II 인터류킨-1 수용체 신호 펩티드가 포함된다. 신호 펩티드에 대한 DNA 서열(분비 리더)은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 인 프레임(in frame) 융합될 수 있고, 따라서 상기 DNA가 초기에 전사되고, 그리고 mRNA가 상기 신호 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로 번역된다. 의도된 숙주 세포에서 기능성인 신호 펩티드는 폴리펩티드의 세포외 분비를 촉진한다. 신호 펩티드는 세포로부터 폴리펩티드의 분비후 상기 폴리펩티드로부터 절단된다. 당업자는 또한, 신호 펩티드가 절단되는 위치(들)가 컴퓨터 프로그램에 의해 예측된 위치와 상이할 수 있고, 그리고 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 이용된 숙주 세포의 유형과 같은 인자에 따라 달리질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 폴리펩티드 제조물은 하나 이상의 부위에서 신호 펩티드의 절단으로부터 발생하는, 상이한 N-말단 아미노산을 갖는 폴리펩티드 분자의 혼합물을 포함할 수 있다.

DNA를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 확립된 방법은 기존 문헌(Kaufman, 1990, Large Scale Mammalian Cell Culture, pp. 15-69)에서 기술되었다. 상업적으로 구입가능한 시약, 예를 들면, Lipofectamine 지질 시약(Gibco/BRL) 또는 Lipofectamine-Plus 지질 시약을 이용한 추가의 프로토콜이 세포를 형질감염시키는데 이용될 수 있다(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417). 이에 더하여, 전통적인 절차, 예를 들면, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에서 기술된 것들을 이용하여 포유동물 세포를 형질감염시키는데 전기천공(electroporation)이 이용될 수 있다. 안정된 형질감염체(transformant)의 선별은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 세포독성 약물에 대한 내성을 이용하여 수행될 수 있다. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990에서는 여러 선별 전략, 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 내성을 기술한다. DHFR 선별에 적합한 균주는 CHO 균주 DX-B11일 수 있는데, 이는 DHFR가 결함된다(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). DHFR cDNA를 발현하는 플라스미드는 균주 DX-B11 내로 도입될 수 있고, 그리고 상기 플라스미드를 내포하는 세포만 적절한 선별 배지에서 성장할 수 있다. 발현 벡터 내로 함입될 수 있는 선별가능 마커의 다른 실례에는 항생제, 예를 들면, G418 및 히그로마이신 B에 대한 내성을 공여하는 cDNA가 포함된다. 이러한 벡터를 내포하는 세포는 이들 화합물에 대한 내성의 기초에서 선별될 수 있다.

대안으로, 유전자 산물은 상동 재조합(homologous recombination), 또는 "유전자 표적화(gene targeting)" 기술에 의해 획득될 수 있다. 이런 기술은 목적되는 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하기 위하여, 게놈 상에서 미리 결정된 특정 부위 내에 외인성 전사 제어 요소(exogenous transcription control element)(가령, CMV 프로모터 등)의 도입을 이용한다. 숙주 염색체 또는 게놈 내로 함입의 위치는 유전자의 공지된 위치와 서열을 고려하여, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에서는 또한, 이번에도 숙주 세포로부터 유전자 자체를 단리할 필요 없이 증가된 양의 유전자 산물을 생산하기 위하여, 증폭가능 유전자와 공동으로 외인성 전사 제어 요소의 도입을 예기한다. 상동 재조합 또는 유전자 표적화의 실시는 Schimke, et al. "Amplification of Genes in Somatic Mammalian cells," Methods in Enzymology 151:85-104 (1987), 그리고 Capecchi, et al., "The New Mouse Genetics. Altering the Genome by Gene Targeting," TIG 5:70-76 (1989)에 의해 설명된다.

다양한 유형의 세포가 폴리펩티드의 발현을 위한 적절한 숙주 세포로서 기능할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에는 예로써, COS-7 계열의 원숭이 신장 세포(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991)에서 기술된 바와 같이 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1(ATCC CCL 70)로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주, 인간 신장 293 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상 배수염색체(diploid) 세포, 일차 조직의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포주, 일차 외식체, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포가 포함된다. 대안으로, 하등 진핵생물, 예를 들면, 효모 또는 원핵생물, 예를 들면, 세균에서 폴리펩티드를 생산하는 것이 가능하다. 잠재적으로 적절한 효모 균주에는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 균주, 칸디다(Candida), 또는 이종기원성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 효모 균주가 포함된다. 잠재적으로 적절한 세균 균주에는 대장균(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라(Salmonella typhimurium), 또는 이종기원성 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 세균 균주가 포함된다. 폴리펩티드가 효모 또는 세균에서 만들어지면, 기능성 폴리펩티드를 획득하기 위하여 예로써, 적절한 부위의 인산화 또는 글리코실화로 생산된 폴리펩티드를 변형하는 것이 필요할 수 있다. 이런 공유 부착은 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 단리된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 곤충 발현 벡터 내에 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결하고, 그리고 곤충 발현 시스템을 이용함으로써 생산될 수 있다. 바쿨로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 대한 물질과 방법은 예로써, Invitrogen, San Diego, Calif., U.S.A.로부터 키트(MaxBac.RTM. 키트)에서 상업적으로 구입가능하고, 그리고 이들 방법은 본 발명에 참조로서 편입되는 Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), 그리고 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에서 기술된 바와 같이, 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 명세서에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 곤충 세포는 "형질전환된다." 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드 구조체로부터 유래된 RNA를 이용하여 폴리펩티드를 생산하기 위하여, 세포-없는 번역 시스템 역시 이용될 수 있다. 전형적으로, 최소한 하나의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"이다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드는 재조합 폴리펩티드를 발현하는데 적합한 배양 조건 하에 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 결과의 발현된 폴리펩티드는 이후, 공지된 정제 공정, 예를 들면, 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 이런 배양물(가령, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터)로부터 정제될 수 있다. 폴리펩티드의 정제는 또한, 폴리펩티드에 결합하는 작용제를 내포하는 친화성 칼럼; 친화성 수지, 예를 들면, 콘카나발린 A-아가로즈, 헤파린-토요펄ㄾ 또는 Cibacrom blue 3GA Sepharoseㄾ 위에서 하나 이상의 칼럼 단계; 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수반하는 하나 이상의 단계; 또는 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography)를 포함할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 정제를 용이하게 하는 형태로 발현될 수도 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드, 예를 들면, 말토오스 결합 폴리펩티드(MBP), 글루타티온-S-전이효소(GST) 또는 티오레독신(TRX)의 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 이런 융합 폴리펩티드의 발현과 정제를 위한 키트는 각각, New England BioLab(Beverly, Mass.), Pharmacia(Piscataway, N.J.) 및 InVitrogen로부터 상업적으로 구입가능하다. 폴리펩티드는 또한, 에피토프로 표식(tagging)되고, 차후에 이런 에피토프에 지향된 특정 항체를 이용함으로써 정제될 수 있다. 이와 같은 한 가지 에피토프("Flag")는 Kodak (New Haven, Conn.)으로부터 상업적으로 구입가능하다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들면, 펜던트(pendant) 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계가 폴리펩티드를 더욱 정제하는데 이용될 수 있다. 상기 정제 단계 중에서 일부 또는 전부는 다양한 조합으로, 실질적으로 동종성 단리된 재조합 폴리펩티드를 제공하는 데에도 이용될 수 있다. 이렇게 정제된 폴리펩티드는 다른 포유동물 폴리펩티드가 실질적으로 존재하지 않고 본 발명에 따라서 "정제된 폴리펩티드"로서 정의된다; 본 발명의 이런 정제된 폴리펩티드에는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드, 단편, 변이체, 결합 상대 등에 결합하는 정제된 항체가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 유전자도입 동물의 산물로서, 예를 들면, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 내포하는 체세포(somatic cell) 또는 생식 세포(germ cell)로 특징되는 유전자도입 소, 염소, 돼지, 또는 양의 모유의 한 성분으로서 발현될 수 있다.

또한, 발현된 폴리펩티드를 친화성-정제하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드-결합 폴리펩티드, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 산출된 단일클론 항체를 포함하는 친화성 칼럼을 이용하는 것이 가능하다. 이들 폴리펩티드는 예로써, 고염 용리 완충액(high salt elution buffer)에서 전통적인 기술을 이용하고, 이후 이용을 위한 더욱 낮은 염 완충액으로 투석되거나, 또는 이용된 친화성 매트릭스에 따라 pH 또는 다른 성분을 변화시킴으로써 친화성 칼럼으로부터 제거되거나, 또는 친화성 모이어티의 자연 발생 기질, 예를 들면, 본 발명으로부터 도출된 폴리펩티드를 이용하여 경쟁적으로 제거될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서, 폴리펩티드-결합 폴리펩티드, 예를 들면, 본 발명의 항-폴리펩티드 항체, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 다른 폴리펩티드는 고체 상 서포트(solid phase support), 예를 들면, 칼럼 크로마토그래피 매트릭스, 또는 표면 상에 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포를 확인하거나, 분리하거나, 또는 정제하는데 적합한 유사한 기질에 결합될 수 있다. 고체 상 접촉 표면에 본 발명의 폴리펩티드-결합 폴리펩티드의 점착은 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다, 가령, 자성 마이크로구(magnetic microsphere)가 이들 폴리펩티드-결합 폴리펩티드로 코팅되고 배양 용기 내에서 자기장(magnetic field)을 통하여 유지될 수 있다. 세포 혼합물의 현탁액은 이런 폴리펩티드-결합 폴리펩티드가 위에 존재하는 고체 상과 접촉된다. 본 발명의 폴리펩티드가 표면에 존재하는 세포는 고정된 폴리펩티드-결합 폴리펩티드에 결합하고, 그리고 결합되지 않은 세포는 이후, 세척된다. 이러한 친화성-결합 방법은 용액으로부터 이들 폴리펩티드-발현 세포를 정제하거나, 스크리닝하거나, 또는 분리하는데 유용하다. 고체 상으로부터 양으로 선별된 세포를 방출하는 방법은 당분야에 공지되어 있고 예로써, 효소의 이용을 포함한다. 이들 효소는 바람직하게는, 세포에 비-독성이고 비-유해하고, 그리고 세포-표면 결합 상대를 절단하도록 지시된다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드-발현 세포를 내포하는 것으로 의심되는 세포 혼합물은 먼저, 본 발명의 비오틴화된 폴리펩티드-결합 폴리펩티드와 함께 배양될 수 있다. 배양 기간은 전형적으로, 본 발명의 폴리펩티드에 충분한 결합을 담보하기 위하여 최소한 하나의 1시간 동안 지속된다. 결과의 혼합물은 이후, 아비딘-코팅된 비드로 채워진 칼럼에 통과되고, 여기서 아비딘에 대한 비오틴의 높은 친화성은 이들 비드에 대한 폴리펩티드-결합 세포의 결합을 제공한다. 아비딘-코팅된 비드의 용도는 당분야에 공지되어 있다(참조: Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). 결합되지 않은 물질의 세척 및 결합된 세포의 방출은 전통적인 방법을 이용하여 수행된다.

폴리펩티드는 또한, 공지된 전통적인 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 합성 수단으로 본 발명의 폴리펩티드를 작제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 합성 작제된 폴리펩티드는 고유 폴리펩티드와 일차, 이차 또는 삼차 구조적 및/또는 형태적 특징을 공유함에 의하여, 폴리펩티드 활성을 비롯한 공통의 생물학적 특성을 가질 수 있다. 따라서 이들은 치료 화합물의 스크리닝 및 항체 발달을 위한 면역학적 과정에서 자연, 정제된 폴리펩티드에 대한 생물학적 활성 또는 면역학적 대체물로서 이용될 수 있다.

순도의 원하는 정도는 폴리펩티드의 의도된 용도에 좌우된다. 폴리펩티드가 예로써, 생체내 투여될 때, 상대적으로 높은 정도의 순도가 요망된다. 이런 경우에, 다른 폴리펩티드에 상응하는 폴리펩티드 밴드가 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분석에서 검출되지 않도록 폴리펩티드가 정제된다. 당업자는 폴리펩티드에 상응하는 복수의 밴드가 차별적 글리코실화, 차별적 번역후 가공 등으로 인하여, SDS-PAGE에 의해 시각화될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 균질하게 정제되고, 이는 SDS-PAGE에 의한 분석에서 단일 폴리펩티드 밴드로 지시된다. 상기 폴리펩티드 밴드는 은 염색(silver staining), Coomassie blue 염색, 또는 (폴리펩티드가 방사성표지되면) 방사선사진촬영술에 의해 시각화될 수 있다.

기억 및/또는 알츠하이머병의 발생 또는 진행을 변화시키기 위하여, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드를 중화시키거나, 프리세닐린-1 또는 -2 유전자(전사 또는 번역)의 발현을 저해하거나, 또는 프리세닐린과 β-APP의 상호작용을 저해하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 길항약은 세포에서 발현된 결합 상대에 대한 최소한 하나의 프리세닐린-1 폴리펩티드의 결합을 저해하고, 따라서 이들 세포에 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 결합에 의해 유도된 생물학적 활성을 저해한다. 본 발명의 일정한 다른 구체예에서, 예로써 프리세닐린-1 또는 -2 mRNA 전사체의 번역을 저해하거나 예방하는 널리 공지된 안티센스 또는 리보자임 접근법; 프리세닐린-1 유전자의 전사를 저해하는 삼중 나선 접근법; 또는 프리세닐린-1 또는 -2 유전자 또는 이들의 내인성 프로모터 또는 인핸서 요소를 비활성화 또는 "녹아웃(knock out)"시키는 표적화된 상동 재조합을 이용하여, 내인성 프리세닐린-1 또는 2 유전자 발현의 수준을 감소시키는 길항약이 설계될 수 있다. 이런 안티센스, 리보자임, 그리고 삼중 나선 길항약은 손상되지 않은, 또는 적절하면, 돌연변이된 프리세닐린-1 또는 -2 유전자 활성을 감소시키거나 저해하도록 설계될 수 있다. 이런 분자의 생산과 이용을 위한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

안티센스 RNA와 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화되고 폴리펩티드 번역을 예방함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 기능을 한다. 안티센스 접근법은 프리세닐린-1 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 설계를 수반한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상보성 표적 유전자 mRNA 전사체에 결합하고 번역을 예방할 것이다. 절대 상보성(absolute complementarity)은 바람직하긴 하지만, 반드시 요구되지는 않는다. 본 명세서에서, 폴리뉴클레오티드의 일부에 "상보적인" 서열은 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 충분한 상보성을 갖고 안정된 이중나선(또는 적절하게는, 삼중나선)을 형성하는 서열을 의미한다. 이중-가닥 안티센스 핵산의 경우에, 이중나선 DNA의 단일 가닥이 조사되거나, 또는 삼중나선 형성이 평가될 수 있다. 혼성화 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 모두에 좌우될 것이다. 메시지의 5' 단부, 예를 들면, AUG 개시 코돈(initiation codon)까지 및 이를 포함하는 5' 비번역 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 번역을 저해하는데 가장 효과적으로 작동할 것이다. 하지만, 프리세닐린-1 또는 -2 유전자 전사체의 5'- 또는 3'-비-번역, 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 안티센스 접근법에서, 내인성 프리세닐린-1 또는 -2 mRNA의 번역을 저해하는데 이용될 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 출발 코돈(start codon)의 보체(complement)를 포함해야 한다. 안티센스 핵산은 최소한 6개 뉴클레오티드 길이를 가져야 하고, 그리고 전형적으로, 6 내지 대략 50개 뉴클레오티드 범위의 길이를 갖는다. 특정한 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개 뉴클레오티드, 최소한 17개 뉴클레오티드, 최소한 25개 뉴클레오티드 또는 최소한 50개 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형된 이형이고, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예로써, 분자의 안정성, 혼성화 등을 향상시키기 위하여, 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 인산염 중추에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 추가된 기, 예를 들면, 펩티드(가령, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적으로 하기 위한), 또는 세포 막을 가로질러 수송을 용이하게 하는 작용제(참조: Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. WO88/09810, published Dec. 15, 1988), 또는 혼성화-촉발된 절단제(hybridization-triggered cleavage agent) 또는 중격제(intercalating agent)(참조: Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)를 포함할 수도 있다. 안티센스 분자는 생체내에서 인간 프리세닐린-1 또는 -2 전사체를 발현하는 세포에 전달되어야 한다. 안티센스 DNA 또는 RNA를 세포에 전달하기 위하여 다수의 방법이 개발되었다; 가령, 안티센스 분자가 조직 또는 세포 유도 부위에 직접적으로 주입되거나, 또는 원하는 세포(가령, 표적 세포 표면 상에서 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 항체에 연결된 안티센스)를 표적으로 하도록 설계된 변형된 안티센스 분자가 전신적으로 투여될 수 있다. 하지만, 종종, 내인성 mRNA의 번역을 억제할 만큼 충분한 안티센스 분자의 세포내 농도를 달성하는 것이 어렵다. 이런 이유로, 한 가지 접근법은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 강한 pol III 또는 pol II 프로모터의 제어 하에 배치되는 재조합 DNA 구조체를 이용한다. 개체 내에서 표적 세포를 형질감염시키기 위한 이런 구조체의 이용은 내인성 프리세닐린-1 유전자 전사체와 상보성 염기 쌍(complementary base pair)을 형성하고, 따라서 프리세닐린-1 또는 -2 mRNA의 번역을 예방할 만큼 충분한 양의 단일 가닥 RNA의 전사를 결과할 것이다. 가령, 벡터는 세포에 의해 흡수되고 안티센스 RNA의 전사를 주동하도록 생체내 도입될 수 있다. 이런 벡터는 전사되어 원하는 안티센스 RNA가 생산될 수만 있으면, 에피솜(episome)으로 남아있거나, 또는 염색체에 함입될 수 있다. 이런 벡터는 당분야의 표준 방법인 재조합 DNA 기술에 의해 작제될 수 있다. 벡터에는 플라스미드, 바이러스, 또는 포유동물 세포에서 복제와 발현에 이용되는 당분야에 공지된 다른 것들이 포함된다.

프리세닐린-1 또는 -2 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단하도록 설계된 리보자임 분자 역시 프리세닐린-1 또는 -2 mRNA의 번역을 예방하고, 따라서 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 발현을 저해하는데 이용될 수 있다(참조: PCT International Publication WO90/11364, published Oct. 4, 1990; U.S. Pat. No. 5,824,519). 본 발명에 이용될 수 있는 리보자임에는 해머헤드(hammerhead) 리보자임(Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591), RNA 엔도리보뉴클레아제(endoribonuclease)(이후, "Cech-타입 리보자임"), 예를 들면, 섬모충류(Tetrahymena Thermophila)에서 자연적으로 발생하고(IVS, 또는 L-19 IVS RNA로 알려져 있음) Thomas Cech 등 (International Patent Application No. WO 88/04300; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216)에 의해 폭넓게 기술된 것 등이 포함된다. 안티센스 접근법에서처럼, 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오티드(가령, 향상된 안정성, 표적화 등을 위하여)로 구성될 수 있고 인간 프리세닐린-1 폴리펩티드를 생체내에서 발현하는 세포에 전달되어야 한다. 전형적인 전달 방법은 강한 구조성 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어 하에 리보자임을 코딩하는 DNA 구조체의 이용을 수반하고, 따라서 형질감염된 세포는 내인성 프리세닐린-1 또는 -2 메시지를 파괴하고 번역을 저해할 만큼 충분한 양의 리보자임을 생산할 것이다. 안티센스 분자와 달리 리보자임은 촉매성이기 때문에, 유효성을 위하여 더욱 낮은 세포내 농도가 요구된다.

대안으로, 내인성 프리세닐린-1 또는 -2 유전자 발현은 프리세닐린-1 유전자의 전사를 예방하는 삼중 나선 구조를 형성하기 위하여 표적 유전자의 조절 영역(가령, 표적 유전자의 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 표적으로 함으로써 감소될 수 있다(참조: Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-584; Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27-36; 그리고 Maher, 1992, Bioassays 14(12):807-815).

본 발명의 안티센스 핵산, 리보자임, 그리고 삼중 나선 분자는 DNA와 RNA 분자의 합성을 위한 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들에는 당분야에 널리 공지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드와 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성하기 위한 기술, 예를 들면, 고체 상 포스포라미디트 화학적 합성이 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 당분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면, 자동화 DNA 합성기(가령, Biosearch, Applied Biosystems 등으로부터 상업적으로 구입가능)의 이용에 의해 합성될 수 있다. 예로써, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209의 방법에 의해 합성될 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 제어된 다공성 유리 중합체 서포트(pore glass polymer support)의 이용에 의해 제조될 수 있다(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451). 대안으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 서열의 시험관내와 생체내 전사에 의해 산출될 수도 있다. 이런 DNA 서열은 적절한 RNA 중합효소 프로모터, 예를 들면, T7 또는 SP6 중합효소 프로모터를 함입하는 매우 다양한 벡터 내로 함입될 수 있다. 대안으로, 이용된 프로모터에 따라, 안티센스 RNA를 구조성으로 또는 유도성으로 합성하는 안티센스 cDNA 구조체가 세포주 내로 안정적으로 도입될 수 있다.

본 명세서에서 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 유전자(들)의 발현이 향상되거나, 감소되거나, 또는 변화된 생물체가 제시된다. 유전자 발현에서 원하는 변화는 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하고 및/또는 이를 절단하는 안티센스 핵산 또는 리보자임의 이용을 통해 달성될 수 있다(Albert and Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15(7):250-254; Lavarosky et al., 1997, Biochem. Mol. Med. 62(1):11-22; 그리고 Hampel, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58:1-39; 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다). 형질전환된 세포 및 이들의 자손 내에서 안정적으로 유지되는 유전자 구조체로 세포의 형질전환에 의해 생산된, 본 명세서에서 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 유전자(들)의 복수 사본을 보유하는 유전자도입 동물이 제시된다. 유전자 발현 수준을 증가시키거나 감소시키고, 또는 유전자 발현의 시간적 또는 공간적 패턴을 변화시키는 변형된 유전자 제어 영역을 보유하는 유전자도입 동물 역시 제시된다(참조: European Patent No. 0 649 464 B1, 본 발명에 참조로서 편입됨). 이에 더하여, 본 명세서에서 개시된 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 유전자(들)가 외부 서열의 상응하는 유전자(들) 내로 삽입을 통해, 또는 상응하는 유전자(들)의 전부 또는 일부의 결실을 통해 부분적으로 또는 완전하게 비활성화된 생물체가 제시된다. 부분적인 또는 완전한 유전자 비활성화는 전치 요소(transposable element)삽입, 그 이후에 부정확한 절제(Plasterk, 1992, Bioessays 14(9):629-633; Zwaal et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(16):7431-7435; Clark et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(2):719-722; 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다)를 통해, 또는 양성/음성 유전자 선별 전략(positive/negative genetic selection strategy)에 의해 검출될 수 있는 상동 재조합(Mansour et al., 1988, Nature 336:348-352; U.S. Pat. No. 5,464,764; 5,487,992; 5,627,059; 5,631,153; 5,614,396; 5,616,491; 그리고 5,679,523; 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입됨)을 통해 달성될 수 있다. 변형된 유전자 발현을 나타내는 이들 생물체는 진핵생물이고, 전형적으로 포유동물이다. 이런 생물체는 상응하는 유전자(들)에 관련된 질환의 연구를 위한 비-인간 모형의 개발, 그리고 상응하는 유전자(들)의 폴리펩티드 산물(들)과 상호작용하는 분자의 확인을 위한 분석평가 시스템의 개발에 유용하다.

본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드는 그 자체로, 프리세닐린-1 또는 -2의 생물학적 활성을 시험관내 또는 생체내 절찬에서 저해하는데 이용될 수 있다. 본 발명에는 융합 폴리펩티드의 단편으로서 또는 성분으로서 발현될 때, 고유 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 기능의 "현저한 부정적인" 저해물질로서 기능하는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 세포외 루프 도메인이다. 가령, 본 발명의 정제된 폴리펩티드 도메인은 내인성 결합 상대에 대한 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 결합을 저해하는데 이용될 수 있다. 이런 용도는 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드와 β-APP의 상호작용을 효과적으로 차단하고 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 활성을 저해할 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 상피 및/또는 내피 세포 상에서 발현되는 프리세닐린-1 또는 -2 결합 상대의 가용성 형태는 내인성 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드에 결합하고 이러한 폴리펩티드의 활성화를 경쟁적으로 저해하는데 이용된다. 게다가, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드에 결합하는 항체는 프리세닐린-1 또는 -2 활성을 저해하고 길항약, 또는 작동약으로서 기능할 수 있다. 가령, 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프, 또는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 보존된 변이체의 에피토프, 또는 프리세닐린-1 폴리펩티드의 펩티드 단편을 특이적으로 인식하는 항체가 본 발명에서, 프리세닐린-1 또는 -2 활성을 저해하는데 이용될 수 있다(가령, 길항성 항체). 작동성 항체는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 또는 결합 상대에 결합하고, 그리고 구조성 세포내 신호전달("또는 "리간드 모방하기")를 유발함으로써, 또는 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 활성의 고유 저해물질의 결합을 예방함으로써 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드 활성을 증가시킨다. 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드에 결합하는 항체에는 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb), 인간(일명, "완전 인간") 항체, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-이디오타입(anti-Id) 항체, 그리고 상기한 것들 중에서 하나의 에피토프-결합 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 대안으로, 본 발명의 정제되고 변형된 프리세닐린 폴리펩티드는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드 및 막-결합되지 않은 프리세닐린-1 또는 -2 결합 상대 사이에 상호작용을 조절하기 위하여 투여될 수 있다. 이런 접근법은 인간 프리세닐린-1-영향 받은 생물활성의 변화를 위한 대안적 방법을 가능하게 할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 세포, 세포-없는 제조물, 화학적 라이브러리, 그리고 자연 산물 혼합물로부터 길항약 및 작동약을 확인하는데 이용될 수 있다. 이들 길항약 및 작동약은 본 발명의 폴리펩티드의 자연 또는 변형된 기질, 리간드, 효소, 수용체 등이거나, 또는 폴리펩티드의 구조적 또는 기능적 모방체일 수 있다. 본 발명의 잠재적 길항약에는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 결합 상대에 결합하여 이들의 결합 부위를 점유함으로써, 그들이 자연 결합 상대에 결합할 수 없도록 하여 정상적인 생물학적 활성을 예방하는 소형 분자, 펩티드 및 항체가 포함될 수 있다. 잠재적 작동약에는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 결합 상대에 결합하고, 그리고 본 발명의 폴리펩티드의 결합에 의해 유발된 것들과 동일하거나 더욱 향상된 생물학적 효과를 유도하는 소형 분자, 펩티드 및 항체가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드의 펩티드 작동약 및 길항약은 공지된 방법에 따라 확인되고 이용될 수 있다(참조: WO 00/24782 및 WO 01/83525, 이들은 본 발명에 참조로서 편입됨).

치료제의 개발을 위한 한 가지 접근법은 펩티드 라이브러리 스크리닝이다. 단백질 리간드와 이의 수용체의 상호작용은 종종, 상대적으로 큰 계면에서 일어난다. 하지만, 인간 성장 호르몬 및 이의 수용체에서 증명된 바와 같이, 계면에서 극히 일부의 핵심 잔기만 대부분의 결합 에너지에 기여한다(Clackson et al., 1995; Science 267: 383-386). 대부분의 단백질 리간드는 정확한 지세(right topology)에서만 결합 에피토프를 전시하거나, 또는 결합에 관련없는 기능을 수행한다. 따라서 단지 "펩티드" 길이의 분자(2 내지 90개 아미노산)만 심지어 큰 단백질 리간드, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드의 수용체 단백질 또는 결합 상대에 결합할 수 있다. 이런 펩티드는 큰 단백질 리간드의 생물활성을 모방하거나("펩티드 작동약") 또는, 경쟁적 결합을 통해, 큰 단백질 리간드의 생물활성을 저해할 수 있다("펩티드 길항약"). 본 발명의 폴리펩티드의 예시적인 펩티드 작동약 및 길항약은 자연 발생 분자의 도메인을 포함하거나, 또는 무작위화된 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 펩티드 서열을 지칭하는데 이용되는 용어 "무작위화된"은 완전 무작위 서열(가령, 파지 전시 방법 또는 RNA-펩티드 스크리닝에 의해 선별됨), 그리고 자연 발생 분자의 하나 이상의 잔기가 자연 발생 분자에서 해당 위치에서 나타나지 않는 아미노산 잔기에 의해 대체되는 서열을 지칭한다. 파지 전시 펩티드 라이브러리는 이런 펩티드 작동약 및 길항약을 확인하는 강력한 방법으로 부상하였다(참조: Scott et al., 1990, Science 249: 386; Devlin et al., 1990, Science 249: 404; U.S. Pat. No. 5,223,409; U.S. Pat. No. 5,733,731; U.S. Pat. No. 5,498,530; U.S. Pat. No. 5,432,018; U.S. Pat. No. 5,338,665; U.S. Pat. No. 5,922,545; WO 96/40987; 그리고 WO 98/15833, 이들은 각각 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). 이런 라이브러리에서, 무작위 펩티드 서열은 섬유상 파지(filamentous phage)의 외피 단백질과의 융합에 의해 전시된다. 전형적으로, 전시된 펩티드는 수용체의 항체-고정된 세포외 도메인에 대하여 친화성-용리된다. 유지된 파지는 연속 라운드의 친화성 정제 및 재증식(repropagation)에 의해 농축될 수 있다. 최고의 결합 펩티드는 하나 이상의 구조적으로 관련된 계통의 펩티드 내에 핵심 잔기를 확인하기 위하여 염기서열분석된다. 이들 펩티드 서열은 또한, 어떤 잔기가 DNA 수준에서 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 또는 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 안전하게 대체될 수 있는 지를 암시한다. 최고 결합자의 서열을 더욱 최적화시키기 위하여, 돌연변이유발 라이브러리(mutagenesis library)가 산출되고 스크리닝될 수 있다(Lowman, 1997, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-424). 가용성 펩티드 혼합물 스크리닝에 다른 생물학적 접근법은 긍정적인 치료 특성을 갖는 펩티드를 찾기 위하여, 발현과 분비에 효모를 이용한다(Smith et al., 1993, Mol. Pharmacol. 43: 741-748). 이하에서, 이러한 방법 및 관련된 방법은 "효모-기초된 스크리닝"으로 지칭된다. 펩티드 라이브러리는 또한, lac 리프레서(repressor)의 카르복실 말단에 융합되고 대장균(E. coli)에서 발현될 수 있다. 다른 대장균(E. coli)-기초된 방법은 펩티도글리칸-결합된 지단백(PAL)과의 융합에 의해 세포의 외부 막에서 전시를 가능하게 한다. 이하에서, 이들 방법 및 관련된 방법은 집합적으로, "대장균(E. coli) 전시"로 지칭된다. 다른 방법에서, 무작위 RNA의 번역은 리보솜 방출(ribosome release)에 앞서 중단되고, 연관된 RNA가 여전히 부착된 폴리펩티드의 라이브러리를 결과한다. 이하에서, 이러한 방법 및 관련된 방법은 집합적으로, "리보솜 전시"로 지칭된다. 다른 방법은 RNA에 연결된 펩티드를 이용한다; 가령, PROfusion 기술, Phylos, Inc.(참조: Roberts and Szostak, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12303). 이하에서, 이러한 방법 및 관련된 방법은 집합적으로, "RNA-펩티드 스크리닝"으로 지칭된다. 화학적으로 유래된 펩티드 라이브러리가 개발되었는데, 여기서 펩티드는 안정된 비-생물학적 물질, 예를 들면, 폴리에틸렌 막대 또는 용매-침투성 수지 상에 고정된다. 다른 화학적으로 유래된 펩티드 라이브러리는 유리 슬라이드 상에 고정된 펩티드를 스캔하기 위하여 사진석판술(photolithography)을 이용한다. 이하에서, 이들 방법 및 관련된 방법은 집합적으로, "화학적-펩티드 스크리닝"으로 지칭된다. 화학적-펩티드 스크리닝이 유리할 수 있는데, 그 이유는 화학적-펩티드 스크리닝이 D-아미노산 및 다른 비자연 유사체, 그리고 비-펩티드 요소의 이용을 가능하게 하기 때문이다. 생물학적 방법 및 화학적 방법 둘 모두 Wells and Lowman, 1992, Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-362에서 검토된다.

공지된 생물활성 펩티드의 경우에, 긍정적인 치료 특성을 갖는 펩티드 리간드의 합리적인 설계가 완결될 수 있다. 이런 접근법에서, 펩티드 서열에 단계적인 변화가 만들어지고 펩티드의 생물활성 또는 예측 생물물리학적 특성(가령, 용해 구조)에 대한 치환의 효과가 결정된다. 이하에서, 이들 기술은 집합적으로, "합리적 설계"로서 지칭된다. 이와 같은 기술에서, 단일 잔기가 하나씩 알라닌으로 대체되는 일련의 펩티드가 만들어진다. 이러한 기술은 통상적으로, "알라닌 워크(alanine walk)" 또는 "알라닌 스캔(alanine scan)"으로 지칭된다. 2개의 잔기(연속 또는 이격)가 대체될 때, 이것은 "이중 알라닌 워크(double alanine walk)"로 지칭된다. 결과의 아미노산 치환은 긍정적인 치료 특성을 갖는 새로운 펩티드 존재를 산출하기 위하여 단독으로 또는 조합으로 이용될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용의 구조 분석 역시 큰 단백질 리간드의 결합 활성을 모방하는 펩티드를 암시하는데 이용될 수 있다. 이런 분석에서, 결정 구조는 펩티드가 설계되는 큰 단백질 리간드의 결정적인 잔기의 정체 및 상대적 정위(relative orientation)를 암시할 수 있다(참조: Takasaki et al., 1997, Nature Biotech. 15: 1266-1270). 이하에서, 이들 방법 및 관련된 방법은 "단백질 구조 분석"으로 지칭된다. 이들 분석 방법은 또한, 파지 전시에 의해 선별된 수용체 단백질과 펩티드 사이에 상호작용을 조사하는데 이용될 수 있고, 이는 결합 친화성을 증가시키기 위한 펩티드의 추가 변형을 암시할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 펩티드 작동약 및 길항약은 운반제 분자에 공유 연결될 수 있다. 용어 "운반제"는 분해를 예방하고 및/또는 반감기를 증가시키거나, 독성을 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 또는 치료 단백질의 생물학적 활성 또는 흡수를 증가시키는 분자를 지칭한다. 예시적인 운반제에는 Fc 도메인 또는 선형 중합체(가령, 폴리에틸레렌 글리콜(PEG), 폴리리신, 덱스트란 등); 가지-사슬 중합체(참조: U.S. Pat. No. 4,289,872; U.S. Pat. No. 5,229,490; WO 93/21259); 지질; 콜레스테롤 기(가령, 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고사카라이드(가령, 덱스트란); 또는 구출(salvage) 수용체 또는 단백질 형질도입(transduction) 도메인에 결합하는 임의의 자연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드가 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드와 면역반응성인 항체가 본 발명에서 제시된다. 이들 항체는 항체의 항원-결합 부위를 경유하여 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다(비-특이적인 결합과 대조적으로). 본 발명에서, 특이적인 결합 항체는 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드, 상동체, 그리고 변이체를 특이적으로 인식하고 이들과 결합하지만 다른 분자와는 그러하지 않은 것들이다. 한 구체예에서, 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적이고 다른 폴리펩티드와 교차-반응하지 않는다. 이러한 방식으로, 앞서 열거된 바와 같은 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드 등은 그들과 면역반응성인 항체를 생산하기 위한 "면역원(immunogen)"으로서 이용될 수 있다.

더욱 구체적으로, 이들 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드 등은 항체의 형성을 유도하는 항원성 결정인자 또는 에피토프를 내포한다. 이들 항원성 결정인자 또는 에피토프는 선형 또는 형태(불연속)일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산의 단일 섹션으로 구성되는 반면, 형태 또는 불연속 에피토프는 폴리펩티드 접힘 시에 가깝게 근접되는 폴리펩티드 사슬의 상이한 영역으로부터 아미노산 섹션들로 구성된다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 접힘된 폴리펩티드가 복잡한 표면을 보유하기 때문에, 가용한 에피토프의 숫자는 극히 많다; 하지만, 폴리펩티드의 형태 및 입체 방해(steric hinderance)로 인하여, 이들 에피토프에 실제로 결합하는 항체의 숫자는 가용한 에피토프의 숫자보다 적다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 에피토프는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 따라서 본 발명의 한 측면은 본 발명의 폴리펩티드의 항원성 에피토프에 관계한다. 이들 에피토프는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 항체, 특히 단일클론 항체를 발생시키는데 유용하다. 부가적으로, 본 발명의 폴리펩티드로부터 에피토프는 분석평가에서 연구 시제(research reagent)로서 이용될 수 있고, 그리고 다중클론 혈청, 또는 배양된 하이브리도마로부터 상층액과 같은 물질로부터 특이적인 결합 항체를 정제하는데 이용될 수 있다. 이런 에피토프 또는 이들의 변이체는 당분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 고체 상 합성, 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적 절단, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 에피토프가 단리되는 지 또는 폴리펩티드의 일부로서 남아있는 지에 상관없이, 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프에 의해 유도될 수 있는 항체와 관련하여, 다중클론 및 단일클론 항체 둘 모두 전통적인 기술에 의해 제조될 수 있다(참조: Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); and Antibodies. A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Kohler and Milstein, (U.S. Pat. No. 4,376,110); the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030); 그리고 the EBV-hybridoma technique (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 역시 본 발명에서 예기된다. 이런 하이브리도마는 전통적인 기술에 의해 생산되고 확인될 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내에서 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 생체내에서 높은 역가로 mAb의 생산으로 인하여, 이것은 가장 일반적인 생산 방법이다. 이런 하이브리도마 세포주를 생산하는 한 가지 방법은 동물을 폴리펩티드로 면역화시키는 단계; 면역화된 동물로부터 비장 세포를 수확하는 단계; 상기 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 산출하는 단계; 그리고 상기 폴리펩티드에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하는 단계를 포함한다. 항체의 생산을 위하여, 다양한 숙주 동물은 프리세닐린-1 폴리펩티드, 프리세닐린-1 폴리펩티드의 단편, 프리세닐린-1 폴리펩티드의 기능성 등가물, 또는 프리세닐린-1 폴리펩티드의 돌연변이 형태 중에서 하나 이상의 주사에 의해 면역화될 수 있다. 이런 숙주 동물에는 토끼, 생쥐 및 쥐가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 숙주 종류에 따라서, Freund(완전 및 불완전), 무기 겔, 예를 들면, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들면, 리소레시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 다중음이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀(dinitrophenol), 그리고 잠재적으로 유용한 인간 어쥬번트, 예를 들면, BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 어쥬번트가 면역 반응을 증가시키는데 이용될 수 있다. 단일클론 항체는 전통적인 기술에 의해 회수될 수 있다. 이런 단일클론 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 그리고 이들의 임의의 하위분류를 비롯한 임의의 면역글로불린 부류일 수 있다.

이에 더하여, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 생쥐 항체 분자로부터 유전자를 절단접합(splicing)함으로써 "키메라 항체"의 생산을 위하여 개발된 기술(Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)이 이용될 수 있다. 키메라 항체는 서로 다른 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자, 예를 들면, 돼지 mAb로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 보유하는 분자이다. 본 발명의 단일클론 항체에는 또한, 뮤린 단일클론 항체의 인간화된 이형이 포함된다. 이런 인간화된 항체는 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 그리고 이들 항체가 인간에 투여될 때, 감소된 면역원성의 이점을 제공한다. 한 구체예에서, 인간화된 단일클론 항체는 뮤린 항체의 가변 영역(또는 단순히, 이의 항원-결합 부위) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 대안으로, 인간화된 항체 단편은 뮤린 단일클론 항체의 항원-결합 부위 및 인간 항체로부터 유래된 가변 영역 단편(항원-결합 부위가 없음)을 포함할 수 있다. 키메라 및 더욱 가공된 단일클론 항체의 생산 절차에는 Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), 그리고 Winter and Harris (TIPS 14:139, Can, 1993)에서 기술된 것들이 포함된다. 유전자도입 방식으로 항체를 산출하는 절차는 GB 2,272,440, U.S. Pat. No. 5,569,825 및 5,545,806, 그리고 이들로부터 우선권을 주장하는 관련된 특허에서 찾아볼 수 있고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다. 바람직하게는, 인간에서 이용을 위하여, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다; 이런 인간 또는 인간화된 항체를 산출하는 기술 역시 널리 공지되어 있고 예로써, Medarex Inc. (Princeton, N.J.) 및 Abgenix Inc. (Fremont, Calif.)로부터 상업적으로 가용하다.

특이적인 에피토프를 인식하는 항원-결합 항체 단편은 공지된 기술에 의해 산출될 수 있다. 가령, 이런 단편에는 항체 분자의 펩신 절단(pepsin digestion)에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편 및 이들 (ab')2 단편의 이황화 가교를 환원시킴으로써 산출될 수 있는 Fab 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 대안으로, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 하는 Fab 발현 라이브러리가 작제될 수도 있다(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281). 단일 사슬 항체의 생산을 위한 기술(U.S. Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 그리고 Ward et al., 1989, Nature 334:544-546)은 또한, 프리세닐린-1 유전자 산물에 대한 단일 사슬 항체를 생산하기 위하여 개조될 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 가교에 의해 Fv 영역의 중쇄와 경쇄 단편을 연결하여 단일 사슬 폴리펩티드를 산출함으로써 형성된다. 이에 더하여, 프리세닐린-1 폴리펩티드에 대한 항체는 차례로, 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드를 "모방하는" 항-이디오타입 항체를 산출하는데 이용될 수 있고, 그리고 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드에 결합할 수 있다(참조: Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7(5):437-444; and Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438).

이런 항체가 확인될 수 있는 스크리닝 절차는 널리 공지되어 있고, 그리고 예로써, 면역친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography)를 수반할 수 있다. 항체는 작동성 (즉, 리간드-모방) 특성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 이런 항체는 세포 표면 프리세닐린-1에 결합 시에, 프리세닐린-1 또는 -2 결합 상대가 세포 표면 프리세닐린-1 또는 -2에 결합할 때 유도되는 생물학적 효과와 유사한 생물학적 효과(가령, 생물학적 신호의 형질도입)를 유도한다. 작동성 항체는 프리세닐린-1 또는 -2-매개된 활성, 예를 들면, 상피 장벽 형성(epithelial barrier formation), 자극 경로(stimulatory pathway), 또는 세포간 소통(intercellular communication)을 유도할 수 있다. 프리세닐린-1에 대한 결합 상대에 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 결합을 차단할 수 있는 항체는 프리세닐린-1 또는 -2-매개된 상피 장벽 형성, 세포간 소통, 또는 이런 결합에 기인하는 보조-자극(co-stimulation)을 저해하는데 이용될 수 있다. 이런 차단 항체는 임의의 적절한 분석평가 절차를 이용하여, 예를 들면, 프리세닐린-1 또는 -2 결합 상대를 발현하는 일정한 세포에 프리세닐린-1 또는 -2의 결합을 저해하는 능력에 대하여 항체를 조사함으로써 확인될 수 있다. 대안으로, 차단 항체는 본 명세서에서 기술된 분석평가를 이용하여, 표적 세포에 프리세닐린-1 또는 -2의 결합에 기인하는 생물학적 효과, 예를 들면, 상피 장벽 형성을 저해하는 능력에 대하여 분석평가에서 확인될 수 있다. 이런 항체는 시험관내 절차에서 이용되거나, 또는 상기 항체를 산출한 존재에 의해 매개된 생물학적 활성을 저해하기 위하여 생체내 투여될 수 있다. 따라서 프리세닐린-1 또는 -2와 세포 표면 결합 상대 수용체의 상호작용에 의해 유발되거나 악화된(직접적으로 또는 간접적으로) 질환이 치료될 수 있다. 치료 방법은 프리세닐린-1 또는 -2 결합 상대-매개된 생물학적 활성을 저해하는데 효과적인 양으로 포유동물에 차단 항체의 생체내 투여를 수반한다. 인간 또는 인간화된 항체가 이런 치료 방법에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 항원-결합 항체 단편이 이용된다. 프리세닐린-1 또는 -2에 지향되는 항체, 그리고 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 조성물이 본 발명에서 제시된다. 이런 조성물의 적절한 성분은 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 대하여 하기에 기술된 바와 같다.

또한, 항체에 부착된 검출제(가령, 진단제) 또는 치료제를 포함하는 접합체가 본 발명에서 제시된다. 이런 작용제의 실례는 상기에 제공된다. 이들 접합체는 시험관내 또는 생체내 절차에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한, 시험관내에서 또는 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 검출하는 분석평가에 이용될 수 있다. 이들 항체는 또한, 면역친화성 크로마토그래피로 본 발명의 폴리펩티드 또는 단편을 정제하는데 이용될 수 있다.

합리적 약물 설계의 목적은 목적되는 생물학적 활성 폴리펩티드 또는 이들이 상호작용하는 소형 분자, 예를 들면, 저해물질, 작동약, 길항약 등의 구조적 유사체를 생산하는 것이다. 이들 실례 중에서 한 가지가 폴리펩티드의 더욱 활동적 또는 안정적 형태이거나, 또는 생체내에서 폴리펩티드의 기능을 증강시키거나 간섭하는 약물을 형성하는데 이용될 수 있다(Hodgson J., 1991, Biotechnology 9:19-21, 본 발명에 참조로서 편입됨). 한 접근법에서, 목적되는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드-저해물질 복합체의 3-차원 구조는 x-선 결정학에 의해, 핵 자기 공명에 의해, 또는 컴퓨터 상동성 모델링에 의해, 또는 가장 전형적으로, 이들 접근법의 조합에 의해 결정된다. 폴리펩티드의 구조를 설명하고 활성 부위(들)를 결정하기 위하여, 상기 폴리펩티드의 형상과 전하 둘 모두 확인되어야 한다. 빈도가 덜하긴 하지만, 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 폴리펩티드의 구조에 기초된 모델링에 의해 획득될 수 있다. 양쪽 경우에, 유사한 프리세닐린-유사 분자를 설계하거나, 효과적인 저해물질을 확인하거나, 또는 본 발명의 프리세닐린에 결합할 수 있는 소형 분자를 확인하는데 관련된 구조 정보가 이용된다. 합리적 약물 설계의 유용한 실례에는 Braxton S and Wells J A (1992, Biochemistry 31:7796-7801)에서 제시된 바와 같이 향상된 활성 또는 안정성을 갖는 분자, 또는 Athauda S B et al. (1993, J Biochem 113:742-746)에서 제시된 바와 같이 고유 펩티드의 저해물질, 작동약, 또는 길항약으로서 기능하는 분자가 포함되고, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. 저해물질 설계 및 저해물질-프리세닐린-1 폴리펩티드 상호작용을 조력하기 위한 분자 모델링 소프트웨어 시스템에서 프리세닐린-1 폴리펩티드 구조 정보의 이용 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 특정 방법은 기질의 가능한 결합 부위에 대한 본 발명의 프리세닐린 폴리펩티드의 3-차원 구조를 분석하는 단계, 예측 반응 부위를 함입하는 새로운 분자를 합성하는 단계, 그리고 본 명세서에서 더욱 기술된 바와 같이 새로운 분자를 평가하는 단계를 포함한다.

또한, 본 명세서에서 더욱 기술된 바와 같이, 기능 분석평가에 의해 선별된 표적-특이적인 항체를 분리하고, 이후 이의 결정 구조를 해석하는 것이 가능하다. 이러한 접근법은 원칙적으로, 차후의 약물 설계가 기초될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 산출한다. 기능성, 약리학적 활성 항체에 대한 항-이디오타입 항체 (anti-id)를 산출함으로써 폴리펩티드 결정학을 우회하는 것이 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 이들 anti-id의 결합 부위는 최초 수용체의 유사체일 것으로 예상된다. 이들 anti-id는 이후, 화학적으로 또는 생물학적으로 생산된 펩티드의 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 분리하는데 이용될 수 있다. 단리된 펩티드는 이후, 파마코어로서 기능할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드와 펩티드는 또한, 자신에게 부착된 작용제를 확인된 결합 상대를 보유하는 세포에 전달하기 위한 담체(carrier)로서 이용될 수 있다. 따라서 이들 폴리펩티드는 시험관내 또는 생체내 절차에서 진단제 또는 치료제를 이런 세포(또는 세포 표면 상에서 결합 상대를 발현하는 것으로 밝혀진 다른 세포 유형)에 전달하는데 이용될 수 있다. 폴리펩티드에 부착될 수 있는 검출제(진단제) 및 치료제에는 독소, 다른 세포독성제, 약물, 방사성핵종, 발색단, 비색(colorimetric) 또는 형광(fluorometric) 반응을 촉진하는 효소 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 특정 작용제는 의도된 적용에 따라 선택된다. 독소에는 리신(ricin), 아브린(abrin), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A, 리보솜 비활성화 폴리펩티드, 마이코톡신(mycotoxin), 예를 들면, 트리코테센(trichothecene), 그리고 이들의 유도체와 단편(가령, 단일 사슬)이 포함된다. 진단적 용도에 적합한 방사성핵종에는 ¹²³I, ¹³¹I, ⁹⁹mTc, ¹¹¹In, 그리고 ⁷⁶Br이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 치료적 용도에 적합한 방사성핵종의 실례는 ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu, 그리고 ⁶⁷Cu이다. 이런 작용제는 임의의 적절한 전통적인 절차에 의해 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 폴리펩티드는 원하는 작용제 상에서 기능기와 반응하여 예로써, 공유 결합을 형성하는 아미노산 측쇄 상에서 기능기를 포함한다. 대안으로, 폴리펩티드 또는 작용제는 원하는 반응성 기능기를 산출하거나 부착하기 위하여 유도체화될 수 있다. 이러한 유도체화는 다양한 분자를 폴리펩티드에 부착하는데 가용한 이중기능성 결합 시약(bifunctional coupling reagent) 중에서 한 가지의 부착을 수반할 수 있다(Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.). 폴리펩티드를 방사성표지(radiolabeling)하기 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 방사성핵종 금속은 예로써, 적절한 이중기능성 킬레이트화제(bifunctional chelating agent)를 이용함으로써 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 따라서 폴리펩티드 및 적절한 진단제 또는 치료제(바람직하게는, 공유 연결된)를 포함하는 접합체가 제조된다. 이들 접합체는 특정 적용에 적합한 양으로 투여되거나, 또는 달리 이용된다.

본 발명에 제시된 방법으로 확인된 작용제 및 본 발명의 펩티드는 임상적 환경(clinical setting)에 상관없이, 아밀로이드 원섬유 형성(fibril formation), 집합(aggregation) 또는 침착(deposition)과 연관된 질환을 치료하기 위하여 치료적으로 또는 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 아래의 기전 중에서 한 가지를 이용하여 아밀로이드 관련된 질환의 과정을 조절하는 작용을 할 수 있다: 아밀로이드 미소섬유 형성 또는 침착의 속도 지연; 아밀로이드 침착의 정도 감소; 아밀로이드 미소섬유 형성의 저해, 감소 또는 예방; 아밀로이드 유도된 염증 저해; 예로써, 뇌로부터 아밀로이드의 소거 강화; 또는 아밀로이드 유도된(올리고머 또는 원섬유(fibrillar)) 독성으로부터 세포 보호.

아밀로이드 침착의 "조절"에는 앞서 정의된 바와 같은 저해 및 아밀로이드 침착 또는 미소섬유 형성의 강화가 모두 포함된다. 이런 이유로, "조절"은 아밀로이드 형성 또는 축적의 예방 또는 중단; 진행성 유전분증(amyloidosis), 예를 들면, 아밀로이드 집합체를 이미 보유하는 개체에서 추가적인 아밀로이드 집합의 저해 또는 지연; 진행성 유전분증 개체에서 아밀로이드 집합체의 감소 또는 반전; 아밀로이드 침착 강화, 예를 들면, 생체내 또는 시험관내에서 아밀로이드 침착의 비율 또는 양 증가를 포괄한다. 아밀로이드-강화 화합물은 예로써, 더욱 짧은 기간 동안 동물에서 아밀로이드 침착물의 발생을 가능하게 하거나, 또는 선택된 기간 동안 아밀로이드 침착물을 증가시키기 위하여, 유전분증의 동물 모형에서 유용할 수 있다. 아밀로이드-강화 화합물은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형에서 유전분증을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝 검사, 세포 검사 및 유전분증에 대한 시험관내 검사에서 유용할 수 있다. 이들 화합물은 예로써, 화합물에 대한 더욱 신속하고 더욱 민감한 검사법을 제공하는데 이용될 수 있다. 일부 사례에서, 아밀로이드 강화 화합물은 예로써, CAA를 예방하기 위하여 뇌혈관(cerebral blood vessel)의 벽보다는 내강(lumen) 내에서 아밀로이드의 침착을 강화시키는 치료 목적으로 투여될 수도 있다. 아밀로이드 집합의 조절은 치료에 앞서, 치료되지 않은 개체 또는 치료된 개체와 비교하여 결정된다.

아밀로이드 침착의 "저해"에는 아밀로이드 형성, 예를 들면, 원섬유발생(fibrillogenesis)의 예방 또는 중단, 뇌로부터 가용성 Aβ의 소거, 유전분증, 예를 들면, 아밀로이드 침착물을 이미 보유하는 개체에서 추가적인 아밀로이드 침착의 저해 또는 지연, 진행성 유전분증 개체에서 아밀로이드 원섬유발생 또는 침착물 감소 또는 반전이 포함된다. 아밀로이드 침착의 저해는 치료에 앞서, 치료되지 않은 개체 또는 치료된 개체와 비교하여 결정되거나, 또는 예로써, 임상적으로 측정가능 향상(clinically measurable improvement)에 의해, 또는 뇌 유전분증 환자, 예를 들면, 알츠하이머(Alzheimer's) 또는 뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy) 개체의 경우에, 인식 기능(cognitive function)의 안정화 또는 인식 기능에서 추가적인 감퇴의 예방(즉, 질병 진행의 예방, 지연 또는 중단), 또는 CSF에서 Aβ 또는 tau의 농도와 같은 파라미터의 향상에 의해 결정된다.

본 명세서에서, 개체의 "치료"에는 본 발명의 방법에 의해 확인된 작용제를 함유하는 조성물의 개체에 적용 또는 투여, 또는 아밀로이드-β 관련된 질환이나 장애, 이러한 질환이나 장애의 증상, 또는 이러한 질환이나 장애의 위험(또는 취약성)의 회복, 치유, 경감, 완화, 변화, 교정, 개선, 향상, 또는 영향의 목적으로, 아밀로이드-β 관련된 질환이나 장애 또는 이러한 질환이나 장애의 증상을 나타내거나, 또는 이러한 질환이나 장애의 증상의 위험이 있는(또는 취약한) 개체로부터 세포 또는 조직에 본 발명의 조성물의 적용 또는 투여가 포함된다. "치료"는 증상 감소(abatement); 경감(remission); 증상 소멸, 또는 손상, 병리 또는 이상이 개체에서 더욱 관용되도록 함; 변성 또는 감퇴의 비율에서 지연; 변성의 최종 지점이 덜 무기력하도록 하는 함; 개체의 신체적 또는 정신적 행복 향상; 또는 일부 상황에서, 치매 발병 예방과 같은 주관적인 또는 객관적인 파라미터를 비롯한 손상, 병리 또는 이상의 치료 또는 완화에서 성공의 징후를 지칭한다. 증상의 치료 또는 완화는 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초될 수 있다; 신체검사(physical examination) 또는 정신병적 평가(psychiatric evaluation)의 결과를 포함. 가령, 본 발명의 방법은 인식 감퇴(cognitive decline)의 비율 또는 정도를 지연시킴으로써 개체의 치매를 성공적으로 치료한다.

가족성(familial) 또는 단발성(sporadic) 유형의 알츠하이머병이 노령 인구(aging population)에서 관찰되는 치매의 주원인이긴 하지만, 다른 유형의 치매 역시 관찰된다. 이들에는 픽병(Pick's disease)과 연관된 전두측두 변성(fronto-temporal degeneration), 혈관성 치매(vascular dementia), 루이 소체 타입(Lewy body type)의 노인성 치매(senile dementia), 전두 위축(frontal atrophy)을 동반하는 파키슨병 치매(dementia of Parkinsonism), 전진적 핵상 마비(progressive supranuclear palsy)와 피질-기저핵 변성(corticobasal degeneration) 및 알츠하이머와 연관된 다운 증후군(Downs syndrome)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 플라크 형성은 CJD, 스크래피(scrapie)와 BSE와 같은 해면상 뇌증(spongiform encephalopathy)에서도 관찰된다. 본 발명은 이런 신경변성 질환, 특히, 신경독성 단백질 플라크, 예를 들면, 아밀로이드 플라크를 수반하는 질환의 치료를 지향한다.

다운 증후군은 800명의 생존 신생아에서 1명의 비율로 발병하는 심각한 인간 질환이다. 이는 병든 개체에서 염색체 21의 추가 사본의 존재(3염색체성(trisomy) 21)와 연관된다. β-아밀로이드 전구체 단백질(β-APP) 유전자는 염색체 21 상에서, 다운 증후군(Down syndrome locus) 좌위에 매우 가깝게 인코딩된다. 모든 다운 증후군 환자는 40세 이상 생존하면, 그들의 뇌에서 알츠하이머-유사 치매와 Aβ의 침착이 발생한다. 이런 이유로, Aβ의 과다-생산이 AD와 다운 증후군 모두에서 치매의 발병과 직접적으로 연관된다는 것은 충분히 합리적인 제안이다. 따라서 AD 증상의 완화를 위한 치료제의 확인의 특성 역시 다운 증후군의 증상의 완화에 유용할 것이다.

"치매"는 조직 또는 정신 인자에 기인하고, 방향 감각 상실(disorientation), 손상된 기억, 판단과 지력 및 얕고 불안정한 감정(shallow labile affect)으로 특성화되는 전반적인 정신 퇴보(mental deterioration)를 지칭한다. 본 명세서에서 치매에는 혈관성 치매, 허혈 혈관성 치매(IVD), 전두측두 치매(FTD), 루이 소체 치매, 알츠하이머 치매 등이 포함된다. 노인 인구에서 가장 일반적인 치매 형태는 알츠하이머병(AD)이다.

표현 "경등도-중등도" 또는 "초기 단계" AD는 진전되지 않고 질병의 징후 또는 증상이 심각하지 않은 AD를 지칭한다. 경등도-중등도 또는 초기 단계 AD 개체는 숙련된 신경과 전문의 또는 임상의에 의해 확인될 수 있다. 한 구체예에서, 경등도-중등도 AD 개체는 간이 정신 상태 평가(Mini-Mental State Examination, MMSE)를 이용하여 확인된다. 본 명세서에서, "중등도-중증도" 또는 "후기 단계" AD는 진전되고 질병의 징후 또는 증상이 현저한 AD를 지칭한다. 이들 개체는 숙련된 신경과 전문의 또는 임상의에 의해 확인될 수 있다. 이러한 형태의 AD 개체는 콜린에스테라아제(cholinesterase) 저해물질 요법에 더 이상 반응하지 않고, 현저하게 감소된 아세틸콜린(acetylcholine) 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 중등도-중증도 AD 개체는 간이 정신 상태 평가(Mini-Mental State Examination, MMSE)를 이용하여 확인된다. "가족성 AD"는 유전 결함에 의해 유발된 유전된 형태의 AD이다. AD 또는 치매의 "증상"은 개체에 의해 경험되고 AD 또는 치매를 지시하는, 구조, 기능 또는 감각에서 임의의 병적 현상 또는 정상으로부터 이탈이다.

작용제는 아밀로이드 미소섬유 형성, 집합 또는 침착과 연관된 질환을 치료하기 위하여 치료적으로 또는 예방적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 작용제는 미소섬유 형성 과정을 완화시키거나, 아밀로이드-β에 의해 유도된 신경변성 또는 세포 독성을 저해하거나, 아밀로이드-β 유도된 감염을 저해하거나, 뇌로부터 아밀로이드-β의 소거를 강화시키거나, 또는 Aβ의 더욱 많은 이화(catabolism)를 유리하게 하는 작용을 한다.

작용제는 예로써, 뇌 Aβ를 비-원섬유 형태로 유지함으로써, 또는 뇌로부터 이의 소거를 유리하게 함으로써 뇌 Aβ에 직접적으로 작용함으로서 아밀로이드-β 침착을 통제하는데 효과적이다. 이들 화합물은 APP 가공을 지연시키거나, 대식세포 또는 뉴런 세포에 의한 Aβ 원섬유의 변성을 증가시키거나, 또는 활성화된 소교세포(microglia)에 의한 Aβ 생산을 감소시킨다. 이들 작용제는 또한, 뇌 내에서 Aβ가 세포 표면과 상호작용하는 것을 예방하고, 따라서 신경독성, 신경변성, 또는 염증을 예방한다.

본 발명에 따른 방법으로 확인되는 작용제는 알츠하이머병(가령, 단발성 또는 가족성 AD)을 치료하는데 이용될 수 있다. 작용제는 또한, 예로써, 다운증후군 개체에서 및 뇌 아밀로이드 맥관병증("CAA"), 유전성 뇌 출혈(hereditary cerebral hemorrhage), 또는 초기 알츠하이머병 환자에서 아밀로이드-β 침착의 다른 임상적 발생을 예방하거나 또는 치료하는데 이용될 수 있다.

작용제는 경등도 인식 손상을 치료하는데 이용될 수 있다. 경등도 인식 손상("MCI")은 사고 기능(thinking skill)에서 경미하지만 측정가능한 손상 상태로 특성화되는 장애인데, 이는 치매의 존재와 반드시 연관되는 것은 아니다. MCI는 반드시 그런 것은 아니지만 빈번하게 알츠하이머병을 선행한다.

부가적으로, 근섬유(muscle fiber) 내에서 APP와 아밀로이드-β 단백질의 비정상적인 축적은 산발성 봉입체 근염(sporadic inclusion body myositis, IBM)의 병리에 관여하였다(Askanas, V., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1314-1319; Askanas, V. et al. (1995) Current Opinion in Rheumatology 7: 486-496)). 따라서 본 발명의 방법에 의해 확인된 작용제는 아밀로이드-β 단백질이 비-신경학적 위치(non-neurological location)에 비정상적으로 침착되는 질환의 치료, 예를 들면, EBM의 치료에서, 근섬유에 이들 화합물의 전달에 의해 예방적으로 또는 치료적으로 이용될 수 있다.

부가적으로, Aβ는 연령-관련된 황반 변성(age-related macular degeneration, ARMD) 개체에서 망막 색소 상피(retinal pigmented epithelium)의 기저 표면을 따라 축적되는 drusen으로 알려져 있는 비정상적인 세포외 침착물과 연관된다. ARMD는 노인 인구에서 비가역성 시력 상실의 원인이다. Aβ 침착은 망막 색소 상피의 위축, drusen 생물발생(biogenesis) 및 ARMD의 병인의 원인이 되는 국소 염증 현상(local inflammatory event)의 중요한 구성요소인 것으로 생각된다(Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(18), 11830-5 (2002)).

따라서 본 발명은 전반적으로, 개체(바람직하게는, 인간)에서 아밀로이드-관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 방법으로 확인되는 작용제 또는 화합물의 치료량(therapeutic amount)을 개체에 투여하여, 아밀로이드 미소섬유 형성 또는 침착, 신경변성, 또는 세포 독성이 감소 또는 저해되도록 하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체(바람직하게는, 인간)에서 아밀로이드-관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 방법으로 확인된 화합물의 치료량을 개체에 투여하여, 뇌 유전분증, 예를 들면, 알츠하이머병, 다운증후군 또는 뇌 아밀로이드 맥관병증 환자에서 인식 기능이 향상되거나 안정화되고, 또는 인식 기능에서 추가적인 악화가 예방되거나, 지연되거나, 또는 중단되도록 하는 단계를 포함한다. 이들 화합물은 이들 개체에서 일상생활의 질 역시 향상시킬 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 아밀로이드-관련된 질환의 치료를 위한 작용제를 함유하는 제약학적 조성물 및 이런 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관계한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 방법으로 확인되는 작용제는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 작용제는 적절한 용매를 포함하는 용액 또는 용매-없는 형태(가령, 냉동 건조된 형태)로 공급된다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 작용제와 완충제는 키트(kit)로 포장될 수 있다. 키트는 본 명세서에 기술된 방법에 따라 상업적으로 이용되고, 본 발명의 방법에 이용되는 사용설명서(instruction)를 포함한다. 추가 키트 성분에는 산(acid), 염기(base), 완충제(buffering agent), 무기염(inorganic salt), 용매(solvent), 항산화제(antioxidant), 보존제(preservative), 또는 금속 킬레이터(metal chelator)가 포함된다. 이들 추가 키트 성분은 순수한 조성물로, 또는 한 가지 이상의 추가 키트 성분을 통합하는 수용액 또는 유기 용액으로 존재한다. 이들 키트 성분에는 완충제가 임의적으로 더욱 포함된다.

또한, 치료제는 비경구, 복강내, 척수내, 또는 뇌내 투여될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 보관과 이용 조건 하에서, 이들 제조물은 미생물의 성장을 예방하기 위하여 보존제를 포함한다.

비경구 투여(parenteral administration) 이외의 경로로 치료제를 투여하기 위하여, 작용제를 이의 불활성화를 예방하는 물질로 코팅하거나, 또는 작용제와 이의 불활성화를 예방하는 물질을 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 가령, 치료제는 적절한 담체, 예를 들면, 리포솜, 또는 희석제에 담겨 개체에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제에는 염수(saline)와 수성 완충액(aqueous buffer solution)이 포함된다. 리포솜에는 수중유 또는 유중수 CGF 에멀젼 및 통상적인 리포솜이 포함된다(Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).

주사가능 용도에 적합한 제약학적 조성물에는 무균 수용액(물 가용성인 경우에), 또는 무균 주사가능 용액이나 분산액의 즉석 제조(extemporaneous preparation)를 위한 분산액과 무균 분말이 포함된다. 모든 사례에서, 조성물은 무균이어야 하고, 용이한 주사가능성(syringability)이 담보될 정도까지 유체이어야 한다. 이는 제조와 보관 조건 하에 안정해야 하고, 세균과 진균과 같은 미생물의 오염 작용(contaminating action)으로부터 보존되어야 한다.

적절한 약학적으로 허용되는 운반제에는 제한없이, 경구, 비경구, 비강, 점막, 경피, 혈관내(IV), 동맥내(IA), 근육내(IM)와 피하(SC) 투여 경로에 적합한 임의의 비-면역원성 제약학적 어쥬번트(non-immunogenic pharmaceutical adjuvant), 예를 들면, 인산염 완충액(phosphate buffer saline, PBS)이 포함된다.

운반제는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 용매 또는 분산 매체(dispersion medium), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일(vegetable oil)일 수 있다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅의 이용으로, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지로, 그리고 계면활성제의 이용으로 유지될 수 있다. 미생물의 작용 예방은 다양한 항균제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤(paraben), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀(phenol), 아스코르빈산(ascorbic acid), 치메로살(thimerosal) 등으로 달성될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장성제(isotonic agent), 예를 들면, 당(sugar), 염화나트륨(sodium chloride), 또는 폴리알코올(polyalcohol), 예를 들면, 만니톨(mannitol)과 소르비톨(sorbitol)이 포함된다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 또는 젤라틴(gelatin)을 조성물 내에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

무균 주사가능 용액은 필요에 따라, 앞서 언급된 성분 중에서 한 가지 또는 이들 성분의 조합과 함께 적절한 용매 내에 필요량의 치료제를 통합한 이후 여과된 멸균(filtered sterilization)으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매체(basic dispersion medium) 및 앞서 기술된 것들로부터 다른 필요 성분을 포함하는 무균 운반제 내로 치료제를 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조(vacuum drying)와 냉동 건조(freeze-drying)인데, 이러한 방법은 활성 성분(즉, 치료제) + 상기 무균-여과된 용액으로부터 추가의 소요 성분의 분말을 산출한다.

치료제는 예로써, 불활성 희석제 또는 동화가능 식용 담체(assimilable edible carrier)와 함께 투여될 수 있다. 치료제와 다른 성분은 또한, 경성이나 연성 껍질 젤라틴 캡슐(gelatin capsule)에 내포되거나, 정제로 압착되거나, 또는 개체의 식이 내로 직접적으로 통합될 수도 있다. 경구 치료 투여를 위하여, 치료제는 부형제(excipient)와 통합되고, 섭취가능 정제, 경구정막(buccal) 정제, 트로치(troche), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액(suspension), 시럽(syrup), 와이퍼(wafer) 등의 형태로 이용된다. 조성물과 제조물 내에서 치료제의 비율은 당연히 변화될 수 있다. 이런 치료에 유용한 조성물 내에서 치료제의 양은 적절한 용량이 달성되도록 하는 양이다.

특히, 용이한 투여와 균일한 용량을 위하여 단위 제형(dosage unit form)으로 비경구 조성물을 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에서에 단위 제형은 치료되는 개체에 대한 단위 용량(unitary dosage)으로 적합된 물리적으로 독립적인 단위를 지칭한다; 각 단위는 요구되는 제약학적 운반제와 함께, 원하는 치료 효과를 산출하도록 산정된 미리 결정된 양의 치료제를 포함한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 명세는 (a) 치료제의 독특한 특성과 달성되는 특정 치료 효과 및 (b) 개체에서 아밀로이드 침착의 치료를 위하여 이런 치료제를 합성하는 분야에 내재된 한계에 의해 직접적으로 좌우된다.

이런 이유로, 본 발명에는 에어로졸, 경구와 비경구 투여를 위한 약학적으로 허용되는 운반제 내에서 본 발명에 따른 방법으로 확인되는 작용제 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 제약학적 제제(pharmaceutical formulation)가 포함된다. 또한, 본 발명에는 이런 작용제 또는 이의 염이 포함되는데, 이들은 냉동 건조되고, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의한 투여를 위한 약학적으로 허용되는 제제를 형성하도록 재구성될 수 있다. 투여는 또한, 피내(intradermal) 또는 경피(transdermal)일 수 있다.

본 발명에 따라, 작용제 및 약학적으로 허용되는 이의 염은 고체로서 경구 또는 흡입을 통하여 투여되거나, 또는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 근육내 또는 정맥내 투여될 수 있다. 대안으로, 작용제 또는 이의 염은 리포좀 현탁액(liposomal suspension)으로서 흡입으로, 정맥내 또는 근육내 투여될 수도 있다. 에어로졸로서 흡입에 의한 투여에 적합한 제약학적 제제 역시 제시된다. 이들 제제는 원하는 작용제 또는 이의 염의 용액이나 현탁액, 또는 이러한 작용제 또는 염의 복수의 고형 입자(solid particle)를 포함한다. 원하는 제제는 소형 챔버 내에 배치되고 분무될 수 있다. 분무(nebulization)는 작용제 또는 이의 염을 포함하는 복수의 액상 비말(liquid droplet) 또는 고형 입자를 형성하는 압축 공기(compressed air)에 의해 또는 초음파 에너지(ultrasonic energy)에 의해 달성될 수 있다. 이들 액상 비말 또는 고형 입자는 대략 0.5 내지 대략 5 마이크론(micron) 범위의 입자 크기를 갖는다. 이들 고형 입자는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 미분화(micronization)에 의해, 고형 작용제 또는 이의 염을 가공함으로써 수득될 수 있다. 고형 입자 또는 비말의 크기는 예로써, 대략 1 내지 대략 2 마이크론이다. 이와 관련하여, 이러한 목적을 달성하기 위하여 상업적 분무기(nebulizer)가 가용하다. 비강내 전달에서, 비말 크기는 전형적으로, 대략 10 내지 대략 20 마이크론 또는 그 이상이다.

에어로졸로서 투여에 적합한 제약학적 제제는 액체 형태이고, 이러한 제제는 물을 포함하는 담체 내에 물-가용성 작용제 또는 이의 염을 포함한다. 계면활성제는 분무될 때 원하는 크기 범위 내에 비말의 형성을 결과할 만큼 충분히 제제의 표면 장력(surface tension)을 낮추기 위하여 존재한다.

경구 조성물(peroral 조성물)에는 또한, 액상 용액, 에멀젼, 현탁액 등이 포함된다. 이런 조성물의 제조에 적합한 약학적으로 허용되는 운반제는 당분야에 널리 공지되어 있다. 시럽, 엘릭시르, 에멀젼과 현탁액에 대한 담체의 전형적인 성분에는 에탄올(ethanol), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 액상 수크로오스(liquid sucrose), 소르비톨(sorbitol)과 물이 포함된다. 현탁액의 경우에, 전형적인 현탁제(suspending agent)에는 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose), 트래거캔스(tragacanth)와 알긴산나트륨(sodium alginate)이 포함된다; 전형적인 습윤제(wetting agent)에는 레시틴(lecithin)과 폴리소르베이트(polysorbate) 80이 포함된다; 전형적인 보존제에는 메틸 파라벤(methyl paraben)과 벤조산나트륨(sodium benzoate)이 포함된다. 경구 액상 조성물((peroral liquid 조성물)은 또한, 앞서 기술된 감미료(sweetener), 향료(flavoring agent)와 착색제(colorant)와 같은 한 가지 이상의 성분을 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 또한, 전형적으로, pH 또는 시간-의존성 코팅을 이용한 전형적인 방법으로 피복되는데, 여기서 목적 작용제는 소요 작용을 연장하기 위하여 원하는 국소 적용의 인근 부위에서, 또는 다양한 시점에서 위장관(gastrointestinal tract)으로 방출된다. 이런 제형(dosage form)에는 전형적으로, 한 가지 이상의 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 폴리비닐아세테이트 프탈레이트(polyvinylacetate phthalate), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(hydroxypropyl methyl cellulose phthalate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 왁스(wax)와 셸락(shellac)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

목적 작용제의 전신 전달(systemic delivery)을 달성하는데 유용한 다른 조성물에는 설하(sublingual), 경구점막과 비강 제형이 포함된다. 이런 조성물은 전형적으로, 한 가지 이상의 가용성 충전제 물질(filler substance), 예를 들면, 수크로오스(sucrose), 소르비톨(sorbitol)과 만니톨(mannitol); 및 결합제(binder), 예를 들면, 아카시아(acacia), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)와 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose)를 포함한다. 앞서 기술된 활택제(glidant), 윤활제(lubricant), 감미료(sweetener), 착색제(colorant), 항산화제(antioxidant)와 향료(flavoring agent) 역시 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 예로써, 개체의 표피(epidermal) 또는 상피(epithelial) 조직에 조성물의 직접적인 바름(laying on) 또는 펼침(spreading)에 의해, 또는 경피 "패치(patch)"를 통하여 개체에 국소 투여될 수도 있다. 이런 조성물에는 예로써, 로션(lotion), 크림(cream), 용액(solution), 겔(gel)과 고형물이 포함된다. 이들 국소 조성물은 효과량(effective amount), 통상적으로, 최소한 0.1%, 또는 심지어, 대략 1% 내지 5%의 본 발명의 작용제를 함유할 수 있다. 국소 투여에 적합한 담체는 전형적으로, 연속 필름(continuous film)으로 피부 상에 존재하고, 발한(perspiration) 또는 물에 담금(immersion)에 의한 제거에 저항한다. 일반적으로, 담체는 본질적으로 유기(organic)이고, 여기에 치료제가 분산되거나 분해될 수 있다. 담체는 약학적으로 허용되는 연화제(emolient), 유화제(emulsifier), 농후제(thickening agent), 용매 등을 포함할 수 있다.

상기에서 및 하기 실시예에서 더욱 기술된 바와 같이, 본 발명은 β-APP-제시 세포와 PS-제시 세포 사이에 특이적인 부착(specific adhesion)이 상이한 생리학적 결과를 나타낼 수 있음을 뒷받침하는데, 한 결과는 이들 단백질의 정상 기능과 연관된 세포횡단(근접분비) 신호전달 과정이고, 다른 결과는 궁극적으로, 알츠하이머병의 병리를 유발하는 β-APP의 Aβ로의 단백분해(proteolysis)이다.

G-단백질 결핍된 수용체(GPCR)는 공통 구조 모티프를 공유한다. 일반적으로, GPCR은 7개의 알파 나선(alpha helix)을 형성하는 22개 내지 24개 소수성 아미노산의 7개 서열을 보유하는데, 이들 각각은 막에 걸쳐있다. 막통과 나선은 세포 막의 외부 또는 "세포외" 부분에서 막통과-2와 막통과-3, 막통과-4와 막통과-5, 막통과-6과 막통과-7 사이에 아미노산 가닥에 의해 연결된다(이들은 각각, "세포외" 영역 1, 2와 3(EC-1, EC-2와 EC-3)으로 지칭된다). 막통과 나선은 또한, 세포 막의 내부 또는 "세포내" 부분에서 막통과-1과 막통과-2, 막통과-3과 막통과-4, 막통과-5와 막통과-6 사이에 아미노산 가닥에 의해 연결된다(이들은 각각, "세포내" 영역 1, 2와 3(IC-1, IC-2와 IC-3)으로 지칭된다). 수용체의 "카르복시"("C") 말단은 세포 내부에서 세포내 공간에 존재하고, 수용체의 "아미노"("N") 말단은 세포 외부에서 세포외 공간에 존재한다.

일반적으로, 리간드가 수용체와 결합할 때(종종, 수용체의 "활성화"로 지칭됨), 세포내 영역과 세포내 "G-단백질" 사이에 결합을 가능하게 하는, 세포내 영역의 형태 변화가 나타난다. GPCR은 G 단백질에 대하여 무차별적으로 결합하는 것으로 보고되었다, 다시 말하면, GPCR은 1개 이상의 G 단백질과 상호작용할 수 있는 것으로 보고되었다(참조: Kenakin, T., 43 Life Sciences 1095 (1988)). 다른 G 단백질이 존재하긴 하지만, Gq, Gs, Gi, Gz와 Go가 현재 확인된 G 단백질이다. G-단백질과의 내인성 리간드-활성화된 GPCR 결합은 신호전달 캐스케이드 과정("신호 전달(signal transduction)")을 시작시킨다. 정상적인 조건 하에, 신호 전달은 궁극적으로, 세포 활성화 또는 세포 저해를 결과한다. 수용체의 IC-3 루프와 카르복시 말단 둘 모두 G 단백질과 상호작용하는 것으로 생각된다.

수용체 활성화된 G 단백질은 세포 막의 내부 표면에 결합한다. 이들은 Gα 및 단단하게 결합된 Gβγ 아단위로 구성된다. 리간드는 G 단백질-결합된 수용체를 활성화시킬 때, G 단백질이 수용체에 결합할 수 있도록 수용체 내에 형태 변화(외형 변화)를 유도한다. 이후, G 단백질은 Gα 아단위로부터 그의 결합된 GDP를 방출하고, GTP의 새로운 분자에 결합한다. 이러한 교환은 Gα 아단위, Gβγ 이합체 및 수용체의 분리를 유인한다. Gα-GTP와 Gβγ 둘 모두 상이한 신호전달 캐스케이드(또는 이차 메신저 경로(second messenger pathway))와 효과기 단백질을 활성화시킬 수 있는 반면, 상기 수용체는 차기 G 단백질을 활성화시킬 수 있다. Gα 아단위는 궁극적으로, 내재된 효소 활성으로, 부착된 GTP를 GDP로 가수분해하여 GDP가 Gβγ와 재결합하고 새로운 주기를 시작하도록 할 수 있다.

구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G_o("o")의 알파 아단위는 다양한 수용체와 효과기 사이에 신호 전달을 매개한다. 2가지 형태의 Go 알파 아단위는 뇌 조직 라이브러리로부터 분리된다. 이들 2가지 형태, G_oA 알파와 G_oB 알파(일명, G_oA와 G_oB)는 대안적 절단접합(alternative splicing)의 산물이다. G_oA 알파 전사체는 다양한 조직에 존재하긴 하지만 뇌에서 가장 풍부하다. G_oB 알파 전사체는 뇌와 고환에서 가장 높은 수준으로 발현된다.

GPCR은 인간 게놈 내에서 최대 유전자 계통 중의 하나를 포함하고, 그리고 신경전달물질, 호르몬, 케모킨 및 많은 다른 분자에 의해 조절되는 많은 다양한 세포 기능을 매개한다. GPCR 신호전달의 시의적절한 짝풀림(uncoupling)은 GPCR-매개된 생리학적 기능(physiological function)의 적절성(appropriateness)과 일체성(integrity)을 유지시키는데 결정적이다. 이러한 짝풀림은 훨씬 적은 수의 유전자 계통, GPCR 키나아제(GRK)의 7개 구성원에 의해 주로 매개된다. 다수의 GPCR을 조절하는 소수 GRK 구성원의 특이성(specificity)은 작동약-의존성 방식으로 통제된다. 다시 말하면, GRK는 작동약-점유된 GPCR에 우선적으로 결합하고 이를 인산화시켜 상동성 탈감작화(homologous desensitization)로 알려져 있는 과정인 상응하는 G-단백질로부터 수용체의 짝풀림을 유도한다. 구조적 유사성에 기초하여, 7개의 공지된 GRK 구성원은 4개의 하위계통(GRK1, GRK2/3, GRK4/5/6과 GRK7)로 분류되는데, GRK2/3과 GRK5/6은 뇌를 비롯한 편재성 분포를 나타낸다. GRK2 및 아마도, GRK5의 조절곤란(dysregulation)은 만성 심부전(chronic heart failure), 심근 허혈(myocardial ischemia)과 고혈압(hypertension), 그리고 GRK가 폭넓게 연구되고 있는 다른 심혈관 질환의 병인(pathogenesis)에 관련된다. GRK1에 의한 시홍소 신호전달(rhodopsin signaling)의 탈감작화 실패는 광수용체 세포 사멸(photoreceptor cell death)을 유발할 수 있고, 망막색소상피 변성증(retinitis pigmentosa)의 원인이 되는 것으로 생각된다. 이에 더하여, 증가된 GRK2 수준은 진정제 중독(opiate addiction)과 연관되었다. 하지만, 이들 이외에, GPCR 변성과 잠재적으로 연관된 많은 다른 병리학적 장애, 예를 들면, AD에서 GRK의 역할은 거의 조사되지 않고 있다.

GPCR의 막 위치로 인하여, 형질 막 상에서 또는 시토졸(cytosol) 내에서 GRK의 유지는 GPCR에 대한 이의 접근과 결합에 물리적인 영향을 준다. 휴지기 세포(resting cell)에서, GRK4 하위계통 구성원(GRK4/5/6 포함)은 형질 막과 단단하게 결합하는 반면, GRK2 하위계통 구성원(GRK2/3)은 주로 시토졸 내에 위치하고 세포가 GPCR 작동약에 의해 자극될 때 막으로 전위된다. 하지만, 활동 세포 내에서, GRK의 세포내 위치(subcellular localization)는 막 vs. 시토졸 내에서 GRK-결합 인자의 내용물(content)과 용량(capacity)에 의해 결정되는 것으로 보인다. 인지질, 특히, 포스파티딜이노시톨-4,5-비포스페이트(phosphatidylinositol-4,5- biphosphate)는 막에 GRK 부착에서 일정한 역할을 수행하고 GPCR에 결합하는 것으로 생각되고, 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS) 역시 막 상에서 GPCR에 GRK2 결합을 강화시킬 수 있다. 다른 한편, 칼슘(calcium)/칼모듈린(calmodulin)과 다른 칼슘-결합 단백질, 그리고 액틴(actin), 액티닌(actinin) 등은 시토졸 내에서 GRK를 격리하고 GPCR에 GRK의 결합을 저해하는데 기여할 수 있다.

AD 뇌에서, 현저한 막 변형, 비정상적인 포스포이노시티드 대사(phosphoinositide metabolism), 교란된 칼슘 항상성(disrupted calcium homeostasis)과 조직붕괴된 세포골격 단백질(disorganized cytoskeleton protein) 모두 GRK의 세포내 분포(subcellular distribution)에 영향을 줄 수 있다. 이에 더하여, AD 병인에 중심적인 소수성 펩티드인 증가된 β-아밀로이드는 막 포스파티딜이노시톨-4,5-비포스페이트를 감소시키고 [Ca²⁺]_i를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 프리세닐린이 G-단백질 결합된 수용체 (GPCR)의 한 가지 유형으로서 기능하고, 이차 메시지전달(secondary messaging) 및 하류 효과(downstream effect)를 결과한다는 증거에 부분적으로 기초된다. PS-1과 PS-2에 대한 7-TM 구조(시홍소의 구조와 유사)의 증거는 PS-1과 PS-2가 본질적으로 유사한 구조를 공유하는 단백질의 G-단백질 결합된 수용체 대과에 속하는 지와 관련된 조사를 이끌어 냈다. PS가 지금까지 조사된 대략 1,000 GPCR 중에서 임의의 하나와 실질적인 아미노산 상동성을 나타내지 않지만, 이들 GPCR 모두 7-TM 내부 단백질이라는 사실은 대부분이 서로 간에 서열 상동성을 보이진 않음에도 불구하고, PS 분자 역시 GPCR일 가능성의 여지를 남긴다.

프리세닐린의 GPCR 활성은 N141I-PS-2 돌연변이를 이용하여 확인하였다. Volga German 가계에서 FAD와 연관된 이 돌연변이는 백일해 독소(PTx) 감수성 방식으로 PC-12 세포 사멸을 유발하였다. 다른 연구에서는 PS-1의 39개 아미노산 잔기 카르복실-말단 도메인(막 내에 PS-1의 거의 모든 지역적 모형(topographic model)에서 세포질 내에 위치함) 내에, 뇌 G_o 단백질에 대한 특이적인 결합과 조절 도메인이 존재한다고 제안하였다. 시험관내에서 G_o에 결합하는 PS-1의 이러한 도메인은 또한, 2개의 다른 GPCR 단백질, D2-도파민성 수용체와 5HT-1B 수용체, 그리고 G-단백질 활성화 올리고펩티드, 마스트로파란(mastoparan)의 G-결합 도메인과 다소의 지역적 아미노산 서열 상동성을 보인다. PS-1이 기능적 GPCR일 가능성은 본 명세서에서 더욱 기술된다.

본 발명에서는 G-단백질 G_o이 전장 PS-1에 결합하고 백일해 독소에 의해 저해된다는 것을 증명한다. 이에 더하여, G_oA만 PS-1에 결합하고, G_oB는 그렇지 않다. PS-1의 꼬리 없는 구조체로 ES 눌 세포의 형질감염은 결합의 대부분이 PS-1의 카르복실 말단 꼬리에서 진행된다는 것을 증명한다. 하지만, 이들 결과는 또한, 다른 세포질 루프 영역(loop region)이 결합에 관여할 수도 있음을 지시하는데, 그 이유는 매우 소량의 결합이 꼬리 없는 PS-1의 존재에서 발생했기 때문이다. 본 발명에서는 또한, G-단백질이 PS-1뿐만 아니라 PS-2에도 결합하고, 그리고 PS-2의 경우에 G_oA의 결합 이외에, G_oB 역시 본래 PS-2에 결합하는 것을 증명한다. 이러한 결합은 꼬리 없는 PS-2가 전장 PS-2 대신에 이용되는 경우에도 여전히 존재한다. 이들 결과는 G_oB가 C-꼬리 이외의 세포질 도메인에서 PS-2에 결합한다는 것을 암시한다. PS-1에 대한 ³⁵S-GTPγS-표지된 Gα_oA 결합에서 700% 이상의 증가(Gα_oB에서는 그렇지 않음)가 관찰된다. PS-2의 경우에, ³⁵S-GTPγS-표지된 Gα_oA 결합의 기저 수준(basal level)에 비하여 700% 이상 증가 및 ³⁵S-GTPγS-표지된 Gα_oB에서 ~ 300% 증가가 유사하게 관찰된다. PTx로 처리는 G_oA와 G_oB 둘 모두에 ³⁵S-GTPγS의 통합을 저해한다.

따라서 G_oA는 유사한 비율로 PS-1과 PS-2 둘 모두에 결합하는 반면, PS-2에 G_oB의 결합은 동일한 실험 조건하에 G_oA에서 관찰된 결합의 절반에도 미치지 못한다. 이러한 데이터는 PS-1과 PS-2에 G-단백질 결합의 기능적 결과를 확증하고, 이들 2개의 프리세닐린 단백질을 G-단백질 결합된 수용체(GPCR)로서 더욱 특성화시킨다.

PS-1과 PS-2는 다른 두 개의 계통보다는 계통 3 GPCR과 더욱 많은 공통 특징을 갖는 것으로 보인다 - 둘 모두 계통 3 GPCR의 특징인 대형 세포외 도메인(N-말단, 그리고 TM VI과 VII 사이에 친수성 루프)을 보유한다. 계통 3 GPCR에서 리간드 결합은 세포외 도메인, 일반적으로, 아미노 말단 도메인을 통하여 배타적으로 진행되는 것으로 보인다. PS-1 또는 PS-2의 N-말단 도메인은 프리세닐린 GPCR 활성화의 가능한 작동약로서 제안된 리간드인 β-APP에 대한 PS-1 또는 PS-2의 개별적인 시험관내 결합을 위하여 충분하다. 일부 계통 3 구성원은 일반적으로, 세포외 Cys 잔기를 통한 이황화 결합(di-sulfide bond)에 의해 동종이합체(homodimer)를 형성한다. PS-1과 PS-2는 이합체(dimer)로서 막 내에 존재하는 것으로 널리 알려져 있다. 게다가, 이들 둘 모두 그들의 세포외 도메인(7-TM 구조) 내에 Cys 잔기를 보유한다. 계통 3 GPCR 모두 가장 짧은 루프로서 세 번째 세포내 루프를 보유하고, 이는 각 유형 간에 보존된다. 유사하게, PS-1과 PS-2 내에서 세 번째 세포내 루프는 완전하게 보존되고 서열 KYLPEW(서열 번호 2의 아미노산 239 내지 243 및 서열 번호 4의 아미노산 245 내지 250)로 구성되는 가장 짧은 루프이다. 계통 3 GPCR의 일부 구성원은 그들의 카르복실 말단 PDZ 결합 도메인을 통하여 세포내 PDZ-도메인 단백질, 예를 들면, Homer와 직접적으로 상호작용한다. 여러 PDZ 단백질에 결합하는 것으로 밝혀진 PS-1의 카르복실 말단 꼬리 내에 PDZ 결합 도메인이 존재한다.

PS는 세포-표면에서 발현가능하고 7-TM 구조를 보유하며, 그리고 PS-1과 PS-2는 β-APP와의 특이적인 세포-세포 상호작용에 참여한다; 이러한 β-APP:PS 매개된 세포내 상호작용은 티로신 키나아제 활성과 단백질 티로신 인산화에서 일시적인 증가를 결과한다. 더 나아가, β-APP:PS 매개된 세포-세포 상호작용은 Aβ 생산의 최소한 주요한 일부로서 요구된다. β-APP와 PS 사이에 이러한 세포내 상호작용은 단백질 티로신 키나아제와 G-단백질 신호전달 경로 사이에 크로스 토크(cross-talk)로 인하여, PS에 G-단백질 결합을 활성화시킨다.

본 발명에서 PS에 의한 G_o 활성화가 Aβ 생산에 궁극적인 영향을 주는 것으로 확인되었기 때문에, 본 발명에서는 한 측면에서, PS-G_o 특이적 결합의 적절하게 설계된 저해물질을 이용한 AD에 대한 약물 요법(drug therapy)을 제시한다.

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 이런 가능한 세포내 단백질 티로신 인산화 신호전달 사건을 탐지하기 위한 실험이 수행되었다. β-APP로 일시적으로 형질감염된 배양된 DAMI(인간 거핵아구(megakaryoblast)) 세포가 PS-1 또는 PS-2로 형질감염된 DAMI 세포와 혼합되는 경우에, 혼합후 수분 이내에, 이들 세포 추출물은 대조에서 또는 특이적인 β-APP:PS 결합의 저해물질을 포함하는 세포 혼합물에서 관찰되지 않는, 단백질 티로신 키나아제 활성 및 단백질 기질의 포스포티로신(PTyr) 변형에서 현저한 일시적인 증가를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 신호전달의 하류 결과는 PS-1 또는 PS-2가 β-APP에 대한 세포내 결합에 관여하는 지에 따라 달라졌는데, 그 이유는 강화된 티로신 인산화를 보이는 단백질의 스펙트럼이 이들 두 사례에서 전혀 상이했기 때문인데, 이는 이들 2가지 매우 상동한 PS 단백질의 생화학적 기능의 중복성(redundancy)보다는 이들 기능 사이에 차별성(distinction)을 암시한다.

게다가, 본 발명에서는 대조 실험에서 형질감염되지 않거나, 또는 β-APP로 형질감염된, 본 명세서에서 ES 이중-눌 세포로 지칭되는 PS-1^-/-, PS-2^-/- 이중 눌 생쥐로부터 유래된 배아 줄기(ES) 세포를 이용함으로써 앞서 기술된 생리 경로(biological pathway)를 증명한다. 후자 사례에서, β-APP-형질감염된 ES 세포는 PS-1- 또는 PS-2-형질감염된 DAMI 세포와 혼합된다; 이들 DAMI 세포는 그들의 표면 상에서 상당량의 내인성 β-APP를 발현하지 않는다. 따라서 이러한 혼합된 세포-배양 시스템에서, β-APP-형질감염된 ES 이중-눌 세포는 세포-표면 발현된 β-APP의 유일 공급원으로서 기능하고, PS-형질감염된 DAMI 세포는 세포-표면 발현된 PS의 유일 공급원이다. β-APP:PS 특이적인 신호전달 사건이 이러한 시스템에서 진행되면, 이는 이들 2가지 세포형 사이에 근접분비(juxtacrine) 상호작용의 결과이다. 본 발명에서는 이런 상호작용을 증명한다.

신호전달이 Src 계통 티로신 키나아제 활성에서 일시적인 상승을 동반하고, β-APP와 PS-1 사이에 세포내 신호전달을 매개하는 개별 Src 계통 구성원이 pp60c-src인 것으로 증명된다. 대조적으로, β-APP:PS-2 신호전달은 Src 계통 구성원 Lyn을 필요로 한다. 이들 신호전달 사건은 정상적인 생리에 영향을 준다. 가령, 이들은 β-APP 눌 생쥐의 발달에서 직면되는 생리 결함에서 일정한 역할을 할 수 있다. 이들 Src 계통의 키나아제는 암, 면역계 기능장애 및 골 재형성 질환(bone remodeling disease)에 관여한다. 전반적인 개관을 위하여, Thomas and Brugge, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 513; Lawrence and Niu, Pharmacol. Ther. 1998, 77, 81; Tatosyan and Mizenina, Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49-58; Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717을 참조한다.

포유동물에서 Src 계통의 구성원에는 아래의 8가지 키나아제가 포함된다: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck, Blk. 이들은 52 내지 62 kD 범위의 분자량(molecular mass)을 갖는 비수용체 단백질 키나아제이다. 이들 모두 6개의 상이한 기능성 도메인으로 구성되는 공통 조직 구조(structural organization)로 특성화된다: Src 상동성 도메인 4(SH4), 유일 도메인, SH3 도메인, SH2 도메인, 촉매 도메인(SH1), 그리고 C-말단 조절 영역(Tatosyan et al. Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49-58). 발표된 연구 결과에 기초하여, Src 키나아제는 다양한 인간 질환에 대한 잠재적인 치료 표적으로 간주된다.

GSK-3 활성은 또한, 알츠하이머병과 연관된다. 상기 질환은 널리 공지된 β-아밀로이드 펩티드의 존재 및 세포내 신경원섬유(neurofibrillary tangle)의 형성으로 특성화된다. 이들 신경원섬유는 과인산화된 Tau 단백질을 포함하는데, 여기서 Tau는 비정상 부위에서 인산화된다. GSK-3은 세포와 동물 모형에서 이들 비정상 부위를 인산화시키는 것으로 밝혀졌다. 게다가, GSK-3의 저해는 세포 내에서 Tau의 과인산화를 예방하는 것으로 밝혀졌다. GSK3을 과다발현하는 유전자도입 생쥐에서, 현저하게 증가된 Tau 과인산화 및 뉴런의 비정상적 형태(abnormal morphology)가 관찰되었다. 활성 GSK3은 미리 얽힌 뉴런의 세포질 내에 축적되는데, 이는 AD 환자의 뇌에서 신경원섬유를 유발할 수 있다. 이런 이유로, GSK-3의 저해는 신경원섬유의 발생을 지연 또는 중단시키고, 따라서 알츠하이머병을 치료하거나 이의 심각도를 감소시킨다. 알츠하이머병에서 GSK-3이 수행하는 역할의 증거는 시험관내에서 확인되었다(참조: Aplin et al. (1996), J Neurochem 67:699; Sun et al. (2002), Neurosci Lett 321:61; Takashima et al. (1998), PNAS 95:9637; Kirschenbaum et al. (2001), J Biol Chem 276:7366; Takashima et al. (1998), Neurosci Res 31:317; Takashima et al. (1993), PNAS 90:7789; Suhara et al. (2003), Neurobiol Aging. 24:437; De Ferrari et al. (2003) Mol Psychiatry 8:195; 그리고 Pigino et al., J Neurosci, 23:4499, 2003). 알츠하이머병에서 GSK-3이 수행하는 역할의 증거는 생체내에서 확인되었다 (참조: Yamaguchi et al. (1996), Acta Neuropathol 92:232; Pei et al. (1999), J Neuropath Exp Neurol 58:1010; Hernandez et al. (2002), J Neurochem 83:1529; De Ferrari et al. (2003) Mol Psychiatry 8:195; McLaurin et al., Nature Med, 8:1263, 2002; and Phiel et al. (2003) Nature 423:435).

프리세닐린-1과 키네신(kinesin)-1 역시 GSK-3에 대한 기질이고, 최근에 Pigino, G., et al., Journal of Neuroscience (23:4499, 2003)에서 보고된 바와 같이, 알츠하이머병에서 GSK-3이 수행하는 역할에 대한 다른 기전에 관계한다. GSK3베타는 킨세신(kinsesin)-1 경쇄를 인산화시키고, 이는 막-결합된 소기관(organelle)으로부터 키네신-1의 방출을 유도하고, 빠른 전행성(fast anterograde) 축삭 이동에서 감소를 결과하는 것으로 밝혀졌다. PS-1에서 돌연변이는 GSK-3 활성을 통제 해제하고 증가시킬 수 있는데, 이는 차례로, 뉴런 내에서 축삭 이동을 손상시킨다. 결과로써, 병든 뉴런 내에서 축삭 이동의 감소는 신경병성을 유발한다

본 발명은 β-APP-제시 세포와 PS-제시 세포 사이에 특이적인 부착(specific adhesion)이 상이한 생리학적 결과를 나타낼 수 있음을 뒷받침하는데, 한 결과는 이들 단백질의 정상 기능과 연관된 세포횡단(근접분비) 신호전달 과정이고, 다른 결과는 궁극적으로, 알츠하이머병의 병리를 유발하는 β-APP의 Aβ로의 단백분해(proteolysis)이다. 이러한 시스템에서 근접분비 상호작용에 대한 증거는 β-APP로, 또는 PS-1 또는 PS-2로 적절하게 형질감염된 배양된 DAMI 세포로 획득되었다; 특이적인 β-APP:PS 매개된 세포-세포 상호작용은 부착 세포 중에서 가장 유력하게는 한쪽에서, 또는 가능하게는 양쪽 모두에서 단백질 티로신 키나아제 활성과 단백질 티로신 인산화의 급속하고 일시적인 증가를 유도하였다. DAMI 세포는 이들 세포가 세포 표면에서 상당량의 내인성 β-APP를 정상적으로 발현하지 못하고, 세포 기초(cell substratum)로부터 물리적으로 쉽게 분리되기 때문에 이용되었다. 따라서 ES 이중-눌 세포를 β-APP로 형질감염시킴으로써, 표면 β-APP만을 발현하고 PS를 발현하지 않는 세포가 생산되고, DAMI 세포를 PS-1 또는 PS-2로 형질감염시킴으로써, 표면에서 PS 단백질을 발현하지만 β-APP를 유의하게 발현하지 않는 부가적인 세포가 생산되었다.

결과에서 확인되는 바와 같이, 이들 형질감염된 세포 사이에 혼합 실험은 근접분비 상호작용, 다시 말하면, 한 세포 표면 상에서 막-결합된 PS 및 다른 세포 표면 상에서 β-APP를 필요로 하는 반응에 기인하는, β-APP와 PS 사이에 신호전달을 명백하게 확인한다(도 5). 이러한 상호작용은 가용성 β-APP(β-APP의 외형질성(exoplasmic) 도메인) 및 FLAG에 융합된 PS-1의 N-말단 도메인에 의해 특이적으로 저해되는데, 이는 β-APP와 PS의 상호작용의 이중 특이성(dual specificity)을 증명한다.

이러한 신호전달의 하류 결과는 PS-1 또는 PS-2가 β-APP에 대한 세포내 결합에 관여하는 지에 따라 달라진다. 티로신 인산화에 의해 변형되는 단백질의 스펙트럼은 PS-1 또는 PS-2가 β-APP에 대한 특이적인 세포내 결합에 관여하는 지에 따라 상이하였다. 따라서 본 발명에서는 β-APP와 PS-1이 세포내에서 상호작용할 때 인산화에서 주요한 일시적인 증가를 나타내는 단백질로서 c-Src를 확인한다. Src 키나아제 계통 구성원 Lyn은 β-APP에 대한 PS-2 세포내 결합에 관여하는 우성(또는 최소한 주요) Src 키나아제인 것으로 보인다. 종합하면, 이들 결과는 이들 2가지 매우 상동한 프리세닐린 단백질에 대한 생리학적 기능의 중복성(redundancy)보다는 차별성(distinction)을 결과할 수 있는 상이한 신호전달 기전을 증명한다.

본 발명에서는 β-APP 및 PS-1 또는 PS-2 사이에 근접분비 신호전달이 이들 두 PS 단백질을 구별시키는 신속하고 일시적인 티로신 키나아제 활성화를 결과한다는 것을 증명한다. C-Src 또는 Lyn은 각각, β-APP의 PS-1 또는 PS-2와의 결합에 동원된다. 동원(recruitment)은 신호전달 복합체가 생체내에서 세포-세포 접촉의 부위에서 일시적으로 형성되고, 발달 결과(developmental consequence)를 유발하는 인산화 사건의 캐스케이드를 작동시킨다는 것을 암시한다. β-APP:PS-1 복합체와의 결합에 필요한 Src의 영역 확인은 β-APP:PS-1 신호전달 복합체의 조립과 활성화와 관련된 귀중한 정보를 제공하고, β-APP:PS 복합체와 이들 키나아제 사이에 상호작용이 직접적인 또는 간접적인 지를 지시한다. β-APP는 세포질 티로신 잔기 상에서 인산화되지 않는 것으로 알려져 있고, PS-1 역시 그러한데, 그 이유는 c-Src의 SH2 도메인이 인산화된 티로신 잔기에서만 결합하고, 따라서 상기 도메인을 통한 결합이 가능하지 않기 때문이다.

직접적인 결합은 Src의 SH3 도메인을 통하여 발생할 수 있다. SH3 도메인은 코어 P-X-X-P(서열 번호 10)를 보유하는 프롤린(proline)-풍부한 서열을 인식하는데, 여기서 X는 임의의 아미노산을 표시한다. 리간드는 양쪽 방향 중에서 한쪽 방향으로 SH3 결합 표면을 인식한다. 타입 1 방향으로 결합하는 펩티드는 공통 서열 R-X-L-P-X-Z-P(서열 번호 11)를 따르는데, 여기서 Z는 정상적으로, 소수성 또는 Arg 잔기이다(Kay et al., 2000). 흥미롭게도, PS-1과 PS-2 둘 모두 세포질 카르복실 말단 영역 내에 보존된 1형 SH3 결합 부위(LPALP)(서열 번호 2의 잔기 432 내지 436 또는 서열 번호 4의 잔기 413 내지 417)를 보유한다.

GPCR 상호작용을 저해하는 다수의 작용제는 당분야에 공지되어 있다. 이에 더하여, 다수의 키나아제(가령, c-src, fln 등) 저해물질은 당분야에 공지되어 있고 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. AD를 치료하거나, 또는 기억 기능을 조절하는데 이용될 수 있는, 제약학적으로 허용되는 담체 내에 이들 작용제를 함유하는 조성물이 본 발명에 의해 안출된다.

특이적인 GPCR 스크리닝 분석평가(screening assay) 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 가령, "포괄적인" G 단백질-결합된 수용체 분석평가(즉, 길항약, 작동약, 부분 작동약, 또는 역 작동약인 화합물을 선별하는 분석평가)을 이용하여 후보 화합물이 확인되면, 이들 화합물이 수용체 부위에서 상호작용하는 지를 확인하는 추가의 스크리닝이 수행될 수 있다. 가령, "포괄적인" 분석평가에 의해 확인된 화합물은 수용체에 결합하지 않고, 대신에 세포내 도메인으로부터 G 단백질을 단순히 "분리"시킬 수 있다.

G-단백질 활성은 G-단백질과 연관된 효소를 평가함으로써 결정될 수 있다. 가령, G_s는 아데닐 고리화효소(adenylyl cyclase)를 촉진한다. 한편, G_i(및 G_z와 G_o)는 상기 효소를 저해한다. 아데닐 고리화효소는 ATP의 cAMP로의 전환을 촉매한다; 따라서 G_s 단백질에 결합하는 구조적으로 활성화된 GPCR은 cAMP의 증가된 세포 수준과 연관된다. 다른 한편, G_i(또는 G_z, G_o) 단백질에 결합하는 구조적으로 활성화된 GPCR은 cAMP의 감소된 세포 수준과 연관된다(참조: "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3rd Ed.) Nichols, J. G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)). 따라서 cAMP를 탐지하는 검사법은 후보 화합물이 예로써, 수용체에 대한 역 작동약 또는 작동약인 지를 결정하는데 이용될 수 있다(즉, 이런 화합물은 cAMP의 수준을 감소시킨다). cAMP를 측정하기 위한 당분야에 공지된 다양한 접근법이 이용될 수 있다; 가장 바람직한 접근법은 ELISA-기초된 양식에서 항-cAMP 항체의 이용에 기초한다. 이용될 수 있는 다른 유형의 검사법은 완전 세포 이차 메신저 리포터 시스템(whole cell second messenger reporter system) 검사법이다. 유전자 상에서 프로모터는 특정 유전자가 인코딩하는 단백질의 발현을 주동한다. 환형 AMP는 cAMP-반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자(transcription factor)(CREB)의 결합을 촉진함으로써 유전자 발현을 유도하고, 이후 상기 단백질 또는 인자는 cAMP 반응 요소(response element)라 불리는 특정 부위에서 프로모터에 결합하고 상기 유전자의 발현을 유도한다. 리포터 유전자(reporter gene), 예를 들면, β-갈락토시다아제 또는 루시페라제 앞에 복수 cAMP 반응 요소를 보유하는 프로모터를 포함하는 리포터 시스템이 작제될 수 있다. 따라서 구조적으로 활성화된 Gs-연결된 수용체는 cAMP의 축적을 유도하고, 이는 상기 유전자 및 리포터 단백질의 발현을 활성화시킨다. 이후, 갈락토시다아제 또는 루시페라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학 검사법을 이용하여 탐지될 수 있다.

G_q와 G_o는 효소 인지질가수분해효소 C의 활성화와 연관되고, 이는 차례로, 인지질 PIP₂를 가수분해하고, 2가지 세포내 메신저: 디아시클로글리세롤(diacycloglycerol, DAG)과 이니스톨 1,4,5-삼인산염(IP₃)을 방출한다. IP₃의 증가된 축적은 G_q-와 G_o-결합된 수용체의 활성화와 연관된다(참조: "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3^rd Ed.) Nichols, J. G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)). IP₃ 축적을 탐지하는 검사법은 후보 화합물이 예로써, G_q- 또는 G_o-결합된 수용체에 대한 역 작동약인지를 결정하는데 이용될 수 있다(즉, 이런 화합물은 IP₃의 수준을 감소시킨다). G_q-결합된 수용체는 G_q-의존성 인지질가수분해효소 C가 AP1 요소를 보유하는 유전자의 활성화를 유도한다는 점에서 AP1 리포터 검사법을 이용하여 시험될 수도 있다; 따라서 활성화된 Gq-결합된 수용체는 이런 유전자의 발현에서 증가를 증명하는데, 여기서 이에 대한 역 작동약/길항약은 이런 발현에서 감소를 증명하고, 그리고 작동약은 이런 발현에서 증가를 증명할 것이다. 이런 탐지를 위하여 상업적으로 이용가능한 검사법이 가용하다.

유사하게, 세포외 도메인 또는 PS-1, PS-2 및/또는 β-APP와 상호작용하고 이들의 자연 세포간 상호작용을 예방하는 작용제 또는 검사 화합물 또는 약물 후보는 알츠하이머병을 치료하고 및/또는 Aβ 생산을 감소시키는데 이용될 수 있다. G-단백질 활성화 및 Aβ 생산 둘 모두 β-APP:PS 세포간 상호작용의 특이적인 저해에 의해 저해된다. G-단백질 활성화 및 Aβ 생산은 공동-배양액에서 G_o 활성화의 저해물질인 백일해 독소의 존재에 의해 저해되고, 이는 β-APP:PS-1 세포간 상호작용 이후에 G-단백질 활성화가 β-APP로부터 Aβ 생산의 경로에 있다는 것을 증명한다. 이들 결과는 G-단백질 신호전달에서 PS의 직접적인 역할을 뒷받침하고, 그리고 AD에 대한 약물 후보의 개발을 위한 새로운 길을 제공할 수 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, 프리세닐린의 β-APP 결합 도메인은 β-APP 세포외 도메인에 결합하는 임의의 자연 발생 또는 합성, 예를 들면, 단백질, 올리고펩티드(가령, 대략 5개 내지 대략 100개 아미노산 길이, 전형적으로, 대략 5개 내지 50개, 5-20개 또는 5-15개 아미노산 길이)을 지칭한다.

"작동약"은 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 촉진하거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 증가시키거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 활성화시키거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 조장하거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성화를 강화시키거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 감작화시키거나, 또는 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성 또는 발현을 상향 조절하는 작용제를 지칭한다.

"길항약"은 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 저해하거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하고, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 촉진을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 감소시키거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 예방하거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성화를 지연하거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 불활성화시키거나, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 탈감작화시키거나, 또는 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 하향 조절하는 작용제를 지칭한다.

"소형 유기 분자"는 대략 50 달톤(Dalton) 이상 내지 대략 2500 달톤 이하, 바람직하게는, 대략 2000 달톤 이하, 더욱 바람직하게는, 대략 100 달톤 내지 대략 1000 달톤, 가장 바람직하게는, 대략 200 달톤 내지 대략 500 달톤의 분자량을 보유하는 자연 발생 또는 합성의 유기 분자를 지칭한다.

"기능성 효과 결정"은 프리세닐린의 영향 하에 간접적으로 또는 직접적으로 파라미터를 증가 또는 감소시키는 화합물을 평가하는 것, 예를 들면, 예로써, G-단백질 또는 β-APP와 프리세닐린 상호작용의 물리적, 화학적 또는 표현형적(phenotypic) 효과를 측정하는 것을 지칭한다. 이런 기능적 효과는 당업자에게 공지된 임의의 수단, 예를 들면, 단백질의 분광(spectroscopic) 특성(가령, 형광(fluorescence), 흡광도(absorbance), 굴절률(refractive index)), 유체역학적(hydrodynamic) 특성(가령, 형상), 크로마토그래피(chromatographic) 특성, 또는 용해도(solubility) 특성에서 변화; 단백질의 유도성 마커(inducible marker) 또는 전사 활성화 측정; 결합 활성 또는 결합 분석평가, 예를 들면, 항체에 대한 결합 측정; 리간드 결합 친화성에서 변화 측정; 칼슘 유입(calcium influx) 측정; 본 발명의 폴리펩티드의 효소 산물의 축적 또는 기질의 고갈 측정; 효소 활성에서 변화, 본 발명의 폴리펩티드의 단백질 수준에서 변화 측정; RNA 안정성의 측정; G-단백질 결합; GPCR 인산화 또는 탈인산화; tau 인산화 또는 탈인산화, 신호 전달, 예를 들면, 수용체-리간드 상호작용, 이차 메신저 농도(가령, cAMP, IP₃, 또는 세포내 Ca²⁺); 예로써, 화학발광(chemiluminescence), 형광(fluorescence), 비색 반응(colorimetric reaction), 항체 결합, 유도성 마커 및 리간드 결합 분석평가를 통한 하류 또는 리포터 유전자 발현(CAT, 루시페라제, 베타-gal, GFP 등)의 확인으로 측정될 수 있다. 이에 더하여, 프리세닐린에 β-APP 결합 및 Aβ 생산 역시 프리세닐린 활성에 대한 기능적 효과의 결정인자(determinant)로서 이용될 수 있다.

하기에 제공된 작업 실시예는 설명을 목적으로 하고 본 발명을 한정하지 않는다. 이들 실시예에 이용된 과학적 방법의 다양한 파라미터는 하기에 상세하게 기술되고, 본 발명을 실시하기 위한 전반적인 보도(guidance)를 제공한다.

도면에 관한 설명
도 1에서는 PS-1이 GPCR인 지를 결정하는 대표적인 연구 결과를 도시한다. 상이한 세포 배양액의 추출물은 G_o이 필요 대조(necessary control)를 비롯한 PS-1과 상호작용하는 지를 결정하기 위하여 분석되었다. 각 레인에서, 특정 세포 추출물은 먼저, PS-1을 지향하는 단일클론 Ab(MAb)로 면역침전시켰다; 면역침전물은 이후, 용해시키고 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, 생성된 겔은 G_o를 지향하는 항체로 Western 블롯팅하였다(상기 항체는 G_oA와 G_oB 둘 모두 인식한다). 레인 1은 형질감염되지 않은 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-)세포의 추출물의 대조이다. 예상된 바와 같이, 상기 추출물은 G_oA(또는 G_oB)가 PS-1에 대한 Ab로 면역침전되지 않는다는 것을 증명하였다. 레인 2는 PS-1로 먼저 형질감염되고 G_oA로 형질감염되지 않은 ES 세포의 추출물이다. G_oA에 대한 어떤 단백질 밴드도 관찰되지 않았다; 이는 다른 대조 실험이다. 레인 3은 PS-1과 G_oA 둘 모두로 형질감염된 ES 세포의 추출물이다. 상기 추출물에서, G_oA는 PS-1과 함께 면역침전되는데, 이는 PS-1이 G_oA에 결합하지만, G_oB에 결합하지 않는다는 것을 증명한다. 막으로부터 수성 세포내 구획으로 돌출하는 C-말단 "꼬리"가 없는 PS-1(레인 4)이 G_oA와 함께 ES 이중 눌 세포(null cell)(레인 6) 내로 형질감염되면, G_oA는 꼬리 없는 PS-1과 함께 거의(또는 전혀) 면역침전되지 않는데, 이는 PS-1의 C-말단 도메인이 PS-1에 결합하는 G_oA의 주요 영역임을 증명한다.
도 2에서는 도 1의 실험과 유사하지만 PS-1 대신에 PS-2가 이용된 실험의 웨스턴 블롯 결과를 도시한다. 레인 2와 4는 꼬리 없는 PS-1과 달리, 꼬리 없는 PS-2가 G_oA(와 G_oB)에 여전히 결합하고, 따라서 G_{oA 와} G_oB에 대한 결합 부위가 PS-1의 경우에서처럼 PS-2의 C-말단 도메인에 한정되지 않는다는 것을 증명한다(도 1). 레인 1은 형질감염되지 않은 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-)이다. 레인 2는 PS-2 + G_oA이다. 레인 3은 꼬리 없는 PS-2 + G_oA이다. 레인 4는 PS-2 + G_oB이다. 레인 5는 꼬리 없는 PS-2 + G_oB이다.
도 3은 PS-1에 G_oA 결합을 증명하는 독립적인 방법에 관련된다. GTP의 유사체인 [³⁵S]-GTPγS는 G-단백질의 활성 부위에 공유 결합을 만드는데, 이는 백일해 독소(Pertussis toxin, PTx)와의 사전 반응으로 차단된다. 칼럼 2에서, PS-1에 대한 항체로 면역침전되는 G_oA 내로 ³⁵S-통합에서 8-배 증가가 관찰되지만 G_oB 내로 통합은 관찰되지 않는다(칼럼 4). 이런 이유로, PS-1은 G_oA에 결합하지만(이는 [³⁵S]-GTPγS와 반응하여 이를 G-단백질로서 확인하고(칼럼 2), 또한 G_oB 보다는 G_oA에 더욱 강하게 결합한다(칼럼 4). G_oA와 G_oB에 대한 ³⁵S 결합은 PTx로 사전 처리에 의해 차단된다(칼럼 3과 5).
도 4는 PS-2와 G-단백질 G_oA에 대한 cDNA로 형질감염된 ES 세포 추출물 내로 ³⁵SGTPγS 통합을 묘사하는 그래프이다.
도 5에서는 고정 세포의 면역형광 현미경 표지화(immunofluorescence microscopic labeling)를 도시한다. a) 형질감염되지 않고 고정되지만 투과되지 않은 DAMI 세포의 인간 PS-1 N-말단 도메인에 대한 일차 쥐 Mab #1563(패널 1) 및 FITC 접합된 항-쥐 IgG 이차 항체로 이중 면역형광 현미경 표지화는 내인성 PS-1 아미노 말단 도메인의 세포 표면 면역표지화(cell-surface immunolabeling)를 보여준다. 패널 2에서는 동일한 세포가 β-APP 세포외 도메인에 대한 Mab #348 및 TRITC-접합된 항-생쥐 IgG 이차 항체로 표지되는 경우에 감지가능한 양의 세포-표면 β-APP를 발현하지 않는다는 것을 보여준다. 패널 3에서는 패널 1과 2에서 세포의 Nomarski 영상을 보여준다. b) β-APP-형질감염되고 고정되지만 투과되지 않은 DAMI 세포의 이중 면역형광 현미경 표지화는 β-APP 세포외 도메인에 대한 Mab #348 및 TRITC-접합된 이차 항체로 표지되는 경우에 세포-표면 발현된 β-APP를 보여준다(패널 2). 패널 1과 3, (a)에서와 동일하게 처리된 세포. c) PS-1-형질감염되고 고정되지만 투과되지 않은 DAMI 세포의 면역형광 현미경 표지화는 (a)에 기술된 동일한 일차와 이차 항체로 표지되는 경우에, 세포-표면 PS-1(패널 1)의 높은 발현을 나타내는 반면 β-APP(패널 2)에서는 그렇지 않다. 패널 3에서는 패널 1과 2에서 세포의 Nomarski 영상을 보여준다. 이들 실험에서는 PS-1로 DAMI 세포의 형질감염(transfection)이 β-APP의 세포 표면 발현을 야기하지 않는다는 것을 증명한다. d) PS-1과 PS-2에 대하여 이중-눌(double-null)이고 β-APP-형질감염되고 고정되지만 투과되지 않은 ES 세포의 면역형광 현미경 표지화. 세포는 β-APP 세포외 도메인에 대한 Mab #348 및 TRITC-접합된 이차 항체로 표지로 표지되는 경우에 세포-표면 발현된 β-APP를 보여준다(패널 2). 패널 1에서는 인간 PS-1 N-말단 도메인에 대한 일차 쥐 Mab #1563 및 FITC 접합된 적절한 이차 항체로 표지화의 결과를 보여주는데, 이는 ES 이중-눌 세포의 표면에서 PS-1의 예상된 부재를 지시한다. 패널 3에서는 패널 1과 2에서 세포의 Nomarski 영상을 보여준다. e) PS-1과 PS-2에 대하여 이중-눌(double-null)이고 형질감염되지 않고 고정되지만 투과되지 않은 ES 세포의 면역형광 현미경 표지화. 세포는 β-APP 세포외 도메인에 대한 Mab #348 및 TRITC-접합된 이차 항체로 표지로 표지되는 경우에 세포-표면 발현된 내인성 생쥐 β-APP를 보여준다(패널 2). d에서처럼 표지된 패널 1과 3; 이들 형질감염되지 않은 ES 세포에서 PS-1에 대한 세포 표면 표지화(패널 1)는 세포 표면 표지화는 전혀 관찰되지 않는다. Bar, 20㎛.
도 6에서는 β-APP-단독 발현 형질감염된 ES 세포와 PS-1 단독 발현 형질감염된 DAMI 세포를 혼합한 이후 수분 이내에, 세포 추출물의 ELISA 분석에 의한 탐지에서, 혼합된 세포 배양액 내에서 일시적인 단백질 티로신 인산화 과정이 진행된다는 것을 도시한다. 이러한 활성은 혼합 이후 ~8-10분 시점에 최대이었다(a). 25 ㎍ 정제된 가용성 β-APP(b) 또는 FLAG에 융합된 PS-1의 N-말단 도메인의 25 ㎍ 정제된 펩티드(c)의 존재에서 수행된 동일한 실험은 (a)에서 관찰된 증가를 보이지 않았다. 하지만, FLAG에 융합된 PS-2의 비-특이적인 N-말단 도메인의 25 ㎍ 정제된 펩티드의 추가(d)는 (a)에서와 매우 유사한, 단백질 티로신 키나아제 활성의 일시적인 증가를 결과하였다.
도 7A-D에서는 도 6에서 티로신 인산화 효소 활성의 특성을 결정하는 실험을 도시한다. 합성 펩티드로 Src 계통 키나아제 검사. a와 b: 혼합 이후 시간의 함수로서, 독립적으로 형질감염된 DAMI 세포와의 β-APP:PS-1 상호작용. Src 키나아제 활성은 Src 계통 기질 펩티드 {lys19}cdc2(6-20)-NH₂(검은색 막대), 그리고 β-APP:PS-1(a)과 대조 pcDNA3:PS-1(b) 상호작용에 대한 대조 펩티드 {lys19Phe15}cdc2(6-20)NH₂ (흰색 막대)와 {lys19ser14val12}cdc2(6-20)NH₂(회색 막대)를 이용하여 평가되었다. c와 d: 혼합 이후 시간의 함수로서, 독립적으로 형질감염된 DAMI 세포와의 β-APP:PS-2 상호작용. Src 키나아제 활성은 Src 계통 기질 펩티드 {lys19}cdc2(6-20)-NH₂(검은색 막대), 그리고 β-APP:PS-2(c)와 대조 pcDNA3:PS-2(d) 상호작용에 대한 대조 펩티드 {lys19Phe15}cdc2(6-20)NH₂(흰색 막대)와 {lys19ser14val12}cdc2(6-20)NH₂(회색 막대)를 이용하여 평가되었다.
도 8A-B에서는 티로신 키나아제 활성의 저해를 도시한다. β-APP와 PS-1로 독립적으로 형질감염되고 10 ㎍/㎖ Herbimycin A(a)와 10 nM PP2(b)의 존재와 부재에서 혼합된 DAMI 세포의 혼합후 시간의 함수로서 티로신 키나아제 활성을 증명하는 ELISA.
도 9A-B에서는 β-APP:PS-1 세포내 상호작용: 혼합된 세포의 추출물 내에서 C-Src 활성을 도시한다. a. 웨스턴 면역블롯(Western Immunoblot). 독립적으로 형질감염된 DAMI 세포의 혼합물과의 β-APP:PS-1 상호작용. β-APP-형질감염된 DAMI 세포가 0-12분 동안 PS-1-형질감염된 DAMI 세포로 혼합되는 동일한 실험으로부터 일차 항-PTyr 다중클론 항체(패널 1)와 항-pp60c-src 단일클론 항체(패널 2)로 웨스턴 면역블롯. 패널 3: pp60c-src 항체로 대조 pp60c-src 단백질의 항체 표지화. 패널 4: β-APP-형질감염된 ES 이중-눌 세포가 PS-1-형질감염된 DAMI 세포와 상호작용하는 실험으로부터, 패널 1에서처럼 일차 항-PTyr 항체로 웨스턴 면역블롯. b. 시험관내 인산화된 단백질의 방사선사진(autoradiograph). 혼합후 0-12분에 독립적으로 형질감염된 β-APP와 PS-1 DAMI 세포 혼합물의 추출물은 c-Src에 대한 항체로 먼저 면역침전시키고, 이후 γ³²P-ATP로 시험관내 인산화시켰다. 자기인산화(autophosphorylation) 반응물은 SDS-PAGE와 방사선사진촬영술을 순차적으로 수행하였다.
도 10A-B에서는 혼합된 세포의 추출물 내에서 β-APP:PS-2 세포내 상호작용: C-Src 활성을 도시한다. a. 웨스턴 면역블롯. 독립적으로 형질감염되고 혼합된 DAMI 세포의 추출물 내에서, 혼합후 시간의 함수로서 β-APP:PS-2 상호작용. 패널 1과 2: β-APP와의 세포내 상호작용에서 PS-2-형질감염된 DAMI 세포가 PS-1-형질감염된 세포를 대체하고 세포가 1-20분 동안 혼합되는 점을 제외하고 도 7a에서와 동일함. b. 시험관내 인산화된 단백질의 방사선사진. a 부분에서와 동일한 추출물. β-APP와의 세포내 상호작용에서 PS-2-형질감염된 DAMI 세포가 PS-1-형질감염된 DAMI 세포를 대체하는 점을 제외하고 5b에서와 동일함.
도 11A-D에서는 β-APP:PS-2 세포내 상호작용: 혼합된 세포의 추출물 내에서 Lyn과 Fyn의 활성을 도시한다. a와 b. 웨스턴 면역블롯: β-APP:PS-2 상호작용. β-APP-형질감염된 DAMI 세포가 0-20분 동안 PS-2-형질감염된 DAMI 세포와 혼합되고 추출물이 만들어지는 동일한 실험으로부터 일차 항-Lyn 다중클론 항체(a, 패널 1)와 항-Fyn 다중클론 항체(b, 패널 1)로 웨스턴 면역블롯. Lyn 또는 Fyn 단백질의 농도에서 시간에 흐름에 따른 변화는 관찰되지 않았다. 패널 2: 대조 Lyn(a)과 Fyn(b) 단백질의 그들의 개별 항체로 항체 표지화. c와 d. 시험관내 인산화된 단백질: β-APP:PS-2 상호작용의 방사선사진. 혼합후 0-20분 시점에 β-APP와 PS-2 혼합된 형질감염된 세포의 혼합물의 추출물은 Lyn(c) 또는 Fyn(d)에 대한 항체로 먼저 면역침전시키고, 이후 γ³²P-ATP로 시험관내 인산화시켰다. 자동인산화 반응 산물은 SDS-PAGE와 방사선사진촬영술을 순차적으로 수행하였다.
도 12에서는 PS의 세포내 도메인을 도시한다.
도 13에서는 Aβ 생산에 대한 세포내 β-APP:PS 상호작용의 효과를 도시한다.
도 14A-C에서는 Aβ의 생산을 위한 특이적인 β-APP:PS 매개된 세포-세포 상호작용으로부터 G-단백질 활성화 결과를 도시한다. (A) 높은- 및 낮은-밀도 β-APP:PS-1 공동-배양액에서 세포내 G-단백질의 활성화를 증명하는 ³⁵S-GTPgS 통합. Ga_o에 지향된 항체 K-20으로 면역침전후 높은 밀도에서 β-APP-단독과 PS-1-단독 세포의 공동-배양액에서 ³⁵S-GTPgS 통합 (레인 1). 레인 1에서는 ³⁵S-GTPgS 통합에서 기준 수준을 초과하여 200% 이상의 증가를 보여준다 (하기 참조). 레인 2: 동일한 세포는 더욱 낮은 밀도에서 배양될 때, 33% 증가를 보여준다. 레인 3: PTx의 존재에서 높은 밀도 공동-배양은 ³⁵S-GTPgS 결합을 기준 미만 38%까지 감소시켰다. 레인 4: β-APP가 벡터 pcDNA3으로 교체된 높은 밀도 공동-배양. 레인 5: PS-1이 pcDNA3으로 교체된 높은 밀도 공동-배양액. 양쪽은 아마도, pcDNA 형질감염된 세포 내에 존재하는 내인성 생쥐 β-APP 또는 PS-1의 존재로 인하여, 낮은 수준의 G-단백질 활성화을 보인다. 데이터는 백분율로서 표시되는, β-APP:PS-1 세포간 상호작용에 의해 증진된 활성화로서 제공되고, 여기서 0%는 형질감염되지 않은 ES 눌 세포 및 형질감염되지 않은 APP^-/- 섬유아세포로부터 추출물을 동등량으로 혼합함으로써 제조된 대조에서 ³⁵S-GTPgS 결합이다. (B)와 (C) 상이한 세포 밀도에서 및 PTx의 존재 또는 부재에서 PS-1:β-APP 공동-배양액에서 Aβ 생산. 1.5 x 10⁷(레인 1과 4), 0.3 x 10⁷(레인 2) 및 0.15 x 10⁷(레인 3)의 최종 숫자로 ³⁵S-met의 존재에서 β-APP-단독 세포와 PS-1-단독 세포의 공동-배양액. PTx(500ng/ml)가 레인 4에서 높은 밀도 배양액에 추가되었다. (B) 동등량(100㎍ 단백질)의 각 세포 추출물은 MAb 6E10으로 면역침전되고, bicene-tris 겔에서 전기영동되고, 방사선사진촬영되었다. 세포당 생산된 Aβ의 양은 감소하는 세포 밀도에 따라서 감소하였다(B, 레인 1 대(對) 레인 2와 3). 높은 밀도 배양액(B, 레인 4) 내에서 PTx의 존재는 PTx를 포함하지 않는 유사한 배양액에서 생산된 Aβ를 완전히 저해하였다(B, 레인 1). (C) 세포 배양액의 밀도는 사진촬영되었다.
도 15A-B에서는 β-APP:PS 매개된 세포-세포 상호작용의 특이적인 저해가 G-단백질 Ga_o 활성화 및 Aβ 생산 둘 모두를 저해한다는 것을 보여준다. (A) PS-1 펩티드 1-80의 존재에서 Aβ 생산을 측정하는 ELISA. 증가하는 양의 펩티드 1-80(0-3μM)의 존재와 부재에서 수행된, β-APP-단독 발현 세포 및 PS-1-단독 발현 세포의 공동-배양. Aβ 생산은 ELISA에 의해 결정되고 펩티드 1-80에 의해 용량-의존성 방식으로 저해되었다. (B) PS-1 펩티드 1-80의 존재에서 G-단백질 활성화를 측정하는 GTPgS 분석평가. 증가하는 양의 펩티드 1-80(0-3μM)의 존재와 부재에서 상기 (A)에서와 같이 수행된, β-APP-단독 발현 세포 및 PS-1-단독 발현 세포의 공동-배양. ³⁵S-GTPgS 분석평가는 펩티드 1-80에 의해 용량-의존성 방식으로 유사하게 저해된 G-단백질 활성화의 척도로서 추출물에서 수행되었다. 데이터는 백분율로서 표시되는, G-단백질 활성화의 저해로서 제공되고, 여기서 100%는 펩티드 1-80의 부재에서 β-APP:PS-1 공동-배양액에서 ³⁵S-GTPgS 결합이다.
도 16A-C에서는 β-APP(β-APP)의 가용성 엑토도메인에 의한 G-단백질 활성화를 도시한다. (A) 도시된 β-APP의 농도에서 부분적으로 정제된 β-APP의 PS-1-단독 APP^-/- 섬유아세포 배양액에 추가는 용량-의존성 방식으로 ³⁵S-GTPgS 통합을 증가시켰다(곡선 1); 단지 내인성 수준의 PS를 발현하는 형질감염되지 않은 APP^-/- 섬유아세포의 배양액에 추가된 유사한 농도의 β-APP는 예상된 바와 같이, ³⁵S-GTPgS 통합에서 단지 크지 않은 증가를 유발하였다(곡선 3); 동등한 β-APP-고갈된 제조물(β-APP 항체로 전-처리후)의 추가는 PS-1-형질감염된 APP^-/- 섬유아세포에 추가될 때, ³⁵S-GTPgS 통합에서 증가를 유발하지 못하였다(곡선 4). 무관한 항체(염소 항-쥐 IgG)로 유사하게 처리된 β-APP의 동등한 제조물의 추가는 처리되지 않은 샘플에서보다 약간 낮은 값을 보였다(곡선 2). 유사한 농도의 β-APP는 형질감염되지 않은 ES(PS^-/-) 배양액에 추가될 때, ³⁵S-GTPgS 통합에서 유의한 증가를 보이지 않았다(곡선 5). 데이터는 백분율로서 표시되는, β-APP에 의해 증진된 촉진으로서 제공되고, 여기서 0%는 β-APP의 부재에서 ³⁵S-GTPgS 결합이다. (B) 부분적으로 정제된 β-APP의 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯. 레인 1은 본 작업에 이용된 부분적으로 정제된 β-APP(화살표)의 Coomassie 착색된 겔을 보여준다. 레인 2는 β-APP 밴드를 나타내는 MAb 348로 동일한 제조물의 웨스턴 블롯이다. (C) MAb 348로 처리된 샘플에서 β-APP의 고갈을 증명하는 웨스턴 블롯. 도 18A에서 레인 1: 처리되지 않은 샘플; 레인 2, MAb-처리된 샘플.
도 17A-B에서는 쥐 막에서 내인성 G-단백질의 활성화를 도시한다. (A) 15분 동안 용해된 쥐 해마 막(100 ㎍)에 추가된 증가하는 농도(0-400pM)의 β-APP는 용량-의존성 방식으로 ³⁵S-GTPgS 통합을 증가시켰다. (B) PS-1과 PS-2에 대한 다중클론 Ab의 혼합물로 먼저 전-처리된 PS-고갈된 쥐 막에 β-APP의 유사한 추가. PS-고갈된 막에 β-APP의 추가에서, ³⁵S-GTPgS 통합에서 증가는 관찰되지 않았다. 데이터는 백분율로서 표시된, β-APP에 의해 증진된 촉진으로서 제공되고, 여기서 100%는 β-APP의 부재에서 ³⁵S-GTPgS 결합이다.
도 18A-C에서는 인간 PS-1 세포질 도메인에 인간 G-단백질 G_o의 직접적인 결합을 도시한다. (A) 다양하게 형질감염된 ES 세포의 추출물은 항-PS-1 루프 MAb로 먼저 면역침전되고, 그리고 면역침전물은 전기영동되고 G_o 항체 K20(G_oA와 G_oB를 인식)으로 웨스턴 블롯팅되었다. 레인 1: 형질감염되지 않은 ES 눌 세포; 레인 2-6, PS-1 단독(레인 2); PS-1과 G_oA(레인 3); PS-1과 G_oB(레인 4)에 대한 cDNA로 형질감염된 ES 눌 세포. (B) 세포질 루프 도메인 1, 2와 3 및 세포질 C-꼬리의 위치를 보여주는 7-TM PS-1. (C) 쥐 뇌 G_o-단백질에 ³⁵S-GTPgS 결합에 대한 PS-1 세포질 펩티드 단편의 효과. 펩티드(200μM)는 전-처리 없이 배양 혼합물에 포함되고, 그리고 ³⁵S-GTPgS의 축적이 측정되었다. 데이터는 백분율로서 표시된, 펩티드에 의해 증진된 활성화로서 제공되고, 여기서 100%는 펩티드의 부재에서 ³⁵S-GTPgS 결합이다. 레인 1, 펩티드 추가 없음; 레인 2, 루프 1 잔기 1-16, 펩티드 목록은 표 1 참조); 레인 3, 루프 1 잔기 17-32; 레인 4, 루프 2; 레인 5, 루프 3; 레인 6, C-꼬리의 잔기 1-20; 레인 7, C-꼬리의 잔기 21-39. 단지 세포질 루프 3(레인 5) 및 C-꼬리의 첫 20개 아미노산을 포함하는 펩티드 C(1-20)(레인 6)만 펩티드가 없는 샘플에 비하여 ³⁵S-GTPgS 결합의 활성화에서 유의한 200% 증가를 증진하였다.
도 19에서는 본 발명의 방법에서 단리된 폴리펩티드의 헤파린 친화성 크로마토그래피를 도시한다.
도 20에서는 펩티드와 폴리펩티드 단리를 위한 겔 여과 크로마토그래피를 도시한다.
도 21에서는 ³⁵S-GTPγS 통합에 대한 G-단백질 미니유전자 저해물질의 효과를 도시한다.
도 22에서는 Aβ 생산에 대한 G-단백질 미니유전자 저해물질의 효과를 도시한다.
도 23A-C에서는 상이한 G-단백질: (a) Gα_o (b) G_q, 그리고 (c) G_s에 대한 다양한 세포내 도메인의 존재에서 ³⁵S-GTPγS 통합을 도시한다.
도 24에서는 합성 펩티드의 존재에서 β-APP:PS-1 세포간 상호작용 이후에 Aβ 생산의 저해를 도시한다. β-APP-단독 세포 및 PS-1-단독 세포의 공동-배양의 시점에서 0-3μM의 단지 펩티드 4, 7과 8의 추가가 ELISA 검사법에 의한 측정에서, 세포-세포 상호작용 및 Aβ 생산을 저해한다. 펩티드 4: (15-mer) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6); 펩티드 5: (15-mer) SNGRPQGNSRQVVEQ(서열 번호 15); 펩티드 6: (15-mer) RQVVEQDEEEDEELT(서열 번호 16); 펩티드 7: (15-mer) DEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 17); 펩티드 8: (8-mer) DEEEDEEL(서열 번호 5).
도 25에서는 도 24의 펩티드를 이용한, Tg 생쥐에서 생체내 Aβ 생산을 도시한다(1: 서열 번호 2의 잔기 1-80; 2: 서열 번호 2의 잔기 1-40; 3: 서열 번호 2의 잔기 41-80(서열 번호 7); 4: 서열 번호 2의 잔기 41-55(서열 번호 6); 8: 서열 번호 2의 잔기 66-73(서열 번호 8); 9: 서열 번호 2의 잔기 41-46; 그리고 10: 서열 번호 2의 잔기 47-55).

실시예

실시예 1

pcDNA3 내에서 G-단백질 Gα_oA와 Gα_oB에 대한 cDNA는 UMR cDNA Resource Center(Rolla, MO)로부터 구입되었다. pcDNA3 내에서 전장 인간 PS-1과 PS-2 cDNA는 이미 기술된 바와 같이 PCR로 클로닝되었다. PS-1과 PS-2의 꼬리 없는 구조체는 pcDNA3 내에 작제되었는데, 여기서 최종 TM-도메인 직후에 PS-1 또는 PS-2의 세포질 도메인만 결실되었다(이러한 구조체는 PS-1의 아미노산 1-430 및 PS-2의 1-410을 포함한다).

세포 배양액: ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포는 공개된 프로토콜에 따라 배양되었다.

형질감염(transfection): ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-)는 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen) 방법을 이용하여, 전장 인간 PS-1 또는 PS-2의 15 ㎍의 pcDNA 구조체 및 원하는 G-단백질의 cDNA로 일시적으로 형질감염되었다. 간단히 말하면, 리포펙타민 - DNA 용액은 30분 동안 실온에서 방치되고, 충분한 혈청-없는 배지(serum-free medium)와 혼합되고, 세포에 추가되었다. 세포는 CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 5시간 동안 배양되고, 이후 배지는 혈청으로 채워지고, 세포는 형질감염후 12-24 시간 시점에 수확되었다.

면역침전(면역침전): 형질감염후 24시간 시점에, 배양 배지는 제거되고, 세포는 200 ㎕의 추출 완충액에서 긁어냈다. 완전 세포-추출물은 Smine 등의 용해화 조건(solubilization condition)(50mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 60 mM 옥틸글리코시드(octylglycoside)와 프로테아제 저해물질)을 이용한 초음파처리(sonication)에 의해 만들어졌다. 100 ㎍의 각 추출물은 PS-1(MAB5232) 또는 PS-2(MA1-754)의 큰 루프에 대한 단일클론 항체를 이용하여 면역침전되었다. 면역침전된 단백질은 이후, 12% SDS PAGE 상에서 분리되고 막으로 이전되었다. 그 다음, G 단백질 G_o에 대한 항체(친화성 정제된 K-20, sc-387, Santa Cruz Biotechnology; 상기 다중클론 항체는 G_oA와 G_oB를 모두 인식한다)로 웨스턴 블롯 혼성화(Western blot hybridization)가 수행되었다.

웨스턴 블롯 혼성화: 면역침전된 단백질은 적하 완충액(loading buffer)(50 mM Tris, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 10% 글리세롤) 내에서 5분 동안 끓여지고, SDS-PAGE(12%) 겔 상에서 전기영동으로 분리되고, 그리고 이들 단백질은 니트로셀룰로오스 필터로 이전되었다. 필터는 일차 다중클론 토끼 G-단백질 항체, 그 이후에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)-접합된 염소 항-토끼 IgG와 함께 배양되었다. 필터-결합된 과산화효소 활성은 화학발광(chemiluminescence)으로 탐지되었다.

PS-1에 G-단백질 G_o의 결합: ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포는 전장 인간 PS-1의 cDNA 및 G-단백질 G_oA 또는 G_oB의 cDNA(UMR cDNA Resource Center, Rolla, MO)로 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염후 24시간 시점에, 완전 세포-추출물은 Smine 등의 용해화 조건(solubilization condition)(50mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 60 mM 옥틸글리코시드(octylglycoside)와 프로테아제 저해물질)을 이용한 초음파처리(sonication)에 의해 만들어졌다. 100 ㎍의 각 추출물은 7-TM 모형(Mab # 5232, Chemicon, 이는 기존의 공개된 연구에 이용되었다)에서 세포외 큰 루프에 대한 단일클론 항체를 이용하여 면역침전되었다. 면역침전된 단백질은 이후, 12% SDS PAGE 상에서 분리되고 막으로 이전되었다. 그 다음, PS-1과 G_o 둘 모두에 대한 항체(친화성 정제된 K-20, sc-387, Santa Cruz Biotechnology; 상기 다중클론 항체는 G_oA와 G_oB를 모두 인식한다)로 웨스턴 블롯 혼성화(Western blot hybridization)가 수행되었다.

PS-2에 G-단백질 G_o의 결합: ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-)는 전장 인간 PS-2의 cDNA 및 G-단백질 G_oA 또는 G_oB의 cDNA(UMR cDNA Resource Center, Rolla, MO)로 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염후 24시간 시점에, 완전 세포-추출물은 Smine 등의 용해화 조건(solubilization condition)(50mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 60 mM 옥틸글리코시드(octylglycoside)와 프로테아제 저해물질)을 이용한 초음파처리(sonication)에 의해 만들어졌다. 100 ㎍의 각 추출물은 PS-2의 큰 루프에 대한 생쥐 단일클론 항체(MA1-754, Affinity BioReagents)를 이용하여 면역침전되었다. 이후, 면역침전된 단백질은 12% SDS PAGE 상에서 분리되고 막으로 이전되었다. 그 다음, PS-2와 G_o 둘 모두에 대한 항체로 웨스턴 블롯 혼성화가 수행되었다.

백일해 독소 처리: PTx 프로모터는 37℃에서 10분 동안 10 mM DTT와 함께 배양하여 이를 효소 활성 형태로 전환시켰다. PS-1 또는 PS-2와 G-단백질 cDNA로 ES 세포의 형질감염후 5시간 시점에, 500 ng/㎖의 활성화된 PTx가 1 mM NAD, 2 mM MgCl₂와 1 mM EDTA의 존재에서 배양 배지 내에 세포에 추가되고, 이들 세포는 5% CO₂의 존재에서 37℃에서 12시간 동안 배양되었다. 이후 세포는 수확되고, 하기에 기술된 바와 같이 [³⁵S]GTPγS 통합에 대해 조사되었다.

GTPγS 결합: 세포는 수확되고, 단백질은 용해화 완충액(50 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 60mM 옥틸글리코시드, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물) 내에서 초음파처리로 용해되었다. 100 ㎍의 단백질은 200 ㎕의 부피에서 동등 부피의 완충액 B(50mM HEPES/NaOH pH 7.4, 40μM GDP, 50mM MgCl₂, 100mM NaCl)와 혼합되었다. 반응은 50 nM [³⁵S]GTPγS(1250 Ci/mmol)로 시작되고, 배양은 RT에서 60분 동안 수행되고, 이후 반응은 20 ㎕의 10X 중단 완충액(stopping buffer)(100 mM Tris-Hcl, pH 8, 25 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 20 mM GTP)의 추가로 중단되었다. 이후, 샘플은 항-PS-1 루프 단일클론 항체(5 ㎕)로 면역침전되었다. 이러한 항체-단백질 복합체는 RT에서 90분 동안 단백질 A/G 아가로즈에 결합되고 세척 완충액(washing buffer) 1(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 1% Triton X-100 1X 프로테아제 저해물질 혼합물, 150 mM NaCl과 60 mM 옥틸-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside))로 2회 세척되고, 세척 완충액 2(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% Triton X-100, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물과 50 mM NaCl)와 3(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0과 1X 프로테아제 저해물질 혼합물)로 각 1회 세척되었다. 세척된 아가로스 비드(agarose bead)는 섬광 액(scintillation fluid)(CytoScint, ICN)(5 ㎖)에 현탁되고, Beckman Coulter LS 6000 SC 섬광 계수기에서 3분 동안 계산되었다.

전장 인간 PS-1과 G-단백질 Gα_oA 또는 Gα_oB에 대한 cDNA로 공동-형질감염된 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포의 100 ㎍의 추출물을 PS-1의 큰 친수성 루프에 대한 MAb로 면역침전시키고, 이후 G_o에 대한 친화성 정제된 다중클론 항체(이는 양쪽 동등형(isoform), G_oA와 G_oB를 모두 인식한다)로 웨스턴 블롯 혼성화를 수행하면, PS-1/G_oA 공동-형질감염된 세포만 ~45kDa에서 G_o에 대한 강한 신호를 제공하는데(도 1, 레인 3), 이는 G_oB가 아닌 G_oA가 PS-1에 결합한다는 것을 암시한다. 형질감염되지 않은 대조 세포 또는 PS-1 단독으로 형질감염된 세포는 동일하게 처리되는 경우에, 웨스턴 블롯 상에서 G_o 밴드를 보이지 않았다(도 1).

PS-1의 세포질 카르복실 말단에 G-단백질 G_o 결합의 검증. PS-1의 꼬리 없는 구조체는 pcDNA3 내에서 만들었는데, 여기서 최종 TM-도메인 직후에 PS-1의 세포질 도메인만 결실되었다(상기 구조체는 아미노산 1-430을 포함한다). 상기 구조체는 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포를 형질감염시키는데 이용되었다. 꼬리 없는 PS-1은 막 내로 함입되고 세포 표면에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 전장 PS-1에 대하여 앞서 기술된 것과 동일한 전략에서, ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포는 꼬리 없는 PS-1과 G-단백질 G_oA 또는 G_oB에 대한 cDNA로 형질감염되었다. 이후, 세포 추출물은 PS-1 루프 MAb # 5232로 면역침전되고, SDS PAGE 상에서 분리되고, G_o에 대한 항체로 웨스턴 블롯팅되었다.

꼬리 없는 PS-1과 G-단백질 Gα_oA 또는 Gα_oB에 대한 cDNA로 공동-형질감염된 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포의 100 ㎍의 추출물은 PS-1의 큰 친수성 루프에 대한 MAb로 면역침전되고, 이후 G_o에 대한 친화성 정제된 다중클론 항체(이는 양쪽 동등형, G_oA와 G_oB를 모두 이식한다)로 웨스턴 블롯 혼성화가 수행되었다. 결합이 탐지되었는데(도 1, 레인 6), 이는 결합 도메인인 것으로 이전에 확인되었던 카르복실 말단 39개 아미노산이 G_oA에 대한 PS-1의 전체 결합 도메인을 구성하지 못한다는 것을 지시한다. G_oB는 꼬리 없는 PS-1에 대한 어떤 결합도 보이지 않았다(도 1, 레인 7).

PS-1에 G_oA 결합의 주요 부분이 제거된 꼬리 없는 구조체를 이용한 결과는 PS-1 꼬리228">꼬리 없는 PS-1과 G-단백질 Gα_oA 또는 Gα_oB에 대한 cDNA로 공동-형질감염된 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포의 100 ㎍의 추출물은 PS-1의 큰 친수성 루프에 대한 MAb로 면역침전되고, 이후 G_o에 대한 친화성 정제된 다중클론 항체(이는 양쪽 동등형, G_oA와 G_oB를 모두 이식한다)로 웨스턴 블롯 혼성화가 수행되었다. 결합이 탐지되었는데(도 1, 레인 6), 이는 결합 도메인인 것으로 이전에 확인되었던 카르복실 말단 39개 아미노산이 G_oA에 대한 PS-1의 전체 결합 도메인을 구성하지 못한다는 것을 지시한다. G_oB는 꼬리 없는 PS-1에 대한 어떤 결합도 보이지 않았다(도 1, 레인 7).

PS-1에 G_oA 결합의 주요 부분이 제거된 꼬리 없는 구조체를 이용한 결과는 PS-1 꼬리 이외에, PS-1의 다른 영역에 일부 PS-1:G_oA 결합에 대한 특이성(specificity)을 보여준다. 이들은 또한, G_oA가 PS-1 항체와 공동-면역침전될 수 있는 PS-1 β-세크레타제 복합체의 다른 성분과 결합되는 가능성을 배제한다.

본래 PS-2에 G-단백질 G_o의 결합을 밝히기 위한 추가의 연구가 수행되었다. 결합 도메인인 것으로 확인된 39개 아미노산 PS-1 C-말단 영역은 PS-2의 C-말단 꼬리 내에서 온전히 보존된다. 따라서 PS-2의 C-말단 도메인 역시 Gα_o에 결합하는 것으로 생각되었다. PS-1에서처럼, G_o는 다소 상이하긴 하지만, PS-2에 결합하는 것으로 밝혀졌다. G_oA와 G_oB를 모두 인식하는 G_o 항체는 PS-2와 G_oA, 그리고 PS-2와 G_oB cDNA로 공동-형질감염된 세포의 추출물의 PS-2 면역침전물의 웨스턴 블롯 상에서 이중선(doublet)을 보였다. 이러한 이중선은 아마도, PS-2에 대한 G_o의 양쪽 동등형의 결합을 나타낸다(도 2, 레인 2와 4). 대조적으로, PS-1은 G_oB에 결합하지 않고(도 1, 레인 4), 동일한 G_o 항체로 웨스턴 블롯 상에서 단일 밴드만을 보였다(도 1, 레인 3).

PS-2의 세포질 카르복실 말단에 G-단백질 G_o의 결합에 대해 조사되었다. PS-1에서처럼, PS-2의 꼬리 없는 구조체는 pcDNA3 내에서 만들어졌는데, 여기서 최종 TM-도메인 직후에 PS-2의 세포질 도메인만 결실되었다(상기 구조체는 아미노산 1-410을 포함한다). 상기 구조체는 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포를 형질감염시키는데 이용되었는데, 막 내로 함입되고 세포 표면에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 전장 PS-1과 PS-2에 대하여 앞서 기술된 것과 동일한 전략에서, ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포는 꼬리 없는 PS-2와 G-단백질 G_oA 또는 G_oB에 대한 cDNA로 형질감염되었다. 이후, 세포 추출물은 PS-2 루프 MAb # MA1-754로 면역침전되고, SDS PAGE 상에서 분리되고, G_o에 대한 항체로 웨스턴 블롯팅되었다.

G_oA와 공동-발현된 꼬리 없는 PS-2를 PS-2 MAb로 면역침전시키고 항-G_o항체로 웨스턴 블롯팅시키면, PS-1에 대한 결과에서처럼, 밴드 강도(band intensity)에서 감소가 관찰되긴 하지만 밴드가 완전히 부재하지는 않았다. 한편, G_oB/PS-2 공동-형질감염 샘플 내에서 밴드의 강도는 이러한 꼬리 없는 샘플의 경우에 변화가 없었는데, 이는 G_oB가 카르복실 말단 꼬리 이외의 세포내 도메인에서 PS-2에 결합하는 것을 암시하였다(도 2, 레인 3과 5). 따라서 PS-1과 PS-2는 그들이 결합하는 G_o 동등형뿐만 아니라 서로 상동하지 않은 PS-1과 PS-2 상에서 결합 부위에 의해 구별된다. 이런 이유로, PS-1과 PS-2의 기능 연구는 전혀 상이한 결과를 제공할 가능성이 높다; 즉, PS-1과 PS-2는 단순히 기능적으로 중복되는 단백질이 아니다.

Gα_oA와 Gα_oB PS-1 및 G-단백질 G_oA와 G_oB의 PS 매개된 기능적 활성화에 관한 추가의 연구가 수행되었다. 기존 연구에서는 PS-1의 카르복실 말단에 G_o 결합을 평가하는 여러 독립된 접근법 중의 하나로서 GTP 가수분해와 GTPγS 결합을 이용하였다. 하지만, 이들 연구에서는 3개의 대조 펩티드와 함께, PS-1의 C-말단에서 잔기 429-467의 합성된 펩티드로 이러한 검사가 수행되었다. 다른 한편, 세포 추출물 내에서 ³⁵S-GTPγS 통합을 평가함으로써, 공동-형질감염된 세포 내에서 본래 PS-1과 PS-2에 G-단백질 G_oA와 G_oB의 결합의 기능적 결과가 평가되었다.

PS-1과 G-단백질 G_oA에 대한 cDNA로 공동-형질감염된 ES 세포의 추출물 내에서 ³⁵S-GTPγS 통합은 형질감염되지 않은 대조 ES(PS^-/-) 세포에서 획득된 값의 700% 이상인 것으로 밝혀졌다(도 3, 칼럼 2). 이러한 증가는 PS-1과 G_oA cDNA로 형질감염된 세포가 PTx로 먼저 처리되는 경우에 관찰되지 않는데(도 3, 칼럼 3), 이는 상기 독소의 존재에서 기능 저해를 증명한다. 다른 한편, PS-1과 G_oB에 대한 cDNA로 형질감염된 세포는 ³⁵S-GTPγS의 통합을 보이지 않았는데(도 , 레인 4), 이는 PS-1에 G_oB의 결합이 부재하는 기존의 결과와 일치되었다.

PS-1에서처럼, PS-2는 G_oA와 공동-발현되고 ³⁵S-GTPγS 결합에 대하여 평가되는 경우에, 형질감염되지 않은 대조 ES(PS^-/-) 추출물과 비교하여 ³⁵S-GTPγS 결합에서 700% 이상의 증가를 보였다(도 4, 칼럼 2). 이것은 PTx의 존재에서 저해되었다(도 4, 칼럼 3). PS-1에서와 달리, PS-2에 G_oB 결합은 ³⁵S-GTPγS 통합에서 증가를 제공한다. 이러한 신규한 조사 결과는 G_oB가 PS-2에 결합하지만 PS-1에는 결합하지 않는다는 것을 지시하는 본 명세서에 제공된 다른 데이터와 일치한다. ³⁵S-GTPγS 통합에서 이러한 증가는 G_oA에서 관찰되는 것보다 덜하다(~300%)(도 4, 칼럼 4). 이러한 증가는 PTx의 존재에서 저해된다. 도 4에 도시된 결과는 최소한 3회 독립된 실험의 전형이다.

실시예 2

ES PS 이중-눌 세포는 배양되고 하룻밤동안 도말되었다. 이들 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민(Invitrogen)을 이용하여 전장 인간 β-APP cDNA의 pcDNA3 구조체로 형질감염되었다. DAMI 세포는 배양되고, pcDNA3으로 또는 전장 인간 PS-1 또는 PS-2 cDNA의 pcDNA3 구조체로 형질감염되었다.

친화성 정제된 다중클론 토끼 항-PTyr 항체(Maher et al., 1985)는 웨스턴 블롯에 이용되었다. 생쥐 단일클론 항-PTyr 항체(4G10; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)는 ELISA 분석에 이용되었다. 인간 pp60c-src에 대한 생쥐 단일클론 항체(항-Src, 클론 GD11) 및 Lyn에 대한 토끼 다중클론 항체(항-Lyn)는 Upstate Biotechnology로부터 구입되었다. Fyn에 대한 토끼 다중클론 항체(항-Fyn, sc-16)는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 구입되었다. PS-1의 N-말단 도메인에 대한 일차 쥐 항-인간 PS-1 단일클론 항체 MAb #1563은 Chemicon International(Temecula, CA)로부터 구입되었다. 이는 GST에 융합된 인간 PS-1의 N-말단 도메인 부분(잔기 21-80)을 보유하는 융합 단백질 항원에 대하여 생성되었다. 인간 β-APP 세포외 도메인에 대한 일차 생쥐 단일클론 항체 MAb #348은 Chemicon International로부터 구입되었다.

플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)-접합된 친화성 정제된 염소 항-쥐 IgG 및 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine B isothiocyanate, TRITC)-접합된 친화성 정제된 당나귀 항-생쥐 IgG 이차 항체는 Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA)로부터 구입되었다. 면역형광 표지화 형질감염된 DAMI 세포와 형질감염되지 않은 DAMI 세포는 PBS에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정되고 투과화(permeabilization) 없이 이용되었다. 세포는 1% BSA를 포함하는 PBS 내에서 PS-1(1:200 희석)과 β-APP(1:500 희석)에 대한 항혈청으로, 실온에서 30분 동안 현탁 동안 표지되었다. 원심분리에 의해 PBS로 3회 세척한 이후, 이들 세포는 1% BSA/PBS에 재현탁되고 적절한 형광 이차 항체와 함께 배양되었다. 배양은 20분 동안 실온에서 수행되고, 이후 이들 세포는 PBS로 세척되고 마운팅 배지(mounting medium)(Vector Laboratories, Burlingame, CA)의 존재에서 슬라이드 위에 위치되었다.

면역형광 검경(immunofluorescent microscopy)은 유침(oil immersion)을 이용하여 X60 대물렌즈(objective lens)로 수행되었다. 이들 슬라이드는 플루오레세인 이소티오시아네이트와 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트필터, 그리고 Zeiss Photoscope III 기계를 이용하여, 또는 Nomarski optics로 시각화되었다.

PS-1과 PS-2의 N-말단 도메인은 PCR로 수득되고 FLAG 발현 벡터(Scientific Imaging Systems, IBI 13100)의 Tth 111 I과 Xho-1 부위 내로 클로닝되어, FLAG가 PS-1 또는 PS-2 N-말단 도메인의 N-말단에 부착된 융합 단백질이 산출되었다. 이들 2가지 FLAG-융합 단백질은 DH5α 세균 내에서 독립적으로 성장되고 제조업체의 프로토콜에 따라 친화성 정제되었다. 정제된 재조합 단백질은 FLAG 및 PS-1 또는 PS-2의 N-말단 도메인 둘 모두에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 조사되었다.

DAMI:ES 세포: 동등한 수(0.5 x 10⁶/㎖)의 β-APP 695(Selkoe and Podlisny, 2002)-형질감염된 ES 이중-눌 세포와 PS-1 형질감염된 DAMI 세포는 0 내지 20 분 사이에 다양한 시간 동안 37℃에서 공동-배양되었다.

실험은 적절하게 형질감염된 DAMI 세포 단독으로 수행되었다. 동등한 수(0.5 x 10⁶/㎖)의 β-APP-형질감염된 DAMI 세포 및 PS-1- 또는 PS-2-형질감염된 DAMI 세포는 기존 문헌(Dewji and Singer, 1998)에 기술된 바와 같이, 실온에서 부드럽게 혼합되었다. 대조 실험에서, pcDNA3 단독으로 형질감염된 DAMI 세포가 β-APP 형질감염된 세포를 대체하였다.

혼합후 0 내지 20분 사이에 다양한 시점에서, 각 세포 혼합물의 분량(aliquot)은 신속하게 원심분리되고, 배양 배지는 제거되고, 세포 펠릿(pellet)은 프로테아제 저해물질(1mM 4-(2-아미노에틸) 벤젠 설포닐 플루오르화물 염산염(AEBSF)/1 ㎍/㎖ 안티파인(antipain)/0.1 ㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin) A/0.1㎍/㎖ 레우펩틴(leupeptin))과 인산분해효소(phosphatase) 저해물질 나트륨 오르토바나드산염(sodium orthovanadate)(0.1mM)을 포함하는 200 ㎕의 추출 완충액(50mM Tris, pH 8.0/150mM NaCl/0.5% Nonidet-P40)에 현탁되었다. 혼합물은 20 sec 지속 시간의 3회 폭발로 초음파처리되고, 이후 원심분리되었다. 이들 추출물 상층액은 하기에 기술된 바와 같이 웨스턴 블롯과 ELISA 분석에 이용되었다.

세포 추출물 내에서 Src 계통의 단백질 티로신 키나아제에 대한 분석평가가 수행되었다. 기질 펩티드 {[Lys19] cdc2 (6-20)-NH2} 및 대조 펩티드 {[Lys19Ser14Val12]cdc2 (6-20)}와 {[Lys19Phe15]cdc2(6-20)}은 Upstate Biotechnology Inc.로부터 구입되었다. Src 키나아제 활성은 이들 3가지 펩티드를 모두 이용하여, PS-1- 형질감염된 세포와 혼합된 형질감염된 DAMI 세포(β-APP- 또는 pcDNA3- 형질감염된), 또는 PS-2- 형질감염된 세포와 혼합된 β-APP- 또는 pcDNA3- 형질감염된 세포의 추출물에서 측정되었다. 대조에는 이러한 반응 혼합물 내에 기질 없음을 이용하여 수행된 실험이 포함되었다.

기질 펩티드(10 ㎕에서 1.5mM), Src 키나아제 반응 완충액(100mM Tris-HCl, pH 7.2, 125 mM MgCl₂, 25 mM MnCl₂, 2 mM EGTA, 0.25 mM 나트륨 오르토바나드산염, 2mM DTT)(10 ㎕), Src 키나아제(분석평가당 2-20 U의 정제된 효소, 또는 10 ㎕에서 10 - 200 ㎍ 단백질 용해물) 및 Mn²⁺/ATP 칵테일(10 ㎕)로 희석된 [γ-³²P]ATP(NEN Dupont, Boston, MA)는 30℃에서 15-20분 동안 배양되었다.

앞서 기술된 추출물 상층액의 분량(100 ㎍ 단백질/레인)은 적하 완충액(50 mM Tris, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤) 내에서 5분 동안 끓여지고, SDS-PAGE(10%) 겔 상에서 전기영동으로 분리되고, 그리고 이들 단백질은 니트로셀룰로오스 필터로 이전되었다. 필터는 일차 다중클론 토끼 항-PTyr 항체, 그 이후에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)-접합된 염소 항-토끼 IgG와 함께 배양되었다. 필터-결합된 과산화효소 활성은 화학발광(chemiluminescence)으로 탐지되었다.

세포 용해물은 추출 완충액 내에서 제조되고, 4℃에서 15분 동안 마이크로-원심분리(micro-centrifugation)로 정화되었다.

추출물은 c-Src, Lyn 또는 Fyn에 특이적인 4 ㎍ 항체, 그 이후에 단백질-A 또는 G 세파로오스(sepharose)(40 ㎕의 슬러리)와 함께 배양되었다. 항원 항체-단백질-A(또는 -G) 세파로오스 복합체는 300 mM NaCl을 포함하는 RIPA(50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Na 디옥시콜레이트(deoxycholate), 0.1% SDS, 1% 트라실롤(trasylol), 25 ㎛ 레우펩틴)로 3회, 10 mM NaCl을 포함하는 RIPA로 1회, 40 mM Tris-HCl, pH 7.2로 2회, 25 mM HEPES, pH 6.9, 3 mM MnCl₂와 200 μM 나트륨 오르토바나드산염을 포함하는 키나아제 완충액으로 1회 세척되었다.

반응은 5ㅅCi [g32P] ATP(3000Ci/mmol)를 포함하는 40 ㎕ 키나아제 완충액(25 mM Hepes, pH 6.9, 3 mM MnCl₂와 200㎛ 나트륨 오르토바나드산염) 내에서 공개된 프로토콜(Zisch et al., 1998)에 따라, 37℃에서 30분 동안 수행되었다. 반응 비드(reaction bead)는 키나아제 완충액으로 3회 세척되고 75 ㎕ SDS 겔 적하 완충액(250mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.02% 브로모페놀 블루와 75% 글리세롤)에서 재현탁되었다. 자기인산화(autophosphorylation) 반응물은 SDS-PAGE, 그리고 단백질의 PVDF 막으로 이전과 방사선사진촬영술이 순차적으로 수행되었다.

ELISA. 단백질 티로신 키나아제 활성은 티로신 키나아제 분석평가 키트(Upstate Biotechnology)를 이용한 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISA)로 측정되었다. 폴리(Glu4-Tyr)의 단위 반복(tandem repeat)을 보유하는 비오틴화된 기질 펩티드는 제조업체의 프로토콜에 따라, 비-방사성 ATP와 Mn²⁺/Mg²⁺ 보조-인자 칵테일의 존재에서 상이한 시간 동안 혼합된 형질감염된 세포의 추출물 상층액(20 ㎍ 단백질/웰)과 함께 배양되었다. 양고추냉이 과산화효소에 접합된 포스포티로신 특이적 생쥐 단일클론 항체(4G10)는 ELISA로 인산화된 기질을 탐지하는데 이용되었다.

형질감염되지 않은 DAMI 세포와 PS-1-형질감염된 DAMI 세포에서 β-APP의 세포 표면 발현의 부재. 이들 초기 연구는 PS-1로 형질감염후 DAMI 세포가 그들의 표면에서 극히 미량의 β-APP만을 계속 발현한다는 제안에 기초하기 때문에, 아래의 실험이 먼저 수행되었다. 고정되지만 불침투성 상태에서 형질감염되지 않은 DAMI 세포와 PS-1-형질감염된 DAMI 세포 둘 모두 β-APP와 PS-1에 대하여 이중으로 면역형광 표지되었다. 형질감염되지 않고 고정된 불침투성 DAMI 세포는 기존 문헌(Querfurth and Selkoe, 1994)에서 확인된 바와 같이, 세포 표면에서 유의한 양의 β-APP를 발현하지 않는 반면(도 5a, 패널 2), β-APP의 pcDNA3 구조체로 형질감염된 DAMI 세포는 고정된 불침투성 세포 내에서 실질적인 세포-표면 발현을 보인다(도 5b, 패널 2). 하지만, 도 5a와 b, 패널 1에서는 형질감염되지 않고 고정된 불침투성 DAMI 세포가 내인성 세포-표면 PS-1을 발현한다는 것을 보여준다. 도 5c, 패널 1에서, PS-1의 이러한 세포-표면 발현은 고정된 불침투성 PS-1-형질감염된 세포에서 증가한다. 도 5c, 패널 2에서는 PS-1로 DAMI 세포의 형질감염이 형질감염되지 않은 세포에서 관찰되는 극히 미미한 수준과 비교하여 β-APP의 세포-표면 발현을 유의하게 증가시키지 못한다는 것을 보여준다(도 5a, 패널 2). 도 5d, 패널 2에서는 β-APP로 형질감염된 ES 이중-눌 고정된 불침투성 세포에서 β-APP의 세포-표면 발현이 관찰되지만 PS-1 발현은 관찰되지 않는다는 것을 보여준다(도 5d, 패널 1).

형질감염되지 않고 고정된 불침투성 ES 이중-눌 세포에서, 예상된 바와 같이, 세포-표면 PS-1에 대한 표지화가 관찰되지 않지만(도 5e, 패널 1), 내인성 β-APP의 소량 표면 발현이 관찰된다(도 5e, 패널 2). 이들 결과는 β-APP-형질감염된 ES 이중-눌 세포와 PS-형질감염된 DAMI 세포의 상호작용에서, 세포-표면에서, ES 세포는 세포-표면 β-APP만을 발현하고 PS를 발현하지 않고, 반면 PS-형질감염된 DAMI 세포는 PS만을 발현하고 β-APP를 발현하지 않는다는 것을 증명한다. β-APP:PS 상호작용이 세포 혼합 이후에 발생하면, 이는 당연히, 세포-세포 상호작용의 결과일 수 있다.

본 명세서에는 특이적인 β-APP:PS 세포내 신호전달이 티로신 키나아제 활성에서 증가를 결과한다는 것을 지시하는 데이터 역시 제시된다. β-APP로 형질감염된 ES 이중-눌 세포는 PS-1로 형질감염된 DAMI 세포와 혼합되고, 세포-세포 접촉을 담보하는 세포 밀도(cell density)를 이용하여 0 내지 20분 사이에 다양한 시간 동안 공동-배양되었다. 이후, 세포 추출물에서 ELISA 검사법을 수행하여 단백질 티로신 키나아제 활성을 측정하였다. 도 6a에서는 이들 공동-배양이 PS-1-형질감염된 DAMI 세포가 β-APP-형질감염된 DAMI 세포와 혼합될 때 기존 문헌(Dewji and Singer, 1998)에서 기술된 것들과 정도와 동역학에서 유사한 단백질 티로신 키나아제 활성의 신속하고 일시적인 증가를 유도한다는 것을 보여준다. 도 6a에서처럼 동일한 상호작용이 25 ㎍ 정제된 바쿨로바이러스(baculovirus)-유래된 가용성 β-APP(β-APP의 세포외 도메인)(도 6b) 또는 PS-1의 N-말단 도메인에 융합된 FLAG 리포터의 25 ㎍ 융합 펩티드(도 6c)의 존재에서 수행될 때, 단백질 티로신 키나아제 활성에서 증가는 관찰되지 않았다. 한편, 25 ㎍ FLAG-PS-2 N-말단 도메인 융합 펩티드의 존재에서 동일한 β-APP:PS-1 공동-배양은 PTyr 형성을 저해하지 못하였다(도 2d). 이들 결과는 여러 중요 사항을 명확하게 확립한다: 1) 가용성 β-APP 자체는 PS-1-형질감염된 DAMI 세포를 활성화시키지 못하고, 따라서 티로신 키나아제 활성을 나타내지 못한다; 형질감염된 ES 세포 막 내에서 본래 β-APP가 요구된다. 반대로, 가용성 β-APP는 막-결합된 β-APP에 의해 산출되는 활성을 저해하는데, 이는 막-결합된 β-APP가 활성화에 특이적으로 관여하다는 것을 증명한다; 2) PS-1의 N-말단 도메인 자체는 β-APP-형질감염된 세포를 활성화시키지 못하고, 따라서 티로신 키나아제 활성을 나타내지 못한다. DAMI 세포 막 내에서 본래 PS-1 분자가 요구된다. 하지만, PS-1의 N-말단 도메인(PS-2는 그렇지 못함)은 이러한 공동-배양의 활성화를 저해하는데, 이는 PS-1-형질감염된 DAMI 세포 상에서 막-결합된 PS-1 역시 이러한 상호작용에 특이적으로 관여한다는 것을 증명한다; 3) 이들 저해물질, 가용성 β-APP 및 PS-1의 N-말단 도메인의 FLAG-융합 단백질의 단백질 특성은 생존 DAMI와 ES 세포의 세포 막에서 그들의 불침투성(impenetrability)을 담보되고, 따라서 세포-표면 β-APP와 PS-1의 외부 도메인들만 신호전달 사건을 발생시키는데 관여한다는 것을 증명한다(즉, 이러한 신호전달은 근접분비 유형이다). 이들 결과는 β-APP와 PS 사이에 근접분비 상호작용이 발생할 수 있음을 확립하는 명백한 증거를 제공한다.

더 나아가, PS-1의 N-말단 도메인이 세포외 표면에서 노출된다는 이러한 증명은 PS 단백질의 7-TM 지형과 일치하지만 8-TM 모형의 예측과는 상반되는데, 이는 PS의 N-말단 도메인을 세포내 위치시킨다.

본 명세서에 제공된 추가의 데이터는 β-APP:PS-1과 β-APP:PS-2 세포내 신호전달이 Src 계통의 티로신 키나아제의 구성원에 의해 매개될 수 있음을 지시한다. β-APP:PS 세포내 결합의 결과인 PTyr 변형에서 이러한 증가는 확인이 요구되는 한 가지 이상의 단백질 티로신 키나아제를 필요로 하였다. β-APP와 PS 단백질 둘 모두 이런 키나아제 활성 부위를 보유하고 있지 않기 때문에, 이들 단백질의 세포질 도메인의 간접적인 활성, 예를 들면, 이들 도메인 중의 하나에 세포질 티로신 키나아제의 직접적인 또는 간접적인 결합이 하류 신호에 관련될 수 있다. 여러 세포질 티로신 키나아제가 Src 유전자 계통 내에서 확인되었기 때문에, Src 계통 단백질 티로신 키나아제는 기질 펩티드 [lys19]cdc2(6-20)-NH₂ (KVEKIGTYGVVKK; 서열 번호 12)를 이용하여 혼합된 형질감염된 세포의 세포 추출물에서 평가되었다. cdc2(6-20)에서 Tyr 19가 lys로 치환된 상기 펩티드는 Src 계통 키나아제에 대한 효과적인 기질인 것으로 밝혀졌다. v-Src와 c-Src, c-Yes, Lck, Lyn, Fyn을 비롯한 조사된 모든 Src 계통 키나아제는 상기 기질에 대하여 강한 활성을 나타낸다. 2개의 대조 펩티드 역시 이용되었다: 첫 번째 펩티드, [lys19ser14val12]cdc2(6-20)NH₂ (KVEKIGVGSYGVVKK; 서열 번호 13)에서, glu12와 thr14가 각각, val과 ser로 치환되고, 결과의 펩티드는 Src 계통 티로신 키나아제에 대한 기질로서 기능하는 능력이 현저하게 감소하였다. 다른 펩티드, [lys19phe15]cdc2(6-20)NH2 (KVEKIGEGTFGVVKK; 서열 번호 14)는 티로신 키나아제에 의해 인산화되지 않았지만 ser/thr 키나아제에 대한 잠재적인 표적(thr 14)을 보유하였다.

β-APP:PS-1 상호작용을 유발하는 PS-1-형질감염된 DAMI 세포와 β-APP-형질감염된 DAMI 세포의 공동-배양의 추출물에서 및 β-APP가 부재하는 상응하는 대조(pcDNA3:PS-1)에서 Src 계통 키나아제 활성 측정의 결과는 도 7a와 b에 도시된다. 이들 3가지 펩티드를 이용하여, β-APP:PS-2 상호작용을 유발하는 형질감염된 DAMI 세포 혼합물, 그리고 대조 pcDNA3:PS-2 혼합된 형질감염된 DAMI 세포의 추출물에 대한 유사한 결과는 도 7c와 d에 도시된다. [lys19]cdc2(6-20)NH₂가 Src 계통 키나아제 기질로서 이용된 각 β-APP:PS 세포 혼합물에서, 티로신 키나아제 활성에 대한 ELISA 결과에 병행하는, 대조 펩티드와 비교하여 증가된 활성의 시간 과정(temporal course)이 획득되었다. β-APP:PS-1 상호작용(도 7a)에서, Src 계통 키나아제 활성은 8분 시점에 최고이었고 12분 시점에 기준 수준(baseline level)으로 환원되었는데, 이는 세포 혼합후 시간의 함수로서 티로신 키나아제 활성에 대한 기존의 ELISA 결과를 확인한다. 동일한 기질이 대조 pcDNA3:PS-1(도 7b) 혼합된 세포에 이용될 때 유의한 증가가 관찰되지 않았다. β-APP:PS-2 상호작용을 유발하는 세포 혼합물(도 7c)의 경우에, 티로신 키나아제 ELISA 결과에서처럼, 혼합후 9분과 16분 시점에 기질 펩티드 [lys19]cdc2(6-20)NH₂에서 2개의 명백한 활성 피크가 관찰되었다.

β-APP가 부재하는 상응하는 대조, pcDNA3:PS-2(도 7d)의 경우에, 배경(background)과 비교하여 Src 키나아제 활성의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 β-APP-와 PS-1-형질감염된 세포 혼합물, 또는 β-APP-와 PS-2-형질감염된 세포 혼합물에 대하여 앞서 관찰된 티로신 키나아제 활성에서 증가가 Src 티로신 키나아제 계통의 하나 이상의 구성원을 필요로 한다는 것을 암시한다.

Src 계통 키나아제와 티로신 키나아제의 특이적인 저해물질의 존재에서 티로신 키나아제 활성의 저해. β-APP:PS 세포내 신호전달에 Src 키나아제 계통의 관여는 티로신 키나아제(허비마이신(herbymycin) A)와 Src 계통 키나아제(PP2)의 특이적인 저해물질의 존재 또는 부재에서 수행된, β-APP:PS-1 혼합된 세포 상호작용의 추출물의 ELISA로 더욱 확인되었다. 도 8a에서는 10 ㎍/㎖ 허비마이신 A의 존재에서, β-APP-형질감염된 DAMI 세포를 PS-1-형질감염된 DAMI 세포와 혼합한 이후 8-10분 시점에 티로신 키나아제 활성에서 증가가 완전히 저해된다는 것을 증명한다. 10 nM PP2(도 8b)의 존재에서 수행된 동일한 실험은 티로신 키나아제 활성의 유사한 저해를 보였다.

β-APP:PS-1 세포내 신호전달에 c-Src의 관여에 관련된 추가의 데이터는 하기에 제공된다. β-APP:PS-1 세포내 신호전달에 관여하는 Src 계통 구성원(들)의 실체를 결정하기 위하여, pp60c-Src를 조사하였다. c-Src에 크기에서 유사한 이중선인 겉보기 분자량(apparent molecular weight) 58과 60 kDa의 2개의 주요 단백질 밴드는 이러한 근접분비 상호작용에서 일시적인 PTyr 변형을 겪었다. PS-1-형질감염된 DAMI 세포와 β-APP-형질감염된 DAMI 세포의 혼합물의 추출물이 SDS16 PAGE 및 항-PTyr 또는 항-c-Src 항체로 면역블롯팅(immunoblotting)에 종속되면, 양쪽 항체는 동일한 두 밴드와 반응하였다(도 9a, 패널 1-3). 항-PTyr 항체로 면역블롯팅된 상기 도면의 패널 1에서는 세포 혼합후 8-10분 시점에, 이러한 단백질 밴드의 티로신 인산화에서 일시적인 최대 증가를 보여준다. 패널 2에서, c-Src항체로 면역블롯팅된 동일한 추출물은 시간의 흐름에서 변화를 나타내지 않는데, 이는 c-Src 단백질 농도가 PTyr 수준에서 증가 동안 변화되지 않는다는 것을 지시한다. 중요한 관찰 결과는 β-APP로 형질감염된 ES 이중-눌 세포(따라서 β-APP만을 발현하고, PS-1과 2를 발현하지 않음)를 PS-1로 형질감염된 DAMI 세포(따라서 PS-1만을 발현하고, 세포 표면 β-APP를 발현하지 않음)와 혼합하면, p60 c-Src 단백질 + 1개 또는 2개의 추가적인 단백질이 PS-1-형질감염된 DAMI 세포와 혼합된 β-APP-형질감염된 DAMI 세포(도 9a, 패널 1)에서 관찰되는, 혼합후 유사한 시점에서 PTyr 변형에서 일시적인 증가(도 9a, 패널 4)를 겪는다는 것이다. 따라서 이러한 PTyr 변형 결과는 PS-1과 연관되고, 이를 발현하는 세포 유형과는 무관하였다(PS-2의 경우에 하기 참조).

c-Src가 β-APP:PS-1 상호작용에서 일시적인 티로신 인산화를 겪는 티로신 키나아제 계통의 구성원인 지를 더욱 조사하기 위하여, 혼합후 상이한 시점에서 채취된 혼합된 형질감염된 DAMI 세포의 추출물을 항-c-src 항체 및 단백질-G 세파로오스 비드로 순차적으로 처리하는 실험(자기인산화)이 수행되었다. 이들 비드에 γ³²PATP가 추가되었다; 이후, 이들 단백질은 비드로부터 용해되고, SDS17 PAGE와 방사선사진촬영술이 수행되었다. 도 9b에서 결과는 세포 혼합후 8-10분 시점에 최대로 인산화되는 여러 일시적인 밴드가 나타난다는 것을 증명하는데, 이러한 시간 과정은 유사한 추출물에서 PTyr의 양상에 상응한다(도 9a, 패널 1). 이들 밴드 중에서 c-Src에 상응하는 이중선이 두드러지는데, 이는 c-Src가 β-APP:PS-1 세포내 상호작용에서 일시적으로 활성화된다는 것을 확인한다.

도 9b에서 다른 인산화된 밴드의 실체는 알지 못한다. 이들 전부가 반드시, 티로신 인산화에 기인한 것은 아니다; 일부 세린 또는 트레오닌 키나아제는 특이적인 항-pc-Src와 면역-반응된 c-Src에 결합되었을 수도 있다.

β-APP:PS-2 세포내 신호전달의 하류에 Fyn이 아닌 Lyn의 관여. β-APP:PS-2 세포내 상호작용이 적절하게 형질감염된 DAMI 세포의 혼합물로 수행되면, β-APP:PS-1 시스템에서와 전혀 상이한 세트의 단백질이 PTyr 변형되었다. 밴드가 50-66kDa에 존재하는 PTyr 항체에 의해 탐지되긴 했지만, 이들은 웨스턴 블롯 상에서 c-Src에 상응하지 않았다(도 11a, 패널 1). 게다가, β-APP:PS-2 혼합된 세포의 추출물이 c-Src 항체로 먼저 면역침전되고 면역침전물이 이후, 시험관내에서 자기인산화되면, 초기 시점(혼합후 8-10분)에서 인산화의 유의한 증가가 관찰되지 않았다(도 10b).

하지만, 후기 시점에서, c-Src는 이들 샘플에서 외관상으로 인산화될 수 있었는데, 이는 c-Src가 β-APP:PS-2 신호전달의 이차 후기 피크(second later peak)에서 확인된 증가에 기여한다는 것을 지시한다(도 10b). Src 키나아제 계통의 다른 구성원의 가능한 관여는 c-Src 이외의 53-59 kDa 범위의 분자량으로 조사되었다. Lyn(Mwt 53/56 kDa)과 Fyn(Mwt 59 kDa)은 조사된 2가지 후보 Src 키나아제이었다.

도 11a에서 항-Lyn 항체로 웨스턴 블롯 혼성화의 결과는 β-APP:PS-2 세포내 상호작용이 수행될 때 Lyn 단백질 농도가 변하지 않지만, 항-Lyn 항체로 추출물의 면역침전 및 이들 침전물의 시험관내 자기인산화 이후, 다른 인산화된 밴드와 함께 8-9분과 17-18분에 활성 피크를 나타내는 Lyn의 일시적인 인산화가 관찰된다는 것을 증명한다(도 11c). Lyn은 β-APP:PS-2 상호작용에 대하여 웨스턴 블롯과 ELISA에서 관찰되는 PTyr 증가와 유사한 패턴으로 일시적인 인산화를 겪는다(도 11c). 한편, Fyn은 항-Fyn 항체로 면역침전후 동일한 추출물에서 시험관내 자기인산화(도 11d) 및 시간의 흐름에서 농도 변화(도 11b)를 보이지 않는다.

실시예 3

아래의 데이터에서는 생쥐 전두엽(frontal cortex)의 추출물 내에서 내인성 PS-1과 PS-2에 G-단백질 결합을 증명한다. WT 생쥐 전두의 20% 균질액(homogenate)은 GTPγS 용해화/추출 완충액[50 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 60 mM 옥틸글리코시드, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물(1 μM 페닐메틸설포닐플루라이드(phenylmethylsulfonylflouride), 1 ㎍/㎖ 안티파인(antipain), 0.1 ㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin) A, 0.1 ㎍/㎖ 레우펩틴(leupeptin)]에서 만들었다. [³⁵S]GTPγS 결합의 측정은 처리되지 않은 추출물, PTX 처리된 추출물 및 PS-1과 PS-2 면역-고갈된(immuno-depleted) 추출물에서 수행되었다.

처리되지 않은 샘플의 경우에, 100 ㎍의 추출물은 GTPγS 용해화/추출 완충액 내에 100 ㎕로 넣어지고, 200 ㎕의 총 부피(total volume)에서 동등 부피의 GTPγS 완충액 B(50 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 40 μM GDP, 50 mM MgCl₂, 100 mM NaCl)와 혼합되었다. 반응은 50 nM [³⁵S] GTPγS(1250 Ci/mMol; Perkin Elmer)로 시작되고, RT에서 60분 동안 배양되었다. 반응은 20 ㎕ 10X 중단 완충액(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 20 mM GTP)의 추가로 중단되었다.

PTX 치료된 샘플의 경우에, 100 ㎍의 추출물은 GTPγS 용해화/추출 완충액 내에 100 ㎕로 넣어지고, PTX 완충액(20 mM HEPES pH 8.0, 1mM EDTA, 2 mM MgCl₂, 1 mM NAD)의 존재에서 500 ng/㎖ 활성화된 PTX로 처리되었다. 상기 샘플은 30℃에서 12시간 동안 배양되었다. 이후, PTX 처리된 샘플은 동등 부피의 GTPγS 완충액 B와 혼합되고, 앞서 기술된 바와 같이 [³⁵S]GTPγS 분석평가가 수행되었다.

생쥐 전두엽의 추출물은 4℃에서 하룻밤동안 PS-1과 PS-2(각각 10 ㎕)에 대한 다중클론 항체의 혼합물로 면역침전시켜 PS-1과 PS-2의 샘플을 고갈시켰다. 단백질 A 아가로스(20 ㎕ 슬러리/100 ㎍ 단백질)이 추가되고, 샘플은 4℃에서 2시간 동안 빙글빙글(end-over-end) 회전되었다. PS-항체-단백질 A 복합체는 5분 동안 고속으로 원심분리되었다. 상층액은 회수되고, 100 ㎍ 분량은 앞서 기술된 바와 같은 [³⁵S] GTPγS 분석평가가 수행되었다.

GTPγS 반응 이후, 5 ㎕의 항-PS-1 또는 항-PS-2 단일클론 항체가 추가되고, 샘플은 4℃에서 하룻밤동안 위치되었다. 항체-단백질 복합체는 20 ㎕ 단백질 A/G 아가로즈(Pharmacia)에 결합되고, 샘플은 4℃에 위치되고 2시간 동안 빙글빙글 회전되었다. 아가로즈 비드는 세척 완충액 1(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 1% Triton-X100, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물)로 3회 세척되고, 세척 완충액 2(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% Triton-X100, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물)와 3(50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물)로 각 1회 세척되었다. 이후, 세척된 아가로즈 비드는 5 ㎖ 섬광 액(CytoScint, ICN)에 현탁되고 Beckman Coulter LS 6000 SC 섬광 계수기에서 3분 동안 계산되었다.

PS-1과 PS-2 둘 모두에 대한 세포내 루프 1의 첫 16개 아미노산에 상응하는 서열[ic1(1-16)], 세포내 루프 1의 나머지 16개 아미노산[ic1(17-32)], 전체 세포내 루프 2(ic2), 전체 세포내 루프 3(ic3), 세포질 C-말단 꼬리의 첫 20개 아미노산(C1-20) 및 세포질 C-말단 꼬리의 나머지 19개 아미노산(C21-39)이 합성되고 >90% 순도로 HPLC 정제된다. 도 12에서는 PS의 세포내 도메인을 도시한다. 표 1에서는 이들 도메인으로부터 합성될 수 있는 서열을 도시한다. 이에 더하여, 펩티드 C1-20의 서열이 뒤섞일 수 있는 20개 아미노산 대조 펩티드가 합성될 수 있다. 이러한 펩티드는 G_o에 대하여 PS-1 상에서 결합 도메인으로 확인된 39개 아미노-산 서열의 일부이다.

	PS-1 세포질 펩티드	PS-2 세포질 펩티드
ic1(1-16)	KSVSFYTRKDGQLIYT	KSVRFYTEKNGQLIYT
ic1(17-32)	PFTEDTETVGQRALHS	TFTEDTPSVGQRLLNS
ic2	VFKTYNVAVD	EVLKTYNVAMD
ic3	KYLPE	(PS-1의 ic3에 동일함)
C(1-20)	KKALPALPISITFGLVFYFA	KKALPALPISITFGLIFYFS
C(21-39)	TDYLVQPFMDQLAFHQFYI	TDNLVRPFMDTLASHQLYI

실시예 4

본 연구에서는 PS-1의 GPCR 기능이 Aβ의 생산을 매개한다는 것을 증명한다. PS-GPCR 기능의 연구에서 주요한 문제는 PS로부터 G-단백질 활성을 유도할 수 있는 PS에 특이적인 리간드를 결정하는 것인데, 상기 리간드는 세포내에서 PS에 결합한다. 본 연구에서는 3-부분 리간드-수용체-G-단백질 시스템이 Aβ의 생산을 개시하는 지를 조사하였다. 이런 시스템에서, 리간드(β-APP) 결합에 의한 PS 활성화는 세포질 도메인 내에서 PS에 G-단백질 결합을 유도할 것이다.

PS-1 또는 PS-2에 G-단백질 결합이 β-APP로부터 Aβ 생산에 영향을 주는 지를 조사하기 위하여, 백일해 독소(PTx)의 존재와 부재에서 β-APP와 PS-1의 세포:세포 상호작용 실험이 수행되었다. PTx는 G-단백질 G_o 활성화의 특이적인 저해물질이다. PS의 GPCR 기능이 β-APP:PS 세포내 결합으로부터 Aβ의 생산에 관여하면, 이의 존재에서 Aβ 생산은 저해될 것이다.

앞서 기술된 방법을 이용하여 β-APP:PS-1 매개된 세포-세포 상호작용을 수행하였는데, PS-1 형질감염된 일차 β-APP-/- 섬유아세포(세포는 PS-1을 발현하고 β-APP를 생산하지 않는다)는 ³⁵S-메티오닌의 존재에서 β-APP-형질감염된 ES(PS-/-) 세포(세포는 β-APP를 생산하지만 PS를 발현하지 않는다)와 상호작용하였다. 이들 형질감염된 세포의 공동-배양후 24시간 시점에, 샘플은 프로테아제 저해물질의 존재에서 수확되었다. 세포는 초음파처리되고, 100 ㎍의 완전 세포 추출물은 Aβ에 대한 항체(6E10)로 면역침전되고, 면역침전된 샘플은 Bicene-Tris 겔 상에서 이동되었다. Aβ 밴드는 건조된 겔의 방사선사진촬영술로 시각화되었다. 500 ng/㎖ PTx의 존재에서 동일한 실험이 수행되었다. 배양된 세포의 처리는 하기에 기술된 바와 같이 12시간 동안 수행되었다. PTx 처리에 대한 대조로서, 이들 배양된 세포는 ATP와 NAD만을 포함하는 PTx 완충액과 함께 배양되었다. 이들 조건 하에, Go의 활성화 및 Aβ의 수준은 영향을 받지 않을 것이다.

도 15에서는 이들 연구의 결과를 도시한다. 레인 1에서는 PS-1-발현 섬유아세포(β-APP-/-)와 공동-배양된 β-APP-발현 ES(PS-/-) 세포의 결과를 보여준다. 레인 2에서는 PTx와 PTX 완충액(NAD + ATP)의 존재에서, 레인 1에 이용된 성분의 결과를 보여준다. 레인 3에서는 PTx 없이 PTx 완충액 단독(NAD + ATP)의 존재에서, 레인 1에 이용된 성분의 결과를 보여준다. 레인 4에서는 + 꼬리 없는 PS-1-발현 섬유아세포(β-APP-/-)와 공동-배양된 꼬리 없는 β-APP-발현 ES(PS-/-) 세포의 결과를 보여준다. 레인 5에서는 PTx의 존재에서, 레인 4에 이용된 성분의 결과를 보여준다. 레인 6에서는 꼬리 없는 PS-1-발현 섬유아세포(β-APP-/-)와 공동-배양된 야생형 β-APP-발현 ES(PS-/-) 세포의 결과를 보여준다.

이들 결과는 PTx 독소가 β-APP와 PS-1의 세포내 상호작용으로부터 Aβ의 생산을 저해한다는 것을 지시한다(상기 레인 1과 2). 레인 3에서는 PTx 없이 PTx 완충액 단독의 존재에서, Aβ 생산이 저해되지 않는다는 것을 보여준다. 레인 4와 6에서는 Go에 대한 PS-1의 결합 도메인인 것으로 이전에 밝혀진 PS-1의 세포질 카르복실 말단 도메인이 부재하면, Aβ 생산이 제거된다는 것을 보여준다.

본 명세서에 제공된 데이터는 β-APP가 PS-1에 대한 리간드이고, 상기 리간드가 결합 이후에, 이의 GPCR 활성을 활성화시킨다는 것을 지시한다. 상기 데이터는 또한, PS-1의 GPCR 기능이 β-APP와 PS-1의 세포내 상호작용 이후에 β-APP로부터 Aβ의 생산에 관여한다는 것을 지시한다. 또한, 이들 결과는 PS-1의 GPCR 활성 조절 역시 Aβ의 생산을 조절한다는 것을 지시한다. 따라서 PS-1의 GPCR 활성을 조절하는 작용제는 Aβ의 생산을 조절할 것이다.

공동-배양 실험을 위하여, ES(PS^-/-)와 β-APP(^-/-) 세포는 25 ㎠ 플라스크당 1 x 10⁷개 세포로 도말되고 적절한 cDNA로 형질감염되었다. 형질감염후 5시간 시점에, β-APP로 형질감염된 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포는 가벼운 트립신처리(trypsinization)로 분리되고, 열-불활성화되고 투석된 FCS(10% v/v)를 포함하는 met-없는 배양 배지로 2X 세척되고, 상기 배지에서 0.33 x 10⁷개 세포/㎖로 재현탁되었다. 유사하게, β-APP 적중(knockout) 생쥐로부터 일차 섬유아세포는 PS-1 또는 PS-2로 공동-형질감염되고 1 x 10⁷개 세포로 도말되었다. 형질감염된 세포는 met-없는 배지로 2X 세척되고 3 ㎖ met-없는 배지 내에 방치되었다.

β-APP 형질감염된 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-) 세포(1 x 10⁷개 세포/3 ㎖ met-없는 배지)가 PS-1-형질감염된 β-APP 적중 세포에 추가되었다. 이들 세포 밀도는 실질적으로 모든 세포가 서로 접촉하도록 담보하였다. ³⁵S-met(66ㅅCi/㎖; 1175Ci/mmol, NEN)이 추가되고, 배양액은 24시간 동안 배양되었다. PTx 처리를 이용한 실험에서, 이 단계에서 적절한 반응 조건 하에 이들 배양액에 500 ng/㎖ PTx가 추가되고 24시간 동안 배양되었다. 이후, 상기 배지는 제거되고, 세포는 긁어내어 수확되었다. 드라이아이스(dry ice)에서 냉동에 앞서, 프로테아제 저해물질 혼합물이 상기 배지에 추가되었다. 프로테아제 저해물질 (1mM 4-(2-아미노에틸) 벤젠 설포닐 플루오르화물 염산염(AEBSF)/1 ㎍/㎖ 안티파인(antipain)/0.1 ㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin) A/0.1㎍/㎖ 레우펩틴(leupeptin))을 포함하는 100 ㎕ 추출 완충액(50mM Tris, pH 8.0 / 150mM NaCl / 0.5% Nonidet-P40)이 세포 펠릿에 추가되고, 샘플은 드라이아이스에서 급속-냉동되었다.

PTx 프로모터(Biomol Research Laboratories)는 37℃에서 10분 동안 10 mM DTT와 함께 배양하여 이를 효소 활성 형태로 전환시켰다. PS-1 또는 PS-2와 G-단백질 cDNA로 ES 세포의 형질감염후 5시간 시점에, 500 ng/㎖의 활성화된 PTx가 1 mM NAD, 1 mM ATP, 2 mM MgCl₂와 1 mM EDTA의 존재에서 배양 배지 내에 세포에 추가되었다. 이들 세포는 5% CO₂의 존재에서 37℃에서 18시간 동안 배양되었다.

완전 세포 추출물은 얼음 위에서 각 20 sec의 3회 폭발로 초음파처리된 세포-펠릿을 이용하여 준비되었다. 단백질 농도는 Lowry 방법에 따라 결정되었다.

면역침전은 4℃에서 하룻밤동안, Aβ의 잔기 1-17(Senetek)에 대하여 생성된 2 ㎍ Aβ 특이적인 단일클론 항체 6E10(Senetek)과 함께 빙글빙글 회전 장치 내에서 면역침전된 100 ㎍ 세포 추출물을 이용하여 수행되었다. 이후, 40 ㎕ 슬러리의 단백질 G 세파로오스(Pharmacia)가 추가되고, 실온에서 1시간 동안 빙글빙글 혼합되었다. 항원-항체-단백질 G 세파로오스 복합체는 완충액 1(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.65M NaCl, 1% NP-40), 완충액 2(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.75% NP-40)와 완충액 3(10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.1% NP-40)으로 각 1회 세척되었다. 세척된 복합체는 bicene-tris 샘플 완충액 내에서 10분 동안 끓여지고, bicene-tris 겔 상에서 SDS PAGE가 수행되었다.

8M 요소를 포함하는 Bicene-tris 겔(15%T/5%C)은 주조되고 이동되었다. 이후, 이들 겔은 0.4M 나트륨 붕산염(sodium borate)/인산염(phosphate) 완충액에서 5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 30분 동안 고정되고, 메탄올-아세트산(methanol-acetic acid)에서 0.1% Coomassie Blue G250로 1시간 동안 착색되었다. 탈색(destaining)후, 이들 겔은 방사선사진촬영술에 준비되었다.

탈색된 겔은 에탄올(30%)과 글리세롤(5%)로 30분 동안 처리되고, Amplify(Amersham)로 30분 동안 채워지고, 진공 하에 80℃에서 건조되고, -70℃에서 4-5일 동안 X-Omat 필름에 노출되었다.

Aβ의 궁극적 생산에 요구되는 특이적인 β-APP:PS-매개된 세포-세포 상호작용 역시 G-단백질을 활성화시킨다. 한 세포 표면 상에서 β-APP 및 다른 세포 표면 상에서 PS의 특이적인 결합에 의해 매개된 세포:세포 상호작용은 β-APP로부터 Aβ의 생산에서 필수적인 최초 단계이다. 인간 β-APP-단독-발현 세포 및 PS-단독-발현 세포 사이에 세포-세포 상호작용이 그들의 결합된 내인성 단백질과 함께, 내인성 생쥐 G-단백질 활성화를 유발하는 지를 결정하기 위하여, G-단백질 활성화를 결정하는 표준 방법인 ³⁵S-GTPγS와 Gσ의 결합이 평가되었다. 이들 모든 연구에서, 내인성 생쥐 Gσ_o의 활성화가 조사되었다.

2가지 세포 유형이 산출되었다: 소량의 내인성 β-APP를 발현하지만 PS를 발현하지 못하는 ES-유래된 생쥐 세포(PS-1^-/-; PS-2^-/-)는 생쥐 β-APP에 비하여 과량의 인간 β-APP를 발현하고, PS-1 또는 PS-2를 발현하지 못하는 세포(β-APP-단독 세포)를 생산하기 위하여, 인간 β-APP에 대한 cDNA로 일시적으로 형질감염되었다. 소량의 내인성 PS-1과 PS-2만을 발현하는, β-APP-눌 생쥐로부터 유래된 태아(E18) 생쥐 일차 섬유아세포는 생쥐 PS-1에 비하여 과량의 인간 PS-1을 발현하지만 β-APP를 발현하지 못하는 세포(PS-1-단독 세포)를 생산하기 위하여 인간 PS-1에 대한 cDNA로 형질감염되었다. β-APP-단독 발현 세포 및 PS-1-단독 발현 세포는 그들의 세포간 상호작용을 가능하게 하는 높은 밀도에서, 또는 더욱 낮은 정도의 세포:세포 상호작용만을 허용하는 더욱 낮은 밀도에서 24시간 동안 공동-배양되었다 (도 14C, 레인 4와 비교하여 도 14C, 레인 2에서 광 현미경 사진을 참조한다). 백일해 독소(PTx)의 존재와 부재에서 높은 밀도 및 낮은 밀도 공동-배양액의 세정제-완충액 추출물(G_o의 활성화는 PTx의 존재에서 저해된다)은 제조되고, 그리고 각각 100 ㎍ 전체 단백질을 포함하는 분량은 ³⁵S-GTPγS와 반응되었다. 각 ³⁵S-GTPγS-처리된 추출물의 면역침전은 Gσ_o에 지향된 다중클론 항체 K-20로 수행되고, 이는 활성화된 ³⁵S-GTPγS-표지된 생쥐 Gσ_o를 면역침전시켰다.

β-APP-단독 세포가 높은 밀도에서 PS-1-단독 세포(도 14C, 레인 1)와 공동-배양되는 경우에, 낮은 밀도 샘플(도 14C, 레인 2)에 대한 33% 증가(도 14A, 레인 2)와 비교하여, 대조 추출물(형질감염되지 않은 ES(PS^-/-) 및 섬유아세포(β-APP^-/-) 세포 추출물의 동등 부분을 혼합함으로써 제조됨)로부터 획득된 기저 값에 비하여 ³⁵S-GTPγS 통합에서 200% 이상의 증가(도 14A, 레인 1)가 관찰되었다. PTx의 존재에서, 높은 밀도 배양액(도 14C, 레인 4)은 기저 값보다 38% 낮은 ³⁵SGTPγS 통합에서 저해를 보였다(도 14A, 레인 3). 이들 결과는 β-APP-단독 세포 및 PS-단독 세포 사이에 특이적인 세포:세포 상호작용이 PS-1 세포질 도메인을 통해 직접적으로, 또는 PS-결합된 단백질을 통해 간접적으로, PTx-민감성 G-단백질을 활성화시킨다는 것을 지시한다.

β-APP-단독 세포 및 PS-단독 세포는 높은 밀도 및 낮은 밀도에서 공동-배양되고, 그리고 PTx와 함께 또는 PTx 없이 ³⁵S-met의 존재에서 물질대사적으로 표지되었다. 24시간 공동-배양액후, 이들 세포는 수확되고 세정제 추출물이 제조되었다. 각각 100㎍ 단백질을 포함하는 샘플은 인간 Aβ에 대한 생쥐 MAb(6E10)로 면역침전되고, 이후 용해된 면역침전물은 Bicene-Tris 겔에서 전기영동되었다. 이후, Aβ 밴드가 ³⁵S-방사선사진촬영술에 의해 시각화되었다. 도 14에서는 1) 동등량의 전체 단백질 내에 존재하는 Aβ 수준(도 14B, 레인 1-3)이 감소하는 세포 밀도(도 14C, 레인 1-3)가 감소함에 따라서 지속적으로 감소한다는 것을 증명하고, 이는 β-APP로부터 Aβ를 생산하기 위하여 β-APP:PS-1-매개된 세포간 결합에 대한 요구와 일치하고; 2) 도 14A에서 도시된 바와 같이, PTx-민감성 G-단백질 활성화를 위한 동일한 세포간 상호작용에 대한 요구를 증명하고; 그리고 3) 높은 밀도 배양액(도 14B, 레인 1 및 14C, 레인 1)에서 Aβ의 생산이 PTx(도 14B 레인 4 및 14C, 레인 4)의 존재에서 완전하게 저해된다는 것을 증명한다. G-단백질 활성화 및 Aβ 생산 둘 모두의 PTx에 의한 저해의 증명은 G-단백질의 활성화가 Aβ 형성에 앞서 발생한다는 것을 강하게 암시하고, 이는 이런 활성화가 β-APP:PS-1 세포간 결합으로부터 Aβ 생산의 경로 상에 있다는 개념과 일치한다.

공동-배양 배지에 추가된 PS-1의 물-용해성 전체 80개 아미노산 NH₂-말단 도메인(펩티드 1-80)의 융합 구조체는 β-APP:PS-1 매개된 세포-세포 상호작용의 특이적인 경쟁적 저해물질로서 기능하고 Aβ 생산을 저해하였다. G-단백질 활성화 및 Aβ 생산 둘 모두를 위한 β-APP와 PS 사이에 특이적인 세포-세포 상호작용에 대한 요구의 진전된 증가로서, 이러한 세포-세포 상호작용에 기인하는 Gσ_o의 활성화가 공동-배양액에 펩티드 1-80의 추가에 의해 저해될 수 있는 지를 결정하기 위한 실험이 수행되었다.

β-APP-단독 세포 및 PS-1-단독 세포의 공동-배양은 펩티드 1-80(0-3 μM)의 존재 및 부재에서 수행되었다. ³⁵S-GTPγS 분석평가는 G-단백질 활성화의 척도로서 추출물에서 수행되었다. 이들 공동-배양 추출물에서 생산된 Aβ는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 15에서는 Aβ의 생산(도 15A) 및 Gσ_o의 활성화(도 15B) 둘 모두 용량-의존성 방식으로 펩티드 1-80에 의해 저해될 수 있음을 증명하고, 이는 G-단백질 활성화가 결과적인 Aβ의 생산을 시작시키는 동일한 β-APP:PS-1 매개된 세포-세포 상호작용에 기인한다는 견해와 일치한다.

이에 더하여, 물-용해성 β-APP 엑토도메인 자체(β-APP)가 PS-1-단독 세포의 배양액에 추가될 때, 용량-의존성 방식으로 용량-의존성 방식으로 G-단백질을 활성화시킬 수 있었다. β-APP는 인간 β-APP를 과다-발현하는 배큘로바이러스 배양액의 조건 배지로부터 부분적으로 정제되었다. 최종 산물(도 16b, 레인 1)은 β-APP 이외에, 81kDa, 55kDa와 31 kDa에서 3가지 주요 오염 밴드를 나타냈고, 이들은 β-APP 엑토도메인으로 공동-정제되었다. 이러한 부분적으로 정제된 β-APP 제조물은 PS-1-단독 APP^-/- 섬유아세포에 증가하는 양으로 추가되었다. 15분후, 각 웰로부터 세포는 추출 완충액에서 수확되고, 그리고 세정제 추출물(각각 100㎍ 단백질 포함)은 ³⁵S-GTPγS로 처리되었다. Gσ_o의 활성화는 활성화된 ³⁵S-GTPγS-Gσ_o의 Gσ_o-특이적 항체로 면역침전후 평가되었다. ³⁵S-GTPγS의 통합에서 증가(도 16A, 곡선 1)는 증가하는 농도의 부분적으로 정제된 β-APP에 따라서 PS-1-단독 세포에서 관찰되고, 120pM β-APP의 추가 시에 500% 이상의 최대 증가가 관찰되었다. 형질감염되지 않은 APP^-/- 섬유아세포의 배양액은 아마도, 이들 세포 내에서 내인성 PS-1의 존재로 인하여, 크지 않은 G-단백질 활성화를 제공하였다(도 16A, 곡선 3). 게다가, 부분적으로 정제된 β-APP가 형질감염되지 않은 ES(PS^-/-) 세포에 추가될 때, G-단백질 활성화에서 증가가 ³⁵S-GTPγS 분석평가(도 16A, 곡선 5)에 의해 관찰되지 않았는데, 이는 PS를 Gσ_o 활성화에서 β-APP 리간드에 대한 수용체로서 더욱 관련시켰다.

부분적으로 정제된 β-APP 제조물에서 β-APP가 오염물질 중의 하나가 아닌 실제로, G-단백질 활성화를 담당하는 리간드인 지를 확인하기 위하여, β-APP는 β-APP에 대한 MAb 348로 처리에 의해 상기 제조물로부터 제거되었다(도 16C, 레인 2 참조). 비-고갈된 제조물에 이용된 동일한 농도에서 이러한 β-APP-고갈된 용액은 PS-1-단독 세포에 추가되고, 이들 세포는 이후, 앞서 기술된 바와 동일하게 처리되었다. 도 16A(곡선 4)에서는 β-APP의 항체 제거가 β-APP 제조물로 관찰된 ³⁵S-GTPγS 통합의 거의 완전한 상실을 유발한다는 것을 보여준다. 대조적으로, 무관한 IgG로 유사하게 처리된 β-APP 제조물은 PS-1-단독 세포에 추가될 때, 처리되지 않은 샘플(도 16A, 곡선 2)로 획득된 것들과 유사한 결과를 제공하였다. 이러한 결과는 G-단백질 활성화(도 16A, 곡선 4)의 상실이 면역고갈(immunodepletion) 절차 동안 비-특이적인 단백질 상실에 기인하지 않고, β-APP의 샘플로부터 특이적인 면역-제거(immuno-removal)에 기인한다는 제안과 일치한다. 이들 결과는 본래 막-결합된 β-APP 이외에, 막-분리된 물-용해성 β-APP 자체가 PS-1 발현 세포에서 G-단백질 활성화를 유도할 수 있지만, PS의 부재에서 그렇지 않다는 증거를 제공한다.

이전 보고서는 G-단백질 G_o 역시 β-APP에 결합한다는 것을 증명하였다. β-APP를 이용한 앞서 기술된 실험에서, β-APP 세포질 또는 막내 도메인은 존재하지 않았다; 이들 실험은 β-APP의 가용성 엑토도메인만 추가된, PS로 형질감염된 β-APP^-/- 세포를 이용하였다. 따라서 본 명세서에서 기술된 모든 작업에서 관찰된 G_o 활성화는 구체적으로, PS 세포질 도메인에서만 G_o 활성화, 또는 PS-결합된 단백질의 G_o 활성화에 기인한다.

지금까지 기술된 결과가 인간 PS로 형질감염된 배양 세포만을 이용하여 획득되었기 때문에, 쥐 해마 막(hippocampal membrane) 내에 존재하는 쥐 Gσ_o와 내인성 쥐 PS 단백질의 결합이 조사되었다. 이들 막은 용해되고, 그리고 ³⁵S-GTPγS 분석평가는 증가하는 농도(0-120pM)의 부분적으로 정제된 β-APP의 추가 전후에, 용해된 막에서 수행되었다. 도 17A에서는 최소 농도의 β-APP(80pM)에서, ³⁵S-GTPγS의 통합이 처리되지 않은 샘플에서보다 100% 이상이었고, 그리고 400pM β-APP에서, G-단백질 G_o 활성화가 600% 이상 증가한다는 것을 보여준다. 이들 증가(도 17B)는 용해된 쥐 막이 PS-1과 PS-2 둘 모두에 지향된 다중클론 Ab의 혼합물로 먼저 처리되어 이들 두 생쥐 단백질의 샘플이 고갈되면 발생하지 않았는데, 이는 β-APP에 의한 G-단백질 활성화에서 PS-1, 또는 이의 연관된 단백질의 참여와 일치한다. 인간 G-단백질 G_o가 인간 Gσ_oA 또는 Gσ_oB 단백질에 대한 cDNA와 함께, 인간 PS-1에 대한 cDNA로 다양하게 형질감염된 ES-유래된(PS^-/-) 생쥐 세포 내에서 본래 인간 PS-1에 결합하는 지를 결정하기 위한 실험이 수행되었다. 세정제 추출물은 이들 세포로부터 제조되고 조사되었다. 다양하게 형질감염된 ES 세포로부터 100㎍의 단백질을 각각 포함하는 추출물은 PS-1의 큰 친수성 루프(이는 PS의 7-TM에서 형질 막의 외부로부터 돌출된다)에 특이적인 MAb로 먼저 면역침전되었다. 면역침전물은 용해되고, 그리고 SDS-PAGE, 그 이후에 양쪽 동종형(isoform), Gσ_oA와 Gσ_oB를 인식하는, Gσ_o에 대한 Ab K-20을 이용한 웨스턴 블롯 혼성화가 수행되었다. PS-1/Gσ_oA 공동-형질감염된 세포만 ~40kDa에서 Gσ_o에 대한 강한 신호를 제공하였는데(도 18A, 레인 2와 4에 비하여 레인 3), 이는 Gσ_oA는 PS-1에 특이적으로 결합하지만 (이러한 결합은 이용된 세정제 용액 내에서 유지된다) Gσ_oB는 그렇지 못하다는 것을 암시하였다. 인간 PS-1와 Gσ_o의 시험관내 선택적 결합을 반응하는 이들 결과는 인간 PS-1에 인간 Gσ_o의 in silico 결합의 공개된 연구 결과와 일치하긴 하지만, 이들은 이전에 밝혀지지 않았던 결과인 이들 2가지 Gσ_o 동종형을 더욱 구별한다.

도 5A에서 관찰된 G_oA 결합이 PS-1에 직접적이지만 공동-면역침전된 PS-결합된 단백질에는 그렇지 않다는 증거를 제공하기 위하여, 세포질 루프 1, 2, 3 및 PS-1의 카르복실 꼬리(7-TM PS 모형에서)에 상응하는 합성 펩티드 단편에 의한 G_o의 자율적 활성화가 조사되었다(도 18B와 C 및 표 1 참조). 이들 펩티드는 쥐 해마 막 제조물에서 G_o에 ³⁵S-GTPγS 결합을 촉진하는 능력에 대하여 개별적으로 조사되었다).

도 18C에서, 세포질 루프 1과 2 펩티드(도 18B)가 ³⁵S-GTPγS 결합의 단지 배경 촉진만을 유도한다는 증거가 제시된다. 하지만, 세포질 루프 3 펩티드는 COOH-꼬리의 첫 20개 아미노산에 상응하는 펩티드가 그러한 것처럼, G_o에 ³⁵S-GTPγS 결합의 강한 촉진을 산출하였다. 하지만, 잔기 21-39에 상응하는 두 번째 COOH-말단 펩티드는 G_o를 활성화시키는데 실패하였다. COOH-꼬리의 잔기 1-20에 상응하는 펩티드를 이용한 결과는 PS-1의 COOH-말단 도메인에 의한 G-단백질 활성화와 일치한다. 하지만, 상기 연구에서는 대부분의 GPCR에 대한 G-단백질 결합에 중요한 것으로 알려져 있는 영역인 7-TM PS-1의 세포질 루프 3에 의한 G_o 활성화가 빠졌다. 이들 결과는 G_oA가 PS-1에 직접 결합하지만, PS-결합된 단백질에는 그렇지 않다는 것을 확증한다.

β-APP:PS 세포-세포 상호작용 이후에 G-단백질 활성화와 관련하여, 이는 다양한 방식으로 Aβ 생산에 관련될 수 있다. 이것은 형질 막으로부터 β-APP:PS 복합체의 인산화 또는 내재화를 신호하거나, 또는 이것은 Aβ의 생산에 이르는 경로에 직접적으로 관련될 수도 있는 다른 하류 사건, 예를 들면, Ca²⁺ 방출을 활성화시킬 수 있다.

상기 데이터는 β-APP와 PS의 특이적인 세포:세포 상호작용에 기인하는 G-단백질 활성화가 β-APP로부터 차후 Aβ의 생산의 경로 상에 있다는 것을 증명한다.

Gα_o 이외에 임의의 다른 G-단백질이 프리세닐린 (PS)-1 세포질 도메인에 결합할 수 있는 지를 결정하기 위하여, Gα COOH 미니유전자 벡터가 이용되었다. 다양한 G-단백질 Gα 아단위로부터 카르복실 말단 도메인은 수용체 결합을 위한 중요한 부위이고, 그리고 COOH-말단에 상응하는 펩티드는 수용체-G-단백질 상호작용의 경쟁적 저해물질로서 이용될 수 있다. Gα의 11-14개 C-말단 아미노산을 인코딩하는 미니유전자 벡터는 신호전달 경로의 수용체 매개된 활성화를 저해/차단하는 능력을 갖는다. pcDNA3 내에 클로닝된 미니유전자는 Caden Biosciences로부터 획득되었다. 표 2에서는 이용된 각 미니유전자에 대한 특정한 서열을 제시한다.

소량의 내인성 β-APP를 발현하지만 PS를 발현하지 못하는 ES-유래된 생쥐 세포(PS-1^-/-; PS-2^-/-)는 생쥐 β-APP에 비하여 과량의 인간 β-APP를 발현하지만 PS-1 또는 PS-2를 발현하지 못하는 세포(β-APP-단독 세포)를 생산하기 위하여 인간 β-APP에 대한 cDNA로 일시적으로 형질감염되었다. 소량의 내인성 PS-1과 PS-2만을 발현하는, β-APP-눌 생쥐로부터 유래된 태아(E18) 생쥐 일차 섬유아세포는 생쥐 PS-1에 비하여 과량의 인간 PS-1을 발현하지만 β-APP를 발현하지 못하는 세포(PS-1-단독 세포)를 생산하기 위하여 인간 PS-1에 대한 cDNA로 형질감염되었다. 이들 미니유전자는 이들 세포에서 조사 중인 내인성 생쥐 Gα를 저해하기 위하여 PS-단독 APP-/- 섬유아세포에서 PS-1로 공동-형질감염되었다. PS-/- ES 세포는 인간 β-APP cDNA로 독립적으로 형질감염되고(β-APP 단독 세포), 그리고 이들 2가지 유형의 세포는 24시간 동안 공동-배양되었다. 세포는 수확되고 공동-배양액의 세정제-완충액 추출물이 제조되었다. 이들 배양액에서 [³⁵S]GTPγS 통합의 결정은 각 미니유전자의 존재와 부재에서 수행되었다: 각각 100㎍ 전체 단백질을 포함하는 분량은 ³⁵S-GTPγS와 반응되고, 그리고 각 ³⁵S-GTPγS-처리된 추출물의 면역침전은 조사 중인 특정 Gα에 지향된 항체로 수행되었다. PS-1에 특정 Gα의 결합의 특이성은 특정한 미니유전자 저해물질의 존재에서 GTPγS 통합의 차단에 의해 확립되었다.

도 21에서는 특정한 미니유전자 저해물질의 존재와 부재에서 Gα_oA, Gα_oB, Gα_q, Gα_s, Gα_i1/2 및 Gα_z의 β-APP:PS-1 세포-세포 상호작용 이후에 G-단백질 활성화의 존재 또는 부재를 도시한다. β-APP:PS-1 세포-세포 상호작용은 Gα_oA, Gα_q 및 Gα_s를 특이적으로 활성화시키고, 그리고 이러한 활성화는 각 G-단백질의 특정한 미니유전자 저해물질에 의해 저해되었다. Gα_oB 미니유전자의 존재는 Gα_o 항체에 의해 면역침전된 활성화된 Gα_o 단백질을 저해하지 못하였는데(상기 항체는 G_OA와 G_OB 동종형 둘 모두와 교차-반응한다), 이는 활성화된 종류가 샘플 내에서 G_oA 단백질이고, 상기 단백질이 G_oB 미니유전자에 의해 저해되지 않는다는 것을 암시하였다. 어떤 G-단백질 활성화도 β-APP:PS-1 세포-세포 상호작용의 결과로써 Gi1/2 또는 Gz에 대하여 관찰되지 않았는데, 이는 이들 G-단백질이 PS-1에 결합하지 않는다는 것을 암시한다.

이들 데이터는 β-APP 및 PS-1 사이에 세포-세포 상호작용이 G-단백질 G_q와 G_s 역시 활성화시킨다는 것을 증명한다. 앞서 기술된 공동-배양액 추출물에서 생산된 Aβ는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 22에서 결과는 PS-1:βAPP 세포간 상호작용의 경우에, Gα_oA와 Gα_q의 활성화가 Aβ의 생산과 일치하는 반면, Gα_s의 활성화는 그렇지 않다는 것을 증명한다. 이들 단백질의 G-단백질 활성화가 각 G-단백질에 대한 특정한 미니유전자 저해물질의 존재에 의해 저해될 때, Aβ 생산 역시 Gα_oA와 Gα_q의 경우에 저해되지만 Gα_s의 경우에는 그렇지 않다. 이들 결과는 β-APP로부터 Aβ의 생산이 G-단백질 G_o와 G_q의 하류 신호전달 경로를 필요로 한다는 것을 증명하고, 이들 둘 모두 PLC(상이한 기전)에 의해 신호한다.

7-TM PS 모형에서 세포질 루프 1, 2, 3 및 인간 PS-1의 COOH 꼬리에 상응하는 올리고펩티드에 의한 G-단백질 Gα_o, Gα_q 및 Gα_s의 자율적 활성화가 조사되었다. 이들 펩티드는 쥐 해마 막 제조물에서 각 G-단백질에 ³⁵S-GTPγS 결합을 촉진하는 능력에 대하여 개별적으로 조사되었다.

도 23A에서는 PS-1의 세포질 루프 펩티드에 의한 Gα_o의 자율적 활성화를 도시한다. 세포질 루프 1과 2 펩티드가 ³⁵S-GTPγS 결합의 배경 촉진만을 유도한다는 증거가 제시된다. 하지만, 세포질 루프 3 펩티드는 COOH-꼬리의 첫 20개 아미노산에 상응하는 펩티드가 그러한 것처럼, G_o에 ³⁵S-GTPγS 결합의 강한 촉진을 산출하였다. 하지만, 잔기 21-39에 상응하는 두 번째 COOH-말단 펩티드는 검출가능한 G_o 활성화를 제공하지 못하였다.

도 23B에서는 Gα_q의 자율적 활성화를 도시한다. 세포질 루프 1과 2 펩티드는 ³⁵S-GTPγS 결합의 배경 촉진만을 유도하였다. 세포질 루프 3 펩티드는 Gα_o의 경우에서처럼, COOH-꼬리의 마지막 19개 아미노산에 상응하는 펩티드가 그러한 것처럼 G_q에 ³⁵S-GTPγS 결합의 강한 촉진을 산출하였다. 이전에 G_o를 활성화시키는 것으로 밝혀진, 잔기 1-20에 상응하는 COOH-말단 펩티드는 G_q의 검출가능한 활성화를 제공하지 못하였다.

도 23C에서는 Gα_s의 자율적 활성화를 도시한다. 잔기 17-32를 포함하는 세포질 루프 1 펩티드(루프 1의 첫 16개 아미노산은 포함되지 않음), 그리고 COOH-꼬리의 마지막 19개 아미노산에 상응하는 펩티드는 ³⁵S-GTPγS 결합의 촉진을 유도하였다. 세포질 루프 2와 3 펩티드, 그리고 Gα_o에 대한 COOH-말단 펩티드 1-20은 ³⁵S-GTPγS 결합의 배경 촉진만을 유도하였다.

이들 결과는 상이한 G-단백질이 PS-1 상에서 상이한 세포질 도메인 또는 도메인의 조합에 결합한다는 것을 지시한다.

일차 항체: Gα_o, K-20, sc-387, Gαq, Gαs, Gαi1/2, 그리고 Gαz에 대한 다중클론 Ab는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입되었다. Gα_o Ab는 G_oA와 G_oB 둘 모두를 인식한다. Aβ의 잔기 1-17에 대한 MAb 6E10(Senetek)은 전장 β-APP, 그리고 Aβ 둘 모두를 인식한다.

세포 배양: 생쥐 ES(PS-1^-/-/PS-2^-/-)는 앞서 기술된 바와 같이 배양되었다.

전체 세포 추출물의 제조: 추출물은 Lowry 검사법을 이용하여 용해화 완충액 1(50 mM HEPES/NaOH pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton-X100, 60mM 옥틸글리코시드, 1X 프로테아제 저해물질 혼합물) 및 단백질에서 초음파처리에 의해 제조되었다.

³⁵S-GTPγS 분석평가: 추출물(100㎍의 전체 단백질)은 동등 부피의 GTPγS 완충액 B(50mM HEPES/NaOH pH 7.4, 40μM GDP, 50mM MgCl_2, 100mM NaCl)와 혼합되고 RT에서 60분 동안 50 nM ³⁵S-GTPγS(1250 Ci/mmol, Perkin Elmer, Waltham, MA)와 반응되었다. 반응은 10X 중단 완충액(100 mM Tris-HCl, pH 8, 25mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 20 mM GTP)으로 중단되고, 그 이후에 특정 Gα에 대한 Ab로 ³⁵S-GTPγS-Gα_o 복합체의 면역침전이 수행되었다. Ab-단백질 복합체는 RT에서 90분 동안 단백질 A/G 아가로즈에 흡수되고 세척되었다. 아가로즈 비드는 섬광 액(CytoScint, ICN) (5 ㎖)에서 현탁되고 Beckman Coulter LS 6000 SC 섬광 계수기에서 3분 동안 계산되었다.

β-APP-단독 세포와 PS-1-단독 세포의 공동-배양은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다.

Aβ1-40의 생산을 위한 ELISA는 샌드위치 ELISA 키트(Biosource)를 이용하여 수행되었다.

쥐 해마 막(Applied Cell Science, Rockville, MD)은 CHAP 완충액에서 용해되었다.

펩티드(200μM)는 ³⁵S 반응 혼합물에서 용해된 쥐 해마 막(50㎍)으로 전-처리 없이 배양되었다. γ-S GTP의 축적: ³⁵S-GTPγS는 특이적인 항-G Ab로 면역침전후 측정되었다.

다수의 구체예와 특징이 앞서 기술되긴 했지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 교시 또는 범위를 벗어나지 않는, 이들 기술된 구체예와 특징의 다양한 개변이 가능함을 인지할 것이다. 본 명세서에 첨부된 부록은 추가 예시를 목적으로 제공되고 본 발명을 한정하지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Dewji, Nazneen Singer, S. Jonathan <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING NEURODEGEERATIVE DISORDES AND ALZHEIMER'S DISEASE AND IMPROVING NORMAL MEMORY <130> 00015-027WO2 <140> Not yet known <141> 2010-05-12 <150> US 12/464,850 <151> 2009-05-12 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1404) <400> 1 atg aca gag tta cct gca ccg ttg tcc tac ttc cag aat gca cag atg 48 Met Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met 1 5 10 15 tct gag gac aac cac ctg agc aat act gta cgt agc cag aat gac aat 96 Ser Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn Asp Asn 20 25 30 aga gaa cgg cag gag cac aac gac aga cgg agc ctt ggc cac cct gag 144 Arg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu 35 40 45 cca tta tct aat gga cga ccc cag ggt aac tcc cgg cag gtg gtg gag 192 Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu 50 55 60 caa gat gag gaa gaa gat gag gag ctg aca ttg aaa tat ggc gcc aag 240 Gln Asp Glu Glu Glu 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Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu 290 295 300 Ala Gln Arg Arg Val Ser Lys Asn Ser Lys Tyr Asn Ala Glu Ser Thr 305 310 315 320 Glu Arg Glu Ser Gln Asp Thr Val Ala Glu Asn Asp Asp Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Trp Glu Ala Gln Arg Asp Ser His Leu Gly Pro His Arg 340 345 350 Ser Thr Pro Glu Ser Arg Ala Ala Val Gln Glu Leu Ser Ser Ser Ile 355 360 365 Leu Ala Gly Glu Asp Pro Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly 370 375 380 Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ser Ala Thr Ala 385 390 395 400 Ser Gly Asp Trp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile 405 410 415 Gly Leu Cys Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile Phe Lys Lys Ala Leu 420 425 430 Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val Phe Tyr Phe Ala 435 440 445 Thr Asp Tyr Leu Val Gln Pro Phe Met Asp Gln Leu Ala Phe His Gln 450 455 460 Phe Tyr Ile 465 <210> 3 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1347) <400> 3 atg ctc aca ttc atg gcc tct gac agc gag gaa gaa gtg tgt gat gag 48 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu 1 5 10 15 Arg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln 20 25 30 Glu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg 35 40 45 Ser Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val 50 55 60 Cys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Gly Ala Lys His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr 85 90 95 Leu Cys Met Ile Val Val Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Arg Phe Tyr 100 105 110 Thr Glu Lys Asn Gly Gln Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr Glu Asp Thr 115 120 125 Pro Ser Val Gly Gln Arg Leu Leu Asn Ser Val Leu Asn Thr Leu Ile 130 135 140 Met Ile Ser Val Ile Val Val Met Thr Ile Phe Leu Val Val Leu Tyr 145 150 155 160 Lys Tyr Arg Cys Tyr Lys Phe Ile His Gly Trp Leu Ile Met Ser Ser 165 170 175 Leu Met Leu Leu Phe Leu Phe Thr Tyr Ile Tyr Leu Gly Glu Val Leu 180 185 190 Lys Thr Tyr Asn Val Ala Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Thr Val 195 200 205 Trp Asn Phe Gly Ala Val Gly Met Val Cys Ile His Trp Lys Gly Pro 210 215 220 Leu Val Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Ile Met Ile Ser Ala Leu Met Ala 225 230 235 240 Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu Trp Ser Ala Trp Val Ile Leu 245 250 255 Gly Ala Ile Ser Val Tyr Asp Leu Val Ala Val Leu Cys Pro Lys Gly 260 265 270 Pro Leu Arg Met Leu Val Glu Thr Ala Gln Glu Arg Asn Glu Pro Ile 275 280 285 Phe Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Ser Ala Met Val Trp Thr Val Gly Met 290 295 300 Ala Lys Leu Asp Pro Ser Ser Gln Gly Ala Leu Gln Leu Pro Tyr Asp 305 310 315 320 Pro Glu Met Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Ser Phe Gly Glu Pro Ser Tyr 325 330 335 Pro Glu Val Phe Glu Pro Pro Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Glu Glu Leu 340 345 350 Glu Glu Glu Glu Glu Arg Gly Val Lys Leu Gly Leu Gly Asp Phe Ile 355 360 365 Phe Tyr Ser Val Leu Val Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gly Ser Gly Asp 370 375 380 Trp Asn Thr Thr Leu Ala Cys Phe Val Ala Ile Leu Ile Gly Leu Cys 385 390 395 400 Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Phe Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu 405 410 415 Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Ile Phe Tyr Phe Ser Thr Asp Asn 420 425 430 Leu Val Arg Pro Phe Met Asp Thr Leu Ala Ser His Gln Leu Tyr Ile 435 440 445 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 5 Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 6 Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro 1 5 10 15 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 7 Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu Pro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln 1 5 10 15 Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu 20 25 30 Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys 35 40 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 8 Lys Lys Ala Leu Pro Ala Leu Pro Ile Ser Ile Thr Phe Gly Leu Val 1 5 10 15 Phe Tyr Phe Ala 20 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 9 Met Ala Leu Val Phe Ile Lys Tyr Leu Pro Glu 1 5 10 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus Sequence for SH3 binding <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa is any amino acid <400> 10 Pro Xaa Xaa Pro 1 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for SH3 binding <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Arg or a hydrophobic residue <400> 11 Arg Xaa Leu Pro Xaa Xaa Pro 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Src peptide substrate <400> 12 Lys Val Glu Lys Ile Gly Thr Tyr Gly Val Val Lys Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide for Src assay <400> 13 Lys Val Glu Lys Ile Gly Val Gly Ser Tyr Gly Val Val Lys Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide for Src assay <400> 14 Lys Val Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Phe Gly Val Val Lys Lys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 15 Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu Gln 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 16 Arg Gln Val Val Glu Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Fragment of Presenilin <400> 17 Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys 1 5 10 15

Claims (27)

1. 프리세닐린-1 또는 -2 폴리펩티드의 N-말단 단편 또는 C-말단 단편의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 단리된 폴리펩티드.
2. 청구항 1에 있어서, 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
   (i) DEEEDEEL(서열 번호 5),
   (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
   (iii) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6),
   (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
   (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)의 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
   (vi) RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7),
   (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
   (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, 그리고
   (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합한다.
3. 청구항 1에 있어서, N-말단 단편의 아미노산 서열은 길이에서 대략 5-80 아미노산을 포함하고, 그리고 아미노산 1에서부터 대략 아미노산 80까지 서열 번호 2 또는 4에서 기재된 바와 같은 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
4. 청구항 1의 폴리펩티드로 구성되는 첫 번째 도메인 및 목적되는 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
5. 청구항 4에 있어서, 목적되는 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
6. 청구항 4에 있어서, 목적되는 폴리펩티드는 정제 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
7. 청구항 1 또는 2의 폴리펩티드로 구성되는 최소한 2개의 폴리펩티드를 포함하는 올리고머 폴리펩티드.
8. 청구항 1 또는 2의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 구성되는 단리된 폴리뉴클레오티드.
9. 청구항 8의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
10. 청구항 9의 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 숙주 세포.
11. 청구항 10에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 게놈 내로 함입되는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
12. 청구항 1의 폴리펩티드를 발현하는 방법에 있어서, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 재조합 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 12에 있어서, 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 12의 방법에 의해 생산된 단리된 폴리펩티드.
16. Aβ의 생산을 저해하는 방법에 있어서, βAPP와 프리세닐린-1(PS-1) 및/또는 프리세닐린-2(PS-2)의 세포간 결합, 또는 G-단백질의 활성화를 간섭하는 간섭제(interfering agent)를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 간섭제는 PS-1 또는 PS-2의 N-말단 영역, 또는 이의 올리고머와 상호작용하는 βAPP의 세포외 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 간섭제는 펩티드, 소형 분자, 펩티드유사체 또는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 펩티드는 PS-1 또는 -2의 가용성 N-말단 또는 세포외 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 청구항 17 또는 19에 있어서, 도메인 아미노산 서열은 아래와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) DEEEDEEL(서열 번호 5),
    (ii) N- 또는 C-말단 단부에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 서열 번호 5, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
    (iii) RRSLGHPEPLSNGRP(서열 번호 6),
    (iv) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 6, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
    (v) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (iii) 또는 (iv)의 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
    (vi) RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(서열 번호 7),
    (vii) 1-5개 보존성 아미노산 치환을 더욱 포함하는 서열 번호 7, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고,
    (viii) N- 또는 C-말단에서 1-50개 추가 아미노산을 더욱 포함하는 (vi) 또는 (vii)로 구성되는 서열, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합하고, 그리고
    (ix) 비자연 아미노산 또는 D-아미노산을 포함하는 전술한 것들 중의 한 가지, 여기서 상기 펩티드는 세포-세포 상호작용을 저해하거나, Aβ 생산을 저해하거나, 또는 β-APP에 결합한다.
21. PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포를 PS-1 및/또는 PS-2와 G-단백질의 상호작용을 저해하는 작용제와 접촉시킴으로써 Aβ의 생산을 저해하는 방법.
22. 청구항 21에 있어서, 작용제는 G_oA 및/또는 G_oB와 함께, PS-1 및/또는 2의 C-말단 꼬리 및/또는 기타 세포질 도메인과 상호작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포에서 Src 계통의 티로신 키나아제의 구성원의 활성을 저해함으로써 Aβ의 생산을 저해하는 방법에 있어서, 이들 세포를 청구항 1의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 기억을 향상시키는 방법에 있어서, G-단백질 활성을 저해하는 청구항 1의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 청구항 24에 있어서, G-단백질은 G_o, G_s, G_i, G_z 및 G_q로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 청구항 24에 있어서, 펩티드는 PS-1 및/또는 2의 C-말단 꼬리 및/또는 기타 세포질 도메인과 G_o, G_s, G_i, G_z 및/또는 G_q의 상호작용을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 청구항 24에 있어서, 펩티드는 PS-1 및/또는 PS-2를 발현하는 세포에서 Src 계통의 티로신 키나아제의 구성원의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
    

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