CN105418750A - 用于治疗神经变性病症和阿尔茨海默病并改善正常记忆的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗神经变性病症和阿尔茨海默病并改善正常记忆的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开一般涉及神经变性疾病，更具体地涉及一组早老素/G蛋白/c-src结合多肽以及用于调节阿尔茨海默病的信号传导和进展的方法。

Description

用于治疗神经变性病症和阿尔茨海默病并改善正常记忆的方法和组合物
本申请是申请日为2010年5月12日、申请人为加利福尼亚大学董事会、发明名称为“用于治疗神经变性病症和阿尔茨海默病并改善正常记忆的方法和组合物”的中国专利申请201080031265.8的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请是于2009年5月12日提交的美国专利申请号12/464,850的部分继续申请并且要求该申请的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
根据国立卫生研究院授予的基金号AG07888、NS027580和NS044768，美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本申请一般涉及治疗神经变性病症并且更加具体而言涉及一组早老素/G蛋白/c-src结合多肽以及经设计用于调节对于β-淀粉样蛋白(Aβ)产生所需的多肽的生理相互作用的小分子药物。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是以在成人中年到晚年生命过程中进行性记忆损害以及认知和智力下降为特征的人中枢神经系统的变性病症。该疾病伴有多种神经病理学特征，这当中主要是脑中出现淀粉样蛋白斑和神经元的神经原纤维变性。该疾病的病因学复杂，尽管大约10％的AD病例仿佛是家族性的，作为常染色体显性特征遗传。在这些遗传形式的AD中，有至少4个不同的基因，这些突变体中的一些赋予对该疾病遗传易感性。载脂蛋白E(ApoE)基因的σ4(Cys112Arg)等位基因多态性已经在显著比例的生命晚期发作病例中与AD相关联。极其小比例的65岁前发作的家族性病例已经与21号染色体上β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)基因中的突变关联。与更大比例早期发作AD病例关联的第三个基因座最近已经被作图定位于染色体14q24.3上。大多数(70-80％)的遗传性早期发作AD作图定位于14号染色体并且似乎源于蛋白质早老素-1(PS1)中20个以上的不同氨基酸置换中的一个。虽然少见，但是1号染色体上相似的AD-风险基因座编码蛋白质早老素-2(PS-2，与PS-1高度同源)。基于mRNA测定，早老素似乎是普遍表达的蛋白质，表明它们是许多细胞类型必需的正常的看家蛋白质。
早老素1是43-45kDa多肽并且早老素2是53-55kDa多肽。早老素是以去污剂敏感性高分子量复合体存在的膜整合蛋白。除了早老素外，该复合体的三个蛋白成分是已知的。
发明内容
本公开提供用于鉴定调节早老素活性的试剂的方法和组合物。因此，本文提供的方法和组合物可以用于通过(1)：干扰β-APP的细胞外N-末端结构域与PS-1或PS-2的结合；或者(2)使用小的肽模拟物分子或者针对β-APP或PS分子相互作用表面上表位的抗体分子的小片段作为抑制性试剂，来调节脑中的Aβ产生。在一个方面中，所述肽是PS-1或者PS-2的可溶性N-末端结构域。
在一个实施方案中，提供了鉴定调节早老素G蛋白偶联受体(GPCR)活性的试剂的方法。该方法包括a)将早老素或其片段与G蛋白在允许G蛋白结合至早老素的条件下接触；b)在a)之前、与a)同时或者在a)之后，将早老素或其片段与试剂接触；c)监测早老素介导的与G蛋白的结合；和d)确定所述试剂是否调节早老素与G蛋白结合，由此鉴定调节早老素G蛋白偶联受体(GPCR)活性的试剂。在一些方面中，调节是通过抑制早老素与G蛋白的结合。在另外的方面中，调节是通过激活早老素与G蛋白的结合。早老素可以是早老素-1(PS-1)或早老素-2(PS-2)。G蛋白可以是Go、Gs、Gi、Gz或Gq。
本公开还提供治疗阿尔茨海默病或者抑制阿尔茨海默病发作的方法，包括将受试者与通过上述方法鉴定的试剂接触。
在一些方面中，试剂包括天然存在的或者合成的多肽或寡肽、肽模拟物、小的有机分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、RNAi或siRNA、asRNA或寡核苷酸。
本文提供的方法可以体外或体内进行。在一些方面中，该方法还包括在早老素与G蛋白接触之前、同时或者之后将早老素与β-APP接触。
在另一个实施方案中，提供了鉴定调节早老素介导的Src蛋白激酶活性的试剂的方法。方法包括a)将早老素或其片段与β-APP在允许β-APP与早老素结合的条件下接触；b)在a)之前、同时或之后，将早老素或其片段与试剂接触；c)监测早老素介导的Src蛋白激酶活性；和d)确定所述试剂是否调节早老素介导的Src蛋白激酶活性。
本文还提供了治疗神经变性病症的组合物和方法，并且更加具体而言涉及一组早老素/G蛋白/c-src结合多肽，和经设计用以调节对于为阿尔茨海默病(AD)中主要神经毒性剂的寡肽β-淀粉样蛋白(Aβ)的产生所需的多肽生理相互作用的小分子药物。本公开提供减少脑中Aβ的量至显著降低AD中神经毒性或者延缓发作或者降低疾病严重性程度的方法和组合物。此类方法和组合物可用于调节阿尔茨海默病的信号传导和进展并改善记忆。
本公开还提供用抑制PS-1或PS-2与G蛋白GoA和GoB相互作用的小分子试剂抑制Aβ产生的方法。已经证明，PS-1或PS-2的细胞质C-末端结构域和其它结构域是GoA和/或GoB与PS相互作用的部位，并且该种Go-PS的细胞内结合是随后Aβ产生所必需的，可能通过该结合过程的下游结果。
本公开同样提供了通过将表达PS-1和/或PS-2的细胞与干扰PS-1和/或PS-2与Go结合的下游结果，例如Go被磷脂酶C活化的试剂接触，而抑制Aβ产生的方法。
本公开还提供了通过使用经选择干扰酪氨酸激酶Src家族成员活性的小分子、肽或者抗体抑制Aβ产生的方法。
本公开还提供了通过使用经选择干扰PS-1和/或PS-2与β-APP相互作用的小分子、肽或者抗体抑制Aβ产生的方法。
本公开还提供在包括表达β-APP但不表达PS的第一转染细胞类型与表达PS但不表达β-APP的第二细胞类型混合的细胞培养系统中测定Aβ产生的抑制剂的方法。加入至该混合细胞培养中的试剂的抑制性作用可根据(a)GoA和GoB与PS-1和PS-2相互作用；或者(b)酪氨酸激酶Src家族；或者(c)βAPP的N-末端结构域与PS-1和/或PS-2的N-末端结构域相互作用的数个可能的下游效应的活性测量。
本公开提供基本上由早老素-1或早老素-2多肽N-末端片段氨基酸序列组成的分离的多肽。在一个实施方案中，分离的多肽基本上由选自下列的氨基酸序列组成：(i)DEEEDEEL(SEQIDNO：5)，(ii)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的SEQIDNO：5，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(iii)RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)，(iv)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：6，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(v)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(iii)或(iv)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(vi)RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)，(vii)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：7，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(viii)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(vi)或(vii)组成的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，和(ix)包含非天然氨基酸或者D-氨基酸的前述任一序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP。在一个实施方案中，所述肽包含的N-末端片段的氨基酸序列具有大约5-80个氨基酸的长度并具有SEQIDNO：2或4中所示从氨基酸1至大约氨基酸80的序列。在一个实施方案中，所述肽可以与用于纯化或者形成寡聚物的第二肽连接。本公开还提供包含在可药用载体中的任意两种或多种上述鉴定的分离多肽的组合物。所述肽可以被乙酰化或糖基化。
在另一实施方案中，本公开提供包含至少两种与早老素或β-APP相互作用的肽的寡聚物。所述至少两种肽可以是相同的或者不同的，或者可以直接融合/连接或者通过连接结构域或肽融合/连接。
本公开还提供基本上由编码本文所述肽或寡聚物的核苷酸序列组成的分离的多核苷酸。多核苷酸可以整合入表达载体中。多核苷酸或表达载体可以转染或转化进入宿主细胞内。
本公开提供用于表达上面以及本文中所述多肽的方法，包括培养编码多肽的多核苷酸已经引入其中的重组宿主细胞。
本公开还提供抑制Aβ产生的方法，包括将细胞与干扰β-APP与早老素-1(PS-1)和/或早老素-2(PS-2)的细胞间结合或者G蛋白活化的干扰剂接触。在一个实施方案中，干扰剂包括早老素-1或早老素-2的细胞外结构域。在一个实施方案中，细胞外结构域包括PS-1或PS-2的N-末端区，或其寡聚物。在又一实施方案中，干扰剂包括可溶性的PS-1或PS-2的N-末端结构域。在又一实施方案中，干扰剂包含选自下列的氨基酸序列：(i)DEEEDEEL(SEQIDNO：5)，(ii)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的SEQIDNO：5，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(iii)RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)，(iv)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：6，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(v)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(iii)或(iv)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(vi)RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)，(vii)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：7，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(viii)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(vi)或(vii)组成的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，和(ix)包含非天然氨基酸或者D-氨基酸的前述任一序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP。
本公开还提供抑制Aβ产生的方法，包括将细胞与包含早老素-1或早老素-2的细胞外结构域的肽接触。在一个实施方案中，细胞外结构域包含PS-1或PS-2的N-末端区，或其寡聚物。在又一实施方案中，所述肽包含可溶性的PS-1或PS-2的N-末端结构域。在又一实施方案中，所述肽包含选自下列的氨基酸序列：(i)DEEEDEEL(SEQIDNO：5)，(ii)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的SEQIDNO：5，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(iii)RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)，(iv)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：6，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(v)在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(iii)或(iv)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(vi)RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)，(vii)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：7，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，(viii)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(vi)或(vii)组成的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，和(ix)包含非天然氨基酸或者D-氨基酸的前述任一序列，其中所述肽抑制Aβ产生。在一个实施方案中，该方法包括药物组合物中任意两种或多种上述肽的组合。
本公开还提供了通过将表达PS-1和/或PS-2的细胞与通过修饰PS-1和/或PS-2活性而抑制PS-1和/或PS-2与G蛋白相互作用或者抑制G蛋白活化的试剂接触，而抑制Aβ产生的方法。在一个实施方案中，所述试剂与PS-1和/或PS-2的C-末端尾和/或其它细胞质结构域与GoA、GoB、Gs和/或Gq相互作用的相互作用。在更加特别的实施方案中，所述肽包含PS-2的细胞内环3或者PS-1和PS-2的C-末端区(例如氨基酸1-20和/或21-39，或者与此类序列具有至少95％同一性的肽)。
在一个实施方案中，本公开提供了改善受试者认知功能和/或记忆的方法。该方法包括施用抑制PS-1和/或PS-2与G蛋白(GoA和GoB)相互作用的试剂。在一个方法中，所述试剂与PS-1和/或PS-2的C-末端尾和/或其它细胞质结构域与GoA和/或GoB相互作用的相互作用。所述试剂还干扰PS-1和/或PS-2与Go结合的下游结果，例如Go被磷脂酶C活化。在另一方法中，所述试剂抑制表达PS-1和/或PS-2的细胞中的酪氨酸激酶Src家族成员的活性。在每种情况中，所述试剂将以与对照受试者相比改善认知功能和/或记忆保持的量施用。
附图说明
图1显示确定PS-1是否是GPCR的代表性研究。分析不同细胞培养物的提取物，包括必要的对照，以确定Go是否与PS-1相互作用。在每一泳道中，特定的细胞提取物首先用抗PS-1的单克隆抗体(MAb)免疫沉淀；然后将免疫沉淀物溶解并进行SDS-PAGE电泳，并将所得到的凝胶使用抗Go抗体(该抗体识别GoA和GoB两者)进行Western印迹。泳道1是未转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞提取物对照。如所预期，该提取物显示，使用抗PS-1抗体没有将GoA(或GoB)免疫沉淀下来。泳道2是已经首先用PS-1转染但没有用GoA转染的ES细胞的提取物。没有观察到GoA蛋白质条带；这是另一个对照实验。泳道3是用PS-1和GoA两者转染的ES细胞的提取物。在该提取物中，GoA与PS-1一起被免疫沉淀下来，证明PS-1结合至GoA，而不是GoB。如果将没有C-末端“尾巴”(其从膜中伸入到水性细胞内区室中)的PS-1(泳道4)连同GoA(泳道6)一起转染进ES双缺失细胞(doublenullcell)中，则很少或者没有GoA连同无尾PS-1被免疫沉淀下来，证明PS-1的C-末端结构域是PS-1与GoA结合的主要区域。
图2显示与图1相似实验的Western印迹，只是用PS-2代替PS-1。泳道2和4显示，与无尾PS-1不同，无尾的PS-2仍然结合GoA(和GoB)，并且因此对GoA和GoB的结合位点并不限制在PS-2的C-末端结构域，虽然对于PS-1限制在C-末端结构域(图1)。泳道1是未转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)。泳道2是PS-2+GoA。泳道3是无尾PS-2+GoA。泳道4是PS-2+GoB。泳道5是无尾PS-2+GoB。
图3以独立的方式证明GoA结合至PS-1。GTP类似物[35S]-GTPγS与G蛋白中先前通过与百日咳毒素(PTx)反应封闭的活性位点产生共价键。在柱2中，显示用抗PS-1抗体免疫沉淀的GoA中35S的掺入增加8倍，但没有掺入到GoB中(柱4)。因此，PS-1结合GoA(其已经与[35S]-GTPγS反应以鉴定其为G蛋白(柱2)，而且以比GoA更低的程度结合GoB(柱4)。35S与GoA和GoB的结合被先前用PTx处理而封闭(柱3和5)。
图4是描述35SGTPγS掺入到以PS-2和G蛋白GoA的cDNA所转染ES细胞的提取物中的图。
图5显示固定细胞的免疫荧光显微标记。a)未转染的、固定的但没有透化的DAMI细胞，用抗人PS-1N-末端结构域的大鼠单克隆抗体#1563一抗(图板1)和FITC缀合的抗大鼠IgG二抗的双重免疫荧光显微标记，显示细胞表面免疫标记了内源性PS-1氨基末端结构域。图板2显示当用抗β-APP细胞外结构域的单克隆抗体#348和TRITC-缀合的抗小鼠IgG二抗标记时，同一细胞没有表达可觉察量的细胞表面β-APP。图板3显示图板1和图板2中细胞的Nomarski图像。b)β-APP转染的、固定的但没有透化的DAMI细胞的双重免疫荧光显微标记显示，当用抗β-APP细胞外结构域的单克隆抗体#348和TRITC-缀合的二抗标记时细胞表面表达β-APP(图板2)。图板1和3，如(a)中处理的相同细胞。c)PS-1转染的、固定的但未透化的DAMI细胞的免疫荧光显微标记显示，当用与(a)中所述相同的一抗和二抗标记时，细胞表面高表达PS-1(图板1)但不表达β-APP(图板2)。图板3显示图板1和2中细胞的Nomarski图像。这些实验表明，以PS-1转染DAMI细胞没有引起细胞表面表达β-APP。d)β-APP转染的、固定的但未透化的PS-1和PS-2双缺失ES细胞的免疫荧光显微标记。当用抗β-APP细胞外结构域的单克隆抗体#348和TRITC-缀合的二抗标记时细胞显示细胞表面表达β-APP(图板2)。图板1显示用抗人PS-1N-末端结构域的大鼠单克隆抗体#1563一抗和FITC缀合的合适的二抗标记的结果，表明如所预期ES双缺失细胞表面上没有PS-1。图板3显示图板1和2中细胞的Nomarski图像。e)未转染的、固定的但未透化的PS-1和PS-2双缺失ES细胞的免疫荧光显微标记。当用抗β-APP细胞外结构域单克隆抗体#348和TRITC-缀合的二抗标记时细胞显示细胞表面表达内源性小鼠β-APP(图板2)。图板1和3如在d中一样标记；在这些未转染的ES细胞中没有观察到PS-1的细胞表面标记(图板1)。标尺，20μm。
图6显示，如通过对细胞提取物的ELISA分析所检测，在将仅表达β-APP的转染的ES细胞与仅表达PS-1的转染的DAMI细胞混合后几分钟内，在混合的细胞培养物中发生短暂的蛋白质酪氨酸磷酸化过程。这种活性在混合后约～8-10分钟时达到峰值(a)。在25μg纯化的可溶性β-APP(b)或者25μg与FLAG融合的PS-1N-末端结构域的纯化肽(c)存在下存在下进行的相同实验显示，均没有出现在(a)中观察到的增加。然而，加入25μg与FLAG融合的PS-2非特异性N-末端结构域的纯化肽(d)导致与(a)中非常相似的蛋白质酪氨酸激酶活性短暂增加。
图7A-D显示确定图6中磷酸化酪氨酸的酶活性的性质的实验。使用合成的肽进行Src家族激酶分析。a和b：分别转染的DAMI细胞的作为混合后时间的函数的β-APP：PS-1相互作用。对于β-APP：PS-1(a)和对照pcDNA3：PS-1(b)相互作用均使用Src家族底物肽{lys19}cdc2(6-20)-NH2(黑色柱)和对照肽{lys19Phe15}cdc2(6-20)NH2(白色柱)和{lys19ser14val12}cdc2(6-20)NH2(灰色柱)测定Src激酶活性。c和d：分别转染的DAMI细胞的作为混合后时间的函数的β-APP：PS-2相互作用。对于β-APP：PS-2(c)和对照pcDNA3：PS-2(d)相互作用均使用Src家族底物肽{lys19}cdc2(6-20)-NH2(黑色柱)和对照肽{lys19Phe15}cdc2(6-20)NH2(白色柱)和{lys19ser14val12}cdc2(6-20)NH2(灰色柱)测定Src激酶活性。
图8A-B显示酪氨酸激酶活性的抑制。进行ELISA以证明作为混合后时间的函数的已经分别以β-APP和PS-1转染并在存在和缺乏10μg/ml除莠霉素A(a)和10nMPP2(b)的情况下混合的DAMI细胞的酪氨酸激酶活性。
图9A-B显示β-APP：PS-1细胞间相互作用：混合细胞提取物中的C-Src活性。a.Western免疫印迹。分别转染的DAMI细胞混合物内的β-APP：PS-1相互作用。来自其中β-APP转染的DAMI细胞与PS-1转染的DAMI细胞混合0-12分钟的相同实验的，使用抗PTyr多克隆抗体一抗(图板1)和抗pp60c-src单克隆抗体(图板2)的Western免疫印迹。图板3：使用pp60c-src抗体对对照pp60c-src蛋白质的抗体标记。图板4：如图板1中，来自其中β-APP转染的ES双缺失细胞与PS-1转染的DAMI细胞相互作用的实验的，使用抗PTyr抗体一抗的Western免疫印迹。b.体外磷酸化蛋白质的放射自显影照片。在混合后0-12分钟时的分别转染β-APP和PS-1的DAMI细胞混合物的提取物用抗c-Src抗体首先免疫沉淀，然后用γ32P-ATP进行体外磷酸化。将自身磷酸化反应物进行SDS-PAGE，然后进行放射自显影。
图10A-B显示β-APP：PS-2细胞间相互作用：混合细胞提取物中的C-Src活性。a.Western免疫印迹。作为混合后时间函数的分别转染和混合的DAMI细胞提取物内的β-APP：PS-2相互作用。图板1和2：除了在与β-APP的细胞间相互作用中以PS-2转染的DAMI细胞代替PS-1转染的细胞以及细胞混合1-20分钟之外，与图7a中相同。b.体外磷酸化蛋白质的放射自显影照片。提取物与a部分中相同。除了在与β-APP的细胞间相互作用中以PS-2转染的DAMI细胞代替PS-1转染的DAMI细胞之外，与5b相同。
图11A-D显示β-APP：PS-2细胞间相互作用：混合细胞提取物中的Lyn和Fyn活性。a和b.Western免疫印迹：β-APP：PS-2相互作用。从来自其中β-APP转染的DAMI细胞与PS-2转染的DAMI细胞混合0-20分钟并制作提取物的相同实验中，使用抗Lyn多克隆抗体(a，图板1)和抗Fyn多克隆抗体(b，图板1)一抗进行Western免疫印迹。没有观察到Lyn或Fyn蛋白质浓度随时间而变化。图板2：使用各自的抗体对对照Lyn(a)和Fyn(b)蛋白质进行抗体标记。c和d.体外磷酸化蛋白质的放射自显影照片：β-APP：PS-2相互作用。在混合后1-20分钟时的β-APP和PS-2转染并混合的细胞混合物的提取物使用抗Lyn(c)或Fyn(d)抗体首先进行免疫沉淀，然后使用γ32P-ATP进行体外磷酸化。将自身磷酸化反应产物进行SDS-PAGE，然后放射自显影。
图12图解说明PS的细胞内结构域。
图13显示细胞间β-APP：PS相互作用对Aβ产生的影响。
图14A-C显示G蛋白活化源于用于Aβ产生的特异的β-APP：PS介导的细胞-细胞间相互作用。(A)35S-GTPgS掺入证明高和低密度β-APP：PS-1共培养物中细胞内G蛋白的活化。仅表达β-APP的细胞与仅表达PS-1细胞的高密度共培养物中，在用抗Gao的抗体K-20免疫沉淀后的35S-GTPgS掺入(泳道1)。泳道1显示35S-GTPgS掺入超出基础水平增加超过200％。(见下)。泳道2：当在较低密度培养时，相同的细胞表现出33％的增加。泳道3：在PTx存在下高密度共培养物中35S-GTPgS结合低于基础38％。泳道4：其中β-APP被载体pcDNA3代替的高密度共培养物。泳道5：其中PS-1被pcDNA3代替的高密度共培养物。两者均显示低水平的G蛋白活化，推测可能由于在pcDNA转染的细胞中存在内源的小鼠β-APP或PS-1。数据呈现为由β-APP：PS-1细胞间相互作用促进的活化，表示为百分数，其中0％是通过混合等量的未转染ES缺失细胞和未转染APP-/-成纤维细胞的提取物制备的对照中的35S-GTPgS结合。(B)和(C)不同细胞密度下和存在或缺乏PTx的情况下PS-1：β-APP共培养物中的Aβ产生。仅表达β-APP的细胞与仅表达PS-1的细胞在35S-met存在下以1.5×107(泳道1和4)、0.3×107(泳道2)和0.15×107(泳道3)的终数量的共培养。向泳道4中的高密度培养中加入PTx(500ng/ml)。(B)等量的(100μg蛋白质)每一细胞提取物用MAb6E10免疫沉淀，在bicene-tris凝胶上电泳并且放射自显影。随着细胞密度的降低每一细胞产生的Aβ的量降低(B，泳道1相比于泳道2和3)。在高密度培养中PTx的存在(B，泳道4)完全抑制了不包含PTx的相似培养中的Aβ产生(B，泳道1)。(C)将细胞培养的密度拍照。
图15A-B显示对β-APP：PS介导的细胞-细胞相互作用的特异性抑制作用抑制了G蛋白Gao活化和Aβ产生两者。(A)测量PS-1肽1-80存在下Aβ产生的ELISA。在增加量的肽1-80(0-3μM)存在和缺乏情况下进行仅表达β-APP细胞与仅表达PS-1细胞的共培养。Aβ的产生通过ELISA测定并且被肽1-80以剂量依赖方式抑制。(B)测定PS-1肽1-80存在情况下G蛋白活化的GTPgS测定。如上面(A)中一样，在增加量的肽1-80(0-3μM)存在和缺乏情况下进行仅表达β-APP细胞与仅表达PS-1细胞的共培养。对提取物进行35S-GTPgS测定作为G蛋白活化的量度，类似地，其被肽1-80以剂量依赖性方式抑制。数据呈现为G蛋白活化的抑制，表示为百分数，其中100％是在肽1-80缺乏情况下β-APP：PS-1共培养物中的35S-GTPgS结合。
图16A-C显示G蛋白被β-APP可溶性胞外域(β-APPs)的活化。(A)向仅表达PS-1的APP-/-成纤维细胞培养中以所示的β-APPs浓度加入部分纯化的β-APPs以剂量依赖性方式增加了35S-GTPgS的掺入(曲线1)；向仅表达内源水平PS的未转染APP-/-成纤维细胞培养中加入相似浓度的β-APPs，如所预期，导致35S-GTPgS掺入仅适度增加(曲线3)；当向PS-1转染的APP-/-成纤维细胞加入等量的耗竭β-APPs的制剂(在用β-APP抗体预处理之后)没有导致35S-GTPgS掺入增加(曲线4)。与用无关抗体(山羊抗大鼠IgG)处理相似，加入等量的β-APPs制剂显示数值比未处理的样品稍微更低(曲线2)。当将相似浓度的β-APPs加入到未转染的ES(PS-/-)培养中时显示35S-GTPgS掺入没有显著增加(曲线5)。数据呈现为被β-APPs促进的刺激，表示为百分数，其中0％是在β-APPs缺乏情况下的35S-GTPgS结合。(B)部分纯化的β-APPs的SDSPAGE和Western印迹。泳道1显示在该工作中使用的部分纯化β-APPs(箭头)的考马斯染色的凝胶。泳道2是使用MAb348对相同制剂的Western印迹，显示β-APPs条带。(C)显示在用MAb348处理的样品中β-APPs被去除。泳道1：未处理的样品；泳道2，在图18A中所使用的MAb处理的样品。
图17A-B显示大鼠膜中内源G蛋白的活化。(A)渐增浓度(0-400pM)的β-APPs加入至溶解的大鼠海马膜(100μg)中15分钟，以剂量依赖性方式增加35S-GTPgS掺入。(B)向首先用抗PS-1和PS-2的多克隆抗体混合物预处理的PS-耗竭大鼠膜中相似性地加入β-APPs。向PS-耗竭的膜中加入β-APPs显示35S-GTPgS掺入没有增加。数据呈现为被β-APPs促进的刺激，表示为百分数，其中100％是在β-APPs缺乏情况下的35S-GTPgS结合。
图18A-C显示人G蛋白Go与人PS-1细胞质结构域的直接偶联。(A)将各种各样转染的ES细胞的提取物首先用抗PS-1环的MAb免疫沉淀，并将沉淀物电泳分离并用Go抗体K20(识别GoA和GoB)进行Western印迹。泳道1：未转染的ES裸细胞；泳道2-6，使用下列cDNA转染的ES裸细胞：仅PS-1(泳道2)；PS-1和GoA(泳道3)；PS-1和GoB(泳道4)。(B)显示细胞质环结构域1、2和3以及细胞质C-尾的定位的7-TMPS-1。(C)PS-1细胞质肽片段对35S-GTPgS与大鼠脑Go-蛋白结合的影响。肽(200μM)包含于没有预处理的孵育混合物中，并且测定35S-GTPgS的积累。数据呈现为被肽促进的活化，表示为百分数，其中100％是在肽缺乏情况下的35S-GTPgS结合。泳道1，没有加入肽；泳道2，环1残基1-16，对于肽的列表见表1；泳道3，环1残基17-32；泳道4，环2；泳道5，环3；泳道6，C-尾残基1-20；泳道7，C-尾残基21-39。仅有细胞质环3(泳道5)和包含C-尾前20个氨基酸的肽C(1-20)(泳道6)促进35S-GTPgS结合的活化比不含肽的样品显著增加200％。
图19显示在本公开方法中分离的多肽的肝素亲和层析。
图20显示用于肽和多肽分离的凝胶过滤层析。
图21显示G蛋白小基因抑制剂对35S-GTPγS掺入的影响。
图22显示G蛋白小基因抑制剂对Aβ产生的影响。
图23A-C显示在不同G蛋白的多种细胞内结构域存在下的35S-GTPγS掺入。(a)Gαo，(b)Gq，和(c)Gs。
图24显示在合成肽存在情况下在β-APP：PS-1细胞间相互作用之后对Aβ产生的抑制。在仅表达β-APP和仅表达PS-1的细胞共培养时，加入0-3μM的仅肽4、7和8抑制细胞-细胞相互作用和Aβ产生，如通过ELISA测定法所测量。肽4：(15-mer)RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)；肽5：(15-mer)SNGRPQGNSRQVVEQ(SEQIDNO：15)；肽6：(15-mer)RQVVEQDEEEDEELT(SEQIDNO：16)；肽7：(15-mer)DEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：17)；肽8：(8-mer)DEEEDEEL(SEQIDNO：5)。
图25显示使用图24中的肽处理后Tg小鼠中的体内Aβ产生(1：SEQIDNO：2残基1-80；2：SEQIDNO：2残基1-40；3：SEQIDNO：2残基41-80(SEQIDNO：7)；4：SEQIDNO：2残基41-55(SEQIDNO：6)；8：SEQIDNO：2残基66-73(SEQIDNO：8)；9：SEQIDNO：2残基41-46；和10：SEQIDNO：2残基47-55)。
具体实施方式
如本文所使用，单数形式“a”、“and”和“the”包括复数形式的指示物，除非上下文另外明确说明。因此，例如，当提到“蛋白质”时包括多种此类蛋白质并且当提到“细胞”时包括本领域技术人员已知的一种或更多种细胞，等等。
同样，使用“或者”意味着“和/或”除非另外说明。相似地，“包含”、“包含着”、“包含的”、“包括”、“包括着”和“包括的”可互换并且不旨在是限制性的。
应当进一步理解，当使用术语“包含”描述多种实施方案时，本领域技术人员将理解，在一些特定的情况下，实施方案可以备选地使用措辞“基本上由……组成”或者“由……组成”描述。
除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。本文描述了示例性的方法、装置和材料，尽管在实施本公开方法和组合物中可以使用与本文所述方法和材料相似或者等效的方法和材料。
上面以及本文通篇讨论的公布单独提供，因为它们的公开早于本申请的申请日。在本文中不能够解释为承认因为先前公开发明人没有资格将此发明的时间提前。
本公开提供用于治疗阿尔茨海默病和病症，以及被早老素与β-APP相互作用调节的神经元发育和活性的方法和组合物。本公开证明，早老素-1和/或-2与β-APP相互作用导致Aβ产生。此外，当早老素结合至β-APP上时激活G蛋白。
本公开证明了β-淀粉样蛋白前体蛋白β-APP与PS-1或PS-2是细胞间信号传导系统的成分。一种或者更多种形式的β-APP通过它们的突出至各自细胞膜外的细胞外结构域特异性地结合PS-1或PS-2。这种体内结合引起对正常神经生理学或发育而言有重要意义的细胞间信号传导事件。该跨膜分子结合、囊泡形成过程、细胞内化和蛋白水解降解的副产物起作用导致细胞形成和释放Aβ并且其在脑区域中缓慢积累。
本公开证明，PS-1、PS-2和β-APP在细胞间信号传导中起作用。已经检查了这三种蛋白质在将β-APP进行蛋白水解成Aβ中的各自作用，这直接或间接涉及PS蛋白质。此外，一个细胞表面上的一种或更多种形式的β-APP和另一个细胞表面上的PS-1(或PS-2)可以是在正常生理学作用中细胞间信号传导系统的特异的配体和受体成分。本公开提供证据表明，细胞间β-APP与PS蛋白质的表面结合在正常生理学中起作用诱导一个或者两个粘附细胞内的信号传导过程，这最终导致对于生物体有意义的发育结果。
术语“淀粉样蛋白β肽”意思是从淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)加工的淀粉样蛋白β肽。最通常的肽包括淀粉样蛋白β肽1-40、1-42、11-40和11-42。其它普遍性较差的淀粉样蛋白β肽种类描述为x-42，其中x范围为2-10和12-17，以及1-y，其中y范围为24-39和41。为了描述和技术的目的，“x”具有2至17的数值，并且“y”具有24至41的数值。
早老素具有许多结构域，它们可以通过一个或更多个不同的预测算法或者实验性蛋白水解裂解实验、溶解度测定等等鉴定。早老素-1(PS-1)具有许多在下面描述的结构域。应当认识到，取决于表达多肽的生物体，结构域可以在任一末端有1-5个氨基酸不同。在一个实施方案中，PS-1N-末端结构域包含SEQIDNO：2的残基x1至大约x2，其中x1包括SEQIDNO：2的氨基酸1、2、3、4或5并且x2包括SEQIDNO：2的氨基酸79、80、81、82或83。在一个实施方案中，N-末端结构域片段包括长度为5和81个氨基酸之间的肽(例如长度为5、10、20、30、40、50、60、70或者80个氨基酸)。此类肽片段(例如可溶性片段)用作βAPP结合剂或者用于开发对早老素-1N-末端细胞外结构域特异的抗体。N-末端结构域还包含含有氨基酸82-100的第一个跨膜结构域(TM-1)的全部或者片段。在一个实施方案中，TM-1结构域包含SEQIDNO：2的氨基酸x2至大约氨基酸x3，其中x2包括SEQIDNO：2的氨基酸79、80、81、82或83并且x3包括SEQIDNO：2的氨基酸98、99、100、101或102。还包含早老素-1第一个TM结构域的片段的早老素1N-末端片段可用于产生膜结合竞争性抑制剂，其缺乏有活性的G蛋白结构域。
早老素-1的第一个细胞质环1包含SEQIDNO：2的氨基酸x3至大约x4，其中x3包括SEQIDNO：2的氨基酸98、99、100、101或102并且x4包括氨基酸130、131、132、133或134。早老素-1的第二个跨膜环(TM-2)包含SEQIDNO：2的氨基酸x4至大约x5，其中x4包括SEQIDNO：2的氨基酸130、131、132、133或134并且x5包括SEQIDNO：2的氨基酸152、153、154、155或156。早老素-1多肽还包含第二个细胞外结构域(胞外1)，其包含SEQIDNO：2的氨基酸x5至大约x6，其中x5包括SEQIDNO：2的氨基酸152、153、154、155或156并且x6包括SEQIDNO：2的氨基酸161、162、163、164或165。早老素-1还包含第三个跨膜结构域(TM-3)，其包含SEQIDNO：2的氨基酸x6至大约x7，其中x6包括SEQIDNO：2的氨基酸161、162、163、164或165并且x7包括氨基酸182、183、184、185或186。早老素-1包含第二个细胞质环(环3/细胞质环2)，其包含SEQIDNO：2的氨基酸x7至大约x8，其中x7包括SEQIDNO：2的氨基酸182、183、184、185或186并且x8包括SEQIDNO：2的氨基酸192、193、194、195或196。早老素-1的第四个跨膜结构域(TM-4)通常描述为包含SEQIDNO：2的氨基酸x8至大约x9，其中x8包括SEQIDNO：2的氨基酸192、193、194、195或196并且x9包括SEQIDNO：2的氨基酸211、212、213、214或215。早老素-1包含第三个细胞外结构域(环4/胞外环2)，其包含SEQIDNO：2的从大约x9至大约x10，其中x9包括SEQIDNO：2的氨基酸211、212、213、214或215并且x10包括SEQIDNO：2的氨基酸217、218、219、220或221。早老素-1的第五个跨膜结构域(TM-5)通常描述为包含SEQIDNO：2的氨基酸x10至大约x11，其中x10包括SEQIDNO：2的氨基酸217、218、219、220或221并且x11包括SEQIDNO：2的氨基酸236、237、238、239或240。早老素-1还包含第三个细胞质结构域(环5/细胞质3)，其包含SEQIDNO：2的氨基酸x11至x12，其中x11包括SEQIDNO：2的氨基酸236、237、238、239或240并且x12包括SEQIDNO：2的氨基酸241、242、243、244或245。第六个跨膜结构域(TM-6)通常指包含SEQIDNO：2的x12至大约x13的序列，其中x12包括SEQIDNO：2的氨基酸241、242、243、244或245并且x13包括SEQIDNO：2的氨基酸260、261、262、263或264。早老素-1还包含第三个细胞质结构域(环6/胞外3)，其包含SEQIDNO：2的x13至大约x14的序列，其中x13包括SEQIDNO：2的氨基酸260、261、262、263或264并且x14包括SEQIDNO：2的氨基酸405、406、407、408或409。早老素-1还包含第7个跨膜结构域(TM-7)，其包含SEQIDNO：2的x14至大约x15序列，其中x14包括SEQIDNO：2的氨基酸405、406、407、408或409并且x15包括SEQIDNO：2的氨基酸427、428、429、430或431。C-末端细胞质尾(C-尾/细胞质)包含SEQIDNO：2的x15至大约x16的序列，其中x15包括SEQIDNO：2的氨基酸427、428、429、430或431并且x16包括SEQIDNO：2的氨基酸462、463、464、465、466或467。
PS-1
早老素-2(PS-2)具有许多下面所述的结构域。应当认识到，取决于表达多肽的生物体，在结构域任一末端可以有1至5个氨基酸不同。在一个实施方案中，PS-2N-末端结构域包含SEQIDNO：4的残基x1至大约x2，其中x1包括SEQIDNO：4的氨基酸1、2、3、4或5并且x2包括SEQIDNO：4的氨基酸85、86、87、88或90。在一个实施方案中，N-末端结构域片段包含长度在5和87个氨基酸之间的肽(长度例如5、10、20、30、40、50、60、70或80个氨基酸)。此类肽片段(例如可溶性片段)用作βAPP结合试剂或者用于开发对早老素-2的N-末端细胞外结构域具有特异性的抗体。N-末端结构域还包含含有氨基酸87-106的第一个跨膜结构域(TM-1)的全部或者片段。在一个实施方案中，TM-1结构域包含SEQIDNO：4的氨基酸x2至大约氨基酸x3，其中x2包括SEQIDNO：4的氨基酸85、86、87、88或90并且x3包括SEQIDNO：4的氨基酸104、105、106、107或108。还包含早老素-2第一个TM结构域的片段的早老素1N-末端片段可用于产生膜结合竞争性抑制剂，其缺乏有活性的G蛋白结构域。
早老素-2的第一个细胞质环1包含SEQIDNO：4的氨基酸x3至大约x4，其中x3包括SEQIDNO：4的氨基酸104、105、106、107或108并且x4包括SEQIDNO：4的氨基酸136、137、138、139或140。早老素-2的第二个跨膜环(TM-2)包含SEQIDNO：4的氨基酸x4至大约x5，其中x4包括SEQIDNO：4的氨基酸136、137、138、139或140并且x5包括SEQIDNO：4的氨基酸158、159、160、161或162。早老素-2多肽还包含含有SEQIDNO：4氨基酸x5至大约x6的第二个细胞外结构域(胞外1)，其中x5包括SEQIDNO：4的氨基酸158、159、160、161或162并且x6包括SEQIDNO：4的氨基酸167、168、169、170或171。早老素-2还包含含有SEQIDNO：4氨基酸x6至大约x7的第三个跨膜结构域(TM-3)，其中x6包括SEQIDNO：4的氨基酸167、168、169、170或171并且x7包括SEQIDNO：4的氨基酸187、188、189、190或191。早老素-2包含含有SEQIDNO：4氨基酸x7至大约x8的第二个细胞质环(环3/细胞质环2)，其中x7包括SEQIDNO：4的氨基酸187、188、189、190或191并且x8包括SEQIDNO：4的氨基酸198、199、200、201或202。早老素-2的第四个跨膜结构域(TM-4)通常描述为包含SEQIDNO：4的氨基酸x8至大约x9，其中x8包括SEQIDNO：4的氨基酸198、199、200、201或202并且x9包括SEQIDNO：4的氨基酸217、218、219、220或221。早老素-2包含含有SEQIDNO：4大约x9至大约x10的第三个细胞外结构域(环4/胞外环2)，其中x9包括SEQIDNO：4的氨基酸217、218、219、220或221并且x10包括SEQIDNO：4的氨基酸223、224、225、226或227。早老素-2的第5个跨膜结构域(TM-5)一般描述为包含SEQIDNO：4的氨基酸x10至大约x11，其中x10包括SEQIDNO：4的氨基酸223、224、225、226或227并且x11包括SEQIDNO：4的氨基酸242、243、244、245或246。早老素-2还包含含有SEQIDNO：4氨基酸x11至x12的第3个细胞质结构域(环5/细胞质3)，其中x11包括SEQIDNO：4的氨基酸242、243、244、245或246并且x12包括SEQIDNO：4的氨基酸247、248、249、250或251。第6个跨膜结构域(TM-6)通常指包含SEQIDNO：4的x12至大约x13的序列，其中x12包括SEQIDNO：4的氨基酸247、248、249、250或251并且x13包括SEQIDNO：4的氨基酸266、267、268、269或270。早老素-2还包含含有SEQIDNO：4的x13至大约x14序列的第3个细胞质结构域(环6/胞外3)，其中x13包括SEQIDNO：4的氨基酸266、267、268、269或270并且x14包括SEQIDNO：4的氨基酸385、386、387、388或389。早老素-2还包含含有SEQIDNO：4的x14至大约x15序列的第7个跨膜结构域(TM-7)，其中x14包括SEQIDNO：4的氨基酸385、386、387、388或389并且x15包括SEQIDNO：4的氨基酸407、408、409、410或411。C-末端细胞质尾(C-尾/细胞质)包括SEQIDNO：4的x15至大约x16的序列，其中x15包括SEQIDNO：4的氨基酸407、408、409、410或411并且x16包括SEQIDNO：4的氨基酸443、444、445、446、447或448。
PS-2
技术人员会认识到，这些结构域的边界是近似的并且此类结构域的确切的边界，例如跨膜结构域的边界，会与本文所预测的那些具有1-5个氨基酸的差异。
据信早老素多肽的细胞质尾结构域的大多数C-末端残基(连同其它细胞质结构域一起)参与与G蛋白的相互作用，以致于这些残基的置换有可能与改变的G蛋白活化或对多肽的结合功能，或者该功能丧失有关。
如本文所使用，“β-APP结合多肽或肽”包括人早老素-1(SEQIDNO：2)，变体(例如早老素-2；SEQIDNO：4)和物种同源物如鼠类早老素-1和这些早老素多肽片段以及它们的物种同源物。本公开的早老素多肽具有与其它早老素家族多肽一致的生物学活性和功能。早老素家族多肽在整个发育过程中的细胞类型中，包括神经元细胞中表达。与该家族多肽有关的有代表性的生物学活性或功能是β-APP结合、G蛋白活化和Aβ肽形成。β-APP结合活性存在于早老素多肽的N-末端结构域和细胞外环中。G蛋白活化与早老素多肽的C-末端细胞质尾结构域和其它细胞质结构域有关。
早老素多肽，例如人早老素-1具有异型结合活性；这些结合活性中的每一个与早老素多肽的细胞外环结构域有关。因此，对于需要异型结合的用途，本公开的早老素多肽将包括具有至少一个细胞外环结构域并表现出至少一种此类结合活性的那些早老素多肽。早老素多肽还具有与早老素多肽细胞质结构域(包括细胞质尾结构域)有关的G蛋白结合活性。因此，对于需要G蛋白活化或结合的用途，本公开的早老素多肽将包括具有细胞质尾结构域并表现出G蛋白结合活性的那些早老素多肽。本公开的早老素多肽还包括寡聚物或融合多肽，其包含本公开的一个或更多个早老素多肽的至少一个细胞外环结构域和/或细胞质尾结构域，和具有异型结合和/或G蛋白结构域结合活性的这些多肽中任一种的片段。人早老素-1和物种同源物和其它早老素家族多肽的一种或多种结合活性可以在例如酵母双杂交测定法或者体外测定法中确定，体外测定法测量早老素多肽与包含一个β-APP和/或G蛋白结构域的结合配偶体之间的结合，其中早老素多肽或者其结合配偶体用放射性、荧光或者生物发光蛋白标记，以致于结合可以被检测到。
术语“人早老素多肽活性”，如本文所使用，包括β-APP结合和相互作用以及G蛋白结合或活化。本公开的早老素多肽和这些多肽的片段和其它衍生物表现出这些活性的程度可以通过标准的测定方法测定。本文公开了示例性的测定法；本领域技术人员将认识到，其他的相似类型的测定法可以用于测量本公开的早老素多肽和其它早老素家族成员的生物学活性。
早老素多肽，包括人早老素-1的生物学活性的一个方面是该多肽家族成员结合特定结合配偶体如异型多肽(包括β-APP)和包含G蛋白结构域的多肽的能力，其中细胞外环结构域结合例如β-APP，并且细胞质尾结构域结合包含G蛋白结构域的多肽。术语“结合配偶体”，如本文所使用，包括配体、受体、底物、抗体、其它早老素多肽、和通过结合配偶体的特定部分与人早老素-1或早老素-2多肽之间的接触或接近而与人早老素-1多肽相互作用的任何其它分子。由于本公开的早老素多肽的细胞外N-末端结构域和环结构域结合异型多肽，所以当包含N-末端80个氨基酸片段和/或一个或多个细胞外环结构域的衍生物多肽作为与例如免疫球蛋白Fc结构域融合的、与人早老素-1多肽剩余部分分开的片段或者可溶性多肽表达时，预期破坏本公开的早老素多肽与其结合配偶体(例如β-APP)的结合。通过结合至一个或更多个结合配偶体，一个或多个分开的细胞外结构域多肽阻止一个或多个天然人早老素-1多肽的结合，并且因此以显性失活方式起作用，以抑制通过本公开的早老素多肽与异型多肽(例如β-APP)结合所介导的生物学活性，因此在一个方面中防止Aβ的形成。人早老素-1和其它早老素家族多肽的生物学活性和配偶体结合特性可以通过标准方法和本文所述的那些测定法测定。
本文所述的，已经证明早老素-1和-2是当被活化时引起Aβ肽产生的GPCRs相关跨膜蛋白。因此，早老素-1和-2涉及到阿尔茨海默病的发展及其相关病症，包括记忆改变。封闭或抑制本公开的早老素多肽与它们的作用物、配体、受体、结合配偶体和/或其它相互作用多肽之间的相互作用是本公开的一个方面，并且提供用于通过使用人早老素-1和早老素-2活性抑制剂治疗或改善这些疾病和病症的方法。此类抑制剂或拮抗剂的实例在下面更加详细的描述。
在一个实施方案中，早老素-1或早老素-2多肽或多核苷酸在正常记忆和阿尔茨海默病发展和进展中起作用。在一个实施方案中，本公开的方法和组合物包括早老素-1或早老素-2活性拮抗剂，包括肽、肽模拟物、小分子或阻止早老素与β-App相互作用或者G蛋白活化的其他试剂。
人早老素-1多肽是这样的多肽，即(a)具有SEQIDNO：2中所示序列；(b)与包含SEQIDNO：2所示氨基酸序列的早老素-1多肽具有足够程度的氨基酸同一性或相似性；(c)被本领域技术人员鉴定为可能与SEQIDNO：2的早老素-1多肽共享特定结构域的多肽；(d)具有与早老素多肽相同的生物学活性；和/或(e)结合至还特异性结合具有SEQIDNO：2所示序列的早老素-1多肽的抗体。人早老素-2多肽是这样的多肽，即(a)具有SEQIDNO：4中所示序列；(b)与包含SEQIDNO：4所示氨基酸序列的早老素-2多肽具有足够程度的氨基酸同一性或相似性；(c)被本领域技术人员鉴定为可能与SEQIDNO：4的早老素-2多肽共享特定结构域的多肽；(d)具有与早老素多肽相同的生物学活性；和/或(e)结合至还特异性结合具有SEQIDNO：4所示序列的早老素-2多肽的抗体。本公开的早老素多肽可以从天然存在来源分离，或者重组产生，以致于重组早老素多肽与天然存在的早老素多肽具有相同的结构，或者可以产生与天然存在早老素多肽不同的结构。通过任何类型的改变(例如，但不限于，例如，1-10个或更多个氨基酸的插入、缺失或置换；多肽糖基化状态的改变；重折叠或异构化以改变其三维结构或者自身缔合状态；和改变其与其它多肽或分子的缔合)从任意的人早老素-1或早老素-2多肽衍生的多肽也是本公开的早老素多肽。因此，本公开提供的多肽包括具有下述特性的多肽，即氨基酸序列与本文所述的本公开早老素多肽的氨基酸序列相似，但是其中天然性地或者通过工程设计有意地提供改变。与本公开的早老素多肽具有共同的生物学活性的多肽是具有早老素-1活性的多肽。早老素多肽家族成员表现出的生物学活性实例包括但不限于，β-APP和G蛋白活化。
分离的多肽或肽指这样的分子，即其包含氨基酸序列并且除了所述的氨基酸序列外还可以具有与多肽或肽的任一端或两端共价连接的额外的物质，所述的在1-10、10-20、20-30或40-50个额外氨基酸之间的额外物质共价连接至多肽的任一端、每一端或者两端，并且多肽离开了其天然状态或者使用分子生物学或者肽合成技术重组产生。
本公开提供全长且成熟形式的本公开早老素多肽。全长多肽是具有如最初翻译的多肽的完整一级氨基酸序列的那些。全长多肽的氨基酸序列可以例如通过cDNA分子的完整开放阅读框(“ORF”)的翻译得到。如果通过可变剪接或者通过使用多个翻译起始位点从单一基因位点产生多个mRNA形式，则数个全长多肽可以由该单一基因位点编码。“成熟形式”的多肽指已经经历翻译后加工步骤，例如信号序列的断裂或者经蛋白水解切割去除前结构域的多肽。可以通过例如在多个部位切割信号序列，或者通过差异性调节将多肽断裂的蛋白酶，产生多个成熟形式的特定全长多肽。一种或多种成熟形式的此类多肽可以通过在适宜哺乳动物细胞或其它宿主细胞中表达编码全长多肽的多核苷酸分子得到。成熟形式多肽的序列还可以通过鉴定信号序列或者蛋白酶切割位点从全长形式氨基酸序列中确定。本公开的早老素多肽还包括源于转录后或者翻译后加工事件的那些多肽，例如可以得到截短但具有生物学活性多肽，例如天然存在的可溶形式多肽的可变mRNA加工。本公开还包括因为蛋白水解而产生的变化形式，例如当在不同类型宿主细胞中表达时，因为从多肽蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸(通常1至5个末端氨基酸)导致的N-末端或C-末端差异。
本公开还包括具有或者不具有相关天然模式糖基化的本公开早老素多肽。取决于表达系统的选择，在酵母或者哺乳动物表达系统(例如COS-1或CHO细胞)中表达的多肽可以在分子量和糖基化模式上与天然多肽相类似或者明显不同。本公开多肽在细菌表达系统，例如大肠杆菌中的表达提供了非糖基化分子。此外，特定的制剂可以包括多种差异糖基化类型的多肽。糖基可以通过常规方法，具体而言使用糖肽酶的那些方法去除。通常，本公开的糖基化多肽可以与摩尔过量的糖肽酶(BoehringerMannheim)孵育。
本公开包括本公开早老素多肽(例如早老素-1的人和鼠形式)和编码它们的多核苷酸的物种同源物。如本文所使用，“物种同源物”是与给定多肽或多核苷酸具有不同物种来源，但是如通过本领域技术人员所确定，与给定的多肽或多核苷酸具有明显序列相似性的多肽或多核苷酸。物种同源物通过从编码本文提供的氨基酸序列的多核苷酸制作合适的探针或引物并且从预期的物种筛选合适的核酸来源而分离和鉴定。本公开还包括本公开早老素多肽的等位基因变体和编码它们的多核苷酸；即其中由于遗传多态性(在种群内个体当中的等位基因变异)引起氨基酸或核苷酸序列差异的此类多肽和多核苷酸的天然存在的可变形式。
本公开早老素多肽片段可以是线性形式或者使用例如H.U.Saragovi等，Bio/Technology10，773-778(1992)和R.S.McDowell等，J.Amer.Chem.Soc.1149245-9253(1992)中所述已知方法环化，该两篇文献通过引用并入本文。本公开的多肽和多肽片段，和编码它们的多核苷酸，包括氨基酸或核苷酸序列长度为早老素-1多肽长度的至少25％(例如至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％)并且与早老素-1多肽或编码多核苷酸具有至少60％序列同一性(例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、或至少99％、或至少99.5％)的多肽和多核苷酸，其中序列同一性通过比较被对齐的(以便将重叠和同一性最大化同时使序列空隙最小化)多肽的氨基酸序列来确定。本公开中还包括这样的多肽和多肽片段，编码它们的多核苷酸，即其包含或者编码有代表性地含有至少8、或至少10、或至少15、或至少20、或至少30、或至少40个连续氨基酸的片段。此类多肽和多肽片段还可包含与本公开的任意早老素多肽的任意此类片段具有至少70％序列同一性(或者至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％、至少99％、或至少99.5％)的片段，其中序列同一性通过比较被对齐的(以便将重叠和同一性最大化同时使序列空隙最小化)多肽的氨基酸序列来确定。同一性百分数可以通过目测和数学计算确定。备选地，两个氨基酸或者两个多核苷酸的同一性百分数可以通过使用Devereux等(Nucl.AcidsRes.12：387，1984)描述的并且从威斯康星大学遗传学计算机组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup，UWGCG)可以得到的第6.0版GAP计算机程序，比较序列信息确定。对于GAP程序的有代表性的默认参数包括：(1)Gribskov和Burgess，Nucl.AcidsRes.14：6745，1986的，对于核苷酸的一元比较矩阵(包含对于同一性的数值1和对于非同一性的数值0)，和加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff，编者，AtlasofPolypeptideSequenceandStructure，NationalBiomedicalResearchFoundation，第353-358页，1979所描述；(2)对于每一空隙罚分为3.0并且对于每一空隙内每一符号的另外罚分为0.10；和(3)对于每一末端空隙无罚分。还可以使用本领域技术人员所使用的其它的序列比较程序，例如诸如BLASTN程序版本2.0.9，可以通过国立医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)网站ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi获得而使用，或者UW-BLAST2.0算法。对于UW-BLAST2.0的标准默认参数设置在下列互联网站上描述：blast.wustl.edu/blast/README.html#References。此外，BLAST算法使用BLOSΜM64氨基酸评分矩阵，并且可以使用的最佳参数如下：(A)包括过滤器以屏蔽具有低组成复杂性的查询序列片段(如通过Wootton和Federhen的SEG程序所确定(ComputersandChemistry，1993)；还可见WoottonJC和FederhenS，1996，Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatabases，MethodsEnzymol.266：554-71)，或者由短的周期性内部重复区组成的片段(如通过Claverie和States的XNU程序所确定(ComputersandChemistry，1993))，和(B)用于报告相对数据库序列匹配的统计学意义的阈值，或者E-评分(根据Karlin和Altschul(1990)的随机模型仅偶尔发现匹配的预期可能性；如果归于匹配的统计学显著性大于该E-评分阈值，将不报告为匹配。)；有代表性的E-评分阈值数值是0.5、或者0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、或1e-100。
本公开还提供了本公开早老素多肽的包含这些多肽的某些片段或结构域的可溶形式，和特别是包含基于本公开7-TM模型的细胞外结构域或者细胞外结构域的一个或多个片段的那些。可溶性多肽是能够从表达它们的细胞分泌的多肽。在此类形式中，部分或全部的多肽细胞内结构域和跨膜结构域缺失以致于多肽从表达它们的细胞中完全分泌。可以根据用于从序列信息中确定此类结构域的已知技术，鉴定本公开多肽的细胞内结构域和跨膜结构域。本公开的可溶性早老素多肽还包括包含部分跨膜区并且有典型地保留人早老素-1活性(例如诸如结合或与β-APP相互作用的能力)的那些多肽，只要可溶性早老素-1多肽能够从细胞分泌即可。本公开的可溶性早老素多肽还包括含有至少一个早老素-1或早老素-2多肽的细胞外部分和具有早老素-1或早老素-2活性的片段的寡聚物或者融合多肽。分泌的可溶性多肽可以通过经例如离心将表达所要多肽的完整细胞与培养基分离，和测定培养基(上清液)中存在想要的多肽来鉴定(并与其非可溶性膜结合对应物相区分)。培养基中存在想要的多肽表明多肽从细胞分泌并且因此是可溶形式的多肽。多肽从重组宿主细胞的纯化被促进，因为可溶性的多肽被细胞分泌出来。此外，可溶性的多肽通常比膜结合形式更适合肠胃外施用和用于许多酶促过程。
在本公开的另一方面中，多肽包括早老素-1多肽结构域的多种组合，例如细胞质尾结构域和细胞外环结构域或者细胞质尾结构域和细胞质环结构域。因此，本公开的多肽和编码它们的多核苷酸包括含有或编码两个或更多个拷贝的结构域例如细胞质尾结构域，两个或更多个拷贝的结构域例如细胞外环结构域，或至少一个拷贝的每一结构域的那些，并且这些结构域在此种多肽中可以以任何顺序存在。
在肽或DNA序列中的进一步修饰可以由本领域技术人员使用已知技术进行。多肽序列中感兴趣的修饰可以包括所选择氨基酸的改变、置换、替代、插入或缺失。例如，一个或更多个半胱氨酸残基可以缺失或者被另一氨基酸置换以改变分子的构象，可包括防止折叠或者复性时不正确的分子内二硫键形成的改变。用于此类改变、置换、替代、插入或缺失的技术是本领域技术人员众所周知的(见例如美国专利号4,518,584)。作为另一实例，多肽细胞外结构域中的N-糖基化位点可以被修饰以防止糖基化，使得在哺乳动物和酵母表达系统中表达减少的糖类似物。真核多肽中的N-糖基化位点特征为氨基酸三联体Asn-X-Y，其中X是除了Pro外的任意氨基酸并且Y是Ser或Thr。对编码这些三联体的核苷酸序列的适宜置换、添加或缺失将导致阻止糖残基连接在Asn侧链上。例如，选择将Asn替换成不同氨基酸的单核苷酸改变足以使N-糖基化位点失活。备选地，Ser或Thr可以用另一氨基酸，例如Ala替换。用于将多肽中N-糖基化位点失活的已知方法包括在美国专利号5,071,972和EP276,846中描述的那些，该两篇文献通过引用并入本文。本公开范围内的另外的变体包括这样的多肽，其通过与其它化学部分，例如糖基、脂质、磷酸盐、乙酰基等等形成共价或聚集的缀合物而修饰产生其衍生物。共价衍生物可以通过将化学部分与多肽的氨基酸侧链或者N-末端或C-末端的官能团连接制备。本文考虑了包含与其连接的诊断(可检测)或治疗试剂的缀合物。优选地，此类改变、置换、替代、插入或缺失保留了多肽的预期活性或者其基本等效的活性。一个实例是以与天然形式基本相同的结合亲和性结合的变体。结合亲和性可以通过常规方法，例如美国专利号5,512,457及本文所述那些来测量。
其它衍生物包括多肽与其它多肽的共价或聚集的缀合物，例如通过在重组培养中作为N-末端或C-末端融合物合成。融合多肽的实例在下面与寡聚物一起讨论。此外，融合多肽可包含为方便纯化和鉴定加入的肽。此类肽包括，例如，聚His或者美国专利号5,011,912和Hopp等，Bio/Technology6：1204，1988中所述的抗原性识别肽。一个此类肽是肽，其具有高度的抗原性并且提供了被特异性单克隆抗体可逆结合的表位，这使得快速分析成为可能并容易纯化表达的重组多肽。命名为4E11的鼠杂交瘤产生在某些二价金属阳离子存在下结合肽的单克隆抗体，如美国专利号5,011,912中所述，该文献通过引用并入本文。4E11杂交瘤细胞系已经以登录号HB9259保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)中。结合肽的单克隆抗体可以从EastmanKodakCo.，ScientificImagingSystemsDivision，NewHaven，Conn得到。
本公开包括含有早老素-1或早老素-2多肽、本公开早老素多肽的一个或更多个片段、或者如本文所公开的本公开早老素多肽的任意衍生物或变体形式的寡聚物或融合多肽。在特定的实施方案中，寡聚物包含本公开的可溶的早老素多肽。寡聚物可以是共价连接或者非共价连接形式的多聚体，包括二聚体、三聚体或者更高的寡聚物。在本公开的一个方面中，寡聚物保留了多肽构成成分的结合能力，并且因此提供二价、三价等的结合位点。在本公开的备选实施方案中涉及含有通过与多肽融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个本公开早老素多肽的寡聚物，所述的此类肽具有促进寡聚化的特性。在促进与其连接的多肽寡聚化的肽中有亮氨酸拉链和衍生自抗体的某些多肽，如在下面更加详细地描述。
在将本公开的早老素多肽变体构建成包括跨膜结构域的实施方案中，它们将形成跨膜多肽。本公开的跨膜早老素多肽可以与其配体已知的受体多肽的细胞外结构域融合。然后可以操纵此类融合多肽以控制由跨膜早老素-1多肽触发的细胞内信号传导途径。本公开的跨细胞膜的早老素多肽还可以与细胞表面受体激动剂或拮抗剂，或者细胞粘附分子融合以进一步调节早老素-1的细胞内效应。在本公开的另一方面中，可将白细胞介素置于早老素-1多肽片段与其它融合多肽结构域之间。
基于免疫球蛋白的寡聚物.用于诸多目的，包括提高多肽结合位点的效价，可将本公开多肽或其片段融合至分子例如免疫球蛋白。例如，早老素-1或早老素-2多肽片段可以(a)直接或者通过连接肽融合至免疫球蛋白的Fc部分，或者(b)直接或通过连接肽融合至另一早老素-1多肽。对于二价形式的多肽，此种融合可以是与IgG分子的Fc部分融合。还可以使用其他免疫球蛋白同种型产生此类融合。例如，多肽-IgM融合可以产生二价形式的本公开多肽。术语“Fc多肽”，如本文所使用，包括由含有Fc区任意或全部CH结构域的抗体Fc区构成的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的截短形式的此类多肽。有用的Fc多肽包括衍生自人IgG1抗体的Fc多肽。作为一个备选的方案，寡聚物使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备。包含融合至抗体衍生多肽的不同部分(包括Fc结构域)的某些异源性多肽的此类融合多肽的制备已经描述于例如Ashkenazi等(PNASUSA88：10535，1991)；Byrn等(Nature344：677，1990)；以及Hollenbaugh和Aruffo("ConstructionofImmunoglobulinFusionPolypeptides"，inCurrentProtocolsinImmunology，Suppl.4，pages10.19.1-10.19.11，1992)中。制备和使用基于免疫球蛋白的寡聚物的方法是本领域众所周知的。本公开的一个实施方案涉及二聚体，其包含两个通过将本公开的多肽与抗体衍生的Fc多肽融合产生的融合多肽。将编码多肽/Fc融合多肽的基因融合物插入至合适的表达载体中。多肽/Fc融合多肽在以重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许装配成极其类似于抗体分子，当Fc部分之间形成链间二硫键时得到二价分子。在PCT申请WO93/10151(其通过引用并入本文)中描述的一个适宜的Fc多肽是从人IgG1抗体N-末端铰链区延伸到天然的Fc区C-末端的单链多肽。另一个有用的Fc多肽是美国专利号5,457,035和Baum等(EMBOJ.13：3992-4001，1994)中描述的Fc突变蛋白，该两篇文献通过引用并入本文。该突变蛋白的氨基酸序列与WO93/10151中给出的天然Fc序列相同，除了氨基酸19已经从Leu改变成Ala，氨基酸20已经从Leu改变成Glu，并且氨基酸22已经从Gly改变成Ala之外。该突变蛋白表现出对Fc受体的亲和性降低。包含Fc部分的上述融合多肽(和从其形成的寡聚物)赋予了这样的优势，即与通过多肽A或多肽G柱相比容易地通过亲和层析纯化。在其它实施方案中，本发明的多肽可以替代抗体重链或轻链可变区。如果融合多肽使用抗体的重链和轻链两者产生，则有可能形成具有多达4个早老素-1细胞外区的寡聚物。
备选地，寡聚物是包含使用或不使用连接肽(间隔肽)的多个本公开早老素多肽的融合多肽。适宜的连接肽是美国专利号4,751,180和4,935,233中描述的那些，该文献通过引用并入本文。编码想要的连接肽的寡核苷酸序列可以使用任何合适的常规技术插入到本公开的早老素多核苷酸之间并与其处于同一阅读框中。例如，编码连接肽的化学合成的寡核苷酸可以连接在序列之间。在特定的实施方案中，融合多肽包含通过连接肽分隔开的2至4个本公开的可溶性早老素多肽。合适的连接肽、它们与其它多肽的组合以及它们的用途是本领域技术人员众所周知的。
用于制备本公开寡聚物的另一方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进它们所存在于其中的多肽寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在数个DNA-结合多肽中鉴定出(Landschulz等，Science240：1759，1988)，并且至此以后已经在多种不同多肽中发现。已知的亮氨酸拉链有进行二聚化或三聚化的天然存在肽及其衍生物。拉链结构域(在本文中也称作寡聚化或者寡聚物形成结构域)包括重复的七肽重复区，经常具有散布在其它氨基酸中的4或5个亮氨酸残基。亮氨酸拉链的用途和使用亮氨酸拉链制备寡聚物是本领域众所周知的。
将预期保留部分或全部多肽活性并因此可用于筛选或者其它免疫方法学的多肽序列的其它片段和衍生物，也可根据本公开由本领域技术人员产生。此类修饰包括在本公开中。
本公开提供了可溶性的肽片段，用于通过结合至β-APP并且防止β-APP与全长的天然早老素-1或早老素-2相互作用来治疗AD。在另一个实施方案中，可溶性的肽片段可用于通过抑制Aβ产生治疗AD。此类可溶性片段可基于如本文所述的早老素7-TM模型鉴定和开发，并且可包括本公开的任何上述鉴定的细胞外(胞外)结构域，片段和缀合的胞外片段。有用的片段包括，但不限于：(i)由DEEEDEEL(SEQIDNO：5)组成的序列，(ii)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的SEQIDNO：5组成的序列，只要该肽能够结合至β-APP即可，(iii)序列RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)，(iv)由还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：6组成的序列，(v)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(iii)或(iv)组成的序列，(vi)序列RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)，(vii)由还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：7组成的序列，(viii)由在N-末端或C-末端还包含1-50个额外氨基酸的(vi)或(vii)组成的序列，和(ix)包含非天然氨基酸或者D-氨基酸的前述任一序列，只要该肽能够与β-APP相互作用或结合即可。本公开证明，当将80个氨基酸的N-末端片段内的PS-1结构域加入至表达β-APP的细胞和表达PS-1的细胞的共培养物中时，可以特异性地抑制Aβ产生。这些肽均抑制β-APP转基因小鼠中的Aβ产生。本公开进一步证明，如果细胞-细胞相互作用被抑制，则G蛋白活化和Aβ产生均被抑制。
本公开还提供抑制通过β-APP与PS-1或PS-2相互作用所诱导G蛋白活化的抑制剂。例如，如果G蛋白活化被抑制(通过在β-APP：PS-1共培养中存在PTx)，则Aβ产生也被抑制。因此，本公开提供对于G蛋白活化和GoA结合所需的PS-1细胞内结构域序列。在一个实施方案中，本公开提供包含PS-1前20个氨基酸(N-KKALPALPISITFGLVFYFA-COOH；SEQIDNO：8)的C-末端尾序列。此外，本公开鉴定了PS-1细胞内环3(KYLPE；SEQIDNO：2氨基酸239-243)(其与PS-2中的相应结构域相同)和结合GoA的肽，包括例如，N-MALVFIKYLPE-COOH；SEQIDNO：9。
本公开包括编码本公开早老素多肽或肽的多核苷酸。这些多核苷酸可以数个方式鉴定，包括从合适的来源分离基因组或cDNA分子。可用作多核苷酸分离的探针或引物的，或者用作数据库检索中查询序列的，对应于本文所述氨基酸序列的核苷酸序列，可以从氨基酸序列通过“回译”得到，或者通过鉴定与其编码DNA序列已经被鉴定出的多肽具有氨基酸同一性的区域得到。可以采用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)方法分离和扩增编码人早老素-1或早老素-2多肽或者想要的人早老素-1或早老素-2多肽片段组合的DNA序列。限定想要的DNA片段组合的末端的寡核苷酸用作5'和3'引物。寡核苷酸可以额外地包含限制性内切核酸酶的识别位点，以利于将扩增的DNA片段组合插入到表达载体中。PCR技术描述于Saiki等，Science239：487(1988)；RecombinantDNAMethodology，Wu等，编者，AcademicPress，Inc.，SanDiego(1989)，第189-196页；以及PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications，Innis等，编者，AcademicPress，Inc.(1990)中。
本公开的多核苷酸分子包括单链和双链两种形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。DNA包括，例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。本公开的多核苷酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段组合。本公开的多核苷酸可以衍生自人来源，但是本公开还包括自非人物种衍生的那些。
在多核苷酸分离自天然来源情况下，“分离的多核苷酸”是已经与分离该多核苷酸的生物体基因组中存在的临接基因序列分开的多核苷酸。在从模板酶促合成或者化学合成的多核苷酸的情况下，例如PCR产物、cDNA分子或者寡核苷酸，例如，应当理解源自此类过程的多核苷酸是分离的多核苷酸。分离的多核苷酸指单独的片段形式的或者作为较大多核苷酸构建体的成分的多核苷酸。在一个实施方案中，本公开涉及基本上没有污染内源物质的某些分离的多核苷酸。多核苷酸优选地来自于这样的DNA或RNA，即其分离至少一次，为基本上纯的形式并且其质量或浓度使得可以通过标准生物化学方法鉴定、操作和回收其组成成分核苷酸序列(例如Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)中描述的那些)。此类序列典型地以如下形式提供和/或构建，即开放阅读框不被内部非翻译序列或者典型地在真核基因中存在的内含子打断。非翻译DNA序列可以存在于开放阅读框的5'或3'，这样做不会干扰编码区的操作或表达。
用于产生本公开早老素多肽的方法在下面描述。本公开的多肽和片段的表达、分离和纯化可以通过任何适宜技术，包括但不限于下列方法实现。本公开的分离核酸可以可操作地连接至表达控制序列，例如pDC409载体(Giri等，1990，EMBOJ.13：2821)或衍生的pDC412载体(Wiley等，1995，Immunity3：673)。pDC400系列载体对于瞬时哺乳动物表达系统，例如CV-1或293细胞是有用的。备选地，本公开的分离的核酸可以连接至表达载体，例如pDC312、pDC316或pDC317载体。pDC300系列载体均包含SV40复制起点、CMV启动子、腺病毒三联前导序列以及SV40polyA和终止信号，并且可用于合适的哺乳动物表达系统中，例如CHO细胞或它们的衍生物。其它表达控制序列和克隆技术也可用于重组性产生多肽，例如pMT2或pED表达载体(Kaufman等，1991，NucleicAcidsRes19：4485-4490；和Pouwels等，1985，CloningVectors.ALaboratoryManual，Elsevier，NewYork)以及GATEWAY载体(LifeTechnologies；Rockville，Md.)。侧翼为attB序列的本公开的分离核酸可以通过整合酶反应与GATEWAY载体，例如包含attP序列的pDONR201重组，提供包含本公开的分离核酸的GATEWAY系统的入门载体(entryvector)。该入门载体可以与其他适当制备的表达控制序列，例如上述的pDC400和pDC300系列的那些进一步重组。许多适宜的表达控制序列是本领域已知的。表达重组多肽的一般方法还描述于Kaufman，1990，MethodsinEnzymology185，537-566中。如本文所使用，“可操作连接的”意思是指本公开的多核苷酸和表达控制序列以这样的一种方式位于构建体、载体或细胞内，以致于当存在适当的分子(例如聚合酶)时表达由多核苷酸编码的多肽。作为本公开的一个实施方案，在重组宿主细胞或其后代中，至少一个表达控制序列与本公开的多核苷酸可操作地连接，其中多核苷酸和/或表达控制序列已经通过转化或转染，或者例如通过任何其他合适的方法引入到宿主细胞内。作为本公开的另一实施方案，至少一个表达控制序列整合在重组宿主细胞的基因组中，以致于其与编码本公开多肽的多核苷酸序列可操作连接。在本公开的又一实施方案，在体外或者在重组宿主细胞中至少一个表达控制序列通过反式作用因子如转录因子与本公开的多核苷酸可操作地连接。
此外，编码适当信号肽(天然的或者异源性的)的序列可以整合入表达载体中。信号肽或者前导序列的选择可以取决于许多因素，如待产生重组多肽的宿主细胞类型。为了举例说明，在哺乳动物宿主细胞中起作用的异源信号肽实例包括美国专利号4,965,195中描述的白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等，Nature312：768(1984)中描述的白细胞介素-2受体的信号序列；EP367,566中描述的白细胞介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中描述的I型白细胞介素-1受体信号肽；和EP460,846中描述的II型白细胞介素-1受体信号肽。信号肽(分泌前导序列)的DNA序列可框内融合至本公开的多核苷酸，以致于DNA被最初转录，并且mRNA被翻译成包含信号肽的融合多肽。在预期的宿主细胞中起作用的信号肽促进多肽的胞外分泌。当细胞分泌多肽时，信号肽从多肽上切下来。技术人员还将认识到，信号肽被切下的一个或更多个位置可以与通过计算机程序预测的那些不同，并且可以根据诸如用于表达重组多肽的宿主细胞类型的因素而改变。多肽制剂可以包括具有不同N-末端氨基酸的多肽分子的混合物，这些分子源自信号肽在一个以上位点的切割。
已经描述了用于将DNA引入哺乳动物细胞的确定的方法(Kaufman，1990，LargeScaleMammalianCellCulture，第15-69页)。使用商业上可得的试剂，例如Lipofectamine脂质试剂(Gibco/BRL)或者Lipofectamine-Plus脂质试剂的另外的方案可以用于转染细胞(Felgner等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7417)。此外，使用常规方法，例如Sambrook等的那些方法(MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版.第1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)的电穿孔可以用于转染哺乳动物细胞。稳定转化体的选择可以使用本领域的已知方法，例如诸如对细胞毒性药物的抗性进行。Kaufman等，Meth.inEnzymology185：487-511，1990描述了数个选择方案，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性。用于DHFR选择的适宜株可以是DHFR缺陷的CHODX-B11株(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)。表达DHFRcDNA的质粒可以引入到DX-B11株中，并且仅有包含质粒的细胞可以在合适的选择培养基中生长。可以整合入表达载体的选择标记的其它实例包括赋予抗生素例如G418和潮霉素B抗性的cDNAs。携带载体的细胞可以在对这些化合物抗性的基础上选择。
备选地，基因产物可以通过同源重组或者“基因打靶”技术得到。此类技术采用外源转录控制元件(例如CMV启动子等)向基因组特定的预定位点的引入，以诱导目的内源多核苷酸序列的表达。考虑到基因的已知位置和序列，整合入宿主染色体或基因组的位置可以容易地由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，本公开还考虑了可扩增基因连同外源转录控制元件一起引入，以产生增加量的基因产物，除此之外还不需要将基因本身从宿主细胞分离。Schimke等，“AmplificationofGenesinSomaticMammaliancells”，MethodsinEnzymology151：85-104(1987)，以及Capecchi等，“TheNewMouseGenetics.AlteringtheGenomebyGeneTargeting”，TIG5：70-76(1989)解释了同源重组或基因打靶的实施。
许多类型的细胞可以充当多肽表达的适宜宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括，例如猴肾细胞COS-7系(ATCCCRL1651)(Gluzman等，Cell23：175，1981)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、如McMahan等(EMBOJ.10：2821，1991)所述的来自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL70)、人肾脏293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他的转化的灵长类细胞系、正常的二倍体细胞、来自体外原代组织培养的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。备选地，其可以在低等真核生物例如酵母或者原核生物例如细菌中产生多肽。可能适宜的酵母株包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)株、念珠菌属(Candida)或者能够表达异源多肽的任何酵母菌株。可能适宜的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)或者能够表达异源多肽的任何细菌菌株。如果多肽在酵母或细菌中产生，可能必须修饰其中产生的多肽，例如通过适当位点的磷酸化或者糖基化，以便得到功能性多肽。此类共价连接可以使用已知的化学或者酶方法实现。还可以通过将本公开的分离的多核苷酸与适宜控制序列在一个或更多个昆虫表达载体中可操作地连接，并且采用昆虫表达系统产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以来自例如美国Invitrogen，SanDiego，Calif.的试剂盒形式(MaxBac.RTM.试剂盒)商业可得的，并且此类方法是本领域众所周知的，如Summers和Smith，TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)以及Luckow和Summers，Bio/Technology6：47(1988)中所述，该两篇文献通过引用并入本文。如本文所使用，能够表达本公开多核苷酸的昆虫细胞被“转化”。还可以使用无细胞的翻译系统使用衍生自本文所公开的多核苷酸构建体的RNAs产生多肽。包含典型地与至少一个表达控制序列可操作地连接的本公开的分离多核苷酸的宿主细胞是“重组体宿主细胞”。
本公开的多肽或肽可以通过在适于表达重组多肽的培养条件下培养转化的宿主细胞制备。然后，使用已知纯化方法，例如凝胶过滤和离子交换层析，将所得到的表达的多肽从此类培养物(例如从培养基中或者从细胞提取物中)中纯化。多肽的纯化还可以包括含有将结合多肽的试剂的亲和柱；在诸如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-或Cibacromblue3GA的亲和树脂上的一个或更多个柱步骤；包括使用诸如苯醚、丁醚或丙醚的树脂的疏水相互作用层析的一个或更多个步骤；或者免疫亲和层析。备选地，本公开的多肽还以利于纯化的形式表达。例如，其可以作为融合多肽表达，例如麦芽糖结合多肽(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或者硫氧还蛋白(TRX)的那些。用于此类融合多肽表达和纯化的试剂盒可以分别从NewEnglandBioLab(Beverly，Mass.)、Pharmacia(Piscataway，N.J.)和InVitrogen商业性获得。多肽还可以用表位标记并且随后通过使用针对此表位的特异性抗体纯化。一个此类表位(“Flag”)可以从Kodak(NewHaven，Conn.)商业性获得。最后，可以使用采用疏水RP-HPLC介质，如具有甲基或其它脂族基团侧基的硅胶，的一个或更多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤进一步纯化多肽。还可以使用前述纯化步骤的一些或者全部步骤的多种组合，提供基本上同质的分离的重组多肽。如此纯化的多肽基本上无其它哺乳动物多肽，并且依据本公开定义为“纯化的多肽”；如此纯化的本公开多肽包括结合本公开早老素多肽的纯化的抗体、片段、变体、结合配偶体等等。本公开的多肽还可以作为转基因动物的产物表达，例如作为以包含编码该多肽的多核苷酸的体细胞或生殖细胞为特征的转基因奶牛、山羊、猪或绵羊的奶的成分。
还可以利用包含本公开的多肽结合性多肽，例如针对本公开多肽产生的单克隆抗体的亲和柱，以亲和纯化所表达的多肽。这些多肽可以使用常规技术，例如在高盐洗脱缓冲液中，并且然后透析进入低盐缓冲液中用于使用，或者根据所采用的亲和性基质通过改变pH或者其它成分而从亲和柱中去除，或者使用亲和性部分的天然存在物质，例如来源于本公开的多肽而被竞争性地去除。在本公开的该方面中，多肽结合性的多肽，例如本公开的抗多肽抗体或者与本公开多肽相互作用的其它多肽，可以结合至固相载体上，例如柱层析基质或者适于鉴定、分离或者纯化在其表面上表达本公开多肽的细胞的相似基片上。本公开的多肽结合性多肽附着至固相接触表面可以通过许多技术实现，例如磁性微球体可以用这些多肽结合性多肽包被并且保持在处于磁场中的孵育管中。细胞混合物的悬液与其上具有此类多肽结合性多肽的固相接触。其表面上具有本公开多肽的细胞结合固定的多肽结合性多肽，然后将未结合的细胞洗掉。该亲和性结合方法可用于从溶液中纯化、筛选或者分离此种表达多肽的细胞。从固相上释放正性选择的细胞的方法是本领域已知的并且包括，例如酶的使用。此类酶优选是对细胞无毒的和无害的并且涉及将细胞－表面接合配偶体断裂。备选地，怀疑包含本公开的表达多肽的细胞的细胞混合物可以首先与本公开的生物素化多肽结合性多肽孵育。孵育阶段有代表性地是至少1小时的持续时间，以保证充分结合本公开的多肽。然后将所得到的混合物通过填充有抗生物素蛋白包被珠的柱子，由此抗生物素蛋白的高生物素亲和性使得多肽结合性细胞结合至珠上。抗生物素蛋白包被的珠的使用是本领域已知的(见例如Berenson等，J.Cell.Biochem.，10D：239，1986)。未结合物质的洗涤以及所结合细胞的释放使用常规方法进行。
多肽还可以通过已知常规化学合成产生。用于通过合成手段构建本公开多肽的方法是本领域技术人员已知的。合成性构建的多肽，由于与天然多肽共享一级、二级或者三级结构和/或构象特征，会具有它们共同的生物学特征，包括多肽活性。因此，它们可以用作天然的、纯化多肽的生物学活性或免疫学替代物用于治疗化合物的筛选中和用于开发抗体的免疫学过程中。
所希望的纯度程度依赖于多肽的预期用途。当打算体内施用多肽时，希望纯度程度相对高。在此种情况下，如此纯化多肽以致于当通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析时没有检测到对应于其它多肽的多肽条带。相关领域的技术人员会认识到，通过SDS-PAGE可见到对应于多肽的多个条带，这样因为差异的糖基化作用，差异的翻译后加工等等。本公开的多肽纯化至基本上同质性，如通过SDS-PAGE分析时的单一多肽条带所表明。多肽条带可通过银染、考马斯兰染色或者(如果多肽被放射性标记)通过放射自显影显色。
中和本公开早老素多肽或者抑制早老素-1或早老素-2基因表达(或者转录或者翻译)或者抑制早老素与β-APP相互作用的任何方法，可以用于改善记忆和/或阿尔茨海默病的发作或者进展。在特定的实施方案中，拮抗剂抑制至少一种早老素-1多肽与细胞上表达的结合配偶体结合，由此抑制通过本公开的那些早老素多肽与细胞的结合而诱导的生物学活性。在本公开的某些其它实施方案中，可以将拮抗剂设计成降低内源早老素-1或早老素-2基因表达的水平，例如使用众所周知的反义核酸或者核酶方法以抑制或者阻止早老素-1或早老素-2mRNA转录物的翻译；使用三螺旋方法以抑制早老素-1基因的转录；或者使用定向同源重组以失活或“敲除”早老素-1或早老素-2基因或者它们的内源启动子或增强子元件。可以设计此类反义核酸、核酶和三螺旋拮抗剂以降低或者抑制未受损的或者，如果需要的话，突变体早老素-1或早老素-2基因活性。产生和使用此类分子的技术是本领域技术人员众所周知的。
反义RNA和DNA分子通过杂交至靶mRNA并阻止多肽翻译起作用直接封闭mRNA的翻译。反义方法包括设计与早老素-1mRNA互补的寡核苷酸(或者DNA或者RNA)。反义寡核苷酸将结合互补的靶基因mRNA转录物并且阻止翻译。绝对的互补性虽然是优选的，但不是必需的。与多核苷酸的部分“互补的”序列，如本文所提到，意思是指序列具有足够的互补性以致于能够与该多核苷酸杂交，形成稳定的双链体(或三链体，在适当时)。在双链反义核酸的情况中，因此可以测试双链DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交能力将取决于互补性程度和反义核酸长度。与信使5'端，例如一直到并包括AUG起始密码子的5'非翻译序列互补的寡核苷酸，将最有效地抑制翻译。然而，与早老素-1或早老素-2基因转录物5'-或者3'-非翻译的非编码区互补的寡核苷酸将在反义方法中用以抑制内源早老素-1或早老素-2mRNA的翻译。与mRNA5'非翻译区互补的寡核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补序列。反义核酸应当是长度为至少6个核苷酸，并且长度范围有代表性地从6至大约50个核苷酸。在特定方面中，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修饰形式、单链的或者双链的。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或者磷酸主链上进行修饰，例如，为改善分子的稳定性、杂交等等。寡核苷酸可包括其它附加基团，例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)，或者促进跨细胞膜运输的试剂(见例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT公布号WO88/09810，于1988年12月15日公布)，或者杂交触发的断裂试剂或者嵌入试剂(见例如Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)。反义分子应该递送至体内表达人早老素-1或早老素-2转录物的细胞。已经开发了许多方法用于递送反义DNA或RNA至细胞；例如反义分子可以直接注射入组织或细胞衍生部位，或者经设计靶向预期细胞的修饰的反义分子(例如，与特异性结合靶细胞表面上所表达受体或抗原的肽或抗体相连的反义分子)可以全身施用。然而，常常难以达到足以抑制内源mRNAs翻译的反义分子的细胞内浓度。因此，一个方法利用其中反义寡核苷酸置于强polIII或polII启动子控制下的重组DNA构建体。使用此种构建体转染受试者内的靶细胞将导致足够量单链RNAs的转录，这些单链RNAs将与内源早老素-1基因转录物形成互补的碱基对，并且由此阻止早老素-1或早老素-2mRNA的翻译。例如，载体可以引入到体内以致于它被细胞摄入并且指导反义RNA的转录。此种载体可以仍然为附加型的或者变成染色体整合型的，只要它可以被转录产生想要的反义RNA即可。此类载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒或者本领域已知用于在哺乳动物细胞中复制和表达的其它载体。
也可以使用经设计催化断裂早老素-1或早老素-2mRNA转录物的核酶分子，以阻止早老素-1或早老素-2mRNA的翻译，由此抑制本公开早老素多肽的表达(见例如PCT国际公布WO90/11364，于1990年10月4日公布；美国专利号5,824,519)。可以在本公开中使用的核酶包括锤头状核酶(Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591)、RNA内切核酶(以下称做“Cech-型核酶”)例如嗜热四膜虫(TetrahymenaThermophila)中天然存在的RNA内切核酶(称作IVS，或L-19IVSRNA)和已经由ThomasCech及合作者广泛描述的RNA内切核酶(国际专利申请号WO88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47：207-216)。如在反义方法中，核酶可以包含修饰的寡核苷酸(例如用于改善稳定性、靶向等等)并且应当递送至体内表达人早老素-1多肽的细胞中。有代表性的递送方法包括使用处于强组成型polII或polIII启动子控制下的编码该核酶的DNA构建体，以致于所转染的细胞将产生足够量的所述核酶以破坏内源早老素-1或早老素-2信使并抑制翻译。由于与反义分子不同，核酶是催化性的，所以就功效而言需要较低的细胞内浓度。
备选地，内源早老素-1或早老素-2基因表达可以通过如下方式降低，即靶向与靶基因调节区(例如靶基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列以形成阻止早老素-1基因转录的三螺旋结构(通常参见，Helene，1991，AnticancerDrugDes.，6(6)：569-584；Helene，等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660，27-36；以及Maher，1992，Bioassays14(12)：807-815)。
本公开的反义核酸、核酶和三螺旋分子可以通过本领域已知的用于DNA和RNA分子合成的任何方法制备。这包括本领域众所周知的用于化学合成寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，例如，固相亚磷酰胺化学合成。寡核苷酸可以通过本领域已知的标准方法合成，例如通过使用自动DNA合成仪(例如可从Biosearch，AppliedBiosystems等等商业性获得)。作为实例，硫代磷酸酯寡核苷酸可以通过Stein等，1988，Nucl.AcidsRes.16：3209的方法合成。甲基膦酸酯寡核苷酸可以通过使用可控孔度玻璃聚合物载体制备(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451)。备选地，RNA分子可以通过编码反义RNA分子的DNA序列的体外和体内转录产生。此类DNA序列可以整合入已整合有合适的RNA聚合酶启动子，例如T7或SP6聚合酶启动子的多种载体中。备选地，取决于所使用的启动子，组成性或者诱导性合成反义RNA的反义cDNA构建体，可以稳定地引入到细胞系中。
提供了对应于本文所公开多核苷酸序列的一个或多个基因表达提高、降低或者改变的生物体。所希望的基因表达的改变可以通过使用结合和/或断裂从该基因所转录的mRNA的反义核酸或核酶来实现(Albert和Morris，1994，TrendsPharmacol.Sci.15(7)：250-254；Lavarosky等，1997，Biochem.Mol.Med.62(1)：11-22；以及Hampel，1998，Prog.NucleicAcidRes.Mol.Biol.58：1-39；所有文献通过引用并入本文)。提供了具有多个拷贝的对应于本文所公开多核苷酸的一个或多个基因的转基因动物，其通过用遗传构建体转化细胞使该遗传构建体稳定维持在所转化细胞和它们的后代中来产生。还提供了这样的转基因动物，其具有增加或者降低基因表达水平，或者改变基因表达的时间或空间模式的修饰的遗传控制区(见例如欧洲专利号0649464B1，通过引用并入本文)。此外，提供了这样的生物体，其中对应于本文所公开多核苷酸序列的一个或多个基因，已经通过向对应的一个或多个基因中插入外源序列或者通过缺失全部或部分的一个或多个对应基因，而部分或者全部失活。部分或完全的基因失活可以通过插入转座因子，然后不精确切除该转座因子来实现(Plasterk，1992，Bioessays14(9)：629-633；Zwaal等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(16)：7431-7435；Clark等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(2)：719-722；全部通过引用并入本文)，或者通过同源重组实现，其可以通过正性/负性遗传选择策略检测(Mansour等，1988，Nature336：348-352；美国专利号5,464,764；5,487,992；5,627,059；5,631,153；5,614,396；5,616,491；和5,679,523；全部通过引用并入本文)。具有改变的基因表达的这些生物体是真核生物并且有代表性地是哺乳动物。此类生物体用于开发非-人模型以用于研究对应的一个或多个基因所涉及的病症，和用于开发测定系统以用于鉴定与对应的一个或多个基因的一个或多个多肽产物相互作用的分子。
本公开的早老素多肽本身也可以在体外或体内方法中用来抑制早老素-1或早老素-2的生物学活性。本公开包括本公开早老素多肽的细胞外环结构域，当其作为片段或者融合多肽的成分表达时充当天然早老素-1或早老素-2多肽功能的“显性失活”抑制剂。例如，纯化的本公开多肽结构域可以用于抑制本公开早老素多肽与内源结合配偶体的结合。此类使用将有效地阻断早老素-1或早老素-2多肽与β-APP的相互作用并抑制早老素-1或早老素-2多肽活性。在本公开的又一方面中，在上皮和/或内皮细胞上表达的可溶形式的早老素-1或早老素-2结合配偶体，用于结合内源早老素-1或早老素-2多肽并竞争性抑制其活化。此外，结合本公开早老素多肽的抗体可以抑制早老素-1或早老素-2活性并且充当拮抗剂或者充当激活剂。例如，特异性识别本公开早老素多肽一个或更多个表位、或者本公开早老素多肽的保守变体的表位、或者早老素-1多肽的肽片段的抗体可以在本公开中用于抑制早老素-1或早老素-2活性(例如拮抗性抗体)。激动性抗体结合本公开的早老素多肽或者结合配偶体，并且通过引起组成性细胞内信号传导(或“配体模拟”)，或者通过阻止早老素-1或早老素-2多肽活性的天然抑制剂的结合提高早老素-1或早老素-2多肽活性。结合早老素-1或早老素-2多肽的抗体包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体(mAbs)、人抗体(也称作“完全的人抗体”)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、通过Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体、和上述任一种的表位结合片段。备选地，纯化的和修饰的本公开早老素多肽可以施用以调节本公开早老素多肽与非膜结合的早老素-1或早老素-2结合配偶体的相互作用。此类手段将提供用于修饰人早老素-1影响的生物活性的替代方法。
本公开的多肽可以用于从细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中鉴定拮抗剂和激动剂。拮抗剂和激动剂可以是本公开多肽的天然或修饰底物、配体、酶、受体等，或者可以是该多肽的结构或功能模拟物。本公开的潜在拮抗剂可以包括这样的小分子、肽和抗体，它们结合并占据本发明多肽或其结合配偶体的结合位点，导致结合位点不能够用于结合它们天然的结合配偶体，并且因此阻止了正常的生物学活性。潜在的激动剂包括这样的小分子、肽和抗体，它们结合本发明的多肽或其结合配偶体，并引起了与由本公开多肽的结合所引起的生物学效应相同或者增强的生物学效应。本公开多肽的肽激动剂和拮抗剂可以根据已知方法鉴定和使用(见例如，WO00/24782和WO01/83525，其通过引用并入本文)。
开发治疗剂的一种方法是肽文库筛选。蛋白质配体与其受体的相互作用常常在相对大的界面处发生。然而，如对于人生长激素及其受体所证明，仅界面处的少数关键残基促成了大部分的结合能量(Clackson等，1995；Science267：383-386)。大多数蛋白质配体仅表现出结合正确拓扑学中的表位或者起着与结合无关的作用。因此，仅“肽”长度(2至90个氨基酸)的分子可结合至甚至大的蛋白质配体例如本公开多肽的受体蛋白质或者结合配偶体。此类肽可模拟大的蛋白质配体的生物活性(“肽激动剂”)或者，通过竞争性结合，抑制大的蛋白质配体的生物活性(“肽拮抗剂”)。本公开多肽的示例性肽激动剂和拮抗剂可以包含天然存在分子的结构域或者可以包含随机序列。术语“随机的”，如所使用，指称做完全随机序列的肽序列(通过噬菌体展示方法或者RNA-肽筛选法选择的)和其中天然存在分子的一个或更多个残基被天然存在分子该位置上未出现的氨基酸残基替代的序列。噬菌体展示肽文库已经作为鉴定此类肽激动剂和拮抗剂的强力方法出现。见例如，Scott等，1990，Science249：386；Devlin等，1990，Science249：404；美国专利号5,223,409；美国专利号5,733,731；美国专利号5,498,530；美国专利号5,432,018；美国专利号5,338,665；美国专利号5,922,545；WO96/40987；和WO98/15833(每篇参考文献的全文通过引用并入本文)。在此类文库中，随机的肽序列通过与丝状噬菌体的外壳蛋白融合而被展示。有代表性地，所展示的肽针对抗体固定化的受体细胞外结构域进行亲和性洗脱。保留的噬菌体可以通过连续数次循环的亲和性纯化和再增殖富集。可将最佳的结合肽测序以鉴定一个或更多个结构相关家族肽内的关键残基。肽序列还表明，哪些残基可以通过丙氨酸扫描或者通过DNA水平的诱变安全地替代。可以产生并筛选诱变文库以进一步优化最佳结合序列的序列(Lowman，1997，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：401-424)。筛选可溶性肽混合物的另一生物学方法使用酵母用于表达和分泌(Smith等，1993，Mol.Pharmacol.43：741-748)以寻找具有有利治疗特性的肽。在下文中，该方法和相关的方法被称为“基于酵母的筛选”。肽文库还可以融合至lac阻遏蛋白羧基末端并在大肠杆菌中表达。另一个基于大肠杆菌的方法通过与肽聚糖相关脂蛋白(PAL)融合在细胞外膜上展示。在下文中，这些方法和相关的方法统称为“大肠杆菌展示”。在一个方法中，随机RNA的翻译在核糖体释放前停止，产生了其相关RNA仍然附着的多肽文库。在下文中，该方法和相关方法统称为“核糖体展示”。其它方法采用与RNA连接的肽；例如，PROfusion技术，Phylos，Inc.(见例如，Roberts和Szostak，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：12297-12303)。在下文中，该方法和相关方法统称为“RNA-肽筛选法”。已经开发了化学来源的肽文库，其中肽被固定于稳定的、非生物物质上，例如聚乙烯棒或者溶剂可渗透的树脂。另一化学来源的肽文库使用照相平板印刷术以扫描固定在载玻片上的肽。在下文中，这些方法和相关方法统称为“化学-肽筛选法”。化学-肽筛选法将是有利的，因为它使用D-氨基酸和其它非天然类似物，以及非肽成分。在Wells和Lowman，1992，Curr.Opin.Biotechnol.3：355-362中综述了生物学和化学方法。
至于已知生物活性肽，可以完成对具有有利治疗特性的肽配体的合理设计。在此种方法中，人们逐步改变肽序列并确定置换对肽的生物活性或者预测的生物物理学特性(例如溶液结构)的影响。在下文中，这些技术统称为“合理设计”。在一个此类技术中，人们产生了一系列肽，其中每一次用丙氨酸置换一个残基。该技术通常称为“丙氨酸步移”或者“丙氨酸扫描”。当两个残基(连续或者分隔开)被置换时，其被称为“双丙氨酸步移”。所产生的氨基酸置换物可以单独使用或者组合使用产生具有有利治疗特性的新的肽实体。还可使用蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析以提示模拟大的蛋白质配体结合活性的肽。在此种分析中，晶体结构可以提示大的蛋白质配体的关键残基的身份和相对定位，根据此可以设计肽(见例如Takasaki等，1997，NatureBiotech.15：1266-1270)。在下文中，这些方法和相关方法被称为“蛋白质结构分析”。这些分析方法还可用于研究受体蛋白质与通过噬菌体展示选择的肽之间的相互作用，这会提示对肽进行进一步修饰以增加结合亲和性。
本公开多肽的肽激动剂和拮抗剂可以共价连接至运载体分子上。术语“运载体”指阻止治疗蛋白质降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性或者增加生物学活性或者摄入的分子。示例性的运载体包括Fc结构域或线性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖等)；支链聚合物(见例如，美国专利号4,289,872；美国专利号5,229,490；WO93/21259)；脂质；胆固醇类(例如类固醇)；糖或寡糖(例如葡聚糖)；或者结合挽救受体或者蛋白质跨膜结构域的任何天然或者合成的蛋白质、多肽或肽。
本文提供了与本公开多肽免疫反应的抗体。此类抗体通过抗体的抗原结合位点特异性结合至多肽(与非特异性结合相对)。在本公开中，特异性结合抗体是将特异性识别并结合本公开早老素多肽、同源物和变体，但不结合并识别其它分子的那些。在一个实施方案中，抗体是本公开多肽特异性的，并且不与其它多肽交叉反应。以该方式，如上所述的本公开早老素多肽、片段、变体、融合多肽等等，可以在产生与其发生免疫反应的抗体中用作“免疫原”。
更加特别地，多肽、片段、变体、融合多肽等等包含引起抗体形成的抗原决定簇或者表位。这些抗原决定簇或者表位可以是线性的或者构象上的(不连续的)。线性表位由多肽的单一部分氨基酸组成，而构象或者不连续表位由来自多肽链不同区的、当多肽折叠时密切接近的氨基酸部分组成(C.A.Janeway，Jr.和P.Travers，ImmunoBiology3：9(GarlandPublishingInc.，第2版，1996))。由于折叠的多肽具有复杂的表面，可利用的表位数量相当多；然而，由于多肽构象和立体位阻，实际上结合表位的抗体数少于可利用表位数(C.A.Janeway，Jr.和P.Travers，ImmunoBiology2：14(GarlandPublishingInc.，第2版，1996))。表位可以通过本领域已知任何方法鉴定。因此，本公开的一个方面涉及本公开多肽的抗原表位。此类表位可用于产生抗体，特别是单克隆抗体，如下面更加详细地描述。另外，来自本公开多肽的表位可以用作测定法中的研究试剂，并且用于从物质中，例如多克隆血清或者来自培养杂交瘤的上清液中纯化特异性结合的抗体。此类表位或其变体可以使用本领域众所周知的技术例如固相合成、多肽的化学或酶促断裂，或者使用重组DNA技术产生。
至于可以通过本公开多肽的表位产生的抗体，不论表位已经分离还是保留了部分多肽，可通过常规技术制备多克隆抗体和单克隆抗体。见例如，MonoclonalAntibodies,Hybridomas：ANewDimensioninBiologicalAnalyses，Kennet等(编者)，PlenumPress，NewYork(1980)；以及Antibodies.ALaboratoryManual，Harlow和Land(编者)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1988)；Kohler和Milstein，(美国专利号4,376,110)；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，ImmunologyToday4：72；Cole等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：2026-2030)；以及EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.，第77-96页)。本文还考虑了产生对本公开多肽特异的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤可以通过常规技术产生和鉴定。产生本公开单克隆抗体的杂交瘤可以体外或体内培养。高效价单克隆抗体的体内生产使得其成为最常用的制备方法。用于产生此类杂交瘤细胞系的一个方法包括用多肽免疫动物；从被免疫的动物收集脾脏细胞；将所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞系融合，由此产生杂交瘤细胞；并鉴定产生结合该多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。对于抗体的生产，可通过注射下列的一种或多种来免疫不同的宿主动物：早老素-1多肽、早老素-1多肽的片段、早老素-1多肽的功能等效物、或者突变体形式的早老素-1多肽。此类宿主动物可包括，但不限于兔、小鼠和大鼠。可以使用多种佐剂以增强免疫反应，取决于宿主种类，包括但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。可以通过常规技术回收单克隆抗体。此类单克隆抗体可以是任何免疫球蛋白种类的，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。
此外，还可使用开发用于通过将来自具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子基因与来自具有适宜生物学活性的人抗体分子基因剪接产生“嵌合抗体”的技术(Takeda等，1985，Nature，314：452-454)。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于猪mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些嵌合抗体。本公开的单克隆抗体还包括人源化形式的鼠单克隆抗体。此类人源化抗体可以通过已知技术制备并且赋予了当该抗体向人施用时具有降低的免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠抗体可变区(或者仅其抗原结合部位)和来源于人抗体的恒定区。备选地，人源化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和来源于人抗体的可变区片段(缺乏抗原结合位点)。用于产生嵌合的和进一步工程化单克隆抗体的方法包括在Riechmann等(Nature332：323，1988)，Liu等(PNAS84：3439，1987)，Larrick等(Bio/Technology7：934，1989)，以及Winter和Harris(TIPS14：139，Can，1993)中描述的那些。通过转基因产生抗体的方法可以在GB2,272,440，美国专利号5,569,825和5,545,806以及被要求优先权的相关专利中找到，所有这些文献通过引用并入本文。优选地，对于在人中使用，抗体是人的或人源化的；用于产生此类人或人源化抗体的技术也是众所周知的并且可以从例如，MedarexInc.(Princeton，N.J.)和AbgenixInc.(Fremont，Calif.)商业性获得。
识别特异性表位的的抗原结合性抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括，但不限于：可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段和可以通过将(ab')2片段的二硫键还原产生的Fab片段。备选地，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science，246：1275-1281)以便快速和容易地鉴定具有所希望特异性的单克隆Fab片段。描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，1988，Science242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；和Ward等，1989，Nature334：544-546)也可以用于产生抗早老素-1基因产物的单链抗体。单链抗体通过将Fv区的重链和轻链片段经由氨基酸桥连接产生单链多肽而形成。此外，抗早老素-1多肽的抗体反过来可以用于使用本领域技术人员众所周知的技术产生“模拟”早老素-1或早老素-2多肽和可以结合早老素-1或早老素-2多肽的抗独特型抗体(见例如Greenspan和Bona，1993，FASEBJ7(5)：437-444；以及Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)：2429-2438)。
可以鉴定此类抗体的筛选方法是众所周知的，并且可以包括例如免疫亲和层析。可以对抗体进行激动性(即配体模拟性)特性筛选。当此类抗体结合至细胞表面早老素-1时，引起与早老素-1或早老素-2结合配偶体结合至细胞表面早老素-1或早老素-2时所引起的生物学效应相似的生物学效应(例如，生物学信号的转导)。激动性抗体可以用于诱导早老素-1或早老素-2介导的活性，例如上皮屏障形成，刺激性途径，或者细胞间通讯。可封闭本公开早老素多肽与早老素-1结合配偶体结合的那些抗体可以用于抑制早老素-1或早老素-2介导的上皮屏障形成、细胞间通讯或者源于此结合的共刺激。此类封闭抗体可以使用任何适宜测定法鉴定，例如通过测试抗体抑制早老素-1或早老素-2与表达早老素-1或早老素-2结合配偶体的某些细胞结合的能力。备选地，使用本文所述的测定法，可以在测定法中鉴定封闭抗体抑制由早老素-1或早老素-2与靶细胞结合引起的生物学效应，例如上皮屏障形成的能力。此种抗体可以在体外方法中使用或者体内施用以抑制由生成该抗体的实体所介导的生物学活性。因此可以治疗由早老素-1或早老素-2与细胞表面结合配偶体受体相互作用所引起或恶化(直接或间接)的病症。治疗方法包括向哺乳动物体内施用有效抑制早老素-1或早老素-2结合配偶体介导的生物学活性的量的封闭抗体。可以在此类治疗方法中使用人或人源化抗体。在一个实施方案中，使用抗原结合性抗体片段。本文提供了包含抗早老素-1或早老素-2的抗体和生理可接受稀释剂、赋形剂或载体的组合物。此类组合物的适宜成分是在下面对于包含本公开早老素多肽的组合物描述的那些。
本文还提供了包含连接至抗体的可检测(例如诊断)性或治疗性试剂的缀合物。此类试剂的实例在上面给出。在体外或体内方法中使用该缀合物。还可以在测定法中使用本公开的抗体，以体外或体内检测本公开多肽或片段的存在。该抗体还可用在通过免疫亲和层析纯化本公开的多肽或片段中。
合理药物设计的目标是产生目的生物活性多肽或者与它们相互作用的小分子例如抑制剂、激动剂、拮抗剂等等的结构类似物。这些实例中任一个可以用于形成为多肽的更有效或稳定形式的药物或者体内增强多肽功能或者干扰多肽功能的药物(HodgsonJ.，1991，Biotechnology9：19-21，通过引用并入本文)。在一个方法中，目的多肽或者多肽-抑制剂复合体的三维结构通过x-射线晶体学、通过核磁共振或者通过计算机同源性建模、或者最有代表性地通过这些方法的组合确定。必须确定多肽的形状和电荷以解释多肽的结构和确定一个或多个活性位点。较少情况下，关于多肽结构的有用信息可通过基于同源多肽结构的建模得到。在这两种情况中，有关的结构信息用于设计类似的早老素-样分子，鉴定有效的抑制剂或者鉴定会结合本公开早老素的小分子。合理药物设计的有用实例将包括具有改善活性或稳定性的分子，如BraxtonS和WellsJA(1992，Biochemistry31：7796-7801)中所示，或者充当天然肽的抑制剂、激动剂或拮抗剂的分子，如AthaudaSB等(1993，JBiochem113：742-746)中所示，该两篇文献通过引用并入本文。本公开还包括，在分子建模软件系统中使用早老素-1多肽结构信息以辅助抑制剂设计和抑制剂-早老素-1多肽相互作用。本公开的特定方法包括分析本公开早老素多肽的三维结构中可能的作用物结合位点，合成整合了预测的活性位点的新分子，和测定该新分子，如本文所进一步描述。
还可以分离通过功能测定法选择的靶特异性抗体，如本文所进一步描述，然后解析其晶体结构。该方法原则上得到药效团，随后可以基于药效团设计药物。通过产生抗功能性药理学活性抗体的抗独特型抗体(抗-ids)可以完全绕过多肽晶体学。作为镜像的镜像，可以预期抗-ids的结合位点是最初受体的类似物。然后，抗-id抗体可用于从化学性或生物性产生的肽库中鉴定和分离肽。然后所分离的肽可充当药效团。
本公开的多肽和肽还可用作将与其连接的试剂递送至携带所鉴定结合配偶体的细胞的载体。因此，在体外或体内方法中，该多肽可以用于递送诊断性或者治疗性试剂至此类细胞(或者在细胞表面上表达结合配偶体的其它细胞类型)。可与多肽连接的可检测(诊断性)和治疗性试剂包括，但不限于，毒素、其它细胞毒性试剂、药物、放射性核素、生色团、催化比色或者荧光反应的酶，等等，其中具体的试剂根据预期应用选择。毒素有蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A、核糖体失活性多肽、真菌毒素例如单端孢菌毒素、及其衍生物和片段(例如单链)。适于诊断用途的放射性核素包括，但不限于，123I、131I、99mTc、111In和76Br。适于治疗用途的放射性核素实例是131I、211At、77Br、186Re、188Re、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu和67Cu。此类试剂可以通过任何适宜的常规方法连接至多肽。例如，多肽包含可以与目的试剂上的官能团反应形成共价键的氨基酸侧链上的官能团。备选地，可将多肽或试剂衍生化以产生或者附着目的活性官能团。衍生化可包括将可用于附着不同分子的一种双功能偶联试剂附着至多肽(PierceChemicalCompany，Rockford，Ill.)。用于放射性标记多肽的许多技术是已知的。例如，可以通过使用适宜的双功能螯合剂将放射性核素金属附着至多肽。因此，制备包含多肽和适宜的诊断性或治疗性试剂的缀合物(优选共价连接)。该缀合物以适合于特定应用的量施用或者使用。
通过本文所提供方法鉴定的试剂和本公开的肽可以治疗性或预防性施用以治疗与淀粉样蛋白原纤维形成、聚集或沉积相关的疾病，而不管临床情况如何。本公开的化合物可使用任何下列机制调节淀粉样蛋白相关疾病的病程，例如但不限于：减慢淀粉样蛋白原纤维形成或沉积速度；减少淀粉样蛋白沉积程度；抑制、减少或者防止淀粉样蛋白原纤维形成；抑制淀粉样蛋白诱导的炎症；增强淀粉样蛋白从例如脑中的清除；或者保护细胞不受淀粉样蛋白(寡聚物或原纤维)诱导的毒性。
“调节”淀粉样蛋白沉积包括抑制，如上面所定义，和增强淀粉样蛋白沉积或原纤维形成。因此术语“调节着”旨在包括防止或者停止淀粉样蛋白形成或积累，抑制或者减慢具有进行性淀粉状变性，例如已经具有淀粉样蛋白聚集的受试者中的进一步的淀粉样蛋白聚集，和减少或者逆转具有进行性淀粉状变性的受试者中的淀粉样蛋白聚集；和增强淀粉样蛋白沉积，例如增加体内或体外淀粉样蛋白沉积的速度或量。淀粉样蛋白增强性化合物可以在淀粉状变性动物模型中用于例如在较短的时间阶段内动物中发生淀粉样蛋白沉积或者在选择的时间段内增加淀粉样蛋白沉积。淀粉样蛋白增强性化合物可在筛选测定法中用于筛选抑制体内淀粉状变性的化合物，例如在用于淀粉状变性的动物模型中、细胞测定法中和体外测定法中。可以使用此类化合物例如提供更快或者更敏感的用于化合物的测定法中。在一些情况下，淀粉样蛋白增强性化合物还可以用于治疗目的施用，例如增强淀粉样蛋白在腔内沉积，而不是在大脑血管壁上，以预防CAA。测定相对于未治疗受试者或者相对于治疗前的治疗受试者的淀粉样蛋白聚集的调节。
“抑制”淀粉样蛋白沉积包括防止或者停止淀粉样蛋白形成，例如原纤维发生，可溶性Aβ从脑中的清除，抑制或减慢具有淀粉状变性，例如已经具有淀粉样蛋白沉积的受试者中进一步的淀粉样蛋白沉积，和减少或者逆转具有进行性淀粉状变性的受试者中的淀粉样蛋白原纤维发生或者沉积。测定相对于未治疗受试者或者相对于治疗前的治疗受试者的淀粉样蛋白沉积的抑制，或者，例如通过临床可测量的改善确定，例如或者在具有脑淀粉状变性的受试者，如阿尔茨海默病或者脑淀粉样蛋白血管病受试者情况下稳定认知功能或者防止认知功能进一步降低(即防止、减慢或者停止疾病进展)或者改善参数，例如CSF中Aβ或tau浓度。
如本文所使用，“治疗”受试者包括，为了治疗、治愈、缓解、减轻、矫正、改进、改善或影响疾病或状况、疾病或状况的症状、或者疾病或状况危险(或易感性)的目的，向具有淀粉样蛋白-β相关疾病或状况、具有此类疾病或状况的症状、或者处于此类疾病或状况危险中(或对其易感)的受试者应用或施用包含通过本公开方法所鉴定试剂的组合物，或者向来自所述受试者的细胞或组织应用或施用本公开的组合物。术语“治疗”指在治疗或改善损伤、病理学或病症中的任何成功迹象，包括任何客观的或主观的参数，例如减轻；缓和；症状减少或者使受试者对损伤、病理学或者病症更耐受；减慢变性或减退的速度；使变性终点更弱；改善受试者的身体或精神健康；或者在一些情况中预防痴呆发作。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查或者精神病学评价结果。例如，本公开的方法通过减慢认知减退的速度或程度成功治疗了受试者的痴呆。
虽然在老年群体中发现大多数的痴呆是家族性或者散发型阿尔茨海默病，但是也发现其它类型的痴呆。这包括但不限于：与尼克病(pick’sdisease)相关的额颞变性，血管性痴呆、Lewy体型老年痴呆、具有额叶萎缩的帕金森病痴呆、进行性的核上性麻痹和皮质基底核退化症和唐氏综合征相关的阿尔茨海默病。在海绵样脑病例如CJD、瘙痒症和BSE中还观察到斑块形成。本公开涉及此类神经变性疾病的治疗，特别是涉及神经毒蛋白斑块，例如淀粉样蛋白斑块的那些。
唐氏综合征是严重的人疾病，在800个活产婴中发生1例。其与受累个体中存在额外拷贝的21号染色体(21三体)有关。β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-APP)基因由21号染色体编码，非常接近于唐氏综合征基因座。如果具有唐氏综合征的所有患者存活超过40岁，则在他们发生阿尔茨海默样痴呆和脑中Aβ沉积。因此这是提出Aβ过量产生与AD和唐氏综合征中痴呆发生直接相关的很好的理由。因此，用于改善AD症状的治疗试剂的性质特征也可用于改善唐氏综合征的症状。
“痴呆”指由于机体或者心理因素引起的总体精神衰退；特征为定向障碍、受损的记忆、判断力和智力、以及浅的情感不稳。本文中的痴呆包括血管性痴呆、缺血血管性痴呆(IVD)、额颞痴呆(FTD)、Lewy体痴呆、阿尔茨海默痴呆等。在老年人中最常见的痴呆类型是阿尔茨海默病(AD)。
在本文中用作症状的表述“轻微-中等”或者“早期”AD是指没有进展并且其中疾病体征或症状不严重的AD。具有轻微-中等或早期AD的受试者可由熟练的神经病学家或者临床医生辨别出来。在一个实施方案中，使用简易精神状态量表(MMSE)可辨别具有轻微-中等AD的受试者。在本文中，“中等-严重”或者“晚期”AD指进展的并且疾病体征或症状显著的AD。此类受试者可以由熟练的神经病学家或临床医师辨别出。具有该种形式AD的受试者将不再对使用胆碱酯酶抑制剂的治疗发生响应，并且会具有显著降低的乙酰胆碱水平。在一个实施方案中，具有中等-严重AD的受试者使用简易精神状态量表(MMSE)辨别出。“家族性AD”是由遗传缺陷引起的遗传形式的AD。AD或痴呆的“症状”是受试者所经历的并且预示着AD或痴呆的任何病态现象或结构、功能或感觉背离正常。
试剂可以治疗性或者预防性施用以治疗与淀粉样蛋白原纤维形成、聚集或沉积相关的疾病。本公开的试剂可以用于改善原纤维形成进程；抑制由淀粉样蛋白-β诱导的神经变性或者细胞毒性；抑制淀粉样蛋白-β诱导的炎症；增强淀粉样蛋白-β从脑中的清除；或者有利于更多地分解代谢Aβ。
试剂可以通过直接作用于脑Aβ，例如通过维持它为非原纤维形式或者有利于它从脑中清除而有效地控制淀粉样蛋白-β沉积。化合物可减慢APP的加工处理；可增强巨噬细胞或者神经元细胞对Aβ原纤维的降解；或者可降低活化的小胶质细胞对Aβ的产生。这些试剂还可防止脑中的Aβ与细胞表面相互作用并且因此防止神经毒性、神经变性或者炎症。
通过本文所提供方法鉴定的试剂可以用于治疗阿尔茨海默病(例如散发的或者家族性AD)。试剂还可以用于预防性或者治疗性治疗例如唐氏综合征个体和具有脑淀粉样蛋白血管障碍(“CAA”)、遗传性脑出血或者早期阿尔茨海默病患者中的淀粉样蛋白-β沉积的其它临床事件。
试剂还可用于治疗轻度认知损害。轻度认知损害(“MCI”)是特征为思考能力轻度但可检测损害状态的病症，其不必然与痴呆的存在相关。MCI经常，单不必然在阿尔茨海默病之前。
另外，APP和淀粉样蛋白-β蛋白在肌肉纤维中的异常积累已经涉及到散发性包涵体肌炎(IBM)病理学(Askanas，V.等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：1314-1319；Askanas，V.等，(1995)CurrentOpinioninRheumatology7：486-496)。因此，通过本文所提供的方法鉴定的试剂可用于预防性或治疗性治疗其中淀粉样蛋白-β蛋白异常沉积在非-神经学部位的病症，例如通过向肌肉纤维递送化合物治疗EBM。
另外，还已经显示Aβ与称作玻璃膜疣的异常细胞外沉积有关，在具有年龄相关黄斑变性(ARMD)个体中其沿着视网膜色素上皮基底面积累。ARMD是老年个体中不可逆视觉丧失的原因。据信，Aβ沉积将是促成视网膜色素上皮萎缩、玻璃膜疣生物发生和ARMD病理发生的局部炎症事件的重要成分(Johnson，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(18)，11830-5(2002))。
因此，本公开通常涉及治疗或者预防受试者(优选人)中淀粉样蛋白相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗量的通过本文所述方法鉴定的试剂或化合物，以致于淀粉样蛋白原纤维形成或者沉积、神经变性或者细胞毒性被降低或者抑制。在一个实施方案中，本公开涉及治疗或者预防受试者(优选人)中淀粉样蛋白相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗量的通过本文所述方法鉴定的化合物，以致于具有脑淀粉状变性，例如阿尔茨海默病、唐氏综合征或者脑淀粉样蛋白血管障碍的患者中认知功能被改善或者稳定或者认知功能的进一步衰退被阻止、减慢或者停止。
此外，本公开涉及包含用于治疗淀粉样蛋白相关疾病的试剂的药物组合物，以及制造此类药物组合物的方法。
通常，通过本文所提供方法鉴定的试剂可以通过技术人员已知的任何方法制备。本公开的试剂可以以具有合适溶剂的溶液提供或者以无溶剂形式提供(例如冻干的)。在本公开的另一个方面中，对于进行本公开方法所必需的试剂和缓冲液可以包装为试剂盒。试剂盒可以根据本文所述方法商业性使用并且可以包括用于本公开方法中使用说明书。另外的试剂盒成分可包括酸、碱、缓冲剂、无机盐、溶剂、抗氧化剂、防腐剂或者金属螯合剂。另外的试剂盒成分作为纯的成分存在，或者作为掺入有一种或更多种另外的试剂盒成分的水溶液或有机溶液存在。任何的或者全部的试剂盒成分还任选包含缓冲液。
治疗剂还可肠胃外、腹膜内、脊柱内或者脑内施用。可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备混悬液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以包含防腐剂以防止微生物生长。
为了通过肠胃外施用之外的途径施用治疗剂，有必要将试剂用阻止其失活的物质包被或者与阻止其失活的物质共施用。例如，治疗剂可以在适宜的载体例如脂质体或者稀释剂中向受试者施用。可药用稀释剂包括盐和水性缓冲液溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等，J.Neuroimmunol.7，27(1984))。
适宜可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当为水可溶性时)或分散液以及用于临时制备无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且必须是存在可容易注射程度的流体。它必须是在制造和储存条件下稳定的并且必须进行防腐处理以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
适宜的可药用载体包括但不限于适用于经口、肠胃外、鼻、粘膜、经皮、血管内(IV)、动脉内(IA)、肌内(IM)和皮下(SC)施用途径的任何非免疫原性药物佐剂，例如磷酸缓冲盐(PBS)。
载体可以是溶剂或分散媒介物，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、它们的适宜混合物和植物油。可以通过使用包被例如卵磷脂、通过维持所需要的颗粒大小(在分散剂的情况下)和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等实现。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇例如甘露醇和山梨糖醇将更好。延长可注射组合物的吸收可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶实现。
无菌可注射溶液可如下制备，即将适当溶剂中的所需量治疗试剂与所需要的上述成分中一种或组合混合，然后过滤除菌。通常，分散剂通过将治疗试剂混合入无菌载体中制备，其中所述无菌载体包含基本的分散媒介物和需要的来自上面所列举的其他成分。以用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂为例，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这样可获得活性成分(即治疗试剂)加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外预期成分的粉剂。
治疗试剂可以经口施用，例如，与惰性稀释剂或可同化的可食载体一起。治疗试剂和其他成分还可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制在片剂中或者直接掺入到受试者食物中。对于口服治疗施用，治疗试剂可以与赋形剂混合并且以可吸收片剂、颊含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片等等形式使用。当然，治疗试剂在组合物和制剂中的百分数是可变的。治疗试剂在此类治疗用途组合物中的量如此，以致于将得到适宜的剂量。
特别有利的是配制成容易施用和剂量均一的单位剂量形式的肠胃外组合物。如本文所使用，剂量形式指适宜作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理不连续单位；每一单位包含经计算产生预期治疗效果的预定量的治疗试剂以及与之结合的所需要的药物载体。对于本发明的剂量单位形式的规格决定于并直接依赖于(a)治疗试剂的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)本领域中将用于治疗受试者中淀粉样蛋白沉积的此类治疗试剂进行复配的固有限制。
因此本公开包括用于气溶胶、经口和肠胃外施用的药物制剂，所述药物制剂包含在可药用载体中的通过本文所述方法鉴定的试剂，包括其可药用盐。同样，本公开包括已经冻干并且可以重构形成如通过静脉内、肌内或皮下注射施用的可药用制剂的此类试剂，或其盐。施用还可以是真皮内或者经皮。
根据本公开，试剂及其可药用盐可以作为固体经口或者经过吸入施用，或者可以作为溶液、混悬液或者乳状液肌内或静脉内施用。备选地，试剂或盐还可以作为脂质体混悬液通过吸入、静脉内或者肌内施用。
还提供适宜作为气溶胶、通过吸入施用的药物制剂。这些制剂包括目的试剂或其盐的溶液或混悬液，或者试剂或盐的多种固体微粒。目的制剂可以置于小的室中并雾化。雾化可以通过压缩空气或者通过超声能量实现，以形成包含试剂或盐的多种液滴或固体微粒。液滴或者固体微粒具有大约0.5至大约5微米的范围的粒度。固体微粒可以通过以本领域已知的任何适宜方式，例如通过微粉化，处理固体试剂或其盐得到。固体微粒或微滴大小可以是，例如，从大约1至大约2微米。在该方面中，商业化的喷雾器是可利用的以实现该目的。对于鼻内递送，微滴大小有代表性地从10至大约20微米或者更大。
适用于作为气溶胶施用的药物制剂可以是液体形式，制剂可在包含水的载体中包含水溶性试剂或其盐。可存在表面活性剂，当进行雾化时，表面活性剂使制剂的表面张力降低足以导致形成目的大小范围内的微滴。
口服组合物还包括液体溶液、乳状液、混悬液等等。适宜制备此类组合物的可药用载体是本领域众所周知的。用于糖浆剂、酏剂、乳状液和悬浮液的有代表性的载体成分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于混悬剂，有代表性的助悬剂包括甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠、西黄蓍胶和藻酸钠；有代表性的湿润剂包括卵磷脂和聚山梨酯80；并且有代表性的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。口服液体组合物还可包含一种或更多种成分例如上面所公开的增甜剂、调味剂和着色剂。
药物组合物还可以通过常规方法有代表性地以pH或者时间依赖性的包衣包被，以致于本公开试剂在接近目的局部应用的胃肠道中释放，或者在不同时间释放以延长目的作用。此类剂量形式有代表性地包括，但不限于，一种或更多种邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸聚乙烯乙酸酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、蜡和虫胶。
用于将本公开试剂达到全身递送的其他组合物包括舌下、颊和鼻剂量形式。此类组合物有代表性地包含一种或更多种可溶性的填充物质例如蔗糖、山梨糖醇和甘露醇；和粘合剂例如阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。还可以包括上面公开的助流剂、润滑剂、增甜剂、着色剂、抗氧化剂和调味剂。
本公开的组合物还可以向受试者局部施用，例如通过将组合物直接置于或者撒于受试者表皮或者上皮组织上，或者通过“贴片”透皮施用。此类组合物包括，例如，洗剂、乳膏剂、溶液、凝胶和固体。这些局部施用组合物可以包含有效量的，通常至少大约0.1％，或者甚至从大约1％至大约5％的本公开试剂。用于局部施用的适宜载体有代表性地仍然作为连续的膜置于皮肤上，并且排汗和浸水不能去除。通常，载体的本质是有机的并且能够使治疗试剂分散或者溶解于其中。载体可包括可药用润滑剂、乳化剂、增稠剂、溶剂等等。
如上面所述以及下面实施例所进一步描述，本公开支持了，β-APP递呈细胞和PS递呈细胞之间的特异性附着具有不同的生理后果，一个是与这些蛋白质的正常功能相关的跨细胞(并邻分泌)信号传导过程，并且最后的其它结果是β-APP的蛋白水解形成Aβ，导致阿尔茨海默病病理学。
G蛋白偶联受体(GPCRs)享有共同的结构基序。通常，GPCRs具有七个22至24个疏水氨基酸之间的序列，形成7个α螺旋，每一个螺旋跨过细胞膜。跨膜螺旋通过在细胞膜外部或者“胞外”侧的、在跨膜-2和跨膜-3之间，跨膜-4和跨膜-5之间，跨膜6和跨膜-7之间的氨基酸链连接(它们分别被称为“胞外”区1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))。跨膜螺旋还通过在细胞膜内部或者“胞内”侧的、在跨膜-1和跨膜-2之间，跨膜-3和跨膜-4之间以及跨膜-5和跨膜-6之间的氨基酸链连接(它们分别被称为“胞内”区1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。受体的“羧基”(“C”)末端位于细胞内的胞内间隙中，并且受体的“氨基”(“N”)末端位于细胞外面的胞外间隙中。
通常，当配体与受体结合时(常称为受体的“活化”)，细胞内区的构象发生改变，使得细胞内区与细胞内“G蛋白”之间偶联。已经报导，GPCRs就G蛋白而论是“泛宿主性的”，即GPCR可以与一种以上G蛋白相互作用。见Kenakin，T.，43LifeSciences1095(1988)。虽然存在其它G蛋白，但是当前已经鉴定的G蛋白是Gq、Gs、Gi、Gz和Go。内源配体活化的GPCR与G蛋白的偶联开始了信号级联过程(被称为“信号转导”)。在正常情况下，信号转导最终导致细胞活化或细胞抑制。据认为，受体的IC-3环以及羧基末端与G蛋白相互作用。
受体活化的G蛋白结合至细胞膜的内表面。它们由Gα和紧密结合的Gβγ亚基组成。当配体活化G蛋白偶联的受体时，其诱导受体构象改变(形状变化)，使得G蛋白此时结合至受体。然后G蛋白从Gα亚基释放其结合的GDP，并且结合新的GTP分子。这种交换触发了Gα亚基、Gβγ二聚体和受体的分离。然后，Gα-GTP和Gβγ均可以活化不同的信号级联(或者第二信使途径)和效应蛋白，同时受体能够活化下一个G蛋白。Gα亚基最终会通过其固有的酶活性将连接的GTP水解成GDP，使其能够与Gβγ再结合并开始新的循环。
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Go(对于其它为“o”)的α亚基介导不同受体和效应子之间的信号传导。已经从脑组织库中分离了两种形式的Goα亚基。这两种形式即GoAα和GoBα(也被称为GoA和GoB)是可变剪接的产物。GoAα转录物存在于多种组织中，但是在脑中最丰富。GoBα转录物在脑和睾丸中表达水平最高。
GPCRs包括人基因组中最大基因家族之一，并且介导由神经递质、激素、趋化因子和许多其它分子调节的极大种类的细胞功能。GPCR信号的适时解偶联是维持GPCR介导的生理功能适当性和完整性的关键。这种解偶联主要由小得多的基因家族，当前有7个成员的GPCR激酶(GRKs)介导。较少GRK成员调节巨大数量GPCRs的特异性以激动剂依赖性方式控制。也就是说，GRKs优先结合并磷酸化被激动剂占据的GPCRs以将受体与相应的G蛋白解偶联，这是一个称作同源脱敏的过程。基于结构相似性，7个已知的GRK成员归为4个亚家族(GRK1、GRK2/3、GRK4/5/6和GRK7)，其中GRK2/3和GRK5/6遍在分布，包括在脑中。GRK2的失调，有可能还有GRK5的失调，已经牵涉到慢性心力衰竭、心肌缺血和高血压、以及其他心血管病症的病理发生，在其中已经广泛研究了GRKs。GRK1不能对视紫红质信号传导脱敏可以导致感光细胞死亡，并且据信促成了色素性视网膜炎。此外，提高的GRK2水平已经与阿片成瘾联系在一起。除了这些之外，然而，GRKs在与GPCR脱调节相关的许多其他病理状况例如AD中的作用事实上仍然没有研究。
由于GPCRs定位在膜上，GRK保留在质膜上或者胞质中完全影响了其接近和结合GPCRs。在静止细胞中，GRK4亚家族成员(包括GRK4/5/6)与质膜紧密结合，而GRK2亚家族成员(GRK2/3)主要在胞质中并且当细胞被GPCR激动剂刺激时转位到细胞膜。然而，在活化细胞中，GRKs的亚细胞定位似乎由细胞膜相对胞质中GRK结合因子的含量和容量决定。磷脂，特别是磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸盐似乎在GRKs粘附至细胞膜并结合GPCRs中起作用，而磷脂酰丝氨酸也增强GRK2结合至细胞膜上的GPCRs。在另一方面，钙/钙调蛋白和其它钙结合蛋白，以及激动蛋白，辅肌动蛋白等等会促进GRKs离开进入胞质中并抑制GRKs与GPCRs的结合。
在AD脑中，明显的细胞膜改变、异常磷酸肌醇代谢、破坏的钙稳态和瓦解的细胞骨架蛋白均将影响GRKs的亚细胞分布。此外，已经证明，对于AD病理发生重要的疏水肽β-淀粉样蛋白的增加会降低细胞膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸盐和增加[Ca2+]i。
本公开部分地基于这样的证明，即早老素作为一种类型的G蛋白偶联受体(GPCRs)起作用，产生次级的信息发生和下游效应。对于PS-1和PS-2为7-TM结构(类似视紫红质结构)的证据引起了检查PS-1和PS-2是否属于G蛋白偶联受体超家族蛋白，实际上所有的G蛋白偶联受体超家族蛋白享有基本相似的结构。虽然PS没有表现出与目前检查的大约1,000个GPCR中的任何一个具有任何本质的氨基酸同源性，所有这些GPCR为7-TM整合蛋白，其中许多GPCR表现出与任何其他GPCR没有序列同源性的事实使得也有可能PS分子也是GPCRs。
使用N141I-PS-2突变鉴定了早老素的GPCR活性。与VolgaGerman家族中FAD连锁的突变以百日咳毒素(PTx)敏感方式引起PC-12细胞死亡。其它研究表明，在PS-1的39个氨基酸残基羧基末端结构域中(在几乎所有的细胞膜中的PS-1拓扑形态模型中其位于细胞质中)，存在对脑Go蛋白质的特异性结合和调节结构域。体外结合Go的该PS-1结构域还显示与两个其它GPCR蛋白，D2-多巴胺能和5HT-1B受体，以及G蛋白活化的寡肽肥大脱粒肽的G-结合结构域具有一些局部氨基酸序列同源性。PS-1作为功能性GPCR的可能性在本文中进一步描述。
本公开证明了G蛋白Go结合全长PS-1，并且被百日咳毒素(PTx)抑制。此外，仅GoA结合PS-1，而GoB不结合。以无尾的PS-1构建体转染ES裸细胞证明，大多数的结合发生在PS-1的羧基末端尾。然而，这些结果表明，其它细胞质环区可能参与结合，因为在无尾PS-1存在下发生极少量的结合。本发明还证明，G蛋白不但结合PS-1，而且还结合PS-2，并且对于PS-2而言，除了结合GoA之外，GoB也结合完整PS-2。当用无尾PS-2代替全长PS-2时，该结合仍然存在。这些结果表明，GoB结合PS-2的细胞质结构域，而不是C-尾。35S-GTPγS-标记的GαoA(而不是GαoB)与PS-1的结合增加超过700％。对于PS-2具有相似的增加，即超过35S-GTPγS-标记的GαoA结合的基础水平增加大于700％，以及在35S-GTPγS-标记的GαoB中增加～300％。用PTx处理抑制了35S-GTPγS向GoA和GoB中的掺入。
因此，GoA以相似的程度结合PS-1和PS-2，而GoB与PS-2的结合少于在相同试验条件下对于GoA所观察到的一半。数据证实了G蛋白与PS-1和PS-2偶联的功能性结果并且进一步表征了两个早老素蛋白作为G蛋白偶联受体(GPCRs)。
PS-1和PS-2与家族“3”GPCRs(如上所述)似乎具有比与其它两个家族更多的共同特征-均具有大的细胞外结构域(N-末端的，和TMVI和VII之间的亲水环)，这是家族3GPCRs的特征。家族3GPCRs中的配体结合似乎通过细胞外结构域，通常为氨基末端结构域排他性地发生。PS-1或PS-2的N-末端结构域足以使PS-1或PS-2在体外分别结合β-APP，β-APP是早老素GPCR活化的建议的配体和可能的激动剂。一些家族3成员通常通过细胞外Cys残基的二硫键形成同型二聚体。众所周知，PS-1和PS-2作为二聚体存在于细胞膜上。此外，它们均在细胞外结构域中具有Cys残基(7-TM结构)。家族3GPCRs均具有作为最短环的第三个细胞内环并且这在每一类型中是保守的。同样，在PS-1和PS-2中的第三个细胞内环是最短的环，由序列KYLPEW组成(SEQIDNO：2的从氨基酸239至243和SEQIDNO：4的从氨基酸245至250)，该序列是完全保守的。家族3GPCRs的一些成员通过它们的羧基末端PDZ结合结构域与细胞内PDZ结构域蛋白质例如Homer直接相互作用。在PS-1的羧基末端尾中存在PDZ结合结构域，已经证明其结合数个PDZ蛋白质。
PS可表达于细胞表面上并且具有7-TM结构，并且PS-1和PS-2参与与β-APP的特异性细胞-细胞相互作用；这种β-APP：PS介导的细胞间相互作用导致酪氨酸激酶活性短暂升高和蛋白质酪氨酸磷酸化。此外，β-APP：PS介导的细胞-细胞相互作用是至少大部分的Aβ产生所必需的。由于蛋白质酪氨酸激酶和G蛋白信号传导途径之间的交叉通讯，β-APP和PS的细胞间相互作用活化了G蛋白与PS的结合。
由于本公开证明了Go被PS活化最终影响Aβ产生，因此本公开在一个方面提供了使用适当设计的PS-Go特异性结合的抑制剂对AD的药物治疗。
如本文所述，进行实验检测此种可能的细胞间蛋白质酪氨酸磷酸化信号传导事件。已经证明，当培养的以β-APP瞬时转染的DAMI(人原巨核细胞)细胞，与以PS-1或PS-2转染的DAMI细胞混合时，显示在混合后数分钟内细胞提取物中，蛋白质酪氨酸激酶活性和蛋白质底物的磷酸酪氨酸(PTyr)修饰显著性的瞬时增加，这在对照中或者在包含β-APP：PS结合特异性抑制剂的细胞混合物中没有出现。该信号传导的下游后果依赖于是PS-1还是PS-2与β-APP发生细胞间结合而不同，因为显示酪氨酸磷酸化作用增强的蛋白质范围在两类中完全不同，表明在两个接近的同源性PS蛋白质的生物化学功能之间，而不是冗余度之间存在差异。
此外，本公开通过使用在对照实验中未转染的，或者以β-APP转染的来源于PS-1-/-，PS-2-/-双缺失小鼠的胚胎干细胞(ES)，在本文中称为ES双缺失细胞，证明了上述的生物学途径。在后者中，β-APP转染的ES细胞与或者PS-1转染的或者PS-2转染的DAMI细胞混合；DAMI细胞在其表面上没有表达明显量的内源β-APP。因此，在这种混合的细胞培养体系中，β-APP转染的ES双缺失细胞担当细胞表面表达的β-APP的唯一来源，而PS转染的DAMI细胞是细胞表面表达的PS的唯一来源。如果在该系统中发生β-APP：PS特异性信号事件，它是两个细胞类型之间的并邻分泌相互作用的结果。本公开证明了恰是此种相互作用。
提供了信号传导通过Src家族酪氨酸激酶活性瞬时提高而实现的证据，并且已经鉴定了介导β-APP和PS-1之间细胞间信号传导的Src家族成员是pp60c-src。与之相反，β-APP：PS-2信号传导涉及Src家族成员Lyn。这些信号传导事件影响正常的生理学。例如，它们可在β-APP缺失小鼠发育中遇到的生理缺陷中起作用。Src家族激酶牵涉到癌症、免疫系统功能障碍和骨重建疾病。对于一般综述，见Thomas和Brugge，Annu.Rev.CellDev.Biol.1997，13，513；Lawrence和Niu，Pharmacol.Ther.1998，77，81；Tatosyan和Mizenina，Biochemistry(Moscow)2000，65，49-58；Boschelli等，DrugsoftheFuture2000，25(7)，717。
Src家族成员包括下列的哺乳动物中的8个激酶：Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck和Blk。存在分子量范围从52至62kD的非受体蛋白激酶。它们的特征为具有由6个不同的功能结构域组成的共同结构组织：Src同源结构域4(SH4)，独特结构域，SH3结构域，SH2结构域，催化结构域(SH1)，和C-末端调节区。Tatosyan等，Biochemistry(Moscow)2000，65，49-58。基于公开的研究，认为Src激酶是多种人疾病的潜在治疗靶标。
GSK-3活性也与阿尔茨海默病有关。该疾病的特征为众所周知的β-淀粉样蛋白肽的存在和细胞内神经原纤维缠结的形成。神经原纤维缠结包含超磷酸化的Tau蛋白，其中Tau在异常位置上被磷酸化。在细胞和动物模型中已经证明GSK-3磷酸化这些异常位点。此外，已经证明对GSK-3的抑制阻止了细胞中Tau的超磷酸化。在过表达GSK3的转基因小鼠中，观察到显著增加的Tau超磷酸化和神经元的异常形态。活化的GSK3在缠结前期神经元的细胞质中积累，这会导致AD患者脑中神经原纤维缠结。对GSK-3的抑制减慢或者停止了神经原纤维缠结的产生并且因此治疗或降低阿尔茨海默病的严重性。GSK-3在阿尔茨海默病中起作用的证据已经在体外证明(见例如Aplin等，(1996)，JNeurochem67：699；Sun等，(2002)，NeurosciLett321：61；Takashima等，(1998)，PNAS95：9637；Kirschenbaum等(2001)，JBiolChem276：7366；Takashima等.(1998)，NeurosciRes31：317；Takashima等，(1993)，PNAS90：7789；Suhara等，(2003)，NeurobiolAging.24：437；DeFerrari等，(2003)MolPsychiatry8：195；和Pigino等，JNeurosci，23：4499，2003)。GSK-3在阿尔茨海默病中起作用的证据已经在体内证明(见例如Yamaguchi等.(1996)，ActaNeuropathol92：232；Pei等，(1999)，JNeuropathExpNeurol58：1010；Hernandez等，(2002)，JNeurochem83：1529；DeFerrari等，(2003)MolPsychiatry8：195；McLaurin等，NatureMed，8：1263，2002；和Phiel等，(2003)Nature423：435。
早老素-1和驱动蛋白-1也是GSK-3的底物并且与GSK-3在阿尔茨海默病中起作用的另一机制有关，如Pigino，G.，等，JournalofNeuroscience(23：4499，2003)最近所述。发现GSK3β磷酸化驱动蛋白-1轻链，这导致驱动蛋白-1从膜结合细胞器中释放，导致减少快速顺向轴突运输。PS-1中的突变会失去调节和增加GSK-3活性，这反过来损害神经元的轴突运输。在受累神经元中轴突运输的降低最终导致神经变性。
本公开支持了β-APP递呈细胞与PS递呈细胞之间特异性附着具有不同的生理后果，一个后果是与这些蛋白质的正常功能有关的跨细胞(并邻分泌)信号传导过程，并且另一个后果最终导致β-APP蛋白水解形成Aβ，引起阿尔茨海默病病理学。在该系统中并邻分泌相互作用的证据使用培养的、或者以β-APP，或者以PS-1或PS-2适宜转染的DAMI细胞得到；特异性的β-APP：PS介导的细胞-细胞相互作用导致最有可能一种或者有可能两种附着细胞内的蛋白质酪氨酸激酶活性和蛋白质酪氨酸磷酸化作用快速且短暂升高。之所以采用DAMI细胞是因为这些细胞正常情况下在细胞表面上不表达显著量的内源β-APP，并且因为可以容易地将它们从细胞基质机械性分开。因此，通过以β-APP转染ES双缺失细胞，可以得到表面仅表达有β-APP但没有PS细胞，并且通过以PS-1或PS-2转染DAMI细胞，产生在表面上表达PS蛋白并且无明显β-APP的另外的细胞。
将这些转染细胞混合的实验，如结果所示，显示了β-APP和PS之间的信号传导(图5)，这源于并邻分泌相互作用；即反应涉及一个细胞表面上的膜结合PS和另一个细胞表面上的β-APP。可溶性的β-APP(β-APP的胞外结构域)，和与FLAG融合的PS-1N-末端结构域均特异性地抑制该相互作用，证明了β-APP与PS相互作用的双特异性。
该信号传导的下游结果依赖于是PS-1还是PS-2与β-APP发生细胞间结合而不同。通过酪氨酸磷酸化修饰的蛋白质范围依赖于是PS-1还是PS-2涉及到与β-APP的特异性细胞间结合而不同。本公开鉴定出c-Src为，当β-APP和PS-1细胞间相互作用时经历主要的磷酸化短暂增加的蛋白质。Src激酶家族成员Lyn似乎是参与PS-2与β-APP细胞间结合的占优势的(或者至少主要的)Src激酶。这些结果加在一起表明了不同的信号传导机制，这会导致对于两个紧密同源的早老素蛋白质产生不同的生理功能，而不是冗余的生理功能。
本公开证明，在β-APP和或者PS-1或者PS-2之间的并邻分泌信号传导导致在两个PS蛋白质之间不同的快速短暂酪氨酸激酶活化。当β-APP分别与PS-1或PS-2结合时，募集C-Src或Lyn。募集反应将表明，在体内在细胞-细胞接触位点处短暂形成信号传导复合体，启动了一连串的导致发育后果的磷酸化事件。对与β-APP：PS-1复合体结合所必需的Src的一个或多个区域的鉴定提供了关于β-APP：PS-1信号传导复合体装配和活化的有价值的信息，并且标明β-APP：PS复合体与激酶之间的相互作用是否是直接的或者间接的。已知β-APP在细胞质酪氨酸残基上不被磷酸化，并且PS-1也是如此，因此通过c-SrcSH2结构域的直接结合是不可能的，因为该结构域仅在磷酸化的酪氨酸残基处结合。
通过Src的SH3结构域可以发生直接结合。SH3结构域识别包含核心P-X-X-P(SEQIDNO：10)的富脯氨酸序列，其中X表示任何氨基酸。配体以两个相反方向中的一个方向识别SH3结合表面。在类型1方向结合的肽符合共有序列R-X-L-P-X-Z-P(SEQIDNO：11)，其中正常情况下Z是疏水的或者Arg残基(Kay等，2000)。有趣的是，PS-1和PS-2均在细胞质羧基末端区具有保守的类型1SH3结合位点(LPALP；见SEQIDNO：2从氨基酸432至436或者SEQIDNO：4从氨基酸413至417))。
抑制GPCR相互作用的许多试剂是本领域已知的。此外，许多激酶(例如c-src、fln等等)抑制剂是本领域已知的并且可以用于本公开方法中。本公开考虑了用于治疗AD或者用于调节记忆功能的包含在可药用载体中的此类试剂的组合物。
特异性的GPCR筛选测定技术是技术人员已知的。例如，一旦使用“通用的”G蛋白偶联受体测定法(例如选择为拮抗剂、激动剂、部分激动剂或者反相激动剂的化合物的测定法)鉴定出候选化合物，可以进行进一步筛选以证实化合物在受体位点相互作用。例如，通过“通用”测定法鉴定的化合物可能不结合受体，而可能仅仅将G蛋白与细胞内结构域“解偶联”。
可通过测定与G蛋白相关的酶测定G蛋白活性。例如，Gs刺激腺苷酸环化酶。另一方面，Gi(和Gz和Go)抑制该酶。腺苷酸环化酶催化ATP转变成cAMP；因此，与Gs蛋白偶联的组成性活化的GPCRs与增加的细胞内cAMP水平有关。另一方面，偶联Gi(或Gz，Go)蛋白的组成性活化的GPCRs与降低的细胞内cAMP水平有关。通常见“IndirectMechanismsofSynapticTransmission”，第8章，FromNeuronToBrain(第3版)Nichols，J.G.等编，SinauerAssociates，Inc.(1992)。因此，检测cAMP的测定法可以用于确定候选化合物是否是例如受体的反相激动剂或拮抗剂(即此种化合物可降低cAMP水平)。本领域已知的用于测量cAMP的多种方法可以采用；最优选的方法依赖于在基于ELISA的模式中使用抗cAMP抗体。可以利用的另一类型的测定法是全细胞第二信使报告基因系统测定法。基因上的启动子驱动特定基因编码的蛋白质表达。环状AMP通过促进与cAMP-反应性DNA结合蛋白或者转录因子(CREB)的结合，然后后者结合至启动子上称作cAMP反应元件的特异性位点并驱动基因表达来驱动基因表达。可以构建其中在报告基因例如β-半乳糖苷酶或萤光素酶之前具有包含多个cAMP反应元件的启动子的报告基因系统。因此，组成性活化的Gs-连接的受体引起cAMP积累，然后后者激活基因和报告蛋白质的表达。然后，报告蛋白质例如半乳糖苷酶或萤光素酶可以使用标准生物化学测定法检测。。
Gq和Go与磷脂酶C的活化有关，反过来磷脂酶C水解磷脂PIP2，释放两个细胞内信使：二酰基甘油(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3积累的增加与Gq-和Go-相关受体的活化有关。通常见“IndirectMechanismsofSynapticTransmission”，第8章，FromNeuronToBrain(第3版)Nichols，J.G.等编，SinauerAssociates，Inc.(1992)。检测IP3积累的测定法可以用于确定候选化合物是否是例如Gq-或Go-相关受体的反相激动剂(即此种化合物会降低IP3的水平)。还可以使用其中Gq-依赖性磷脂酶C引起包含AP1元件的基因活化的AP1报告基因测定法测定Gq-相关受体；因此，活化的Gq-相关受体会显示此类基因表达增加，由此它们的反相激动剂/拮抗剂会显示此种表达降低，并且激动剂会显示此种表达增加。用于此种测定的商业可得的测定法是可用的。
类似地，与PS-1、PS-2和/或β-APP的细胞外结构域相互作用和阻止它们的天然细胞间相互作用的试剂或测试化合物或者药物候选物可以用于治疗阿尔茨海默病和/或降低Aβ产生。G蛋白活化和Aβ产生均被β-APP：PS细胞间相互作用的特异性抑制所抑制。在共培养中Go活化的抑制剂百日咳毒素的存在抑制G蛋白活化和Aβ产生。证明了在β-APP：PS-1细胞间相互作用之后的G蛋白活化处在Aβ从β-APP产生的途径上。这些结果支持了PS在G蛋白信号传导中的直接作用并且可提供用于开发用于AD的药物候选物的新途径。
如本文所述，早老素β-APP结合结构域指结合β-APP细胞外结构域的天然存在的或者合成的，例如蛋白质、寡肽(例如长度从大约5至大约100个氨基酸，有代表性的长度从大约5至50，5-20或者5-15个氨基酸)。
“激动剂”指结合至本公开的多肽或者多核苷酸，刺激、增加、活化、促进、增强活化、致敏或者上调本公开多肽或多核苷酸活性或表达的试剂。
“拮抗剂”指抑制本公开多肽或多核苷酸表达，或者结合、部分或完全阻断刺激、降低、阻止、延缓活化、失活、脱敏或者下调本公开多肽或多核苷酸活性的试剂。
“小的有机分子”指天然存在或者合成的，分子量大于大约50道尔顿并且小于大约2500道尔顿，优选小于大约2000道尔顿，优选在大约100至大约1000道尔顿之间，更优选在大约200至大约500道尔顿之间的有机分子。
“测定功能效应”指测定化合物增加或降低直接或者间接处于早老素影响下的参数，例如测量例如早老素与G蛋白或β-APP相互作用的物理和化学或者表型效应。此类功能效应可通过本领域技术人员已知的任何手段测量，例如分光的(例如荧光、吸光度、折射指数)、流体的(例如形状)、色谱的或者溶解度特性的改变；测量可诱导的标志物或者蛋白质的转录活化；测量结合活性或者结合测定法，例如结合至抗体；测量配体结合亲和性的改变；测量钙内流；测量本公开多肽的酶促产物的积累或者底物的耗竭；酶活性的改变，测量本公开多肽的蛋白质水平的改变；测量RNA稳定性；G蛋白结合；GPCR磷酸化或脱磷酸化；tau磷酸化或脱磷酸化，信号转导，例如受体-配体相互作用，第二信使浓度(例如cAMP、IP3或细胞内Ca2+)；鉴定下游或者报告基因表达(CAT、萤光素酶、β-gal、GFP等等)，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标志物、和配体结合测定法。此外，β-APP与早老素结合和Aβ产生还可以用作对早老素活性的功能效应的判定因素。
下面提供的工作实施例是说明，但不限制本公开。在这些实施例中采用的科学方法的多个参数在下面详细描述并且提供大体上实施本公开的指导。
实施例
实施例1
在pcDNA3中的用于G蛋白GαoA和GαoB的cDNAs购自UMRcDNAResourceCenter，Rolla，MO。在pcDNA3中的全长人PS-1和PS-2cDNAs通过如已经描述的PCR克隆。PS-1和PS-2的无尾构建体在pcDNA3中构建，其中仅仅缺失PS-1或PS-2中最后一个TM结构域之后的细胞质结构域(该构建体包含PS-1的氨基酸1-430和PS-2的氨基酸1-410)。
细胞培养：根据已发表的方案培养ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞。
转染：使用lipofectamine(Invitrogen)方法用15μg全长人PS-1或PS-2的pcDNA构建体和目的G蛋白cDNA瞬时转染ES(PS-1-/-/PS-2-/-)。简言之，lipofectamine-DNA溶液置于室温下30分钟，与足够的无血清培养基混合并加入至细胞中。将细胞在CO2孵箱中于37℃下孵育5小时，此后向培养基中补充血清并且在转染后12-24小时收获细胞。
免疫沉淀：转染后24h，去除培养基，并将细胞刮到200μl提取缓冲液中。使用Smine等的增溶条件(50mMHEPES/NaOH，pH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％TritonX-100，60mM辛基葡糖苷和蛋白酶抑制剂)，通过超声处理制备全细胞提取物。100μg每一提取物用抗PS-1(MAB5232)或PS-2(MA1-754)大环的单克隆抗体免疫沉淀。接着，免疫沉淀的蛋白质在12％SDSPAGE上分离并转移至膜。然后使用抗G蛋白Go抗体(K-20，sc-387来自SantaCruzBiotechnology，亲和纯化的；该多克隆抗体识别GoA和GoB两者)进行Western印迹杂交。
Western印迹杂交：免疫沉淀的蛋白质在加样缓冲液(50mMTris，pH6.8，0.1MDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)中煮沸5分钟，在SDS-PAGE(12％)凝胶上电泳分离，并将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。膜与多克隆抗兔G蛋白一抗孵育，然后与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG孵育。通过化学发光检测膜结合的过氧化物酶活性。
G蛋白Go与PS-1结合：ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞以全长人PS-1cDNA和G蛋白GoA或GoBcDNA(UMRcDNAResourceCenter，Rolla，MO)瞬时转染。转染后24h，使用Smine等的增溶条件(50mMHEPES/NaOH，pH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％TritonX-100，60mM辛基葡糖苷和蛋白酶抑制剂)，通过超声处理制备全细胞提取物。100μg每一提取物用抗7-TM模型中细胞外的大环的单克隆抗体(Mab#5232，Chemicon，其在先前公布的工作中使用)免疫沉淀。接着免疫沉淀的蛋白质在12％SDSPAGE上分离并且转移至膜上。然后使用抗PS-1和Go两者的抗体(K-20，sc-387来自SantaCruzBiotechnology，亲和纯化的；该多克隆抗体识别GoA和GoB两者)进行Western印迹杂交。
G蛋白Go与PS-2的结合：ES(PS-1-/-/PS-2-/-)以全长人PS-2cDNA和G蛋白GoA或GoB的cDNA(UMRcDNAResourceCenter，Rolla，MO)瞬时转染。转染后24h，使用Smine等的增溶条件(50mMHEPES/NaOH，pH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％TritonX-100，60mM辛基葡糖苷和蛋白酶抑制剂)，通过超声处理制备全细胞提取物。100μg每一提取物用PS-2大环的单克隆抗体(MA1-754，来自AffinityBioReagents)免疫沉淀。接着免疫沉淀的蛋白质在12％SDSPAGE上分离并且转移至膜上。然后使用抗PS-2和Go两者的抗体进行Western印迹杂交。
百日咳毒素处理：PTx原体与10mMDTT在37℃下孵育10分钟，将其转变成酶学上活性形式。以PS-1或PS-2和G蛋白cDNAs转染ES细胞后5小时，向在1mMNAD、2mMMgCl2和1mMEDTA存在下的培养基中的细胞加入500ng/ml活化的PTx，并将细胞在5％CO2存在下于37℃孵育12小时。然后收获细胞并如下所述检测[35S]GTPγS掺入。
GTPγS结合：收获细胞并在增溶缓冲液(50mMHEPES/NaOHpH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％Triton-X100，60mM辛基葡糖苷，1×蛋白酶抑制剂混合物)中通过超声处理将蛋白质溶解。100μg的蛋白质与等体积的缓冲液B(50mMHEPES/NaOHpH7.4，40μMGDP，50mMMgCl2，100mMNaCl)在200μl的体积中混合。反应以50nM[35S]GTPγS(1250Ci/mmol)开始并且在室温下孵育60分钟，之后通过加入20μl的10X终止缓冲液(100mMTris-Hcl，pH8，25mMMgCl2，100mMNaCl，20mMGTP)终止反应。然后将样品用抗PS-1环的单克隆抗体(5μl)免疫沉淀。于室温将抗体-蛋白质复合体与蛋白A/G琼脂糖结合90分钟并用洗涤缓冲液1(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，1％TritonX-1001×蛋白酶抑制剂混合物，150mMNaCl和60mM辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)洗涤两次，并且用洗涤缓冲液2(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，0.5％TritonX-100，1×蛋白酶抑制剂混合物和50mMNaCl)和洗涤缓冲液3(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0和1×蛋白酶抑制剂混合物)各洗涤一次。然后将洗涤的琼脂糖珠悬浮于闪烁液体中(CytoScint，ICN)(5ml)并在BeckmanCoulterLS6000SC闪烁计数器中计数3分钟。
当以全长人PS-1和G蛋白GαoA或GαoB的cDNA共转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞的100μg提取物用抗PS-1大亲水环的MAb免疫沉淀，接着用亲和纯化的抗Go多克隆抗体(其识别GoA和GoB两个同种型)进行Western印迹杂交时，仅PS-1/GoA共转染的细胞在～45kDa得到强的Go信号(图1，泳道3)，表明GoA，而不是GoB，结合至PS-1。当相同处理时，未转染的对照细胞或者用PS-1单独转染的细胞在Western印迹上没有显示Go带(图1)。
G蛋白Go结合至PS-1细胞质羧基末端的证实.在pcDNA3中产生PS-1的无尾构建体，其中仅缺失了PS-1最后一个TM结构域之后的细胞质结构域(该构建体包含氨基酸1-430)。该构建体用于转染ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞。已经证明无尾PS-1整合至细胞膜中并且在细胞表面上表达。以与上面对于全长PS-1所述相同的策略，ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞用无尾PS-1和G蛋白GoA或GoB的cDNA转染。然后将细胞提取物用抗PS-1环MAb(#5232)免疫沉淀，在SDSPAGE上分离并用抗Go抗体进行Western印迹。
以无尾PS-1和G蛋白GαoA或GαoB的cDNA共转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞的100μg提取物用抗PS-1大的亲水环的MAb免疫沉淀，接着用亲和纯化的抗Go多克隆抗体(识别GoA和GoB两种同种型)进行Western印迹杂交。检测结合(图1，泳道6)，表明早期鉴定为结合结构域的羧基末端39个氨基酸没有构成PS-1对于GoA的完整结合结构域。GoB显示不结合无尾PS-1(图1，泳道7)。
使用去除了GoA与PS-1的大部分结合的无尾构建体的结果，表明了除了PS-1尾之外的PS-1的另一区域对于一些PS-1：GoA结合具有特异性。它还排除了GoA会结合至可以使用PS-1抗体免疫共沉淀的PS-1β-分泌酶复合体的其它成分的可能性。
进行另外的研究以阐明G蛋白Go与完整PS-2的结合。鉴定为结合结构域的39个氨基酸PS-1C-末端区在PS-2C-末端尾中完全保守。因此，据信PS-2的C-末端结构域还将结合Gαo。与PS-1一样，Go显示与PS-2结合，但是具有明显的差异。识别GoA和GoB两者的Go抗体显示以PS-2和GoA以及PS-2和GoBcDNAs共转染细胞提取物的PS-2免疫共沉淀物的Western印迹上有双联体(doublet)。该双联体可能代表着Go的两种同种型均结合PS-2(图2，泳道2和4)。与之相反，PS-1不结合GoB(图1，泳道4)并且使用相同的Go抗体在Western印迹上仅显示一条带(图1，泳道3)。
研究了G蛋白Go与PS-2细胞质羧基末端的结合。如对于PS-1那样，在pcDNA3中制备PS-2无尾构建体，其中仅缺失PS-2最后一个TM结构域后面的细胞质结构域(该构建体包含氨基酸1-410)。该构建体用于转染ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞并且已经证明整合入细胞膜中并在细胞表面上表达。以与上面对于全长PS-1和PS-2所述相同的策略，ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞用无尾PS-2和G蛋白GoA和GoB的cDNA转染。然后将细胞提取物用抗PS-2环MAb(MA1-754)免疫沉淀，在SDSPAGE上分离并用抗Go抗体进行Western印迹。
当与GoA共表达的无尾PS-2用抗PS-2MAb免疫沉淀并用抗Go抗体进行Western印迹时，如对于PS-1的结果那样，存在条带强度的降低，但是条带没有完全缺失。另一方面，在GoB/PS-2共转染样品中的条带强度对于无尾样品没有改变，表明GoB在细胞内结构域而不是羧基末端尾结合PS-2(图2，泳道3和5)。因此，PS-1和PS-2的差别不仅在于它们所结合的Go同种型，而且还在于PS-1和PS-2上彼此不同源的结合位点。因此，似乎有可能PS-1和PS-2的功能性研究会得到完全不同的结果；即，PS-1和PS-2不仅仅是功能上冗余的蛋白质。
另外进行了PS介导的GαoA和GαoBPS-1以及G蛋白GoA和GoB的功能性活化的研究。先前研究使用GTP水解和GTPγS结合作为数个独立方法之一评价Go与PS-1羧基末端的结合。然而，他们使用PS-1C-末端残基429-467的合成肽连同三个对照肽进行该测定法。另一方面，该方法通过测定细胞提取物中35S-GTPγS的掺入评价了共转染细胞中G蛋白GoA和GoB与完整PS-1和PS-2的结合的功能后果。
共转染PS-1和G蛋白GoAcDNAs的ES细胞提取物中35S-GTPγS的掺入显示的数值超过从未转染对照ES(PS-/-)细胞得到的数值的700％(图3，柱2)。当以PS-1和GoAcDNAs转染的细胞首先用PTx处理时没有见到这种增加(图3，柱3)，显示在毒素存在下存在对功能的抑制。另一方面，以PS-1和GoBcDNAs转染的细胞没有显示35S-GTPγS的掺入(图3，柱4)，这与先前GoB与PS-1不结合的结果一致。
如PS-1一样，当PS-2与GoA共表达并且测定35S-GTPγS结合时，显示35S-GTPγS结合增加超过未转染对照ES(PS-/-)提取物大于700％(图4，柱2)。在PTx存在下其被抑制(图4，柱3)。与对于PS-1的情况不同，GoB与PS-2的结合增加35S-GTPγS掺入。这种新的发现与本文提供的表明GoB结合PS-2而不结合PS-1的其它数据一致。35S-GTPγS掺入的增加小于对于GoA所观察到的增加(～300％)(图4，柱4)。这种增加在PTx存在下会被抑制。图4中所示的结果是至少3次独立实验的代表性结果。
实施例2
培养ESPS双缺失细胞并铺板过夜。使用lipofectamine(Invitrogen)根据生产商的方案以全长人β-APPcDNA的pcDNA3构建体转染细胞。培养DAMI细胞并用pcDNA3或用全长人PS-1或PS-2cDNA的pcDNA3构建体转染。
在Western印迹中使用亲和纯化的多克隆兔抗PTyr抗体(Maher等，1985)。在ELISA分析中使用小鼠单克隆抗PTyr抗体(4G10；UpstateBiotechnology，LakePlacid，NY)。抗人pp60c-src的小鼠单克隆抗体(Anti-Src，克隆GD11)和抗Lyn的兔多克隆抗体(Anti-Lyn)购自UpstateBiotechnology。抗Fyn的兔多克隆抗体(Anti-Fyn，sc-16)购自SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA。针对PS-1N-末端结构域的大鼠抗人PS-1单克隆抗体MAb#1563一抗购自ChemiconInternational，Temecula，CA。其用包含融合至GST的人PS-1N-末端结构域的一部分(残基21-80)的融合蛋白抗原产生。抗人β-APP细胞外结构域的小鼠单克隆抗体MAb#348一抗购自ChemiconInternational。
异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的亲和纯化的山羊抗大鼠IgG和异硫氰酸四甲基罗丹明B(TRITC)-缀合的亲和纯化的驴抗小鼠IgG二抗购自JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA。免疫荧光标记的转染的和未转染的DAMI细胞用PBS中4％多聚甲醛固定10分钟并不进行透化而使用。细胞在含1％BSA的PBS中的抗PS-1(1：200稀释)和抗β-APP(1：500稀释)抗血清悬浮液中室温标记30分钟。通过离心用PBS洗涤三次之后，细胞重悬于1％BSA/PBS中并与合适的荧光二抗孵育。室温孵育20分钟，之后用PBS洗涤细胞并且在封固介质(VectorLaboratories，Burlingame，CA)存在下封固在载玻片上。
使用油浸×60物镜进行免疫荧光显微镜检查。使用异硫氰酸荧光素和异硫氰酸四甲基罗丹明B过滤片和ZeissPhotoscopeIII仪器或者使用Nomarskioptics观察载玻片。
PS-1和PS-2的N-末端结构域通过PCR得到并克隆入FLAG表达载体(ScientificImagingSystems，IBI13100)的Tth111I和Xho-1位点以产生在PS-1或PS-2N-末端结构域的N-末端连接FLAG的融合蛋白。两个FLAG-融合蛋白分别在DH5α细菌中生长并根据生产商的方案亲和纯化。纯化的重组蛋白通过使用抗FLAG抗体和抗PS-1或PS-2的N-末端结构域的抗体的Western印迹检查。
DAMI：ES细胞：等量的(0.5×106/ml)β-APP695(Selkoe和Podlisny，2002)转染的ES双缺失细胞和PS-1转染的DAMI细胞在37℃下共培养0-20分钟之间的不同时间。
仅使用适当转染的DAMI细胞进行实验。等量的(0.5×106/ml)β-APP-转染的DAMI细胞和或者PS-1或者PS-2转染的DAMI细胞在室温下轻轻混合，正如所述(Dewji和Singer，1998)。在对照实验中，仅转染pcDNA3的DAMI细胞代替β-APP转染的细胞。
在混合后的0和20分钟之间的数个时间点，将每一细胞混合物的等分试样快速离心，去除培养基，并将细胞沉淀重悬于包含蛋白酶抑制剂(1mM4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)/1μg/ml抗蛋白酶/0.1μg/ml胃酶抑素A/0.1μg/ml亮抑蛋白酶肽)和磷酸酶抑制剂正钒酸钠(0.1mM)的200μl提取缓冲液中(50mMTris，pH8.0/150mMNaCl/0.5％Nonidet-P40)中。混合物用三次20秒持续时间的超声处理，然后离心。然后将这些提取上清液用于Western印迹和ELISA分析，如下所述。
进行了细胞提取物中蛋白质酪氨酸激酶Src家族的测定。底物肽{[Lys19]cdc2(6-20)-NH2}和对照肽{[Lys19Ser14Val12]cdc2(6-20)}和{[Lys19Phe15]cdc2(6-20)}购自UpstateBiotechnologyInc。使用全部的三种肽，测量了转染DAMI细胞(或者β-APP转染的或者pcDNA3转染的DAMI细胞)与PS-1转染细胞混合的提取物中；以及β-APP或者pcDNA3转染细胞与PS-2转染细胞混合的提取物中的Src激酶活性。实验中包括的对照在反应混合物中无底物的情况下进行。
底物肽(在10μl中1.5mM)，Src激酶反应缓冲液(100mMTris-HCl，pH7.2，125mMMgCl2，25mMMnCl2，2mMEGTA，0.25mM正钒酸钠，2mMDTT)(10μl)，Src激酶(每一测定2-20U纯化的酶)或者10μl中10-200μg蛋白质裂解物和用Mn2+/ATP混合物稀释的[γ-32P]ATP(NENDupont，Boston，MA)(10μl)，在30℃下孵育15-20分钟。
上面描述的提取上清液的等分试样(100μg蛋白/泳道)在加样缓冲液中(50mMTris，pH6.8，0.1MDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)煮沸5分钟，在SDS-PAGE(10％)凝胶上电泳分离，并将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。膜用多克隆兔抗PTyr抗体一抗孵育，接着用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG孵育。通过化学发光检测膜结合的过氧化物酶活性。
细胞裂解物在提取缓冲液中制备并且通过在4℃下微离心15分钟澄清。
提取物与4μg对c-Src、Lyn或者Fyn特异的抗体孵育，之后与蛋白-A或G琼脂糖(40μl浆液)孵育。抗原抗体-蛋白-A(或-G)琼脂糖复合体在包含300mMNaCl的RIPA(50mMTris-HCl，pH7.2，150mMNaCl，1％TritonX-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％抑肽酶，25μM亮抑蛋白酶肽)中洗涤3次，用包含10mMNaCl的RIPA洗涤一次，用40mMTris-HCl，pH7.2洗涤2次并且用包含25mMHEPES，pH6.9，3mMMnCl2和200μM正钒酸钠的激酶缓冲液洗涤一次。
根据公布的方案(Zisch等，1998)在包含5μCi[g32P]ATP(3000Ci/mmol)的40μl激酶缓冲液(25mMHepes，pH6.9，3mMMnCl2和200μM正钒酸钠)中于37℃进行反应30分钟。反应珠用激酶缓冲液洗涤3次并且重悬于75μlSDS凝胶加样缓冲液中(250mMTris-HCl，pH6.8，4％SDS，10％2-巯基乙醇，0.02％溴酚蓝和75％甘油)。将自身磷酸化反应物进行SDS-PAGE，之后将蛋白质转移至PVDF膜上并且放射自显影。
ELISAs：蛋白质酪氨酸激酶活性使用酪氨酸激酶测定试剂盒(UpstateBiotechnology)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。根据生产商的方案，将包含聚(Glu4-Tyr)串联重复的生物素化底物肽，在非放射性ATP和Mn2+/Mg2+辅因子混合物存在下，与混合不同时间的转染细胞提取物上清液孵育(20μg蛋白质/孔)。缀合辣根过氧化物酶的磷酸酪氨酸特异性小鼠单克隆抗体(4G10)用于通过ELISA检测磷酸化的底物。
在未转染和PS-1转染的DAMI细胞的细胞表面上不表达β-APP。由于最初组的研究依赖于以PS-1转染后的DAMI细胞在其表面上持续表达仅可忽略不计量的β-APP的提议，所以首先进行下列实验。处于固定但未透化状态中的未转染和PS-1转染DAMI细胞进行对β-APP和PS-1的双免疫荧光标记。未转染的固定的未透化DAMI细胞，如先前所示(Querfurth和Selkoe，1994)在细胞表面上不表达显著量的β-APP(图5a，图板2)，而以β-APPpcDNA3构建体转染的固定的未透化DAMI细胞显示在细胞表面上大量表达(图5b，图板2)。然而，图5a和b，图板1显示未转染的固定的未透化DAMI细胞不表达内源的细胞表面PS-1。在图5c，图板1中，在固定的未透化PS-1转染细胞中这种PS-1细胞表面表达增加。图5c，图板2显示用PS-1转染的DAMI细胞与在未转染细胞中所见的可忽略不计的水平(图5a，图板2)相比没有显著增加β-APP的细胞表面表达。图5d，图板2显示用β-APP转染ES双缺失的固定的未透化细胞中有β-APP的细胞表面表达，但不表达PS-1(图5d，图板1)。
使用未转染的固定的未透化ES双缺失细胞，如所预期，对于细胞表面PS-1没有标记信号(图5e，图板1)，但有少量的内源β-APP的表面表达(图5e，图板2)。这些结果证实，在β-APP转染的ES双缺失细胞和PS转染的DAMI细胞的相互作用中，仅ES细胞表达细胞表面β-APP，并且不表达PS；而仅PS转染的DAMI细胞在细胞表面表达PS，并且不表达β-APP。如果β-APP：PS相互作用在细胞混合后发生，因此这仅是细胞-细胞相互作用的结果。
本文还提供了数据表明，特异性的β-APP：PS细胞间信号传导导致酪氨酸激酶活性增加。以β-APP转染的ES双缺失细胞与以PS-1转染的DAMI细胞混合，并且使用保证细胞-细胞接触的细胞密度共培养0-20分钟之间的不同时间。然后对细胞提取物进行ELISA测定以测量蛋白质酪氨酸激酶活性。图6a显示这些共培养产生蛋白质酪氨酸激酶活性的快速且短暂升高，其程度和动力学与先前描述的当PS-1转染的DAMI细胞与β-APP转染的DAMI细胞混合时(Dewji和Singer，1998)相似。当与图6a中相同的相互作用在25μg纯化的杆状病毒衍生的可溶性β-APP(β-APP的细胞外结构域)(图6b)或25μg的FLAG报告子与PS-1N-末端结构域融合的融合肽(图6c)存在下进行时，没有导致蛋白质酪氨酸激酶活性的增加。另一方面，在25μgFLAG-PS-2N-末端结构域融合肽存在下相同的β-APP：PS-1共培养没有抑制PTyr形成(图2d)。这些结果清楚地确立了几点：1)可溶性β-APP自身不活化PS-1转染的DAMI细胞以表现出酪氨酸激酶活性；在转染的ES细胞的膜上完整的β-APP是必需的。相反，可溶性β-APP抑制由膜结合β-APP产生的活性，表明膜结合的β-APP特异性参与活化；2)PS-1N-末端结构域自身不能够活化β-APP转染的细胞以表现出酪氨酸激酶活性。在其DAMI细胞膜上完整PS-1是必需的。但是PS-1(而不是PS-2)的N-末端结构域抑制共培养的活化，表明PS-1转染的DAMI细胞上的膜结合PS-1也特异性参与相互作用；3)抑制剂、可溶性β-APP和PS-1N-末端结构域的FLAG-融合蛋白的蛋白质性质保证了它们不能透过活DAMI和ES细胞的细胞膜，并且因此证明仅仅细胞表面β-APP和PS-1的外部结构域参与产生信号传导事件(即信号传导是并邻分泌(juxtacrine)类型的)。这些结果提供了有力的证据确立了在β-APP和PS之间会发生并邻分泌相互作用。
此外，PS-1N-末端结构域暴露于细胞外表面的这种证明与PS蛋白质的7-TM拓扑形态一致，但是与8-TM模型的预测矛盾，在8-TM模型中PSN-末端结构域位于细胞内。
本文提供的另外的数据表明，β-APP：PS-1和β-APP：PS-2细胞间信号传导可以通过酪氨酸激酶Src家族成员介导。作为β-APP：PS细胞间结合结果的PTyr修饰的增加涉及一种或者更多种需要鉴定的蛋白质酪氨酸激酶。由于β-APP和PS蛋白质均不包含此种激酶活性位点，这些蛋白质的细胞质结构域的间接活性，例如细胞质酪氨酸激酶直接或间接结合至这些结构域之一，会参与下游的信号。由于鉴定了Src基因家族中的数个细胞质酪氨酸激酶，使用底物肽[lys19]cdc2(6-20)-NH2(KVEKIGTYGVVKK；SEQIDNO：12)测定了混合的转染细胞的细胞提取物中Src家族蛋白质的酪氨酸激酶。其中cdc2(6-20)中Tyr19替换成lys的该种肽已经显示是Src家族激酶的有效底物。所测试的所有Src家族激酶，包括v-Src和c-Src、c-Yes、Lck、Lyn和Fyn，证明了对该底物具有强的活性。还使用了两个对照肽：在第一个肽[lys19ser14val12]cdc2(6-20)NH2(KVEKIGVGSYGVVKK；SEQIDNO：13)中，glu12和thr14分别被val和ser替换，导致所得到的肽充当Src家族酪氨酸激酶底物的有效性显著降低。另一个肽[lys19phe15]cdc2(6-20)NH2(KVEKIGEGTFGVVKK；SEQIDNO：14)应当不被酪氨酸激酶磷酸化，但是的确包含ser/thr激酶的潜在靶标(thr14)。
引起β-APP：PS-1相互作用的β-APP转染DAMI细胞与PS-1转染DAMI细胞共培养的提取物中，和对于缺乏β-APP(pcDNA3：PS-1)的相应对照的Src家族激酶活性测量结果示于图7a和b中。对于使用这三种肽的，引起β-APP：PS-2相互作用的转染的DAMI细胞混合物，和对照pcDNA3：PS-2混合的转染的DAMI细胞提取物的相似结果示于图7c和d中。对于每一β-APP：PS细胞混合物，其中[lys19]cdc2(6-20)NH2用作Src家族激酶底物，对于酪氨酸激酶活性的平行ELISA结果得到与对照肽相比活性短暂升高。对于β-APP：PS-1相互作用(图7a)，Src家族激酶活性在8分钟时达到高峰并且到12分钟时返回到基线水平，证实了作为细胞混合后时间的函数的酪氨酸激酶活性的先前ELISA结果。对相同的底物用于对照pcDNA3：PS-1(图7b)混合细胞时没有观察到显著增加。对于引起β-APP：PS-2相互作用的细胞混合物(图7c)，至于酪氨酸激酶ELISA结果，使用底物肽[lys19]cdc2(6-20)NH2在混合后9和16分钟观察到两个明显的活性峰。
对于缺乏β-APP，pcDNA3：PS-2的相应对照(图7d)，没有观察到Src激酶活性超过背景显著增加。这些结果表明，先前对于β-APP与PS-1转染细胞混合物或者β-APP与PS-2转染细胞混合物所观察到的酪氨酸激酶活性增加涉及Src酪氨酸激酶家族的一个或更多个成员。
在Src家族激酶和酪氨酸激酶特异性抑制剂存在下酪氨酸激酶活性的抑制.在酪氨酸激酶(除莠霉素A)和Src家族激酶(PP2)特异性抑制剂存在或缺乏下，使用β-APP：PS-1混合细胞相互作用提取物进行的ELISA进一步证实Src激酶家族参与β-APP：PS细胞间信号传导。图8a证明，在10μg/ml除莠霉素A存在下，在β-APP转染DAMI细胞与PS-1转染DAMI细胞混合8-10分钟时的酪氨酸激酶活性增加被完全抑制。在10nMPP2存在下进行的相同实验(图8b)同样显示酪氨酸激酶活性的抑制。
在下面提供与c-Src参与β-APP：PS-1细胞间信号传导有关的另外的数据。为了确定在β-APP：PS-1细胞间信号传导所涉及到的一个或更多个Src家族成员的身份，我们通过研究pp60c-Src开始。表观分子量为58和60kDa的两个主要的蛋白质条带，在大小上类似于c-Src的双联体，在此并邻分泌相互作用中经历短暂的PTyr修饰。当PS-1转染的DAMI细胞与β-APP转染的DAMI细胞混合物的提取物进行SDS16PAGE和用抗-PTyr或者抗c-Src抗体免疫印迹时，两个抗体均与相同的两个条带反应(图9a，图板1-3)。使用抗PTyr抗体进行免疫印迹的该图中的图板1显示在细胞混合后8-10分钟时蛋白质条带的酪氨酸磷酸化短暂增加达最大值。在用c-Src抗体对相同提取物进行免疫印迹的图板2显示没有随着时间而变化，表明在PTyr水平增加过程中，c-Src蛋白质浓度保持未变。重要的观察是，当用β-APP(因此仅表达β-APP，但是不表达PS-1或者2)转染的ES双缺失细胞与用PS-1(因此仅表达PS-1，但不表达细胞表面β-APP)转染的DAMI细胞混合时，在与β-APP转染的DAMI细胞与PS-1转染的DAMI细胞混合中所见到的混合后时间(图9a，图板1)相似的混合后时间时，p60c-Src蛋白质加上一种或者两种另外的蛋白质经历PTyr修饰的短暂增加(图9a，图板4)。因此，PTyr修饰结果与PS-1相关，而与表达它的细胞类型不相关(对于PS-2见下)。
为了进一步测试，c-Src是否是在β-APP：PS-1相互作用中经历短暂酪氨酸磷酸化的酪氨酸激酶家族成员，进行这样的实验(自身磷酸化)，其中在混合后不同时间获取的混合的转染DAMI细胞提取物用抗c-src抗体处理，之后用蛋白-G琼脂糖珠处理。然后向珠中加入γ32PATP；随后将蛋白质离开珠而溶解，并进行SDS17PAGE和放射自显影。图9b中的结果表明，数个暂时的条带表现出在细胞混合后8-10分钟时最大磷酸化，该时间过程对应于类似提取物中PTyr的出现(图9a，图板1)。在这些条带中，突出的是对应于c-Src的一个双联体，证实在β-APP：PS-1细胞间相互作用中c-Src被短暂活化。
在图9b中其他磷酸化条带的身份未知。它们当中并非全部必然是酪氨酸磷酸化；一些丝氨酸或者苏氨酸激酶可能已经结合至与特异性抗pc-Src免疫反应的c-Src。β-APP：PS-2细胞间信号传导下游涉及Lyn，但不涉及Fyn。当使用适宜转染的DAMI细胞混合物进行β-APP：PS-2细胞间相互作用时，与β-APP：PS-1系统完全不同的一组蛋白质被PTyr修饰。虽然通过PTyr抗体检测到在50-66kDa存在有条带，但这些不对应于Western印迹上的c-Src(图11a，图板1)。此外，当β-APP：PS-2混合细胞的提取物首先用c-Src抗体免疫沉淀，然后该免疫沉淀物在体外自身磷酸化时，观察到在较早时间点(混合后8-10分钟)磷酸化没有显著增加(图10b)。
然而，在较晚的时间点，这些样品中c-Src将明显地被磷酸化，表明这促成了在β-APP：PS-2信号传导第二个较晚的峰中鉴定的增加(图10b)。对于c-Src之外的53-59kDa范围分子量研究了Src激酶家族其它成员参与可能性。Lyn(Mwt53/56kDa)和Fyn(Mwt59kDa)是检查的两个候选Src激酶。
在图11a中的使用抗Lyn抗体进行的Western印迹杂交结果显示，当进行β-APP：PS-2细胞间相互作用时Lyn蛋白质浓度没有改变，但是在用抗Lyn抗体对提取物免疫沉淀和对沉淀物的体外自身磷酸化后，观察到Lyn短暂磷酸化，在8-9和17-18分钟时出现活性峰值，还有其他磷酸化条带(图11c)。Lyn以与在对于β-APP：PS-2相互作用的Western印迹和ELISA中所观察到的PTyr增加相类似的模式经历短暂的磷酸化(图11c)。另一方面，在用抗Fyn抗体免疫沉淀后在相同的提取物中显示没有Fyn体外自身磷酸化(图11d)，其浓度也没有随着时间发生任何改变(图11b)。
实施例3
下列数据表明，G蛋白结合小鼠额叶皮质提取物中的内源PS-1和PS-2。WT小鼠额叶的20％匀浆液在GTPγS增溶/提取缓冲液[50mMHEPES/NaOHpH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％Triton-X100，60mM辛基葡糖苷，1×蛋白酶抑制剂混合物(1μM苯甲基磺酰氟，1μg/mL抗蛋白酶，0.1μg/mL胃酶抑素A，0.1ug/mL亮抑蛋白酶肽)]中制备。在未处理的、PTX处理的；和PS-1和PS-2免疫耗竭的提取物中进行对[35S]GTPγS结合的测量。
对于未处理的样品，将100μg提取物置于100μL的GTPγS增溶/提取缓冲液中并与等体积的GTPγS缓冲液B(50mMHEPES/NaOHpH7.4，40μMGDP，50mMMgCl2，100mMNaCl)混合，得到总体积200μL。反应以50nM[35S]GTPγS(1250Ci/mMol；PerkinElmer)开始并室温孵育60分钟。通过加入20μL10×终止缓冲液(100mMTris-HCl，pH8.0，25mMMgCl2，100mMNaCl，20mMGTP)终止反应。
对于PTX处理的样品，100μg提取物置于100μLGTPγS增溶/提取缓冲液中并在PTX缓冲液(20mMHEPESpH8.0，1mMEDTA，2mMMgCl2，1mMNAD)存在下用500ng/mL活化的PTX处理。样品于30℃下孵育12小时。然后将PTX处理的样品与等体积的GTPγS缓冲液B混合并如上所述进行[35S]GTPγS测定。
小鼠额叶皮质提取物用抗PS-1和PS-2(每种10μL)的多克隆抗体混合物于4℃免疫沉淀过夜以耗竭样品中的PS-1和PS-2。加入蛋白A琼脂糖(20μL浆液/100μg蛋白质)并将样品于4℃上下颠倒摇动2小时。PS-抗体-蛋白A复合体高速离心5分钟。回收上清液并如所述用100μg等分试样进行[35S]GTPγS测定。
在GTPγS反应之后，加入5μL抗PS-1或抗PS-2单克隆抗体并将样品置于4℃下过夜。抗体-蛋白质复合体结合至20μL蛋白A/G琼脂糖(Pharmacia)并将样品置于4℃下并上下颠倒摇动2小时。琼脂糖珠用洗涤缓冲液1(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，1％Triton-X100，1×蛋白酶抑制剂混合物)洗涤3次并用洗涤缓冲液2(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，0.5％Triton-X100，1×蛋白酶抑制剂混合物)和3(50mMHEPES，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，1×蛋白酶抑制剂混合物)各洗一次。然后将洗涤的琼脂糖珠悬浮于5mL闪烁液体(CytoScint，ICN)中并在BeckmanCoulterLS6000SC闪烁计数器上计数3分钟。
将对PS-1和PS-2合成对应于细胞内环1前16个氨基酸[ic1(1-16)]、细胞内环1的剩余16个氨基酸[ic1(17-32)]、完整的细胞内环2(ic2)、完整的细胞内环3(ic3)、细胞质C-末端尾的前20个氨基酸(C1-20)和细胞质C-末端尾的剩余19个氨基酸(C21-39)的序列并用HPLC纯化至>90％的纯度。图12图解说明PS的细胞内结构域。表1显示可以从这些结构域合成的序列。此外，合成了其中肽C1-20的序列为乱序的20个氨基酸的对照肽。该肽是被鉴定为PS-1上对Go的结合结构域的39个氨基酸序列的一部分。
表1
实施例4
本研究证明，PS-1的GPCR功能调节Aβ的产生。研究PS-GPCR功能中的主要问题是确定可以自PS引起G蛋白活性的PS特异性配体，所述配体与PS在细胞间结合。本研究研究了三部分的配体-受体-G蛋白系统是否启动Aβ的产生。在此种系统中，通过配体(β-APP)结合导致的PS活化将导致G蛋白结合至PS的细胞质结构域。
为了研究G蛋白与PS-1或PS-2的结合是否影响从β-APP产生Aβ，进行了在百日咳毒素(PTx)存在和缺乏情况下β-APP和PS-1的细胞：细胞相互作用实验。PTx是G蛋白Go活化的特异性抑制剂。如果PS的GPCR功能涉及从β-APP：PS细胞间结合产生Aβ，则在PTx存在下，Aβ产生将被抑制。
使用上面描述的方法，在35S-甲硫氨酸存在下，使用PS-1转染的原代β-APP-/-成纤维细胞(细胞表达PS-1并且不产生β-APP)与β-APP转染的ES(PS-/-)细胞(细胞产生β-APP，但不表达PS)的相互作用进行β-APP：PS-1介导的细胞-细胞相互作用。在转染细胞共培养后24小时，在蛋白酶抑制剂存在下收获样品。将细胞超声处理并将100μg的全细胞提取物用抗Aβ(6E10)的抗体免疫沉淀并且免疫沉淀的样品在Bicene–Tris凝胶上泳动。通过干燥凝胶的放射自显影显示Aβ带。在500ng/mlPTx存在下进行相同的实验。如下所述，将培养细胞处理12小时。作为PTx处理的对照，将培养的细胞与仅包含ATP和NAD的PTx缓冲液孵育。在这些条件下，Go活化和Aβ水平应该不受影响。
图15显示这些研究的结果。泳道1显示表达β-APP的ES(PS-/-)细胞与表达PS-1的成纤维细胞(β-APP-/-)共培养的结果。泳道2显示在PTx和PTX缓冲液(NAD+ATP)存在下在泳道1中所使用成分的结果。泳道3显示在仅PTx缓冲液(NAD+ATP)但无PTx存在下在泳道1中所使用成分的结果。泳道4显示表达无尾β-APP的ES(PS-/-)细胞与表达无尾PS-1的成纤维细胞(β-APP-/-)共培养的结果。泳道5显示在PTx存在下在泳道4中使用的成分的结果。泳道6显示表达野生型β-APP的ES(PS-/-)细胞与表达无尾PS-1成纤维细胞(β-APP-/-)共培养的结果。
结果表明，PTx毒素抑制从β-APP和PS-1的细胞间相互作用产生Aβ(上面的泳道1和2)。泳道3显示，在仅PTx缓冲液存在，但PTx缺乏情况下，Aβ产生没有被抑制。泳道4和6显示，早前证明为PS-1对Go的结合结构域的PS-1细胞质羧基末端结构域，在缺乏时消除了Aβ产生。
本文提供的数据表明，β-APP是PS-1的配体，当配体结合时活化了PS-1的GPCR活性。数据还表明，PS-1的GPCR功能参与在β-APP与PS-1发生细胞间相互作用之后从β-APP产生Aβ。这些结果进一步表明，对PS-1的GPCR活性的调节还调节Aβ的产生。因此，调节PS-1的GPCR活性的试剂将调节Aβ的产生。
对于共培养实验，ES(PS-/-)和β-APP(-/-)细胞以1×107个细胞每个25cm2瓶铺板并用适宜的cDNA转染。转染后5小时，用β-APP转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞通过温和的胰蛋白酶消化分离，用包含热灭活的透析FCS(10％v/v)的无甲硫氨酸培养基洗涤2次并以0.33×107个细胞/ml重悬于该培养基中。类似地，来自β-APP敲除小鼠的原代成纤维细胞以PS-1或PS-2共转染并以1×107个细胞铺板。转染的细胞用无甲硫氨酸培养基洗涤2次并置于3ml无甲硫氨酸培养基中。
β-APP转染的ES(PS-1-/-/PS-2-/-)细胞(1×107个细胞/3ml无甲硫氨酸培养基)加入至PS-1转染的β-APP敲除细胞中。细胞密度保证了基本上所有细胞彼此接触。加入35S-甲硫氨酸(66μCi/ml；1175Ci/mmol，NEN)并将培养物孵育24小时。在使用PTx处理的实验中，在该阶段的适宜反应条件下向培养物中加入500ng/mlPTx并孵育24小时。然后去除培养基并通过刮取收获细胞。在于干冰上冰冻之前向培养基加入蛋白酶抑制剂混合物。向细胞沉淀物中加入100μl包含蛋白酶抑制剂(1mM4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)/1μg/ml抗蛋白酶/0.1μg/ml胃酶抑素A/0.1μg/ml亮抑蛋白酶肽)的提取缓冲液(50mMTris，pH8.0/150mMNaCl/0.5％Nonidet-P40)并将样品在干冰上迅速冷冻。
PTx原体(BiomolResearchLaboratories)与10mMDTT于37℃下孵育10分钟以将PTx原体转变成酶活性形式。在用PS-1或PS-2和G蛋白cDNAs转染ES细胞后5小时，向存在1mMNAD、1mMATP、2mMMgCl2和1mMEDTA的培养基中的细胞中加入500ng/ml的活化PTx。细胞在5％CO2存在下于37℃孵育18小时。
在冰上对细胞沉淀物进行3次超声，每次20秒，制备全细胞提取物。蛋白质浓度根据Lowry方法确定。
使用100μg细胞提取物进行免疫沉淀，使用针对Aβ的残基1-17(Senetek)产生的2μgAβ特异性单克隆抗体6E10(Senetek)在上下颠倒旋转仪中于4℃免疫沉淀过夜。然后加入40μl的蛋白G琼脂糖浆液(Pharmacia)并室温上下颠倒混合1小时。抗原-抗体-蛋白G琼脂糖复合体用下列缓冲液各洗涤一次：缓冲液1(10mMTris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，0.65MNaCL，1％NP-40)，缓冲液2(10mMTris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，0.75％NP-40)and缓冲液3(10mMTris-HCl，pH7.4，1mMEDTA，pH8.0，0.1％NP-40)。洗涤的复合体在bicene-tris样品缓冲液中煮沸10分钟并在bicene-tris凝胶上进行SDSPAGE。
制备含8M尿素的Bicene-tris凝胶(15％T/5％C)并运行。然后将凝胶用0.4M硼酸钠/磷酸盐缓冲液中的5％戊二醛固定30分钟并用甲醇-乙酸中的0.1％考马斯蓝G250染色1小时。在脱色后，将凝胶准备进行放射自显影。
脱色的凝胶用乙醇(30％)和甘油(5％)处理30分钟并用Amplify(Amersham)浸渍30分钟，再80℃下真空干燥并用X-Omat胶片于–70℃下曝光4-5天。
对于Aβ的最后产生所必需的特异性β-APP：PS介导的细胞-细胞相互作用还激活G蛋白。由一个细胞表面上的β-APP与另一细胞表面上的PS的特异性结合介导的细胞：细胞相互作用是从β-APP产生Aβ所需的第一个步骤。为了确定仅表达人β-APP的细胞和仅表达PS的细胞之间的细胞-细胞相互作用，连同它们结合的内源蛋白质是否导致内源小鼠G蛋白活化，测定了35S-GTPγS与Gα的结合，这是确定G蛋白活化的标准方法。在所有这些研究中，检查了内源小鼠Gαo的活化。
产生两个细胞类型：表达仅少量内源β-APP但不表达PS的ES来源的小鼠细胞(PS-1-/-；PS-2-/-)以人β-APP的cDNA瞬时转染产生表达超过小鼠β-APP的过量人β-APP，但不表达PS-1或PS-2的细胞(仅β-APP的细胞)。来源于β-APP缺失小鼠的表达仅少量内源PS-1和PS-2的胚胎(E18)小鼠原代成纤维细胞，用人PS-1的cDNA转染以产生表达超过小鼠PS-1的过量人PS-1但不表达β-APP的细胞(仅PS-1细胞)。仅表达β-APP的细胞与仅表达PS-1的细胞，或者以允许这些细胞间相互作用的高密度，或者以许可仅较小程度细胞：细胞相互作用的较低密度共培养24小时(见图14C，泳道2与图14C，泳道4中的光学显微照片比较)。
制备在百日咳毒素(PTx)存在或缺乏下高和低密度共培养的去污剂-缓冲液提取物(在PTx存在下Go活化被抑制)并且包含100μg总蛋白的等分试样与35S-GTPγS反应。使用针对Gαo的多克隆抗体K-20进行每一35S-GTPγS-处理提取物的免疫沉淀，该抗体免疫沉淀活化的35S-GTPγS标记的小鼠Gαo。
当仅β-APP的细胞与仅PS-1细胞以高密度共培养时(图14C，泳道1)，35S-GTPγS掺入超过从对照提取物(通过混合等部分的未转染ES(PS-/-)和成纤维细胞(β-APP-/-)的细胞提取物制备)得到的基础数值增加超过200％(图14A，泳道1)，与之相比，对于低密度样品(图14C，泳道2)为33％增加(图14A，泳道2)。在PTx存在下，高密度培养物(图14C，泳道4)显示对35SGTPγS掺入的抑制低于基础数值(图14A，泳道3)38％。这些结果表明，在仅β-APP细胞和仅PS细胞之间的特异性细胞：细胞相互作用还通过PS-1细胞质结构域直接，或者通过PS缔合的蛋白间接激活PTx敏感性G蛋白。
仅β-APP细胞和仅PS细胞在高密度和低密度下共培养并且在含或不含PTx的35S-met存在下代谢性标记。共培养24小时后，收获细胞并制备去污剂提取物。包含100μg蛋白质的样品用抗人Aβ的小鼠MAb(6E10)免疫沉淀，之后溶解的免疫沉淀物在Bicene–Tris凝胶上电泳分离。然后通过35S-放射自显影显示Aβ条带。图14证明：1)随着细胞密度的降低(图14C，泳道1-3)，等量总蛋白中存在的Aβ水平平稳降低(图14B，泳道1-3)，这与为了从β-APP产生Aβ需要β-APP：PS-1介导的细胞间结合一致；2)对于PTx敏感的G蛋白活化需要同样的细胞间相互作用，如图14A中所示；和3)在高密度培养中Aβ的产生(图14B，泳道1和14C，泳道1)被PTx的存在完全抑制(图14B泳道4和14C泳道4)。G蛋白活化和Aβ产生均被PTx抑制的证明强力地表明，G蛋白活化发生早于Aβ形成，这符合此类活化处于从β-APP：PS-1细胞间结合产生Aβ的途径中的想法。
PS-1的水溶性的完整的80个氨基酸NH2-末端结构域(肽1-80)的融合构建体加入到共培养的培养基中，充当β-APP：PS-1介导的细胞-细胞相互作用的特异性抑制剂并抑制Aβ产生。作为对于G蛋白活化和Aβ产生均需要β-APP和PS之间的特异性细胞-细胞相互作用的进一步的证据，进行实验以确定源于该种细胞-细胞相互作用的Gαo活化是否会通过向共培养中加入肽1-80而被抑制。
仅β-APP和仅PS-1的细胞的共培养在肽1-80(0-3μM)存在和缺乏下进行。对提取物进行35S-GTPγS测定，作为对G蛋白活化的量度。在这些共培养提取物中产生的Aβ通过ELISA确定。图15显示，Aβ产生(图15A)和Gαo活化(图15B)均被肽1-80以剂量依赖方式抑制，这与G蛋白活化源于启动Aβ最终产生的相同β-APP：PS-1介导的细胞-细胞相互作用的观点一致。
此外，水溶性的β-APP胞外域本身(β-APPs)，当加入至仅PS-1细胞的培养物中时，也会以剂量依赖方式活化G蛋白。β-APPs从过表达人β-APP的杆状病毒培养物的条件培养基部分地纯化。最终产物(图16b，泳道1)除了具有β-APP之外，还具有与β-APP胞外域共纯化的81kDa、55kDa和31kDa的三个主要污染条带。这种部分纯化的β-APPs制剂以增加的量加入至仅PS-1的APP-/-成纤维细胞中。在15分钟后，将每一孔的细胞收集在提取缓冲液中，并且去污剂提取物(每一个包含100μg蛋白质)用35S-GTPγS处理。在用Gαo-特异性抗体将活化的35S-GTPγS-Gαo免疫沉淀后测定Gαo的活化。在仅PS-1的细胞中，随着部分纯化β-APPs浓度的增加观察到35S-GTPγS掺入的增加(图16A，曲线1)，其中加入120pMβ-APPs时最大增加超过500％。未转染的APP-/-成纤维细胞的培养物中G蛋白活化中等(图16A，曲线3)，这可能是由于这些细胞中存在内源PS-1引起。此外，当部分纯化的β-APPs加入至未转染的ES(PS-/-)细胞时，通过35S-GTPγS测定没有观察到G蛋白活化的增加(图16A，曲线5)，进一步暗示PS为Gαo活化中的β-APP配体的受体。
为了证实在部分纯化的β-APPs制剂中的确是为负责G蛋白活化的配体的β-APPs，而不是污染物之一，通过用β-APP的MAb348处理将β-APPs从制剂中去除(见图16C，泳道2)。将与β-APPs非耗竭制剂中使用浓度相同的浓度的该β-APPs耗竭的溶液加入至仅PS-1的细胞中，然后如上所述正确处理。图16A(曲线4)显示，用抗体去除β-APPs导致在使用β-APPs制剂所观察到的35S-GTPγS掺入几乎全部丧失。相反，当加入至仅PS-1细胞时，用无关IgG对β-APPs制剂进行相似处理，结果类似于使用未处理样品得到的那些结果(图16A，曲线2)。该结果与这样的提议一致，即G蛋白活化的丧失(图16A，曲线4)不是因为在免疫耗竭过程中非特异性蛋白质的丧失引起的，而是因为从样品中特异性免疫去除β-APPs引起的。这些结果提供了除了完整的膜结合β-APP之外，与膜分离的可溶性β-APPs自身可诱导PS-1表达细胞中的G蛋白活化，但在缺乏PS时不能诱导G蛋白活化的证据。
先前报导已经证明，G蛋白Go也结合β-APP。在刚描述的使用β-APPs的实验中，没有β-APP细胞质或膜内结构域的存在；该实验使用以PS转染的β-APP-/-细胞，向其中加入了β-APP的仅可溶性胞外域。因此，在本文所述的所有工作中观察到的Go活化是特异性地由于仅在PS细胞质结构域或者PS缔合的蛋白处的Go活化引起的。
由于目前描述的结果是使用仅以人PS转染的培养细胞获得的，检查了大鼠海马膜中存在的内源大鼠PS蛋白与大鼠Gαo的结合。将这些膜溶解并对溶解的膜在加入增加浓度(0-120pM)的部分纯化β-APPs之前和之后进行35S-GTPγS测定。图17A显示，在最低β-APPs浓度时(80pM)，35S-GTPγS的掺入比未处理样品多100％，并且在400pMβ-APPs时，G蛋白Go活化增加大于600％。如果溶解的大鼠膜首先用针对PS-1和PS-2两者的多克隆抗体混合物处理以耗竭样品中的该两种蛋白质，则不发生这些增加(图17B)，这与PS-1或其缔合的蛋白参与β-APPs活化G蛋白一致。
进行实验以确定人G蛋白Go是否结合已经不同地以人PS-1cDNA和人GαoA或GαoB蛋白质任一种的cDNA转染的ES来源(PS-/-)小鼠细胞内的完整人PS-1。从这些细胞制备去污剂提取物并测定。来自已经被不同地转染的ES细胞的包含100μg蛋白质提取物首先用对PS-1大的亲水环(在PS的7-TM模型中其突出到质膜的外部)特异的MAb免疫沉淀。然后将免疫沉淀物溶解并进行SDS-PAGE，接着用抗Gαo的识别GαoA和GαoB两种同种型的AbK-20进行Western印迹杂交。仅PS-1/GαoA共转染的细胞在～40kDa处得到Gαo强信号(图18A，泳道3与泳道2和4比较)，表明GαoA，而不是GαoB，特异性结合PS-1(结合保留在所使用的去污剂溶液中)。反映体外人PS-1和Gαo选择性结合的结果与公布的人Gαo与人PS-1结合的计算机分析研究一致，但是它们在两个Gαo同种型之间有所不同，该结果先前未显示。
为了提供在图5A中观察到的GoA结合是与PS-1直接结合而不是与免疫共沉淀的、PS缔合的蛋白质结合的证据，研究了Go被对应于PS-1细胞质环1、2、3和羧基尾(在7-TMPS模型中)的合成肽片段的自主活化(见图18B和C和表1)。分别测试肽刺激35S-GTPγS结合至大鼠海马膜制剂中Go的能力。
在图18C中，给出了细胞质环1和2肽(图18B)诱导仅背景刺激35S-GTPγS结合的证据。然而，细胞质环3肽对35S-GTPγS与Go的结合产生强刺激，对应于COOH-尾前20个氨基酸的肽也是这样。然而，对应于残基21-39的第二个COOH-末端肽不能活化Go。使用对应于COOH-尾残基1-20的肽的结果与G蛋白被PS-1COOH-末端结构域的活化一致。然而，该研究丢失了Go被7-TMPS-1的细胞质环3的活化，这是已知对于G蛋白与大多数GPCRs结合重要的区域。结果证实GoA直接结合PS-1，而不结合PS-缔合的蛋白。
至于在β-APP：PS细胞-细胞相互作用之后的G蛋白活化，其可能以多种方式参与Aβ产生。其可发出磷酸化的信号或者β-APP：PS复合体从质膜内化的信号，或者其可以活化其它下游事件，例如Ca2+释放，这会直接参与到产生Aβ的途径。
数据表明，源于β-APP与PS的特异性细胞：细胞相互作用的G蛋白活化处于随后从β-APP产生Aβ的途径上。
为了确定除了Gαo外任何其它G蛋白是否可以偶联早老素(PS)–1细胞质结构域，使用GαCOOH小基因载体。来自多种G蛋白Gα亚基的羧基末端结构域是受体结合的重要位点，并且对应于COOH-末端的肽可以用作受体-G蛋白相互作用的竞争性抑制剂。编码Gα的11-14C-末端氨基酸的小基因载体具有抑制/阻断受体介导的信号传导途径活化的能力。克隆在pcDNA3中的小基因从CadenBiosciences得到。表2显示对于所使用每一小基因的特异性序列。
表2：由Gα小基因载体编码的肽序列
表达仅少量内源β-APP，但不表达PS的ES来源的小鼠细胞(PS-1-/-；PS-2-/-)以人β-APP的cDNA瞬时转染以产生表达超过小鼠β-APP的过量人β-APP但不表达PS-1或PS-2的细胞(仅β-APP细胞)。来源于β-APP缺失小鼠的，表达仅少量内源PS-1和PS-2的胚胎(E18)小鼠原代成纤维细胞以人PS-1cDNAs转染以产生表达超过小鼠PS-1的过量人PS-1但不表达β-APP的细胞(仅PS-1细胞)。小基因与PS-1共转染仅PS的APP-/-成纤维细胞以抑制这些细胞中所研究的内源小鼠Gα。PS-/-ES细胞单独用人β-APPcDNA转染(仅β-APP细胞)并且两种类型的细胞共培养24小时。收获细胞并且制备共培养物的去污剂-缓冲液提取物。在每一小基因存在或缺乏下对这些培养物进行[35S]GTPγS掺入测定：每一种包含100μg总蛋白的等分试样与35S-GTPγS反应并且使用针对所研究的特定Gα的抗体对每一35S-GTPγS处理的提取物进行免疫沉淀。特定Gα与PS-1结合的特异性通过在特异小基因抑制剂存在下阻断GTPγS掺入确定。
图21显示在β-APP：PS-1的细胞-细胞相互作用之后，在其特异性小基因抑制剂存在和缺乏下GαoA、GαB、Gαq、Gα、Gαi1/2和Gαz的G蛋白活化的存在或缺乏。β-APP：PS-1细胞-细胞相互作用特异性活化GαoA、Gαq和Gαs，并且活化被每一G蛋白的特异性小基因抑制剂抑制。GαoB小基因的存在没有抑制活化的Gαo蛋白被Gαo抗体(该抗体与GOA和GOB同种型两者交叉反应)免疫沉淀，表明在该样品中活化的种类是不被GoB小基因抑制的GoA蛋白。没有看到由β-APP：PS-1的细胞-细胞相互作用导致的Gi1/2或Gz的G蛋白活化，表明这些G蛋白不偶联PS-1。
这些数据表明，β-APP与PS-1之间的细胞-细胞相互作用还活化G蛋白Gq和Gs。在上面所述的共培养提取物中产生的Aβ通过ELISA确定。图22中的结果显示，对于PS-1：βAPP的细胞间相互作用，GαoA和Gαq的活化与Aβ产生同时发生，而Gαs的活化不是这样。当这些蛋白质的G蛋白活化被对于每一G蛋白特异的小基因抑制剂抑制时，在GαoA和Gαq情况中也抑制Aβ产生，但是在Gαs情况下不抑制Aβ产生。这些结果表明，Aβ从β-APP产生涉及G蛋白Go和Gq的下游信号传导途径，该两者通过PLC发信号(不同机制)。
检查了G蛋白Gαo、Gαq和Gαs被对应于7-TMPS模型中人PS-1的细胞质环1、2、3和COOH尾的寡肽自主活化。分别检测所述肽刺激35S-GTPγS结合至大鼠海马膜制剂中每一G蛋白的能力。
图23A显示Gαo被PS-1细胞质环肽的自主活化。提供了细胞质环1和2肽诱导仅背景刺激35S-GTPγS结合的证据。然而，细胞质环3肽对35S-GTPγS与Go的结合产生强刺激，对应于COOH-尾前20个氨基酸的肽也是这样。然而，对应于残基21-39的第二个COOH-末端肽没有可检测到的Go活化。
图23B显示Gαq的自主活化。细胞质环1和2肽诱导仅背景刺激35S-GTPγS结合。对于Gαo，细胞质环3肽对35S-GTPγS与Gq的结合产生强刺激，对应于COOH-尾最后19个氨基酸的肽也是这样。先前显示活化Go的对应于残基1-20的COOH-末端肽没有提供可检测到的Gq活化。
图23C显示Gαs的自主活化。包含残基17-32(而不包含环1的前16个氨基酸)的细胞质环1肽以及对应于COOH-尾最后19个氨基酸的肽诱导刺激35S-GTPγS结合。对于Gαo，细胞质环2和3肽，以及COOH-末端肽1-20诱导仅背景刺激35S-GTPγS结合。
这些结果表明，不同的G蛋白结合PS-1上的不同细胞质结构域或者结构域组合。
一抗：抗Gαo(K-20，sc-387)、Gαq、Gαs、Gαi1/2和Gαz多克隆抗体购自SantaCruzBiotechnology。Gαo抗体识别GoA和GoB。针对Aβ的残基1-17的MAb6E10(Senetek)识别全长β-APP，以及Aβ。
细胞培养：小鼠ES(PS-1-/-/PS-2-/-)如前所述培养。
全细胞提取物的制备：通过在增溶缓冲液1(50mMHEPES/NaOHpH7.4，1mMEDTA，1mMDTT，1％Triton-X100，60mM辛基葡糖苷，1×蛋白酶抑制剂混合物)中超声处理制备提取物并且使用Lowry测定法测定蛋白质。
35S-GTPγS测定法：提取物(100μg总蛋白)与等体积的GTPγS缓冲液B(50mMHEPES/NaOHpH7.4，40μMGDP，50mMMgCl2，100mMNaCl)混合并与50nM35S-GTPγS(1250Ci/mmol，PerkinElmer，Waltham，MA)室温反应60分钟。使用10×终止缓冲液(100mMTris-HCl，pH8，25mMMgCl2，100mMNaCl，20mMGTP)终止反应，然后用抗特定Gα的抗体对35S-GTPγS-Gαo复合体进行免疫沉淀。抗体-蛋白质复合体室温吸附至蛋白A/G琼脂糖90分钟并洗涤。琼脂糖珠悬浮于闪烁液体(CytoScint，ICN)(5ml)中并在BeckmanCoulterLS6000SC闪烁计数器计数3分钟。
仅β-APP细胞与仅PS-1细胞的共培养如上所述进行。
对于Aβ1-40产生的ELISA使用夹心ELISA试剂盒(Biosource)进行。
大鼠海马膜(AppliedCellScience，Rockville，MD)溶解于CHAPs缓冲液中。
肽(200μM)在不进行预处理的条件下在35S反应混合物中与溶解的大鼠海马膜(50μg)孵育。在用特异性的抗-G抗体免疫沉淀后，测定γ-SGTP和35S-GTPγS的积累。
表3：不同G蛋白与人PS-1的结合
虽然上面已经描述了许多实施方案和特征，但是本领域技术人员会理解，在不脱离本公开的教导或者如后附权利要求书所限定的本公开范围的情况下，可以对所述的实施方案和特征作修改和改变。提供附件以进一步阐明但不是限制本发明。

Claims (10)

1.分离的多肽，其由选自下列的氨基酸序列组成：
(i)RQVVEQDEEEDEELT(SEQIDNO：16)，
(ii)还包含1-5个保守氨基酸置换的SEQIDNO：16，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(iii)在N-末端或C-末端还包含1-10个额外氨基酸的(i)或(ii)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(iv)还包含1-5个保守氨基酸置换的DEEEDEEL(SEQIDNO：5)，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(v)在N-末端或C-末端还包含1-10个额外氨基酸的DEEEDEEL(SEQIDNO：5)或(iv)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(vi)还包含1-5个保守氨基酸置换的RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(vii)在N-末端或C-末端还包含1-10个额外氨基酸的RRSLGHPEPLSNGRP(SEQIDNO：6)或(vi)的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(viii)还包含1-5个保守氨基酸置换的RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(ix)由在N-末端或C-末端还包含1-10个额外氨基酸的RRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：7)或(viii)组成的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(x)还包含1-5个保守氨基酸置换的DEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：17)，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，
(xi)由在N-末端或C-末端还包含1-10个额外氨基酸的DEEEDEELTLKYGAK(SEQIDNO：17)或(x)组成的序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP，以及
(xii)含有非天然氨基酸或D-氨基酸的前述任一序列，其中所述肽抑制细胞-细胞相互作用，抑制Aβ的产生或者结合至β-APP。
2.权利要求1的分离的多肽，其由RQVVEQDEEEDEELT(SEQIDNO：16)组成。
3.分离的多核苷酸，其基本上由编码权利要求1或2的多肽的核苷酸序列组成。
4.表达载体，其包含权利要求3的多核苷酸。
5.重组宿主细胞，所述重组宿主细胞中已经引入了权利要求4的多核苷酸。
6.表达权利要求1的多肽的方法，所述方法包括培养已经向其中引入编码所述多肽的多核苷酸的重组宿主细胞。
7.权利要求6的方法，还包括分离所述多肽。
8.分离的多肽，其通过权利要求6的方法产生。
9.权利要求1中所述的多肽在制备用于抑制Aβ的产生的药物中的用途。
10.权利要求1中所述的多肽在制备用于改善记忆的药物中的用途。
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