JP2003527835A - Ａｔｐシンターゼにおける調節内因性インヒビター - Google Patents

Ａｔｐシンターゼにおける調節内因性インヒビター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＡＴＰシンターゼとのＩＦ１の相互作用を開発する結合アッセイおよび機能アッセイを含む、ミトコンドリアＡＴＰ産生を変化させるための組成物および方法を提供する。ミトコンドリアＡＴＰ加水分解を減少し得、および／またはミトコンドリアＡＴＰ合成を増加させ得る化合物についてのスクリーニングアッセイのための方法も開示され、この化合物は、このような方法によって同定される薬学的組成物を含む。本発明はまた、開示される方法に従って同定される因子を使用して、糖尿病、特に２型ＤＭを処置するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本願は、１９９９年１１月１０日出願の米国仮特許出願第６０／１６４，６２
２号の利益を請求し、この仮出願は、その全体が本明細書中で参考として援用さ
れる。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、一般に、真性糖尿病に関し、そして特に、２型糖尿病の診断、予後
および処置のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、オル
ガネラへの細胞外ポリペプチドの直接送達のための組成物および方法に関し、糖
尿病を処置するための増加したミトコンドリアＡＴＰ産生の使用に関し、真性糖
尿病についての治療剤としてＩＦ１（ミトコンドリアＡＴＰアーゼの阻害因子）
およびその誘導体を使用する方法に関し、そして、真性糖尿病を（ｉ）引き起こ
すかもしくは寄与するか、または（ｉｉ）軽減するかもしくは処置するかのいず
れかである、因子を同定するために設計されるアッセイのための試薬としてＩＦ
１およびその誘導体を使用する方法に関する。
【０００３】 （発明の背景） ２型真性糖尿病、または「遅発性（ｌａｔｅ ｏｎｓｅｔ）」糖尿病は、先進
国における人口の５〜１０パーセントに影響する、一般的変性疾患である。２型
真性糖尿病（「２型ＤＭ」）を発症する傾向は、報告されるには母系遺伝性であ
り、このことは、ミトコンドリアの遺伝的関与を示唆する。（Ａｌｃｏｌａｄｏ
，Ｊ．Ｃ．およびＡｌｃｏｌａｄｏ，Ｒ．、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．３０２：１１７
８〜１１８０（１９９１）；Ｒｅｎｙ，Ｓ．Ｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍ．２３：８８６〜８９０（１９９４））。糖尿病は、強力な
遺伝的要素を有する異種遺伝子性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）障害であり；
一卵性双生児は非常に一致し、そして罹患した個体の一親等の身内の間でのこの
疾患の高い発生率が存在する。
【０００４】 ２型ＤＭについての現在の薬理学的治療としては、インスリン注入、および血
液グルコースレベルを低下するように設計された経口薬剤が挙げられる。現在利
用可能な経口薬剤としては、以下が挙げられる：（ｉ）スルホニルウレア（これ
は、グルコースに対する膵β細胞の感受性を増強し、それにより所定のグルコー
ス付加に応答するインスリン分泌を増加させることにより、作用する）；（ｉｉ
）ビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）（これは、グルコース排除速度を改善し
、そして肝臓グルコース排出を阻害する）；（ｉｉｉ）チアゾリジンジオン（ｔ
ｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）（これは、核ペルオキシソーム増殖因子活
性化レセプター（ＰＰＡＲ）との相互作用を介して、末梢インスリン感受性を改
善する）（例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、１９９８、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７
：５０７〜５１４；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｌｉｐｉｄｏｌ．８：１５９〜１６６；Ｓｔａｅｌｓら、１９９７、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｅ ７９：９５〜９９を参照のこと）；（ｉｖ）レパグリニド（ｒｅｐａ
ｇｌｉｎｉｄｅ）（これは、ＡＴＰ依存性カリウムチャネルとの相互作用を介し
てインスリン分泌を増強する）；ならびに（ｖ）アカルボーズ（ａｃａｒｂｏｓ
ｅ）（これは、糖質の腸での吸収を減少する）。
【０００５】 細胞レベルにて、遅発性真性糖尿病の特徴であり得る変性表現型としては、変
化したミトコンドリア呼吸機能の指標、例えば、インスリン分泌減損、減少した
ＡＴＰ合成および反応性酸素種の増加したレベルが、挙げられる。研究により、
２型ＤＭが、特定の関連する障害の後に続き得るか、またはそのような障害と関
連し得ることが、示された。例えば、米国において４，０００万人の個体がグル
コース寛容減損（ＩＧＴ）に罹患していると、推定される。グルコース付加後、
ＩＧＴ患者における循環中のグルコース濃度は、罹患していない個体よりも高い
レベルに上昇し、そしてよりゆっくり基礎レベルに戻る。ＩＧＴ個体の小さい割
合（５〜１０％）が、毎年非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）へと進行す
る。この形態の真性糖尿病（２型ＤＭ）は、膵β細胞による減少したインスリン
放出およびインスリンに対する減少した終末器応答に関連する。真性糖尿病およ
び真性糖尿病に先行するかまたは真性糖尿病に関連する状態の他の症状としては
、肥満、血管病理、末梢神経障害および感覚神経障害ならびに失明が挙げられる
。
【０００６】 現在の病理学的治療のいずれも、２型ＤＭにおいて根底にある生化学的欠損を
正さないことが、明らかである。これらの現在利用可能な処置のいずれも、２型
ＤＭにおける生理学的異常（例えば、インスリン分泌減損、インスリン耐性およ
び／または過度の肝臓グルコース排出）のすべてを改善することはない。さらに
、これらの因子を用いての処置の失敗が一般的であり、その結果、多剤治療が頻
繁に必要である。
【０００７】 真性糖尿病の強力な遺伝的成分に起因して、核ゲノムは、原因となる遺伝的変
異についての探索の主な焦点である。しかし、集中的努力に関わらず、真性糖尿
病を分離する核遺伝子はまれであり、そして例えば、インスリン遺伝子、インス
リンレセプター遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子における変異が挙げられる。
比較により、真性糖尿病を分離する多数の変化したミトコンドリア遺伝子が、報
告されている（一般的には、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０４０６３を参照のこ
と）が、細胞の呼吸活性および／または代謝活性に寄与するミトコンドリア因子
およびミトコンドリア外因子間の関係は、それらが糖尿病に関係するので、不十
分にしか理解されていないままである。
【０００８】 ミトコンドリアは、高等生物の細胞における主なエネルギー源であり、そして
広範な群の細胞の呼吸プロセス、酸化プロセスおよび代謝プロセスの直接的およ
び間接的な生化学的調節を提供する。このようなプロセスとしては、電子伝達鎖
（ＥＴＣ）活性を含み、この活性は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で代
謝エネルギーを生成するように酸化的リン酸化を駆動し、そして細胞内およびミ
トコンドリア内のカルシウムホメオスタシスのミトコンドリア調節を制御する。
【０００９】 ミトコンドリアの超微細構造的特徴付けにより、オルガネラと細胞質ゾルとの
間の界面として作用するミトコンドリア外膜、複数の部位でのこの外膜への付着
を形成するようである高度に折り畳まれたミトコンドリア内膜、ならびにこの２
つのミトコンドリア膜間の膜間腔の存在が明らかである。このミトコンドリア内
膜内のサブコンポーネントは、一般に、ミトコンドリアマトリックスと呼ばれる
。（概説について、例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．９１：２２７ｓを参照のこと）。稜（ミトコンドリア内膜の陥入として生
じるともともと推定されている）が、最近、３次元電子断層撮影を使用して、ネ
ットワークを形成し得そして内膜および／または膜間腔に開環（３０ｎｍ直径）
接合により連結し得ると特徴づけられた（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１９：２６０〜２
７２）。外膜は、約１０キロダルトン未満の分子量を有するイオン性および非イ
オン性の溶質に対して自由に透過性であるが、ミトコンドリア内膜は、多くの低
分子（特定のカチオンを含む）について選択的かつ調節された透過性を示し、そ
して大（約１０ｋＤａを超える）分子に対して不透過性である。
【００１０】 ＥＴＣ活性を媒介する５つのマルチサブユニットタンパク質複合体のうち４つ
（複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）は、ミトコンドリア内膜に局在化する。残
りのＥＴＣ複合体（複合体ＩＩ）は、マトリックスに位置する。ＥＴＣ内で生じ
ることが公知である少なくとも３つの別個の化学反応において、プロトンが、ミ
トコンドリアマトリックスから、内膜を越えて、膜間腔へと移動される。荷電し
た種のこの不均衡は、「プロトン駆動力」（ＰＭＦ）と呼ばれる約２２０ｍＶの
電気化学膜ポテンシャルを生じる。このＰＭＦは、しばしば、記号Δｐにより示
され、以下の等式： Δｐ＝ΔΨｍ−ＺΔｐＨ に従う電気ポテンシャル（ΔΨｍ）と内膜を越えるｐＨ差（ΔｐＨ）の合計に対
応し、ここで、Ｚは、−２．３０３ ＲＴ／Ｆを示す。Ｚの値は、ΔｐおよびΔ
ΨｍがｍＶにて表されかつΔｐＨがｐＨ単位で表される場合に、２５℃で−５９
である（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓ
、１９８１およびその中で引用される参考文献を参照のこと）。
【００１１】 ΔΨｍは、ＥＴＣ複合体ＶによるＡＴＰを生成する（マトリックスへのプロト
ンの輸送と化学量論的に共役しているプロセス）ようにアデノシン二リン酸（Ａ
ＤＰ）のリン酸化のためのエネルギーを提供する。ΔΨｍはまた、ミトコンドリ
アへの細胞質ゾルＣａ2+の流入のための駆動力である。基本的生物学的プロセス
（例えば、ポリペプチドを生成するためのｍＲＮＡ分子の翻訳）さえ、ΔΨｍに
依存し得る（Ｃｏｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７５３２〜７５３
８、１９９０）。正常な代謝条件下で、内膜は、膜間腔からマトリックスへのプ
ロトンの移動についてほとんど不透性であり、ＥＴＣ複合体Ｖを主な手段として
残され、それによりプロトンがマトリックスへと戻り得る。しかし、ミトコンド
リア内膜の完全性が損なわれた場合、変化したミトコンドリア機能に関係する特
定の疾患を伴うミトコンドリア透過性遷移（ＭＰＴ）の間に生じるように、プロ
トンは、ＡＴＰを生成することなく複合体Ｖの道を避けることができ、それによ
りＡＴＰ生成から呼吸を共役しない。ＭＰＴの間に、ΔΨｍは下落し、そしてミ
トコンドリア膜は、小さい溶質（例えば、イオン性のＣａ2+、Ｎａ+、Ｋ+、およ
びＨ+）および大きい溶質（例えば、タンパク質）に対する透過性を選択的に調
節する能力を失う。ミトコンドリアポテンシャルの損失はまた、変化したミトコ
ンドリア機能に関係する疾患（例えば、真性糖尿病であり、そしてまた、以下の
ような変性疾患を含む： アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病
；失調症；レーバー遺伝性視神経萎縮；精神分裂病；ミトコンドリア脳障害、乳
酸アシドーシスおよび発作（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｏ
ｐａｔｈｙ，ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ， ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ）（Ｍ
ＥＬＡＳ）癌、乾癬；過剰増殖性障害；ミトコンドリア性糖尿病および難聴（ｍ
ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｄｅａｆｅｓｓ）（Ｍ
ＩＤＤ）；ならびにＭＥＲＲＦ（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｒａ
ｇｇｅｄ ｒｅｄ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ））の進行における重要な事
象であるようである。
【００１２】 上記のように、生化学エネルギーが、ミトコンドリア酸化的リン酸化により生
成され、それにより電子が、ドナーＮＡＤＨからＥＴＣに沿って伝達され、そし
て最終的にＡＴＰ合成を共役したプロセスにおいてアクセプター酸素へと転移さ
れる。上記のようなミトコンドリア内膜を越える電気化学プロトン勾配に依存す
る様式で、ＥＴＣ複合体Ｖ（ＡＴＰシンターゼ、Ｆ0Ｆ1ＡＴＰアーゼまたはＡＴ
Ｐアーゼとも本明細書中で呼ばれる）は、細胞エネルギー需要に応じて、反応物
質ＡＤＰ＋エネルギーをＡＴＰへと可逆的に相互変換することができる。ＡＴＰ
シンターゼは、少なくとも１６個の異なるポリペプチドのマルチコンポーネント
複合体として存在し（Ｗａｌｋｅｒら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６
：３９）、プロトンポンプ活性が存在する膜貫通Ｆ0部分、および触媒（例えば
、ＡＴＰ合成またはＡＴＰ加水分解）活性を有するＦ1膜外部分を含む。球状の
触媒Ｆ1 ＡＴＰシンターゼ部分は、６つのポリペプチド（サブユニットα、β
、χ、δ、εおよびＡＴＰシンターゼインヒビタータンパク質ＩＦ1）を含み、
これは、核遺伝子によりコードされそしてミトコンドリア生合成の間にミトコン
ドリアへと輸送される。哺乳動物ＡＴＰシンターゼに類似する酵素複合体が、す
べての細胞型および葉緑体および細菌膜において見出される。
【００１３】 ＡＴＰ生成の調節は、ＩＦ１（ＩＦ1とも記される）により一部媒介され、Ｉ
Ｆ１は、ＡＴＰシンターゼＦ1部分の触媒活性を阻害する（例えば、Ｐｕｌｌｍ
ａｎら、１９６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：３７６２；Ｔｕｅｎａら
、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６６：６７７；Ｗａｌｋｅ
ｒら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：８６１３；Ｈｉｇｕｔｉら、１９９３
、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７２：３１１；米国特許第
５，９０６，９２３号およびこれらにおいて引用される参考文献を参照のこと）
。成熟ＩＦ１タンパク質は、約８４アミノ酸長（９．６ｋＤａ）であり、そして
約１０５アミノ酸の前駆タンパク質として合成され、この前駆タンパク質から、
Ｎ末端シグナル配列が、ミトコンドリアへの輸送後に切断される。ＩＦ１は、真
核生物（例えば、酵母および哺乳動物）において高度に保存される、ｐＨ感受性
の一次αへリックス構造を特徴とする（Ｌｅｂｏｗｉｔｚら、１９９３、Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０１：６４）。αへリックス立体構造
のＩＦ１は、ＡＴＰシンターゼインヒビターとして不活性であるが、ｐＨ＜６．
７において、ＩＦ１は、そのへリックス構造を失い、そして活性化されて、触媒
部分β（およびおそらくα）サブユニットに結合し、そしてＡＴＰシンターゼを
阻害する（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９８８、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２９：２２４
；Ｍｉｍｕｒａら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３５０）。ＡＴＰ
アーゼ活性のＩＦ１阻害はまた、ミトコンドリア膜ポテンシャルにより、そして
／またはリン脂質とのＩＦ１相互作用により、影響され得る（例えば、Ｓｏｌａ
ｉｎｉら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３２７：４４３およびその中に引用
される参考文献を参照のこと）。ＩＦ１および関連タンパク質が、例えば、ＷＯ
９８／３３９０９およびその中に引用される参考文献において記載される。
【００１４】 ミトコンドリアのエネルギー生成は、主に、グルコース刺激インスリン分泌（
ＧＳＩＳ）の調節を介して、グルコースホメオスタシスに関連する。グルコース
媒介インスリン分泌の一般に受け入れられているパラダイムに従うと、最初の段
階は、ｇｌｕｔ２グルコーストランスポーターを介するβ細胞へのグルコース取
り込みである（図２）。取り込みは、グルコース利用をかなり上回り、従って、
インスリン放出を誘発する事象の続発について律速的ではない（Ｍａｔｓｃｈｉ
ｎｓｋｙ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４５：２２３〜２４１（１９９６）；Ｎｅｗｇａ
ｒｄおよびＭｃＧａｒｒｙ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、６４：６８９
〜７１９（１９９５））。むしろ、分泌が開始される設定値を規定するようであ
るのは、その後のグルコースからグルコース−６リン酸（Ｇ６Ｐ）へのリン酸化
である。膵臓のランゲルハンス島（「島」）は、低Ｋｍ（ヘキソキナーゼＩ）お
よび高Ｋｍ（グルコキナーゼ＝ヘキソキナーゼＩＶ）の両方のグルコースリン酸
化活性を含む。グルコースのＫｍは、６〜１１ｍＭであり、一方ヘキソキナーゼ
ＩのＫｍは１０〜１００μＭである。さらに、ヘキソキナーゼＩは、その生成物
Ｇ６Ｐにより阻害されるが、一方グルコキナーゼは阻害されない。β細胞におけ
るグルコースリン酸化活性の大部分は、高Ｋｍグルコキナーゼにより説明される
。低ＫｍヘキソキナーゼＩは、Ｇ６Ｐによる阻害に起因して島において不活性で
あると考えられる。結果として、インスリン分泌は、血液グルコースが約５．５
ｍＭの生理学的レベルを超え始めた場合に、通常は生じる。
【００１５】 グルコキナーゼは、ミトコンドリア膜タンパク質ポーリン（ＶＤＡＣまたは電
位依存性アニオンチャネルとも呼ばれる）との相互作用により、β細胞における
ミトコンドリアの外表面に結合している（Ｍａｌａｉｓｓｅ−Ｌａｇａｅおよび
Ｍａｌａｉｓｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｍｅｔａｂ Ｂｉｏｌ，３９：８
０−８９，（１９８８）；Ｓｅｎｅｒら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ，２５１：６１−６７（１９８６）；Ｍｕｌｌｅｒら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３０８：８−２３（１９９４））。この状況は、ヘ
キソキナーゼＩＩと、肝臓および骨格筋におけるミトコンドリアとの相互作用、
ならびにヘキソキナーゼＩと肝臓のミトコンドリアとの相互作用に類似する（Ｇ
ｅｒｂｉｔｚら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：１１３−１２６（１９９６）；Ｗｅ
ｉｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ，３３：２２３−２３５（１９８５）；Ａ
ｄａｍｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９３２：１９５−２
０５（１９８８））。ポーリンは、ミトコンドリアアデニンヌクレオチドトラン
スロケーター（ＡＮＴ）と結合するので、ＧＫの細孔への結合は、酸化的に産生
されたＡＴＰの酵素への送達を促進し得、これにはミトコンドリアにより産生さ
れたＡＴＰが優先的に使用される（ＲａｓｓｃｈａｅｒｔおよびＭａｌａｉｓｓ
ｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｌａ，１０１５：３５３−３６０（
１９９０））。複合体ＶによるＡＴＰの再合成のためにミトコンドリアに戻され
るＡＤＰの送達はまた、この結合の機能であり得る（Ｌａｔｅｒｖｅｅｒら，
Ｉｎ Ｇｎａｉｇｅｒ Ｅ，Ｇｅｌｌｅｒｉｃｈ ＦＮ、およびＷｙｓｓ Ｍ
（編）： Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒｍｏｋｉｎｅｔ
ｉｃｓ ３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ，１８６−１９０頁（１９９４
））。グルコースセンサーとしてのグルコキナーゼの重要性は、グルコキナーゼ
遺伝子の変異を有する個体における糖尿病の発症により例示される（Ｆｒｏｇｕ
ｅｌら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２８：６９７−７０２（１９９３）；Ｂ
ｅｌｌら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，５８：１７１−１８６（１９９
６））。若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）は、臨床的にＮＩＤＤＭに類似
するが、２５歳より前の発症を有し、一般的に穏やかで、そして常染色体の優勢
伝達形式を有する、真性糖尿病の形態である。少なくとも３つの異なる変異が、
ＭＯＤＹファミリーにおいて同定されている（Ｂｅｌｌら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，５８：１７１−１８６（１９９６））。ＭＯＤＹ ２は、グル
コキナーゼ遺伝子の変異により特徴付けられ、この変異は、グルコキナーゼ活性
における推定５０〜１００％の減少、および減損したインスリン分泌を生じる（
Ｆｒｏｇｕｅｌら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３２８：６９７−７０２（１９
９３）；Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙら，Ｌａｎｃｅｔ，３３９：１３０７−１３１０
（１９９２））。いくらかグルコキナーゼ活性の残存する異型接合個体における
糖尿病の同時発生は、β細胞の速度制限グルコースセンサーとしてのグルコキナ
ーゼの役割を強調する。
【００１６】 グルコースリン酸化に続いて、Ｇ６Ｐのその後の運命は、ほとんど完全に、解
糖経路を通る代謝を経由する。なぜならば、ペントースリン酸経路は、相対的に
膵臓β細胞において不活性であり（Ａｓｈｃｒｏｆｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，
１２６：５２５−５３２（１９７２））、そしてグリコーゲン合成が７％以下の
グルコースフラックスの原因となる（ＭｅｇｌａｓｓｏｎおよびＭａｔｓｃｈｉ
ｎｓｋｙ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ，２：１６３−２１４（１９
８６））からである。Ｇ６Ｐに対して末端の解糖経路は、ＮＡＤＨの産生に関し
てインスリン分泌のために特に重要であるようであり（Ｄｕｋｅｓら，Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：１０９７９−１０９８２（１９９４）；ＭａｃＤｏｎ
ａｌｄおよびＦａｈｉｅｎ，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２７
９：１０４−１０８（１９９０））、これは、サイトゾルからミトコンドリアに
効率的に運ばれる。ここで、複合体１における電子伝達鎖に入り、そしてＡＴＰ
の酸化的産生に補給する。細胞代謝とインスリン分泌との間の次の明確な相関は
、細胞内ＡＴＰ：ＡＤＰ比の上昇であり（Ｅｒｅｃｉｎｓｋａら，Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１１０１：２７１−２９５（１９９２）；Ｌｏ
ｎｇｏら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６：９３１４−９３１９（１９９１）
；Ａｓｈｃｒｏｆｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１３２：２２３−２３１（１９７
３））、これが、β細胞形質膜におけるＡＴＰ感受性Ｋ+チャネルの閉鎖を引き
起こし、細胞の脱分極を生じる。グルコース負荷後のＡＴＰ：ＡＤＰの増加は、
主に酸化的起源のＡＴＰの上昇に起因すると考えられる（Ｍａｌａｉｓｓｅ，Ｉ
ｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５：５９３−７０１（１９９２））。実際、一連の
解糖インヒビタ−を使用して、Ｄｕｋｅｓら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９
：１０９７９−１０９８２（１９９４））は、酸化的に誘導されるＡＴＰのみが
β細胞におけるＫ+チャネルの閉鎖を引き起こし得ることを実証した。この膜脱
分極は、カルシウムのサイトゾルへの流入を伴うＣａ2+チャネルの開放をもたら
す。最終的にインスリンのエキソサイトーシスを生じるのは、細胞内カルシウム
の上昇である。培養（ＨＩＴ）においてβ細胞を使用して、Ｃｉｖｅｌｅｋおよ
び共同研究者ら（Ｃｉｖｅｌｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３１８：６１５−６
２１（１９９６ａ）；Ｃｉｖｅｌｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３１５：１０１
５−１０１９（１９９６ｂ））は、提案された時間的関係を確かめ、グルコース
リン酸化がＡＴＰ：ＡＤＰの上昇の前に起こり、この上昇は細胞内カルシウム上
昇の前に起こることを確立した。
【００１７】 グルコース媒介インスリン分泌のこのモデルに従って、β細胞ミトコンドリア
は、インスリン放出において重要な役割を果たす。細胞の研究において、ミトコ
ンドリア機能の操作は、正常なグルコースホメオスタシスを変更し得る。従って
、例えば、グルコース刺激インスリン分泌は、種々の代謝インヒビター（オリゴ
マイシン（ｏｌｇｏｍｙｃｉｎ）、アジド、アンチマイシン（ａｎｔｉｍｙｃｉ
ｎ）Ａ、ロテノン、シアニド、およびアンカップラーＦＣＣＰを含む）により細
胞レベルで排除され得る（ＭａｃＤｏｎａｌｄおよびＦａｈｉｅｎ，Ａｒｃｈ
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２７９：１０４−１０８（１９９０）；Ｄｅ
ｔｉｍａｒｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２９７：４５５−４６１（１９９４）；
Ｄｕｋｅｓら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：１０９７９−１０９８２（１
９９４）；Ｋｉｒａｎａｄｉら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２８３：９３−９６（１
９９１））。ＡＴＰシンターゼを阻害するためにオリゴマイシンを使用して、Ａ
ＴＰシンターゼの触媒活性は、インスリン分泌と密接に連結されることが示され
、その結果、酵素の活性における少量の欠損でさえ、グルコース刺激インスリン
分泌の同様な減損を引き起こすことが推測される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄｒｕｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（ｌ）：４７−６７（１９
９９））。
【００１８】 同様に、ｍｔＤＮＡを除去することによる全てのミトコンドリアコード酵素活
性の減少は、グルコース刺激インスリン分泌を排除する。Ｓｏｅｊｉｍａおよび
共同研究者ら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：２６１９４−２６１９９（１
９９６））は、ビス−４−ピペリジルジクロリドを使用して、マウス膵臓β細胞
株ＭＩＮ６からｍｔＤＮＡを除去した。これらの細胞は、検出可能なミトコンド
リアでコードされるタンパク質も、シトクロムオキシダーゼ活性も、そしてグル
コース刺激インスリン分泌も発現しなかった。Ｔｓｕｒｕｚｏｅおよび共同研究
者（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４７：６２１−６３１（１９９８））は、臭化エチジウ
ムでｍｔＤＮＡを除去されたＭＩＮ６細胞を使用して同様の一連の実験を行った
。それらの細胞株はまた、グルコースに応じてインスリンを分泌する能力または
細胞内ＡＴＰを増加する能力を欠失しているが、スルホニル尿素もしくはＫＣｌ
に応じてインスリンを分泌する能力を保持していた。Ｋｅｎｎｅｄｙおよび共同
研究者ら（Ｉｎｔ Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１−１１頁（１９９８））は、ラッ
ト由来ＩＮＳ−１細胞株を臭化エチジウムで処理して、ｍｔＤＮＡの大部分を除
去し、グルコースに対するＡＴＰ応答およびインスリン応答を同様に損失させた
。抗ウイルス化合物のジデオキシシチジン（ｄｄＣ）を使用してＩＮＳ−１細胞
からｍｔＤＮＡを除去する、有意に異なるアプローチもまた記載される（Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４７ 補遺１：Ａ２６０（１９９８））。Ｋ
ｅｎｎｅｄｙおよび共同研究者ら（Ｉｎｔ Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１−１１頁
（１９９８））により構築される細胞と同様に、ｄｄＣを使用して産生されたｐ
°ＩＮＳ−１細胞は、正常の基礎インスリン分泌を保持していたが、グルコース
チャレンジに応じてインスリン分泌を増加しなかった。対照的に、ＫＣｌに対す
る正常インスリン分泌は、これらの細胞において観察され、ミトコンドリアに対
して末端のインスリン分泌機構がインタクトであることを示唆した。同様に、細
胞内ＡＴＰレベルは、これらのｐ°ＩＮＳ−１細胞においてグルコースに応じて
変化しなかった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，４６：５７−６７（１９９９））。このｐ°細胞株における酸化
的ＡＴＰ産生から解糖的ＡＴＰ産生へのシフトはまた、親ＩＮＳ−１細胞に比較
して、ｐ°細胞によるラクテート産生の増加により実証された。
【００１９】 従って、グルコース刺激インスリン分泌における正常ミトコンドリア機能の重
要性についてほとんど疑いがない。しかし、グルコース利用におけるミトコンド
リアの役割（グルコースホメオスタシスの他の鍵となる成分）は、よく理解され
ていない。ミトコンドリア糖尿病のいくつかの場合における軽度から中程度イン
スリン耐性の発生は、ミトコンドリア機能がインスリン感受性に関与し得ること
を示唆する（Ｓｕｅら，Ｌａｎｃｅｔ ３４１：４３７−４３８（１９９３）；
ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：
３６８−３７１（１９９２）；Ｋｉｓｈｉｍｏｔａら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉ
ａ，３８：１９３−２００（１９９５））。さらに、２つの別々の研究は、正常
グルコース耐性を有する個体と比較した場合の、ＮＩＤＤＭまたは減損したグル
コース耐性（インスリン抵抗性により特徴付けられる）を有する患者の集団にお
けるｍｔＤＮＡの変更の発生率の増加を示した（Ｐｏｕｌｔｏｎら，Ｄｉａｂｅ
ｔｏｌｏｇｉａ，４１：５４−４８（１９９８）；Ｌｉａｎｇら，Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ，４６：９２０−９２３（１９９７））。末梢インスリン感受性におけるミ
トコンドリアの役割は、ヘキソキナーゼのミトコンドリアタンパク質ポーリンと
の相互作用に関連し得る。上記のように、ヘキソキナーゼは、骨格筋においてミ
トコンドリアと結合し、酵素の活性化を生じ（Ｄｅ Ｖｏｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｉｎｔ，２４：１１７−１２１（１９９１）；Ａｄａｍｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，９３２：１９５−２０５（１９８８）；Ｗｅｉｌｅ
ｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ，３３：２２３−２３５（１９８５））、そしてＡ
ＴＰの酵素への送達を促進する。ヘキソキナーゼの活性に対するミトコンドリア
変異およびミトコンドリア不全の特定の効果は、決定されないままであるが、減
損されたインスリン媒介グルコース利用に寄与し得る。ＮＩＤＤＭの一般的形態
を有する個体において、骨格筋におけるヘキソキナーゼ活性は、低いことが報告
され（Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９６：２６３
９−２６４５（１９９５）；Ｋｒｕｓｚｙｎｓｋａら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４７
：Ａ６６（１９９８））、そして高インスリン血症クランプ研究の間に正常に増
加しなかった（Ｋｒｕｓｚｙｎｓｋａら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４７：Ａ６６（１
９９８））。ＳｉｍｏｎｅａｕおよびＫｅｌｌｅｙ（Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ，８３：１６６−１７１（１９９７））は、ＮＩＤＤＭ骨格筋においてヘキ
ソキナーゼ活性の減少ではなくわずかな増加を観察したが、彼らは、解糖活性に
対する酸化的酵素活性の全体的な低下を証明した。ＮＩＤＤＭにおける代謝のこ
のような変更が一次的または二次的事象のいずれであるかは、まだ明らかではな
いが、これらの観察はさらに、末梢グルコース利用におけるミトコンドリア代謝
の潜在的役割を例示する。
【００２０】 成長する細胞におけるエネルギー産生におけるその役割に加えて、ミトコンド
リア（または少なくともミトコンドリア成分）は、プログラムされた細胞死（Ｐ
ＣＤ）（アポトーシスとしても公知）に関与する（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら，Ｃｅｌ
ｌ ７９：３５３−３６４，１９９４；Ｌｉｕら，Ｃｅｌｌ ８６：１４７−１
５７，１９９６）。アポトーシスは、明らかに神経系の正常発達、および免疫系
の適切な機能化に必要とされる。さらに、いくつかの疾患状態は、アポトーシス
の不十分なレベルまたは過剰なレベルに関連すると考えられる（例えば、癌、自
己免疫疾患および最初の例における糖尿病の可能な特定の形態、ならびに発作損
傷および後者の場合におけるアルツハイマー病の神経変性）。アポトーシス、お
よびアポトーシスにおけるミトコンドリアの役割の一般的概説については、例え
ば、ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９−１３１２
，１９９８），Ｇｒｅｅｎ（Ｃｅｌｌ ９４：６９５−６９８，１９９８）なら
びにＫｒｏｅｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６１４−６２０，
１９９７）を参照のこと。
【００２１】 明らかに、変更されたミトコンドリア機能の根底にあるこのような欠損がミト
コンドリア起源またはミトコンドリア外起源のいずれであり得るかに関わらず、
２型ＤＭを発症する危険性の初期検出のための改善された診断方法、およびこの
疾患の原因となる生化学的欠損および／または代謝欠損を修正するために標的化
されるより良好な治療剤の必要性が存在する。本発明は、ミトコンドリアエネル
ギー生成によるグルコース刺激インスリン分泌の調節を利用して、少なくとも部
分的に２型ＤＭにおける不適切なＧＳＩＳを克服することに関連する組成物およ
び方法を提供し、そして他の関連する利点を提供する。
【００２２】 （発明の要旨） ミトコンドリアＡＴＰ産生を変更する因子を同定するための方法を提供するこ
とが本発明の局面であり、この方法は、以下：（ｉ）候補因子の存在下でＡＴＰ
シンターゼサブユニットに、ＡＴＰシンターゼの内因性インヒビターが結合する
レベルを、（ｉｉ）候補因子の非存在下でＡＴＰシンターゼサブユニットに、Ａ
ＴＰシンターゼの内因性インヒビターが結合するレベルと、比較する工程を包含
し、ここで結合の変更されたレベルが、この因子がミトコンドリアＡＴＰ産生を
変更することを示す。特定の実施形態において、ＡＴＰシンターゼの内因性イン
ヒビターはＩＦ１であり、特定のさらなる実施形態では、このＩＦ１は、哺乳動
物ＩＦ１であり、そして特定のさらなる実施形態では、哺乳動物ＩＦ１は、マウ
スＩＦ１、ラットＩＦ１、ウサギＩＦ１、ウシＩＦ１、イヌＩＦ１、非ヒト霊長
類ＩＦ１またはヒトＩＦ１である。
【００２３】 別の実施形態において、本発明は、ミトコンドリアＡＴＰ産生を変更する因子
を同定するための方法を提供し、この方法は、以下：候補因子の非存在下および
存在下で、ＡＴＰ産生が起こるのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたって、
単離されたＩＦ１ポリペプチドおよび単離されたミトコンドリアＡＴＰシンター
ゼを接触させる工程であって、ここでこのＡＴＰシンターゼが、ＡＴＰ合成し得
る、工程；および候補因子の存在下でのＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ産生のレ
ベルを、候補因子の非存在下でのＡＴＰ産生のレベルを比較し、それによりミト
コンドリアＡＴＰ産生を変更する因子を同定する工程、を包含する。
【００２４】 別の実施形態では、本発明は、糖尿病を処置する方法を提供する。この方法は
、糖尿病の処置の必要な患者に、（ａ）細胞においてミトコンドリアＡＴＰの合
成を増大させるか、（ｂ）細胞においてミトコンドリアＡＴＰの加水分解を減少
させるか、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方を行う、有効量の化合物を投与す
る工程を包含する。特定の実施形態では、この化合物が、ＩＦ１の１以上の活性
を阻害する組成物またはＩＦ１を模倣する組成物である。別の実施形態では、本
発明は、糖尿病を処置するために有用な因子を同定する方法を提供する。この方
法は、ミトコンドリアを含むサンプルと候補因子とを接触させる工程、およびこ
のサンプルにおけるＡＴＰ量に対する化合物の効果を決定する工程を包含し、こ
こで、このサンプルにおけるＡＴＰの増加を生じる化合物が、糖尿病の処置のた
めに有用な因子として同定される。
【００２５】 別の実施形態では、本発明によって、糖尿病を処置するために有用な因子を同
定する方法が提供され、ミトコンドリアを含むサンプルと候補因子とを接触させ
る工程、およびこのミトコンドリアにおけるＡＴＰ量に対する化合物の効果を決
定する工程を包含し、ここで、このミトコンドリアにおけるＡＴＰの増加を生じ
る化合物が、糖尿病の処置のために有用な因子として同定される。
【００２６】 オルガネラを標的化する融合タンパク質を提供することが本発明の別の局面 あり、このオルガネラを標的化する融合タンパク質は、以下：（ａ）オルガネラ
標的化配列を含む第１のポリペプチド部分であって、ここで、このオルガネラ標
的化配列は、選択されたオルガネラへのタンパク質の局在化を促進し得る、第１
のポリペプチド部分；（ｂ）ｔａｔ配列を含む第２のポリペプチド部分；および
（ｃ）この第１のポリペプチド部分ともこの第２のポリペプチド部分とも異なる
アミノ酸配列を有する第３のポリペプチド部分を含み、ここで、このオルガネラ
を標的化する融合タンパク質は、接触時に細胞によって取り込まれ、そしてこの
選択されたオルガネラに優先的に局在化される。
【００２７】 他の実施形態では、オルガネラを標的化する化合物が提供され、このオルガネ
ラを標的化する化合物は、以下：（ａ）オルガネラ標的化配列を含む第１のポリ
ペプチド部分であって、ここで、このオルガネラ標的化配列は、選択されたオル
ガネラへのタンパク質の局在化を促進し得る、第１のポリペプチド部分；（ｂ）
「ｔａｔ配列」を含む第２のポリペプチド部分；および（ｃ）核酸部分を含み、
ここで、このオルガネラを標的化する化合物は、接触時に細胞によって取り込ま
れ、そしてこの選択されたオルガネラに優先的に局在化される。特定のさらなる
実施形態では、この核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザ
イム、発現カセット、発現構築物またはペプチド核酸である。
【００２８】 特定の他の実施形態では、オルガネラを標的化する化合物は検出可能な標識を
さらに含む。特定の実施形態では、この選択されたオルガネラがミトコンドリア
であり、かつこのオルガネラを標的化する配列がミトコンドリア標的化配列であ
り、特定のさらなる実施形態では、このミトコンドリア標的化配列が、配列番号
１０、配列番号１１または配列番号１４である。特定の他の実施形態では、この
選択されたオルガネラがゴルジ体であり、かつこのオルガネラを標的化する配列
がゴルジ標的化配列である。特定の他の実施形態では、この選択されたオルガネ
ラが核であり、かつこのオルガネラを標的化する配列が核標的化配列である。特
定の他の実施形態では、この選択されたオルガネラが葉緑体であり、かつこのオ
ルガネラを標的化する配列が葉緑体標的化配列である。特定の他の実施形態では
、この選択されたオルガネラが小胞体であり、かつこのオルガネラを標的化する
配列がＥＲ標的化配列である。別の実施形態では、本発明は、細胞中のオルガネ
ラに、オルガネラを標的化する融合タンパク質を送達する方法を提供し、この方
法は、この細胞と、直前に記載したオルガネラを標的化する融合タンパク質とを
接触させる工程を包含する。
【００２９】 別の実施形態では、本発明は、オルガネラを標的化する融合タンパク質をコー
ドする発現構築物を提供する。ここで、このオルガネラを標的化する融合タンパ
ク質は、以下：（ａ）オルガネラを標的化する配列を含む第１のポリペプチド部
分であって、ここで、このオルガネラを標的化する配列は、選択されたオルガネ
ラへのタンパク質の局在化を促進し得る、第１のポリペプチド部分；（ｂ）ｔａ
ｔ配列を含む第２のポリペプチド部分；および（ｃ）この第１のポリペプチド部
分ともこの第２のポリペプチド部分とも異なるアミノ酸配列を有する第３のポリ
ペプチド部分を含み、ここで、このオルガネラを標的化するタンパク質は、接触
時に細胞によって取り込まれ、そしてこの選択されたオルガネラに優先的に局在
化される。別の実施形態では、本発明は、直前に記載した発現構築物を含む宿主
細胞を提供する。特定の他の実施形態では、本発明は、オルガネラを標的化する
融合タンパク質を産生する方法を提供する。この方法は、直前に記載の宿主細胞
を培養する工程、およびこのオルガネラを標的化する融合タンパク質をこの宿主
から回収する工程を包含する。
【００３０】 本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照して明らか
となる。さらに、本発明の特定の局面をより詳細に記載する種々の参考文献が本
明細書中に示され、従って、これらの参考文献は、それらの全体において、参考
として援用される。
【００３１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、２型ＤＭを処置するための組成物および方法に関し、これには、ミ
トコンドリアＡＴＰ産生を改変する因子を同定するための方法が含まれる。従っ
て、本発明は、要点として、ミトコンドリアエネルギー産生によるグルコース刺
激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の調節が、２型ＤＭにおいて存在する不適切な
ＧＳＩＳの幾分かまたはすべての回復を可能にする様式で操作され得るという予
想外の観察に関連する。
【００３２】 従って、本発明の特定の好ましい実施形態では、ミトコンドリア機能は、本明
細書中に記載のようにＩＦ１とＡＴＰシンターゼとの間の相互作用を改変するこ
とによって、改変され得る（例えば、適切な制御と比較して統計的に有意な様式
で増加または減少され得、そして特定の非常に好ましい実施形態では、増加され
得る）。特定の実施形態では、ＡＴＰシンターゼとのＩＦ１相互作用は、例えば
、ＡＴＰシンターゼへのＩＦ１の結合を改変することによって改変され得、そし
て特定の実施形態では、ＩＦ１がＡＴＰシンターゼの触媒活性（これは、ＡＴＰ
シンターゼ活性および／またはＡＴＰ加水分解活性を含み得る）を改変または調
節する能力が、改変され得る。限定ではなく例示として、従って、本発明は、少
なくとも１つのＡＴＰシンターゼサブユニットとのＩＦ１の結合を改変するため
、またはＩＦ１の発現レベルを改変するため、またはＩＦ１の活性を改変するた
めの組成物および方法を意図する。
【００３３】 例えば、本発明は、ＡＴＰのＡＴＰシンターゼ触媒合成のＩＦ１阻害を妨げる
様式で、ＡＴＰシンターゼサブユニットへのＩＦ１結合を妨害する因子、および
この因子を同定するためのスクリーニングアッセイを意図する；本発明はまた、
ＩＦ１をコードする遺伝子の発現を妨害する因子、およびこの因子を同定するた
めのスクリーニングアッセイを意図する；本発明はまた、ＡＴＰシンターゼと相
互作用する能力を改変されている変異体ＩＦ１を意図する。また、上述のように
、ＩＦ１は、ＡＴＰシンターゼＦ１のαおよび／またはβサブユニット上の部位
に結合し得る。従って、本発明はまた、変異に起因して、ＩＦ１と機能的に相互
作用する能力において改変されている変異体ＡＴＰシンターゼサブユニットを意
図する。
【００３４】 本発明はまた、部分的に、オルガネラを標的化した融合タンパク質に関し、そ
して特定の実施形態では、オルガネラ選択的またはオルガネラ特異的な標的化配
列（ＯＴＳ）を含むＩＦ１融合タンパク質に関する。ポリペプチド標的化ドメイ
ンが当該分野において公知であるオルガネラの例が、本明細書中において手短に
記載されている。本明細書中の開示に基づき、そして当該分野において公知のよ
うに、当業者は、慣用的な方法によって、そして過度な実験を伴わずに、これら
および他のポリペプチド配列（または、それらをコードする核酸配列）を使用し
得、そしてＩＦ１融合タンパク質の適切な構造および所望されるオルガネラへの
送達を決定し得る。
【００３５】 （ミトコンドリア） 上記のように、ミトコンドリアは、高等生物体の細胞に
おける主要なエネルギー供給源であり、そして広範な一連の細胞性呼吸、酸化お
よび代謝プロセス（ＡＴＰを産生するための酸化的リン酸化を含む）、細胞内カ
ルシウムホメオスタシスならびにアポトーシスの直接的ならびに間接的な生化学
的調節を提供する。従って、例えば、ミトコンドリア標的化配列を含むミトコン
ドリアを標的化した融合タンパク質（この融合タンパク質はさらに、ミトコンド
リア成分と相互作用し得るポリペプチドドメインおよび／またはミトコンドリア
成分に影響を及ぼし得るポリペプチドドメインを含む）を含む因子は、種々の治
効的、治療的、待期的、リハビリテーション的、防害的、予防的、または疾患防
止的な用途を有し得る。
【００３６】 限定ではなく例示として、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質
誘導体は、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶタンパク質配列を使用し
て、ミトコンドリアマトリックスに標的化されており（Ｌｌｏｐｉｓら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６８０３−６８０８，１
９９３）、シトクロムｃタンパク質配列を使用してミトコンドリア膜間腔に標的
化されており（Ｍａｈａｊａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４
７−５５２，１９９８）、そしてヘキソキナーゼ（Ｓｕｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４５：１１１−１２５，１９９７）、Ｂｃｌ−２
またはＢａｘ（Ｍａｈａｊａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５４
７−５５２，１９９８）のタンパク質配列を使用してミトコンドリアの外膜に標
的化された。ＧＦＰ融合タンパク質はまた、３−オキソアシル−ＣｏＡチオラー
ゼ（Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
２４２：３９０−３９５，１９９８）、ＯＳＣＰ（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら，ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｌｔｓ．４１１：９７−１０１，１９９７）およびＢＮＩＰ３（Ｙａｓ
ｕｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２４１５−１２４２１，１９９
８）のタンパク質配列を用いて、ミトコンドリアに標的化された。エクオリン融
合タンパク質誘導体は、シトクロムｃオキシダーゼタンパク質配列を使用してミ
トコンドリアに標的化された（Ｐｉｎｔｏｎら，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ ８：２
４３−２５３，１９９８；Ｒｉｚｚｕｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ ３５８：３２５−
３２７，１９９２）。ミトコンドリア（または、細菌性）チオラーゼ（Ａｒａｋ
ａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｔｏｋｙｏ，１０７：１６０−１６４，１９
９０）、Ｆ0−ＡＴＰａｓｅサブユニット９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：２５２０８−２５２１２，１９９６）、マンガンスーパーオキシドジスムター
ゼ（Ｂａｌｚａｎ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．９２：４２１９−４２２３，１９９５）、およびＰ−４５０（ＳＣＣ）
（Ｋｕｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｔｏｋｙｏ，１０５：７２−７
８，１９８９）由来のタンパク質配列を使用して、ミトコンドリア部位に標的化
する他の融合タンパク質が記載されている。
【００３７】 （葉緑体） 葉緑体は、植物細胞内で見出されるオルガネラであり、ここにお
いて光合成が行われる。植物細胞の代謝の必須部分であることに加えて、光合成
はまた、多くの他の生存している生物に影響を与える重要なプロセスである。こ
の理由は、２つの面を有する：光合成は、大気ＣＯ2を生物学的に利用可能な炭
水化物（ＣＨＯ）n分子に「固定」し、そしてまた、すべての好気性生物によっ
て必要とされるＯ2を生成する。ミトコンドリアと同様に、葉緑体は、二重膜（
外膜および内膜）を有し、その自己のＤＮＡを含み、そして細胞質において見出
されるのとは異なる翻訳因子（リボソーム、ｔＲＮＡなど）を有する。電子顕微
鏡検査によって、葉緑体は、ミトコンドリアと同様に、ラメラまたはチラコイド
板（ｔｈｙｋａｌｏｉｄ ｄｉｓｃ）として公知の扁平の膜状体を含む、高度に
組織化された内部超微細構造を有することが実証された。しかし、葉緑体は代表
的に、ミトコンドリアよりもはるかに大きく；高等植物において、葉緑体は一般
に、円柱状の形状であり、そして長さが約５〜１０マイクロ、そして直径が０．
５〜２マイクロの範囲である。特定の組織（例えば、肝臓）において他の組織よ
りも多数で存在するミトコンドリアと同様に、葉緑体は、いくつかの組織におい
て他の組織よりも多くのコピー数を有する。例えば、成熟葉は多くの葉緑体を含
み、そしてこのような葉における葉緑体ＤＮＡの総量は、核ＤＮＡの総量の約２
倍である（Ｊｏｐｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７９：６３１−６３６、１９
７８）。
【００３８】 限定ではなく例示として、融合タンパク質は、ＳＣＥ７０熱ショックタンパク
質標的化配列を使用することによって、葉緑体外膜に標的化された（Ｗｕら，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９３８４−１９３９１，１９９３）。リスケ
鉄−硫黄タンパク質由来の標的化配列（Ｍａｄｕｅｎｏら，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：１７４５８−１７４６３，１９９４）のような他の標的化配列は
、融合タンパク質を、葉緑体のチラコイド膜の横断に指向させる。本発明が、ミ
トコンドリアおよび葉緑体に対して二重標的化し得る融合タンパク質を意図する
特定の実施形態では、二重標的化ポリペプチド配列を含む融合タンパク質を、（
Ｃｒｅｉｓｓｅｎら，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：１６７−１７５，１９９５；Ｈｕａ
ｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２４９−１２６０，１９９０）に記載の
ように使用し得る。逆に、植物細胞を使用し、そしてミトコンドリアのみまたは
葉緑体のみを標的化することが所望される場合には、二重標的化配列が使用され
ていないことを保証するために注意されなければならない。
【００３９】 （核） 核は、いくつかの染色体形態において最多の細胞性ＤＮＡ（質量でな
くとも、情報の観点から）を含むオルガネラである（ミトコンドリアおよび葉緑
体は、核ゲノムよりも代表的にはるかに小さく、従って、より少ない機能をコー
ドする、その独自のＤＮＡ分子を有する；しかし、細胞はわずか１つの核を含み
、そして多くのミトコンドリアおよび／または葉緑体を含み得るので、これらの
オルガネラ中のＤＮＡ分子の総質量は、核ＤＮＡの総質量に近似し得る）。核は
、集合的に核包膜と呼ばれる２つの膜（これらの膜は、核内膜および核外膜とし
て公知である）によって境界付けられる。高分子（最も特には、ＲＮＡ分子）は
、核孔と呼ばれる核包膜における開口部を通して、細胞質ゾルへまたは細胞質ゾ
ルから運搬される。核の場合、限定ではなく例示として、エクオリン融合タンパ
ク質誘導体が、核質タンパク質配列を使用して核に標的化された（Ｂａｄｍｉｎ
ｔｏｎら，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１２１０−３１２１４，１９９
７）。
【００４０】 （小胞体） 小胞体（ＥＲ）は、一連の扁平なシート、管、大きな細胞内空間
を囲む嚢からなる。ＥＲの膜は、核外膜と構造的に一続きとなっており、そして
細胞質全体に及ぶ。ＥＲのいくつかの機能としては、膜タンパク質および脂質の
合成および輸送が挙げられる。概して言うと、２つの型のＥＲが細胞中に存在し
得る。滑面ＥＲは、一般的に管状形態であり、そして代表的に付着したリボソー
ムを欠き；滑面ＥＲの１つの主要な機能は、脂質代謝である。粗面ＥＲは代表的
に扁平なシートとして存在し、その細胞質側は通常、多くの活性な（タンパク質
合成している）リボソームと結合している。非限定的な例として、エクオリン融
合タンパク質誘導体は、カルレティキュリンタンパク質配列を使用して、小胞体
へと標的化された（Ｋｅｎｄａｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９．１００８−１０１６，１９９２）。
【００４１】 （ゴルジ体） ゴルジ体は、積重なり、扁平な、そして膜に囲まれた嚢の系で
あり、そして一般的に、分泌または他の細胞下区画への送達のために高分子を改
変、分類、およびパッケージングすることに関与していると考えられている。多
数の小さな（約５０ｎＭ以上の）膜に取り囲まれた小胞があり、これらは、ゴル
ジ体と他の細胞下区画との間のその輸送を行うために高分子を含むと考えられて
いる。
【００４２】 エクオリン融合タンパク質誘導体は、例えば、ガラクトシルトランスフェラー
ゼ、ＳＮＡＰ−２５、コネキシンおよび５−ＨＴ1A−レセプタータンパク質を使
用して、ゴルジ膜に標的化された（Ｂｕｒｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉ
ｏｌ．７：４１９−４３４，１９９６；Ｍａｒｓａｕｌｔら，ＥＭＢＯ Ｊ １
６：１５７５−１５８１，１９９７；Ｄａｇｕｚａｎら，Ｉｎｔ．Ｊ Ｄｅｖ．
Ｂｉｏｌ．３９：６５３−６５７，１９９５）。ＧＦＰ融合タンパク質は、ガラ
クトシルトランスフェラーゼタンパク質配列を使用して、ゴルジ体に標的化され
た（Ｌｌｏｐｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９
５．６８０３−６８０８，１９９３）。
【００４３】 一般的に、本発明のオルガネラを標的化した分子は、以下の構造を有する： （ＯＥＴ）−（ＣＴＳ）−（ＯＴＳ）−（ＭＯＩ） （構造１）、 （ＯＥＴ）−（ＯＴＳ）−（ＣＴＳ）−（ＭＯＩ） （構造２）、 （ＯＥＴ）−（ＣＴＳ）−（ＭＯＩ）−（ＯＴＳ） （構造３）、 （ＯＥＴ）−（ＯＴＳ）−（ＭＯＩ）−（ＣＴＳ） （構造４）、 （ＯＥＴ）−（ＭＯＩ）−（ＯＴＳ）−（ＣＴＳ） （構造５）、 （ＯＥＴ）−（ＭＯＩ）−（ＣＴＳ）−（ＯＴＳ） （構造６）、 （ＯＴＳ）−（ＣＴＳ）−（ＯＥＴ）−（ＭＯＩ） （構造７）、 （ＯＴＳ）−（ＯＥＴ）−（ＣＴＳ）−（ＭＯＩ） （構造８）、 （ＯＴＳ）−（ＣＴＳ）−（ＭＯＩ）−（ＯＥＴ） （構造９）、 （ＯＴＳ）−（ＯＥＴ）−（ＭＯＩ）−（ＣＴＳ） （構造１０）、 （ＣＴＳ）−（ＯＴＳ）−（ＭＯＩ）−（ＯＥＴ） （構造１１）、 （ＣＴＳ）−（ＯＴＳ）−（ＯＥＴ）−（ＭＯＩ） （構造１２）、 （ＭＯＩ）−（ＯＥＴ）−（ＯＴＳ）−（ＣＴＳ） （構造１３）、 （ＭＯＩ）−（ＯＥＴ）−（ＣＴＳ）−（ＯＴＳ） （構造１４）、 などであり、ここで、 「ＯＥＴ」は、任意のエピトープタグ（例えば、Ｈｉｓタグ（配列番号１），
ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ（配列番号２），ＡＵ１エピトープ（配列番号
３），ＡＵ５エピトープ（配列番号４），ｃ−ｍｙｃエピトープ（配列番号５）
，Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ（配列番号６），ＨＡ．１１エピトープ（配列番号
７），ＩＲＳエピトープ（配列番号８），またはＫＴ３エピトープ（配列番号９
））を示し； 「ＣＴＳ」は、細胞性輸送配列を示し、好ましい配列は、本明細書中で「ＴＡ
Ｔ ＣＴＳ」（配列番号１０、１１および２７）と記載され； 「ＯＴＳ」は、オルガネラ標的化配列を示し；ならびに 「ＭＯＩ」は、特定のオルガネラに標的化することが所望される目的の分子（
例えば、ポリペプチドまたは核酸）を示す。特定の好ましい実施形態では、ＭＯ
Ｉは、ＩＦ１ポリペプチドであり、そして特定の他の好ましい実施形態では、Ｍ
ＯＩは、本明細書中に提供されるような、ＩＦ１ポリペプチド、またはそのフラ
グメント、誘導体、変異体もしくは改変体をコードする核酸配列である。特定の
実施形態では、ＭＯＩは、アンチセンスＩＦ１核酸、例えば、ＩＦ１コード核酸
配列の一部の逆相補体であり得る（例えば、開始メチオニンをコードするＡＴＧ
配列の逆相補体を含む）。他の実施形態では、ＭＯＩは、ＡＴＰシンターゼへの
その結合不全について選択された変異ＩＦ１ポリペプチド（または、このような
変異ＩＦ１をコードする核酸）であり得る。他の実施形態では、ＭＯＩは、ＡＴ
Ｐシンターゼ触媒活性を活性化するその能力について選択された変異ＩＦ１ポリ
ペプチド（または、このような変異ＩＦ１をコードする核酸）であり得る。
【００４４】 上記に示したように、これらのエレメントは、左側のアミノ（Ｎ−）末端から
右側のカルボキシ（Ｃ−）末端へと配置される。これらのエレメントの順序が変
更され得、そしてさらなるエレメントが、その種々のエレメントの機能が保持さ
れ、かつ所望のオルガネラへの送達が損なわれない限りにおいて、オルガネラ標
的化分子に付加され得ることが、当業者に理解される。
【００４５】 ＣＴＳ（細胞性輸送配列）は、共有結合した分子を標的細胞中に送達し得るポ
リペプチドである。好ましいＣＴＳは、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質またはＨ
ＩＶ−１ ｔａｔ由来ポリペプチドであり、本明細書または米国特許第５，６７
０，６１７号；同第５，６７４，９８０号；同第５，７４７，６４１号；もしく
は同第５，８０４，６０４号に記載されるようなものである。他のウイルス（例
えば、ＨＩＶ−２（Ｇｕｙａｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９
，１９８７），ウマ伝染性貧血ウイルス（Ｃａｒｒｏｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６５：３４６０−３４６７，１９９１），およびサル免疫不全ウイルス５（Ｃｈ
ａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４３−５４７，１９８７）；
Ａｒｙａら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４８−５５０，１９８７））由来のｔａ
ｔタンパク質が公知である。これらのｔａｔタンパク質由来のＴＡＴポリペプチ
ドが、本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。細胞中への進入およ
び取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴポリペプチドは、公知技術（例えば、Ｆ
ｒａｎｋｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：
７３９７−７４０１，１９８９を参照のこと）および指針として本発明の開示を
使用して、規定され得る。
【００４６】 本発明は、一部、２型糖尿病（２型ＤＭ）の処置のためにミトコンドリアエネ
ルギー産生およびＧＳＩＳを調節するための組成物および方法に関する。本発明
の特定の有用な実施形態としては、以下が挙げられる： （１）糖尿病を処置するための方法であって、この方法は、糖尿病の処置を必
要とする個体の細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ合成を増加させること、また
はミトコンドリアＡＴＰの加水分解を減少させること（または両方）を包含する
； （２）少なくとも１つのＩＦ１タンパク質および少なくとも１つのＡＴＰシン
ターゼサブユニットの結合相互作用を変更する（例えば、増加または減少させる
）因子についてスクリーニングまたは同定する方法であって、この方法は、ＡＴ
ＰシンターゼサブユニットへのＩＦ１結合を可能にするに十分な条件および時間
のもとで、１以上の候補因子または試験化合物の存在下または非存在下において
、少なくとも１つのＩＦ１タンパク質と、少なくとも１つのＡＴＰシンターゼサ
ブユニットとを接触させた後に、ＡＴＰシンターゼサブユニットへのＩＦ１結合
のレベルを比較する工程を包含する； （３）ＡＴＰシンターゼ触媒活性に対するＩＦ１タンパク質の効果を変更する
因子をスクリーニングまたは同定する方法であって、この方法は、１以上の候補
因子または試験化合物の存在下または非存在下においてＡＴＰシンターゼ触媒活
性を検出するに十分な条件および時間のもとで、ＩＦ１タンパク質と、触媒能を
有するＡＴＰシンターゼとを接触させることによって、候補因子の非存在下での
活性レベルに対して、候補因子の存在下でのＡＴＰシンターゼ触媒活性（例えば
、シンターゼ活性および／または加水分解酵素活性）のレベルを比較する工程、
ならびにＡＴＰシンターゼの活性を決定する工程を包含する； （４）ＩＦ１タンパク質の活性に影響を及ぼす因子をスクリーニングまたは同
定する方法であって、この方法は、１以上の候補因子または試験化合物と、ＩＦ
１タンパク質を含む少なくとも１つの細胞を接触させる工程、および少なくとも
１つのミトコンドリア活性を測定する工程を包含する；ならびに、 （５）ＩＦ１タンパク質をコードする核酸の発現を変更する因子をスクリーニ
ングまたは同定する方法であって、この方法は、１以上の候補因子または試験化
合物と、ＩＦ１タンパク質をコードする核酸を含む少なくとも１つの細胞を接触
させる工程、およびＩＦ１タンパク質の発現を測定する工程を包含する。
【００４７】 （定義および一般的方法） 他に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学
技術用語は、本発明が関与する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意
味を有する。一般的に、本明細書中で使用されている命名法、ならびに以下で記
載される細胞生物学、化学、微生物学、分子生物学、細胞科学、細胞培養および
組織培養における実験手順は、当該分野において周知であり、そして一般的に使
用されている。従来の方法（例えば、当該分野および種々の一般的な参考文献に
おいて提供される方法）が、これらの手順のために使用される（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））。用語が単数で提供さ
れている場合、本発明者らはまた、この用語の複数も意図する。本明細書中で使
用される命名法および以下に記載される実験手順は、当該分野において周知であ
り、かつ一般的に使用されているものである。
【００４８】 （定義） 「膜透過誘導体」は、化合物の膜透過性を増大する化合物の化学的な誘導体を
いう。これらの誘導体は、親水性の基がより疎水性の誘導体を提供するようにマ
スクされるので、より良好に細胞膜を通過するようになる。また、マスクする基
は、細胞内で化合物から切断されるように設計され得、一旦細胞内に入ると化合
物がより親水性になる。基質は膜透過誘導体よりも親水性であるので、これは細
胞内に優先的に局在化される（１９９８年４月２１日に発行されたＴｓｉｅｎら
、米国特許第５，７４１，６５７号）。
【００４９】 「単離されたポリペプチド」は、ゲノムのポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、また
はＰＣＲもしく合成の起源のもの、あるいはそれらの組合せをいう。これらの起
源によって、単離されたポリヌクレオチドは、（１）単離されたポリヌクレオチ
ドが天然において見出される細胞と会合していない、または（２）天然において
は連結していないポリヌクレオチドに対して作動可能に連結されている。単離さ
れたポリヌクレオチドは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、または
他の調節配列に対して作動可能に連結され得る。
【００５０】 「単離されたタンパク質」は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成の起源の
もの、あるいはそれらの組合せをいう。その起源によって、単離されたタンパク
質は、（１）天然において通常に見出されるタンパク質とは会合していないか、
または（２）通常存在する細胞から単離されているか、または（３）同じ細胞の
供給源に由来する他のタンパク質を含まない（例えば、細胞性のタンパク質を含
まない）で単離されているか、または（４）異なる種に由来する細胞によって発
現されるか、あるいは（５）天然には存在しない。
【００５１】 「ポリペプチド」は、天然のタンパク質、フラグメント、またはポリペプチド
配列のアナログをいうような遺伝的な用語として、本明細書中で使用される。
【００５２】 「活性なフラグメント」は、有機分子、核酸分子、またはタンパク質もしくは
ポリペプチド、あるいはそれらの組合せのような親分子のフラグメントをいう。
これらは、親分子の少なくとも１つの活性を保持している。
【００５３】 「天然に存在している」は、対象が天然に見出され得るという事実をいう。例
えば、天然の供給源から単離され得、そして研究室中で人によって故意に改変さ
れていない、生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド配列は、天然に存在している。
【００５４】 「作動可能に連結される」は、そのように記載された成分がそれらがそれらの
意図される様式で機能することを可能にする関係である並置をいう。コード配列
に対して作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合
性である条件下で達成されるような様式で連結される。
【００５５】 「制御配列」は、それらが連結されるコード配列および非コード配列の発現を
達成するポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物
体に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列は一般的には、
プロモーター、リボソームの結合部位、および転写終結配列を含む；真核生物に
おいては、一般的には、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配
列を含む。用語制御配列は、その存在が発現に影響を与え得る成分を含むことが
意図され、そしてまた、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、リーダー
配列および融合パートナー配列）を含み得る。
【００５６】 「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチ
ドのいずれか、またはいずれかの型のヌクレオチドから改変された形態、少なく
とも１０塩基の長さのヌクレオチドの多分子の形態をいう。この用語は、ＤＮＡ
またはＲＡの一本鎖および二本鎖の形態を含む。
【００５７】 「ゲノムポリヌクレオチド」は、核のゲノムの一部をいう。
【００５８】 「ミトコンドリアのゲノムポリヌクレオチド」は、ミトコンドリアのゲノムの
一部をいう。
【００５９】 「活性なゲノムポリヌクレオチド」または「ゲノムの活性な部分」は、生物学
的なプロセスによって直接または間接的にのいずれかで、アップレギュレートさ
れるか、ダウンレギュレートされるか、またはそれらの両方をされ得るゲノム（
核のまたはミトコンドリアのゲノム）の領域をいう。
【００６０】 「リボザイム」は、ＲＮＡの特異的な切断を触媒し得る酵素性のＲＮＡ分子を
意味する。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分
子の配列特異的なハイブリダイゼーション、それに続く内ヌクレオチド結合分解
性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）の切断を含む。任意の可能性のあるＲＮ
Ａ標的内の特異的なリボザイムの切断部位が、配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵ
Ｃを含むリボザイム切断部位の標的ＲＮＡ標的をスキャンすることによって最初
に同定される。一旦同定されると、切断部位を含有している標的遺伝子の領域に
対応する１５から２０個の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌ
クレオチドを実施不可能にし得る二次的な構造特性について評価され得る。候補
の標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補的なオリ
ゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの利用可能性を試験することによっ
て評価され得る。
【００６１】 生物学的プロセス（単数または複数）の状況においては、「直接的」は、１つ
の分子が別の分子（同じ型の分子または異なる型の分子）に対して接触または結
合することによって通常は引き起こされる中間の工程を必要とせずにプロセスを
直接引き起こすことをいう。例えば、分子Ａは分子Ｂに接触し、これによって分
子Ｂは生物学的プロセスの一部である効果Ｘを発揮する。
【００６２】 生物学的プロセス（単数または複数）の状況においては、「間接的」は、２つ
以上の直接的な工程によって通常引き起こされる中間の工程を必要とする間接的
な原因をいう。例えば、分子Ａは分子Ｂに接触して、効果Ｘを発揮し、次いで効
果Ｙを生じる。
【００６３】 「配列同一性」は、２つの核酸配列間での塩基の適合の割合、または２つのア
ミノ酸配列間のアミノ酸の適合の割合をいう。配列同一性が、例えば、５０％の
割合として示される場合、この割合は、いくつかの他の配列と比較した所望され
る配列に由来する配列の長さの適合の割合を示す。ギャップ（２つの配列のいず
れかにおける）は、適合を最大にすることを可能とされる；１５塩基以下のギャ
ップの長さが通常は使用され、好ましくは６塩基以下であり、２塩基以下がより
好ましい。プローブとしてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的の核酸と
オリゴヌクレオチド配列との間での配列同一性は、好ましくは、２０のうちの１
０未満の標的の塩基の適合（５０％）であり、より好ましくは、約６０％の同一
性、７０％の同一性、８０％の同一性、または９０％の同一性より少なく、そし
て最も好ましくは、９５％未満の同一性である。
【００６４】 「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能でありそして特異的に結合する
ことをいう。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらのフラグメ
ントは、標的核酸の鎖に対して、非特異的な核酸に対する検出可能な結合の感知
される量を最少にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、選択的
にハイブリダイズする。高いストリンジェンシーの条件が、当該分野で公知の選
択的なハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般的には
、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらのフラグメントと、目
的の核酸配列との間での核酸配列の同一性は、少なくとも３０％であり、そして
より代表的かつ好ましくは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、または９０％である。
【００６５】 ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、代表的には、従来のハイブリ
ダイゼーション手順に従って高ストリンジェンシーで行われる。ポジティブなク
ローンが単離され、そしてスクリーニングされる。例えば、全長のポリヌクレオ
チド配列は、当該分野で公知である場合には、標識され得、そして、適切な標的
ライブラリーからゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用される。プラークリフトをスクリーニングするためおよび他の目
的のための代表的なハイブリダイゼーション条件および方法が、当該分野で公知
である（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０（１
９７８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出（１９８９））。
【００６６】 ２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的にまたは完全な同一性が存在
する場合には、相同である。例えば、８５％の同一性は、２つの配列が最大の適
合のために整列（アラインメント）される場合、アミノ酸の８５％が同一である
ことを意味する。ギャップ（適合する２つの配列のいずれかにおける）が、適合
を最大にするために許容される；５以下のギャップの長さが好ましく、２以下が
より好ましい。あるいは、そして好ましくは、２つのタンパク質の配列（または
少なくとも３０アミノ酸の長さのものに由来するポリペプチド配列）は、この用
語が本明細書中で使用される場合、それらが変異データマトリックスを有するプ
ログラムＡＬＩＧＮを使用して少なくとも５（標準偏差単位）のアラインメント
スコア、および６以上のギャップペナルティーを有する場合に、相同である（Ｄ
ａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、第５巻、１０１−１１０頁（１９７２）、およ
び補遣２、１〜１０頁）。
【００６７】 「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチドの全てまた
は一部に対して相同（例えば、同一である）であること、またはポリペプチド配
列が参照ポリペプチド配列のヌクレオチド配列の全体または一部に対して同一で
あることをいう。対照的に、用語「相補的である」は、本明細書中では、相補的
な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対して相同である相補的
な配列を意味するように使用される。例として、ヌクレオチド配列ＴＡＴＡＣは
、参照配列ＴＡＴＡＣに対応し、そして参照配列ＧＴＡＴＡに対して相補的であ
る。
【００６８】 以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために
使用される：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一
性の割合」、および「実質的な同一性」。参照配列は、配列比較のための基準と
して使用される定義された配列である；参照配列は、大きな配列（例えば、配列
表に与えられる全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして）のサブセ
ットであり得るか、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含み得る。一般
的には、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、頻繁に少なく
とも２５ヌクレオチドの長さであり、そしてしばしば少なくとも５０ヌクレオチ
ドの長さである。２つのポリヌクレオチドがそれぞれ、（１）２つのポリヌクレ
オチド間で類似である配列（例えば、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含
み得、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含み得るの
で、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間での配列比較は、代表的には
、配列類似性の局所的な領域を同定しそして比較するために、「比較ウィンドウ
」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。
比較ウィンドウは、本明細書中で使用される場合、少なくとも２０個の連続した
ヌクレオチドの位置の概念上のセグメントをいう。ここでは、ポリヌクレオチド
配列が少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの参照配列と比較され得、そし
て比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部が２つの配列の最適なアライ
ンメントのために参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較される
場合に、２０％以下の付加および欠失（例えば、ギャップ）を含み得る。比較ウ
ィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、局所的な
同一性アルゴリズムによって（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａ
ｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））、同一性アラインメントアルゴリ
ズムによって（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．，４８：４４３（１９７０））、類似的な方法のための検索によって（Ｐｅａ
ｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ
．Ａ．８５：２４４４（１９８８））、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、
およびＴＦＡＳＴＡのようなこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実
施によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａ
ｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または目視検査によって行われ得る。好ましく
は、種々の方法によって生成された最良の整列（アラインメント）（例えば、比
較ウィンドウにわたって最も高い同一性の割合を有する結果）が、選択される。
【００６９】 「完全配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウに
わたって同一である（例えば、ヌクレオチド−対−ヌクレオチド基準で）ことを
意味する。
【００７０】 「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列（アラインメント）さ
れた配列を比較のウィンドウにわたって比較すること、両方の配列中で同一の核
酸塩基が生じる位置の数を決定して適合した位置の数を得ること、比較ウィンド
ウ中の位置の総数（例えば、ウィンドウの大きさ）で適合した位置の数を割り算
すること、そして結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計
算される。
【００７１】 「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合は、ポリヌクレオチド配
列の特徴を示す。ここでは、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオ
チドの位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば、少なくとも２５個から５０
個のヌクレオチドのウィンドウにわたって、参照配列に対して比較される場合に
は、少なくとも３０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも５０から６０
％の配列同一性、より通常には、少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を
含む。ここでは、配列同一性の割合は、比較ウィンドウにわたって参照配列の全
体の２０％以下である欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列に対して
、参照配列を比較することによって、計算される。
【００７２】 「実質的な同一性」は、本明細書中でポリペプチドに対して適用される場合は
、例えば、デフォルトギャップ重量を使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴ
ＦＩＴによって最適にアラインメントされた場合に、２つのペプチド配列が、少
なくとも３０％の配列同一性を共有する、好ましくは、少なくとも４０％の配列
同一性、そしてより好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、そして最も好ま
しくは少なくとも６０％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、
同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００７３】 「保存的アミノ酸置換」は、同様の大きさの鎖を有している残基の互換性をい
う。例えば、脂肪族の側鎖を有しているアミノ酸のグループは、グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである；脂肪族−ヒドロキシル側
鎖を有しているアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンである；アミド
を含有している側鎖を有しているアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグ
ルタミンである；芳香族の側鎖を有しているアミノ酸のグループは、フェニルア
ラニン、チロシン、およびトリプトファンである；塩基性の側鎖を有しているア
ミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである；そしてイ
オウを含有している側鎖を有しているアミノ酸のグループは、システインおよび
メチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換のグループは：バリン−ロイ
シン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラ
ニン−バリン；グルタミン−アスパラギン；およびアスパラギン酸−グルタミン
酸である。
【００７４】 「調節」は、生物学的活性またはプロセス（例えば、酵素活性またはレセプタ
ーの結合）の機能的な特性を増強するかまたは阻害するかのいずれかである能力
をいう。このような増強または阻害は、特異的な事象（例えば、シグナル伝達経
路の活性化）の出現に対して付随的であり得、そして／または特定の細胞型にお
いてのみ顕著であり得る。
【００７５】 「調節因子」は、生物学的なマクロ分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプ
チド、または有機分子）のような、化学薬品（天然に存在しているかまたは天然
には存在していない）、あるいは、生物学的な物質（例えば、原核生物、細菌、
真核生物、植物、真菌、多細胞の生物体、または動物、無脊椎動物、脊椎動物、
哺乳動物、およびヒト）から作成された抽出物をいう。これらは、適切である場
合には、生物体全体または生物の一部、細胞、器官、組織、体液、全培養物もし
くは培養物の一部、または環境的なサンプルもしくはその一部の抽出物を含む。
調節因子は、代表的には、生物学的なプロセス（単数または複数）の（直接また
は間接的に）インヒビターまたは活性化因子（例えば、アゴニスト、部分的なア
ンタゴニスト、部分的なアゴニスト、アンタゴニスト、新生物の形質転換体また
は細胞増殖の抗新生物性細胞毒性のインヒビター、細胞増殖促進因子、抗ウイル
ス剤、抗菌剤、抗細菌剤、抗生物質など）としての潜在的な活性について、本明
細書中に記載されているアッセイに含まれることによって評価される。調節因子
の活性は、公知であり得るか、未知であり得るか、または部分的に公知であり得
る。
【００７６】 「試験化合物」は、推定の調節因子であることが本発明の少なくとも１つの方
法によって試験される、「試験化合物」のような試薬または化合物を含む化学薬
品または抽出物をいう。試験化学薬品は、通常、目的の標的に結合することが公
知ではない。「コントロール試験化学薬品」は、標的に結合することが公知の化
学薬品をいう（例えば、公知のアゴニスト、アンタゴニスト、部分的なアゴニス
ト、または逆のアゴニスト）。試験化合物は、代表的には、アッセイにおけるシ
グナルの特異性を決定するための標的の機能を変更するコントロール条件として
は、混合物に添加される化学薬品を含まない。このようなコントロール化学薬品
または条件として、以下の化学薬品が挙げられる：（１）タンパク質構造を非特
異的にまたは実質的に破壊する化学薬品（例えば、尿素またはグアンジウム、ス
ルフヒドリル試薬（例えば、ジチオトリトールおよびβ−メルカプトエタノール
）のような変性剤）、（２）一般的に細胞の代謝を阻害する化学薬品（例えば、
ミトコンドリアルアンカップル）、ならびに（３）タンパク質の電気的または疎
水性相互作用を非特異的に破壊する化学薬品（例えば、疎水性相互作用または電
気的な相互作用を非特異的に破壊するために十分な濃度での高塩濃度または界面
活性剤）。用語試験化学薬品はまた、代表的には、被験体の毒性に起因して特定
の指標の治療的な使用のためには不適切であることが公知の化合物は含まない。
試験化学薬品の分子量が公知である場合は、以下の範囲の濃度が使用され得る：
約０．００１マイクロモル〜約１０ミリモルの間、好ましくは、約０．０１マイ
クロモル〜約１ミリモルの間、より好ましくは、約０．１マイクロモル〜約１０
０マイクロモルの間。抽出物が試験化合物を使用する場合は、使用される試験化
学薬品の濃度は、容量の基準に対して重量で示され得る。これらの環境下では、
以下の濃度の範囲が使用され得る：約０．００１μｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／
ｍｌ、好ましくは、約０．０１μｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの間、そしてよ
り好ましくは、約０．１μｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌの間、または約１μｇ／
ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの間。
【００７７】 「標的」は、生物学的プロセスに含まれる生化学的な物質をいう。標的は、代
表的には、生物体の生理学または生物学において有用な役割を果たすタンパク質
である。治療用化学薬品は、代表的には、その機能を変更するかまたは調節する
ために標的に結合する。本明細書中で使用される場合は、標的として、細胞表面
レセプター、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質結合レセプター、キナーゼ、ホスファ
ターゼ、イオンチャンネル、リパーゼ、ホスホリパーゼ、核レセプター、細胞内
構造、小管、チューブリンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７８】 「標識」または「標識された」は、検出可能なマーカーの援用（例えば、放射
標識された化合物の援用よって）または、例えばマークされたアビジンのような
分泌部分の結合によって検出され得るビオチンのような部分のポリペプチドへの
接着をいう。ポリペプチド、核酸、炭水化物、および他の生物学的または有機分
子を標識する種々の方法が、当該分野で公知である。このような標識は、放射活
性、蛍光、色、化学発光、または当該分野で公知であるかもしくは後に開発され
る他の読み出し情報のような種々の読み出し情報を有し得る。読み出し情報は、
酵素活性（例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ）；放射性同位元素（
例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、または131Ｉ）；蛍光タンパク質（例えば、
緑色蛍光タンパク質）；または他の蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、
およびランタノイド）に基づき得る。適切である場合には、これらの標識は、こ
の用語が当該分野で理解されているように、レポーター遺伝子の発現産物であり
得る。レポーター遺伝子の例は、β−ラクタマーゼ（１９９８年４月２１に発行
されたＴｓｉｅｎら、米国特許第５，７４１，６５７号）、および緑色蛍光タン
パク質（１９９８年７月７日に発行されたＴｓｉｅｎらの米国特許第５，７７７
，０７９号；１９９８年９月８日に発行されたＣｏｒｍａｃｋらの米国特許第５
，８０４，３８７号）である。
【００７９】 「実質的に純粋」とは、優れた種または活性が存在する（例えば、それが組成
物中の任意の他の個々の種または活性よりも豊富である分子基準において）目的
の種または活性をいう。そして好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の
種または活性が、存在する全マクロ分子または活性の少なくとも約５０％（モル
、重量または活性の基準において）を含む組成物である。一般的には、実質的に
純粋な組成物は、組成物中に存在する全マクロ分子種または活性の約８０％より
多く、より好ましくは、約８５％、９０％、９５％、そして９９％より多くを含
む。最も好ましくは、目的の種または活性は、本質的な均質性のために精製され
る。ここでは、混入している種または活性は、従来の検出方法によって検出され
得ない。ここでは、組成物は、本質的には、単一のマクロ分子の種または活性か
ら構成される。本発明者らは、活性が、組成物（特に、抽出物）中の単一の種ま
たは複数の種によって、直接または間接的に引き起こされ得ることを認識する。
【００８０】 「薬学的な試薬または薬物」とは、適切な投与の用量、レジメ、投与経路、時
間、および送達様式によって適切に投与される場合に、所望される治療効果を誘
導し得る化学薬品、組成物、または活性をいう。
【００８１】 「薬学的な試薬または薬物」とは、適切な投与の用量、レジメ、投与経路、時
間、および送達様式によって適切に投与される場合に、所望される治療効果を誘
導し得る化学薬品、組成物、または活性をいう。
【００８２】 「生物活性化合物」とは、少なくとも１つの生物活性を提示する化合物をいう
。
【００８３】 「生物活性」は、生物学的プロセス、細胞プロセス、または疾患状態を調節す
る少なくとも１つの活性を提示する組成物をいう。好ましくは、生物活性は、以
下の活性を含むが、これに限定されない：少なくとも１つのミトコンドリアの活
性、または、本明細書で提供されるような、ミトコンドリアの機能（例えば、Ａ
ＴＰ産生）、あるいはミトコンドリアの質量（例えば、ミトコンドリアの数また
はミトコンドリアのＤＮＡ量における増加（ミトコンドリアの生物発生）もしく
は減少による）を調節する活性。別の好ましい生物活性は、細胞のプロセス（例
えば、インシュリンの産生または分泌）を調節する活性を含む。さらに好ましい
生物活性は、疾患状態（例えば、Ｉ型糖尿病（タイプ１ＤＭ）またはＩＩ型糖尿
病（タイプ２ＤＭ））を調節する活性を含む。
【００８４】 「ミトコンドリアの生物発生活性」は、活性、不活性または欠損のミトコンド
リアの産生を調節する活性であり、好ましくは活性ミトコンドリアである。
【００８５】 「ミトコンドリア破壊（ｍｉｔｏｃｌａｓｔｉｃ）活性」は、ミトコンドリア
の破壊を調節する活性である。
【００８６】 「抗糖尿病活性」は、糖尿病（Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病を含む）の疾患
状態を調節する活性である。好ましくは、抗糖尿病活性はまた、直接的または間
接的にミトコンドリアの生物発生活性である。
【００８７】 「生物活性誘導体」とは、親化合物の少なくとも１つの特徴的な活性を保持す
る生物活性化合物または生物活性の改変をいう。
【００８８】 「生物活性前駆体」とは、生物活性化合物もしくは生物活性を生じる少なくと
も１つの特徴的な活性を提示する生物活性化合物または生物活性の前駆体をいう
。
【００８９】 「患者の」または「被験体」とは、処置が必要性な生物全体（例えば、家畜、
コンパニオン・アニマルまたはヒト）をいう。動物とは、任意の非ヒト動物をい
う。
【００９０】 「ミトコンドリア機能の指標」は、当業者によって測定され得るミトコンドリ
アの機能を示す任意のパラメーターである。特定の実施形態において、ミトコン
ドリア機能の指標は、ミトコンドリアの電子伝達鎖酵素、クレブズ回路酵素、ミ
トコンドリアのマトリックス構成成分、ミトコンドリアの膜構成成分、またはＡ
ＴＰ生合成因子である。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指標は、
細胞あたりのミトコンドリア数、または細胞あたりのミトコンドリアの質量であ
る。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指標は、ＡＴＰ生合成因子で
ある。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指標は、ミトコンドリアあ
たりのＡＴＰ量、単位ミトコンドリア質量あたりのＡＴＰ量、単位タンパク質あ
たりのＡＴＰ量、または単位ミトコンドリアタンパク質あたりのＡＴＰ量である
。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指標は、フリーラジカル産生を
含む。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指標は、上昇した細胞内カ
ルシウムに対する細胞応答を含む。他の実施形態において、ミトコンドリア機能
の指標は、以下のミトコンドリア酵素の活性である：例えば、非限定例の例とし
て、クエン酸シンターゼ、ヘキソキナーゼＩＩ、チトクロムＣオキシダーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコー
ゲンホスホリラーゼ、クレアチンキナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、グリセ
ロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ、リン酸トリオースデヒドロゲナーゼ、また
はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ。他の実施形態において、ミトコンドリア機能の指
標は、患者における細胞あたりのミトコンドリアＤＮＡの相対量または絶対量で
ある。
【００９１】 「改善されたミトコンドリア機能」とは、（ａ）実質的に、減少されたグルコ
ース応答性および減少されたミトコンドリアの質量、および／もしくは損なわれ
たミトコンドリア機能を有する細胞においてグルコース応答性の少なくとも１つ
の指標を正常レベルにまで回復すること；あるいは（ｂ）損なわれたミトコンド
リアの機能を有する細胞または正常のミトコンドリア機能を有する細胞それぞれ
における、少なくとも１つのミトコンドリア機能の指標を、それぞれ実質的に、
正常レベルまで回復すること、または正常レベル以上に増加させることを、いい
得る。改善されたミトコンドリアの機能は、ミトコンドリア外の構造または事象
における変化、およびミトコンドリア構造または事象に起因する変化、ミトコン
ドリアおよびミトコンドリア外の遺伝子および／もしくはそれらの遺伝子産物間
の直接的な相互作用における変化、あるいはこのような相互作用の結果として形
成され得る中間体（代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆体、補因子などを含む
）間の相互作用の結果として生じる構造的または機能的変化から生じ得る。
【００９２】 「損なわれたミトコンドリア機能」は、生物学的供給源の一部もしくは全ての
細胞における任意の呼吸活性、代謝活性、または他の生化学的もしくは生理学的
活性のレベルおよび／もしくは速度における障害を含み得る。非限定例として、
顕著に損なわれたＥＴＣ活性は、損なわれたミトコンドリア機能に関連し得、こ
れはまた、増加したＲＯＳの産生または不完全な酸化的リン酸化反応に関連し得
る。さらなる例としては、変更されたミトコンドリア膜電位、アポトーシス経路
の誘導ならびに非定型の化学的架橋および生化学的架橋種の細胞内での形成は、
酵素的機構か非酵素的機構のいずれによっても、ミトコンドリアの機能の指標と
して全てみなされ得る。損なわれたミトコンドリアの機能のこれらのおよび他の
非限定例は、以下でより詳細に記載される。
【００９３】 本明細書中で使用される他の技術的な用語は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉ
ｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ ａｎｄ Ｓｔｅｄｍ
ａｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｔｉｏｎａｒｙのような種々の技術辞典によ
って例証されているように、それらが使用される当該分野においてそれらの通常
の意味を有する。
【００９４】 （ミトコンドリア機能のアッセイ） 本発明の上の局面のいずれかの特定の実施形態に従って、ミトコンドリア機能
の特定のアッセイは、実施され得、好ましい実施形態において、これは、ＡＴＰ
生合成または本明細書中で提供されるようなＡＴＰ生合成因子の決定に関し得る
。従って、本発明の上記の局面のいずれかの特定の実施形態において、ミトコン
ドリア機能は、サンプルにおける細胞あたり、単位タンパク質あたり、または単
位ミトコンドリアあたりのＡＴＰ量として決定され、特定の実施形態において、
サンプル中のＡＴＰ合成の速度は決定される。特定の実施形態において、本明細
書中で提供されるようなＡＴＰ生合成因子が、決定される。
【００９５】 「ＡＴＰ生合成因子」とは、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生の効力に寄与
する、任意の天然に存在する細胞成分をいう。このような細胞成分には、タンパ
ク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、またはそれらの誘導体；脂質、脂肪
酸など、またはそれらの誘導体；炭水化物、サッカリドなど、またはそれらの誘
導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジン、または関連分
子、またはそれらの誘導体などであり得る。ＡＴＰ生合成因子には、少なくとも
、ＥＴＣの成分およびクレブス回路（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５ Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ；ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０ Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍａｔｈｅｗｓおよびｖａｎ
Ｈｏｌｄｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍ
ｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照のこと）の成
分、および任意のタンパク質、酵素、またはＡＴＰ合成に関与する他の細胞成分
が含まれ、これは、このようなＡＴＰ生合成因子が核遺伝子の産物であるか、ま
たは核外遺伝子（例えば、ミトコンドリア遺伝子）の産物であるかに関わらない
。ＡＴＰ合成への関与は、以下を含み得るがこれらに限定されない：ＡＴＰ合成
に関連する任意の反応の触媒、膜を通したＡＴＰもしくは酵素補因子の移入およ
び／または排出、ミトコンドリア酵素をコードする遺伝子の転写、ならびに／ま
たはこのような遺伝子の転写物の翻訳。
【００９６】 細胞成分がＡＴＰ生合成因子であるか否かを決定するための組成物および方法
は、当該分野で周知であり、そしてＡＴＰ産生を決定するための方法（サンプル
中のＡＴＰ産生の速度の決定を含む）、およびＡＴＰそれ自体を定量するための
方法を含む。ＡＴＰ産生へのＡＴＰ生合成因子の寄与は、例えば、細胞に添加さ
れるかまたは無細胞系に添加される、単離されたＡＴＰ生合成因子を使用して決
定され得る。ＡＴＰ生合成因子は、ＡＴＰ産生に影響を与える生合成経路中で、
段階（単数または複数）を直接的または間接的に媒介し得る。例えば、ＡＴＰ生
合成因子は、ＡＴＰ産生をもたらす特定の化学反応を触媒する酵素であり得る。
別の例として、ＡＴＰ生合成因子は、このような酵素の効力を増強する補因子で
あり得る。別の例として、ＡＴＰ生合成因子は、ＡＴＰ生合成経路に直接的また
は間接的に影響を与える細胞または無細胞系に導入される外因性遺伝子エレメン
トであり得る。当業者は、候補ＡＴＰ生合成因子の存在下および非存在下でのＡ
ＴＰ生合成経路によるＡＴＰ産生を容易に比較し得る。ＡＴＰ産生の慣用的な決
定は、任意の公知の定量的ＡＴＰ検出のための方法を用いて達成され得る。これ
らの方法は、例えば、例示目的であり限定を意図しないが、必要に応じてクロマ
トグラフィーによる単離を含む、サンプルからの示差的抽出によるか；分光測定
法によるか；検出可能に標識された（例えば、32Ｐ）ＡＴＰ前駆体分子の適切な
形態と接触されたサンプルから回収された標識されたＡＴＰの定量によるか；Ａ
ＴＰの合成または分解に関連する酵素活性の定量によるか；または当該分野で公
知の他の技術による。従って、本発明の特定の実施形態において、生物学的サン
プル中のＡＴＰの量または生物学的サンプル中のＡＴＰの産生（ＡＴＰ産生の速
度を含む）は、ミトコンドリア機能の指標であり得る。１つの実施形態において
、例えば、ＡＴＰは、ＡＴＰ依存的プロセスである、ルシフェラーゼによって触
媒されるＤ−ルシフェリンの酸化の発光を測定することによって定量され得る。
【００９７】 「酵素触媒活性」とは、１以上の特定の細胞機能に指向される特定の酵素また
は酵素の範疇によって実行される任意の機能をいう。例えば、「ＡＴＰ生合成因
子触媒活性」とは、ＡＴＰの産生に寄与する、本明細書中に提供されるようなＡ
ＴＰ生合成因子によって実行される任意の機能をいう。代表的には、酵素触媒活
性は、特定の酵素（例えば、ＡＴＰ生合成因子である酵素）による化学反応の促
進として表され、ここで、少なくとも１つの酵素基質または反応物が、共有結合
的に修飾されて、生成物を形成する。例えば、酵素触媒活性は、共有化学結合の
形成または切断によって修飾された基質または反応物を生じ得るが、本発明は、
そのように限定される必要はない。酵素触媒活性を測定する種々の方法が当業者
に公知であり、そして決定される特定の活性に依存する。
【００９８】 多くの酵素（ミトコンドリア酵素または本明細書中に提供されるＡＴＰ生合成
因子である酵素を含む）について、酵素触媒活性についての定量的な判断基準が
十分に確立されている。これらの判断基準には、例えば、国際単位（ＩＵ）、酵
素代謝回転数、触媒速度定数（Ｋcat）、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定
数（Ｋm）、比活性、または、少なくとも１つの酵素触媒活性のレベルを測定す
るための、当該分野で公知の任意の他の酵素学的な方法によって定義され得る活
性が含まれる。ミトコンドリア酵素（例えば、ＡＴＰ生合成因子）の比活性は、
単位時間あたりの、および、必要に応じてさらに単位サンプル重量あたり（例え
ば、単位タンパク質あたりまたは単位ミトコンドリア重量あたり）の、生成物に
検出可能に転換された基質の単位として表現され得る。
【００９９】 本発明の特定の好ましい実施形態において、酵素触媒活性は、単位時間あたり
、サンプル中の単位総タンパク質あたりの生成物に対する、酵素によって検出可
能に転換される基質の単位として表現され得る。特定の好ましい実施形態におい
て、酵素触媒活性は、単位時間あたり、サンプル中の単位ミトコンドリア重量あ
たりの生成物に対する、酵素によって検出可能に転換される基質の単位として表
現され得る。特定の高度に好ましい実施形態において、酵素触媒活性は、単位時
間あたり、サンプル中の単位ミトコンドリアタンパク質重量あたりの生成物に対
する、酵素によって検出可能に転換される基質の単位として表現され得る。酵素
触媒活性の生成物は、特定の生成物の量および生理化学的特性に依存する、適切
な方法によって検出され得る。従って、検出は、例えば、例示の目的であって限
定のためではなく、放射測定、比色測定、分光測定、蛍光測定、免疫測定、また
は質量スペクトル測定の手順によって、あるいは当業者に容易に明らかである他
の適切な手段によってであり得る。
【０１００】 本発明の特定の実施形態において、酵素触媒活性の生成物の検出は、直接的に
達成され得、そして特定の他の実施形態において、生成物の検出は、基質または
反応物への検出可能なレポーター部分または標識（例えば、マーカー酵素、色素
、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチンなど）の導入によって達成され得
る。次いで、酵素触媒活性をアッセイするための反応後の、未反応基質および／
または反応生成物として存在するこのような標識の量は、特異的に検出可能なレ
ポーター部分または標識について適切な方法を使用して決定され得る。放射活性
基については、放射性核種崩壊モニタリング、シンチレーション計数、シンチレ
ーション近似アッセイ（ＳＰＡ）またはオートラジオグラフィー法が、一般的に
適切である。免疫定量（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）測定については、適切に標
識された抗体が調製され得、これらには、例えば、放射性核種、蛍光団、アフィ
ニティータグ、ビオチンまたはビオチン模倣配列で標識された抗体、あるいは抗
体酵素結合体として調製された抗体が挙げられる（例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．
，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；Ｓｃ
ｏｕｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５
：３０−６５，１９８７；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９６ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ．；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ
，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｅｒｍａ
ｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａ
ｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，ＮＹ；Ｌｕｏら、１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５、
ならびにそれらに引用される参考文献を参照のこと）。分光測定法は、色素（例
えば、酵素反応の比色性生成物が挙げられる）、発光基および蛍光基を検出する
ために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常、放射活性基また
は蛍光基あるいは酵素）に結合された、アビジンまたはストレプトアビジンを使
用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加、その後の反応
生成物の分光測定分析、分光光度分析または他の分析によって検出され得る（一
般には、特定の時間の期間で）。標準および標準付加物が、周知技術を使用して
、サンプル中の酵素触媒活性のレベルを決定するために使用され得る。
【０１０１】 上記のように、ＡＴＰ生合成因子の酵素触媒活性は、基質または反応物の共有
結合性の改変に関する機能的活性以外の、ＡＴＰ生成を導く他の機能的活性をさ
らに含み得る。例えば、例示として、かつ限定でなく、酵素であるＡＴＰ生合成
因子とは、膜貫通トランスポーター分子といい得、これは、その酵素触媒活性を
介して、細胞区画間の代謝物の移動を容易にする。このような代謝物は、ＡＴＰ
またはＡＴＰ合成に関与する他の細胞成分（例えば、遺伝子産物およびその下流
中間体（代謝物、異化物、基質、前駆体、補因子などを含む））であり得る。別
の非限定的な例として、酵素であるＡＴＰ生合成因子は、その酵素触媒活性を介
して、ＡＴＰ合成を促進する様式で、ＡＴＰ合成に関与する細胞成分に一過的に
結合し得る。このような結合事象は、例えば、その細胞成分を、ＡＴＰ合成に関
与する別の酵素に送達し得、そして／またはＡＴＰ合成を促進する様式で、その
細胞成分のコンフォーメーションを変化させ得る。この例に加えて、このような
コンフォーメーション変化は、シグナル伝達経路、アロステリック活性化経路、
転写活性化経路などの部分であり得、ここでは、細胞成分間の相互作用が、ＡＴ
Ｐ生成を導く。
【０１０２】 従って、本発明に従い、ＡＴＰ生合成因子とは、例えば、ミトコンドリア膜タ
ンパク質を含み得る。適切なミトコンドリア膜タンパク質としては、以下のよう
なミトコンドリア成分が挙げられる：アデニンヌクレオチドトランスポーター（
ＡＮＴ；例えば、Ｆｉｏｒｅら、１９９８ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８０：１３７
；Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ １９８５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４
５６：２７９）、電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ、ポリンともまた呼ば
れる；例えば、Ｍａｎｅｌｌａ，１９９７ Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ
Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２９：５２５）、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル、ミト
コンドリアカルシウムユニポータ（例えば、Ｌｉｔｓｋｙら、１９９７ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．３６：７０７１）、結合解離（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）タンパク質（
ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３；例えば、Ｊｅｚｅｋら、１９９８ Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３０：１１６３を参照のこと）
、ヘキソキナーゼ、末梢ベンゾジアゼピンレセプター、ミトコンドリア膜間クレ
アチンキナーゼ、サイクロフィリンＤ、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーコードポリ
ペプチド、トリカルボン酸キャリア（例えば、Ｉｏｃｏｂａｚｚｉら、１９９６
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２８４；９；Ｂｉｓａｃｃｉ
ａら、１９９０ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０１９：２５
０）およびジカルボン酸キャリア（例えば、Ｆｉｅｒｍｏｎｔｅら、１９９８
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４７５４；Ｉｎｄｉｖｅｒｉら、１９９３
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１４３：３１０；ミトコンド
リア膜トランスポーターの一般的概説については、例えば、Ｚｏｎａｔｔｉ、１
９９４ Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：５４３お
よびそれに引用される文献を参照のこと）。
【０１０３】 アフィニティー技術は、本発明の方法に従う使用のために、酵素またはＡＴＰ
生合成因子のタンパク質またはポリペプチドを単離する状況下で特に有用であり
、そして酵素またはＡＴＰ生合成因子に関する特異的な結合相互作用を利用して
、分離をもたらす、任意の方法が挙げられ得る。例えば、酵素またはＡＴＰ生合
成因子のタンパク質またはポリペプチドは、共有結合されたオリゴサッカリド部
分を含み得るので、アフィニティー技術（例えば、レクチンによる炭水化物結合
を可能にする条件下での、適切な固定されたレクチンへのその酵素（またはＡＴ
Ｐ生合成因子）の結合）が、特に有用なアフィニティー技術であり得る。
【０１０４】 他の有用なアフィニティー技術として、特定のタンパク質またはポリペプチド
抗原（例えば、酵素またはＡＴＰ生合成因子）および／または生分子（例えば、
タンパク質）間の特定の結合相互作用を単離ならびに／または検出するための免
疫学的技術および他の生物学的アフィニティー技術が挙げられ、この技術は、抗
原に対する抗体の結合部位と因子上に存在する抗原決定基との間（またはタンパ
ク質−タンパク質結合部位間、リガンド−レセプター結合部位間、レセプター−
カウンターレセプター結合部位間など）の特異的な結合相互作用に依存する。抗
体または他のアフィニティー試薬の抗原もしくは他の結合リガンド、レセプター
またはカウンターレセプターへの結合は、「特異的」であり、ここで、結合相互
作用は、約１０4Ｍ-1以上、好ましくは、約１０5Ｍ-1以上、より好ましくは、約
１０6Ｍ-1以上、そしてなおより好ましくは、約１０7Ｍ-1以上のＫaを含む。結
合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ
ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）によって記
載されるような技術）を使用して容易に決定され得る。
【０１０５】 免疫学的技術としては、免疫親和性クロマトグラフィー、免疫沈降、固相免疫
吸着または他の免疫親和性方法が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない
。これらおよび他の有用なアフィニティー技術については、例えば、Ｓｃｏｐｅ
ｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ら、
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，１９９２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ（これらは、複合体を単離および特徴付けするための技術（アフィニティ
ー技術を含む）に関する詳細について、それらの全体が参考として本明細書によ
って援用される）を参照のこと。
【０１０６】 （サンプル） 本発明の細胞のサンプルは、培養中の細胞または被験体由来の細胞（例えば、
組織、流体もしくは器官または上記のいずれかの一部）として、提供され得る。
例えば、細胞は、好ましくは、グルコース代謝に関与する組織由来（例えば、膵
臓細胞、ランゲルハンス島、膵β細胞、筋細胞、肝臓細胞もしくは他の適切な細
胞）であり得る。好ましくは、細胞は、培養物にて提供され、そして一次細胞株
または連続細胞株であり得、そして細胞のクローン性集団または細胞の混合集団
として、提供され得る。好ましくは、この細胞は、天然でインスリンを産生し必
要に応じてインスリンを分泌するか、または適切な刺激下（例えば、グルコース
の存在下）でインスリンを産生し必要に応じてインスリンを分泌するように操作
されたという点で、インスリン産生（より好ましくはインスリン分泌）細胞であ
る。
【０１０７】 好ましい細胞としては、グルコース応答性インスリン産生細胞株（例えば、ラ
ット由来ＩＮＳ−１細胞株）；ツッカー糖尿病性肥満（ｆａｔｔｙ）ラット（Ｚ
ＤＦ）由来細胞（特に、β細胞）またはツッカー痩せ（ｌｅａｎ）コントロール
ラット（ＺＬＣ）由来の細胞（特に、β細胞）（Ｓｈａｆｒｉｒら、Ｊ．Ｂａｓ
ｉｃ Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９：３４７〜３８５、
１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好ましい細胞としては
、そのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が除去された上記細胞株の誘導体が
挙げられ；このような細胞は、一般に、「ρ0」（「ロー−ゼロ」）と呼ばれる
。他の好ましい細胞としては、サイブリッド細胞、すなわち、内因性ｍｔＤＮＡ
が、糖尿病もしくは目的の別のミトコンドリア疾患に罹患している個体由来のｍ
ｔＤＮＡにより置換された、上記細胞株の誘導体が、挙げられる。ロー−ゼロお
よびサイブリッド細胞のミトコンドリア機能を調製、使用およびアッセイするた
めの一般的方法が、米国特許第５，８８８，４３８号、公開されたＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ９５／２６９７３およびＷＯ ９８／１７８２６、ＫｉｎｇおよびＡｔｔａ
ｒｄｉ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：５００〜５０３、１９８９）、Ｃｈｏｍｙｎ
ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２２３６〜２２４４、１９９１）、Ｍ
ｉｌｌｅｒら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：１８９７〜１９０７、１９９６
）、Ｓｗｅｒｄｌｏｗら（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４０：６
６３〜６７１、１９９６）、Ｃａｓｓａｒｉｎｏら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ １３６２：７７〜８６、１９９７）、Ｓｗｅｒｄｌｏｗら（
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４９：９１８〜９２５、１９９７）、Ｓｈｅｅｈａｎら（
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６８：１２２１〜１２２３、１９９７）、およびＳｈ
ｅｅｈａｎら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４９：９１８〜９２５、１９９７）、
およびＳｈｅｅｈａｎら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：４６１２〜４６２２、
１９９７）に記載される。糖尿病個体由来のミトコンドリアを含むサイブリッド
細胞が、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９５／２６９７３およびＷＯ ９８／１７
８２６に記載されている。
【０１０８】 サイブリッド細胞は、健常な被験体またはミトコンドリア欠損を有し得る被験
体由来のミトコンドリアを使用して生成され得る。簡単に述べると、宿主細胞株
が、臭化エチジウムまたは抗ウイルス剤（例えば、ｄｄＣ）で（同時継続中の米
国特許出願０９／０６９，４８９号および同第０９／２３７，９９９号に記載さ
れるように）処理されて、細胞がミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を実質的
に除去される。血小板または他のミトコンドリア供給源が、このミトコンドリア
除去細胞と融合されて、宿主細胞の核ゲノムおよび被験体のミトコンドリア（従
ってミトコンドリアゲノム）を含むハイブリッド細胞が形成される。
【０１０９】 ＺＤＦラットのβ細胞において、増加したセラミド合成および酸化窒素が、β
細胞アポトーシスを増加する。セラミド（特にＣ２セラミドだが、Ｃ２ジヒドロ
セラミドではない）および酸化窒素が、ＦＡＡ（オレエート：パルミテート）に
より刺激される。また、Ｃ６セラミドは、ＩＮＳ−１細胞におけるカスパーゼ３
活性化を誘導し得る。また、ＩＮＳ−１細胞におけるカスパーゼ３活性化を誘導
し得る。さらに、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）は、ＩＮＳ−１細胞死を
誘導し得る。
【０１１０】 生物学的サンプルは、少なくとも１つのミトコンドリア機能が欠失され得（そ
して、特定の好ましい実施形態において、本明細書中に提供されるようなミトコ
ンドリアＡＴＰ生成および／またはＡＴＰ生合成因子に関す）る、任意の組織も
しくは細胞調製物を含み得、そして比較される特定の指標に依存して、従って天
然で変化し得る。生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源由来の血液
サンプル、生検標本、組織移植片、器官培養物、または他の任意の組織もしくは
細胞調製物を得ることにより提供され得る。この被験体もしくは生物学的供給源
は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養物または培養適合細胞株（染色体組込
みされた組換え核酸配列もしくはエピソーム性組換え核酸配列を含み得る遺伝子
操作された細胞株、不朽化細胞株もしくは不朽化可能な細胞株、体細胞ハイブリ
ッド細胞株もしくは細胞質ハイブリッド「サイブリッド」細胞株、分化した細胞
株もしくは分化可能な細胞株、形質転換細胞株などを含むが、これらに限定され
ない）であり得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、被験体または生
物学的供給源は、２型真性糖尿病を有すると疑われ得るかまたは有する危険があ
ると疑われ得、そして本発明の特定の好ましい実施形態において、被験体または
生物学的供給源は、このような疾患の危険または存在がないと知られており得る
。
【０１１１】 被験体または生物学的供給源が２型真性糖尿病の指標である臨床パラメーター
内にあるか否かを決定することが望ましい他の特定の好ましい実施形態において
、当業者により受け入れられている２型糖尿病の兆候および症状が、被験体また
は生物学的供給源をそのように指摘するために使用され得、そのような兆候およ
び症状は、例えば、Ｇａｖｉｎら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２２（補遺１
）：Ｓ５−Ｓ１９、１９９９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ
Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）およびその中で引用される参考文献において言及される臨
床兆候、または２型糖尿病を診断するために当該分野で公知の他の手段である。
本発明の特定の局面において、生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給
源を候補因子と接触させて、例えば、その因子に対する被験体または生物学的供
給源の曝露の前のレベルと比較して、ミトコンドリア機能のレベルにおける変化
をもたらし得る候補因子を同定する工程の前および後に、その被験体または生物
学的供給源から入手され得る。
【０１１２】 本発明により提供されるスクリーニングアッセイ方法（例えば、ミトコンドリ
アＴＰ生成を変化させる因子を同定するための方法、または糖尿病を処置するた
めの因子を同定するための方法）における使用のための候補因子が、化合物、組
成物または分子の「ライブラリー」またはコレクションとして、提供され得る。
このような分子は、代表的には、当該分野で「低分子」として知られており、そ
して１０5ダルトン未満、好ましくは１０4ダルトン未満そしてなおより好ましく
は１０3ダルトン未満の分子量を有する、化合物が挙げられる。例えば、試験化
合物のライブラリーのメンバーが、複数のサンプルに投与され得、そしてミトコ
ンドリア機能の少なくとも１つの指標のレベルを増加または減少させるその能力
についてアッセイされ得る。
【０１１３】 候補因子はさらに、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され
得、これは好ましくは、複数の反応容器中にて実施される複数の所定の化学反応
に従って調製される合成因子を含む。例えば、所定の構成成分が複数の順列およ
び／または組み合わせの反応条件を種々の開始化合物が追跡可能に経験すること
を可能にする、１つ以上の固相合成、記録されたランダムな混合法および記録さ
れた反応分割技術を使用して調製され得る。生じた生成物は、スクリーニングさ
れ得、その後反復選択および合成手順が行われ得る、ライブラリー（例えば、ペ
プチドの合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８
６９４、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６６６（その全体が参考として本明細書中に援
用される）を参照のこと）あるいは本明細書中に提供されるような低分子を含み
得る他の組成物の合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９
４／０８５４２、ＥＰ ０７７４４６４、Ｕ．Ｓ．５，７９８，０３５、Ｕ．Ｓ
．５，７８９，１７２、Ｕ．Ｓ．５，７５１，６２９（その全体が参考として本
明細書中に援用される）を参照のこと）を含む。当業者は、このようなライブラ
リーの多様な一団が、確立された手順に従って調製され得、そして本開示に従っ
て、ミトコンドリア機能の指標に対するその影響について試験され得ることを認
識する。
【０１１４】 他の特定の実施形態において、本発明は、２型真性糖尿病を有する患者を処置
する方法を提供し、この方法は、細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ合成を実質
的に増加する因子、および／または細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ加水分解
を実質的に減少する因子、および／またはコントロール被験体もしくは正常被験
体において見出されるレベルへと少なくとも１つのミトコンドリア機能を回復す
る因子を患者に投与することによる。１つの好ましい実施形態において、回復し
たミトコンドリア機能または増加したミトコンドリア機能は、生成されたＡＴＰ
の量である。最も好ましい実施形態において、ミトコンドリアＡＴＰ生合成機能
および／またはミトコンドリアＡＴＰ加水分解機能を正常なレベルへと実質的に
回復または変化させる因子が、コントロール被験体において見出されるレベルへ
のＡＴＰのレベルの復帰をもたらす。別の好ましい実施形態において、このよう
なミトコンドリア機能を実質的に回復する因子が、被験体に対して臨床的な有益
な効果を付与する。別の実施形態において、そのようなミトコンドリア機能を実
質的に回復する因子は、ミトコンドリア機能の統計学的に有意な変化を促進する
。本明細書中に注記されるように、当業者は、特定のミトコンドリア機能のレベ
ルの変化が、そのレベルを正常な値に近づけ、そして／または被験体に臨床的に
利益を与えるか否かを容易に決定し得る。従って、少なくとも１つのミトコンド
リア機能を正常なレベルへと実質的に回復する因子は、そのようなレベルを完全
にかまたは部分的に回復できる因子を含み得る。例えば、そして限定しない理論
に従って、本発明の特定の実施形態に従う好ましい因子は、ＩＦ１の１つ以上の
活性を阻害（すなわち、損なうか、妨げるか、さもなくばダウンレギュレートす
る）組成物を含む。他の特定の実施形態において、好ましい因子は、ＩＦ１を模
倣する組成物を含み得、これは、天然のＩＦ１分子のすべてまたは一部に構造的
および／または機能的に、似るか、模倣するか、取って代わるか、補うか、増強
するか、増大するか、置換するか、さもなくば置き換える、組成物に関し、これ
は例えば、ＩＦ１が結合する結合パートナーと結合相互作用できる３次元構造を
保有することによるか、または別の例としては、ＩＦ１が予期され得るよりも生
理学的条件下で大きい安定性および／または特異性を示すことによる。
【０１１５】 （発現系） 本発明のさらなる実施形態のために目的の遺伝子産物を十分な量で産生するた
めに、目的のヌクレオチド配列（例えば、ＩＦ１をコードするヌクレオチド配列
）またはその機能的等価物が、適切な「発現ベクター」（すなわち、転写および
遺伝子産物がタンパク質である場合においては挿入されたヌクレオチド配列の翻
訳のために必要な要素を含む遺伝子要素（しばしば、自己複製し得る）内に挿入
される。目的の遺伝子産物の発現のための適切な配列で発現ベクターおよび目的
の核酸を含む遺伝子要素は、本明細書中において「発現構築物」と呼ばれる。
【０１１６】 当業者に周知である方法を使用して、目的のヌクレオチド配列ならびに適切な
転写制御および翻訳制御を含む、発現構築物を調製し得る。これらの方法として
は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換えもしくは遺伝
子組換えが挙げられる。そのような技術は、当該分野において公知である（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、
編、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．
，１９９２を参照のこと）。
【０１１７】 種々の発現ベクター／宿主系が、目的のヌクレオチド配列を含みかつ発現させ
るために利用され得る。これらとしては、微生物（例えば、組換えバクテリオフ
ァージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌）
；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バ
キュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カ
リフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でト
ランスフェクトされた植物細胞系または細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉまたは
ｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】 強度および特異性において変動し得る、これらの系の「制御エレメント」また
は「調節配列」は、ベクター、エンハンサー、プロモーターならびに５’および
３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域のそれらの非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒ
ａｎｓｌａｔｅｄ）領域であり、この領域は宿主細胞タンパク質と相互作用して
転写を実行し、そして目的の遺伝子産物がタンパク質である場合、翻訳を実行す
る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写要素および
翻訳要素（構造性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得
る。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、誘導性プロモーター（例えば
、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMファージミドのｌａｃＺプロモーター（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．）またはｐＳｐｏｒｔ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびｐｔｒｐ
−ｌａｃハイブリッドなどのハイブリッドプロモーターが挙げれられる）が使用
され得る。昆虫細胞において、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターが使
用され得る。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ；および
貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター）もしくは植物ウイルスまたは病原体（例え
ば、ウイルスプロモーターまたはアグロバクテリウムベースのプロモーターもし
くはリーダー配列）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーをベク
ター内にクローン化し得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子由来のプ
ロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが適切である。目的のヌ
クレオチド配列の複数のコピーを含む細胞系を生成する必要がある場合、ＳＶ４
０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択マーカーと共に使用され得る。
【０１１９】 細菌系において、多数の発現ベクターが、目的の発現される遺伝子産物につい
て意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量の目的のタンパク質が
抗体の誘導に必要とされる場合、目的のタンパク質またはアッセイおよび／また
は精製がより容易な、それらから誘導される融合タンパク質の高レベル発現を指
向するベクターが望ましくあり得る。
【０１２０】 このようなベクターには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉクローニングベ
クターおよび発現ベクター（例えば、ｐＥＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ｐＧＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはｐＧＭＥＸTM（Ｐｒｏｍｅｇａ
，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクター（ここで、目的のタンパク質をコードする配
列が、バクテリオファージＴ７プロモーターおよびリボソーム結合部位から下流
にライゲートされ、その結果、発現構築物がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現す
るＥ．ｃｏｌｉに形質転換される場合、大量レベルの目的のポリペプチドが産生
される）；ｐＧＥＭTMベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ここで、ｌａｃＺ α−ペ
プチドをコードする配列への挿入物は、比色スクリーニングを使用して検出され
得る）など）が挙げられるが、これらには限定されない。比較的不溶性のポリペ
プチドについて、例えば、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）を使用して、チオレドキシン融合タンパク質を産生することが望ま
しくあり得る。
【０１２１】 ｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のようなプラスミドは、融合タンパク質として
目的のポリペプチドを発現するために使用され得る。このようなベクターは、Ｓ
ｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のグルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子（Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ ６７：３１−
４０）に作動可能に連結されるプロモーターを含み、このコード配列は、マルチ
プルクローニング部位からすぐ５’側のトロンビン切断部位をコードするヌクレ
オチド配列を含むように改変されている。ＧＳＴ融合タンパク質は、抗ＧＳＴを
用いるウエスタンブロットによって、または比色アッセイを使用することによっ
て検出され得；後者のアッセイは、ＧＳＴに対する基質としてグルタチオンおよ
び１−クロロ−２−４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を利用し、３４０ｎｍに
て検出可能な黄色の産物を産生する（Ｈａｂｉｇら、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２４９：７１３０〜７１３９）。この発現ベクターから誘導される発
現構築物から産生されるＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、グルタチオン−アガ
ロースビーズへの吸着、続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって精製さ
れ得る。このタイプの発現ベクターの別の系列は、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓベクター（
Ｇｕｚｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７７：４１２１〜４１３０，１９９７；Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）であり、これは、５’〜３’の方
向に作動可能に連結される以下のエレメントを含む：誘導性であるが、密接に制
御可能なａｒａＢＡＤプロモーター；最適Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳開始シグナル；アミ
ノ末端ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）コード配列（「Ｈｉｓ−ｔａｇ」とも呼ば
れる）；ＸＰＲＥＳＳTMエピトープコード配列；エンテロキナーゼ切断部位（所
望される場合、前述のＮ末端アミノ酸を除去し、続いてタンパク質を精製するた
めに使用され得る）；マルチクローニング部位；およびインフレーム終止コドン
。ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ発現構築物から作製される融合タンパク質は、Ｈｉｓ−ｔａ
ｇに特異的に結合する基質または抗体を使用して精製され得、そしてＡｎｔｉ−
ＸｐｒｅｓｓTM抗体を使用してウェスタン分析によってアッセイされ得る。この
ような系において作製されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、エンテロキ
ナーゼ、第ＸＡ因子または他のプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、そ
の結果、目的のクローン化されたポリペプチドが、適切なプロテアーゼを用いる
処理によってＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１２２】 バクテリオファージから誘導される発現ベクター（コスミドおよびファージミ
ドを含む）はまた、目的の核酸を細菌細胞内で発現するために使用され得る。こ
のようなベクターには、ＺａｐＥｘｐｒｅｓｓTM、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰTMおよ
びＬａｍｂｄａ ｇｔ１１のバクテリオファージベクター（全てＳｔｒａｔａｇ
ｅｎｅから入手可能）ならびにｐＳＬ１１８０ Ｓｕｐｅｒｌｉｎｋｅｒ Ｐｈ
ａｇｅｍｉｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙
げられるが、これらには限定されない。
【０１２３】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓのような酵母において、接合因子α、ＧＡＬ１、ＴＥＦ１、ＡＯ
Ｘ１またはＧＡＰに対するような、構成性プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーを含む多くのベクターが使用され得る。適切な発現ベクターには、種々のｐＹ
ＥＳ、ｐＹＤおよびｐＴＥＦ誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる（例
えば、Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：
５１６〜５４４、１９８７；Ｌｕｎｄｂｌａｄら、Ｃｈａｐｔｅｒ１３のＵｎｉ
ｔｓ １３．４〜１３．７：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、１３−
１９頁〜１３−３３頁を参照のこと）。
【０１２４】 植物発現ベクターが使用される場合、目的のヌクレオチド配列の発現は、任意
の多数のプロモーターによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＹの３５Ｓおよび
１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１０：５１１〜５１４、１９８４）は、単独で、またはＴＭＶ由来の
ωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ
Ｊ．６：３０７〜３１１，１９８７）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユ
ニットをコードする遺伝子のプロモーターのような植物プロモーター（Ｃｏｒｕ
ｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１〜１６８０、１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８〜８４３、１９８４）；または熱ショック
プロモーター（ＷｉｎｔｅｒおよびＳｉｎｉｂａｌｄｉ、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒ
ｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５〜１０５，１９９１）が使用され
得る。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換によってまたは病原体媒介トラン
スフェクションによって植物細胞に導入され得る。このような技術の総説につい
て、Ｇｏｓｓｅｎら、（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５１
６〜５２０，１９９４）、ＰｏｒｔａおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２０９〜２２１，１９９６）ならびにＴｕｒｎｅｒ
およびＦｏｓｔｅｒ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５〜３６，１９
９５）を参照のこと。
【０１２５】 目的の遺伝子産物を発現するために使用され得る別の発現系は、昆虫系である
。１つのこのような系において、Ａｕｔｒｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇ
ｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生の外来遺伝子を発現する
ためのベクターとして使用される。目的のヌクレオチド配列は、ポリヘドリン遺
伝子のようなウイルスの非必須領域にクローンされ得、ポリヘドリンプロモータ
ーの制御下で配置され得る。目的の配列の挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子を
不活性にし、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで、組換
えウイルスは、目的の遺伝子産物が発現されるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞ま
たはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼生に感染するために使用される（「Ｐｉｗｎｃ
ｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏ
ｒｓ」、Ｃｈａｐｔｅｒ １６のＳｅｃｔｉｏｎ ＩＩ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９２、１６−３２頁〜１６−４８頁；Ｌｏｐｅｚ−Ｆｅｒｂｅｒ
ら、Ｃｈａｐｔｅｒ ２：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、第３９巻、Ｃ．Ｒ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔ
ｏｔａｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９５、２５〜６３頁）を参照のこと）
。Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１またはＨｉｇｈ ＦｉｖｅTM 細胞）および適切なバキュロウイルストランスファーベクターは、例えば、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞（こ
れもまたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）を利用する発現系もまた、
利用され得る。
【０１２６】 哺乳動物細胞において、目的の核酸を発現するための発現構築物は、逐次的な
プロセスで調製される。第１に、目的の核酸に作動可能に連結されるプロモータ
ー（および関連する調節配列）を含む発現カセットは、細菌プラスミドに基づく
系において構築され；これらの発現カセットを含む構築物は、それらを用いて一
過性でトランスフェクトされる哺乳動物細胞中の目的の遺伝子産物を産生する能
力について評価され、そして最適化される。第２に、これらの発現カセットは、
ウイルス（例えば、ＳＶ４０、ＢＰＶ、ＥＢＶ、アデノウイルス；以下を参照の
こと）の溶菌性増殖の間に組換えタンパク質を産生するウイルス系、または哺乳
動物細胞ゲノムに安定的に組み込み、そしてこれらを形質導入し得るウイルス（
例えば、レトロウイルス発現構築物）由来のウイルス系に移入される。
【０１２７】 第１工程に関して、市販の「シャトル」（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉと哺乳動物
細胞の両方において複製可能である）ベクター（哺乳動物細胞において機能する
プロモーターを含み、目的の核酸に作動可能に連結され得る）は、ＳＶ４０後期
プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＳＶＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、糖質コルチコイド誘導性プロモーター発現ベクタ
ー（例えば、ｐＭＳＧ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）、ラウス肉腫エンハンサー−プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＲｃ／
ＲＳＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＭＶ初期プロモーター発現ベクター（
Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎまたはＺＥＯＣＩＮTMのような薬剤に
対する選択マーカーを有するそれらの誘導体を含む）（例えば、ｐＲｃ／ＣＭＶ
２、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３
．１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらには限定されない。一般的に、目的の
核酸のための好ましいシャトルベクターは、選択マーカー（形質転換された細胞
の単離および維持を容易にするため）ならびに誘導性（従って調節可能性）プロ
モーター（目的の遺伝子産物の過剰発現が毒性の効果を有し得る場合）を有する
シャトルベクターである。
【０１２８】 哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法は、当該分野で公知である（
Ｋｉｎｇｓｔｏｎら、「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｈａｐｔｅｒ９のＳｅｃｔｉｏｎ Ｉ
：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、９−３〜９−１６頁を参照のこと
）。制御プラスミド（例えば、ｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））は、試験
される発現構築物を用いて同時トランスフェクトされ得、その結果、目的の遺伝
子産物のレベルが、制御プラスミドから発現される遺伝子産物に対して規格化さ
れ得る。好ましい発現カセット（目的の核酸に作動可能に連結されるプロモータ
ーおよび関連調節配列から本質的になる）は、目的の遺伝子産物またはそれから
誘導される融合タンパク質（そうするために誘導される場合）を高レベルで発現
するための所与の発現カセットを含むベクターを用いて一過性で形質転換される
細胞の能力によって同定される。発現は、ノーザン分析またはウェスタン分析に
よって、あるいは融合タンパク質の場合は酵素またはエピトープのようなレポー
ター部分によってモニターされ得る。次いで、有効な発現カセットをウイルス発
現ベクターに組み込む。
【０１２９】 好ましい発現カセットを含む核酸（好ましくは、ＤＮＡ）は、それらが調製さ
れ、特徴付けされ、そして最適化された一過性発現構築物から単離される。この
ような発現カセットを単離する好ましい方法は、ＰＣＲによる増幅によるが、他
の方法（例えば、適切な制限酵素を用いる消化）が使用され得る。好ましい発現
カセットは、ウイルス発現ベクター、好ましくは、レトロウイルス発現ベクター
に、以下の方法で導入される。
【０１３０】 好ましい発現カセットを含むＤＮＡ分子は、ライゲーションによってレトロウ
イルス移入ベクターに導入される。２つのタイプのレトロウイルス移入ベクター
（複製インコンピテントベクターおよび複製コンピテントベクター）が当該分野
で公知である。複製インコンピテントベクターは、感染性粒子を産生するために
必要なウイルス遺伝子を欠くが、ウイルス伝染に必要なシス作用ウイルス配列を
保持する。このようなシス作用配列は、Ψパッケージング配列、逆転写および組
込みのためのシグナル、およびウイルスプロモーター、エンハンサー、ポリアデ
ニル化配列および他の調節配列を含む。複製コンピテントベクターは、これら全
てのエレメントおよびビリオン構造タンパク質をコードする遺伝子（典型的には
、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを示す遺伝子によってコードされるもの）を保持
し、従って、種々の細胞株において感染性粒子を形成し得る。対照的に、これら
の機能は、パッケージング細胞株（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝
子をコードするｍＲＮＡを産生するが、Ψパッケージング配列を欠くｍＲＮＡを
産生する細胞株）において複製インコンピテントなベクターに対してトランスに
供給される。一般的には、Ｃｅｐｋｏ、Ｃｈａｐｔｅｒ９のＵｎｉｔ ９．１０
：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、９−３０〜９−３５頁を参照のこ
と。
【０１３１】 目的の核酸を含む発現カセットを含むレトロウイルス構築物は、カセット配列
およびΨパッケージング配列を含むＲＮＡ分子を産生する。これらのＲＮＡ分子
は、適切な細胞株のウイルス構造タンパク質によってカプシド形成されるウイル
スゲノムに対応する（「適切」によって、例えば、パッケージング細胞株が、複
製インコンピテントレトロウイルスベクターに基づく構築物に使用されなければ
ならないことを意味する）。次いで、感染性ウイルス粒子が産生され、細胞膜か
らの発芽によって、培養上清に放出される。感染性粒子（目的の遺伝子産物に対
する発現カセットを含むウイルスＲＮＡゲノムを含む）は、公知の方法に従って
調製され、濃縮される。所望されないヘルパーウイルス（すなわち、目的の遺伝
子産物に対する発現カセットを含まないウイルス粒子）をモニターすることが望
ましくあり得る。一般的には、Ｃｅｐｋｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ９のＵｎｉｔ ９．
１１、９．１２および９．１３：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、９−
３６頁〜９−４５を参照のこと。
【０１３２】 目的の遺伝子産物に対する発現カセットを含むウイルス粒子は、インビトロ（
例えば、培養された細胞）またはインビボ（例えば、げっ歯動物または鳥類の細
胞（これらは、全動物の一部である））で感染させるために使用される。組織外
植片または培養胚もまた、当該分野において公知な方法に従って感染され得る。
一般的には、Ｃｅｐｋｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ９のＵｎｉｔ ９．１４：Ｓｈｏｒｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、
Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２、９−４５頁〜９−４８を参照のこと。使用される
細胞のタイプに関わらず、目的の遺伝子産物の産生は、組換えウイルスゲノムに
よって指向される。
【０１３３】 真核生物発現系において、宿主細胞は、挿入される配列の発現を調節するその
能力について、または目的の遺伝子産物がタンパク質である場合、所望される様
式で目的のタンパク質をプロセスするその能力について選択され得る。タンパク
質のこのような改変には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸
化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらには限定されない。目的の
タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、その正確
な細胞内局在化、折り畳みおよび／または機能において重要であり得る。ＣＨＯ
、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８などのような異なる宿主細胞は
、特異的な細胞機構およびこのような翻訳後活性に対する特徴的な機構を有し、
目的のタンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され
得る。
【０１３４】 本発明の発現系はまた、目的の核酸がオルガネラゲノムから発現される少数の
系を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのミトコンドリ
アゲノムの遺伝子操作のための手段（Ｓｔｅｅｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９３：５２５３〜５２５７、１９９６）および植
物葉緑体（ｃｈｌｏｒｐｌａｓｔ）の遺伝子操作のための系（米国特許第５，６
９３，５０７号；Ｄａｎｉｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １６：３４５〜３４８、１９９８）が記載されている。当然、ポリペプチド
配列をコードする核酸は、オルガネラの遺伝子コードにおける差を反映するため
に、オルガネラ発現系において変化される必要があり得る（例えば、表１を参照
のこと）。
【０１３５】 （核酸およびヌクレオチド配列） 一旦、目的の核酸が同定されると、この核酸を使用して、関連する配列を有す
る他の有用な核酸（限定されないがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられる）
を生成し得る。好ましい実施形態において、目的のＲＮＡを使用して、目的の配
列を有する核酸を検出するために使用され得るｃＤＮＡ分子を産生するか、また
は目的のＲＮＡの配列によりコードされるポリペプチドを産生する。
【０１３６】 例えば、目的のｍＲＮＡを単離し、そしてこれらを逆転写することは、当該分
野において公知である。逆転写とは、逆相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、テンプレー
トとして作用するＲＮＡ分子から産生される、プロセスである。次いで、得られ
る（ＲＮＡ：ＤＮＡ）ハイブリッドのＲＮＡ部分は、置換されるかまたは酵素的
に分解され得、その後、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を１区切り以上のＤＮＡ重
合のためのテンプレートとして使用し、その産物は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ
）分子である。このｄｓＤＮＡ分子は、目的のＲＮＡの配列を含む（ＲＮＡにお
けるウリジン残基がＤＮＡにおけるチミン残基により置換されることを除く）。
次いで、ｄｓＤＮＡのヌクレオチド配列が、決定および分析される；さらにまた
は代替的に、ｄｓＤＮＡがクローニングされる。すなわち、適切な宿主細胞中で
複製し得るベクターＤＮＡに取り込まれる。ｄｓＤＮＡ分子がポリペプチドをコ
ードする配列を含む場合には、好ましいベクターは、発現ベクターである。
【０１３７】 本発明の方法に従って調製されるＤＮＡ分子は、全長ｃＤＮＡ（すなわち、タ
ンパク質全体をコードするヌクレオチド配列を含む分子）であり得る。少なくと
も、全長ｃＤＮＡは、「開始」（翻訳開始）コドン、「終止」（翻訳終止）コド
ン、および間に存在するポリペプチドコード配列の全てを含む。
【０１３８】 あるいは、本発明の方法に従って調製されたＤＮＡ分子は、発現配列タグ（Ｅ
ＳＴ）であり得る。すなわち、そのＤＮＡ分子は完全な全長ｃＤＮＡを含まない
が、全長ｃＤＮＡもしくは全長ｃＤＮＡを含むｍＲＮＡの一部であるヌクレオチ
ド配列を含む。ＥＳＴはそれ自体、例えば目的のｍＲＮＡを検出するための方法
におけるプローブとして有用である。全長ｃＤＮＡが、例えば目的のｍＲＮＡに
よってコードされるタンパク質の組換えＤＮＡ発現のために必要とされるという
理由で、ＥＳＴを、種々の方法に従って全長ｃＤＮＡを単離するための道具とし
て使用することもまた所望され得る。例えば、目的のＥＳＴ配列を含む核酸は標
識され得、そして配列とハイブリダイズさせるための細胞のＤＮＡ、ｃＤＮＡま
たはＲＮＡの調製物を調査するために使用され得、そしてそのようなハイブリダ
イズした配列は公知の方法に従って単離され得、増幅され得、そしてクローン化
され得る。別の例として、ＥＳＴの配列は、逆ＰＣＲ（このプロセスによって、
目的のＥＳＴに隣接する配列が決定され得る）のためのプライマーを調製するた
めに使用され得る（例えば、ＢｅｎｋｅｌおよびＦｏｎｇ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａ
ｌ．１３：１２３−１２７、１９９６；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４：１４５−１５５，１９９６；ＰａｎｇおよびＫｅｎｃ
ｈｔ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１０４６−１０４８，１９９７；Ｈ
ｕａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：８９−９６，１９９７；
Ｈｕａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６７：２８７−２９４，１９
９７；ならびにＯｆｆｒｉｎｇａおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１８１−１９５，１９９６を参照のこと；これら
の全ては本明細書中に参考として援用される）。
【０１３９】 ＥＳＴから全長ｃＤＮＡをクローニングする方法において、そしてそれ自体有
用な方法として、目的の核酸の比較的高レベルを発現する細胞および組織を同定
するために、種々の細胞および組織から調製されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることが所望される。
【０１４０】 例えば、目的の核酸を使用して、当該分野において公知の種々の方法において
目的の核酸の組織特異的発現パターンまたは時期特異的発現パターンを試験し得
る。目的の核酸は、検出可能に標識され得、そして（ｉ）ｍＲＮＡ分子の固定さ
れた集合（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＢｌｏｔTM もしくはＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ，ＭＴＮTM，Ｂｌ
ｏｔｓ）または（ｉｉ）ｃＤＮＡライブラリー（当該分野において公知の方法に
従って調製されたｃＤＮＡライブラリーまたは例えばＣｌｏｎｅｔｅｃｈもしく
は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡのような受託所から入手可能なｃＤＮＡラ
イブラリー）を調査するために使用され得る。あるいは、またはさらに、目的の
配列を使用して、９６ウェルプレートにおける増幅反応において使用され得る特
定のＰＣＲプライマーを設計し得る（ここで各ウェルは特定の組織に由来する第
１鎖ｃＤＮＡを含む（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤからのＲａｐｉｄ−ＳｃａｎTM遺伝子発現パ
ネル））。この実施形態において、自動化された手段、半自動化された手段、ま
たはロボット化された手段を使用して、そのようなアッセイを実行し得る。
【０１４１】 試験され得る哺乳動物組織としては、脳（脳全体およびその小区分（例えば、
扁桃、尾状核、小脳、大脳皮質、前頭葉、海馬、延髄、後頭葉、被殻、黒質、側
頭葉、視床、眼識（ａｃｕｍｅｎｓ）、視床下部、下側頭回皮質（ｉｎｆｅｒｉ
ｏ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、内側前頭脳底皮質（ｍｅｄｉａｌ ｆ
ｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、後頭極）を含むが、これらは例としてであって
、限定するものではない）、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結腸、肺、小腸、胃、骨
格筋、平滑筋、精巣、子宮、膀胱、リンパ節、脊髄、後根神経節、気管、骨髄、
胎盤、唾液腺、甲状腺、胸腺、副腎、膵臓、卵巣、子宮、前立腺、皮膚、骨髄、
膵臓またはβ細胞のようなそれらの一部、胎児脳および胎児肝臓が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０１４２】 目的のＥＳＴに対応するｃＤＮＡが最適に調製され得る組織または細胞を同定
するために、目的のＥＳＴが単離された生物体に由来するｍＲＮＡもしくはｃＤ
ＮＡライブラリーまたはアレイが調査される。目的の核酸の高レベルの発現を有
する組織または細胞が、全長核酸すなわち目的の完全な遺伝子産物を発現するた
めに必要な全ての遺伝子情報を含む核酸のための供給源として好ましくは使用さ
れる。この全長核酸は、例えば、目的の遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡまたはタ
ンパク質）を発現させるためか、あるいは目的の遺伝子産物の発現もしくは活性
レベル、または組織もしくは時期特異的発現パターンが野生型条件に関して変更
される操作された細胞もしくはトランスジェニック動物を調製するために使用さ
れる。
【０１４３】 ＥＳＴおよび全長ｃＤＮＡの別の有用性は、それによりコードされる目的のタ
ンパク質を同定するため、そしてそれに対する抗体を調製するために、対応する
タンパク質配列についてインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で調査することであ
る。例えば、目的のＥＳＴまたはｃＤＮＡの核酸配列は、６つの全ての潜在的な
リーディングフレーム（ｄｓＤＮＡの各々の鎖に対して３つのリーディングフレ
ーム）においてインシリコで翻訳されて、そして生じたアミノ酸配列をプローブ
として使用して、公知のアミノ酸配列を有する一部のタンパク質との一致につい
てタンパク質データベースを検索する。ミトコンドリアタンパク質の場合におい
て、異なるアミノ酸配列が各々の場合において生じるので、「ユニバーサル」の
遺伝子コードおよびミトコンドリアにて利用されるいくらか異なる遺伝子コード
（表１）の両方を使用して、そのようなインシリコ翻訳を実行することが所望さ
れる。
【０１４４】
【表１】 目的の配列を有するか、または含む核酸が、当該分野において公知の種々の方
法によって調製され得る。例えば、そのような核酸は、分子生物学または合成技
術を使用して作製され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。ヌクレオチド配列における多くの
等価な塩基（天然に存在する塩基および合成性の塩基の両方）が、当該分野にお
いて公知である。例えば、ＤＮＡのチミン残基（Ｔ）は、ＲＮＡ分子においてウ
ラシル（Ｕ）残基に転写されるが、ＴおよびＵの両方はアデニン（Ａ）残基と特
異的に対を形成するので、これらの変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に
影響を与えない。そのような等価な置換体を含む核酸は、本開示の範囲内である
。さらに、本発明の核酸は、１つ以上の核酸以外の部分を有し得る。リボゾーム
におけるこれらの非核酸およびこれらの使用は、米国特許第５，８９１，６８３
号に記載され、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ポリヒドロカーボンお
よび失歩の核酸が挙げられる。
【０１４５】 別の例として、そのような核酸は、オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホトリ
エステル、ホスホラミダイトまたはＨ−ホスファナート（ｐｈｏｓｐｈａｎａｔ
ｅ）方法論によってインビトロで合成されるオリゴデオキシリボヌクレオチドお
よびオリゴリボヌクレオチドを含む）であり得る（それぞれ、Ｃｒｉｓｔｏｄｏ
ｕｌｏｕ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ」第２章：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆ
ｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｓｔ
ｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ａｇｒａｗａｌ、編、Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２０巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９３）；Ｂｅａｕｃａｇｅ、「Ｏｌｉｇｏ
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｈｏｓｐｈ
ｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ」第３章、Ｉｄ．；および、Ｆｒｏｅｈ
ｌｅｒ、「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｈ
−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ」第４章、Ｉｄを参照のこと、こ
れらの全ては本明細書中に参考として援用される）。
【０１４６】 本発明に従う核酸の長さは、核酸が意図される特定の目的に依存して当業者に
よって選択され得る。ＰＣＲプライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド
について、その核酸の長さは約１０〜約１００塩基ヌクレオチド（ｎｔ）が好ま
しく、約１２〜約６０ｎｔがさらに好ましく、そして約１５〜約３０ｎｔが最も
好ましい。リボゾームについて、その核酸の長さは、約２０ｎｔ〜約２００ｎｔ
、約３０ｎｔ〜約１００ｎｔがさらに好ましく、そして約４０ｎｔ〜約８０ｎｔ
が最も好ましい。プローブについて、その核酸の長さは、約１０〜約５，０００
ｎｔが好ましく、約１５〜約１，０００ｎｔがさらに好ましく、そして約２０〜
約５００ｎｔが最も好ましい。
【０１４７】 本発明の核酸に対する適切な化学的改変はまた、当業者によって容易に選択さ
れる。そのような改変としては、例えば、核酸がプローブとして使用するために
検出可能に標識される手段が挙げられ得る。代表的な検出可能な標識としては、
放射活性部分およびレポーター基（例えば、酵素および蛍光部分またはルミネッ
センス部分）が挙げられる。特定の使用（例えばアンチセンス用途）のための適
切な他の化学的改変は、本明細書中に説明される通りである。
【０１４８】 検出可能に標識された核酸は、本発明の診断方法、予後方法および薬理ゲノミ
クス方法のために好ましい。本発明の標識された核酸または標識されていない核
酸のいずれかが、キット形態、例えば、単一容器または分離容器において、他の
試薬（本発明の少なくとも一つの方法を実施する際に使用されるべき緩衝液、酵
素もしくは材料）と共に提供され得る。このキットは、本発明の方法を実施する
ための取り扱い説明書またはソフトウェアを必要に応じて備え得る容器において
提供され得る。そのような取り扱い説明書またはソフトウェアは、任意の言語形
式、あるいはヒトにより読み取り可能な形式または機械により読み取り可能な形
式において提供され得る。
【０１４９】 （示差的に発現される核酸を含む核酸の検出） 示差的に発現される核酸を含む核酸を検出するための種々の方法および手段が
、本発明の方法において使用され得る。そのような方法としては、限定されない
が、以下の方法論が挙げられる。示差的に発現される候補遺伝子を同定するため
に使用される方法にかかわらず、第二の独立した方法が使用されて、第一の方法
から得た結果を確証することが、注目されるべきである。好ましくは、本発明に
おいて、ＩＦ１を発現しない細胞は、第１の細胞として用いられ、そしてＩＦ１
を発現する細胞は、第２の細胞として用いられ、その結果、第１の細胞および第
２の細胞の示差的な表示が決定される。本発明において、第１の細胞および第２
の細胞は、同じ細胞であり得るが、第２の細胞は、図１の記述と同様の構成で、
特定のＩＦ１を発現するように適切なインデューサー（例えば、テトラサイクリ
ン）により誘導される。
【０１５０】 （サブトラクティブハイブリダイゼーション）：参照細胞（例えば、対応する
正常組織由来の細胞）のサンプルの遺伝子の発現と比較した場合の、試験細胞も
しくは標的細胞（例えば、腫瘍組織由来）または疾患状態の組織（例えば、糖尿
病によって影響を受けた組織）の特定のサンプルの遺伝子の発現における差異を
調査するための、サブトラクティブハイブリダイゼーションの技術（Ｈｅｄｒｉ
ｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１４９−１５３、１９８４）を適用するための
代表的な手順において、全細胞ｍＲＮＡが、両方の細胞のサンプルから（任意の
好ましい方法を使用して）抽出される。次いで、試験細胞または標的細胞からの
抽出物中のｍＲＮＡを、従来の様式で使用して、対応する一本鎖ｃＤＮＡを、適
切なプライマーおよび逆トランスクリプターゼを使用して、必要なデオキシヌク
レオシドトリホスフェートの存在下で合成し、引き続いてテンプレートｍＲＮＡ
を、アルカリ加水分解またはＲＮａｓｅ Ｈにより分解して、この一本鎖ｃＤＮ
Ａのみを残す。次いで、試験細胞または標的細胞により発現されるｍＲＮＡから
このように誘導される一本鎖ｃＤＮＡを、ハイブリダイズ条件下で、参照（正常
）細胞からの過剰量のｍＲＮＡ抽出物と混合する；このｍＲＮＡは、一般に、サ
ブトラクティブハイブリダイゼーション「ドライバー」と呼ばれる。なぜなら、
サブトラクティブプロセスを「駆動」するのは、過剰に存在するこのｍＲＮＡか
または他の一本鎖核酸であるからである。その結果として、共通の相補配列を有
するｃＤＮＡ鎖は、ｍＲＮＡ鎖とアニーリングして、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖
を形成し、従って存在する一本鎖種から差し引かれる。これにより、唯一の残存
する一本鎖ＤＮＡは、試験細胞または標的細胞により単独で発現される遺伝子に
より産生されるｍＲＮＡに特異的に誘導される、独自のｃＤＮＡである。あるい
は、この参照細胞は、一本鎖ＤＮＡの供給源として使用され得、そしてこの試験
細胞または標的細胞は、ドライバーＲＮＡの供給源として使用され得る。この場
合、残りの一本鎖ＤＮＡは、参照細胞（標的細胞ではない）中で発現される遺伝
子によって産生されたｍＲＮＡから駆動される。
【０１５１】 サブトラクティブプロセスを完了するために、共通のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重
鎖を、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）または（ストレプト）アビジン−
ビオチンを使用して、クロマトグラフィー分離法において物理的に分離すること
が、一般に必要である。サブトラクティブハイブリダイゼーションの１つ以上の
繰り返し区切りが実施されて、共通に発現した配列の回収の程度を改善し得るが
、他の手段が使用され得る（例えば、米国特許第５，５８９，３３９号を参照の
こと）。サブトラクティブプロセスによって単離した配列をクローニングして、
それらが増幅され得るようにすること、および同定を容易にすることが、一般に
必要である。一本鎖ｃＤＮＡは、当該分野で公知の方法および手段によって二本
鎖ＤＮＡに変換され得る。例えば、一本鎖のヌクレオチド（例えば、デオキシシ
チジン）の複数のコピーを、末端トランスフェラーゼのような酵素を使用して、
一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端上に付加し、次いで、任意の複数の市販のＤＮＡポ
リメラーゼを使用して、相補鎖の合成を開始するために相補配列のオリゴヌクレ
オチド（例えば、ポリＧ）が使用され得る。サブトラクティブハイブリダイゼー
ションから得られたｃＤＮＡ配列を使用して、標識プローブを産生し得、次いで
恐らく、この標識プローブをｃＤＮＡクローンコロニーまたはｃＤＮＡライブラ
リーにおいて、対応するクローン化コピーを検出および同定するために使用し得
る（このようなプローブの標識は頻繁に、ｃＤＮＡの合成において標識デオキシ
ヌクレオシドトリホスフェートを使用することにより導入される）。
【０１５２】 （高密度アレイ）：複数サンプルの核酸ハイブリダイゼーション分析を、マイ
クロ形式の多重デバイスまたはマトリックスデバイス（例えば、ＤＮＡチップま
たはＲＮＡチップ、フィルタおよびマイクロアレイ）において実施し得る（例え
ば、Ｂａｉｎｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７５７−７５８、１９
９２を参照のこと）。これらのハイブリダイゼーション形式は、従来の「ドット
ブロット」および「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション系の、マイクロスケ
ール版である。これらの方法において、特定のＤＮＡ配列が、代表的に、固体支
持体の非常に小さな特定の領域に取り付けられるか、またはそこで合成されて、
多数の異なるＤＮＡ配列が、小さな領域に配置されることを可能にする。この高
密度アレイは、標的エレメント（すなわち、固体支持体に結合した標的核酸分子
）を含む。標的エレメントおよびプローブの両方のための核酸は、例えば、ＲＮ
Ａ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。１つの型のアレイにおいては、ｍＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴ配列由来の短鎖の合成オリゴヌクレオチドである核酸
エレメントを含む標的エレメントが使用されて、遺伝子発現の系列分析が実施さ
れる（ＳＡＧＥ：米国特許第５，８６６，３３０号）。
【０１５３】 ２つの核酸コレクションを比較するための方法において、試験コレクションお
よびコントロールコレクション（これは、例えば、疾患したヒトおよび疾患して
いないヒト由来のｍＲＮＡ調製物であり得る）中の核酸分子が検出可能に標識さ
れる。このように形成した第１および第２の標識プローブは、各々が、複数の標
的エレメントを含む同一の高密度アレイに、標的エレメントへの核酸のハイブリ
ダイゼーションが起こり得るような条件下で、接触される。
【０１５４】 プローブを標的エレメントに接触させた後に、２つのアレイの各々における各
標的エレメントへの結合の量が測定され、そして結合比（すなわち、疾患サンプ
ルにおいて結合した量／コントロールサンプルにおいて結合した量）を、各標的
エレメントに対して決定する。１より大きい結合比は、特定の標的エレメントに
ハイブリダイズする核酸が、コントロール個体から調製した核酸に対して、疾患
した患者から調製した核酸コレクションにおいて「アップレギュレート」される
ことを示し、一方で１より小の結合比は、特定の標的エレメントにハイブリダイ
ズする核酸が、疾患した患者において「ダウンレギュレート」されることを示す
。
【０１５５】 本発明において使用され得る高密度ｃＤＮＡアレイとしては、以下が挙げられ
るが、これらに限定されない：合成オリゴヌクレオチドを含むＧｅｎｅＣｈｉｐTM アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）
；ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓTM酵母またはヒトｃＤＮＡアレイ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）；ＡＴＬＡＳTM ｃＤＮＡ
アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ならびにＧＥＭTMおよびＧｅｎｅ Ｄｉｓｐｌａ
ｙ Ａｒｒａｙ（ＧＤＡ）ｃＤＮＡアレイ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉ
ｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。さらに、マイクロアレイアー（マイクロア
レイを製造する機械）を構築するための１つの方法が、ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ
．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔ
ｍｌにおいてオンラインで利用可能である。
【０１５６】 １つの型の高密度アレイは、電子ハイブリダイゼーションを使用する。すなわ
ち、サンプルＤＮＡ分子を、正電荷により電子的に活性化され得るマイクロチッ
プ上の試験部位に指向し、そしてこれらの分子をそこで濃縮する方法である。溶
液中のＤＮＡ分子は強い負電荷を有するので、これらは活性化部位に引き付けら
れる。各試験部位におけるサンプルＤＮＡ分子の電子ハイブリダイゼーションは
、サンプルＤＮＡの、標的エレメントの核酸との迅速なハイブリダイゼーション
を促進する。電子ハイブリダイゼーションの材料は、Ｎａｎｏｇｅｎ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能であり、そして方法は、米国特許第５，８４９
，４８６号に記載される。
【０１５７】 （示差的ディスプレイ）：試験細胞または標的細胞（例えば、糖尿病に影響を
与えられる組織）の特定のサンプルの遺伝子の発現において、参照細胞（例えば
、対応する正常な脳組織由来の細胞）のサンプルの遺伝子の発現と比較した場合
の差を調査するために、ＲＮＡを逆転写し、そして特定のプライマーセットを用
いて増幅し、そして２種のサンプル由来の得られた増幅産物を比較した（Ｈｉｐ
ｆｅｌ Ｒ，ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ３７:１３１−１３５;Ｂｏｓｃｈ ＴＣおよびＬｏｈｍａｎｎ ＪＵ（１
９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８６：１５３−１６０）。総細胞
ＲＮＡは、両方の細胞のサンプルから（任意の好ましい方法を使用して）抽出さ
れる。両方のサンプル由来のＲＮＡを、１２個のプライマーのセットを使用して
逆転写され、このプライマーは、ＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、ＡＴ、ＣＡ、ＣＣ、ＣＧ、
ＣＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＧ、またはＧＴのいずれか１個で終結するポリ（Ｔ）の配
列を含む。次いで、得られるｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリドーマの一本鎖ｃＤＮ
Ａを、分離反応において増幅し、各反応には、逆転写反応において使用される１
２個の「３’」プライマーのセットの一つおよび「５’」プライマーのセットの
一つを使用する。代表的に、示差的な任意の配列を各々有する、約１２個の５’
プライマーのセットを使用する。得られた増幅産物を、好ましくは、蛍光色素を
有するプライマーを使用することによって標識するが、他の標式方法および他の
標識を使用し得、そして例えばゲル上で電気泳動する。同一のプライマーを用い
た、異なる２種のサンプル由来のＲＮＡの逆転写および増幅から得られる産物を
、比較する。２種のサンプルにおいて異なる発現レベルを有する遺伝子を同定す
るために、ゲルから惹起され得る別のサンプルと比較した場合に１種のサンプル
において過剰発現または発現中のバンドを、再増幅、クローニング、およびシー
クエンシングした。
【０１５８】 （核酸および遺伝子産物の遺伝的調節） 種々のアンチセンスに基づく方法論が、オルガネラ、細胞、組織、器官および
生物体において、目的の核酸の発現、および対応する遺伝子産物の発現を調節（
減少または除外）するために使用され得る。このようなアンチセンス調節は、疾
患または障害における目的の遺伝子の役割を確認するために、あるいは、疾患ま
たは障害の原因または症状が目的の核酸の過剰発現から生じる場合、治療薬剤と
して使用され得る。本発明の場合、ＩＦ１の発現は、ＩＦ１転写または翻訳のイ
ンヒビターの転写または翻訳を阻害することによって増加し得る。あるいは、Ｉ
Ｆ１の発現は、ＩＦ１転写もしくは翻訳の活性化剤の転写もしくは翻訳を阻害す
ることまたはＩＦ１自体の転写もしくは翻訳を阻害することによって減少し得る
。
【０１５９】 用語「アンチセンス」は、遺伝子の「センス」鎖（すなわち、転写される鎖、
タンパク質コード配列の場合、翻訳される鎖）の逆相補体である１つ以上の配列
を含む核酸を示す。アンチセンス核酸はそれらの標的核酸に対して高い特異性で
結合するので、選択性が高く、化合物の誤認から生じる毒性の副作用が最小であ
り得る。
【０１６０】 一般的に、アンチセンス組成物は２つのタイプがある：（ｉ）例えばリボザイ
ムのような酵素的なものを含む合成アンチセンスオリゴヌクレオチド；および(
ｉｉ）アンチセンス発現構築物。当業者は、所与の状況において適切な場合、い
ずれの様式も利用し得る。
【０１６１】 合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的の核酸の逆相補体から調製され
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、示差的に発現されるＲＮＡの逆相補体
に対応する核酸配列からなる。目的のＲＮＡを発現する細胞に導入される場合、
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ分子に特異的に結合し、そして二次
構造が調節因子またはＲＮＡ安定化因子の結合を形成することまたはブロックす
ることを妨げることによってそれらの機能を妨害する。さらに、タンパク質コー
ドＲＮＡ種の場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニ
ル化またはタンパク質翻訳を阻害し得、従って、このようなｍＲＮＡから作製さ
れるタンパク質の量を制限または防止し得る。さらに、または、代替として、こ
のようなオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子に結合し、それらとともに三
重鎖を形成し得、従って、このような配列の転写を妨害し得る。
【０１６２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドをオルガネラゲノムから産生されるＲＮＡに
標的することが所望される場合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、好ましい合成オリ
ゴヌクレオチドである。ＰＮＡにおいて、生物学的核酸の糖リン酸骨格は、ポリ
ペプチド様鎖によって置換されている。タンパク質をオルガネラに指向させる標
的配列は、アンチセンスＰＮＡの骨格に結合され得、結果として、このような結
合体が、標的オルガネラに優先的に送達される（例えば、公開ＰＣＴ出願ＷＯ９
７／４１１５０およびＷＯ９９／０５３０２を参照のこと）。
【０１６３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然において固有に酵素的であり得、す
なわち、標的されるＲＮＡ分子を分解し得る；このような分子は、一般的に「リ
ボザイム」と呼ばれる。目的の核酸配列を含むように改変され得る種々の増加性
的に短い合成リボザイムフレームワークが記載され（ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔ
ｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０〜５１５，１９９
６）、これには、ヘアピンリボザイム（Ｈａｍｐｅｌ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８：１〜３９、１９９８）、ハン
マーヘッドリボザイム（Ｂｉｒｉｋｉｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４
５：１〜１６、１９９７）およびミニザイム（ｍｉｎｉｚｙｍｅ）（Ｋｕｗａｂ
ａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：９６１〜９６５
、１９９８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】 一般的に非触媒的なアンチセンス核酸およびリボザイムの場合、細胞中の遺伝
子発現のアンチセンス調節はまた、インビボの目的のヌクレオチド配列の逆相補
体の転写に指向する発現構築物によって達成され得る。例えば、哺乳動物細胞ま
たは植物細胞においてアンチセンス転写を非触媒的に発現するために、それぞれ
哺乳動物発現ベクターまたは植物発現ベクターにクローンされている目的の核酸
の「フリッピング」（すなわち、方向の逆転）のみが必要とされ得る。翻訳シグ
ナルなどのようなエレメントの適切な関係を維持することは必要ではない。なぜ
なら、このタイプのアンチセンス発現構築物にための最小限の要件は、目的の核
酸の逆相補体に作動可能に連結されるプロモーターであるからである。細胞中に
おいてリボザイムを発現する発現構築物を設計することも可能である。アンチセ
ンスおよびリボザイム発現構築物はまた、目的の遺伝子の発現レベルが時間特異
的な方法でまたは組織特異的な方法で調節され得るトランスジェニック動物を産
生するために使用される（総説について、ＳｏｋｏｌおよびＭｕｒｒａｙ、Ｔｒ
ａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．、５：３６３〜３７１、１９９６を参照のこと）。
【０１６５】 本発明に従って誘導される核酸配列はまた、「ＲＮＡデコイ（ｄｅｃｏｙ）」
すなわち、トランス作用調節因子と結合するシス作用調節配列に対応する短いＲ
ＮＡ分子を設計するために使用され得る。細胞において過剰に発現される場合ま
たは過剰に細胞に投与される場合、このようなＲＮＡデコイは、トランス作用性
調節因子の結合従って作用を競合的に阻害し、従ってこのような因子が目的のＲ
ＮＡを安定化する（もしくは不安定化する）プロセス、あるいはポリアデニル化
、核輸送のスプライシング、またはＲＮＡの翻訳を増強（もしくは減少する）プ
ロセスを実行するための能力を制限または防止する（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒら、Ｊ
．Ｖｉｔｒｏｌ．６５：６８１１〜６８１６，１９９１）。従って目的のＲＮＡ
の発現は、治療目的のために増強されるかまたは減少されるかのいずれかであり
得る。
【０１６６】 （ポリペプチドおよびタンパク質） 本発明の方法に従って同定された目的の核酸は、アミノ酸配列をコードし得る
。このようなアミノ酸配列は、全長タンパク質またはそれらのポリペプチド部分
に対応し得る。本発明はまた、ＩＦ１の誘導体であるポリペプチドまたはＩＦ１
の少なくとも１つの活性を有するポリペプチドを含む。例えば、上記のように、
本発明に従う特定のポリペプチドは、ＩＦ１変異体、改変体、誘導体、アナログ
、融合体、またはフラグメントポリペプチドなどを含み、これらは、ＡＴＰシン
ターゼサブユニットと結合し得ないか、あるいはＡＴＰシンターゼと結合する場
合、ＡＴＰシンターゼ活性を阻害するのではなく活性する。このようなポリペプ
チドの同定、構築、発現、検出および機能アッセイは、本発明の開示に基づいて
当業者によって容易に実施される。
【０１６７】 目的の核酸により全長タンパク質がコードされる場合、このタンパク質は、市
販される公知のタンパク質またはそれに対する抗体が公知であるタンパク質であ
り得、そして適切な生物学的サンプルからそのタンパク質を単離するために使用
され得る。本発明の全長タンパク質が以前に記載されてない場合、そのタンパク
質は、組換えＤＮＡ方法を介して産生されるか、公知の生化学的技術を使用して
生物学的サンプルから調製され得る。本発明の短い（すなわち、約１００ヌクレ
オチド未満を有する）核酸によりコードされるか、またはより長い核酸によりコ
ードされるアミノ酸配列由来かもしくは全長タンパク質由来の短い（すなわち、
約３０アミノ酸未満を有する）ポリペプチドは、当該分野で公知の技術によりイ
ンビトロで合成され得る。目的のアミノ酸配列を含む融合タンパク質はまた調製
され得、そして本発明のポリペプチドおよびタンパク質の範囲内に含まれる。
【０１６８】 本発明のポリペプチドおよびタンパク質が調製される手段に関係なく、ポリペ
プチドおよびタンパク質は、種々の適用を有する。これらは、抗体を産生するか
もしくは治療剤として機能し得るリガンドをスクリーニングするために使用され
得るか、またはそれら自体が治療剤として使用され得る。本発明の全長タンパク
質は、野生型タンパク質の活性を有し得、そして従って、そのような活性の欠損
から生じる状態を処置するために使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、
このような活性を有し得るか、またはタンパク質のリガンドを結合することによ
り、インビボで目的のタンパク質を競合的に阻害し得る。このリガンドがこのタ
ンパク質の活性化剤である場合、このようなポリペプチドは、インビボでのこの
タンパク質の過剰発現または過剰活性化から生じる状態を処置するために使用さ
れ得る。このリガンドが毒物または細胞死（アポトーシスまたは壊死）の活性化
剤である場合、それらの投与を必要としている患者へのこのようなリガンドを結
合するタンパク質またはポリペプチドの投与は、毒物または細胞死活性化剤を競
合的に阻害する有利な効果を有する。
【０１６９】 （抗体） 目的のタンパク質またはポリペプチドに対する抗体は、当該分野で公知の種々
の方法に従って調製される。特に、ＩＦ１と結合する抗体または標識配列（例え
ば、ＦＬＡＧ）は、特に、細胞中で、このようなポリペプチドと結合する標識化
抗体を使用して、ＩＦ１または標識配列を検出するために使用され得る。一般に
、このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたは単一特異的抗体で
あり得る。本発明の一次抗体は、目的の特定のタンパク質またはポリペプチドに
特異的に結合し、そして従って、このようなタンパク質およびポリペプチドを検
出しそして定量するためのアッセイに使用される。本発明はまた、結合特異性を
示す活性フラグメントまたは活性部位、あるいはこれらが誘導されたインタクト
な抗体との実質的な結合特異性を示す活性フラグメントまたは活性部位を含む。
このようなアッセイでは、一般に、当該分野で免疫アッセイといわれ、本発明の
一次抗体は、検出可能に標識されるか、または検出可能に標識された二次抗体、
または二次抗体および検出可能に標識された三次分子（これもまた抗体であり得
る）との組み合わせにより特異的に認識されそしてモニターされる。特定の形式
に関係なく、本発明の一次抗体は、目的のタンパク質またはポリペプチドが特異
的に結合され、そして引き続いて検出される手段を提供する。１つの好ましいア
ッセイ形式は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）形式である。
【０１７０】 目的の核酸は、公知のタンパク質もしくはそれらの部分、または公知のタンパ
ク質に対して相同であるポリペプチド配列をコードし得る。このような場合、公
知のタンパク質またはそれらの公知の部分に対する抗血清は、市販され得る。後
者の場合、または組換えＤＮＡ発現技術を介して目的の核酸が目的のタンパク質
（または長さが約３０アミノ酸を超えるポリペプチド部分）を生成するために使
用され得る場合、公知であるかまたは組換え的に産生されたタンパク質は、ポリ
クローナル抗体が調製され得る抗血清を生成するために選択の動物（例えは、ウ
サギ、マウスまたはラット）を免疫化するために使用され得る（例えば、Ｃｏｏ
ｐｅｒおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、第１１章の１１．１２ならびに１１．１３節：
Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，１１−３７〜１１−４１頁を参照のこと
）。
【０１７１】 目的の核酸配列が完全タンパク質（またはそれらのホモログ）が公知でないポ
リペプチド配列をコードするか、目的の核酸配列が約３０を超えるアミノ酸をコ
ードするには短すぎるか（すなわち、目的の核酸が約１００を超えるヌクレオチ
ド長である）、または見込み目的の１つ以上のポリペプチド配列をコードする場
合、このような候補アミノ酸配列は、各々が規定のアミノ酸配列を有する１つ以
上のポリペプチド分子を合成するために使用され得る。次いで、このような合成
ポリペプチドは、当該分野で公知の方法（ＣｏｌｌａｗｎおよびＰａｔｅｒｓｏ
ｎ，第１１章の１１．１４および１１．１５節：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９２，１１−４２〜１１−４６頁；ＣｏｏｐｅｒおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、第
１１章のＵｎｉｔｓ １１．１２ならびに１１．１３節：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９９２，１１−３７〜１１−４１頁）に従って動物（例えば、ウサギ）
を免疫化する。次いで、得られた抗血清（特定の患者に特異的であり、そして時
々「単一特異的」といわれる）は、目的の核酸が単離されるプローブ細胞に使用
され得る。所定の抗血清に対する陽性応答は、抗血清を誘起するために使用され
る合成ポリペプチドが誘導される候補リーディングフレームがそのように試験さ
れる細胞における少なくとも１つのタンパク質をコードするために使用されるレ
ーディングフレームであることを示す。さらに、このような抗血清は、目的の核
酸が単離される細胞中の目的のタンパク質を同定するために使用され得る。
【０１７２】 これらの高度な特異性および相同性から、モノクローナル抗体は、しばしば種
々の適用に対する好ましい型の抗体である。モノクローナル抗体を産生し、そし
て調製する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｆｕｌｌｅｒら、第１１章
の１１．４ならびに１１．１１節：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，１１
−２２〜１１−３６頁を参照のこと）。マウスモノクローナル抗体は、「ヒト化
」され、そして治療剤として使用され得る（例えば、ＧｕｓｓｏｗおよびＳｅｅ
ｍａｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：９９−１２
１，１９９１；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１６：５３５−５３９、１９９８）。
【０１７３】 目的のタンパク質およびポリペプチドに対する抗体は、種々のアッセイ形式に
おけるそのようなタンパク質およびポリペプチドを検出するために使用される。
このような免疫アッセイは、本発明の診断的方法、予後的方法もしくは薬理ゲノ
ミクス的方法において、または種々の細胞型、組織もしくは器官が目的のタンパ
ク質の存在に関して調査される方法において有用であり得る。モノクローナル抗
体は、一般に、それらの高度な特異性または相同性に起因して、そのような方法
にとって好ましい。
【０１７４】 （診断的方法、予後的方法および薬理ゲノミクス的方法） 本発明の１つ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質、それらのリガンド
ならびに核酸プローブおよびプライマーをアッセイするか、または使用すること
は、本発明の診断的方法、予後的方法および薬理ゲノミクス的方法において使用
される。用語「診断（的）」とは、個体が目的の疾患もしくは障害を患っている
か否かを決定するために、典型的には他のアッセイからの結果と組み合わせて、
当業者により使用され得る結果を提供するアッセイをいい、一方用語「予後（的
）」とは、治療的もしくは予防的処置に対するこのような疾患または障害を有す
る抗体の応答を評価するためのこのようなアッセイの使用をいう。用語「薬理ゲ
ノミクス（的）」とは、１つの群においてどの個々の患者が、特定の治療的もし
くは予後的組成物または処置に対して最も良く応答するのかを予想するためのア
ッセイの使用をいう。
【０１７５】 用語「疾患」および「障害」は、Ｉ型またはＩＩ型のいずれかの糖尿病をいう
。
【０１７６】 本発明の診断的および予後的適用において、個体由来のサンプルを、「マーカ
ー」、すなわち目的の核酸またはタンパク質、あるいは目的の核酸またはタンパ
ク質の内因性リガンドまたは抗体の、相対的または絶対的な量に関してアッセイ
する。コントロールレベルに比較して増加したまたは減少したマーカーのレベル
は、サンプルを取ったその個体が、目的の疾患または障害を有しているか、有し
ていたか、またはそれに発展する可能性があることを示す。用語「コントロール
レベル」は、目的の疾患または障害を有さないことが既知である一以上の個体か
ら取ったサンプル中に存在するマーカーのレベル、あるいは診断的サンプルの前
または後に、問題の個体から取ったサンプル中に存在するマーカーのレベルを指
す。それに加えて、または代替的に、目的の疾患または障害を有さないことが知
られている多くの個体を、マーカーのレベルに関して試験して、そしてマーカー
の正常レベルに対応する絶対的な量または濃度を確立する；この実施形態におい
て、影響された個体を、正常値より有意に低いまたは高いマーカーのレベルを有
するものとして同定する。さらに、ハイブリダイゼーションの技術（Ｓａｐｏｌ
ｓｋｙ ＲＪら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．（１９９９）１４：１８７−１９２）
または当該分野で公知もしくは後に開発された他の方法によって、本発明の核酸
を使用して、一本鎖ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）について、および遺伝子欠失ま
たは挿入のような他の変異についてスクリーニングし得る。
【０１７７】 本発明の薬理ゲノミクス的適用において、目的の疾患または障害に罹患してい
る患者を、本発明の１つ以上のアッセイを用いて、所望されるまたは所望されな
い応答に関して分類する。他に比べてある患者においてより有効であることが公
知であるか、またはより大きな副作用を引き起こす治療的組成物および／または
処置を、目的の疾患または障害に罹患している患者の群に投与する。疾患を有す
るどの患者が、治療的組成物および／または処置に応答する可能性がより高いか
同定する方法は、疾患を有する患者の群からサンプルを提供すること；サンプル
中に存在する目的のタンパク質もしくはポリペプチド、または目的の核酸、また
はそのリガンドもしくはそれに対する抗体の量を測定すること；治療的組成物お
よび／または処置を患者に提供すること；治療的組成物および／または処置に対
する患者の応答の程度、頻度、率、または範囲を測定すること；およびサンプル
中に存在する目的のタンパク質もしくはポリペプチド、または目的の核酸、また
はそのリガンドもしくはそれに対する抗体の量と、そのような応答の程度、頻度
、率、または範囲との間に関連が存在するかどうかを決定することを含む。
【０１７８】 得られる関連を、以下のような方法で患者を分類するのに使用する。そのよう
な関連がポジティブな関連である場合、そのような関連の存在は、増加した量の
目的のタンパク質もしくはポリペプチド、またはそのリガンド、または目的の核
酸を有するサンプルを産生する患者は、処置に応答する可能性がより高いことを
示す。対照的に、関連がネガティブな関連である場合、関連の存在は、増加した
量の目的のタンパク質もしくはポリペプチド、またはそのリガンド、または目的
の核酸を有するサンプルを産生する患者は、処置に応答する可能性がより低いこ
とを示す。さらに、本発明の核酸および／またはポリペプチドの分子属性は、治
療組成物および処置に対する患者の応答とポジティブまたはネガティブに相関し
得、そして最適な治療過程を決定して患者を満足させるための明確な分子属性に
関するスクリーニング方法がまた、本発明の一部である。
【０１７９】 これらの方法において測定される応答は、所望される応答であり得、その場合
には治療的組成物および／または処置を、比較的高レベルの目的のタンパク質も
しくはポリペプチド、またはそのリガンド、または目的の核酸を有する患者に提
供することが好ましい。あるいは、これらの方法で測定される応答は所望されな
い応答であり得、その場合には治療的組成物および／または処置を、比較的高レ
ベルの目的のタンパク質もしくはポリペプチド、またはそのリガンド、または目
的の核酸を有する患者に提供するのを避けることが好ましい。
【０１８０】 前述の方法のアッセイは、患者から得たサンプルが配達される実験室で、また
は患者処置の場所で行い得る。後者の場合、１つ以上の本発明のアッセイを行う
キットが好ましい。本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質、そのリガン
ドおよび核酸プローブおよびプライマーを、例えば単一のまたは別々の容器で、
本発明の少なくとも１つの方法を実施するのに使用する他の試薬、緩衝液、酵素
または材料と共に、キット形式で提供し得る。そのようなキットを、必要に応じ
て本発明の方法を実施するための説明書またはソフトウェアを含み得る容器で提
供し得る。そのような説明書またはソフトウェアは、あらゆる言語で、または人
もしくは機械により読み取り可能な形態で提供し得る。
【０１８１】 （高スループットアッセイを含む化合物のスクリーニング） 本発明の核酸、タンパク質、ポリペプチド、抗体およびトランスジェニック動
物を、特定の疾患、障害、または所望されない応答における目的の遺伝子産物の
役割を検証するために、および好ましくは当該分野で公知の、または後で開発さ
れたもののような高スループットスクリーニング方法を用いて、そのような疾患
、障害、および所望されない応答を処置するために使用し得る条件または化合物
をスクリーニングするために使用し得る。そのような処置は、本質において治効
の（ｒｅｍｅｄｉａｌ）、治療の、緩和する、回復する、予防的な（ｐｒｅｖｅ
ｎｔａｔｉｖｅ）、妨げとなる、または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）で
あり得る。本発明が適用され得る疾患および障害は、Ｉ型およびＩＩ型を含む糖
尿病を含む。
【０１８２】 「所望されない応答」という用語は、生物体の１つ以上の細胞による、１つ以
上の物理的条件、化学的薬剤、またはその組み合せに対する、所望されない結果
に至る生物学的または生化学的応答を指す。所望されない応答は、オルガネラレ
ベルで（例えばミトコンドリアにおけるΔψの喪失）、細胞レベルで（例えばア
ポトーシスまたはネクローシスのような細胞死）、組織において（例えば虚血）
、臓器において（例えば虚血性心疾患）または生物体全体に対して（例えば死；
生殖能力または認識過程の喪失）起こり得る。
【０１８３】 所望されない応答を引き起こし得る物理的条件は、制限無しに、低体温、高体
温、脱水、紫外線および他の型の照射に対する曝露、微小重力状態、物理的外傷
、引っ張り応力、および電場または磁場への曝露を含む。所望されない応答を引
き起こし得る化学的薬剤は、制限無しに、活性酸素種（ＲＯＳ）、アポトーゲン
（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）等を含む。
【０１８４】 本発明の核酸を、以下の方法で、疾患状態および所望されない応答を処置する
ために使用し得る条件または化合物をスクリーニングするために使用する。リボ
リボサイムを含むアンチセンス分子を用いた細胞の処理、または目的の所定の遺
伝子産物に特異的なアンチセンス構築物のそこへの導入は、その遺伝子が検証さ
れる疾患または障害に関連する、少なくとも１つの生化学的または生物学的欠損
を示すような細胞を産生する。同様の様式で、目的の遺伝子の過剰発現を指示す
る構築物、またはアンチセンスもしくはリボザイム発現構築物を含むトランスジ
ェニック動物、あるいはアンチセンス、リボザイムまたは分子デコイオリゴヌク
レオチドが投与される動物は、もしその核酸がその疾患または障害の効果的な標
的である遺伝子産物をコードするなら、目的の疾患または障害に関連する、少な
くとも１つの生化学的または生物学的欠損を示す。さらに、本発明によって同定
され、そして疾患または障害と相関付けされる遺伝子のＳＮＰまたは変異形態は
、相同組換えによって細胞または動物に導入され得る。このような細胞または動
物、あるいはこのような動物由来の細胞は、種々のアッセイまたは生理学的評価
／測定のいずれかによって、疾患状態を処置するために使用され得る状態または
化合物に対する応答を評価するために使用され得る。
【０１８５】 同様に、治療的介入の標的となり得る目的のタンパク質に関して、細胞をタン
パク質に特異的な１つ以上の抗体と接触させ得、そして疾患または障害に関連す
る応答の提示が効果的な標的によって見られる。本発明のポリペプチドおよびタ
ンパク質をまた、疾患状態および所望されない応答を処置するために使用し得る
条件または化合物をスクリーニングするために使用する。１つの型のスクリーニ
ングにおいて、目的のタンパク質、または目的のタンパク質の少なくとも１つの
活性を有するそれから得られたポリペプチドを、組換えＤＮＡ方法またはインビ
トロ合成技術によって産生する。固体支持体に結合し得るタンパク質またはポリ
ペプチドを、検出可能に標識したリガンド（例えば抗体を含む）と接触させる。
次いで化合物を反応容器に導入し、そして検出可能に標識したリガンドの放出を
引き起こすものとして活性化合物を同定する。
【０１８６】 本発明の核酸、ポリペプチド、抗体を含むアッセイは、複数の化合物の迅速な
スクリーニングのために自動化され得る。本発明は、本発明の核酸、ポリペプチ
ド、抗体および遺伝子操作された細胞に対する特定の適用性を有するように開発
され得る高スループットスクリーニング、そしてまた、当該分野で公知である高
スループットスクリーニングを含み（例えば、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，ＢＲら（１
９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：７１−８３；ＭｃＤｏｎａｌｄ、ＯＢら（１
９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３１８−３２９；Ｓａｐｏｌｓｋ
ｙ，ＲＪら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．（１９９９）１４：１８７−１９２；Ｓｗ
ａｒｔｚｍａｎｎ，ＥＥら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１
４３−１５１；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ＪＥおよびＮｅｇｌｅｓｃｕ ＰＡ（１９９
８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６２４−６３１）、そして本発明の
目的に適合され得る。
【０１８７】 上記のように、ＩＦ１とＡＴＰとの間の相互作用を変更する薬剤を同定する方
法を提供するために、本発明は、本明細書中に記載されるようなＩＦ１とＡＴＰ
シンターゼとの間の結合相互作用を開拓する。ＩＦ１と少なくとも１つのＡＴＰ
シンターゼサブユニットおよび／またはＡＴＰシンターゼマルチサブユニット複
合体（例えば、Ｆ１部分）との間の結合相互作用が、複合体の形成を生じ得、こ
れは、本明細書に提供される、ＩＦ１とＡＴＰシンターゼとの間の親和性相互作
用から生じる特異的分子間会合をいう。
【０１８８】 ＩＦ１およびＡＴＰシンターゼ複合体は、２つのポリペプチド間の分子間相互
作用を実証するために、当該分野で公知の種々の技術（例えば、同時精製、同時
沈澱、同時免疫沈降、放射分析アッセイまたは蛍光定量アッセイ、ウエスタン免
疫ブロット分析、親和性捕獲（例えば、固相リガンド−対リガンド（ｃｏｕｎｔ
ｅｒｌｉｇａｎｄ）吸着剤技術、アフィニティクロマトグラフィーおよび表面親
和性プラズモン共鳴のような親和性技術を含む）など）のいずれかによって同定
され得る。複合体の存在の決定は、本明細書に提供されるようなＩＦ１および／
またはＡＴＰシンターゼに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体、ポリク
ローナル抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体などを含む）を使用し得る。
【０１８９】 本明細書中に提供されるような標識されたＩＦ１ポリペプチドおよび／または
１つ以上の標識されたＡＴＰシンターゼサブユニットはまた、複合体の存在を検
出するために使用され得る。これらのタンパク質は、適切なレポーター分子また
は部分（例えば、種々の酵素、蛍光物質、発光物質および放射活性物質のいずれ
か）を共有結合的にまたは非共有結合的に付着させることによって標識され得る
。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリ
ホスホターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げ
られるが、これらに限定されない。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェ
ロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチ
オシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化
ダンシルおよびフィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。適切
な発光物質はルミノールを含み、そして適切な放射活性物質は、放射活性なリン
［32Ｐ］、ヨウ素［125Ｉまたは131Ｉ］またはトリチウム［3Ｈ］を含む。
【０１９０】 本発明に従って、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのＡＴＰシ
ンターゼサブユニットポリペプチドは、分子間複合体の形成を可能にするに条件
下および十分な時間の間、ＡＴＰシンターゼサブユニットと相互作用する少なく
とも１つの検出可能な標識ＩＨ１ポリペプチド（例えば、エピトープタグ化ＩＦ
１融合タンパク質）と組合わせられる。このような複合体の形成のための適切な
条件は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に提供される教示に基づいて
容易に決定され得、これは、溶液条件ならびに複合体の存在を検出するためのお
よび／または溶液中の遊離基質を検出するための方法を含む。本発明に従って、
ＩＦ１とＡＴＰシンターゼとの間の相互作用を変更する薬剤を同定するための方
法が提供され、この方法は、このような薬剤の非存在下での結合のレベルと、候
補薬剤の存在下でのＩＦ１−ＡＴＰシンターゼ結合のレベルを比較する工程を包
含する。このような結合アッセイは、結合複合体の存在の直接的または間接的な
検出を使用し得、そして当業者に知られた高スループットスクリーニングアッセ
イに容易に適用可能である。特定の他の関連した実施形態において、ＡＴＰシン
ターゼ触媒活性（ＩＦ１とＡＴＰシンターゼとの間の結合相互作用の代わりに）
が、確立された方法に従って決定され得、その結果、ＡＴＰシンターゼ触媒活性
に対するＩＦ１の効果に対する候補薬剤の影響が、観測され得る。
【０１９１】 （治療的適用） 上記の実施形態によってそれから得られた治療薬を、従来の賦形剤、すなわち
活性化合物と有害に反応しない、非経口適用に適切な薬剤学的に受容可能な有機
または無機キャリア物質と組み合せて採用し得る。適切な薬剤学的に受容可能な
キャリアは、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラ
チン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘
性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、石油エーテル
脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む
がこれらに限らない。薬学的調製物を、滅菌およびもし所望されるなら補助剤、
例えば活性化合物と有害に反応しない潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化
剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、色素、矯味矯臭剤および／または芳香物
質等と混合し得る。非経口適用に関しては、特に適切なビヒクルは、好ましくは
油性の溶液または水溶液、および懸濁液、エマルジョン、またはインプラントか
らなる。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質を含み得、そして例えば
カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキス
トランを含む。必要に応じて、懸濁液はまた安定化剤を含み得る（一般的にはＷ
ｈｉｔｎｅｙに対する第ＷＯ９８／１３３５３号、１９９８年４月２日公開を参
照のこと）。
【０１９２】 本発明の目的のために、「治療的有効量」という用語は、その意図した目的を
達成するのに有効な治療的薬剤の量を指す。個体の要求は異なるが、治療的薬剤
の有効な量の最適な範囲を決定することは、当該分野の技術の範囲内である。ヒ
ト投与量を動物研究から外挿し得る（ＦｉｎｇｌｅおよびＷｏｏｄｂｕｒｙ、Ｇ
ｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第５版、ＭａｃＭｉｌ
ｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）の第１
章、１−４６頁）。一般的に、有効な量の組成物を提供するのに必要な、そして
当業者によって調節し得る投与量は、レシピエントの年齢、身体の健康状態、体
重、疾患の程度、治療の頻度、ならびに所望される効果の性質および範囲によっ
て異なる。
【０１９３】 本発明の治療的薬剤は、１つ以上のこれら組成物または、リポソーム（Ｒａｈ
ｍａｎおよびＳｃｈｅｉｎ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉ
ｅｒｓ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）、３８１−４００頁；Ｇａｂｉｚｏｎ，Ａ．、Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒ
ｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９巻、Ｒｏｅｒｄｉｎｋら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、１８５−２１２頁）、微粒子（Ｔｉｃｅら、
米国特許第４，５４２，０２５号）、またはこれらの組成物の１つ以上を含む処
方物の間欠的なまたは連続的な静脈内注射によって；薬剤−ポリマー結合体の皮
下インプラントによって（Ｄｕｎｃａｎ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ
３：１７５−２１０、１９９２）によって；ミクロパーティクルボンバードメ
ント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって（Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，
９４５，０５０号）；注入ポンプによって（ＢｌａｃｋｓｈｅａｒおよびＲｏｈ
ｄｅ、Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９巻、Ｒｏｅｒｄｉｎｋ
ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、２９３−３１０頁
）、または当該分野で公知の他の適切な方法によって（一般的にはＲｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇ
ｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐ
Ａ、１９９０を参照のこと）、哺乳動物に送達し得る。
【０１９４】 （トランスジェニック動物） 目的の核酸に関して修飾されたトランスジェニック動物が、調製され得る。こ
のような動物は、ヒト疾患の動物モデルの開発のため、および本発明の治療剤の
安全性および有効性を評価するために有用である。一般に、このようなトランス
ジェニック動物には３つの型がある：（ｉ）「トランスジェニックノックアウト
」（動物の、目的の遺伝子のホモログが破壊または除去され、対応する遺伝子産
物の機能の欠損を伴う）；（ｉｉ）「構成的トランスジェニック」（目的の遺伝
子が構成的プロモーターに作動可能に連結される）；（ｉｉｉ）「調節トランス
ジェニック」（目的の遺伝子が、誘導プロモーターに動作可能に連結される）；
および（ｉｖ）「置換トランスジェニック」（動物の、目的の遺伝子のホモログ
が目的のヒト遺伝子、または目的の遺伝子の改変形態（例えば、成熟形態）（内
在性プロモーターかまたは誘導プロモーターから発現され得る）で置換されてい
る）。
【０１９５】 本発明の非ヒトトランスジェニック動物としては、１つ以上の上記のクラスの
トランスジェニック動物を生成するように遺伝子操作され得る任意の動物が挙げ
られる。このような非ヒト動物としては、脊椎動物（例えば、げっ歯類、非ヒト
霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、両性類、爬虫類など）が挙げられる。好ましい非
ヒト動物は、動物の非ヒト哺乳動物種（ラットおよびマウス、最も好ましくはマ
ウス（例えば、米国特許第５，６７５，０６０号および同第５，８５０，００１
号を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されないげっ歯類ファミリーに属
する非限定的な動物を含む）から選択される。調製され得る他の非ヒトトランス
ジェニック動物は、非限定的にウサギ（米国特許第５，７９２，９０２号）、ブ
タ（米国特許第５，５７３，９３３号）、ウシ種（米国特許第５，６３３，０７
６号および同第５，７４１，９５７号）およびヒツジ（ｏｖｉｎｅ）種（例えば
、ヤギおよびヒツジ（ｓｈｅｅｐ））（米国特許第５，８２７６９０号；同第５
，８３１，１４１号および同第５，８４９，９２２号）が挙げられる。
【０１９６】 本発明の１つの局面において、同定されたＩＦ１遺伝子を有する動物（マウス
またはラット）は、動物ＩＦ１が「ノックアウト」であり、そしてヒトバージョ
ンで置換されるように操作され得る。このようなマウスは、相同組換えを使用し
て、作製され得る。これらの動物は、ヒトＩＦ１の活性を評価するために、それ
らの非操作対応物と比較され得る。
【０１９７】 本発明のトランスジェニック動物は、非自然的な手段により（すなわち、人間
の操作により）、動物において天然に存在しない１つ以上の遺伝子（例えば、外
来遺伝子、遺伝子操作された内在性遺伝子など）を導入された動物である。導入
遺伝子として公知である非自然的に導入された遺伝子は、動物と同じかまたは異
なる種由来であり得るが、その導入遺伝子により与えられる配置および／または
染色体の座位では動物において天然に見出されない。導入遺伝子は、外来ＤＮＡ
配列を含み得る（すなわち、配列は、通常宿主動物のゲノム中に見出されない）
。あるいは、またはさらに、導入遺伝子は、遺伝子の発現の通常のインビボパタ
ーンを変化するかまたは遺伝子によりコードされる内在性遺伝子産物の生物学的
活性を変化するかもしくは排除するために、内因性ＤＮＡ配列がインビトロで再
配列されるかもしくは変異された、異常である内因性ＤＮＡ配列を含み得る。（
Ｗａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、２５５−２７２頁；Ｇｏｒｄ
ｏｎ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９，１９８９；Ｊ
ａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４，１９８９；Ｒ
ｏｓｓａｎｔ，Ｎｅｕｒｏｎ ２：３２３−３３４，１９９０）。導入遺伝子は
、相同組換えによってゲノムに導入され得、それによって、導入遺伝子は、レシ
ピエント動物ゲノム中の遺伝子の内因性コピーを置換する。標的遺伝子置換を生
成し、そしてスクリーニングする方法ならびに標的化遺伝子置換を保有するトラ
ンスジェニックマウスの生成が、米国特許第５，８１４，３００号に記載される
。
【０１９８】 本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物の生殖系列中へ、目的
の配列を含むトランスジェニック構築物またはそれらの宿主動物のホモログを導
入することにより作製される。種々の発達段階の胎仔の標的細胞は、本発明の導
入遺伝子を導入するために使用される。異なる方法が、胎仔の標的細胞の発達の
段階に依存して使用される。
【０１９９】 接合体のマイクロインジェクションは、本発明の実施の過程において、動物の
ゲノム中に導入遺伝子を組み込むための好ましい方法である。接合体（前核融合
または引き続く細胞分裂を経てない受精卵）は、トランスジェニックＤＮＡ配列
のマイクロインジェクションのための好ましい標的細胞である。マウス雄性前核
は、直径約２０マイクロメートルのサイズに達し、この特色は、１〜２ピコリッ
トルのトランスジェニックＤＮＡ配列を含む溶液の再現性のある注射を可能にす
る。導入遺伝子の導入のための接合体の使用は、多くの場合、注射したトランス
ジェニックＤＮＡ配列が、最初の細胞分裂の前に宿主動物のゲノム中へ組み込ま
れる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８２：４４３８−４４４２，１９８５）という利点を有する。結果として、
得られるトランスジェニック動物（創始動物）の全細胞は、トランスジェニック
対立遺伝子といわれる特定の遺伝子座に組み込まれた導入遺伝子を安定に保有す
る。このトランスジェニック対立遺伝子は、メンデル遺伝を示す：非トランスジ
ェニック動物とトランスジェニック動物との交配から生じる子孫の半分は、ラン
ダムな組み合わせのメンデルの法則に従って、トランスジェニック対立遺伝子を
遺伝する。
【０２００】 ウイルス性の組込みはまた、動物への本発明の導入遺伝子を導入するために使
用され得る。発生中の胚は、胞胚として知られる発達段階へ、インビトロで培養
される。同時に、割球が、適切なレトロウイルスで感染され得る（Ｊａｅｎｉｓ
ｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３：１２６０−１２６４，
１９７６；ＳｏｒｉａｎｏおよびＪａｅｎｉｓｃｈ，Ｃｅｌｌ ４６：１９−２
９，１９８６）。割球の感染は、透明帯の酵素的除去により増強される（Ｈｏｇ
ａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｋｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。導入遺伝子は、宿主動物のゲノム中へ、ウ
イルスベクター（典型的には複製欠損であるが、このようなウイルス配列に連結
されているトランスジェニックＤＮＡ配列を含むウイルス関連ＤＮＡ配列の組み
込みに対してはコンピテントなままである）を介して導入される（Ｊａｈｎｅｒ
ｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６９２７
−６９３１，１９８５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６１４８−６１５２，１９８５）。
トランスフェクション体は、導入遺伝子を含むウイルスベクターを産生する細胞
の単層上の割球の培養により簡便かつ効果的に得られる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕ
ｔｔｅｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：６
１４８−６１５２，１９８５；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３８３−
３８８，１９８７）。あるいは、感染は、より遅い段階（例えば、胞胚腔）で行
われ得る（Ｊａｈｎｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８，１９８
２）。任意の事象において、ウイルス性の組込みにより作製される、ほとんどの
トランスジェニック創始動物は、トランスジェニック対立遺伝子に関してモザイ
クである；すなわち、導入遺伝子は、ドランスジェニック創始動物を形成する全
ての細胞のサブセットのみへ組み込まれる。さらに、複数のウイルス性の組み込
み事象が、単一の創始動物において生じ得、子孫の後世を差別化する複数のトラ
ンスジェニック遺伝子を作成する。この方法による生殖系列細胞への導入遺伝子
の導入は可能であるが、おそらく低頻度で起こる（Ｊａｈｎｅｒｔら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９８：６２３−６２８，１９８２）。しかし、一旦導入遺伝子がこの方
法により生殖系列細胞へ導入されると、子孫は、トランスジェニック遺伝子が全
ての動物の細胞（すなわち、体細胞および生殖系列細胞の両方）に存在する、動
物において産生され得る。
【０２０１】 胚幹（ＥＳ）細胞はまた、動物への、本発明の導入遺伝子の導入についての標
的細胞として機能し得る。ＥＳ細胞は、インビトロで培養される移植前の胚から
得られる（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６，１９８１；
Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８，１９８４；Ｇｏｓ
ｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９０
６５−９０６９，１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４
４５−４４８，１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃ
ｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓａｏｎ，Ｅ．Ｊ．編，ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７，７１−１１２頁）。市販のＥＳ細胞
（例えば、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
製）は、確立された方法により１つ以上の導入遺伝子で形質転換され得る（Ｌｏ
ｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，Ｒ．Ｈ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓａｏｎ，Ｅ．Ｊ．編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ，１９８７，１５３−１８２頁）。形質転換されたＥＳ細胞は、ＥＳ細
胞が、胚を転移増殖し、そして得られた動物（キメラ（２以上の動物に由来する
細胞からなる）である）の生殖系列に対して寄与した後、動物の未分化胚芽細胞
と組み合わされ得る（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−
１４７４，１９８８；Ｂｒａｄｌｅｙ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａ
ｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓａｏｎ，Ｅ．Ｊ．編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ １９８７，１１３−１５１頁）。同様に、この方法により、一旦
導入遺伝子が生殖系列細胞中へ導入されると、子孫は、トランスジェニック遺伝
子が全ての動物細胞（すなわち、体細胞および生殖系列細胞の両方）に存在する
動物において産生され得る。
【０２０２】 これは生じるが、始めの導入遺伝子の導入は、非メンデル事象である。しかし
、本発明の導入遺伝子は、生殖細胞系細胞中へ安定に取り込まれ得、そしてメン
デル遺伝子座としてトランスジェニック動物の子孫に伝達され得る。モザイク導
入遺伝子において、いくつかの細胞は、導入遺伝子を保有し、そしてタンパク質
の細胞はそうではない。生殖細胞系細胞が導入遺伝子を保有しないモザイクトラ
ンスジェニック動物において、子孫への導入遺伝子の伝達は、起こらない。それ
にも関わらず、モザイクドランスジェニック動物は、導入遺伝子と関連する表現
型を示し得る。
【０２０３】 本発明の導入遺伝子を遺伝した子孫は、本発明の導入遺伝子の配列に一致する
かまたはこれによりコードされる固有の配列を含む生体分子の存在に関する子孫
由来の遺伝形質の分析により、導入遺伝子を遺伝しない同腹仔から区別される。
例えば、本発明の導入遺伝子により固有にコードされるポリペプチドを含む生物
学的流体は、そのポリペプチドの存在について免疫アッセイされ得る。トランス
ジェニック子孫を同定する、より単純かつ信頼のおける手段は、動物の端（例え
ば、尾）から組織サンプルを得る工程、および本発明の導入遺伝子の固有の部分
のＤＮＡ配列に対応する核酸配列の存在についてそのサンプルを分析する工程を
包含する。そのような核酸配列の存在は、例えば、導入遺伝子の固有の部分に対
応するＤＮＡ配列を用いるハイブリイダイゼーション（「サザン（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ）」）分析、導入遺伝子のＤＮＡ配列由来の基質およびオリゴヌクレオチド
としてのサンプル中のＤＮＡ配列を使用するＰＣＲ反応の産物の分析などにより
決定され得る。
【０２０４】 本発明のクローン動物、トランスジェニックおよび他もまた、調製され得る（
哺乳動物クローン化技術の概説については、Ｗｏｌｆら、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｐ
ｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２３５−２３９，１９９８を参照のこと）。こ
のようなクローン動物としては、限定なしで、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）種（例えば
、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ））（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４
−６６，１９９６；Ｗｅｌｌｓら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：３８５−３
９３，１９９７）、げっ歯類（例えば、マウス）（Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３９４：３６９−３７４、１９９８）および非ヒト霊長類（例えば、ア
カゲザル）（Ｍｅｎｇら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｏｄ．５７：４５４−４５９，
１９９７）が挙げられる。
【０２０５】 本発明のトランスジェニック動物およびクローン動物は、ヒト疾患状態の動物
モデルとして、およびそのような疾患状態のための潜在的な治療を評価するため
に使用され得る。例えば、そのような方法において、疾患状態（または１つ以上
のそれらの症候的成分）を有する第１トランスジェニック動物は、既知の用量の
候補治療組成物を与えられるか、または候補治療処置に曝され、そして第２の（
コントロール）トランスジェニック動物は、プラセボを与えられるか、または候
補治療処置に曝されない。疾患状態に関連する症状および／または臨床的終点は
、適切な時間の間隔にわたって両方の動物において測定され、そして結果が比較
される。治療的（所望される）組成物および治療は、コントロール動物と比較し
て処置された動物において、そのような症状の発症を改善（ａｍｅｒｉｏｌａｔ
ｅ）するか、その発症を遅らせるかまたは症状を取り除く組成物および治療、な
らびに終点として認識される。同様の様式で、疾患状態を悪化するかまたは拍車
をかける所望でない組成物および処置は、そのような症状の度合いおよび終点を
増強し、そして／またはそれらの発症を早める組成物および処置として認識され
る。それらの高度な遺伝的同一性から、クローントランスジェニック動物は、そ
のような方法において好ましい。
【０２０６】 （本発明の実施形態） （Ａ．細胞において少なくとも１つのミトコンドリア機能を増加させるための
方法） 特定の実施形態において、本発明は、特にエキソビボまたはインビボでの、細
胞における少なくとも１つのミトコンドリア機能を増加するための方法を提供す
る。本発明の方法は、任意の特定の細胞型、疾患または障害に限定されない。好
ましくは、本発明は、糖尿病または前糖尿病の細胞または被験体（Ｉ型糖尿病ま
たはＩＩ型糖尿病）、特にインスリン生成細胞またはグルコース応答性細胞にお
ける少なくとも１つのミトコンドリア機能を増加する。少なくとも１つのミトコ
ンドリア機能におけるこのような増加は、好ましくは、ＩＦ１の転写、翻訳また
は活性を調節することによって達成され得る。
【０２０７】 従って、本発明は、それが必要な被験体中の細胞における少なくとも１つのミ
トコンドリア機能を改善する工程を含む、糖尿病を処置するための方法を提供す
る。この方法は、適切な刺激、化合物または組成物（低分子、ポリペプチド、核
酸分子を含む）、遺伝子治療構築物または有機分子、本発明の方法またはその組
み合わせを使用して同定された化合物または組成物を提供することを含む、任意
の種々の方法で達成され得る。
【０２０８】 細胞中の少なくとも１つのミトコンドリア機能を増加または改善することは、
任意の方法で達成され得る。好ましくは、改善されるミトコンドリア機能は、細
胞内のＡＴＰ生成が増加するように、機能的な（すなわち、分離していない）ミ
トコンドリア中に存在する。しかし、ミトコンドリアは、特定の実施形態に従っ
て、例えば、ＵＣＰのような分離因子によって、ある程度分離され得る（Ｗｕら
、Ｃｅｌｌ ９８：１１５−１２４（１９９９））。あるいは、細胞内のＡＴＰ
生成が増加するように、ミトコンドリア機能が増加する。理論に制限されるのを
待つのではなく、インシュリン産生細胞におけるミトコンドリア機能中の増加に
関連したＡＴＰ生成の増加は、インシュリン産生および／またはインシュリン分
泌の増加を生じる。あるいは、ＡＴＰ生成の増加は、インシュリンに対するイン
シュリン細胞の感受性を増加し得る。
【０２０９】 この細胞は、被験体内の任意の細胞、好ましくは、インシュリン産生細胞また
はインシュリン感受性細胞であり得る。好ましいインシュリン産生細胞は、膵臓
細胞（例えば、ランゲルハンス島内の細胞、好ましくは、β細胞）である。好ま
しいインシュリン感受性細胞は、グルコース代謝、ホメオスタシスおよび／また
は貯蔵に関与する細胞（例えば、肝臓細胞および／または筋肉細胞）である。肝
臓細胞におけるミトコンドリア機能の増加に対する１つのさらなる利点は、これ
らの細胞が、抗ウイルス化合物およびアンチセンス化合物などの治療法を含む解
毒機能（例えば、毒性を減少することまたは化合物の溶解性を増加すること）を
行ない得るように、肝臓の活性が増加することである。さらに、肝臓疾患または
障害（例えば、肝炎、肝硬変、毒性化合物の取り込み）を有する被験体は、本発
明の方法を使用して、それらの肝臓機能を増加し得る。
【０２１０】 本発明の特定の実施形態において、被験体および／または細胞は、ＩＦ１遺伝
子またはポリペプチドの少なくとも１つの活性を増強する少なくとも１つの薬剤
で処理され得る。ＩＦ１遺伝子の活性を増加する薬剤は、このような遺伝子の転
写を直接または間接的に増加し得、転写後修飾またはｍＲＮＡ半減期を調節し得
る遺伝子である。このような化合物の例としては、非放射性および熱量の取り込
みが挙げられる。あるいは、この細胞または被験体は、内因性または外因性ＩＦ
１遺伝子の転写を増加するように誘導され得る核酸分子を含み得る。例えば、こ
のような構築物は、ＩＦ１転写が調節されるかまたは調節されない様式で増加し
得るように、誘導性または構成的なプロモーターに作動可能に連結されたＩＦ１
遺伝子を誘導し得る。
【０２１１】 ＩＦ１は、任意のＩＦ１（例えば、野生型または変異ラット、マウスもしくは
ヒトＩＦ１）であり得る。ＩＦ１は、少なくとも１つのＩＦ１活性を有し、好ま
しくは、ＡＴＰ生成に対して阻害的な効果を与えることなく、ＡＴＰシンターゼ
のサブユニットに結合する。このことは、ＡＴＰ合成の増加を導き得る。ＡＴＰ
シンターゼに結合し、その触媒活性を阻害する野生型ＩＦ１はまた、例えば、こ
れらの機能的活性と干渉する薬剤についてのスクリーニングアッセイにおいて、
本発明に従って有用である。種々の生物学的供給源由来の種々のＩＦ１核酸配列
およびアミノ酸配列が、配列番号１２〜１６に提供される。これらの配列または
その一部、またはＩＦ１の少なくとも１つの活性を含む本明細書中に記載の関連
配列は、本発明において使用され得る。
【０２１２】 （Ｂ．ミトコンドリア機能を増加する試験化合物についてのスクリーニングの
ための方法） 本明細書中に提供されるように、特定の実施形態に従って、本発明は、特にエ
キソビボまたはインビボでのミトコンドリア機能を増加する化合物についてスク
リーニングするための方法を提供する。本発明は、特定の機構細胞型、疾患状態
または障害に制限されない。好ましくは、ミトコンドリア機能は、前糖尿病また
は天然に糖尿病である細胞、特に、インシュリン産生細胞（グルコース応答性細
胞を含む（Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病））である細胞中で増加する。ミトコ
ンドリア機能におけるこのような増加は、ＩＦ１の転写、翻訳または活性を調節
することによって達成され得る。
【０２１３】 本発明の１つの実施形態は、ＩＦ１タンパク質をコードする核酸の発現に影響
する試験化合物を同定するためのスクリーニングの方法であり、この方法は、Ｉ
Ｆ１タンパク質をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの細胞を、１つ以上
の試験化合物と接触させる工程；およびＩＦ１タンパク質の発現を測定する工程
を包含する。
【０２１４】 本発明の方法において使用される細胞は、任意の細胞であり得、好ましくは、
インシュリン産生細胞またはインシュリン感受性細胞、好ましくは、培養細胞（
例えば、連続的な細胞株）が挙げられる。さらに、懸濁細胞または生物体の組織
または器官または体液由来の細胞（例えば、ツッカー糖尿病脂肪性ラット（ＺＤ
Ｆ））、好ましくは、β細胞のような膵臓細胞が使用され得る。インシュリン産
生細胞としては、ラット細胞株ＩＮＳ１が好ましい。他の好ましい細胞としては
、ＳＹ５Ｙ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｇ７／Ｖ７９細胞、ｒｈｏ0３Ｔ３−Ｌ１
、およびｒｈｏ0ＩＮＳ−１、ならびに２９３細胞が挙げられる。インシュリン
感受性細胞としては、筋肉細胞または肝臓細胞（例えば、ＨＥＰＧ２細胞）が、
当該分野で公知のように好ましい。
【０２１５】 ＩＦ１をコードする核酸分子は、細胞のゲノムに対して内因性であり得るか、
または、相同組換えもしくはランダムな組み込みによってゲノム中に操作され得
る（Ｗｈｉｔｎｅｙら、ＷＯ９８／１３３５３、１９９８年４月２日公開、Ｓｍ
ｉｔｈら、ＷＯ９４／２４３０１、１９９４年１０月２７日公開）。内因性であ
る場合、ＩＦ１の発現は、このような発現を増強することが既知または予想され
る刺激または化合物を使用して増強され得る。ランダムに組み込まれる場合、こ
のような核酸分子は、誘導物質またはリプレッサー（例えば、２ＸＴｅｔＯ2）
の存在下で調節され得る内因性制子エレメントまたは外因性制御エレメントに作
動可能に連結され得る。ＩＦ１遺伝子の発現がレポーター遺伝子またはタグの発
現を測定することによってモニターされ得るように、必要に応じて、ＩＦ１遺伝
子は、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ラクタマーゼまた
はルシフェラーゼ）またはタグ（例えば、ＦＬＡＧ）に作動可能に連結され得る
。
【０２１６】 外因性ＩＦ１遺伝子の場合、遺伝子は、染色体外に存在する構築物（例えば、
プラスミド）を形成する制御エレメントに作動可能に連結され得る。ＩＦ１遺伝
子の発現は、調節エレメントのリプレッサーまたは誘導物質によって調節され得
る。ＩＦ１遺伝子の発現が、インビトロ、エキソビボまたはインビボで、レポー
ター遺伝子またはタグの発現を測定することによってモニターされ得るように、
必要に応じて、ＩＦ１遺伝子は、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク
質、β−ラクタマーゼまたはルシフェラーゼ）またはタグ（例えば、ＦＬＡＧ）
に作動可能に連結され得る。ＩＦ１遺伝子および目的の第２の遺伝子は、同一細
胞で共に提供される場合、必要に応じて、同一または異なった染色体外エレメン
ト上に存在し得る。このような一般的な技術は、当該分野で公知である（米国特
許第５，２９８，４２９号、Ｅｖａｎｓ、１９９４年３月２９日発行）。
【０２１７】 上記議論されるように、ＩＦ１の発現は、レポーター遺伝子またはタグ（例え
ば、免疫学的タグ）を含む、種々の方法（インビトロ、エキソビボ、またはイン
ビトロ）を使用して測定され得る。さらに、他の検出方法（例えば、ノーザンブ
ロットまたはサザンブロット）が使用され得る。さらに、核酸増幅方法（例えば
、ＰＣＲ（例えば、定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ））が使用され得る。また
、インサイチュハイブリダイゼーション方法または免疫組織学的反応または他の
レセプターリガンド反応が使用され得る。
【０２１８】 あるいは、ＩＦ１の活性は、直接測定され得る（例えば、少なくとも１つのＡ
ＴＰシンターゼサブユニットまたはＩＦ１特異的抗体へのＩＦ１の結合）かまた
は当該分野で公知の他の方法によって測定され得る。ＩＦ１活性を変更するかま
たは調節する化合物はまた、ミトコンドリア生合成、ＡＴＰ合成、インシュリン
生成またはインシュリン分泌、その他に推定的に影響し得る。
【０２１９】 本発明の細胞は、１つ以上の試験化合物に接触され得る。細胞中のＩＦ１の発
現はモニターされ得、そして、このような発現を増加する試験化合物が同定され
得る。あるいは、ＡＴＰの生成を増加する試験化合物、ＡＴＰの加水分解を減少
する試験化合物、インシュリンの合成または分泌を増加するかまたは細胞のイン
シュリン感受性を増加する試験化合物がまた、当該分野で公知の方法を使用して
モニターされ得る。このような活性を有する試験化合物は、本明細書中に記載の
他の活性について同定およびスクリーニングされ得る。
【０２２０】 （一般的な材料および方法） （１．発現構築物および細胞） 本発明の核酸分子は、発現構築物の一部として提供され得る。発現構築物は、
適切な発現系における核酸分子の発現に適切な発現制御配列（例えば、プロモー
ター）を含む核酸分子である。好ましくは、本発明の核酸分子は、特定の発現系
（例えば、インビトロ発現系または宿主細胞（例えば、細菌細胞または真核生物
細胞））に適切な発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され
る。
【０２２１】 「作動可能に連結される」は、そのように記載された成分がそれらがそれらの
意図される様式で機能することを可能にする関係である並置をいう。コード配列
に対して作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合
性である条件下で達成されるような様式で連結される。
【０２２２】 「制御配列」は、それらが連結されるコード配列および非コード配列の発現を
達成するポリヌクレオチド配列をいう。このような制御配列の性質は、宿主生物
体に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列は一般的には、
プロモーター、リボソーマル結合部位、および転写終結配列を含む；真核生物に
おいては、一般的には、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配
列を含む。用語制御配列は、その存在が発現に影響を与え得る成分を含み得るよ
うに、そしてまた、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、リーダー配列
および融合パートナー配列）を含み得ることが意図される。
【０２２３】 核酸分子は、当業者に公知の方法を使用して、発現構築物（例えば、プラスミ
ドまたはウイルスベクター）中へ操作され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１
９８９）。核酸分子によってコードされるネイティブなポリペプチドと比較して
適切なアミノ酸配列のポリペプチドが、その発現の際に産生されるように、この
核酸分子は、好ましくは、発現構築物中で、インフレームで、そして適切な方向
で挿入される。このようなインフレームの挿入は、核酸分子のヌクレオチド配列
から推定され得、そして、種々の方法（推定アミノ酸配列およびその折り畳みの
コンピューター分析を含む）を使用してか、または同定されたかまたは孤児のタ
ンパク質（例えば、同定されていないタンパク質または同定された機能を有して
いないタンパク質の一部）に特異的に結合する抗体を用いて結合することによっ
て、確認され得る。
【０２２４】 本発明の核酸分子は、好ましくは、発現構築物中にあり、当該分野で公知の方
法（例えば、エレクトロポレーションまたは非放射性のカルシウム溶液）を使用
して、宿主細胞（例えば、原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌）または真核
生物細胞（ＨｅＬａ細胞など））中に挿入され得る。本発明の核酸分子によって
コードされるネイティブなアミノ酸配列が、発現構築物によって発現されるよう
に、発現制御エレメント（例えば、プロモーター）が、インフレームおよび適切
な方向で、本発明の核酸分子に作動可能に連結されるように、この発現構築物は
、好ましくは構築される。本発明の核酸分子が、選択された宿主細胞中で効率的
に発現されるように、発現構築物は選択される。ＲＮＡ転写産物および少なくと
も１つのポリペプチドを含む、本発明の発現された核酸の産物は、当該分野で公
知の方法を使用して、収集および同定され得る。「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ
を鋳型として使用しＲＮＡポリメラーゼによって合成された（「転写された」）
ＲＮＡ分子である。
【０２２５】 （２．遺伝子治療構築物） 本発明の別の局面は、本発明の少なくとも１つの核酸に作動可能に連結された
プロモーターを含む発現ベクターを含む遺伝子治療構築物である。好ましくは、
本発明の核酸は、ａ）配列番号１〜配列番号１２の少なくとも１つおよびその逆
の相補体、本発明の方法によって調製されたｃＤＮＡ分子およびその逆の相補体
を含む実質的に純粋な核酸分子から選択される。
【０２２６】 遺伝子治療構築物は、好ましくは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パピローマウイルスまたは遺伝子治
療系または細胞の遺伝子操作において使用される他の型のウイルス）である。好
ましい遺伝子治療構築物は、インシュリン産生細胞またはインシュリン感受性細
胞を標的し得る構築物を含む。コクサッキーウイルス、特にコクサッキーウイル
スＢおよびコクサッキーウイルスＢ４、エコーウイルス（例えば、エコー１１）
、特定のアデノウイルスベクターおよび特定のレトロウイルス（例えば、Ｃ型レ
トロウイルス）が、膵臓細胞（例えば、β細胞）を標的化し得る（Ｒａｍｓｉｎ
ｇｈら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １９：７９３−８００（１９９７），Ｈｙｏｔｙ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：７７−８４（１９９８），Ｊｅｎ
ｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ，２（８１９０）：３５４−３５８（１９８０），Ｌｕ
ｐｐｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ １３：
１４−２４（１９９９），Ｔｓｕｍｕｒａら、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．３２：８６−
９４（１９９８），Ｆｒｉｓｋら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３３：２２９−２４０
（１９９４），Ｇｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：１７３
０−１７３６（１９９９）。さらに、リポソームおよび脂質調製物がまたベクタ
ーとして使用され得る。これらのベクターの種々の型が、当該分野で公知である
（例えば：米国特許第５，３９９，３４６号、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５年
３月２１日発行；Ｂａｎｄａｒａら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１１：２２７−２３１（１９９２）；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｓ ６：６１６−６２９（１９８９）；米国特許第５，２４０，８４６号、
Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９３年８月３１日発行；ＣｕｌｖｅｒおよびＢｌａｅｓ
ｅ、ＴＩＧ ５：１７１−１７８（１９９４）；Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ３：８１１−８１８（１９９６）；Ｈａｍａｄａら、Ｇｙｎｅ
ｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６３：２１９−２２７（１９９６）；Ｈｏ
ｌｏｍｂｅｒｇら、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１：３９３−４０６（１９
９０）；Ｈｕｒｏｆｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｎｅｔｉｃｓ １０：４３０−
４３５（１９９５）；Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．５：２３７
７−２３８５（１９８６）；Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５５：２８３１−２８３６（１９９５）；Ｋｒｕｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：４４−４８（１９９６）；米国特許第５
，５３２，２２０号、Ｌｅｅら、１９９６年７月２日発行；Ｌｉｕら、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１６７−１７３（１９９７）；Ｍａ
ｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３８６：４１０−（１９９７）；Ｎａｂｅ
ｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３０７−１
１３１１（１９９３）；Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４、９月：１２８５
−１２８８（１９９０）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８
（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９
９２）；米国特許第５，５８０，８５９号、Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９７年１２
月３０日発行；ＷＯ９８／１３３５３、Ｗｈｉｔｎｅｙら、１９９８年４月２日
公開；米国特許第５，２９８，４２９号、Ｅｖａｎｓら、１９９４年３月２９日
発行；米国特許第５，５１４，５６１号、Ｑｕａｎｔｅら、１９９６年５月７日
発行；ＷＯ９６／２４３０１、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎ
ｂｕｒｇｈ、１９９４年１０月２７日公開；ＷＯ９６／３０５４０、Ｔｈｅ Ｒ
ｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ、１９９６年１０月３日公開；ＬａｒｒｉｃｋおよびＢｕｒｃｋ，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；ならびにＰｉ
ｎｋｅｒｔ，Ｔａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４）を参照のこと）。
【０２２７】 適切なウイルスベクターは、投与の経路および標的細胞型または集団に基づい
て選択され得る。例えば、標的細胞型または集団が活動的に増殖する場合、レト
ロウイルスが好ましく、そして、標的細胞型または集団が活動的に増殖しない場
合、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスなどの他のウイルス
が好ましい（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照のこと）。異なったウイルスは
、異なった細胞型および集団について、異なった特異性を有する。従って、細胞
の集団の標的細胞型に感染するウイルスが選択され得る。このウイルスベクター
は、投与の適切な経路およびレジメンについて適切な用量で、適切な薬学的に受
容可能なキャリア（例えば、賦形剤）中で薬学的組成物として、提供され得る。
【０２２８】 遺伝子治療構築物はまた、遺伝子治療処置系において有用なプラスミドのよう
な裸のＤＮＡ構築物であり得る（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号、Ｆ
ｅｌｇｎｅｒら、１９９６年１２月３日発行；米国特許第５，７０３，０５５号
、Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９７年１２月３０日発行；米国特許第５，８４６，９
４６号、Ｈｕｅｂｎｅｒら、１９９８年１２月８日発行；ならびに米国特許第５
，９１０，４８８号、Ｎａｂｅｌら、１９９９年６月８日発行を参照のこと）。
特定のベクターは、意図した特定の標的組織、細胞型または細胞集団を用いて作
製され得る。例えば、特定の調節エレメント（例えば、制御エレメントおよびプ
ロモーター）が、調節エレメントが標的細胞中で作動可能であるように、標的細
胞に基づいて選択され得る。このベクターは、好ましくは、病理学的部位（例え
ば、脳）への直接の注入を介して被験体に導入されるが、他の送達方法（例えば
、病理学的部位（例えば、筋肉）から遠位の全身投与または組織内投与または器
官投与）もまた使用され得る。これらのベクター型は、投与の適切な経路および
レジメンのための適切な用量で、適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
賦形剤）中で薬学的組成物として提供され得る。
【０２２９】 （３．スクリーニング方法） 本発明はまた、本発明のポリペプチドの少なくとも１つの機能の活性を調節し
得る生物学的に活性な薬剤を同定するための種々の方法を含む。この機能は、イ
ンビトロ（細胞全体の外側）、エキソビボ（細胞内または細胞上であるが、生物
体全体または培養細胞由来のサンプルのような生物体全体中ではない）またはイ
ンビボ（生物体全体内）であり得る。本発明はまた、これらの方法によって同定
された生物学的に活性な薬剤を含む。生物体とは、被験体（例えば、試験動物ま
たはトランスジェニック動物のような非ヒト動物）またはヒトをいう。
【０２３０】 用語「調節」は、生物学的活性またはプロセス（例えば、酵素活性またはレセ
プターの結合）の機能的な特性を増強するかまたは阻害するかのいずれかである
能力をいう。このような増強または阻害は、特異的な事象（例えば、シグナル伝
達経路の活性化）の出現に対して付随的であり得、そして／または特定の細胞型
においてのみ顕著であり得る。
【０２３１】 用語「調節因子」は、生物学的なマクロ分子（例えば、核酸、タンパク質、非
ペプチド、または有機分子）のような、化学薬品（天然に存在しているかまたは
天然には存在していない）、あるいは、生物学的な物質（例えば、原核生物、細
菌、真核生物、植物、真菌、多細胞の生物体、または動物、無脊椎動物、脊椎動
物、哺乳動物、およびヒト）から作成された抽出物をいう。これらは、適切であ
る場合には、生物体全体またはその一部、細胞、器官、組織、体液、全培養物も
しくは培養物の一部、または環境的なサンプルもしくはその一部の抽出物を含む
。調節因子は、代表的には、生物学的なプロセス（単数または複数）の（直接ま
たは間接的に）インヒビターまたは活性化因子（例えば、アゴニスト、部分的な
アンタゴニスト、部分的なアゴニスト、アンタゴニスト、抗新生物剤、細胞傷害
剤、新生物の形質転換体または細胞増殖の抗新生物性細胞毒性のインヒビター、
細胞増殖促進因子、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗細菌剤、抗生物質など）としての
潜在的な活性について、本明細書中に記載されているアッセイに含まれることに
よって評価される。調節因子の活性は、公知であり得るか、未知であり得るか、
または部分的に公知であり得る。
【０２３２】 用語「試験化合物」または「試験化学薬品」は、推定の調節因子であることが
本発明の少なくとも１つの方法によって試験される、化学薬品、化合物、組成物
、または抽出物をいう。本発明によって同定された試験化合物または試験化学薬
品は、「生物学的に活性な薬剤」である。試験化合物は、低分子（例えば、薬物
、タンパク質、もしくはペプチド、またはそれらの活性なフラグメント、例えば
、抗体、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの組合せ）、アン
チセンス分子、リボザイム、または他の有機もしくは無機分子（例えば、脂質、
炭水化物、もしくはそれらの任意の組合せ））を含み得る。核酸分子を含む試験
化合物は、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルス、また
はアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクター）、リポソーム、プラ
スミド中で提供され得るか、またはリポフェクション試薬と供に提供され得る。
一旦同定された試験化合物は、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的なアゴニス
ト、または標的の逆のアゴニストであり得る。試験化合物は、通常は、目的の標
的に結合することが公知ではない。「コントロール試験化合物」は、標的に結合
することが公知の化合物をいう（例えば、公知のアゴニスト、アンタゴニスト、
部分的なアゴニスト、または逆のアゴニスト）。試験化合物は、代表的には、ア
ッセイにおけるシグナルの特異性を決定するための標的の機能を変更するコント
ロール条件としては、混合物に添加される化合物を含まない。このようなコント
ロール化合物または条件として、以下の化学薬品が挙げられる：（１）タンパク
質構造を非特異的にまたは実質的に破壊する化学薬品（例えば、尿素またはグア
ンジウム、スルフヒドリル試薬（例えば、ジチオトリトールおよびβ−メルカプ
トエタノール）のような変性剤）、（２）一般的に細胞の代謝を阻害する化学薬
品（例えば、ミトコンドリアアンカップル）、ならびに（３）タンパク質の電気
的または疎水性相互作用を非特異的に破壊する化学薬品（例えば、疎水性相互作
用または電気的な相互作用を非特異的に破壊するために十分な濃度での高塩濃度
または界面活性剤）。用語試験化合物はまた、代表的には、被験体の毒性に起因
して特定の指標の治療的な使用のためには不適切であることが公知の化合物は含
まない。通常は、種々の予め決定された試験化合物の濃度が、それらの活性を決
定するために使用される。試験化学薬品の分子量が公知である場合は、以下の範
囲の濃度が使用され得る：約０．００１マイクロモルから約１０ミリモルの間、
好ましくは、約０．０１マイクロモルから約１ミリモルの間、より好ましくは、
約０．１マイクロモルから約１００ミリモルの間。抽出が試験化合物を使用する
場合は、使用される試験化学薬品の濃度は、容量の基準に対して重量で示され得
る。これらの環境下では、以下の濃度の範囲が使用され得る：約０．００１マイ
クログラム／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０１マイクログラム
／ｍｌから約１００マイクログラム／ｍｌの間、そしてより好ましくは、約０．
１マイクログラム／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの間。
【０２３３】 本発明のポリペプチドの少なくとも１つのインビトロまたはエキソビボ機能の
活性を調節する化合物は、ヒトを含む被験体におけるインビボでの機能の活性を
調節する際、推定的な治療活性を有する。本発明は、本発明の方法によって同定
された生物学的に活性な薬剤を含む。このような生物学的に活性な薬剤は、（例
えば、賦形剤と共に）医薬品として提供され得る。
【０２３４】 （４．インビトロ機能） 本発明の別の局面は、生物学的に活性な薬剤を同定するための方法を含み、こ
の方法は、以下の工程を包含する：本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含
むサンプルを提供する工程；少なくとも１つの試験化学薬品とサンプルを接触さ
せる工程；ポリペプチドの少なくとも１つのインビトロの機能を検出する工程；
およびポリペプチドの少なくとも１つのインビトロ機能を調節する（増強または
阻害するなど）少なくとも１つの試験化学薬品を同定する工程。好ましくは、こ
の方法は、ＷＯ９８／５２０４７、Ｓｔｙｌｌｉら、１９９８年１１月１９日公
開に記載されるように、ハイスループットフォーマットおよびデバイスで行なわ
れる。
【０２３５】 操作中、酵素基質に対する少なくとも１つのインビトロ機能の作用に対して、
少なくとも１つのインビトロ機能の読み出しを提供する化合物（例えば、少なく
とも１つの特性（例えば、比色特性、分光写真特性または蛍光特性）を変化させ
る酵素基質）を使用して検出可能である少なくとも１つのインビトロ機能を有す
る本発明のポリペプチドが提供される。このような酵素基質は、種々の活性（例
えば、プロテアーゼおよびキナーゼ）について、当該分野で公知である（例えば
、ＷＯ９７／２８２６１、Ｔｓｉｅｎら、１９９７年８月７日公開；ＷＯ９８／
０２５７１、Ｔｓｉｅｎら、１９９８年１月２２日公開；およびＴｈｅ Ｓｉｇ
ｍａＣａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）を参照のこと）。
【０２３６】 少なくとも１つのインビトロ機能を有する本発明のポリペプチドは、少なくと
も１つのインビトロ機能について読み出しを提供する化合物と接触される前また
は同時に、試験化学薬品と接触される。少なくとも１つのインビトロ機能が、そ
の活性の読み出しをモニタリングすることによってモニターされる。これらの研
究の結果は、少なくとも１つのインビトロ機能の活性を調節する試験化学薬品の
能力を決定するための適切な能力と比較され得る。適切なコントロール（例えば
、試験化合物の非存在下で、試験を行う）が、当該分野で公知である。このコン
トロールは、試験と同時に行なわれ得るが、試験から離れた時間および場所にお
いてもまた行なわれ得る。例えば、標準曲線または標準値が獲得され得、そして
比較の際に使用され得る特定の試験のために提供され得る。
【０２３７】 （５．エキソビボ機能） 本発明の別の局面は、生物学的に活性な薬剤を同定するための方法を含み、こ
の方法は、以下の工程を包含する：本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含
む少なくとも１つの細胞を含むサンプルを提供する工程；少なくとも１つの試験
化学薬品とサンプルを接触させる工程；ポリペプチドの少なくとも１つのエキソ
ビボ機能を検出する工程；およびポリペプチドの少なくとも１つのエキソビボ機
能を調節する（増強または阻害するような）少なくとも１つの試験化学薬品を同
定する工程。本発明のポリペプチドは、好ましくは、細胞内であるかまたは細胞
に関連し、そして、試験化学薬品は、この細胞と接触される。好ましくは、この
方法は、ＷＯ９８／５２０４７、Ｓｔｙｌｌｉら、１９９８年１１月１９日公開
に記載されるように、ハイスループットフォーマットおよびデバイスで行なわれ
る。少なくとも１つの細胞が、被験体（例えば、試験動物、トランスジェニック
動物、またはヒト）由来のサンプルに由来し得るか、または、培養細胞であり得
る。
【０２３８】 実施の際に、酵素基質における少なくとも１つのエキソビボ機能の作用に対し
て、少なくとも１つのインビボ機能の読出しを提供する化合物（例えば、少なく
とも１つの特性（例えば、色調（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）特性、分光特性また
は蛍光特性のような）を変化する酵素基質）を使用して検出可能な、少なくとも
１つのエキソビボ機能を有する本発明のポリペプチドが、提供される。このよう
な酵素基質は、例えば、プロテアーゼ、キナーゼ（例えば、１９９７年８月７日
に刊行されたＴｓｉｅｎらに対するＷＯ９７／２８２６１；１９９８年１月２２
日に刊行されたＴｓｉｅｎらに対するＷＯ９８／０２５７１；およびＴｈｅ Ｓ
ｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）を参照のこと）のように種々の活性に
ついて当該分野において公知である。
【０２３９】 少なくとも１つのエキソビボ機能を有する、少なくとも１つの本発明のポリペ
プチドを含む細胞は、少なくとも１つのエキソビボ機能についての読出しを提供
する化合物と接触される前かまたは同時に試験化学物質と接触される。この少な
くとも１つのエキソビボ機能は、その活性の読出しをモニタリングすることによ
ってモニターされる。これらの研究の結果は、少なくとも１つのエキソビボ機能
の活性を調節するための試験化学物質の能力を決定するために適切なコントロー
ルと比較され得る。適切なコントロールは、試験化学物質の非存在下において試
験を実施するように当該分野において公知である。コントロールは、試験と同時
に実施され得るが、また、試験とは別の時間および場所で実施され得る。例えば
、標準曲線または標準値は、比較において使用され得る特定の試験について獲得
および提供され得る。
【０２４０】 （６．インビボ機能） 本発明の別の局面は、生物学的活性薬剤を同定するための方法を含み、この方
法は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む、少なくとも１つの被験体
を提供する工程；少なくとも１つの被験体を試験化学物質と接触する工程；ポリ
ペプチドの少なくとも１つのインビボ機能を検出する工程；およびポリペプチド
の少なくとも１つのインビボ機能を調節（例えば、増強または阻害）する少なく
とも１つの試験化学物質を同定する工程、を包含する。
【０２４１】 実施の際に、この酵素基質における少なくとも１つのエキソビボ機能の作用に
対して、少なくとも１つのインビボ機能の読出しを提供する化合物（例えば、少
なくとも１つの特性（例えば、色調（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）特性、分光特性
または蛍光特性のような）を変化する酵素基質）を使用して検出可能な、少なく
とも１つのエキソビボ機能を有する本発明のポリペプチドが、提供される。この
ような酵素基質は、例えば、プロテアーゼ、キナーゼ（例えば、１９９７年８月
７日に刊行されたＴｓｉｅｎらに対するＷＯ９７／２８２６１；１９９８年１月
２２日に刊行されたＴｓｉｅｎらに対するＷＯ９８／０２５７１；およびＴｈｅ
Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）を参照のこと）のように種々の活
性について当該分野において公知である。
【０２４２】 少なくとも１つのインビボ機能を有する、少なくとも１つの本発明のポリペプ
チドを含む被験体は、少なくとも１つのインビボ機能についての読出しを提供す
る化合物と接触される前かまたは同時に試験化学物質と接触される。この少なく
とも１つのインビボ機能は、その活性の読出しをモニタリングすることによって
モニターされる。これらの研究の結果は、少なくとも１つのインビボ機能の活性
を調節するための試験化学物質の能力を決定するために適切なコントロールと比
較され得る。適切なコントロールは、試験化学物質の非存在下において試験を実
施するように当該分野において公知である。コントロールは、試験と同時に実施
され得るが、また、試験とは別の時間および場所で実施され得る。例えば、標準
曲線または標準値は、比較において使用され得る特定の試験について獲得および
提供され得る。
【０２４３】 糖尿病の場合、好ましい動物モデルは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスである
。糖尿病薬物送達におけるこの動物モデルの首尾よい使用は、以下の文献に報告
される：（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１０：２５７−２６０（１９
９７），Ａｋａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１１５９−１１６４（
１９９７），ＳｕｒｉおよびＫａｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：５５
−６５（１９９９），Ｐａｋら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：１９−２４
（１９９５），ＴｏｙｏｄａおよびＦｏｒｍｂｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２０：
７５０−７５７（１９９８），Ｃｏｈｅｎ，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：
２８６−２９１（１９９７），ＢａｘｔｅｒおよびＣｏｏｋｅ，Ｄｉａｂｅｔｅ
ｓ Ｍｅｔａｌ．Ｒｅｖ．１１：３１５−３３５（１９９５），ＭｃＤｕｆｆｉ
ｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：７０４−７０９（１９９８）
，Ｓｈｉｅｈら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：１２３−１３５（１９９３
），Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：１１３−１２２（
１９９３））。ＮＯＤマウスを使用してか、または別の適切な動物モデルにおい
て本明細書中に提供されるような本発明の特定の実施形態に従って、候補薬剤（
例えば、本明細書中に記載されるインビトロスクリーニングアッセイの１以上を
使用して同定される薬剤）の、試験動物における血中グルコースを調節（および
好ましくは低減）する能力を試験することが意図される。
【０２４４】 （７．試験化合物の薬理学および毒性） 試験化合物の構造は、当該分野において公知の方法（例えば、質量分析装置）
によって決定または確認され得る。種々の条件下で拡張された期間にわたって貯
蔵された試験化合物について、その構造、活性および能力が確認され得る。
【０２４５】 同定された試験化合物は、認識された方法および本明細書中に開示された方法
を使用して、特定の活性について評価され得る。例えば、同定された試験化合物
がインビトロで抗癌細胞活性を有することが見出される場合、次いで、この試験
化合物は、癌を処置する化学療法剤として推定の薬理学的特性を有する。このよ
うな関係は、いくつかの疾患状態に関して当該分野において公知であり、そして
多くが発見されることが長い間期待される。このような関係に基づいて、薬理学
活性、および毒性を適切に確認するインビトロモデルおよびインビボモデルは、
選択かつ実施され得る。本明細書中に記載される方法はまた、薬理学的選択性お
よび特異性、ならびに毒性を評価するために使用され得る。
【０２４６】 同定された試験化合物は、以下の公知の方法を使用して毒性学的効果について
評価され得る（Ｌｕ，Ｂａｓｉｃ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ
ａｌｓ，Ｔａｒｇｅｔ Ｏｒｇａｎｓ，ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎ
ｔ，Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ（１９８５）；Ｃｕｌｂｒｅｔｈに対する米国特許第５，１９６，３１
３号（１９９３年３月２３日に刊行）およびＢｅｎｅｔに対する同５，５６７，
９５２号（１９９６年１０月２２日に刊行）を参照のこと）。例えば、試験化合
物の毒性学は、細胞株（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞株）に対するイ
ンビトロ毒性を決定することによって達成され得る。試験化合物は、増加または
減少した試験化合物の毒性学的特性を決定するために、生物体全体によって代謝
された後に、例えば、組織抽出物（例えば、肝臓の調製物（例えば、ミクロソー
ム調製物））で処理され得る。これらの型の研究の結果によって、動物（例えば
、ヒトを含む哺乳動物）における化学物質の毒性学的特性を予期し得る。
【０２４７】 あるいは、またはこれらのインビトロの研究に加えて、動物モデル（例えば、
マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはサル）における試験化合物の毒性学的特性
は、確立された方法を使用して決定され得る（Ｌｕ、前出（１９８５）；および
Ｃｒｅａｓｅｙ、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｔ
ｈｅ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７９）を参
照のこと）。試験化合物の毒性、標的器官、組織、位置および仮定の機構に依存
して、適切な用量、ＬＤ50値、投与経路、および試験化合物の毒性学的特性を決
定するために適切なレジメンを決定するために、当業者は、悩まされない。動物
モデルに加えて、ヒト臨床試験は、確立された手順（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ
ｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（Ｕ
ＳＦＤＡ）または他の政府の等価物によって記載される手順）に従って実施され
得る。これらの毒性研究は、インビボでの試験化合物の効力を決定するための基
礎を提供する。
【０２４８】 （８．試験化合物の効力） 試験化合物の効力は、インビトロ法、動物モデルまたはヒト臨床試験（Ｃｒｅ
ａｓｅｙ、前出（１９７９）を参照のこと）のような当該分野において認識され
たいくつかの方法を使用して確立され得る。認識されたインビトロモデルは、い
くつかの疾患または状態について存在する。例えば、インビトロでのＨＩＶ感染
細胞の生存期間を延長する試験化合物の能力は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを処
置するに効果的であることが期待される化合物を同定するために受容可能なモデ
ルとして認識される（Ｄａｌｕｇｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１：１０８２−１０９３（１９９５）を参照のこと）。さ
らに、インビトロでＴ細胞の増殖を阻止するシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の能力
は、免疫抑制剤として効果的であることが期待される化学物質を同定するために
受容可能なモデルとして確立された（Ｓｕｔｈａｎｔｈｉｒａｎら、前出（１９
９６）を参照のこと）。治療剤、疾患または状態のほぼ全クラスについて、受容
可能なインビトロモデルまたは動物モデルが利用可能である。当業者は、文献に
おいてかまたはＵＳＦＤＡもしくはＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）より利用可能であるような広範な種々のモデルを
用意する。さらに、これらのインビトロ法は、試験化合物に対する代謝の効果の
確実な指標を提供するために組織抽出物（例えば、肝臓の調製物（例えば、ミク
ロソーム調製物））を使用し得る。同様に、受容可能な動物モデルを使用して、
種々の疾患または状態を処置する試験化合物の効力を確立し得る。例えば、ウサ
ギ膝は、関節炎を処置する際の効力について薬剤を試験するために受容されたモ
デルである（ＳｈａｗおよびＬａｃｙ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．
（Ｂｒ．）５５：１９７−２０５（１９７３）を参照のこと）。ヒトにおける関
節炎を処置するための使用が承認されるヒドロコルチゾンは、有効性を確認する
このモデルにおいて効果的である（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ，Ｐｈｙｓ．Ｔｈｅｒ．
６２：８３５−８３９（１９８２）を参照のこと）。試験化合物の効力を決定す
るために適切なモデルを選択する場合、当業者は、当該分野、ＵＳＦＤＡまたは
ＮＩＨの事情によって導かれて、適切なモデル、用量および投与経路、レジメン
および終了点を選択し得、そして、過度に悩まされない。
【０２４９】 動物モデルに加えて、ヒト臨床試験を試用して、試験化合物の効力を決定し得
る。ＵＳＦＤＡ、または等価な政府機関は、このような研究についての手順を確
立した。
【０２５０】 （９．試験化合物の選択性） 上記のインビトロ法およびインビボ法はまた、候補調節因子の選択性を確立す
る。化学物質が広範な種々の生物学プロセスを調節し得るかまたは選択性であり
得ることは認識される。当該分野において公知の細胞のパネルを使用して、試験
化合物の特異性を決定し得る（１９９８年４月２日に刊行された、Ｗｈｉｔｎｅ
ｙらに対するＷＯ９８／１３３５３）。選択性は、例えば、化学療法の分野にお
ける証拠であり、ここで、癌細胞に対して毒性であるが非癌細胞に対して毒性で
はない化学物質の選択性は、明らかに好ましい。選択可能な調節因子は、好まし
い。なぜなら、これらは、臨床的設定において副作用がほとんどないからである
。試験化合物の選択性は、種々の細胞性経路および感受性を示す複数の細胞株に
対する試験化合物の毒性および効果を試験することによってインビトロで確立さ
れ得る。これらのインビトロ毒性研究より得られたデータは、試験化合物の毒性
、効力および選択性を決定するために動物モデル研究（ヒト臨床試験を含む）に
拡張され得る。
【０２５１】 試験化合物の選択性、特異性および毒性学、ならびに一般的薬理学は、元々活
性を有するとして同定された試験化合物の構造／特性関係に基づく、さらなる試
験化合物を作製することによってしばしば改良され得る。試験化合物は、種々の
特性（例えば、親和性、血中での生存時間、毒性学、特異性および膜透過性）を
改良するように改変され得る。このように精製された試験化合物は、当該分野に
おいて公知であるかまたは本明細書中に記載されるさらなるアッセイに供され得
る。このような化合物または組成物を作製および分析するための方法は、Ａｇｒ
ａｆｉｏｔｉｓらに対する米国特許第５，５７４，６５６号のように当該分野に
おいて公知である。
【０２５２】 （１０．薬学的組成物） 本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中に薬学的有効量の
試験化合物を有する、貯蔵、および好ましくは、引き続く投与のために調製され
た薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物中の試験化合物を含む。治療
的使用のために受容可能なキャリアまたは希釈剤は、製薬の分野において周知で
あり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇ
ｅｎｎａｒｏ編（１９８５））に記載される。保存薬、安定剤、色素および香味
剤でさえ、薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソル
ビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、保存薬として添加され得る
。さらに、抗酸化剤および懸濁剤は使用され得る。
【０２５３】 本発明の試験化合物は、経口投与のための錠剤、カプセルまたはエリキシル；
直腸投与のための坐剤；注射用投与のための滅菌溶液または懸濁液、などとして
処方および使用され得る。注射液は、液体の溶液または懸濁液としてのいずれか
の簡便な形態、注射前の液体における溶液または懸濁液に適切な固体形態、ある
いはエマルジョンとして調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩
水、デキストロース、マンニトール、乳酸、レクチン、アルブミン、グルタミン
酸ナトリウム、システイン塩酸などである。さらに、所望ならば、注射用薬学的
組成物が、少量の非毒性助剤物質（例えば、保湿剤、ｐＨ緩衝化剤など）を含み
得る。所望ならば、吸収増強調製物（例えば、リポソーム）は、使用され得る。
【０２５４】 投与量として必要とされる薬学的有効量の試験化合物は、投与経路、投与され
るべき動物または患者の型、および考慮中の特定の動物の身体的特徴に依存する
。用量は、所望の効果を達成するために調整され得るが、体重、食餌、同時投薬
のような薬剤、および医学分野において当業者が認識する他の薬剤のような因子
に依存する。本発明の方法を実施する際に、薬学的組成物は、単独でかまたは互
いと組合わせて、あるいは、他の治療剤または診断剤と組合わせて使用され得る
。これらの製品は、インビボで（好ましくは哺乳動物患者において、好ましくは
ヒトにおいて）またはインビトロで使用され得る。これらがインビボで利用され
る際に、薬学的組成物は、種々の投薬形態を利用して種々の方法（非経口的、静
脈内、皮下的、筋肉内、結腸、直腸、経鼻的、または耳内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉ
ｏｔｏｎｅａｌｌｙ）を含む）で患者に投与され得る。このような方法はまた、
インビボでの試験化合物の活性を試験する際に使用され得る。
【０２５５】 当業者に容易に明らかなように、投与されるに有用なインビボ投薬および投与
の特定の形態は、処置される患者の年齢、体重および型、利用される特定の薬学
的組成物、および薬学的組成物が利用されるための特定の使用に依存して変動す
る。所望の結果を達成するために必要な用量レベルである効果的な投薬レベルの
決定は、当業者によって上記のような慣用的方法を使用して達成され得、そして
ＵＳＦＤＡまたはＮＩＨのような機関によって導かれ得る。典型的には、製品の
ヒト臨床適用は、所望の効果が達成されるまで増加される投薬レベルを伴う、よ
り低い投薬レベルで開始される。あるいは、受容可能なインビトロ研究を使用し
て、試験化合物の有用な用量および投与経路を達成し得る。
【０２５６】 非ヒト動物研究において、所望の効果がもはや達成されないかまたは有害な副
作用が見出されないまで減少される投与量を伴う、薬学的組成物の適用は、より
高い用量レベルで開始される。本発明の試験化合物についての投薬量は、所望の
効果、治療指標、投与経路ならびに試験化合物の純度および活性に依存して広範
であり得る。典型的には、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇとの間
、好ましくは、約１０ｎｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、約
１００ｎｇ／ｋｇと約１００μｇ／ｋｇとの間、そして最も好ましくは、約１μ
ｇ／ｋｇと約１０μｇ／ｋｇとの間であり得る。
【０２５７】 正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態の観点で個々の医師によっ
て選択され得る（Ｆｉｎｇｌｅら、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５）を参照のこと）。主
治医が、毒性、器官機能不全または他の有害な効果に起因してどのようにそして
投与をいつ終了、中断または調整するかを知っていることに注意すべきである。
逆に、主治医はまた、臨床応答が妥当ではない場合より高いレベルに処置を調整
することを知っている。目的の障害の管理における投与される用量の大きさは、
処置されるべき状態の重篤度および投与経路に対する重篤度で変動する。状態の
重篤度は、例えば、標準の徴候評価法によって部分的に評価され得る。さらに、
用量およびおそらくは用量頻度はまた、個々の患者の年齢、体重および応答に従
って変動し、獣医学的適用についてのものを含む。
【０２５８】 処置される特定の状態に依存して、このような薬学的組成物は、全身的または
局所的に処方および投与され得る。処方および投与の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８編、Ｍａｃ
ｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）に見出さ
れ得る。適切な投与経路としては、経口、経直腸、経皮、経耳、経眼、経膣、経
粘膜または経腸の投与；非経口送達（筋肉内、皮下、骨髄内の注射、ならびに髄
腔内注射、直接脳室内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または眼内注射を含む）
が挙げられ得る。
【０２５９】 注射について、本発明の薬学的組成物は、水性溶液、好ましくは薬理学的に適
合性の緩衝液（例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、リンゲル溶液または生理食塩水緩衝液
）中で処方され得る。このような経粘膜投与について、浸透されるべきバリアに
適切な浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）は、処方物中に使用される。このような浸
透剤は、当該分野において一般に公知である。全身的投与に適切な投与量での本
発明の実施について本明細書中に開示される薬学的組成物を処方するための薬学
的に受容可能なキャリアの使用は、本発明の範囲内である。キャリアおよび適切
な製造実施の好ましい選択について、本発明の組成物、特に溶液としての処方物
は、静脈内注射によるように、非経口的に投与され得る。薬学的組成物は、経口
投与に適切な投与量で当該分野において周知の薬学的に受容可能なキャリアを使
用して容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の試験化合物を、処
置されるべき患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、
シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方し得る。
【０２６０】 細胞内に投与されることが意図される薬剤は、当業者に周知の技術を使用して
投与され得る。例えば、このような薬剤は、リポソーム処方物中にカプセル化さ
れ得、次いで、上記のように投与され得る。リポソームの際に水溶液に存在する
実質的に全ての分子は、次いで形成されるリポソームへまたは内へ組み込まれる
。リポソーム内容物は、外部微小環境から保護され、かつ、リポソームが細胞膜
に融合するので細胞質内へ効果的に送達される。さらに、これらの疎水性に起因
して、小器官分子は、直接細胞内へ投与され得る。
【０２６１】 本発明における使用に適切な薬学的組成物は、活性成分が意図される目的を達
成するために有効量で含まれる組成物を含む。薬学的組成物の有効量を決定する
ことは、特に、本明細書中に提供される詳細な開示の観点から十分に当業者の能
力内である。活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性な化学物質の薬
学的に使用され得る調製物への処理を容易にする賦形剤および助剤を含む、適切
な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。経口投与に処方される調製物は、錠
剤、糖剤、カプセルまたは溶液の形態にあり得る。本発明の薬学的組成物は、そ
れ自体公知である様式（例えば、慣用的混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖剤
作製工程、乳化工程、カプセル化工程、包括化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）工程、
または凍結融解工程）によって製造され得る。非経口投与についての薬学的処方
物は、水溶性形態での活性な化学物質の水溶液を含む。
【０２６２】 さらに、活性な化学物質の懸濁液は、適切な油状注入懸濁液として調製され得
る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪酸油（例えば、ゴマ油）、または
合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）あるいはリポ
ソームを含む。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソ
ルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加する物質を含み得る
。任意には、懸濁液はまた、特定の適切な安定化剤、または高度に濃縮された溶
液の調製物を可能にする化学物質の安定性を増加する薬剤を含み得る。
【０２６３】 経口使用についての薬学的組成物は、所望ならば、錠剤または糖剤の核を得る
ために適切な助剤を添加する後に、活性な化学物質を固形賦形剤と結合すること
、任意には、生じた混合物を粉砕すること、および顆粒の混合物を処理すること
によって得られ得る。適切な賦形剤は、特に、以下である：糖（ラクトース、ス
クロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）のような充填剤；例えば、
トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、イモ澱粉、ゼラチン、ガムトラガン
ト、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンのようなセルロ
ース調製物。所望ならば、崩壊剤（例えば、架橋するポリビニルピロリドン、寒
天、アルギン酸、またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））は、添加さ
れ得る。糖剤の核は、適切な被膜とともに提供され得る。活性な用量の異なる組
み合わせを同定または特徴付けるために、色素または顔料は、錠剤または糖剤被
膜に添加され得る。
【０２６４】 本発明の試験化合物、およびこのような試験化合物を含む薬学的組成物は、患
者（ヒトを含む）における種々の病気を処置するために有用である。このような
処置が必要な患者は、本発明の試験化合物を、好ましくは、患者における疾患ま
たは障害の症状、病理学または進行速度を軽減するために効果的な量だけ薬学的
組成物中に提供され得る。量、投薬量、投与経路、レジメンおよび終了点は、本
明細書中に記載される手順か、または適切な政府機関（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｄ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）
による手順を使用して、全て決定され得る。
【０２６５】 （１１．同定された化合物を使用する糖尿病の処置） 本発明の別の局面は、有効量の本発明の薬学的組成物を被験体（例えば、糖尿
病の処置が必要なヒト患者）に投与することによって糖尿病を処置する方法を含
む。薬学的組成物は、治療効果、待機効果、予防効果、防止（ｉｍｐｅｄｉｔｉ
ｖｅ）効果を有するに十分な量、投与経路およびレジメンで、これらの作用を改
善するために被験体に投与され、糖尿病の経過を反転し、糖尿病の発症を遅延ま
たは糖尿病を阻止させる。被験体は、好ましくは、糖尿病の発達の危険性を有す
るかまたは危険性にあることが予想される。
【０２６６】 「有効量」は、適切な投薬量およびレジメンによって被験体に投与される場合
所望の結果が生じる治療的試薬の量である。
【０２６７】 「糖尿病の処置が必要な被験体」は、糖尿病と診断されたかまたは糖尿病を有
することが予想される被験体である。
【０２６８】 「治療的効果」は、疾患状態または病理学的状態の減弱または排除である。
【０２６９】 「待機効果」は、疾患または病理学的状態と関連する症状の緩和である。
【０２７０】 「予防効果」は、疾患状態または病理学的状態の防止である。
【０２７１】 「防止効果」は、疾患状態または病理学的状態の進行速度の減少である。
【０２７２】 「効果を改善する」は、疾患状態または病理学的状態の症状の重篤度の減少を
いう。
【０２７３】 「糖尿病疾患の経過を反転する」は、被験体におけるグルコース代謝の回復ま
たは改善をいう。
【０２７４】 （１．核酸分子） （治療組成物）本発明の治療組成物は、少なくとも１つの本発明の核酸分子、
好ましくは、核酸を含む。核酸は、他の分子（例えば、限定されないが、標的組
織へのその核酸の送達を容易にし得るタンパク質）に共有結合または非共有結合
で連結または結合され得る。葉酸のような小分子は、核酸分子に連結されて、脳
血液関門を通過する輸送を増強し得る（Ｗｕ，Ｄら、（１９９９）Ｐｈａｒｍ．
Ｒｅｓ．１６：４１５−１９）。
【０２７５】 核酸分子は、カチオン性脂質と複合体化され得、リポソーム内にパッケージン
グされ得、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性微小カプセル、もしく
は生物接着性ミクロスフェア内に組み込まれ得る。薬学的組成物としては、オリ
ゴヌクレオチドに加えて、キャリア、シックナー、希釈剤、緩衝液、保存薬、表
面活性剤などが挙げられ得る。薬学的組成物はまた、オリゴヌクレオチドに加え
て、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１つ以上の活性成分を含み得る。投
与が注射または注入による場合、核酸分子は、直接にかまたは滅菌溶液中の前出
の組成物中で送達され得、これはまた、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加
物を含み得る。局所投与についての処方物としては、軟膏、ローション、クリー
ム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。慣用的
な薬学的なキャリア、水性、粉末または油ベース、シックナーなどは、必要であ
り得るかまたは所望され得る。
【０２７６】 鼻腔吸入は、脳への薬学的組成物（Ｗａｎｇ，Ｙら（１９９８）、Ｂｉｏｐｈ
ａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．１９：５１７〜５）、および／または脳脊髄
液（Ｓａｋａｎｅ Ｔ．（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４
３：４４９−５１）の送達のために特に有効である。核酸分子を含む薬学的組成
物はまた、鼻上皮細胞による吸収を増大する化合物（例えば、カチオン性化合物
（Ｎａｔｓｕｍｅ，Ｈ．ら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８５：１
〜１２）、シクロデキストリン（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ
．６：１７〜３６）、または鼻腔吸収を増大することが知られているかまたは後
に発見され得る他の化合物）を含み得る。鼻腔送達のための核酸を含む溶液は、
エアロゾル吸入のためのスプレー容器で提供され得る。
【０２７７】 経口送達のための組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒
体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、カシェ剤、またはタブレットが挙げら
れる。濃厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましく
あり得る。
【０２７８】 用量：核酸分子を含む薬学的組成物の最適な用量は、様々な因子（処置される
状態の重篤度、送達されている核酸分子の毒性、投与の経路、および処置に対す
る個々の患者の応答を含む）に依存する。熟練した開業医は、これらの因子、な
らびに動物試験および臨床的研究から誘導される有効用量に基づいて適切な用量
を決定し得る。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇにつき０．０１μｇ〜１００ｇ
であり、そして一日、一週間、一ヶ月、または一年に１回以上、あるいはさらに
２〜２０年毎に１回与えられ得る。当業者は、測定された滞留時間および体液ま
たは組織中の薬物の濃度に基づいて、投薬のための繰返し率を推測し得る。患者
に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが所望され得、ここで
、核酸は、体重１ｋｇにつき０．０１μｇ〜１００ｇで、１日につき１回以上〜
２０年毎に１回の範囲の維持投薬量で投与される。
【０２７９】 投与の経路：核酸分子は、任意の適切な投与経路（例えば、非経口または静脈
内注射）によって投与され得る。核酸はまた、ポンプ、ステントまたは点滴によ
って静脈内送達され得る。核酸分子は、脊柱への注射によって脳脊髄液に導入さ
れ得る。脳への送達のために、注射はカニューレを介して脳腔に送達され得る。
他の送達経路としては、経口送達および局所適用が挙げられる。エアロゾルの鼻
腔吸入は、脳への、本発明の核酸およびそれらの処方物の投与のために特に有用
であり得る。核酸はまた、局所的に送達されるポリマー、固体支持体もしくはフ
ァブリック、またはゲルの中に入れられるか、あるいはこれに塗布され得る。こ
のような固体支持体、ファブリック、ポリマー、またはゲルは生分解性であり得
る。
【０２８０】 レジメン：用量レジメンは、動物研究および臨床試験に基づいて、実験的に決
定される。用量は、一日、一週間、一ヶ月もしくは一年に一回以上、またはさら
に２〜２０年毎に１回与えられ得る。当業者は、測定された滞留時間および体液
または組織中の薬物の濃度に基づいて、繰返し率を推測し得る。首尾良い処置の
後、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが所望され得
、ここで、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇにつき０．０１μｇ〜１００ｇで
、１日につき１回以上〜２０年毎に１回の範囲の維持投薬量で投与される。
【０２８１】 モニタリング過程：糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型のいずれか）の処置の過程は、
当該分野で公知の方法を使用して測定される。例えば、血液グルコース、尿グル
コース、または血液または血漿インシュリンレベルは、確立された方法を使用し
てモニタリングされ得る。これらの測定は、適切な間隔（食餌または絶食の前、
間および後を含む）で行われ得る。この場合、カロリー摂取およびカロリー摂取
のタイプ（例えば、炭水化物）が注意されなければならない。
【０２８２】 （２．遺伝子治療構築物） 遺伝子治療構築物は、遺伝子調節エレメントに必要に応じて作動可能に連結さ
れた本発明の核酸分子を含む核酸を含む。この核酸分子および遺伝子調節エレメ
ントはプラスミド中に存在し得るか、またはベクター（例えば、レトロウイルス
ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクチンウ
イルスベクター、ヘルパーウイルスベクター、または当該分野で公知であるかま
たは後に開発された他のベクターが挙げられるが、これらに限定されない）に組
み込まれ得る。遺伝子治療構築物は、ＤＮＡとして、ウイルス粒子として、また
は細胞中に投与され得る。
【０２８３】 治療組成物：ベクター（例えば、ウイルス）に組み込まれていない核酸分子か
らなる遺伝子治療構築物は、遊離核酸として送達され得るか、または他の分子（
例えば、血液−脳バリアを横切るそれらの輸送を増大する分子、または標的組織
（単数または複数）へのそれらの送達を促進し得る分子が挙げられるが、これら
に限定されない）に共有結合もしくは非共有結合して送達され得る。他のＤＮＡ
配列（例えば、アデノウイルスＮＡ遺伝子）は、投与媒体に含まれ得、そして目
的の遺伝子と共に同時トランスフェクトされる。アデノウイルスＶＡ遺伝子産物
をコードする遺伝子の存在は、プラスミドから転写されたｍＲＮＡの翻訳を有意
に増大し得る。ウイルスにパッケージングされた遺伝子治療構築物は、タンパク
質、または他の分子もしくは化合物（例えば、細胞への送達を促進するためにウ
イルスに組み込まれたかまたはウイルスに付随する脂質、タンパク質、またはポ
リマーが挙げられるが、これらに限定されない）を有し得る。遺伝子治療構築物
（裸のＤＮＡであろうとパッケージされたベクター構築物であろうと）は、カチ
オン性脂質に結合体化され得るか、リポソーム内にパッケージされ得るか、ヒド
ロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、または生体付着性マイク
ロスフェアに組み込まれ得る。薬学的組成物は、キャリア、濃厚剤、希釈剤、緩
衝液、保存剤、界面活性剤などをオリゴヌクレオチドに加えて含み得る。薬学的
組成物はまた、１つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬など）
をオリゴヌクレオチドに加えて含み得る。投与が注射または注入による場合、こ
の遺伝子治療構築物は、直接送達され得るか、または滅菌溶液中の上記の組成物
の形態で投与され、この溶液はまた、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤を
含み得る。局所投与のための処方物は、軟膏、ローション、クローム、ゲル、ド
ロップ、坐剤、スプレー、液体、および散剤を含み得る。従来の薬学的キャリア
、水溶液、散剤または油性基剤、濃厚剤などは、必要または所望であり得る。
【０２８４】 鼻腔吸入は、脳への薬学的組成物（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら（１９９８）Ｂｉｏｐｈ
ａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．１９：５７１〜５）、および／または脳脊髄
液（Ｓａｋａｎｅ Ｔ．（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４
３：４４９〜５１）の送達のために特に有用である。遺伝子治療構築物を含む薬
学的組成物はまた、鼻腔上皮細胞による吸収を増大する化合物（例えば、カチオ
ン性化合物（Ｎａｔｓｕｍｅ，Ｈ．ら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．
１８５：１〜１２）、シクロデキストリン（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔ
ａｒｇｅｔ．６：１７〜３６）、または鼻腔吸収を増大することが知られている
かまたは後に発見され得る他の化合物）を含み得る。遺伝子治療構築物を含む溶
液は、エアロゾル吸入のためのスプレー容器で提供され得る。
【０２８５】 経口送達のための組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒
体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、カシェ剤、またはタブレットが挙げら
れる。濃厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましく
あり得る。核酸はまた、局所的に送達されるポリマー、固体支持体もしくはファ
ブリック、またはゲルの中に入れられるか、あるいはこれに塗布され得る。この
ような固体支持体、ファブリック、ポリマー、またはゲルは生分解性であり得る
。
【０２８６】 遺伝子治療構築物はまた、細胞内に送達され得る。遺伝子治療構築物を含む細
胞は、患者、別のヒト、または別の種の動物由来であり得る、遺伝子治療構築物
は、ウイルストランスフェクション、電気泳動、リポソームとの膜融合、ＤＮＡ
でコーティングした微粒子を用いる高速衝突、カルシウム−リン酸−ＤＮＡ沈降
を用いるインキュベーション、ＤＥＡＥ−デキストランでのトランスフェクショ
ン、直接微量注射、または当該分野で公知であるかまたは後に開発された方法に
よってインビボで細胞に導入され得る。次いで、細胞は任意の様々な手段（移植
または注射を含む）によって患者に送達される。これらの細胞は、インビボで遺
伝子治療構築物を発現して、患者における治療効果を得る。あるいは、患者への
導入の後、遺伝子治療構築物を含む細胞は、遺伝子治療構築物を複製および／ま
たはパッケージし得、その結果、患者における内在性細胞は、この遺伝子治療構
築物で感染、形質転換またはトランスフェクトされ、それによりこれを発現し得
る。遺伝子治療構築物を含む細胞は、これらを滴注部位に保持するか、またはこ
れらを患者の細胞免疫機構から保護するために、ポリマーまたは他の材料からな
る構造に封入され得る。
【０２８７】 用量：最適な用量は、処置される状態の重篤度、送達されている遺伝子治療構
築物の毒性、投与の経路、および処置に対する個々の患者の応答に依存する。熟
練した開業医は、これらの因子、ならびに動物および臨床的研究から誘導される
有効用量に基づいて適切な用量を決定し得る。一般的に、裸のＤＮＡ遺伝子治療
構築物について、投薬量は、体重１ｋｇにつき０．０１μｇ〜１００ｇである。
ウイルス遺伝子治療構築物について、適切な用量は、ウイルス発現ベクター１ｍ
ｌあたり１０6〜１０11粒子形成単位の０．１〜５０ｍｌである。ウイルス発現
構築物を含む細胞について、約１０5〜約１０8個の細胞が、適切な部位に送達さ
れ得る。
【０２８８】 投与の経路：裸のＤＮＡ遺伝子治療構築物およびウイルス遺伝子治療構築物は
、静脈内注射もしくは腹腔内注射、気管内、クモ膜下腔内、関節内、筋肉内投与
されるか、またはカニューレによる注射により脳に導入されるか、または脳脊髄
液内の分布に関する脊柱に注射され得る。遺伝子治療構築物は、注射、カテーテ
ル、ポンプまたは点滴によって静脈内投与され得る。あるいは、遺伝子治療構築
物を含む細胞は、脳に外科的に移植され得るか、またはこれらは体内の別の部位
に送達され得る。この遺伝子構築物から発現されるタンパク質または核酸分子が
脳に標的化されるか、または細胞がパッケージング細胞である場合、これは簡便
であり得、導入された細胞によって産生されるウイルスは、脳または他の関連の
組織に標的化され得る。細胞は、局所的、眼内、非経口、鼻腔内、気管内、気管
支内、筋肉内、皮下、または任意の他の手段で投与され得る。
【０２８９】 レジメン：用量レジメンは、動物研究および臨床試験に基づいて、実験的に決
定される。用量は、一日、一週間、一ヶ月もしくは一年に一回以上、またはさら
に２〜２０年毎に１回与えられ得る。当業者は、測定された滞留時間および体液
または組織中の遺伝子治療ベクターの濃度に基づいて、繰返し率を推測し得る。
遺伝子産物のレベルが、疾患の進行を予防するのに必要なレベルより下に低下し
たことが決定される場合、または疾患の進行の症状がある場合、首尾良い処置の
後に、患者にさらなる用量の遺伝子治療ベクターを投与することが所望され得る
。遺伝子治療構築物または遺伝子治療構築物を含む細胞は、維持用量で投与され
得、ここで、この用量は動物実験および臨床試験に基づいて決定され、そして患
者の体液における遺伝子治療構築物の発現産物を測定することによってモニタリ
ングされ得る。
【０２９０】 モニタリング過程：糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型のいずれか）の処置の過程は、
当該分野で公知の方法を使用して測定される。例えば、血液グルコース、尿グル
コース、または血液または血漿インシュリンレベルは、確立された方法を使用し
てモニタリングされ得る。これらの測定は、適切な間隔（食餌または絶食の前、
間および後を含む）で行われ得る。この場合、カロリー摂取およびカロリー摂取
のタイプ（例えば、炭水化物）が注意されなければならない。
【０２９１】 （３．生物学的活性剤） 治療組成物：本発明の治療組成物は、少なくとも１つの本発明の生物学的活性
剤を含み得る。少なくとも１つの本発明の生物学的活性剤は、必要に応じて、標
的組織（単数または複数）へのそれらの送達を促進し得る他の分子（例えば、タ
ンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）に共有結合または非共有結合
され得る。葉酸塩のような低分子は、本発明の生物学的活性剤に結合して、血液
−脳バリアを横切る輸送を促進し得る（Ｗｕ，Ｄ．ら（１９９９）Ｐｈａｒｍ．
Ｒｅｓ．１６：４１５〜１９）。薬学的組成物は、貯蔵、そして好ましくは引き
続く投与のために調製された薬学的に受容可能なキャリアを含み得、これは薬学
的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中に薬学的有効量の生物学的活性剤を有す
る。治療用途に受容可能なキャリアまたは希釈剤は、薬学的分野で周知であり、
例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ
編（１９８５））に記載される。保存剤、安定剤、色素、さらに香味剤は、薬学
的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ
−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、保存剤として添加され得る。さらに、酸化
防止剤および懸濁剤が使用され得る。
【０２９２】 本発明の生物学的活性剤は、経口投与のための錠剤、カプセル剤、またはエリ
キシル；直腸投与のための座剤；注射可能な投与のための滅菌溶液または懸濁液
などとして処方されそして使用され得る。注射可能剤は、液体溶液または懸濁液
のいずれかとしての従来の形態、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適切な個
体形態、またはエマルジョンとして調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水
、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブ
ミン、グルタミン酸ナトリウム、システインヒドロクロリドなどである。さらに
、所望の場合、注射可能な薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質（例えば、湿
潤剤、ｐＨ緩衝化剤など）を含み得る。所望ならば、吸収促進調製物（例えば、
リポソーム）が使用され得る。薬学的組成物はまた、キャリア、濃厚剤、希釈剤
、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを、１つ以上の生物学的活性剤に加えて含み
得る。薬学的組成物はまた、１つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、
麻酔薬など）を、本発明の生物学的活性剤に加えて含み得る。局所投与のための
処方物としては、軟膏剤、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプ
レー、液体および散剤が挙げられる。従来の薬学的キャリア、水溶液、散剤また
は油性基剤、濃厚剤などが必要であるかまたは所望され得る。
【０２９３】 細胞内に投与されることが意図される薬剤は、当業者に周知の技術を使用して
投与され得る。例えば、このような薬剤はリポソームにカプセル化され、次いで
、上記のようにして投与され得る。リポソーム形成時に水溶液中に存在する実質
的に全ての有機分子は、このように形成されたリポソーム中に組み込まれるか、
リポローム内に組み込まれる。リポソーム含量は、外的な微小環境から保護され
、かつリポソームが細胞膜と融合するため、細胞質に効果的に送達される。さら
に、それらの疎水性に起因て、小有機分子は細胞内に直接投与され得る。
【０２９４】 鼻腔吸入は、脳への薬学的組成物（Ｗａｎｇ，Ｙ．ら（１９９８）Ｂｉｏｐｈ
ａｒｍ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓ．１９：５７１〜５）、および／または脳脊髄
液（Ｓａｋａｎｅ Ｔ．（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４
３：４４９〜５１）の送達のために特に有用であ得る。生物学的活性剤を含む薬
学的組成物はまた、鼻上皮細胞による吸収を増大する化合物（例えば、カチオン
性化合物（Ｎａｔｓｕｍｅ，Ｈ．ら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１
８５：１〜１２）、シクロデキストリン（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａ
ｒｇｅｔ．６：１７〜３６）、または鼻腔吸収を増大することが知られているか
または後に発見され得る他の化合物）を含み得る。鼻腔送達のための生物学的活
性剤を含む溶液は、エアロゾル吸入のためのスプレー容器で提供され得る。
【０２９５】 用量：用量として必要とされる本発明の生物学的活性剤の薬学的有効量は、投
与の経路および研究中の特定の動物の物理特性に依存する。この用量は、所望の
効果を達成するために変更され得るが、体重、食餌、併用の薬剤、および医療分
野の当業者が認識する他の因子のような因子に基づく。本発明の方法を実施する
際、薬学的組成物は単独で使用されるか、または互いに組み合わせて使用され得
るか、または他の治療薬または診断薬と組み合わせて使用され得る。当業者は、
これらの因子、ならびに動物実験および臨床試験から誘導される有効用量に基づ
いて、適切な用量を決定し得る。所望の結果を達成するのに必要な用量レベルで
ある、有効投薬レベルの決定は、慣用的な方法を使用して当業者によって達成さ
れ得る。典型的に、製品のヒト臨床適用は、低い投薬レベルで開始され、投薬レ
ベルは所望の効果が達成されるまで増加される。あるいは、受容可能なインビト
ロ研究を使用して、有用な用量、ならびに生体活性化合物の投与経路、および生
体活性を確立し得る。
【０２９６】 投与の経路：これらをインビボで使用する際、少なくとも１つの本発明の生物
学的活性剤を含む薬学的組成物は、様々な投薬形態を使用して、様々な方法（例
えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経結腸、経直腸、経鼻腔または経内耳を
含む）で患者に投与され得る。生物学的活性剤は、脊柱への注射によって、脳脊
髄液に導入され得る。脳への送達について、カニューレを介して脳に注射され得
る。他の送達経路としては、経口送達および局所適用が挙げられる。エアロゾル
の鼻腔吸入は、本発明の生物学的活性剤およびそれらの処方物を脳に投与するた
めに特に有用であり得る。
【０２９７】 レジメン：本発明の生物学的活性剤の最適な量および個々の投薬の間隔は、処
置される状態の特徴および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに処置さ
れる特定の患者によって決定され、そしてこのような最適条件は、従来の技術に
よって決定され得ることが当業者によって理解される。処置の最適な経過、すな
わち、規定された日数の間、一日に投与される本発明の生物学的活性剤の用量の
数は、処置決定試験の従来の過程を使用して当業者によって確認され得ることも
また当業者によって理解される。当業者は、測定された滞留時間および体液また
は組織中の生物学的活性剤の濃度に基づいて、繰返し率を推測し得る。首尾良い
処置の後、患者に維持用量の生物学的活性剤を受けさせることが所望され得、こ
こで維持用量は、動物実験および臨床試験に基づいて決定される。
【０２９８】 モニタリング過程：糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型のいずれか）の処置の経過は、
当該分野で公知の方法を使用して測定される。例えば、血液グルコース、尿グル
コース、または血液または血漿インシュリンレベルは、確立された方法を使用し
てモニタリングされ得る。これらの測定は、適切な間隔（食餌または絶食の前、
間および後を含む）で行われ得る。この場合、カロリー摂取およびカロリー摂取
のタイプ（例えば、炭水化物）が注意されなければならない。
【０２９９】 （実施例） 以下の実施例は本発明を例示し、そして本発明を限定することを意図しない。
当業者は、慣用的な実験によって、本明細書中に記載される特定の物質および手
順に対する多くの等価物を理解するか、または確認し得る。このような等価物は
、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０３００】 （実施例１） （グルコース応答性はミトコンドリアＤＮＡと関係する） 相関がミトコンドリアの質量および／または機能の間に存在するか否かを決定
するために、以下の実験を行った。
【０３０１】 （ミトコンドリアＤＮＡを枯渇したＩＮＳ−１細胞の生成） ＩＮＳ−１ラットインスリノーマ細胞を、Ｐｒｏｆ．Ｃｌａｅｓ Ｗｏｌｌｈ
ｅｉｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｇｅｎｅｖａ
，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，から得、そしてＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ ウシ胎児血清（Ｉｒｖ
ｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、
１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ β−メルカプトエタノールを補
充）中で、加湿した５％ ＣＯ2環境で、３７℃で培養した。
【０３０２】 培地が、５０μｇ／ｍｌ ウリジン、ならびにヌクレオシドアナログの２’３
’−ジデオキシシチジン［ｄｄＣ］、２’３’−ジデオキシイノシン［ｄｄＩ］
、または２’３’−ジデヒドロ−３−デオキシチミジン［ｄ４Ｔ］（全てＳｉｇ
ｍａ製）をＰＢＳ中１００倍のストックから希釈された様々な濃度（１〜５００
μＭ）またはＰＢＳを含まない比較可能な希釈で含むこと以外は、ＩＮＳ−１細
胞を、上記のような条件下で３〜６０日間培養した。培地を２日おきに補充した
。定期的な間隔で細胞を収集し、そしてインスリン分泌およびｍｔＤＮＡ含量に
ついてアッセイした。
【０３０３】 ＤＮＡｚｏｌTM試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ
，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）および製造者の使用書に本質的に従
う方法を使用して、全ＤＮＡを、ラット肝臓（ラット由来細胞をプローブするた
め）、またはマウス細胞株３Ｔ３ Ｌ１（マウス由来細胞をプローブするため；
Ｇｒｅｅｎら、Ｃｅｌｌ ３：１２７−１３３，１９７４およびＣｅｌｌ ５：
１９−２７，１９７５を参照のこと）から調製した。テンプレートＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって試験し、そしてほぼ
等価であることを見出した。各テンプレートＤＮＡを、分離ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）反応に使用して、１，２０７塩基対を有し、ラット（Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド５３４２〜６５
４９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１４８４８、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ２９０：４９７−５１６，１９８１）またはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌ
ｕｓ）ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド５３６１〜６５６８（ＧｅｎＢａｎ
ｋ受託番号Ｖ００７１１、Ｂｉｂｂら、Ｃｅｌｌ ２６：１６７−１８０，１９
８１）のいずれかに対応するＤＮＡ分子を調製した。ミトコンドリアでコードさ
れるシトクロムｃ オキシダーゼサブユニットＩ（ＣＯＸ−Ｉ）遺伝子に特異的
な同じ対のオリゴヌクレオチドプレイマーを、ラットテンプレートまたはマウス
テンプレートのいずれかの反応のために使用した。プライマーの対は、以下の配
列を有する順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドからなっ
た： 順方向：５’−ＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＣＴＡ（配列番号１
７） 逆方向：５’−ＡＡＧＴＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴ（配列番
号１８）。
【０３０４】 ＰＣＲ反応物は、適切な量のテンプレートＤＮＡ、プライマー、ＭｇＣｌ2、
４つ全てのｄＮＴＰ、反応緩衝液、およびＴａｑポリメラーゼを含み、滅菌水を
使用して５０μｌまでの容量にした。この反応物を９５℃で１０秒間、続いて９
５℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクルでインキュ
ベートし、その後、この反応物を、７２℃で４分間インキュベートし、次いで、
４℃に冷却した。
【０３０５】 このＰＣＲ反応混合物を、フェノール：クロロホルムで抽出し、そして一連の
分子量マーカーと共に、アガロースゲルで電気泳動し、アガロースゲルをエチル
ブロマイドで染色し、そして紫外光で可視化した。両方の反応物について、予測
したサイズ（すなわち、約１．２キロ塩基）の単一のバンドが観察された。ラッ
トプローブを、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ランダムプライミングキ
ット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、製造者の使用書に
本質的に従って、32Ｐで放射標識した。
【０３０６】 スロットブロッティングによってミトコンドリアＤＮＡを定量するために、上
記のようにしてｄｄＣを使用して生成したＩＮＳ−１細胞またはρ0ＩＮＳ−１
細胞を、上記のように補充したＲＰＭＩ培地を含む１２ウェルプレートに、０．
４×１０6細胞／ウェルで播種し、そして３７℃、５％ ＣＯ2で２日間培養した
。細胞（０．７×１０6細胞／ウェル）をＰＢＳでリンスし、そして全細胞ＤＮ
ＡをＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎ
ｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を使用して、製造者の使用書に従って
抽出した。各細胞調製物由来の１００ｎｇのＤＮＡをＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ膜（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にスロットブロッ
ティングし、そしてＢｉｏＲａｄ ＧＳ ＧｅｎｅＬｉｎｋｅｒ照射／エネルギ
ー源を使用して１２５ジュールで架橋した。
【０３０７】 この膜をハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％ Ｎ−ラウリ
ルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、１％ ブロック溶液、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）でリンス
し、そして同じ緩衝液中で４２℃で一晩、［32Ｐ］標識したラットＣＯＸＩプロ
ーブでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、膜を２×ＳＳＣ／０
．１％ ＳＤＳで２回洗浄し、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗
浄し、そしてＸ線フィルムに暴露した。ミトコンドリアＤＮＡを、得られたオー
トラジオグラムの濃度測定スキャニングによって定量した。
【０３０８】 ｄｄＣ、ｄｄＩまたはｄ４Ｔを用いるＩＮＳ−１の７日間のインキュベーショ
ンは、用量依存様式で、ｍｔＤＮＡ含量を減少した。全細胞ＤＮＡに対して正規
化された細胞の相対ｍｔＤＮＡ含量（平均ＣＯＸ−Ｉハイブリダイゼーションシ
グナル＋ＳＥＭ）を、図１Ａにおいて、ヌクレオチドアナログ濃度の関数として
プロットする。ｄｄＣのＩＣ50は、約５０μＭであった。２５μＭのｄｄＣと共
に、４０日までインキュベートしたＩＮＳ−１細胞について、ｍｔＤＮＡ含量の
減少は、時間依存性であり、約３日のｔ1/2を有し；ｍｔＤＮＡは２１日後にこ
れらの細胞中に検出されなかった。
【０３０９】 （ミトコンドリアＤＮＡの枯渇したＩＮＳ−１細胞グルコース−応答性インス
リン産生） 上記のようにｄｄＣを用いて生成したＩＮＳ−１細胞（すなわちρ0ＩＮＳ−
１細胞）を上記のように補充したＲＰＭＩ培地を含む１２ウェルプレートへ０．
５×１０6細胞／ウェルで播種し、そして３７℃、５％ＣＯ2にて２日間培養した
。細胞（０．７×１０6細胞／ウェル）をグルコースを含まないＫＲＨ緩衝液（
１３４ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ2ＰＯ４、１．
２ｍＭ ＭｇＳＯ4、１．０ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ
ＮａＨＣＯ3、０．５％ＢＳＡ）でリンスし、次いで、同じ緩衝液中で、加湿
した５％ＣＯ2／９５％空気雰囲気中で３７℃にて１時間インキュベートした。
０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチンを含む新鮮なＫＲＨ緩衝液および続いて
分泌促進物質：５ｍＭグルコース、１０ｍＭグルコース、２０ｍＭグルコース、
５ｍＭ ＫＣｌまたは２０ｍＭ ＫＣｌ、を添加した。３７℃、５％ＣＯ2、に
てさらに１時間後、培養上清を収集した。この上清中のインスリン濃度を測定し
、そしてインスリン特異的な放射性イムノアッセイキット（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して製造業者の指示に従って細胞
数に対して正規化した。
【０３１０】 予想通り、未処理（ミトコンドリアに熟達した）ＩＮＳ−１細胞は、５ｍＭで
開始するグルコースの濃度にてグルコース媒介性インスリン分泌を示し始める（
図１Ｂ、「親ＩＮＳ−１」）。対照的に、２０日にわたってｄｄＣ（１０μＭ）
で処理した細胞において、ｍｔＤＮＡが有意に減少した時間にて、グルコース刺
激インスリン分泌は、試験した任意のグルコースレベルにて観察されなかった（
図１Ｂ、「ｍｔＤＮＡ枯渇ＩＮＳ−１」）。
【０３１１】 （他のグルコース媒介性応答は、ミトコンドリアＤＮＡの枯渇したＩＮＳ−１
細胞において鈍い） ミトコンドリアに熟達した細胞、および他の方法でグルコースに応答する、ｄ
ｄＣで処理され、従ってｍｔＤＮＡの枯渇したＩＮＳ−１細胞の能力を試験した
。
【０３１２】 細胞内ＡＴＰレベルを、グルコースの種々の用量に対する応答における両方の
型の細胞について、ＡＴＰ生物発光アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して決
定した。結果（図２Ａ）は、未処理ＩＮＳ−１細胞が漸増量のグルコースに応答
して、漸増量のＡＴＰを産生することを示す。対照的に、ｍｔＤＮＡを実質的に
枯渇したが、ＡＴＰの基底レベルを維持し得るＩＮＳ−１細胞は、グルコースに
よる刺激に対する任意の実質的な応答を示さない。
【０３１３】 ラクテート産生をも、グルコースの種々の用量に応答する両方の型の細胞につ
いて決定した。細胞を、種々の濃度のグルコースを有する３５ｍｍ皿中で増殖さ
せた。培地を、アッセイの約１６時間前に、種々の濃度のグルコースを含有する
正常な培養培地で再び満たした。次いで、培地を収集し、そして市販のキット（
ここで、ラクテートデヒドロゲナーゼが、蛍光化合物を産生するために使用され
る）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して基本的には製造業者の
指示に従ってラクテートを測定した。
【０３１４】 結果（図２Ｂ）は、未処理ＩＮＳ−１細胞が、ラクテートの減少したレベルを
維持し、そして漸増量のグルコースに応答してＡＴＰのわずかに漸増する量のみ
を産生することを示す。対照的に、ｍｔＤＮＡを実質的に枯渇したＩＮＳ−１細
胞は、グルコースによる刺激に対する任意の実質的な応答を示す。
【０３１５】 これらの結果は、最小で、ミトコンドリアを作動させることが、インスリン分
泌細胞においてグルコース応答性を促進し、そしてミトコンドリアを作動させる
ことが、そのような細胞においてグルコースに対する応答におけるインスリン、
ＡＴＰおよびラクテートの強力な産生に必要とされることを示唆する。
【０３１６】 （実施例２） （ＩＦ１融合タンパク質発現構築物の構築） ２つのＩＦ１誘導融合タンパク質を、以下のように略され得る構造を有して構
築された（詳細については実施例３を参照のこと）： ＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍａ： （Ｈｉｓタグ）−（ＴＡＴ）−（ＩＦ１） ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬ： （Ｈｉｓタグ）−（ＴＡＴ）−（ｍｔＯＴＳ）−（
ＩＦ１）、 ここで、 「Ｈｉｓタグ」は、連続した順序の６つのヒスチジンアミノ酸残基（配列番号
１）を示し； 「ＴＡＴ」は、ＨＩＶ−１由来の細胞標的化配列（ＣＴＳ）（配列番号１０）
を示し； 「ｍｔＯＴＳ」は、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＩＦ１由来のミト
コンドリア標的化配列（配列番号１４）を示し；そして 「ＩＦ１」は、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のＩＦ１ポリペプチ
ド（配列番号１３）を示す。
【０３１７】 これらのＩＦ１誘導融合タンパク質をコードし、そしてその産生を指向するよ
うに設計された発現構築物を以下のように構築した。
【０３１８】 （ラット心臓ｃＤＮＡライブラリー：） 総細胞性ＲＮＡラット心臓由来のｃＤＮＡライブラリーを、当該分野で公知の
方法に従って調製した。簡潔には、ラット心臓を、結合する組織から解剖し、そ
して４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を含有する緩衝液中で、任意の
ＲＮａｓｅまたは混入したＲＮＡを取り除くために処置された外科用器具を用い
て穏やかに刻んだ。この細胞を溶解し、そしてＲＮＡを溶解産物から精製し、そ
して４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、６ｍＭ塩化マグネシウムおよ
び２ｍＭ塩化カルシウムを含む緩衝液中の１μｌのＤＮａｓｅＩ（１０μ／μｌ
）を用いて、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，以前はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で３７℃
にて３０分間処理することにより清澄させた。この処置に続いて、２回のフェノ
ール／クロロホルム抽出、１回のクロロホルム抽出、および酢酸ナトリウムの存
在下でエタノール沈殿を行なった。このＲＮＡペレットを、遠心分離により収集
し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、そしてＲＮａｓｅを含まない滅菌水中
に再懸濁した。ＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ｈ−欠乏Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｒ
ｉｐｔａｓｅ（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM；Ｌｉｆｅ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、逆転写してｃＤＮＡを生成した
。
【０３１９】 （ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬ挿入物：） ラットＩＦ１ ｃＤＮＡを、製造業者の指示にしたがって、以下のプライマー
、ＡＭＰＬＩＴＡＱTMＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、なら
びにＧＥＮＥＡＭＰTMＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ）に供給される試薬および緩衝液を使用して、サーマルサイキュラーにおい
てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりラット心臓ｃＤＮＡライブラリーから
増幅した。以下のＰＣＲプライマーの提示において、下線のヌクレオチドは、ラ
ットＩＦ１ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下
線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＳａｃＩ（認識配列：５’−ＧＡＧＣＴＣ
）およびＨｉｎｄＩＩＩ（認識配列：５’−ＡＡＧＣＴＴ）についての認識配列
を示し、そしてラットＩＦ１開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ，
逆相補ＴＣＡを有する）の逆相補が強調されている。
【０３２０】 ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬについて、ここでは、全長ラットＩＦ１（配列番号１２
および１３）は、ＴＡＴ配列に連結され、以下のヌクレオチド配列を有するプラ
イマーが使用された： 順方向−ＦＬ（センス）：
【０３２１】
【化１】 および 逆方向（アンチセンス）
【０３２２】
【化２】 順方向−ＦＬプライマーにおいて、ＳａｃＩ制限酵素部位とラットＩＦ１につ
いての開始コドンとの間の配列は、Ｔａｔ誘導細胞性標的化配列をコードし、以
下のそれらの提示において下線を付される：
【０３２３】
【化３】 ＰＣＲ産物を、製造業者の提供した反応緩衝液を使用して、製造業者の推奨に
基本的に従って、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（両方の酵素ともＲｏｃｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で消化した。この制限酵素
消化したＤＮＡを、水平方向アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａ
ｎTMＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ
．，Ｓｏｌａｎａ Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）を使用するバンド抽出により精製した。
【０３２４】 （ＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍａ挿入物：） ラットＩＦ１ｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用したことを除いて、前述の
節におけるようにＰＣＲによりラット心臓ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
以下のＰＣＲプライマーの提示において、下線を付されたヌクレオチドは、ラッ
トＩＦ１ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線
を付したヌクレオチドは、制限酵素ＳａｃＩ（認識配列：５’−ＧＡＧＣＴＣ）
およびＨｉｎｄＩＩＩ（制限配列：５’−ＡＡＧＣＴＴ）についての認識配列を
示し、そしてラットＩＦ１終止コドン（ＴＧＡ，逆相補ＴＣＡを有する）の逆相
補が強調されている。
【０３２５】 ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬ（ここでは、その天然のミトコンドリア標的化配列（配
列番号１４）を欠くラットＩＦ１が、ＴＡＴ配列に連結される）について、ここ
では、全長ラットＩＦ１（配列番号１２および１３）は、ＴＡＴは維列に連結さ
れ、以下のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用された： 順方向−Ｍａ（センス）：
【０３２６】
【化４】 および 逆方向（アンチセンス）：
【０３２７】
【化５】 順方向−ＦＬプライマーの場合、ＳａｃＩ制限酵素部位とラットＩＦ１につい
ての開始コドンとの間の配列は、Ｔａｔ誘導細胞性標的化配列をコードする。こ
のＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、そして
水平方向アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎ
キット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出によ
り精製した。
【０３２８】 （発現ベクターの調製および連結） 発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡ）を使用した。このベクターは、５’から３’の配向で作動可能に連結され
た以下のエレメントを含む：誘導性だが密接に調節可能であるａｒａＢＡＤプロ
モーター；最適化されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳開始シグナル；アミノ末端のポリヒス
チジン（６×Ｈｉｓ）コード配列（「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」ともいわれる）；ＸＰＲ
ＥＳＳTMエピトープコード配列；そのように所望される場合に、タンパク質精製
後に前述のＮ末端アミノ酸を取り除くために使用され得るエンテロキナーゼ切断
部位；多重クローニング部位；およびインフレーム終結コドン。
【０３２９】 プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ ＤＮＡを、製造業者の指示に基本的に従って制
限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製
し、そして水平方向アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅ
ｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバン
ド抽出に供した。消化されそして精製したＩＦ．ＦＬ ＤＮＡまたはＩＦ．Ｍａ
ＤＮＡを、製造業者の反応緩衝液を使用して、そして製造業者の指示に従って
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、制限した発現ベクターＤＮＡと連結した。コンピテ
ントなｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ ｅｎｄＡ１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’
株：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って、真核生物ベクター構築
物を含有する連結混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択し、そして５０
μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）を含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを
、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｒｅ
ａｇｅｎｔｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用
して、微生物培養物から単離した。「ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬ
」および「ｐＢＡＤ／ＨＩｓ．ＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍａ」発現構築物のいくつかの
候補単離物を、これらの構築物を確認するために制限マッピングした。推定制限
マッピングを有する各発現構築物の１つの単離物を、さらなる実験のために選択
した。
【０３３０】 （実施例３） （ＩＦ１融合タンパク質の発現および精製） ＴＡＴ．ＩＦ１．ｍａおよびＴＡＴ．ＩＦ１．ｍａ融合タンパク質の誘導性発
現を、以下のように試験した。一晩の培養および新鮮な培地への希釈に続いて、
ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬまたはｐＢＡＤ／Ｈｉｓ．ＴＡＴ．Ｉ
Ｆ１．Ｍａを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、０．０２％の濃度のＬ−アラビノー
スで約４時間処理することによって誘導した。細胞を収集し、溶解させ、そして
超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）して、タンパク質抽出物を調製した。この抽
出物のタンパク質含量を決定し、そして同量のタンパク質をウエスタン分析に供
した。
【０３３１】 結果は、推定分子量の特定のバンド（Ｈｉｓ−Ｔａｇ＋エンテロキナーゼ部位
＋エピトープ＋全長ラットＩＦ１）が、アラビノース誘導Ｅ．ｃｏｌｉ（これは
、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬ発現構築物で形質転換された）にお
いて観察されたが、非誘導コントロール培養物において存在しなかったことを示
す。同様に、ＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍａの推定分子量に対応するバンド（Ｈｉｓ−Ｔ
ａｇ＋エンテロキナーゼ部位＋エピトープ＋ラットＩＦ１−ラットＩＦ１ミトコ
ンドリア標的化配列）が、誘導したｐＢＡＤ／Ｈｉｓ．ＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍａ形
質転換Ｅ．ｃｏｌｉにおいて観察されたが、非誘導培養物において存在しなかっ
た。Ｈｉｓタグ化タンパク質を、ＰｒｏＢｏｎｄTMニッケル−キレート化樹脂（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、基本的に製造者の指示に従って、誘導細胞か
ら精製した。ニッケル−アフィニティカラム精製したＩＦ１融合タンパク質を、
図７に示す。図７は、示された構築物の発現された産物のクマシーブルー染色さ
れた電気泳動図を示し、そして図７はまた、上記のようなＸｐｒｅｓｓTMエピト
ープタグに特異的な抗体を用いて、検出されたＩＦ１融合タンパク質のウエスタ
ンブロット分析を示す。
【０３３２】 （実施例４） （ミトコンドリアへのＩＦ１融合タンパク質の直接送達） ２つのＩＦ１誘導融合タンパク質の細胞へ入り、そしてミトコンドリアへ直接
送達される能力を試験するために、以下の実験を実施した。
【０３３３】 前述の実施例に記載される、精製したＩＦ１融合タンパク質誘導体を、Ｏｒｅ
ｇｏｎ ＧｒｅｅｎTM ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）
を用いて、蛍光成分（Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎTM）を付着させることによって
標識した。ＩＮＳ−１細胞を実施例４におけるように培養し、そして精製したＴ
ＡＴ．ＩＦ１．ＭａおよびＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬポリペプチドを別のセットの細
胞に、最終濃度１００μｇ／ｍｌまで添加した。
【０３３４】 この細胞を蛍光顕微鏡で視覚的に試験した。非標識のＴＡＴ．ＩＦ１．ＦＬポ
リペプチドを添加したコントロールＩＮＳ−１細胞は、わずかな散乱蛍光発光を
示した。これは、この細胞は、ある程度自然に蛍光を発し、いくらかのバックグ
ラウンドシグナルを生成するからである。同様に、標識したＴＡＴ．ＩＦ１．Ｍ
ａポリペプチドを添加した細胞は、散乱パターンの蛍光を示し、これは、バック
グラウンドシグナルより強力ではなかった。対照的に、標識したＴＡＴ．ＩＦ１
．ＦＬポリペプチドを添加した細胞は、斑点状パターンの蛍光を示し、ポリペプ
チドのオルガネラ送達を示した。
【０３３５】 （実施例５） （ＡＴＰアーゼおよびＩＦ１活性のアッセイのための試薬の調製） （ＩＦ１ポリペプチド誘導体の構造および調整） ラットＩＦ１の部分に対応する合成ポリペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を用いて、
当該分野において公知の方法に従って調製した。合成が完了した後に、ポリペプ
チド鎖の保護基からの放出を達成するために、保護基を除去し、そしてポリペプ
チド鎖を樹脂から切断した。
【０３３６】 ２つのポリペプチドを調製した。ＩＦ１(22-46)は、ラットＩＦ１の成熟形態
のアミノ酸２２〜４６（すなわち、ミトコンドリア標的化配列の切断および除去
後に残るタンパク質）から構成され、そして以下の配列を有する：
【０３３７】
【化６】 ＩＦ１(42-58)は、ラットＩＦ１の成熟形態のアミノ酸４２〜５８から構成され
、そして以下の配列を有する：
【０３３８】
【化７】 （Ｆ０−Ｆ１ ＡＴＰアーゼおよびＦ１ ＡＴＰアーゼの調製） 完全なミトコンドリアＡＴＰシンターゼ複合体は、膜結合部分（Ｆ０）および
マトリックスへ突出する「ロリポップ形（ｌｏｌｌｉｐｏｐ−ｓｈａｐｅｄ）」
の部分（Ｆ１）を含むと考えられる。Ｆ１−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰアーゼの活
性な、水溶性サブ複合体であり、これは、ミトコンドリアマトリックス内に向く
ミトコンドリアＡＴＰアーゼの部分を表す。Ｆ１ ＡＴＰアーゼは、Ｆ０から単
離され得、そして単離されたサブ複合体としていくらかの酵素活性を保持する。
単離されたＦ１ ＡＴＰアーゼは、Ｆ０サブ複合体と再結合し、元来の膜結合構
造を再形成する（ＫａｇａｗａおよびＲａｃｈｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２４１：２４６７、１９６６）。
【０３３９】 Ｆ０−Ｆ１ ＡＴＰアーゼ複合体およびＦ１ ＡＴＰアーゼサブ複合体を、中
性ｐＨでのＳＭＰ（亜ミトコンドリア粒子）の調製の代わりに、ＡＳＭＰ（アル
カリ性亜ミトコンドリア粒子；ＲｏｕｌｉｎおよびＢｒｏｇｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２２２：６８−７５、１９９４を参照）を、ウシ心臓から塩基性溶
液中での超音波処理によって調製した点を除いて、Ｗａｌｋｅｒらの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｘｙｍｏｌｏｇｙ ２６０：１６３−１９０、１９９５
）に基本的に従って、ウシ心臓サンプルから単離した。ＡＳＭＰを、クロロホル
ムで抽出し、そしてＷａｌｋｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ２６０：１６３−１９０、１９９５）に従って使用し、Ｆ０−Ｆ１
ＡＴＰアーゼおよびＦ１ ＡＴＰアーゼを調製した。
【０３４０】 （ウシ心臓ＩＦ１の調製） ＩＦ１を、以下の例外を伴って、ＲｏｕｌｉｎおよびＢｒｏｇｅの方法（Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：６８−７５、１９９４）に基本的に従って、ウ
シ心臓サンプルから単離した。調製に続いて、ＳＭＰを約５．０のｐＨの溶液中
で加熱した。濾過液を硫酸アンモニウム、Ｈ２０および７Ｍの尿素で洗浄したＤ
ｏｗｅｘ ５０カラムに注入した。カラムに７Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ
−ＳＯ４、ｐＨ７．３の溶液をアプライすることによって、タンパク質を溶出し
た。溶出した分画をプールし、そしてＩＦ１タンパク質をＣｎｅｔｒｉｃｏｎ（
登録商標）濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて濃縮
した。
【０３４１】 （ラットＡＳＭＰの調製） ＡＳＭＰ（アルカリ性亜ミトコンドリア粒子）を、ＲｏｕｌｉｎおよびＢｒｏ
ｇｅらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：６８−７５、１９９４）に
基本的に従って、ラット心臓サンプルから調製した。
【０３４２】 （実施例６） （ＡＴＰアーゼ活性およびその阻害の評価のための方法） ＡＴＰアーゼ活性についての１つのアッセイとしては、当該分野において公知
の方法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６
０：１６３−１９０、１９９５；ＲｏｕｓｌｉｎおよびＢｒｏｇｅ、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：６８−７５、１９９４）に従って、ＡＴＰ加水分解を
測定することが挙げられる。このようなアッセイは、精製したＦ０−Ｆ１ ＡＴ
Ｐアーゼ複合体またはＦ１ ＡＴＰアーゼサブ複合体を用いて、あるいはアルカ
リ性亜ミトコンドリア粒子（ＡＳＭＰ）を用いて実施される。
【０３４３】 試薬およびアッセイ系を確証するための最初の実験において、Ａｕｒｏｖｅｒ
ｔｉｎ−Ｂをポジティブコントロールとして使用した。この抗生物質は、細菌お
よびミトコンドリアのＡＴＰアーゼに結合し、そしてその活性を阻害する（ｖａ
ｎ Ｒａａｉｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３
：１４６９１３−１４６９１７、１９９６）。前述の実施例に記載される精製し
たＦ１ ＡＴＰアーゼを、種々の濃度のＡｕｒｏｖｅｒｔｉｎ−Ｂで処理し、そ
してＡＴＰ加水分解を測定した。図３に示されるように、Ａｕｒｏｖｅｒｔｉｎ
−Ｂは、用量依存性形式で、精製したＦ１ ＡＴＰアーゼによってＡＴＰ加水分
解を阻害した（ＩＣ５０＝０．８５μＭ）。
【０３４４】 同様な形式で、前述の実施例の部分的に精製したＩＦ１を、精製したＦ１−Ａ
ＴＰアーゼのＡＴＰ加水分解活性を阻害するその能力について試験した。図４に
示されるように、ＩＦ１調製物のプールされた画分１２−１６（黒丸）は、プー
ルされた画分の量（体積）に依存した形式で、精製したＦ１−ＡＴＰアーゼによ
って、ＡＴＰ加水分解を阻害した。対照的に、プールされた画分８−１１（図４
の白丸）は、Ｆ１ ＡＴＰアーゼに対して基本的に影響を有さず、このことは、
これらの画分が実質のない量のＩＦ１を含むことを示した。
【０３４５】 同様の形式で、２つのＩＦ１ポリペプチド誘導体を、精製したＦ１ ＡＴＰア
ーゼおよびＦ０−Ｆ１−ＡＴＰアーゼを阻害するそれらの能力について試験した
。結果（図５）は、両方の合成ポリペプチドが、Ｆ１ ＡＴＰアーゼを阻害した
ことを示す。ＩＦＩ(22-46)ポリペプチドは、約１．３９μＭのＩＣ５０を有し
、一方、ＩＦ１(42-58)ポリペプチドは、約０．８７μＭのＩＣ５０を有した。
対照的に、ＩＦ１(42-58)ポリペプチドのみが、約０．１８μＭのＩＣ５０で、
Ｆ０−Ｆ１−ＡＴＰアーゼを阻害し；ＩＦＩ(22-46)ポリペプチドは何の影響も
有さなかった（図５における「Ｎ．Ｅ．」）。理論によって束縛されることを望
まずに、この結果は、ＩＦ１の作用の２つの形態があり得ることを示唆する。こ
の結果は、２つの別々のＡＴＰアーゼ結合部位（Ｆ０サブユニットによってブロ
ックされる成熟ＩＦ１タンパク質のアミノ酸２２−４６に含まれる第１の部位、
および成熟ＩＦ１タンパク質のアミノ酸４２−５８に存在し、そしてＡＴＰアー
ゼ複合体におけるＦ０の存在によって影響されない第２の部位）がＩＦ１にあり
得るという可能性を生じさせさえする。
【０３４６】 ＩＦ１(42-58)ポリペプチドをまた、前述の実施例に置けるように調製したラ
ットＡＳＭＰ（アルカリ性亜ミトコンドリア粒子）においてＦ０−Ｆ１−ＡＴＰ
アーゼを阻害するその能力についても試験した。その結果（図６）は、ＩＦ１(4 2-58) ポリペプチドは、用量に依存した形式で、ラットＡＳＭＰにおいてＦ０−
Ｆ１−ＡＴＰアーゼを阻害することを示す。この実験におけるＩＦ１(42-58)ポ
リペプチドのＩＣ５０（約２．５μＭ）は、精製したウシＦ０−Ｆ１−ＡＴＰア
ーゼで観察されるＩＣ５０（０．１８μＭ、図５）とはいくぶん異なるが、これ
は、ウシＦ０−Ｆ１−ＡＴＰアーゼとラットＦ０−Ｆ１−ＡＴＰアーゼとの間の
種差を反映し得る。図８は、示される濃度の組換え体ｔａｔ．ＩＦ１．ｆｌ（上
記）をラット肝臓亜ミトコンドリア粒子とインキュベートし、そしてＡＴＰ加水
分解活性を測定した場合に生成された阻害曲線を示す。ＡＴＰ加水分解活性は、
添加されたＩＦ１含有融合タンパク質の非存在下における検出可能な活性の百分
率として示され、そしてオリゴマイシン−阻害可能な活性のレベルをも決定した
（図８）。
【０３４７】 ｔａｔ．ＩＦ１．ｆｌ融合タンパク質はまた、ＩＮＳ−１細胞中で、上の実施
例１に記載されるアッセイ条件を用いて、ＧＳＩＳを増強した（図９）。簡潔に
いうと、ＩＮＳ−１細胞を、種々の量のｔａｔ．ＩＦ１．ｆｌまたはビヒクルコ
ントロールの存在下において、ＲＰＭＩ中で、３７℃で１時間インキュベートし
た。次いで、グルコースを含まないＲＰＭＩを、持続して存在する融合タンパク
質（またはビヒクルコントロール）と共に、１時間添加し、培地を収集し、そし
てインスリン濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。図９は、グルコースおよびＩ
Ｆ１融合タンパク質の非存在下において決定されたインスリン分泌の百分率とし
て表されたインスリン分泌を示す。
【０３４８】 前述から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的で本明細書中に記載された
が、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得るこ
とが理解される。従って、本発明は、添付される特許請求の範囲による場合を除
いて限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｄｄＣで処理されたＩＮＳ−１細胞からのミトコンドリアＤＮＡ（ｍ
ｔＤＮＡ）の経時的損失（パネル１Ａ）、およびグルコース処理に応答した、こ
れらの細胞および親ＩＮＳ−１細胞によるインスリン分泌（パネル１Ｂ）を示す
。
【図２】 図２は、ＩＮＳ−１細胞およびｍｔＤＮＡ枯渇ＩＮＳ−１細胞をグルコースで
処理し、そしてＡＴＰ（パネル２Ａ）または乳酸（パネル２Ｂ）を産生するそれ
らの能力を測定する実験の結果を示す。
【図３】 図３は、Ａｕｒｏｖｅｒｔｉｎ−Ｂによる精製Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの阻害を示
す。
【図４】 図４は、部分的精製されたウシ心臓ＩＦ１による精製Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの阻
害を示す。
【図５】 図５は、ラットＩＦ１のアミノ酸配列（配列番号１３）、およびラットＩＦ１
由来の２つの異なる合成ポリペプチドを、それらの精製Ｆ１−ＡＴＰａｓｅまた
はＦ０−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅを阻害する能力について試験した実験からの結果を
示す。
【図６】 図６は、ラットＩＦ１のアミノ酸４２〜５８に対応する合成ポリペプチドを、
ラットアルカリ性亜ミトコンドリア粒子においてＦ０−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅを阻
害するその能力について試験した実験の結果を示す。
【図７】 図７は、ゲル電気泳動（クマシー染色）およびウェスタンブロットでの組換え
ＩＦ１融合タンパク質の特徴付けを示す。
【図８】 図８は、組換えＩＦ１融合タンパク質による、ラット肝臓亜ミトコンドリア粒
子中のＡＴＰ加水分解酵素活性の阻害を示す。
【図９】 図９は、組換えＩＦ１融合タンパク質による、グルコース刺激性インスリン分
泌（ＧＳＩＳ）の増強を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB20 BB50 BB51 CB01 DA36 FA20 FB01 FB08 FB09 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ21 QQ95 QR20 QR48 QR67 QR77 QS28 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4C084 AA17 NA14 ZC35 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 DA55 EA27 EA50 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ミトコンドリアＡＴＰ産生を変化させる因子を同定するため
    の方法であって、以下： （ｉ）候補因子の存在下でのＡＴＰシンターゼサブユニットへのＡＴＰシンタ
    ーゼの内因性インヒビターの結合レベルと（ｉｉ）該候補因子の非存在下でのＡ
    ＴＰシンターゼサブユニットへのＡＴＰシンターゼの内因性インヒビターの結合
    レベルとを比較する工程を包含し、 ここで、変化した結合レベルは、該因子がミトコンドリアＡＴＰ産生を変化さ
    せることを示す、方法。
  2. 【請求項２】 ＡＴＰシンターゼの前記内因性インヒビターがＩＦ１である
    、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＩＦ１が哺乳動物のＩＦ１である、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物のＩＦ１が、マウスＩＦ１、ラットＩＦ１、ウ
    サギＩＦ１、ウシＩＦ１、イヌＩＦ１、非ヒト霊長類ＩＦ１およびヒトＩＦ１か
    らなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ミトコンドリアＡＴＰ産生を変化させる因子を同定するため
    の方法であって、以下： 候補因子の非存在下および存在下で、単離されたＩＦ１ポリペプチドと単離さ
    れたミトコンドリアＡＴＰシンターゼとを接触させる工程であって、ここで、Ａ
    ＴＰシンターゼは、ＡＴＰ産生が起こるのに十分な条件下および時間の間、ＡＴ
    Ｐ合成が可能である、工程；ならびに 該候補因子の存在下でのＡＴＰシンターゼによるＡＴＰ産生のレベルと、該候
    補因子の非存在下でのＡＴＰ産生のレベルとを比較し、それからミトコンドリア
    ＡＴＰ産生を変化させる因子を同定する工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 糖尿病を処置する方法であって、該処置の必要な患者に、（
    ａ）細胞においてミトコンドリアＡＴＰの合成を増大させるか、（ｂ）細胞にお
    いてミトコンドリアＡＴＰの加水分解を減少させるか、または（ｃ）（ａ）と（
    ｂ）の両方を行う有効量の化合物を投与する工程を包含する、方法。
  7. 【請求項７】 前記化合物が、ＩＦ１の１以上の活性を阻害する組成物およ
    びＩＦ１を模倣する組成物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 糖尿病を処置するために有用な因子を同定する方法であって
    、ミトコンドリアを含むサンプルと候補因子とを接触させる工程、および該サン
    プルにおけるＡＴＰ量に対する化合物の効果を決定する工程を包含し、ここで、
    該サンプルにおけるＡＴＰの増加を生じる化合物が、糖尿病の処置のために有用
    な因子として同定される、方法。
  9. 【請求項９】 糖尿病を処置するために有用な因子を同定するための方法で
    あって、ミトコンドリアを含むサンプルと候補因子とを接触させる工程、および
    該ミトコンドリアにおけるＡＴＰ量に対する化合物の効果を決定する工程を包含
    し、ここで、該ミトコンドリアにおけるＡＴＰの増加を生じる化合物が、糖尿病
    の処置のために有用な因子として同定される、方法。
  10. 【請求項１０】 オルガネラを標的化する融合タンパク質であって、以下： （ａ）オルガネラ標的化配列を含む第１のポリペプチド部分であって、ここで
    、該オルガネラ標的化配列は、選択されたオルガネラへのタンパク質の局在化を
    促進し得る、第１のポリペプチド部分； （ｂ）ｔａｔ配列を含む第２のポリペプチド部分；および （ｃ）該第１のポリペプチド部分とも該第２のポリペプチド部分とも異なるア
    ミノ酸配列を有する第３のポリペプチド部分、 を含み、 ここで、該オルガネラを標的化する融合タンパク質は、接触時に細胞によって
    取り込まれ、そして該選択されたオルガネラに優先的に局在化される、オルガネ
    ラを標的化する融合タンパク質。
  11. 【請求項１１】 オルガネラを標的化する化合物であって、以下： （ａ）オルガネラ標的化配列を含む第１のポリペプチド部分であって、ここで
    、該オルガネラ標的化配列は、選択されたオルガネラへのタンパク質の局在化を
    促進し得る、第１のポリペプチド部分； （ｂ）「ｔａｔ配列」を含む第２のポリペプチド部分；および （ｃ）核酸部分、 を含み、 ここで、該オルガネラを標的化する化合物は、接触時に細胞によって取り込ま
    れ、そして該選択されたオルガネラに優先的に局在化される、オルガネラを標的
    化する化合物。
  12. 【請求項１２】 前記核酸部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、
    リボザイム、発現カセット、発現構築物およびペプチド核酸からなる群から選択
    される、請求項１１に記載のオルガネラを標的化する化合物。
  13. 【請求項１３】 検出可能な標識をさらに含む、請求項１０または１１のい
    ずれかに記載のオルガネラを標的化する化合物。
  14. 【請求項１４】 前記選択されたオルガネラがミトコンドリアであり、かつ
    前記オルガネラを標的化する配列がミトコンドリア標的化配列である、請求項１
    ０または１１のいずれかに記載のオルガネラを標的化する化合物。
  15. 【請求項１５】 前記ミトコンドリア標的化配列が、配列番号１０、１１お
    よび１４からなる群から選択される、請求項１４に記載のオルガネラを標的化す
    る化合物。
  16. 【請求項１６】 前記選択されたオルガネラがゴルジ体であり、かつ前記オ
    ルガネラを標的化する配列がゴルジ標的化配列である、請求項１０または１１の
    いずれかに記載のオルガネラを標的化する化合物。
  17. 【請求項１７】 前記選択されたオルガネラが核であり、かつ前記オルガネ
    ラを標的化する配列が核標的化配列である、請求項１０または１１のいずれかに
    記載のオルガネラを標的化する化合物。
  18. 【請求項１８】 前記選択されたオルガネラが葉緑体であり、かつ前記オル
    ガネラを標的化する配列が葉緑体標的化配列である、請求項１０または１１のい
    ずれかに記載のオルガネラを標的化する化合物。
  19. 【請求項１９】 前記選択されたオルガネラが小胞体であり、かつ前記オル
    ガネラを標的化する配列がＥＲ標的化配列である、請求項１０または１１のいず
    れかに記載のオルガネラを標的化する化合物。
  20. 【請求項２０】 細胞のオルガネラに、オルガネラを標的化する融合タンパ
    ク質を送達する方法であって、該細胞と、請求項１０に記載のオルガネラを標的
    化する融合タンパク質とを接触させる工程を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 オルガネラを標的化する融合タンパク質をコードする発現
    構築物であって、ここで、該オルガネラを標的化する融合タンパク質は、以下： （ａ）オルガネラを標的化する配列を含む第１のポリペプチド部分であって、
    ここで、該オルガネラを標的化する配列は、選択されたオルガネラへのタンパク
    質の局在化を促進し得る、第１のポリペプチド部分； （ｂ）ｔａｔ配列を含む第２のポリペプチド部分；および （ｃ）該第１のポリペプチド部分とも該第２のポリペプチド部分とも異なるア
    ミノ酸配列を有する第３のポリペプチド部分、 を含み、 ここで、該オルガネラを標的化するタンパク質は、接触時に細胞によって取り
    込まれ、そして該選択されたオルガネラに優先的に局在化される、発現構築物。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の発現構築物を含む、宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 オルガネラを標的化する融合タンパク質を産生する方法で
    あって、請求項２２に記載の宿主細胞を培養する工程、および該オルガネラを標
    的化する融合タンパク質を該宿主から回収する工程を包含する、方法。
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