KR101956302B1 - 세포 내부 pH 감응성 융합 펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 - Google Patents
세포 내부 pH 감응성 융합 펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 Download PDFInfo
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
Abstract
본 발명에 따른 pH 감응성 융합 펩티드는 2 내지 15 개를 포함하는 아르기닌 잔기를 포함하는 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드와 베타-시트 형성 단편으로 인하여, pH 변화에 따라 구조적 변화를 갖는다. 이러한 구조적 변화로 인하여, 상기 융합 펩티드의 항프리온 활성과 세포 독성 능력을 적제 적소에 사용할 수 있도록 제어할 수 있다.
Description
본 발명은 세포 내부 pH 감응성 융합 펩티드, 및 이를 유효성분으로 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
아밀로이드는 주로 크로스 베타-시트의 2차 구조를 가지는 단백질이 섬유상 구조를 형성하고, 콩고 레드, 티오플라빈 T와 같은 아밀로이드 특이 염료를 이용했을 때 복굴절 혹은 형광을 내며, 수용액에 있어서 불용성을 나타내는 단백질 응집체이다 (Murphy, R.M., Annu. Rev. Biomed. Eng., 4:155, 2002). 아밀로이드의 형성은 기본적으로 단백질의 1차 구조에는 변함없이 2차, 3차 구조의 변화가 생기도록 하는 비정상 접힘 현상에 의해 일어나는데, 이렇게 형성된 아밀로이드 원섬유 침착이 조직 손상을 유도한다. 이러한 아밀로이드는 알츠하이머병, 프리온 관련 뇌병증, 해면상 뇌중, 파킨슨병, 원발 전신 아밀로이드증, 제2형 당뇨병, 가족성 아밀로이드 중 및 경쇄 아밀로이드증(light-chain amyloidosis)를 포함하는 여러 가지 질병과 관련이 있다.
최근에서야 아밀로이드에 관한 연구가 광범위하게 이루어지게 되었고, 아밀로이드성 단백질의 침착과 퇴행성 신경질환의 관계를 규명하기 위해 아밀로이드성 단백질의 비정상 접힘 현상 및 이에 의한 세포 독성에 관한 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 그러나 아직까지도 알츠하이머병이나 프리온 질환과 같은 질환을 치료할 수 있는 치료제는 개발되지 않은 상태이다.
즉, 아밀로이드와 관련된 질환은 단백질 미스폴딩으로부터 비롯되는 것으로, 발병요인이 전혀 다른 종래의 질환들과 달리 명확한 인지부위나 결합영역(binding pockets)이 존재하지 않기 때문에, 종래 약물 개발방법으로는 치료제 개발에 한계가 있다.
일예로 SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 증가 메커니즘에서, 이를 억제하기 위한 방법을 찾는 등(특허문헌 1), 아밀로이드 응집체를 형성하는 다양한 기전에 대하여, 이의 억제력을 발휘할 수 있는 억제제가 개발되어 왔으나, 이는 단지 종래의 방법에 따라 어느 하나의 단분자종에 대해서만 효과를 가질 뿐이라는 문제점이 존재한다.
이에 본 발명자들은 자기조립된 펩티드 나노구조체를 이용하여 다양한 아밀로이드 응집체 또는 프리온과 같은 단백질 미스폴딩에 대한 억제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 세포 외 중성 조건에서는 세포 독성 및 항프리온 활성을 거의 나타내지 않다가, 세포 내로 엔도시토시스 과정을 통해 유입되면, 엔도솜 및 리소좀의 산성에서 구조적 변화를 통해 약리 효과를 갖는 소낭 형태의 나노구조체로 형성되는 것을 특징으로 하는 융합 펩티드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합 펩티드를 유효성분으로 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개를 포함하는 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드; 및 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편;을 포함하는 융합 펩티드를 제공한다.
[화학식 1]
-(-X1-X2-X3-X4-)n-
상기 화학식에서,
상기 X1, X3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 소수성을 띄는 방향족 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X2는 양전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X4는 음전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이다.
상기 n은 1 내지 10의 정수이다.
상기 화학식 1에서 X1과 X3은 서로 동일하고, 페닐알라닌 또는 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 화학식 1에서 X2와 X4는 서로 상이하고, 상기 X2가 라이신이면, 상기 X4는 아스파트산 또는 글루탐산일 수 있다.
상기 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드는 Tat 펩티드이거나, 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개로 이루어진 올리고 아르기닌 펩티드일 수 있다.
상기 융합 펩티드는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
가장 바람직하게 상기 융합 펩티드는 서열번호 1 내지 12로 표시되는 것일 수 있다.
상기 융합 펩티드는 산성 조건(pH 2 내지 pH 6)에서, 베타 시트 형성 단편의 소수성 상호작용과 정전기적 결합으로 융합 펩티드 간의 자기조립화를 통해 나노구조체를 형성하는 것일 수 있다.
상기 나노구조체는 소낭 형태의 3차 구조를 갖는 것일 수 있다.
상기 융합 펩티드는 pH 9.0 내지 12 조건에서는 베타 시트 형성 단편의 소수성 상호작용과 정전기적 결합으로 융합 펩티드 간의 자기조립화를 통해 아밀로이드 섬유 형태의 3차 구조를 갖는 나노구조체를 형성하고, 상기 섬유 형태의 나노구조체는 pH 변화에도 안정적인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 융합 펩티드를 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환은 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 뇌허혈(brain ischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis) 및 크로이츠펠트-야콥병, 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathy), 전염성 해면양뇌증(transmissible spongiform encephalopathy)과 같은 프리온 질병(prion disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환은 치매 또는 광우병인 것일 수 있다.
상기 조성물은 세포 내 함입 조건인 pH 2.0 내지 6.0 조건에서 소낭 형태의 나노구조체를 형성하고, 항프리온 활성과 세포 독성이 증가하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 pH 감응성 융합 펩티드는 2 내지 15 개를 포함하는 아르기닌 잔기를 포함하는 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드와 베타-시트 형성 단편으로 인하여, pH 변화에 따라 구조적 변화를 갖는다. 이러한 구조적 변화로 인하여, 상기 융합 펩티드의 항프리온 활성과 세포 독성 능력을 적제 적소에 사용할 수 있도록 제어할 수 있다.
다시 말해 본 발명의 융합 펩티드는 세포 내 엔도시토시스 과정을 통해 세포 내 엔도솜 또는 리소좀에 함입되고, 상기 엔도솜과 리소좀의 산성조건에서 항프리온 활성을 갖는 소낭 형태의 나노구조체로 자기조립됨으로써, 상기 엔도솜과 리소좀에 존재하는 프리온 단백질(PrPC)이 감염성 프리온 단백질(PrPSC)로 변형되지 않도록 하거나, 응집되지 않도록 하여 예방 또는 치료 효과를 높일 수 있다.
따라서 본 발명의 융합 펩티드는 세포 외의 중성 조건에서는 항프리온 활성을 나타내지 않다가, 세포 내로 이입되면, pH 에 따른 구조적 변화를 통해 상술한 활성을 나타냄으로써, 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1, 도 2a 및 도 2b는 본 발명에 따른 융합 펩티드의 매커니즘을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1, 실시예 2로부터 제조된 융합 펩티드와 비교예 1로부터 제조된 단분자 펩티드로 처리된 ScN2a 세포에서 단백질분해효소 K에 대해 내성을 갖는 PrPSC를 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 1, 실시예 2의 융합 펩티드와 비교예 1의 단분자 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 5는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 6은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 7은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 다시 pH를 7.4로 조절한 후 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)의 펩티드로 처리한 ScN2a 세포 내에서 단백질 가수분해효소 K에 내성을 갖고 있는 PrPSC에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도면의 상단에 표시한 숫자는 해당 융합 펩티드의 농도(nM)이다.
도 9는 밀도측정을 통해 도 8의 결과를 PrPSC 상대농도로 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)으로부터 합성된 펩티드의 ScN2a 세포에 대한 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 음성염색 TEM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 5일 때(b), pH 7일 때(c), pH 11일 때(d)의 실시예 3의 융합 펩티드를 음성염색 TEM으로 촬영한 이미지이다. 이때 pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. bar는 1 ㎛이다.
도 12는 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 AFM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 7일 때(b), pH 11일 때(c)의 실시예 3의 융합 펩티드를 AFM으로 촬영한 이미지이다.
도 13은 pH 3에서 소낭형태로 자기조립된 실시예 3의 융합 펩티드의AFM 이미지와 이로부터 길이(width(㎚))에 따른 높이(height(㎚))를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 pH에 따른 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 15는 pH 7에서 pH 5로 변화시켰을 때(초록색)와, pH 11에서 pH 7, pH 5, pH 3으로 순차적으로 변화시켰을 때(푸른색)의 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 16은 실시예 3 중에서 나노구조체로 형성되지 않은 pH 7의 R12-β UNS로 처리한 ScN2a 세포를 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다. 화살표는 R12-β 소낭을 가리킨다.
도 17은 실시예 4의 융합 펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 측정 그래프로, A = 0.066, ε = 1146, DF = 2 C = 115 uM(1 mL)이고, M.W.cal는 4147 g/mol이며 M.W. meas.는 4165.288 g/mol로 측정되었다.
도 18은 실시예 5의 융합 펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 측정 그래프로, A = 0.163, ε = 1146, DF = 2 C = 284 uM(1 mL)이고, M.W.cal는 4303 g/mol이며 M.W. meas.는 4319.148 g/mol로 측정되었다.
도 3은 실시예 1, 실시예 2로부터 제조된 융합 펩티드와 비교예 1로부터 제조된 단분자 펩티드로 처리된 ScN2a 세포에서 단백질분해효소 K에 대해 내성을 갖는 PrPSC를 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 1, 실시예 2의 융합 펩티드와 비교예 1의 단분자 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 5는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 6은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 7은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 다시 pH를 7.4로 조절한 후 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)의 펩티드로 처리한 ScN2a 세포 내에서 단백질 가수분해효소 K에 내성을 갖고 있는 PrPSC에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도면의 상단에 표시한 숫자는 해당 융합 펩티드의 농도(nM)이다.
도 9는 밀도측정을 통해 도 8의 결과를 PrPSC 상대농도로 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)으로부터 합성된 펩티드의 ScN2a 세포에 대한 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 음성염색 TEM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 5일 때(b), pH 7일 때(c), pH 11일 때(d)의 실시예 3의 융합 펩티드를 음성염색 TEM으로 촬영한 이미지이다. 이때 pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. bar는 1 ㎛이다.
도 12는 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 AFM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 7일 때(b), pH 11일 때(c)의 실시예 3의 융합 펩티드를 AFM으로 촬영한 이미지이다.
도 13은 pH 3에서 소낭형태로 자기조립된 실시예 3의 융합 펩티드의AFM 이미지와 이로부터 길이(width(㎚))에 따른 높이(height(㎚))를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 14는 pH에 따른 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 15는 pH 7에서 pH 5로 변화시켰을 때(초록색)와, pH 11에서 pH 7, pH 5, pH 3으로 순차적으로 변화시켰을 때(푸른색)의 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 16은 실시예 3 중에서 나노구조체로 형성되지 않은 pH 7의 R12-β UNS로 처리한 ScN2a 세포를 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다. 화살표는 R12-β 소낭을 가리킨다.
도 17은 실시예 4의 융합 펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 측정 그래프로, A = 0.066, ε = 1146, DF = 2 C = 115 uM(1 mL)이고, M.W.cal는 4147 g/mol이며 M.W. meas.는 4165.288 g/mol로 측정되었다.
도 18은 실시예 5의 융합 펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 측정 그래프로, A = 0.163, ε = 1146, DF = 2 C = 284 uM(1 mL)이고, M.W.cal는 4303 g/mol이며 M.W. meas.는 4319.148 g/mol로 측정되었다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
일반적으로, 단백질의 미스폴딩은 정상 단백질 기능의 소실을 야기할 뿐만 아니라, 비정상적 단백질이 세포 내에서 축적됨으로써 독성을 일으키며, 이에 의해 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 암, 낭포성 섬유증, 제2 형 당뇨병과 같은 여러 질병이 초래되는 것으로 알려져 왔다. 단백질의 미스폴딩에 관련한 연구에 있어서, 항-아밀로이드 화합물의 종류 중 하나인 콩고 레드 등은 단백질 미스폴딩에 의한 피브릴 형성을 막는 효과가 있음이 공지된 바 있으나, 신체 독성이 크고, 미스폴딩된 단백질의 전이를 억제하는 효과는 없다는 단점이 있으며, 무엇보다 단백질 미스폴딩 보다 어느 특정된 단백질의 피브릴 형성을 억제하는 것일 뿐이라는 점에서 한계가 존재한다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 세포 내에서 합성된 단백질이 외부로 방출되기 전, 세포 내 엔도솜 및 리소좀에서 단백질 미스폴딩을 억제하거나, 응집을 저해하여 변형된 단백질의 생성을 억제할 수 있는 융합 펩티드를 제공하고자 하였다.
특히, 본 발명에 따른 융합 펩티드는 세포 외 중성 조건에서는 세포 독성이 현저히 낮을 뿐만 아니라, 항프리온 활성도 거의 나타나지 않아, 그 자체로 인체에 안정하게 사용할 수 있다.
이러한 융합 펩티드는 엔도시토시스 과정을 통해 세포 내 엔도솜 및 리소좀으로 함입되게 되고, 엔도솜 및 리소좀의 약산성 조건에 노출되게 되어 소수성 상호작용과 정전기적 결합을 통해 소낭 형태의 나노구조체로 자기조립됨으로써, 항프리온 활성이 증가하게 된다. 상기 엔도솜 또는 리소좀과 같은 세포질 소포(cytoplasmic vesicle)는 정상 프리온 단백질에서 병원성 프리온 단백질로, 단백질의 미스폴딩(즉, 변성)이 일어날 것으로 예측되는 세포 내 장소이다.
따라서, 본 발명에 따른 융합 펩티드가 상기 세포 내 장소(엔도솜 또는 리소좀)에서만 특이적이고 선택적으로 항프리온 활성을 갖는 소낭 형태의 나노구조체로 자기조립화를 통해 변형되어 단백질의 미스폴딩 또는 응집이 형성되지 않도록 함으로써, 단백질 미스폴딩 또는 응집과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다할 수 있다.
게다가 본 발명에 따른 융합 펩티드를 실제로 세포에 적용하였을 때, 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서, 세포로부터 병원성 프리온 단백질(PrPSC)의 발현을 현저히 저하시킨 것을 확인한 바 있다.
본 발명의 일 측면은 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개를 포함하는 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드; 및 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편;을 포함하는 융합 펩티드에 관한 것이다.
[화학식 1]
-(-X1-X2-X3-X4-)n-
상기 화학식에서,
상기 X1, X3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 소수성을 띄는 방향족 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X2는 양전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X4는 음전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이다.
상기 n은 1 내지 10의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개를 포함하는 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드는 아르기닌-리치 친수성 단편(arginine-rich hydrophilic segment)으로, 세포 내 엔도시토시스(endocytosis)를 거쳐 세포를 파괴하지 않고 세포 내로 들어갈 수 있는 성질을 갖는다. 다만 상기 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드의 양전하 크기와 비례하여 세포독성을 갖는 문제가 있어, 상기 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드만으로는 충분한 약학적 효과를 얻을 수 없다는 문제가 있다.
또한 상기 세포투과성 펩티드는 상기 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드는 Tat 펩티드이거나, 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개로 이루어진 올리고 아르기닌 펩티드일 수 있는데, 바람직하게는 상기 세포 투과성 펩티드는 6 내지 15개로 이루어진 올리고 아르기닌 펩티드일 수 있다.
왜냐하면 상기 세포 투과성 펩티드가 5개 이하로 이루어지거나, 아르기닌 잔기 외에 다른 양전하성 펩티드를 포함할 경우, pH 변화에 따른 자기조립화를 통한 안정된 구조적 변화가 유도되지 못할 수 있기 때문에, 최소한 5 개 이상의 아르기닌 잔기로 이루어진 것이 바람직하다. 한편 상기 세포 투과성 펩티드가 아르기닌 잔기 15 개를 초과하여 이루어질 경우 과도하게 높은 전하를 형성하게 되어, 아르기닌 펩티드 간에 β-시트 형성 단편에서 발생한 인력보다 훨씬 강한 정전기적 척력이 발생하기 때문에 약산성 조건 하에서 자기조립이 어려워진다.
일 예로, 본 발명에서의 세포 투과성 펩티드는 다음과 같은 화힉식 2일 수 있다.
[화학식 2]
-[Arg]m-
상기 화학식에서, 상기 m은 6 내지 15이다.
이처럼, 아르기닌으로 이루어진 세포투과성 펩티드는 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편과 결합하여 pH 조건에 따라 베타 시트 상호작용(정전기적 결합 및 소수성 상호작용)을 통해 자기조립될 수 있는 블록 코폴리펩티드 형태의 융합 펩티드로 형성된다. 이의 구조는 다음 도 2에 나타내었다.
다음, 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편은 소수성이면서 방향족 작용기를 갖는 아미노산 잔기와 양전하 또는 음전하를 띄는 아미노산 잔기가 서로 교차되어 형성된 것으로, 이에 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 다음과 같다.
[화학식 1]
-(-X1-X2-X3-X4-)n-
상기 화학식에서,
상기 X1, X3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 소수성을 띄는 방향족 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X2는 양전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X4는 음전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이다.
상기 n은 1 내지 10의 정수이다.
상기 β-시트 형성 단편은 소수성이면서 방향족 잔기를 갖는 아미노산과 전하를 갖는 아미노산이 서로 교차되어 형성된 것이면 특별히 제한되지 않는다. 이에 대해 아래에서 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 융합 펩티드는 앞서 설명한 효과를 얻기 위하여 중성조건(pH 6.0-9.0)에서 단분자(unimolecular) 형태와 같이 구조화되지 않은 형태로 존재해야하고, 세포 내 엔도솜 또는 리소좀의 약산성(pH 2-5.5) 조건에서 특이적으로 반응하여 소낭 형태의 나노구조체로 구조적 변화를 가져야 한다(도 1 및 도 2 참조).
도 1, 도 2a 및 도 2b에서 노란색 화살표 부분은 β-시트 형성 단편이고, 붉은 색 원뿔형 부분은 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드를 의미한다.
이러한 구조를 형성함에 있어서, 약산성 조건에 노출되면 상기 적어도 하나 이상의 융합 펩티드가 소수성 상호작용과 정전기적 결합을 통해 자기조립화하여 소낭 형태의 나노구조체를 형성하게 된다. 구체적으로 상기 선형의 융합 펩티드의 β-시트 형성 단편과 다른 융합 펩티드의 β-시트 형성 단편이 비평행 구조로, 소수성 상호작용과 정전기적 결합에 의해 결합되고, 상기 결합된 융합 펩티드 단위구조(도 1의 ② 참조)는, 서로 간의 소수성과 친수성에 따라 정렬되고 배열되어 속이 빈 중공형의 입자 형태 즉, 소낭 형태의 나노구조체를 형성하게 된다. 다만 상기 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드와 β-시트 형성 단편의 상호작용 간의 정전기적 인력과 척력에 의해서 중성 조건(pH 6.0-9.0)에서는 구조를 형성하지 못하고, 오직 산성 또는 약산성(pH 2-5.5)에서 소낭 형태의 나노구조체로 자기조립화된다.
이때, 상기 융합 펩티드는 염기성 조건(pH 10-12)에서도 자기조립화를 통해 특정 형태의 나노구조체를 형성할 수 있는데, 아밀로이드와 같은 섬유 형태의 나노구조체이며, 이러한 구조의 나노구조체로 형성되면 엔도솜 또는 리소좀으로 세포내 이입이 되더라도 단백질 미스폴딩 또는 응집을 억제하거나 저해하는 활성을 나타내지 않는다.
아울러, 섬유형태의 나노구조체로 형성된 경우, 이후 pH를 변화시켜 주더라도 구조적 변화가 나타나지 않는 비가역적 구조임을 알 수 있다.
본 발명에서 적어도 하나 이상의 β 시트 형성 단편 간의 결합에서 "비평행(antiparallel) 구조"란, 결합하는 β 시트 형성 단편이 수소 결합으로 고정되었을 때 상기 β 시트 형성 단편 중 어느 하나가 N 말단에서 C 말단의 방향(N->C)으로 위치하고, 상기 β 시트 형성 단편과 결합하는 다른 β 시트 형성 단편은 이와 반대방향(C<-N)으로 놓인 것을 의미한다(도 1에서 노란색 화살표 부분 참조).
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열의 β-시트 형성 단편은, 모두 앞서 설명한 바와 같이 이웃하는 β-시트 형성 단편과 소수성 상호작용 및 정전기적 결합을 형성할 수 있다.
구체적으로 상기 소수성을 띄는 방향족 아미노산 잔기는 페닐알라닌(Phe) 또는 트립토판(Trp)일 수 있고, 상기 양전하를 띄는 아미노산 잔기는 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 라이신(Lys)일 수 있으며, 상기 음전하를 띄는 아미노산 잔기는 아스파트산(Asp) 또는 글루탐산(Glu)일 수 있다.
적어도 하나 이상의 융합 펩티드의 결합함에 있어서, 상기 융합펩티드와 이웃하는 다른 융합 펩티드의 β-시트 형성 단편의 결합관계는 상기 페닐알리닌 또는 트립토판으로 인한 소수성 상호작용과, 양전하를 띄는 아미노산 잔기의 +로 하전된 암모늄 이온과 음전하를 띄는 아미노산 잔기의 +로 하전된 카복실기 이온으로 인한 정전기적 결합에 의해 형성된다. 이러한 결합은 pH 4.5~5.5 일 때 결합력이 최대가 된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 화학식 1에서 X1과 X3은 서로 동일하고, 페닐알라닌 또는 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드와의 적절한 인력과 척력의 균형을 유지하기 위하여 상기 화학식 1에서 X2와 X4는 서로 상이하고, 상기 X2가 라이신이면, 상기 X4는 아스파트산 또는 글루탐산인 것이 바람직하다.
상기 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드와 β-시트 형성단편은 직접 결합된 것일 수 있고, 아니면 링커를 통해 연결된 것일 수 있다.
상기 링커는 글리신으로 이루어진 아미노산((G)n), 글리신-세린으로 이루어진 아미노산(예컨대 (GS)n, (GSGS)n 및 (GGGS)n을 포함하며 상기 n은 적어도 한 개의 정수), 글리신-알라닌으로 이루어진 아미노산, 알라닌-세린으로 이루어진 아미노산, 쉐이커 포타슘 채널을 위한 테더(tether) 및 ahx와 같은 다른 플렉서블 링커일 수 있다. 다만, 글리신이 알라닌 보다 더 phi-psi 공간을 유효하게 접근할 수 있고 장쇄를 가진 다른 아미노산 잔기들보다 덜 제한적이기 때문에 글리신으로 이루어진 아미노산이 가장 바람직하다. 또한 세린은 친수성이므로 구형의 글리신 체인을 용해할 수 있으므로 글리신-세린으로 이루어진 아미노산으로 이루어진 플렉서블 링커가 가장 바람직하다. 또한 상기 ahx는 6-아미노헥산산 즉 (CH2)6-NH2를 나타낸다.
상기 융합 펩티드는 서열번호 1 내지 12 중에서 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 융합 펩티드의 매커니즘을 나타낸 도면이다.
도 2에 나타난 바와 같이 산성 조건(pH 2-5.5)에서 글루탐산 잔기가 양성자화되어 카르복실산 음이온이 소수성이 더 큰 카르복실산으로 전환되고, 그로 인해 자기조립화하는 과정에 소낭형태의 나노구조체를 형성하게 된다. 구체적으로 융합 펩티드가 소낭형태의 나노구조체로 구조적 변화하는 것은, β-시트의 자기조립 부분의 소수성이 증가되고, 그 결과 소수성 블록이 차지하는 부피가 증가하게 되었기 때문이다.
즉, 본 발명에 따른 융합 펩티드를 생체 내 또는 생체 외의 세포로 투여하는 과정에 있어서, pH 7.4 하에서 본 발명에 따른 융합 펩티드가 투여되면, 상기 융합 펩티드는 구조화되지 않거나 불안정한 응집체를 형성하고, 그로 인해 낮은 세포독성을 갖게 된다. 이러한 구조화되지 않거나 불안정한 응집체를 형성한 융합 펩티드들은 엔도시토시스를 통해 세포 내로 진입하게 되고, 엔도시토시스 경로에 따른 pH 감소(초기 엔도섬 : pH 6.0~6.5, 후기 엔도솜 및 리소좀 : pH 4.5~5.5)로 인해 상기 융합 펩티들이 자기조립화를 통해 소낭형태의 나노구조체를 형성하게 된다. 후술하는 실험예를 통해서 본 발명의 융합 펩티드가 세포 내에서 자기조립화하여 소낭형태의 나노구조체를 형성하였음을 확인하였다. 상기 융합 펩티드가 소낭형태의 나노구조체로 변환되면 유효 분자량과 전하밀도가 증가하게 되어, 아르기닌 잔기 만으로 이루어진 폴리머보다 4.5배 높은 항프리온 활성을 나타내게 된다.
단백질 미스폴딩에 의해 유도되는 다양한 질환과 관련된 프리온의 변환과 PrPSC의 성숙은 엔도솜/리소좀 내부에서 진행되기 때문에, 상기 본 발명에 따른 융합 펩티드가 세포 내(특히 엔도솜과 리소좀 내)에서 소낭 형태의 나노구조체를 형성함으로써, 생체 외에서는 세포독성도 낮고 항프리온 활성도 낮은 상태로 존재하다가, 엔도솜과 리소좀 내에서만 강한 항프리온 활성을 나타낸다.
이와 대조적으로 상기 융합 펩티드를 염기성 조건(pH 10-12)으로 처리할 경우 아밀로이드와 유사한 구조로 자기조립화되어 나노구조체를 형성하기 때문에, 엔도시토시스 과정에서 나노구조의 변화에 대해 내성을 가지고 있으며, 생체 내, 외 모두에서 중간 정도의 세포 독성과 항프리온 활성을 나타낸다. 상기 아밀로이드의 섬유 형태의 나노구조체는 비가역적 구조로, pH 변화에 대해 구조적 안정성을 갖는다.
도 2a에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 융합 펩티드(붉은 색은 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드이고, 노란색 화살표는 β-시트 형성 단편을 의미한다)는 자기조립을 통해 서로 베타 시트 부분이 비평행하게 배열되어 결합되고, 이렇게 결합된 구성단위가 소낭의 면을 형성하게 된다. 이때, 적색으로 표기된 아르기닌 잔기로 이루어진 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드가 외부로 향하고, 베타시트가 막의 내측에 위치한다. 이러한 형태의 분자 배열 및 분자 정렬은 분자 정렬밀도와 전하밀도를 극대화한다.
상기 융합 펩티드는 앞서 설명한 바와 같이, 세포의 외부 조건에서는 항프리온 활성을 나타내지 않으며, 세포 독성도 거의 발현되지 않으므로, 이로 인한 부작용을 피할 수 있다.
게다가 상기 융합 펩티드는 별도의 약물을 포함하지 않음에도 불구하고 단백질의 미스폴딩이나 단백질의 비정상적인 응집을 억제하고 방지하는 효과를 나타내므로, 매우 효율적이다. 상기 융합 펩티드를 합성하기만 하면 자기조립 과정을 통해 약산성 조건에서 특이적이고 선택적으로 소낭 형태의 나노구조체로 제조되며, 상기 완성된 소낭 형태의 나노구조체는 중공형의 입자 형태로, 이중층의 단일막으로 이루어져 외부에는 양전하를 띄는 세포 투과성 펩티드가 노출되어 있고, 막의 내측에 β-시트 형성 단편이 위치한다. 이러한 형태의 나노구조체는 항프리온 활성이 일반 아르기닌 잔기로만 이루어진 펩티드 또는 펩티드 폴리머보다 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 융합 펩티드는 산성 또는 약산성 조건(pH 2-5.5)하에서 + 38 내지 + 40 mV이고, 중성 조건(pH 6.0 내지 9.0)에서는 + 22 내지 +26 mV이며, 염기성 조건(pH 10.0 내지 12.0)에서는 + 28 내지 +32 mV였다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 융합 펩티드를 포함하는 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물은 아르기닌 잔기가 2 내지 15 개를 포함하는 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드; 및 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편;을 포함하는 융합 펩티드를 유효성분으로 함유한다.
[화학식 1]
-(-X1-X2-X3-X4-)n-
상기 화학식에서,
상기 X1, X3은 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 소수성을 띄는 방향족 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X2는 양전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이며,
상기 X4는 음전하를 띄는 아미노산 잔기 중 선택되는 어느 하나이다.
상기 n은 1 내지 10의 정수이다.
상기 융합 펩티드에 대해서 설명함에 있어서, 상술한 설명과 동일한 내용은 생략하기로 한다.
상기 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환은 프리온 단백질의 변형 또는 응집을 원인으로 하는 광우병 등의 질병 또는 질환 뿐만 아니라, 단백질 응집으로 인한 다른 질병(예를 들어, 알츠하이머 병을 유발하는 베타아밀로이드, 타우 단백질, 파킨슨병을 유발하는 알파시누클레인, 전두측두엽변성 및 근위축측삭경화와 관련된 TDP-43 단백질) 등을 포함할 수 있는데, 구체적으로 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 인간의 쿠루병 (KURU), 뇌허혈(brain ischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥 질병 (Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD), 변형크로이츠펠트-야콥 질병 (Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD), 의원성 크로이츠펠트-야콥 질병 (iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease, iCJD), 가족성 크로 이츠펠트-야콥 질병 (Familial Creutzfeldt-Jakob disease, fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병 (Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병 (Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome, GSS), 치명적 가족성 불면증 (Fatal Familial Insomnia, FFI), 치명적 산발성 불면증 (sporadic fatal insomnia, sFI), 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathy), 전염성 해면양뇌증(transmissible spongiform encephalopathy)과 같은 프리온 질병(prion disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
보다 바람직하게 상기 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환은 프리온 질병일 수 있는데, 상기 프리온 질병은 인간의 쿠루병 (KURU), 뇌허혈(brain ischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥 질병 (Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD), 변형크로이츠펠트-야콥 질병 (Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD), 의원성 크로이츠펠트-야콥 질병 (iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease, iCJD), 가족성 크로 이츠펠트-야콥 질병 (Familial Creutzfeldt-Jakob disease, fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병 (Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병 (Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome, GSS), 치명적 가족성 불면증 (Fatal Familial Insomnia, FFI), 치명적 산발성 불면증 (sporadic fatal insomnia, sFI), 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathy), 전염성 해면양뇌증(transmissible spongiform encephalopathy), 알츠하이머병 및 광우병 등을 포함할 수 있다.
프리온(prion)은 기존의 병원체와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산 없이 감염성 질환을 일으키는 특징을 갖는다. 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌의 신경세포의 사멸을 일으켜 퇴행성 신경질환을 유발한다고 알려져 있다. 이러한 프리온 단백질에 의해 유발된 질환은 정상적인 프리온 단백질(PrPC)이 비정상적인 형태인, 변형 프리온 단백질(PrPSC)에 의한 것이다.
본 발명은 융합 펩티드는 세포 외부 조건에서는 세포독성과 항프리온 활성을 나타내지 않고 있다가, 엔도시토시스 과정을 통해 세포 내 엔도솜 또는 리소좀 내에 유입되게 되면 소낭 형태의 나노구조체로 구조가 변화되어, 우수한 항프리온 활성을 나타내게 된다. 즉, 상기 세포 내 엔도솜 또는 리소좀에서 상기 융합 펩티드로부터 형성된 나노구조체가 프리온 단백질의 비정상적인 응집 또는 변형을 효과적으로 저해 및 억제하여, 변형 프리온 단백질의 생성을 효과적으로 방지함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 융합 펩티드는 단백질 특히, 프리온 질병의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 인체에 안전하게 사용할 수 있다.
특히 본 발명의 융합 펩티드는 엔도솜 또는 리소좀에서의 프리온 단백질의 비정상적인 응집 또는 변형에 의한 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 엔도시토시스에 의해 세포의 엔도솜 또는 리소좀으로 함입되고, 상기 엔도솜 또는 리소좀의 pH 2.0 내지 5.5 조건하에서 소낭 형태의 나노구조체를 형성하고, 항프리온 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 융합 펩티드를, 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 특히 세포 내의 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 프리온 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩에 의해 유도된 질환(구체적으로 알츠하이머병 또는 크로이츠펠트-야콥 질병)을 억제하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물은, 상기 융합 펩티드를 0.001 내지 2000 ㎍/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 융합 펩티드는 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 융합 펩티드의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
또 다른 구현예에 따르면, 상기 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩과 관련된 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물은 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. '비경구'란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제될 수 있다.
본 발명의 주사가능한 조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다.
예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두 개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.
이 때, 조성물의 투여 값은 치료되는 질병, 질환 또는 병의 유형 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 임의의 특정 피검체에 대하여, 특정 용량 섭생이 개개인의 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 함을 추가로 이해해야 한다. 생체내 투여는 세포 배양에서의 시험관내 방출 연구 또는 생체내 동물 모델에 기초할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 단백질 특히 세포 내 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 프리온 단백질의 비정상적인 응집 또는 변형을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 단백질 특히 세포 내 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 프리온 단백질의 비정상적인 응집 또는 변형이 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 상기 융합 펩티드는 감압 증류 및 동결건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 펩티드는 광의로는 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 가공물, 예컨대, 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 융합 펩티드로 실험을 진행하긴 하였으나, 융합 펩티드의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
세포배양.
배양접시(직경 100mm, Corning, 미국) 내에서 4~5일 간격으로 계대배양하였다. 프리온 물질과 관련된 실험은 BL-2 시설 내에서 수행하였다.
ScN2a세포는 문헌에 기재된 방법에 따라 배양하였다 간략하게 설명하면.,스크래피 프리온에 의해 영구 감염된 ScN2a 세3포주를 10% 우태아혈청(FBS, 미국)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, 미국) 및 1% n, 미국)를 포함하는, 글루코스 함량이 높은(4.5 g/L) DMEM 배지(Invitrogen, 미국) 내에서 성장시켰다. 이어, 세포들을 37 ℃에서 5% CO2 및 포화 습도 조건에서 인큐베이션하였다. 세포들을 배양접시(직경 100 mm, Corning, 미국 ) 내에서 4~5일 간격으로 계대배양하였다. 프리온 물질과 관련된 실험은 BL- 2 시설 내에서 수행하였다.
실시예
1 내지 3. 자기조립 융합 펩티드 합성.
Fmoc-아미노산과 커플링 시약(coupling reagent)은 각각 Novabiochem(Germany)와 Anaspec(USA)로부터 구입한 것을 사용하였다. 일반적인 화학시약은 Sigma-aldrich(USA)와 Merck(Germany)로부터 구입한 것을 사용하였다.
펩티드는 표준 Fmoc 프로토콜에 따른 표준 아미노산-보호기를 갖는 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem, Germany)을 사용하여, Triute 펩티드 합성기(Protein Technologies, USA)를 통해 표 1에 나타난 바와 같은 각각의 서열번호를 갖는 자기조립 펩티드를 합성하였다.
상기 레진으로부터 분리(cleavage)하고 탈보호하기 위하여, 상기 합성된 펩티드가 결합되어 있는 레진에 분리 칵테일(cleavage cocktail)[trifluoroacetic acid(TFA)/triisopropylsilane(TIS)/water](95:2.5:2.5)을 3 시간동안 처리한 다음, tert-butyl methyl ether로 고체화(trituration)하고, 이를 역상HPLC(reverse-phase HPLC)(0.1% TFA를 포함하는 water-acetonitrile)로 정제하였다.
상기 펩티드의 분자량(molecular weight)을 확인하기 위하여, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석기(mass spectrometry)(Microflex LRF20, Bruker, Germany)를 사용하였다. 이때 α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)를 매트릭스로 사용하였다. 상기 과정을 통해 합성된 펩티드 농축(concentrations)은 257 nm에서의 페닐알라닌(phenylalanine)의 몰랄 흡광 계수(molar extinction coefficient)(191 M-1cm-1)를 사용하여, water/acetonitrile(1:1) 하에서 분광광도계(spectrophotometrically)를 통해 측정하였다.
본 발명에서는 아르기닌-리치 친수성 단편(arginine-rich hydrophilic segment)의 전하 밀도와 길이를 다양하게 한, β-시트 상호작용을 통해 나노구조체 형태로 자기조립 될 수 있는 융합 펩티드를 아래 표 1과 같이 설계하고 합성하였다(표 1에서 실시예 4, 5의 융합 펩티드에 대한 MALDI-TOF 질량 측정 그래프가 도 17, 도 18에 나타나있다.)
| 구분 | 융합 펩티드 명칭 | 시퀀스(N->C) |
| 실시예 1 | Tat-β (서열번호 13) |
H-GRKKRRQRRRPPQ-GSGG-FKFEFKFEFKFE-NH2 |
| 실시예 2 | R2-β (서열번호 14) |
H-RR-ahx-FKFEFKFEFKFE-NH2 |
| 실시예 3 | R12-β (서열번호 1) |
H-RRRRRRRRRRRR-GSGG-FKFEFKFEFKFE-NH2 |
| 실시예 4 | R14-β (서열번호 3) |
H-RRRRRRRRRRRRRR-GSGG-FKFEFKFEFKFE-NH2 |
| 실시예 5 | R15-β (서열번호 4) |
H-RRRRRRRRRRRRRRR-GSGG-FKFEFKFEFKFE-NH2 |
여기서, ahx는 ε-aminohexanoic acid를 의미한다.
비교예
1 내지 3.
단분자
펩티드 합성.
서열번호 15 내지 17로 표시되는 아미노산 서열의 단분자 펩티드를 합성하였다는 것을 제외하고는 실시예 1과 모두 동일하게 하여 비교예 1 내지 3의 단분자 펩티드를 제조하였다.
이때, R60-polymer는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다.
| 구분 | 융합 펩티드 명칭 | 시퀀스(N->C) |
| 비교예 1 | Tat (서열번호 15) |
H-ahx-GRKKRRQRRRPPQ-NH2 |
| 비교예 2 | R12 (서열번호 16) |
H-RRRRRRRRRRRR-NH2 |
| 비교예 3 | R60 polymer (서열번호 17) |
-(R)60- |
여기서, ahx는 ε-aminohexanoic acid를 의미한다.
실험예
1. 융합 펩티드와
단분자
펩티드의
항프리온
활성 측정 및 비교
융합 펩티드와 단분자 펩티드의 항프리온 활성을 측정하고 비교하기 위하여, 실시예 1 내지 3으로부터 제조된 융합 단백질과 비교예 1 내지 3으로부터 제조된 단분자 펩티드를 다음과 같은 과정으로 ScN2a 세포에 처리한 후, 세포 내 존재하는 PrPSC의 농도를 웨스턴 블롯과 원편광이색성(CD) 분석을 통해 측정하였다.
1) 세포 배양
ScN2a 세포는 종래 문헌[Lee, Y. S. Self-assembly and nanotechnology : a force balance approach. (John Wiley & Sons, 2008)/Stuart, M. A. et al. Emerging applications of stimuli-responsive polymer materials. Nature Mater. 9, 101-113 (2010)]에 기재된 방법에 따라 배양하였다.
배양과정을 간략하게 설명하면, RML 스크래피 프리온에 의해 영구 감염된 ScN2a 세포주를 고함량의 글루코스(4.5 g/L) DMEM 배지(Invitrogen, USA)에 배양하였다. 이때 상기 DMEM 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS, Invitrogen, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, USA), 1% Glutamax(Invitrogen, USA)을 첨가한 것을 사용하였다. 이를 37 ℃, 5% CO2 및 포화 습도 조건하에서 배양하였다. 배양된 세포들을 배양접시(직경 100 mm, Corning, USA) 내에서 4~5일 간격으로 계대 배양하고, 이후 이를 이용한 프리온 물질 관련 실험은 BL-2 시설 내에서 수행하였다.
2) 펩티드를 이용한
인큐베이션
종래 문헌[Lee, Y. S. Self-assembly and nanotechnology : a force balance approach. (John Wiley & Sons, 2008)/Stuart, M. A. et al. Emerging applications of stimuli-responsive polymer materials. Nature Mater. 9, 101-113 (2010)]에 따라 상술한 과정을 통해 배양된 세포 각각에 실시예 1 내지 3의 융합 펩티드, 비교예 1 내지 3의 단분자 펩티드를 처리하였다.
confluent 100%에 이르렀을 때, ScN2a 세포 배양액을 분리하여 배양접시(직경 100 mm, Corning, USA)에서 confluent 2%부터 성장시켰다. 세포들이 배양용기 표면에 고정되자마자(약 4~6 시간 소요됨), 여기에 최종 펩티드 농도가 0~1000 nM이 되도록 펩티드 시료(실시예 1-3, 비교예 1-3의 펩티드 중 어느 하나)를 가하였다. 이후 6일 동안 배양하였다. 이때, 배양 4일째에 배양배지를 새로운 배양배지와 펩티드 시료(처음 넣은 펩티드와 동일 종류, 동일양)로 교체해 주었다.
3)
웨스턴
블롯
실시예 1-3, 비교예 1-3의 펩티드에 따른 항프리온 활성을 비교 분석하기 위하여, 상기 각각의 펩티드로 처리하여 배양한 ScN2a 세포(실험예 1), 2) 과정으로부터 제조)에서의 PrPSC 농도를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
종래 문헌[Stuart, M. A. et al. Emerging applications of stimuli-responsive polymer materials. Nature Mater. 9, 101-113 (2010)]을 참고로 하여 웨스턴 블롯을 실시하였고, 구체적으로 실험예 1-2)로부터 제조된 각각의 펩티드로 6일 동안 처리한 ScN2a 세포를 차가운 PBS(Invitrogen, USA)로 2회 세척하고 1 mL의 세포용해완충액(cell lysis buffer)[20 mM Tris, pH 8.0; 150 mM 염화나트륨; 0.5% Nonidet P-40, 0.5% 디옥시콜산나트륨(Sigma-Aldrich, USA)]을 사용하여 세포 용해물(cell lysate)을 제조하였다. 상기 세포 용해물의 일부는 원심분리하여 세포 잔해물(cell debris)을 제거한 후, 바이신코니닉산 단백질 분석키트(Pierce, USA)를 사용하여 맑은 상등액 내의 단백질을 정량하였다.
상기 세포 용해물의 다른 일부(2 mg)는 20 μg/mL의 단백질 가수분해효소 K(proteinase K, PK, Invitrogen, USA)로 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후, 페닐메탄설포닐 플루오라이드(Sigma-Aldrich, USA)를 최종농도 2 mM가 되도록 상기 용액에 첨가하여 효소 반응을 종료하였다.
상기 종료된 효소 반응액을 4 ℃에서 1 시간 동안 16,000ㅧg로 원심분리하여 PK 내성 PrPSc가 포함된 펠릿을 얻었다. 얻어진 펠릿을 1X샘플 로딩 완충액(sample loading buffer)(50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 2.5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루)에 용해한 후 97 ℃에서 10분 동안 가열하였다. 다음 상기 가열된 샘플을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 1.5 시간 동안 120 V의 전압 하에 분리하고, 젤 상에 존재하는 로딩된 단백질 샘플을 Immobilon P PVDF 막(EMD Millipore, Merck KGaA, 독일)으로 전기이동시켰다. 이후 단일클론 항-PrP 항체 클론 5C64(콜로라도주립대학교의 G. Telling 제공)과 2차 항-마우스 IgG-퍼옥시다제 컨주게이트(secondary anti-mouse IgG-peroxidase conjugates)(Pierce, Rockford, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
ECL Prime 검출시약(Amersham, GE Healthcare, USA)을 사용하여 PrPSc밴드를 가시화하였다. G:Box Chemi XR5 시스템(Syngene, UK)을 사용하여 이미지를 얻은 후, 이를 GeneTools 소프트웨어(Syngene, UK)를 이용하여 밀도 분석을 수행하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
4)
이색성
원편광
스펙트럼(Circular
dichroism
(CD) spectroscopy)
CD 스펙트럼은 Chirascan Circular Dichroism spectrometer을 사용하여 기록하였고, 상기 분석장치는 펠티에 온도조절기(Peltier temperature controller)(Applied Photophysics, UK)가 구비되어 있는 것을 사용하였다.
190 내지 260 ㎚에서 상기 펩티드의 CD 스펙트럼을 기록하였고, 이때 1 ㎜ 통과길이를 갖는 큐벳을 사용하였다. 상기 펩티드 농도는 10-20 mM로 하였다. 몰랄 흡광은 아미노산 잔기 당 계산하였다. 이의 결과는 도 4에 나타내었다.
도 3은 실시예 1, 실시예 2로부터 제조된 융합 펩티드와 비교예 1로부터 제조된 단분자 펩티드로 처리된 ScN2a 세포에서 단백질분해효소 K에 대해 내성을 갖는 PrPSC를 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3에 따르면, 실시예 1로부터 제조된 융합 펩티드는 β-시트 상호작용에 의해 자기조립된 나노리본 형태의 나노구조체를 형성하고 있는 것으로 확인되었다. 즉, 비교예 1로부터 제조된 단분자 펩티드(Tat 펩티드)에서는 자체적으로 항프리온 활성을 보이지 않다가, 실시예 1의 융합 펩티드(Tat-β)가 되면, 베타-시트 상호작용에 의해 상기 각각의 융합 펩티드가 서로 응집 및 자기조립되어 나노리본 형태의 나노구조체를 형성하게 됨으로써, 다가(multivalent)의 Tat 펩티드를 갖게 되자, 항프리온 활성이 나타나게 되었음을 확인하였다.
다시 말해 비교예 1의 단분자 펩티드(Tat)의 다양한 농도 하에서는 PrPSC 농도가 줄어듬이 없다가, 실시예 1의 융합 펩티드(Tat-β)의 처리 농도가 증가할수록 PrPSC 농도가 점차 줄어드는 것을 확인할 수 있다. 즉, 실시예 1의 흉합 펩티드에서는 항프리온 활성이 존재함을 알 수 있고, 구체적으로 실시예 1의 융합 펩티드는 총 용액에서 실시예 1의 융합 펩티드 농도가 100 nM 이상부터 유효한 효과를 나타내고 있음을 확인하였다.
또한 실시예 2의 융합 펩티드에서도 실시예 1의 융합 펩티드에 비해서는 낮으나 약한 항프리온 활성이 존재함을 알 수 있다.
도 4는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 1, 실시예 2의 융합 펩티드와 비교예 1의 단분자 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 단분자 펩티드는 구조화되지 않은 반면, 실시예 1의 융합 펩티드는 도 3의 결과 분석시 예상했던 바와 같이 β-시트 상호작용에 의해 자기조립화되어 나노구조체를 형성하고 있음이 확인되었다. 실시예 2의 융합 펩티드 역시 β 시트 상호작용에 의해 자기조립화되어 상기 융합 펩티드끼리 나노리본 형태의 나노구조체를 형성하고 있음을 확인할 수 있다.
아울러 실시예 2의 융합 펩티드는 실시예 1의 융합 펩티드에 비해 미미한 항프리온 활성을 보였었는데, 이는 실시예 1과 실시예 2의 융합 펩티드에서 아르기닌 잔기의 수가 서로 다르기 때문으로 여겨진다. 즉, 자기조립된 나노구조체 표면의 전하밀도와 프리온 억제 활성은 서로 비례한다는 것을 유추해 볼 수 있고, 따라서 자기조립과정에 있어서, 아르기닌 풍부 펩티드의 유효분자량이 증가함에 따라 더 강력한 프리온 억제제가 형성될 것이라 예상할 수 있다.
실험예
2.
실시예
3으로부터 합성된 융합 펩티드의 구조 분석.
실험예 1에서의 결과를 바탕으로, 높은 전하밀도를 갖는 나노구조체를 형성하도록 하기 위해, 실시예 3의 융합 펩티드(서열번호 1)를 고안하였다. pH 7.4에서 실시예 3의 융합 펩티드의 2차 구조를 분석하고자 실험예 1의 4) 이색성 원편광 분석으로 분석하였고, 이를 도 5에 나타내었다.
도 5는 pH 7.4 에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, pH 7.4, 25 ℃ 조건, 인산완충용액 상에서 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 3의 융합 펩티드는 자기조립되지 못하고, 2차 구조를 형성하지 않은 상태임을 확인하였다.
이러한 결과는 높은 전하를 갖고 있는 아르기닌 잔기로 이루어진 올리고 아르기닌 펩티드(R12) 부분들 사이에 강한 정전기적 척력이 발생하였기 때문으로 여겨진다. 즉, 자기조립은 인력과 그에 반하는 척력 사이의 힘의 균형이 매우 중요한 과정으로, R12 부분들에서의 정전기적 척력이 β-시트 형성 단편 사이의 β-시트 상호작용에 따른 인력보다 강했기 때문으로 여겨진다.
이에 본 발명에서 아르기닌의 양성자화 정도를 낮춰, 전체적인 정전기적 척력을 감소시키면, 자기조립이 일어날 것으로 가정하고, 더욱 높은 pH 조건에서 실시예 3의 융합 펩티드를 자기조립화해보기로 하였다.
실험예
3. pH 11에서
실시예
3으로부터 합성된 융합 펩티드의 구조 분석.
실험예 2에서 제안한 바와 같이 pH 11 하에서 펩티드 2차 구조를 확인하고자, 실시예 3의 융합 펩티드가 존재하는 용액의 pH를 7.4에서 11로 변경한 후, 원편광 이색성 분석을 실시하였고, 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
이후 pH 11로 변경하여 실시예 3의 융합 펩티드가 나노구조체를 형성한 후, 이를 다시 pH 7.4로 변경한 다음, 이의 구조적 변화를 확인하고자, 원편광 이색성 분석을 실시하여 도 7에 나타내었다.
이때, 실시예 3의 융합 펩티드는 가장 먼저 150 mM NaCl에 용해하였고, pH는 HCl과 NaOH를 사용하여 조절하였다. 그래프 상에 표기한 화살표는 β-시트의 최저 피크(~216 ㎚)를 의미한다.
도 6은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이고, 도 7은 pH 7.4 -> pH 11로 변경한 후, 다시 pH를 7.4로 조절한 후 측정한 실시예 3의 융합 펩티드의 원편광 이색성 분석 결과 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이 pH를 11로 높이자 β-시트의 상호작용이 발생하여, 나노구조체로 자기조립되는 것을 확인하였다. 이렇게 나노구조체를 형성한 후에는 pH 7.4로 변경하여도 구조가 붕괴되지 않고 안정적인 상태로 그대로 유지되는 것을 확인하였다.
실험예
4.
실시예
3의 융합 펩티드의
항프리온
활성 측정
실시예 3의 구조형성에 따라, 항프리온 활성이 달라짐을 확인하고자 앞서 설명한 웨스턴 블롯 실험과정을 통해 수행하였다.
도 8은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)의 펩티드로 처리한 ScN2a 세포 내에서 단백질 가수분해효소 K에 내성을 갖고 있는 PrPSC에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 9는 밀도측정을 통해 도 8의 결과를 PrPSC 상대농도로 나타낸 그래프이다.
이때, 실시예 3의 경우, pH 7.4에서 pH 11로 변화하여, 자기조립화를 통해 나노구조체를 형성하도록 하고, 최종적으로 pH 7.4로 변화하여 구조를 안정적으로 유지한 나노구조체로 형성된 펩티드로, R12-β SPN로 표기하였다.
한편, pH 7.4로 고정하여, 비구조화시킨 실시예 3의 펩티드(R12-β)는, 나노구조체가 형성되지 않은 펩티드로, R12-β UNS로 표기하였다.
우선, R12-β UNS는 단분자 상태로 존재할 것이라는 가정하에, 음성 대조군의 활성을 나타낼 것이라 여겼으나, 이와 달리 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 3 중에서 나노구조체로 형성되지 못한 R12-β UNS는 실시예 3의 R12-β SPN(아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체)보다 14.5 배 높은 항프리온 활성을 나타내고 있음을 확인하였다. 이러한 항프리온 활성은 아르기닌 잔기 수가 5 배가 많은 비교예 3의 펩티드와 유사하였다.
이와 반대로 실시예 3 중에서 섬유형태의 나노구조체로 형성된 펩티드, R12-β SPN는 실시예 1의 펩티드(Tat-β SPN)와 유사한 정도의 항프리온 활성을 나타내었다.
실험예
5.
실시예
3의 융합 펩티드의
항프리온
활성 측정
도 10은 실시예 3(R12-β), 비교예 2(R12), 비교예 3(R60-polymer)으로부터 합성된 펩티드의 ScN2a 세포에 대한 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
이때, 실시예 3의 융합 펩티드는 아래 세가지 조건으로 처리하여 구조적 변화를 유도한 다음, 이에 대한 항프리온 활성을 측정하였다.
1) R12-β UNS
: pH 7.4로 pH 조건을 유지하여 비구조화시킨 단분자 형태의 실시예 3의 융합 펩티드.
2) R12-β SPN
: pH 조건을 pH 7.4 -> pH 11로 1차 변화시켜, 자기조립화를 통해 아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체로 형성된 실시예 3의 융합 펩티드(pH 7.4->11로 추가 표기).
: pH 조건을 pH 7.4 -> pH 11로 1차 변화한 후 다시 -> pH 7.4로 2차 변화시켜, 자기조립화를 통해 아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체로 형성된 실시예 3의 융합 펩티드(pH 7.4->11->7.4로 추가 표기).
상기 두 가지 조건에서 제조된 실시예 3의 융합 펩티드는 모두 아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체를 가지므로, 조건의 표기가 필요한 경우를 제외하고는 별도의 구분없이 표기하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 각각의 펩티드에서의 세포 독성을 확인한 결과, 나노구조체가 형성되지 않은 융합 펩티드, R12-β UNS(실시예 3, pH 7.4 조건에서)은 비교예 3의 펩티드와 유사한 항프리온 활성을 보였으나, 세포 독성은 상당히 달랐다. 구체적으로 R12-β UNS(실시예 3, pH 7.4 조건에서)는 10 μM의 높은 농도에서도 낮은 독성을 나타내고 있는데 반해, 비교예 3의 펩티드는 매우 낮은 농도(0.2 μM)에서도 매우 높은 독성을 나타내었다.
구체적으로 실시예 3의 R12-β SPN는 중간 정도의 세포 독성이 확인되었다. 이에 반해 비교예 1의 펩티드는 아르기닌 잔기가 12개 인 펩티드로 세포 독성이 현저히 낮았으며, 실시예 3의 R12-β UNS와 유사한 정도로 낮은 독성을 나타내었다.
상술한 결과를 통해 본 발명에 있어서 다수의 세포 투과성 펩티드(CPP) 부분은 많은 수의 아르기닌 잔기를 포함하고 있고, 이러한 폴리양이온 분자인 아르기닌 함량이 높아 질수록, 펩티드 내에 존재하는 양이온 잔기 수가 증가하기 때문에, 이와 비례하여 세포독성도 증가하게 되는 것을 알 수 있다. 상기 아르기닌 잔기의 함량이 증가할수록 세포막 교란이 발생하게 되어 세포독성이 유도되는 것이라 여겨진다.
허나, 실시예 3의 융합 펩티드(R12-β)는 다량의 아르기닌 잔기를 포함하고 있는데도 불구하고, pH 7.4에서 비구조화된 펩티드(R12-β UNS)로 존재할 경우, 낮은 독성과 우수한 항프리온 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.
종합하면 pH 7.4 조건 하에서 실시예 3의 융합 펩티드가 구조화되지 않은 단분자 상태로 유지되면, 5 배 아르기닌 잔기를 더 포함하고 있는 펩티드(R60-polymer)와 유사한 정도의 항프리온 활성을 가지면서 현저히 낮은 세포 독성을 나타내고 있음을 확인하였다. 구체적으로 실시예 3의 융합 펩티드는 3000 nM 이하의 농도에서 세포 생존률을 70% 이상 유지하고, 최대 10000 nM의 고농도에서도 세포 생존률이 60% 이하로 낮아지지 않는 현저히 낮은 세포독성을 가지고 있다.
아울러 실시예 3의 융합 펩티드는, 동일한 수(R12)의 아르기닌 잔기만으로 이루어진 펩티드보다 현저히 우수한 항프리온 활성을 가지게 됨을 알 수 있다. 구체적으로 실시예 3의 융합 펩티드는 10 nM의 매우 낮은 농도에서도 현저히 우수한 항프리온 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
한편 염기성 조건에서는 실시예 3의 융합 펩티드는 아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체로 비가역적으로 구조가 변화하게 된다는 것을 확인하였으며, 이러한 형태로 형성되면 세포 독성이 어느 정도 증가함과 동시에 항프리온 활성 역시 실시예 3의 R12-β UNS 보다 14.5 배 이상 저하되는 것을 알 수 있다.
pH 조건에 따른 단순한 구조적 차이로 인하여 실시예 3의 R12-β UNS는 실시예 3의 R12-β SPN(아밀로이드와 유사한 섬유형태의 나노구조체)보다 14.5 배의 항프리온 활성 차이와 세포 독성 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
보다 구체적으로 pH 변화에 따른 R12-β 펩티드의 상태를 조사하기로 하였다.
실험예
6. pH 변화에 따른
실시예
3의 융합 펩티드의 분자 상태 분석.
본 발명에서, 상술한 결과를 통해 실시예 3의 융합 펩티드가 pH에 따라 다양한 분자상태로 변화됨을 확인하였고, 이를 증빙하기 위하여 투과전자현미경(TEM)과 원자힘현미경(AFM)을 이용하여 보다 구체적으로 나노구조를 분석하고자 하였다.
도 11은 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 음성염색 TEM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 5일 때(b), pH 7일 때(c), pH 11일 때(d)의 실시예 3의 융합 펩티드를 음성염색 TEM으로 촬영한 이미지이다. 이때 pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. bar는 1 ㎛이다.
도 12는 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 pH 변화에 따라 실시예 3의 융합 펩티드의 분자상태를 확인하기 위한 AFM 이미지로, pH 3일 때(a), pH 7일 때(b), pH 11일 때(c)의 실시예 3의 융합 펩티드를 AFM으로 촬영한 이미지이다.
우선 도 11 및 도 12를 살펴보면, pH 5 이하(pH < 5)에서는 자기조립화를 통해 소낭형태의 나노구조체를 형성하고 있음을 확인할 수 있다.
또한 pH 7에서는 실시예 3의 융합 펩티드는 주로 비규칙적인 작은 응집체 형태로 존재하고 있음을 확인할 수 있었고, 심지어 나노시트 형태도 관찰되었는데, 이는 단분자 상태와 소낭형태의 나노구조체의 중간체에 해당하는 것으로 확인된다.
pH 11에서는 실시예 3의 융합 펩티드가 더 큰 크기의 섬유상 응집체 형태로 자기조립화된 것을 확인할 수 있는데, 이러한 형태의 나노구조체는 아밀로이드 응집체와 구조적으로 유사한 것을 확인하였다.
상술한 결과를 종합하면 실시예 3의 융합 펩티드는 용액의 pH에 따라 뚜렷한 구조적, 형태적 변화를 겪으며, 이러한 변화에 따라 항프리온 활성도 변화되는 것을 확인하였다.
허나 세포 독성의 경우, 실시예 3의 융합 펩티드는 용액의 pH에 따라 미미한 변화는 나타나지만, 어떤 나노구조체라도 아르기닌 잔기만으로 이루어진 비교예 3의 펩티드에 비해 현저히 낮은 독성을 나타내고 있음을 확인할 수 있다.
아울러, 세포 외 중성 조건에서 실시예 3의 융합 펩티드는 고농도를 투여함에도 불구하고 세포 독성이 거의 관찰되지 않으며, 세포 내 엔도솜 및 리소좀의 약산성 조건에서는 세포 독성이 증가하긴 하나, 이는 세포 내 엔도솜 및 리소좀의 환경 하에서만 국한된 것으로, 상기 실시예 3의 융합 펩티드가 세포에 적용될 경우 상기 융합 펩티드는 세포 내 엔도솜과 리소좀에 함입되기 때문에 세포독성이 세포의 생존에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
아울러, 상기 약산성 조건에서 소낭 형태의 나노구조체로 변화된 실시예 3의 융합 펩티드가 세포 외로 방출될 경우, 상기 구조가 다시 중성조건에서의 세포독성이 낮은 구조로 변화되기 때문에, 세포 내, 외에서 세포로 독성에 따른 영향을 미치지 않는 장점을 갖는다.
실험예
7. pH 3에서
실시예
3의 융합 펩티드의 입자 크기 분석.
도 13은 pH 3에서 소낭형태로 자기조립된 실시예 3의 융합 펩티드의AFM 이미지와 이로부터 길이(width(㎚))에 따른 높이(height(㎚))를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3의 융합 펩티드가 pH 3에서 자기조립화하여 소낭형태의 나노구조체를 형성하였을 때, 직경은 20 내지 90 ㎚일 수 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로 상기 소낭형태의 나노구조체는 타원형으로 길이(width)는 평균 50 내지 100 ㎚, 바람직하게 70 내지 90 ㎚이고, 높이(height)는 평균 1 내지 20 ㎚, 바람직하게 8 내지 16 ㎚일 수 있다.
실험예
8. pH에 따른
실시예
3의 융합 펩티드의
제타포텐셜
(ζ
포텐셜
) 분석.
도 14는 pH에 따른 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 산성 조건(pH 3) 하에서 실시예 3의 융합 펩티드는 자기조립화하여 소낭형태의 나노구조체를 형성하는데, 이의 나노구조체일 때가 제타포텐셜 값이 가장 높았다. 구체적으로 pH 3일 때는 + 40 mV이고, pH 5 일때는 + 38 mV이였다.
한편 pH 7하에서 실시예 3의 융합 펩티드는 자기조립화하지 않고, 비구조화된 형태로 존재하며, 이때 제타포텐셜 값이 가장 낮다. 구체적으로 pH 7에서 +24 mV이였다.
다음으로 pH 11하에서 실시예 3의 융합 펩티드는 나노시트 형태로 자기조립화된 나노구조체를 형성하는데, 이때 제타포텐셜 값은 중간 정도였다(+ 30 mV).
상술한 결과를 종합하면 pH가 변화함에 따라 나노구조체의 형태적 변화와 더불어 표면전하도 달라지고 있음을 확인할 수 있다. 구체적으로 실시예 3의 융합 펩티드는 산성 조건(pH2-5.5)에서 소낭형태의 나노구조체로 형성될 경우 가장 높은 양전하를 띄게 되며, 이는 항프리온 활성이 우수한 것으로 확인된 중건 조건에서의 실시예 3의 융합 펩티드에 비해 + 14~18 mV 더 높은 수준이다.
따라서 실시예 3의 융합 펩티드는 산성 조건(pH2-5.5)에서 소낭형태의 나노구조체로 형성되었을 때가 중성 조건(pH 6.0-9.0)에서 비구조화된 단분자 형태로 존재할때에 비해 현저히 우수한 항프리온 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.
실험예
9. pH 변화에 따른
실시예
3의 융합 펩티드의
제타포텐셜
(ζ
포텐셜
) 분석.
다음, 용액의 pH를 변화시켰을 때, 제타포텐셜의 변화를 확인하고자 하였다.
도 15는 pH 7에서 pH 5로 변화시켰을 때(초록색)와, pH 11에서 pH 7, pH 5, pH 3으로 순차적으로 변화시켰을 때(푸른색)의 실시예 3의 융합 펩티드의 제타포텐셜을 측정하여 나타낸 그래프이다. pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조정하였다. 평균 ㅁ 표준편차(n=3)으로 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, pH 7에서 pH 5로 변화시켰을 때 제타포텐셜이 +24 mV에서 +38 mV로 변화함을 확인하였다. 이에 반해, pH 11에서 pH 7, pH 5, pH 3으로 순차적으로 변화시켰을 때에는 제타포텐셜이 거의 변화없이 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.
상술한 실험결과를 모두 종합하였을 때, 본 발명에 따른 융합 펩티드 바람직하게 아르기닌 잔기가 6 내지 15개인 양전하를 띄는, 세포 투과성 펩티드와 화학식 1로 표시되는 β-시트 형성 단편을 포함하는 융합 펩티드의 경우, 도 2와 같은 매커니즘을 통해 프리온 형성을 저해하는 효과를 갖는다고 할 수 있다.
실험예
10. pH 변화에 따른
실시예
3의 융합 펩티드의 제타포텐셜(ζ
포텐
셜) 분석.
도 16은 실시예 3 중에서 나노구조체로 형성되지 않은 pH 7의 R12-β UNS로 처리한 ScN2a 세포를 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다. 화살표는 R12-β 소낭을 가리킨다.
도 16에 나타난 바와 같이, 실시예 3 중에서 나노구조체로 형성되지 않은 pH 7의 R12-β UNS을 세포에 처리할 경우, 세포의 엔도시토시스 경로를 통해, 세포의 엔도시토시스 경로에 의해 발생한 엔도좀 및 리소좀과 같은 세포 소낭 내로 함입되고, 세포 소낭은 낮은 pH 조건을 형성하고 있기 때문에, 세포 소낭 내에서 상기 실시예 3의 융합 펩티드는 소낭 형태의 나노구조체로 자기조립화되는 것을 확인하였다.
상기 융합 펩티드 간의 자기조립화를 통해 형성된 소낭 형태의 나노구조체는 항프리온 활성이, 종래 아르기닌 잔기(약 60 개)로만 이루어진 폴리머에 비해 더 높은 활성을 가지고 있기 때문에, 세포 소낭에 존재하는 단백질 미스폴딩만을 억제 및 저해하는 특성을 갖는다.
실험예
12.
실시예
4, 5의 융합 펩티드의 구조 분석.
본 발명에서, 상술한 결과를 통해 아르기닌 잔기가 13개 이상을 포함하는 실시예 4의 융합 펩티드 역시 pH에 따라 다양한 분자상태로 변화된다고 유추되었으며, 이를 증빙하기 위하여 원자힘현미경(AFM)을 이용하여 나노구조를 분석하고자 하였다.
도 19, 20은 생리적 염 농도(150 mM NaCl) 하에서 강산(pH 3) 조건일 때 실시예 4의 융합 펩티드가 소낭(vesicle) 형태로 나노구조체를 형성하는지 여부를 확인하기 위한 AFM 이미지로, pH 3일 때 실시예 4의 융합 펩티드를 AFM으로 촬영한 이미지이다. 이때 도 19는 위상 이미지(phase image)이고 도 20은 높이 이미지(height image)이다.
우선 도 19 및 도 20을 살펴보면, 상술한 바와 같이 본 발명의 실시예 4, 5의 융합 펩티드 역시 강산 조건(pH 3)에서는 자기조립화를 통해 가역적으로 소낭형태의 나노구조체를 형성하고 있음을 확인할 수 있다.
즉, 아르기닌 잔기가 14~15개로 이루어진 양전하를 띄는 세포투과성 펩티드를 포함하고 있음에도 산성 조건(pH 2-5.5) 에서 베타 시트 형성 단편의 소수성 상호작용과 정전기적 결합을 통해, 융합 펩티드 간의 자기조립화로 소낭 형태의 나노구조체가 형성되고 있음을 확인할 수 있다.
실험예
13.
실시예
4, 5의 융합 펩티드의
항프리온
활성.
pH 7.6 조건 하에서 구조화되지 않은 실시예 4, 5의 융합 펩티드(R14-β UNS, R15-β UNS)에 따른, 항프리온 활성을 확인하고자 앞서 설명한 웨스턴 블롯 실험과정을 통해 수행하였다.
도 21은 실시예 4(R14-β UNS)의 융합 펩티드로 처리한 ScN2a 세포 내에서 단백질 가수분해효소 K에 내성을 갖고 있는 PrPSC에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 22는 실시예 5(R15-β UNS)의 융합 펩티드로 처리한 ScN2a 세포 내에서 단백질 가수분해효소 K에 내성을 갖고 있는 PrPSC에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 21, 22에서 R14-β UNS와 R15-β UNS 표기 밑에 표시된 수치는 처리된 융합 펩티드의 농도(nM)를 나타낸 것이다.
이때, 실시예 4, 5의 융합 펩티드는 pH 7.4로 유지하여 비구조화된 단분자 상태에서 항프리온 활성을 측정하였다.
도 21, 22에 나타난 바와 같이 실시예 4, 5의 융합 펩티드(R14-β UNS, R15-β UNS)는 모두 30 nM의 매우 저농도에서도 항 프리온 활성이 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 실험예 12의 결과와 종합하면 실시예 4, 5의 융합 펩티드(R14-β UNS, R15-β UNS)는 중성 조건(pH 6.0-9.0)에서 구조화되지 않은 단분자 상태에서 매우 높은 항프리온 활성을 가지고 있음을 확인하였고, 실시예 3의 융합 펩티드와 같이 산성 조건(pH 2-5.5)에서 제타포텐셜이 양의 방향으로 높아지는 소낭 형태의 나노구조체로 형성되는 것을 확인하였다.
따라서 실시예 4, 5의 융합 펩티드(R14-β UNS, R15-β UNS)는 실시예 3의 융합 펩티드와 마찬가지로, 중성 조건(pH 6.0-9.0)에서는 세포 독성이 낮고 항프리온 활성이 높게 유지되는 비구조화된 단분자 상태로 존재하다가 세포 내 엔도시토시트를 통해 엔도솜과 리소좀으로 함입되고, 산성 조건(pH 2-5.5)과 마주하게 되면서 가역적으로 더욱 항프리온 활성이 증가된 소낭 형태의 나노구조체로 형성됨으로써, 엔도솜과 리소좀 내에서 단백질의 비정상적인 응집 또는 미스폴딩을 억제할 수 있는 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus
<120> intracellular pH-responsive fusion peptide, phamaceutical
composition for treatment of protein aggregation and misfolding
related diseases
<130> HPC6906
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pH-responsive fusion peptide, R12-beta
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
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20 25
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pH-responsive fusion peptide
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pH-responsive fusion peptide, R14-beta
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1 5 10 15
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20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly
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Ser Gly Gly Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu
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<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 5
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
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<210> 14
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
20 25 30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
35 40 45
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
50 55 60
Claims (14)
- 서열번호 1 내지 12 중에서 어느 하나로 표시되는 융합 펩티드를 유효성분으로 하되, 상기 융합 펩티드는 pH 조건에 따라 형태변화를 나타내는 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 융합 펩티드는 pH 2 내지 pH 5.5에서, 베타 시트 형성 단편의 소수성 상호작용과 정전기적 결합으로 융합 펩티드 간의 자기조립화를 통해 나노구조체를 형성하는 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 나노구조체는 소낭 형태의 3차 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 융합 펩티드는 pH 9.0 내지 12 조건에서는 베타 시트 형성 단편의 소수성 상호작용과 정전기적 결합으로 융합 펩티드 간의 자기조립화를 통해 아밀로이드 섬유 형태의 3차 구조를 갖는 나노구조체를 형성하고,
상기 섬유 형태의 나노구조체는 pH 변화에도 안정적인 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 프리온 질병은 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 폴리글루타민 확장증(polyglutamine expansion disease), 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia), 척수 및 연수 근육위축(spinal and bulbar muscular atrophy), 타우증(tauopathy), 근육긴장 이상(dystonia), 서핀 결핍증(Serpin deficiency), 경변증(cirrhosis), 제 II형 당뇨병, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매(Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병(familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병(hereditary cerebral amyloid angiopathy), 혈투석-관련 아밀로이드증, 황반 퇴화(age-related macular degeneration), 알츠하이머 병, 방사선 치료로 유도된 치매(radiotherapy induced dementia), 축색 돌기 상해(axon injury), 급성확산성 피질억제(acute cortical spreading depression), 알파-시누클레인성 병태(alpha-synucleinopathies), 인간의 쿠루병 (KURU), 뇌허혈(brain ischemia), 영구 중뇌 허혈(permanent focal cerebralischemia), 말초 신경 재생(peripheral nerve regeneration), 중첩성 간질 후 모델(post-status epilepticusmodel), 척수손상(spinal cord injury), 산발성 루게릭병(sporadic amyotrophic lateral sclerosis), 크로이츠펠트-야콥 질병 (Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD), 변형크로이츠펠트-야콥 질병 (Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD), 의원성 크로이츠펠트-야콥 질병 (iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease, iCJD), 가족성 크로 이츠펠트-야콥 질병 (Familial Creutzfeldt-Jakob disease, fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병 (Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병 (Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome, GSS), 치명적 가족성 불면증 (Fatal Familial Insomnia, FFI), 치명적 산발성 불면증 (sporadic fatal insomnia, sFI), 스폰지폼 뇌질환(Spongiform encephalopathy), 전염성 해면양뇌증(transmissible spongiform encephalopathy)과 같은 프리온 질병(prion disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 엔도시토시스에 의해 세포의 엔도솜 또는 리소좀으로 함입되고, 상기 엔도솜 또는 리소좀의 pH 2.0 내지 5.5 조건하에서 소낭 형태의 나노구조체를 형성하고, 항프리온 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 프리온 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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