KR101603195B1 - Atg12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 진단 방법, 및 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 ATG12의 발현 또는 활성 억제제를 이용한 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 SUMO1에 의한 ATG12 발현 증가를 억제시킴으로써 아밀로이드 베타 수준을 감소시키므로 알츠하이머병 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition comprising ATG12 inhibitor for preventing or treating Alzheimer's disease}

ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer disease, AD)은 노인성 치매의 가장 흔한 형태이며, 아밀로이드 플라크 및 신경섬유다발(neurofibrillary tangle, NFT)이 관찰되는 특징이 있다. 이 때 아밀로이드 플라크를 구성하는 아밀로이드 베타_1-40 및 아밀로이드 베타_1-42는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)이 β-및γ-세크리테이즈(secretase)에 의해 가수분해 과정을 거치면서 생산되고, 비정상적인 아밀로이드 베타 단백질의 축적이 알츠하이머병(Alzheimer disease, AD)을 확인하는 증거가 된다. 이러한 아밀로이드 베타 단백질의 축적에 대한 연구가 진행되었으며, 주요 원인중 하나로 자식작용(autophagy)이 지목되고 있다.

자식작용(autophagy)은 세포 항상성을 유지하기 위한 주요 메커니즘으로, 세포 단백질의 분해 재활용을 매개로 하고, 내부 또는 외부의 세포 스트레스에 노출된 경우 세포 생존에 도움을 준다. 또한 자식작용(autophagy)은 세포질의 일부를 둘러싸서 자가포식소체라고 일컬어지는 이중막 소포를 형성시키도록 확장되는 분리막의 형성에 의해서 개시된다. 그러나 최근 자식작용(autophagy)이 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease), 알츠하이머병(Alzheimer disease, AD), 파킨슨병(Parkinson disease, PD), 리소좀 질환, 및 암 등을 포함하는 많은 질병들의 원인임이 밝혀지고 있으며, 특히 알츠하이머를 앓고 있는 인간 또는 AD 모델 마우스의 뇌에서 많은 자가식포(autophagic vacuole)가 변성된 신경돌기에 축적된 것이 보고되었다(Nixon RA. Autophagy, amyloidogenesis and Alzheimer disease. Journal of cell science 2007; 120:4081-91., Nixon RA, Wegiel J, Kumar A, Yu WH, Peterhoff C, Cataldo A, et al. Extensive involvement of autophagy in Alzheimer disease: an immuno-electron microscopy study. Journal of neuropathology and experimental neurology 2005; 64:113-22.). 또한, 한 연구 결과는 비정상적인 자가식포(autophagic vacuole)의 조기축적이 어린 알츠하이머 모델 마우스 해마의 플라크-연관 이상 신경염의 전자현미경이미지를 통해 나타남을 확인하였고(Sanchez-Varo R, Trujillo-Estrada L, Sanchez-Mejias E, Torres M, Baglietto-Vargas D, Moreno-Gonzalez I, et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta neuropathologica 2012; 123:53-70.), 이는 축삭내의 자가식포(autophagic vacuole)가 아밀로이드 베타 올리고머화의 요건이 될 수 있음을 암시한다.

이러한 자식작용의 지표로서는 LC3-Ⅱ 단백질이 주로 이용된다. LC3(Light Chain 3)은 자가소화작용시 그 양이 증가하는 단백질이며, 본래 미세소관-연관 단백질 1A 및 1B의 서브유닛(MAP1LC3으로 명명됨)으로서 동정되었고(Mannm S.S. and Hammarback, J.A. (1994) J.Biol. Chem. 269, 11492-11497), 이어서 자가소화작용에 중요한 역할을 하는 효모 단백질 Apg8/Aut7/Cvt5에 유사한 것으로서 발견되었다(Lang, T et al. (1998) EMBO J. 17, 3597-3607). 인간에서는 LC3의 세가지 동형(isoform)으로 LC3A, LC3B, 및 LC3C가 알려져 있고 이들은 자가소화작용 과정 동안 전사후 변형의 과정을 거친다. LC3은 그 합성 후 즉시 이어지는 카르복시 말단의 첫번째로 절단을 통하여 세포질성 형태 LC3-I을 생성시키고, 자가소화작용 동안 LC3-I는 Apg7 및 Apg3이 관여하는 유비퀴틴 유사 시스템으로 인하여 LC3-II으로 변환되어 LC3이 자가포식소체(autophagosome)에 연결된다. 따라서, 자가포식소체에서 LC3의 존재와 LC3의 더 낮은 이동 형태인 LC3-II으로의 변환은 자가소화작용의 지표로서 사용된다.

한편, SUMO1는 표적 단백질의 라이신 잔기와 결합하고 많은 세포작용들을 조절하는 단백질이며, 포유류 세포에서 3개의 동형단백질(isoform)이 발현된다. SUMO의 주요한 기능중 하나는 표적 단백질의 안정화이며, 최근 연구결과는 SUMO의 변형은 허혈, 저산소증, 산화스트레스 등의 해로운 상태를 초래함을 확인하였다(Yang W, Sheng H, Homi HM, Warner DS, Paschen W. Cerebral ischemia/stroke and small ubiquitin-like modifier (SUMO) conjugation--a new target for therapeutic intervention Journal of neurochemistry 2008; 106:989-99.). 저산소증은 SUMO1의 발현을 증가시키며, SUMO1는 저산소증-유도인자1 알파(hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1α)의 수모화(sumoylation)에 주요한 역할을 한다. 또한 HIF-1α수준은 BECN1/Beclin1 및 LC3 발현과 연관되어 있으므로, 결국 HIF-1α 수준의 증가는 자식작용(autophagy)을 촉진할 수 있다. 따라서 SUMO1의 변형은 HIF-1α을 안정화 하므로, SUMO1에 의한 HIF-1α의 조절이 자식작용(autophagy)에 영향을 미칠것으로 예상되었으나, 아직까지 SUMO1과 자식작용(autophagy) 사이의 직접적인 연관성에 대한 연구 결과는 없었다. 다만, Atg5, Atg7은 거대자식작용(macroautophagy)에 필수적인 요소이고, Atg12는 Atg5와 결합하여 Atg12-Atg5 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 자가포식소체(autophagosome) 형성을 위한 LC3 지질화의 E3 효소로서 역할하는 것이 알려져 있었다.

이에 본 발명자들은, SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 증가 메커니즘에서, 이를 억제하기 위한 방법을 찾기위해 노력한 결과, Atg12가 SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 생성의 마커가 될 수 있고, Atg12를 억제하면 아밀로이드 베타 수준이 감소하여, Atg12의 억제제가 알츠하이머병 등의 신경퇴행성질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Atg12의 발현 억제제를 이용하여 아밀로이드 베타 수준을 감소시킴으로써 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 진단방법, 및 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체로부터 분리된 시료의 ATG12의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 ATG12 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군과 비교하여 알츠하이머병에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단의 정보를 제공하기 위한 ATG12 발현 수준의 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 진단 키트을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) ATG12 발현 세포에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 세포에서 ATG12 또는 HIF-1α의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 ATG12의 발현 또는 활성수준을 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 Atg12의 발현 또는 활성 억제제를 이용한 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 SUMO1에 의한 ATG12 발현 증가를 억제시킴으로써 아밀로이드 베타 수준을 감소시키므로 알츠하이머병 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 H4 세포 및 HGS1 세포의 LC3 단백질 양을 웨스턴 블롯으로 측정한 것을 나타내는 도이다.
도 1B는 H4 세포 및 HGS1 세포의 LC3-Ⅱ/Ⅰ 비율을 나타내는 도이다.
도 1C는 H4 세포 및 HGS1 세포에 BafA를 처리한 후 LC3 단백질 양을 웨스턴 블롯으로 측정한 것을 나타내는 도이다.
도 1D는 H4 세포 및 HGS1 세포에 BafA를 처리한 후 LC3-Ⅱ/Ⅰ 비율을 나타내는 도이다.
도 2A는 H4 세포에 GFP-표지 LC3 및 myc-표지 SUMO1을 일시적 형질주입 한 후 이를 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 2B는 HGS1 세포를 MDC로 염색한 후, 자가식포(autophagic vacuole)의 수준을 측정한 것을 나타내는 도이다.
도 2C는 mRFP-GFP-표지 LC3을 안정하게 발현하는 H4 세포에서 자가포식소체 및 자가용해소체의 위치 및 양을 나타내는 도이다.
도 3A는 H4 세포의 자가식포(autophagic vacuole)의 양을 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3B는 H4 세포의 자가식포(autophagic vacuole)의 양을 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3C는 HGS1 세포의 자가식포(autophagic vacuole)를 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3D는 HGS1 세포의 자가식포(autophagic vacuole)를 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3E는 H4 세포에 트레할로오스(trehalose)를 처리한 후 자가식포(autophagic vacuole)를 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3F는 H4 세포에 트레할로오스(trehalose)를 처리한 후 자가식포(autophagic vacuole)를 전자현미경 관찰한 것을 나타내는 도이다.
도 3G는 H4 세포, HGS1 세포, 트레할로오스(trehalose)를 처리한 H4 세포의 자가포식소체(autophagosome) 및 자가용해소체(autolysosome)의 세포당 개수를 나타내는 도이다.
도 4A는 H4 세포에 shSUMO1을 형질주입한 후 SUMO1의 발현양의 변화를 나타내는 도이다.
도 4B는 H4 세포에 shSUMO1을 형질주입한 후 BafA를 처리한 때 LC3의 발현양의 변화를 나타내는 도이다.
도 4C는 H4 세포에 shSUMO1을 형질주입한 후 BafA를 처리한 때 LC3-Ⅱ/actin 비를 나타내는 도이다.
도 5A는 HAmg세포에 3-MA를 처리한 후 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 5B는 HAmg세포에 3-MA 및 BafA를 처리한 후 LC3의 수준을 나타내는 도이다.
도 5C는 HSW 세포에 3-MA를 8시간 처리한 후 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 5D는 HSW 세포에 3-MA를 16시간 처리한 후 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 5E는 HSW 세포에 보르트만닌(wortmannin) 및 BafA를 처리한 후 LC3의 수준을 나타내는 도이다.
도 5F는 HSW 세포에 보르트만닌(wortmannin) 및 BafA를 처리한 후 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 6은 H4 세포 및 HGS1 세포내의 BECN1-PIK3C3 복합체양을 측정한 것을 나타내는 도이다.
도 7A는 HSW 세포에 Atg5 siRNA를 형질주입한 경우 Atg5의 발현양을 나타내는 도이다.
도 7B는 HSW 세포에 Atg5 siRNA를 형질주입한 경우 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 7C는 HSW 세포에 Atg7 siRNA를 형질주입한 경우 Atg7의 발현양을 나타내는 도이다.
도 7D는 HSW 세포에 Atg7 siRNA를 형질주입한 경우 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 7E는 HSW 세포에 Atg12 siRNA를 형질주입한 경우 Atg12의 발현양을 나타내는 도이다.
도 7F는 HSW 세포에 Atg12 siRNA를 형질주입한 경우 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 7G는 HSW 세포에 HIF-1α siRNA를 형질주입한 경우 HIF-1α의 발현양을 나타내는 도이다.
도 7H는 HSW 세포에 HIF-1α siRNA를 형질주입한 경우 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 나타내는 도이다.
도 8A는 HIF-1α siRNA를 형질주입한 경우 Atg12-Atg5 복합체 및 BECN1의 발현양의 변화를 나타내는 도이다.
도 8B는 SUMO1 shRNA를 형질주입한 경우 Atg12-Atg5 복합체의 발현양의 변화를 나타내는 도이다.
도 9A는 18개월생 WT 및 APP 형질전환 마우스의 LC3발현을 나타내는 도이다.
도 9B는 16개월생 WT 및 APP 형질전환 마우스의 LC3 및 SUMO1 단백질의 면역조직화학(immunohistochemistry) 결과를 나타내는 도이다. 별표시는 콩고 레드(congo red)로 염색된 아밀로이드 플라크(plaque)를 나타낸다.
도 9C는 LC3 및 SUMO1를 동시에 표지한 APP 형질전환 마우스 피질의 공초점 현미경 이미지를 나타내는 도이다.
도 9D는 ATG12 및 SUMO1를 동시에 표지한 21개월생 APP 형질전환 마우스 피질의 공초점 현미경 이미지를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 SUMO1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 및 치료용 약학적 조성물일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA는 <서열번호 1> 내지 <서열번호 3> 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 동일한 활성을 갖는 한, 하나 또는 몇 개의 염기가 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있고, ATG12 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 모든 서열이 될 수 있다.

상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 본 발명의 ATF3 siRNA를 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 ATG12 siRNA를 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 siRNA의 생적합성과 전달성을 향상시키는 것을 가능하게 하는 당업자에게 잘 알려진 모든 운반체를 추가로 포함할 수 있다. 특히, siRNA와 함께 사용될 수 있는 운반체는 세포막을 투과할 수 있는 리포좀 및 펩타이드("세포-투과성 펩타이드")를 포함한다.

상기 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 SUMO1에 의한 자식작용을 억제하거나, 아밀로이드 베타 생성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Atg12 siRNA를 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)을 발현하는 세포에 형질주입하여 자식작용(autophagy)을 억제하였고, 아밀로이드 베타의 수준이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 7b, 7d, 7f).

상기 ATG12의 발현 또는 활성 억제제는 ATG12 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 ATG12 단백질의 활성 억제제는 ATG12 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머 또는 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 ATG12 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머 (Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 앱타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346:818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.

상기 ATG12 단백질에 상보적으로 결합하는 항체는 ATG12의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 다클론 항체는 ATG12을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한, 상기 ATG12에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 ATG12 유전자는 <서열번호 4> 또는 <서열번호 5>의 서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으며, 일반적으로 알려진 ATG12 유전자 또는 이의 가능한 모든 돌연변이 서열일 수 있다.

상기 알츠하이머병은 아밀로이드 베타의 축적으로 유발되는 노인성 치매일 수 있으며, 치매, 뇌졸증, 중풍, 헌팅턴병, 피크병, 및 크로이츠펠트-야콥병일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.

일일 투여량은 siRNA의 양을 기준으로 0.6 내지 1.2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.7 내지 1.1 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.1 ㎎/㎏이며, 하루 1회 투여되고 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명은,

1) 피검체로부터 분리된 시료의 ATG12의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 ATG12 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군과 비교하여 노인성 치매에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계를 포함하는 노인성 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 ATG12 발현 또는 활성 수준의 측정 방법.

상기 단계 1)의 시료는 혈청, 혈장 및 혈액일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 ATG12의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩에 의한 mRNA 발현 수준 측정일 수 있으며, 또한 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 및 샌드위치 ELISA에 의한 단백질 발현 수준 측정일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 모든 유전자 발현 수준 분석 방법일 수 있다.

또한, 본 발명은 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 진단 키트를 제공한다.

또한, 상기 ATG12 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immnosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid)키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)키트 등 이 있으며, 이에 한정되지 않고, mRNA 또는 단백질에 상보적으로 결합하는 방식을 이용한다면 당업자에게 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, ATG12의 억제가 아밀로이드 베타 수준 감소를 야기하는 것을 확인하였으므로, ATG12 발현양을 측정하는 것이 진단키트에 사용될 수 있다.

상기 ATG12의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 ATG12에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 ATG12의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 ATG12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은

1) 피검물질이 처리된 ATG12 발현 세포에서 ATG12의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 ATG12의 발현 또는 활성수준을 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 노인성 치매 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, ATG12 siRNA를 처리한 경우 아밀로이드 베타 수준이 감소하는 것을 확인하였으므로, ATG12를 억제하는 피검물질은 알츠하이머 치료제 후보물질이 될 수 있으며, 본 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 웨스턴 블롯을 이용한 LC3-Ⅱ 발현양 측정으로 SUMO1 단백질의 자식작용 유도 효과 확인

본 발명자들은, SUMO1 단백질의 자식작용(autophagy) 유도시의 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 H4세포, 및 SUMO1을 안정하게 발현하는 H4세포(HGS1)의 LC3-Ⅱ단백질 수준을 측정하였고, 또한, 자가포식소체(autophagosome)와 용해소체(lysosome)의 융합을 차단하고, LC3-Ⅱ를 자가포식소체(autophagosome)에 고정(trap) 하기 위해 라이소좀 억제제인 bafilomycin A1(bafA, obtained from Sigma)를 H4 및 HGS1 세포에 처리한 후 LC3 단백질의 발현을 측정하였다.

구체적으로, 인간 신경교종 H4 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Invitrogen, 11995-065)에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Invitrogen, 15140)을 보충하여 배양되었고, myc 표지된 pEGFP-C1(Clontech, 6084-1) 또는 pCS2-MT으로 서브클로닝(subcloning)된 플라스미드를 이용하여 일시적 형질주입하였다. 상기 세포들은 PBS로 세척되고 1xRIPA(20mM Tris, pH7.4, 150mM NaCl, 1mM Na3VO4, 10mM NaF, 1mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 1mM ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA), 0.2mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 및 0.5% deoxycholate)로 용해하였다. 모든 단백질은 MES SDS running 버퍼(Invitrogen, NP0002-02)를 사용하여 NuPage 12% BisTris-polyacrylamede gel electrophoresis(Invitrogen, NP0335)에 의해 분리되었다. NIH Image 소프트웨어를 사용하여 신호를 정량화 하였다.

그 결과, bafA를 처리하지 않은 경우, HGS1 세포의 LC3-Ⅱ/Ⅰ 비율은 600% 이상으로 증가하였고(p<0.05; 도 1a, 1b), bafA를 처리를 처리한 경우에도 HGS1 세포는 H4 세포와 비교하여 bafA 처리후 더 많은 LC3-Ⅱ 축적을 보였다. 따라서, 이는 SUMO1이 HGS1세포내의 자식작용(autophagy)의 유도를 일으킴을 나타낸다 (도 1c, 1d).

<실시예 2> 일시적 SUMO1 형질주입 된 H4 세포에서 LC3-Ⅱ 형광현미경 관찰으로 SUMO1 단백질의 자식작용 유도 효과 확인

본 발명자들은, H4 신경교종(neuroglioma) 세포에 GFP-표지 LC3 및 SUMO1를 형질주입하여 SUMO1에 의해 자가포식소체(autophagosome) 형성이 활성화 되는지 확인하였다.

구체적으로, H4 세포는 GFP-표지 LC3으로 일시적으로 형질주입되고, 양성 대조군으로서 자식작용(autophagy)을 증가시키는 트레할로오스(trehalose)(100mM, obtained from Sigma)를 처리 또는 처리하지 않고 배양하였으며, 실험군은 GFP-표지 LC3 및 myc-표지 SUMO1을 같이 일시적 형질주입하였다. SUMO1 플라스미드는 myc 표지된 pEGFP-C1(Clontech, 6084-1) 또는 pCS2-MT으로 서브클로닝(subcloning)되었고, GFP-LC3 플라스미드는 Tamotsu Yoshimori 박사(Osaka University, japan)에게서 제공받았다.

그 결과, H4 세포에 GFP-표지 LC3 및 myc-표지 SUMO1이 동시에 일시적 형질주입 된 경우, LC3-Ⅱ 양성 자가포식소체(autophagosome)가 대조군에 비해 증가하였다 (도 2a).

<실시예 3> HGS1 세포에서 LC3-Ⅱ 형광현미경 관찰을 통한 SUMO1 단백질의 자식작용(autophagy) 유도 효과 확인

SUMO1을 안정하게 발현하는 H4세포(HGS1)에서, SUMO1에 의해 자가포식소체(autophagosome) 형성이 활성화 되는지 확인하였다. 자가포식소체(autophagosome) 및 자가용해소체(autolysosome)에 특이적으로 작용하는 자발적 형광염료(spontaneously fluorescent dye)인 Monodansylcadaverine(MDC)를 사용하였다.

구체적으로, HGS1은 G418 선별에 의해 확립되었다. 세포를 PBS로 2회 세척하였고, PBS 버퍼에 50μM MDC 첨가하여 배양하였다(37℃, 30분). 배양 후, 세포는 PBS 버퍼로 3회 세척하였고, 즉시 Olympus X171 형광 현미경으로 관찰하였다(흥분 파장 380-420, barrier filter 450nm).

그 결과, SUMO1을 안정하게 발현하는 HGS1 세포에서도 MDC로 염색된 자가식포의 증가가 전체적인 세포질내에서 더 강한 강도로 관찰되었다 (도 2b).

<실시예 4> H4 세포에서 SUMO1 단백질의 자가용해소체(autolysosome)의 형성유도를 이중 표지한 LC의 형질주입을 통하여 확인

본 발명자들은, 자식작용(autophagy)의 성숙과정을 관찰하기 위하여 mRFP-GFP 이중표지 LC를 안정하게 발현하는 H4 세포를 사용하였다. mRFP-GFP-LC3 플라스미드는 Tamotsu Yoshimori 박사(Osaka University, japan)에게서 제공받았다

구체적으로, 안정적으로 이중 mRFP-GFP-표지 LC3을 안정하게 발현하는 H4 세포에 myc-SUMO1 또는 mock 벡터를 형질주입 하고, 양성 대조군에는 100mM 트레할로오스(trehalose)를 처리하였다. 그 후 24시간 뒤 세포를 고정하고 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, SUMO1의 과발현은 LC3의 발현 및 mRFP 및 GFP 형광의 동시 위치화(co-localization)를 증가시켰고, 이는 자가포식소체(autophagosome) 형성의 증가를 나타낸다(도 2c). 또한, GFP 형광은 자가용해소체(autolysosome)의 산성조건에서 분해되므로, mRFP의 빨간 형광을 띄는 액포(vacuole)들이 자가포식소체로부터 성숙된 자가용해소체(autolysosome)를 나타낸다. 따라서, SUMO1의 과발현이 자가용해소체(autolysosome) 형성을 증가시켜 자식작용을 증가시킬 것을 나타낸다.

<실시예 5> HGS1 세포에서 SUMO1 단백질의 자식작용(autophagy)의 유도를 전자현미경 확인

SUMO1을 안정하게 발현하는 H4세포(HGS1)에서, SUMO1에 의해 자가포식소체(autophagosome) 형성이 활성화 되는지 전자현미경으로 확인하였다

구체적으로, 인간 신경교종 H4 세포 및 HGS1 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium 에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Invitrogen, 15140)을 첨가하여 배양되었다. 양성대조군으로, H4 세포에 100mM 트레할로오스(trehalose)를 24시간동안 처리하였다. 이후 세포는 cold 2.5% glutaraldehyde(EMS, 16020) 첨가한 0.1M phosphate buffer(pH 7.2) 및 2% paraformaldehyde(Merck, 1.04005.1000) 첨가한 0.1M phosphate buffer (pH 7.2) 및 내장된 에폭시 수지(EMS, 14120)의 혼합물 내에서 하루동안 고정되었다. 이 후 상기 에폭시 수지 혼합 시료를 캡슐에 위치시키고 중합하고(60℃, 48시간), 울트라마이크로톰(ultramicrotome, Leica, UC7)으로 박편으로 절단하고, 구리 그리드 상에 수집하였다. 박편을 위한 적절한 부분이 70nm 두깨로 절단 후, 포화된 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate, EMS, 22400) 및 납 시트레이트(EMS, 17800)로 염색하여 투과전자현미경(Carl Zeiss, Libra120, 120kV)으로 관찰하였다.

그 결과, 상기 실시예들의 GFP-LC3 점(GFP-LC3 dot) 또는 MDC-양성 자가식포(MDC-positive autophagic vacuole)의 결과와 마찬가지로, SUMO1-형질주입 H4 세포(HGS1)의 세포질에 풍부한 자가포식소체(autophagosome)가 있음을 나타내었다(도 3c, 3d, 3g). 결론적으로 상기 결과는 H4 신경교종(neuroglioma)세포 내의 SUMO1은 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 증가시킴을 나타낸다.

<실시예 6> H4 세포내의 SUMO1의 억제가 LC3-Ⅱ의 감소를 일으킴을 확인

본 발명자들은, SUMO1이 자식작용(autophagy)을 유도함을 상기 실시예들을 통해 확인하였으므로, 반대로 H4 세포내의 SUMO1의 억제가 자식작용(autophagy)의 유도를 억제하는지 여부와 SUMO1 억제 조건하에서 라이소솜의 억제제인 BafA의 영향을 확인하였다.

구체적으로, H4 세포에 SUMO1 shRNA를 60시간동안 형질주입하고, 또는 같은조건에서 라이소솜의 억제제인 BafA 1nM을 1시간동안 처리한 후 LC3 항체, BECN1 항체, 및 SUMO1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. shSUMO1의 표적 서열은 Bioneer(대전)에서 합성하였다.

그 결과, shRNA를 사용했을때, 대조군과 비교하여 SUMO1이 40% 감소하는 것이 관찰되었고(도 4a), SUMO1의 억제는 LC3-Ⅱ 수준 역시 감소시켰으며, BafA의 처리는 LC3-Ⅱ 수준을 증가시켰다(p<0.05; 도 4b, 4c). BECN1의 수준은 유의미한 변화를 나타내지 않았다.

<실시예 7> 3-MA의 처리에 의한 자식작용(autophagy)의 억제가 아밀로이드 베타 생성을 억제함을 확인

이전의 연구들을 통해 거대자식작용-유도 아밀로이드베타 발생(macroautophagy-induced Aβ generation)이 자식작용(autophagy) 억제제인 3-메틸아데닌(methyladenine, 3-MA, obtained from Sigma)의 처리를 통해 억제된다는 것이 알려졌다. 따라서, 자식작용(autophagy)의 억제가 아밀로이드 베타의 분비를 감소시키는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 H4세포에 3-MA를 처리한 후, LC3-Ⅱ 및 아밀로이드 베타_1-40의 수준을 측정하였다.

구체적으로, 안정적으로 인간 야생형 APP695를 발현하는 H4세포(HAmg 세포, G418 선별)에 5mM 3-MA를 처리하고 24시간동안 배양 후, 분비된 아밀로이드 베타_1-40를 ELISA(SoftMax Pro 5.0)을 사용하여 측정하였다. 또한 HAmg 세포에 5mM 3-MA를 18시간 동안 처리한 후, 10nM BafA를 3시간 동안 처리하고 LC3 항체를 사용하여 웨스턴 블롯하였다. 아밀로이드 베타_1-40의 농도는 human Aβ ELISA kit(Invitrogen, KHB3482)로 정량화 하였다.

그 결과, LC3-Ⅱ 수준은 3-MA의 처리로 인해 감소하였으며, 3-MA와 BafA의 동시 투여한 경우에도 LC3-Ⅱ의 축적을 감소시켰다(도 5b). 따라서 3-MA가 HAmg 세포에서 자식작용(autophagy)의 경로을 억제한다는 것을 확인하였고, 이에 따라 아밀로이드 베타는 대조군과 비교하여 20%정도 억제된것으로 나타났다(p<0.05; 도 5a).

<실시예 8> SUMO1의 과발현이 아밀로이드 베타 생성을 증가시킴을 확인

상기 실시예들을 통하여 SUMO1의 과발현이 자식작용을 증가시킴을 확인하였고, 자식작용의 억제가 아밀로이드 베타 생성을 감소시킴을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 SUMO1에 의한 자가포식소체(autophagosome)의 형성으로 인하여 아밀로이드베타 생성이 증가하는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 안정하게 Swedish mutant-type APP695를 발현하는 H4 세포(APPsw, HSW 세포, Chae SS, Yoo CB, Jo C, Yun SM, Jo SA, Koh YH. Caspases-2 and -8 are involved in the presenilin1/gamma-secretase-dependent cleavage of amyloid precursor protein after the induction of apoptosis. Journal of neuroscience research 2010; 88:1926-33.)에 SUMO1을 48시간동안 형질주입하고, 3-MA를 처리 또는 처리하지 않은 상태에서 SUMO1의 과발현에 따른 아밀로이드 베타 수준을 측정하였다.

그 결과, HAmg세포와 같이, HSW 세포에 5mM 3-MA를 8시간 동안 처리한 후에 대조군과 비교하여 아밀로이드 베타_1-40 분비가 30% 정도 감소하였다(p<0.05; 도 5c). SUMO1이 일시적 형질주입된 환경에서는 아밀로이드 베타_1-40 의 생성이 대조군과 비교하여 370% 증가하였다. 또한, 5mM 3-MA를 16시간동안 HSW 세포에 처리한 경우에는 SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 생성이 현저하게 감소하였다(도 5d).

<실시예 9> 보르트만닌(wortmannin)의 처리에 의한 자식작용(autophagy)의 억제가 아밀로이드 베타 생성을 억제함을 확인

또한, 본 발명자들은 SUMO1에 의한 아밀로이드베타 생성에 대하여, HSW 세포에 보르트만닌(wortmannin, 자가포식소체 시작(initiation) 억제제, Sigma)을 8시간 동안 처리한 후의 효과를 조사하였다.

구체적으로, 세포에 1μM 보르트만닌(wortmannin)을 3시간 동안 처리한 후, 10nM BafA를 3시간 동안 처리하고 LC3-Ⅱ 수준을 측정하였고, 1μM 보르트만닌(wortmannin)을 8시간 동안 처리한 후, 아밀로이드 베타_1-40 분비 수준을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, 보르트만닌(wortmannin)의 처리에 의해 LC3-Ⅱ의 축적이 감소하여 자식작용이 억제됨을 확인하고(도 5e), 대조군과 비교하여 아밀로이드 베타_1-40 분비가 30% 정도 감소한 것을 확인하였다(도 5f). 더욱이, 보르트만닌(wortmannin)은 SUMO1을 형질주입한 HSW세포에서 현저하게 아밀로이드 베타의 생산을 감소시켰다(도 5f).

<실시예 10> SUMO1이 BECN1-PIK3C3 복합체 형성을 증가시켜 자식작용(autophagy)을 활성화하는지 여부 확인

BECN1-PIK3C3 복합체가 클래스 Ⅲ 포스패티딜이노시톨 3-카이네이즈(phosphatidylinositol 3-kinase, PIK3C)의 중요 요소라는 사실은 잘 알려져있다. 포스패티딜이노시톨-3-포스페이트(phosphatidylinositol-3-phosphate, PI3P) 발생 및 자가포식소체(autophagosome) 형성의 시작에 있어서 BECN1-PIK3C3 복합체 형성이 중요한 역할을 하기 때문에, 본 발명자들은 SUMO1이 BECN1-PIK3C3 복합체 형성에 영향을 미치는지 확인하였다.

구체적으로, H4세포와 HGS1 세포에서 항-PIK3C3 항체를 이용하여 면역침전(immunoprecipitation)을 수행하였고, 그 후 항-BECN1 항체 및 항-PIK3C3 항체를 사용하여 면역블롯을 수행, BECN1-PIK3C3 복합체 형성을 분석하였다. 면역침전시, 세포는 PBS로 세척되고, 단백질 분해효소 억제제(Sigma)가 보충된 면역침전 버퍼(50mM Tris-HCL(pH8.0), 150mM NaCl, 2mM EDTA(pH8.0), 10% glycerol, 1% Triton X-100)에 용해되었다. 각 용해물 시료는 단백질 A/G-아가로즈가 첨가되어 프리클리어링(preclearing)하기 위해 배양했다(2시간, 4℃). 2시간의 배양이 종료된 후, 수지(resin)는 세척되고, 펠릿(pellet)은 SDS 시료 버퍼에서 재부유(resuspending) 되었다. 이 후프리클리어링(preclearing)된 세포 용해물은 1차 항체와 함께 배양하였다(하루, 4℃).

그 결과, BECN1-PIK3C3 복합체는 H4 세포에 비하여 HGS1 세포 내에서 증가하였다(도 6). 따라서 SUMO1의 과발현은 BECN1-PIK3C3 복합체 및 자가포식소체(autophagosome) 형성을 증가시킴을 알 수 있다.

<실시예 11> Atg5, 7, 또는 12의 고갈이 SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 생산을 억제함을 확인

본 발명자들은 자식작용(autophagy) 연관 유전자(autophagy-related gene, Atg)가 SUMO1에 의한 아밀로이드 베타 생산과 관련이 있는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, Atg7, Atg5, 또는 Atg12 siRNA를 48시간동안 HSW 세포에 일시적 형질주입함으로써 자식작용(autophagy) 경로를 억제하고, 분비된 아밀로이드 베타1-40 수준을 ELISA로 측정하였다. 총 세포 용해물들은 ATG5 항체, ATG7 항체, 또는 ATG12 항체를 이용하여 웨스턴 블롯하였다. Atg5(6345) 및 Atg7(6604)에 대응하는 siRNA는 Cell Signaling으로부터 구매하였고, Atg12(sc-72578)에 대응하는 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구매하였으며, 음성 대조군 siRNA(SN-1013)은 Bioneer로부터 구매하였다.

그 결과, 도 7a, 7c, 7e와 같이, Atg5, Atg7, Atg12 단백질 수준이 각각 감소하고, 아밀로이드 베타_1-40 분비 수준은 Atg7 또는 Atg5 siRNA 형질주입에 의해 약간 감소하였다(도 7b, 7d). 또한 SUMO1-형질주입 HSW 세포에서, Atg5 또는 Atg7의 고갈에 의한 적지만, 의미있는 정도의 아밀로이드 베타 생산 감소를 발견하였다(도 7b, 7d). 반면 HSW 세포에 Atg12 siRNA 형질주입한 경우, 가장 큰 아밀로이드 베타 생산 감소가 관찰되었으며 약 30% 정도의 아밀로이드 베타 수준 감소를 관찰하였다. SUMO1-형질주입 HSW 세포도 또한 아밀로이드 베타 생산이 현저하게 감소하였다(도 7f). 또한 상기 결과는 Atg 단백질이 자가포식소체와 형성과 관련하여 SUMO1-조절 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미침을 나타낸다.

<실시예 12> SUMO1가 HIF-1α를 통하여 아밀로이드 베타 생산을 증가시킴을 확인

SUMO1의 과발현은 HIF-1α 안정화에 의하여 자식작용(autophagy)의 활성을 유도하므로, 본 발명자들은 SUMO1-유도 아밀로이드 베타 생산에서 HIF-1α 고갈의 효과를 조사하였다.

구체적으로, HIF-1α siRNA를 48시간동안 HSW 세포에 일시적 형질주입하고, 분비된 아밀로이드 베타_1-40 수준을 ELISA로 측정하였다. 총 세포 용해물들은 HIF-1α 항체를 이용하여 웨스턴 블롯하였다. HIF-1α(L-004018-00-0005)에 대응하는 siRNA는 Dharmacon RNA Technology로부터 구매하였다.

그 결과, HIF-1α 녹다운은 웨스턴 블롯으로 확인되었다(도 7g). 또한 HSW 세포에서 아밀로이드 베타_1-40의 분비 수준이 무작위한 RNA를 대조군으로서 형질주입한 군과 비교하여 28%정도 감소하였다. 또한, HSW 세포에 GFP-표지 SUMO1과 HIF-1α의 siRNA를 함께 형질 주입한 경우, GFP-표지 SUMO1만 주입한 군에 비교하여 아밀로이드 베타_1-40의 분비 수준이 약 40% 정도 감소하였다(도 7h). 따라서 HIF-1α가 SUMO1-조절 아밀로이드 베타 생산에 기여함을 나타낸다.

<실시예 13> SUMO1의 고갈이 Atg12-Atg5 복합체 수준을 감소시킴을 확인

HIF-1α의 고갈이 아밀로이드 베타 생산을 감소시켰기 때문에 이때의 BECN1의 수준을 확인하였다. 그러나, SUMO1의 고갈이 BECN1의 수준을 변화시키지 못한것과 같이 HIF-1α의 고갈은 BECN1의 수준을 변화시키지 못하였다(도 8a). 따라서 아밀로이드 베타 감소의 다른 원인을 찾기 위해 Atg12-Atg5 복합체의 수준을 측정하였다.

구체적으로 H4 세포는 HIF-1α siRNA로 72시간동안 일시적 형질주입된 후, ATG12 항체 또는 BECN1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 또한 H4 세포에 shSUMO1을 72시간동안 일시적 형질주입한 후, ATG12 항체를 이용하여 웨스턴 블롯하였다.

그 결과, HIF-1α의 고갈상태에서 Atg12-Atg5 복합체의 수준이 감소한것으로 나타났고(도 8A), SUMO1의 고갈 또한 Atg12-Atg5 복합체를 감소시키는 것으로 나타났다(도 8B). 상기 결과는 SUMO1 또는 HIF-1α의 고갈이 Atg12-Atg5 복합체를 감소시키고, 이는 결국 LC3-Ⅱ의 감소로 이어질 것을 나타낸다.

<실시예 14> APP 형질전환 마우스 뇌에서, SUMO1 및 LC3이 아밀로이드 용균반(plaque)상에 위치함을 확인

이전 연구들을 통해, 알츠하이머 모델 마우스에서 LC3 단백질의 현저한 축적이 증명되었다. 또한 상기 실시예들에서 증가된 SUMO1 면역반응성이 알츠하이머 모델 마우스의 내에서 발견됨을 확인하였다. 따라서, 알츠하이머 모델 마우스 뇌에서 SUMO1 및 LC3의 증가 사이의 관련성에 대한 조사를 위해, 먼저 APP 형질전환 마우스의 뇌내의 LC3-Ⅱ수준이 웨스턴 블롯을 통해 측정되었다. 또한 16개월생 야생형 및 형질전환 마우스의 뇌 절단편을 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의해 더 측정되었다. 또한 알츠하이머 모델 마우스 피질이 이중-표지 면역형광 공초점 현미경법으로 관찰되었다.

구체적으로, 먼저 18개월생 APP 형질전환 마우스와 그 대조군의 뇌내의 LC3-Ⅱ 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다(도 9a). 그리고 16개월생 APP Swedish/PS1dE9 형질전환 마우스와 그 대조군의 뇌 박편을 LC3 항체 및 SUMO1 항체를 이용하여 면역염색하고, 아밀로이드 플라크를 표시하기 위해 콩고 레드(congo red)를 이용하여 대조염색(conterstain) 하고 면역조직화학(immunohistochemistry) (도 9b) 및 공초점 현미경(도 9c)으로 분석 하였다. 또한 21개월생 형질전환 마우스와 그 대조군의 피질 박편을 ATG12 항체 및 SUMO1 항체를 이용하여 면역 표지하고, 공초점현미경 관찰하였다(도 9d). 면역조직화학(immunohistochemistry)을 위해, 16개월생 형질전환 마우스 및 대조군의 뇌를 4% (w/v) paraformaldehyde(PFA)내에서 고정한 후 마이크로톰으로 10μm 두깨로 절단하여 -20℃ 저온 시상단면을 만들었고, 면역염색을 위해 마이크로슬라이드(microslide)에 위치시켰다. 상기 절단면은 LC3(1:200, Abgent, AM1800a) 및 SUMO1 항체로 면역염색되었다. 이후 절단면은 상온에서 Alexa Fluor 488 및 555와 결합된 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 사용하여 염색하였다. 필요한 경우, 면역 표지된 부분은 20% Congo red 용액에서 3분동안 배양되었다. Axiolab Pol Polarizing microscope (Carl Zeiss, Axio Vision Realese 4.8 software)가 3,3’-diaminobenzidine (DAB) 현미경 이미지 분석을 위해 사용되었다. 공초점 이미지는 Olympus Fluoview 1000 현미경을 사용하여 얻었다. APP 형질전환 마우스의 제작법은 이미 공개되어 있으며(Yun SM, Cho SJ, Song JC, Song SY, Jo SA, Jo C, et al. SUMO1 modulates Abeta generation via BACE1 accumulation. Neurobiology of aging 2013; 34:650-62), 모든 연구는 Institutional Animal Care Use Committee 에서 승인된 프로토콜에 따라 수행되고, 동물 실험에 대한 국립보건연구원 지침에 따랐다.

그 결과, 18개월된 APP 형질전환 마우스의 뇌에 LC3-Ⅱ이 현저하게 축적되었고(도 9a), 16개월생 APP 형질전환 마우스의 뇌에서 LC3 및 SUMO1의 면역반응성이 증가되어 있는것이 확인되었다(도 9b). 또한 APP 형질전환 마우스의 뇌내에서 Congo Red로 염색된 일부 아밀로이드 플라크가 LC3 면역 양성 세포 주변에서 관찰되어 상기 실시예들과 일치하는 결과를 확인하였다(도 9b). 또한 이중-표지 APP 형질전환 마우스에서 LC3 및 SUMO1가 동시에 같은 위치에서 발현이 증가되었고(도 9c), Atg12 및 SUMO1의 같은 위치에서 발현도 증가되는 것이 관찰되었다(도 9d). 따라서 SUMO1이 알츠하이머에서 자가포식소체(autophagosome)의 축적에 연관되어 있음을 나타낸다.

<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION <120> Pharmaceutical composition comprising ATG12 inhibitor for preventing or treating Alzheimer's disease <130> 2014p-04-037 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siATG12 <400> 1 gttgcagctt cctacttca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siATG12 <400> 2 ggaagagaca gctctgaaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siATG12 <400> 3 gcatgaatgg actcagaaa 19 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Atg12 [Homo sapiens] <400> 4 Met Thr Ser Arg Glu His Gln Val Ser Leu Cys Asn Cys Val Pro Leu 1 5 10 15 Leu Arg Arg Leu Leu Cys Asp Ala Pro Trp Arg Lys Ala Arg Pro Leu 20 25 30 His Ala Leu Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Arg Val Ser Pro Ser Lys Met 35 40 45 Ala Glu Glu Pro Gln Ser Val Leu Gln Leu Pro Thr Ser Ile Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Glu Gly Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Thr Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Pro Pro Ser Ser Ala Ala Val Ser Pro Gly Thr Glu Glu Pro Ala Gly 85 90 95 Asp Thr Lys Lys Lys Ile Asp Ile Leu Leu Lys Ala Val Gly Asp Thr 100 105 110 Pro Ile Met Lys Thr Lys Lys Trp Ala Val Glu Arg Thr Arg Thr Ile 115 120 125 Gln Gly Leu Ile Asp Phe Ile Lys Lys Phe Leu Lys Leu Val Ala Ser 130 135 140 Glu Gln Leu Phe Ile Tyr Val Asn Gln Ser Phe Ala Pro Ser Pro Asp 145 150 155 160 Gln Glu Val Gly Thr Leu Tyr Glu Cys Phe Gly Ser Asp Gly Lys Leu 165 170 175 Val Leu His Tyr Cys Lys Ser Gln Ala Trp Gly 180 185 <210> 5 <211> 74 <212> PRT <213> Atg12 [Homo sapiens] <400> 5 Met Ala Glu Glu Pro Gln Ser Val Leu Gln Leu Pro Thr Ser Ile Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly Glu Gly Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Thr Thr Thr Pro 20 25 30 Glu Pro Pro Ser Ser Ala Ala Val Ser Pro Gly Thr Glu Glu Pro Ala 35 40 45 Gly Asp Thr Lys Lys Lys Ile Tyr Leu Cys Glu Ser Val Leu Cys Ser 50 55 60 Phe Pro Arg Pro Arg Ser Trp Asn Ser Leu 65 70

Claims (14)

1. ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제로서 ATG12 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 <서열번호 1> 내지 <서열번호 3> 중 어느 하나의 서열을 포함하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA 및 shRNA를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 상기 ATG12의 발현 또는 활성 억제제는 ATG12 단백질에 상보적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 SUMO1에 의한 자식작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, ATG12 유전자의 발현 또는 활성 억제제는 아밀로이드 베타 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 ATG12 유전자는 <서열번호 4> 또는 <서열번호 5>의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 1) 피검체로부터 분리된 시료의 ATG12의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
   2) 상기 단계 1)의 ATG12 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군과 비교하여 알츠하이머병에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단의 정보를 제공하기 위한 ATG12 발현 또는 활성 수준의 측정 방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 시료는 혈청, 혈장 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발현 수준의 측정 방법.
   
10. 제 8항에 있어서, 상기 ATG12의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩, 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 및 샌드위치 ELISA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 측정 방법.
    
11. ATG12 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제로서 ATG12에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이거나, 또는 ATG12 단백질 활성 수준을 측정하는 제제로서 ATG12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 알츠하이머병 진단 키트.
    
12. 삭제
13. 삭제
14. 1) 피검물질이 처리된 ATG12 발현 세포에서 ATG12의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 ATG12의 발현 또는 활성수준을 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
    

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