JP2001514528A

JP2001514528A - 天然プレセニリン１ヌルバックグラウンド上で非天然野生型および家族性アルツハイマー病突然変異プレセニリン１タンパク質を発現するトランスジェニック動物

Info

Publication number: JP2001514528A
Application number: JP54946198A
Authority: JP
Inventors: チエン，ホイ; チエン，スー; フアン・デル・プルーフ，レオナルドウス・ハー・テー; ウオン，フイリツプ・シー; サイソデイア，サングラム・エス; ジアン，ピン
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド; ジヨンズ・ホプキンズ・ユニバーシテイ
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2001-09-11
Also published as: WO1998051781A1; EP0981602A1; EP0981602A4; US6452065B2; CA2290039A1; US20020016978A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、天然プレセニリン（1）を欠くトランスジェニック非ヒト動物胚、および非天然プレセニリン（1）のみを有するトランスジェニック非ヒト動物に関する。該トランスジェニック動物およびそれに由来する細胞は、プレセニリン（1）の発現パターン、活性およびモジュレーターの研究、アルツハイマー病におけるプレセニリン（1）の役割の研究、および中枢神経系の障害の研究において使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】天然プレセニリン１ヌルバックグラウンド上で非天然野生型および家族性アルツハイマー病突然変異プレセニリン１タンパク質を発現するトランスジェニック動物発明の分野本発明は、天然プレセニリン１(PS1)タンパク質を欠くトランスジェニック非ヒト動物、および天然PS1ヌルバックグラウンド（null background）上で、野生型ヒトPS1または家族性アルツハイマー病(FAD)突然変異含有ヒトPS1のいずれかを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。該トランスジェニック動物は、PS1のインビボ機能の研究、および胚発生中および加齢中の両方のPS1機能におけるFAD突然変異の効果の研究において使用することができる。また、該トランスジェニック動物は、PS1の発現または活性を調節する化合物の同定に使用することかできる。発明の背景プレセニリン１(PS1)は、初期胚発生から成体期にわたり動物の中枢神経系および他の組織において発現されるタンパク質である。PS1は、エンドタンパク質分解によりインビボでプロセシングされる（G ．Thinakaranら，Neuron 17:181(1996)）８回膜貫通タンパク質であり、それは、受容体のNotch/lin-12ファミリーにより媒介される信号伝達を促進するシー・エレガンス（C．elegans）タンパク質sel-12と相同である（D．LevitanおよびI ．Greenwald，Nature，377:351(1995);S．Artavanis-Tsakonasら，Science 268: 225(1995)）。線虫においては、sel-12機能の喪失に伴う特定の産卵欠損がPS1により救助され(D.Levitanら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 93:14940(1996))、これは、これら相同タンパク質が、いくつかの機能に関して機能的に互換性を有する可能性があることを示している。 PS1は、65歳以上の集団を釣り合いなく冒す神経障害であるアルツハイマー病（AD）に関連づけられている。PS1中の突然変異は、早期発症型家族性アルツハイマー病の約25％を引き起こす原因となる。この疾患の発生率は、60〜65歳の1 ％未満から、75歳では5％に、さらに85歳では47％にまで増加する。その結果、6 5歳を超える者の痴呆の全症例の60％〜80％は、ADにより引き起こされる。罹患者は、認識機能および記憶の障害を示す。 ADの顕著な特徴には、新皮質、海馬および関連構造体における老人斑の存在、神経原線維変化および広範なニューロンの喪失が含まれる。老人斑は、β-アミロイドペプチドまたはAβと称される39〜43アミノ酸のペプチドを主成分とする不均一物質の細胞外沈着物である（GlennerおよびWong，Biochem．Biophys．Res ．Commun．120:885-890(1984)）。この4kDaAβペプチドは、より大きなβ-アミロイド前駆体タンパク質（APP）からタンパク質分解切断により誘導される。老人斑は、ジストロフィー神経突起、グリアおよび星状細胞の輪に取り囲まれている。また、β-アミロイド沈着物は、新皮質血管壁にも存在する。老人斑の他の成分には、ユビキチン、アミロイドP、アポE、インターロイキン-1およびα-1- アンチキモトリプシンが含まれる。ADの完全な病因は未だ解明されていないが、現在では、ADの発生に関与する遺伝的、免疫学的および環境的因子を含む多くのことが公知である。家族性ADの研究からは、遺伝的データが認められる。ADの症例の大多数は散発性であるらしいが、約10％の症例は早期発症型家族性AD（FAD）である。この障害は、第21染色体上に位置するβ-アミロイド前駆体タンパク質（APP）、第14染色体上のPS1遺伝子および第１染色体上に位置しPS1のホモログであるプレセニリン２(PS2)を含む特定の遺伝子中の突然変異の常染色体優性遺伝に関連していることが、FADの家系の遺伝分析から確認されている。早期発症型FADの症例の約25％は、PS1中の突然変異に結びつけられている。3個の全遺伝子中の突然変異は、全Aβまたは、よりアミロイド生成性（amylodogenic）であると考えられているAβ42(43)（Scheunerら，Nature Medicine 2:864-870(1996);Selkoe，Science，275:630-631(1997)）の産生の増加を招くことが、生化学的研究で示されている。現在のところ、42個の異なるミスセンス突然変異および１個のインフレームスプライス部位突然変異が記載されている（Crutsら，Hum．Mol．Genet．5:1449-1455(1996)）。しかしながら、PS1の生理的役割の全容や、AD発生病理におけるそのメカニズムは、現時点では十分に理解されているわけではない。トランスジェニック非ヒト動物の技術により、ADに関連した遺伝子の効果を検討するためのモデル系が得られる。ヒトPS1またはその成分の発現を指令する遺伝子構築物を中枢神経系内の鍵領域に加えることは、PS1およびPS1のモジュレーターの発現および活性を研究するための手段を提供する。野生型ヒトPS1タンパク質、または種々のFAD突然変異を含有するヒトPS1のいずれかを、PDGFプロモーターまたはPrPプロモーター下で発現させる試みが、これまでに報告されている(Duffら，Nature 383:710-713(1996);Borcheltら，Neuron 17:1005-1013(1996))。各場合において、野生型マウスPS1バックグラウンド上でPS1トランスジーンが発現されたと報告されている。したがって、得られたトランスジェニックマウス中で、マウスPS1タンパク質とヒトPS1タンパク質との混合物が産生された。 Aβ42(43)レベルの相対的増加は、PS1 FAD患者に由来する血漿および繊維芽細胞培養において、ならびにヒトPS1 FADタンパク質を発現するトランスジェニックマウスにおいて認められている(Scheunerら，1996;Duffら，(1996);Borchelt ら，1996;Lemereら，(1996);Citronら，Nature Medicine 3:67-72(1997))。その結果は、PS1突然変異から生じる病原性が、APPプロセシングおよびAβ42(43)産生を介したものかもしれないことを示唆している。発明の概要したがって、非ヒトトランスジェニック動物であって、その動物に固有の機能的PS1遺伝子に関してヘテロ接合体である動物を提供することが、本発明の１つの態様である。本発明で用いる機能的は、細胞内またはインビトロ系内に存在する場合に、あたかも天然のまたは未改変の条件または環境中に存在するかのように正常に機能する遺伝子またはタンパク質を表すために用いる。本発明のこの態様の動物は、この遺伝子の機能的コピーを１つだけ有する動物中のPS1の、組織および時期に特異的な発現または活性の研究に有用である。また、この動物は、種々の化合物がインビボにおいてPS1の活性または発現のモジュレーターとして作用する能力を研究するのに有用であり、あるいはインビトロにおける培養用細胞を提供する点で有用である。本発明で用いるモジュレーターは、PS1の発現または活性の変化を引き起こす又はPS1とそのリガンドもしくは他のタンパク質との相互作用の効果の変化を引き起こす化合物である。この態様の１つの実施形態においては、この動物は、機能的天然PS1遺伝子を欠くもう１つの動物を作製するための方法において使用される。もう１つの実施形態においては、この態様の動物は、天然PS1遺伝子の発現の不存在下で非天然PS1遺伝子を発現する動物を作製するための方法において使用される。特定の実施形態において、該非ヒト動物はマウスである。別の実施形態において、該非天然 PS1は、野生型ヒトPS1、A246E突然変異ヒトPS1遺伝子または他の任意の突然変異ヒトPS1遺伝子である。本発明のトランスジェニック動物に関して、本発明者らはトランスジーンおよび遺伝子に注目する。本発明で用いるトランスジーンは、遺伝子を含む遺伝的構築物である。当技術分野で公知の方法により、該トランスジーンを動物の細胞中の１以上の染色体内に組込む。該トランスジーンは、一旦組込まれると、トランスジェニック動物の染色体内の少なくとも１ヵ所で保持される。遺伝子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。また、該遺伝子および／またはトランスジーンは、当技術分野で公知の遺伝的調節要素および／または構造要素を含むことが可能である。本発明のもう１つの態様は、天然PS1の発現が欠損した非ヒト動物胚である。この胚は、発生中の動物に対するプレセニリン１欠損の効果の研究に有用である。特定の実施形態においては、該動物はマウスである。また、該動物胚は、機能的天然PS1遺伝子を欠く細胞の起源として有用である。該細胞は、PS1の不存在下でのインビトロ培養研究において有用である。本発明の１つの態様は、動物を得るための方法であって、細胞が、該動物に固有の機能的遺伝子PS1を欠くことを特徴とする方法である。この方法は、該動物に固有の変化形態のPS1遺伝子用の遺伝子をトランスジーンの形態で準備し、該動物の染色体中の天然PS1遺伝子の位置を該トランスジーンの標的とする（targe ting）ことを含む。該トランスジーンは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびリポフェクションを含む当技術分野で公知の種々の方法により、胚幹細胞中に導入することができる。ついで、該トランスジーンを保持する細胞を胚盤胞中に注入し、ついでそれを偽妊娠動物に移植することができる。別の実施形態においては、該トランスジーンの標的とされる胚幹細胞を受精卵または桑実胚と共にコインキュベート（coincubate）し、ついで雌体内に移植することができる。妊娠後に得られる動物はキメラファウンダー（chimeric founder ）トランスジェニック動物である。さらに別の実施形態においては、該ファウンダー動物を使用して、野生型動物と交配させ、該改変PS1遺伝子に関してヘテロ接合であるF1動物を得ることができる。さらに別の実施形態においては、これらのヘテロ接合動物を相互交配させて、生存不可能なトランスジェニック胚（その体細胞および生殖細胞は、該改変PS1遺伝子に関してホモ接合であり、したがって機能的PS1遺伝子を欠く）を得ることができる。他の実施形態においては、該ヘテロ接合動物を使用して細胞系を得ることができる。好ましい実施形態においては、該動物はマウスである。本発明のさらに別の態様は、天然PS1ヌルバックグラウンド上で非天然PS1を発現するトランスジェニック非ヒト動物である。特定の実施形態においては、非機能的な改変天然PS1遺伝子を有する動物（すなわち、ノックアウト体）を作製することにより、該ヌルバックグラウンドを得る。該動物は、該改変PS1遺伝子に関してヘテロ接合（すなわち、二倍体ゲノムの染色体の各対上に異なる対立遺伝子表現を有すること）またはホモ接合（すなわち、二倍体ゲノムの染色体の各対上に同じ遺伝子表現を有すること）であることが可能であり、また、該非天然PS 1遺伝子に関してヘミ接合（すなわち、二倍体ゲノムの染色体の対の一方だけにおいて表現される遺伝子を有すること）またはホモ接合であることが可能である。好ましい実施形態においては、該動物はマウスである。特定の実施形態においては、該非天然PS1遺伝子は、野生型または突然変異対立遺伝子（疾患に関連したそれらの突然変異対立遺伝子を含む）であることが可能である。さらに別の実施形態においては、該非天然PS1はヒトPS1である。特定の実施形態においては、該PS1遺伝子は、ヒト野生型PS1対立遺伝子、ヒトA246E突然変異対立遺伝子または別の突然変異ヒトPS1である。さらに別の実施形態において、該非天然P S1遺伝子は、プロモーターに作動的に結合している。本発明で用いる作動的に結合（している）は、お互いに対する配向が様々であることが可能な２つの要素間の機能的な連結を示すために用いる。この特定の場合においては、プロモーターを、遺伝的構築物中の遺伝子コード配列から種々の距離に配置して該コード配列に作動的に結合させて、該コード配列の発現を指令させることが可能である、と当技術分野では理解されている。好ましい実施形態においては、該プロモーターは、ニューロン特異的ヒトThy-1プロモーターである。さらに別の実施形態は、本発明のこの態様の動物に由来する細胞である。本発明の１つの態様は、天然PS1ヌルバックグラウンド上に非天然PS1遺伝子を含むトランスジーンを有するトランスジェニック動物の生産方法である。この方法は、機能的PS1タンパク質をコードする天然遺伝子および改変天然PS1遺伝子に関してヘテロ接合である細胞を有する本発明のトランスジェニック動物を準備することを含む。これらの動物を、非天然PS1遺伝子を含むトランスジーンに関してヘミ接合である本発明のトランスジェニック動物と交配させて、改変天然PS1遺伝子に関してヘテロ接合および非天然PS1遺伝子に関してヘミ接合である動物を得る。後者の動物を相互交配させて、非天然PS1に関してホモ接合またはヘミ接合、および該改変天然PS1遺伝子に関してホモ接合である動物を得る。特定の実施形態においては、該方法の工程において得た動物のいずれかから細胞系を得る。本発明のトランスジェニック動物および細胞は、中枢神経系における及び動物の他の組織における非天然PS1のインビボ機能の決定において有用である。また、該動物は、組織および時期に特異的な非天然PS1発現パターンを該動物全体において研究するのに有用である。また、該動物は、非天然PS1の種々の形態の野生型および突然変異対立遺伝子が該天然PS1ヌル欠損から救助する能力を判定するのに有用である。また、該動物は、種々の化合物がインビボにおいて非天然PS 1の発現または活性のモジュレーターとして作用する能力を確認し研究するのに有用であり、あるいはインビトロ研究のための培養用細胞を提供する点で有用である。本発明の１つの態様は、Aβ産生に対する化合物の効果を検出するためのアッセイである。好ましい実施形態においては、本発明の動物を準備し、該動物を該化合物にさらし、該動物におけるAβ産生を測定することにより、該アッセイを行なう。該測定結果は、該化合物にさらされていない遺伝的に類似または同一の動物におけるAβ産生の測定結果と比較することができる。もう１つの好ましい実施形態においては、本発明の動物そのものの代わりに本発明の動物に由来する細胞集団を使用する以外は前記のとおりに、このアッセイを行なう。本発明のアッセイを行なう際には、該動物または細胞を、種々の時間にわたり種々の用量の化合物にさらす。Aβ産生に対する化合物の効果を、サンドイッチELISA、ウエスタンブロット分析および質量分析を含む当業者に公知の種々の方法により測定することができる。「さらす」なる語は、通常の意味で用いられ、細胞の環境中（例えば、培地中）に化合物を配置することにより該細胞を該化合物にさらすことを含み、また、注射、吸入、消費（consumption）、外的または内的適用、坐剤投与および当技術分野で公知の他の手段により、動物を化合物にさらすことを含む。図面の簡単な説明図1A〜1D。1Aは、置換ベクターpPS1KOを使用する標的組換えによるマウス染色体PS1遺伝子の破壊とエキソン４(E4)とを含むマウスPS1遺伝子の一部のゲノム地図を表す図である。R:EcoRI、H:HindIII。1Bは、野生型および２つの標的胚幹(E S)クローン（それぞれレーンa、ｂおよびc）ならびにヘテロ接合交配の結果として破壊されたPS1対立遺伝子に関してホモ接合（-/-）、野生型（+/+）またはヘテロ接合（+/-）となった胚(レーンd、ｅおよびf)のサザンハイブリダイゼーション分析を示す。1Cは、胚の卵黄嚢から抽出したDNAのPCR分析である。パネルA に示すプライマーを使用した場合、370bp（neoセンスプライマーおよびPS1アンチセンスプライマーによる）または500bp（PS1センスプライマーおよびPS1アンチセンスプライマーによる）の断片は、それぞれ標的または内因性PS1対立遺伝子に特異的である。該プライマーの配列は以下のとおりである：neoセンス5'-CC ATTGCTCAGCGGTGCTG-3'（配列番号1）、PS1センス：5'-CTGCTGCAGGTGGCTCTGCA-3' （配列番号2）、PS1アンチセンス：5'-CAGCTCTATACAAGCAAACAAG-3'（配列番号3 ）。1D は、胚日数18.5（E18.5）における野生型（+/+）、ヘテロ接合（+/-）およびホモ接合（-/-）PS1ノックアウト胚の全タンパク質抽出物（100mg）の免疫ブロットを示す。図2A〜21。PS1-/-胚における軸骨格、硬節および背根神経節（DRG）の異常分節。2A：E17.5胚を固定し、無傷のまま写真撮影した。同腹子対照と比較して、P S1-/-胚の全体のサイズが減少しており、その尾が太くて短いことに注目されたい。2B、2C:アリザリンレッド（骨）およびアルシアンブルー（軟骨）で染色されたPS1-/-（2B）およびPS1+/+（2C）E17.5胚の骨格標本。PS1-/-胚（2B）においては脊椎骨原基が癒合しており、一方、同腹子対照（2C）においては脊柱が規則正しく分節していることに注目されたい。2D、2E：E15.5 PS1-/-胚の矢状断面（2D）は、PS1+/-対照（2E）と比べた場合の、脊髄（*で示される）に隣接した脊柱（矢印）の異常分節および背弓（矢じり）の癒合を示す。2F、2G:E11.5におけるPS1-/-(2F)およびPS1+/-(2G)胚の硬節。パネルg中の矢印は、PS1+/-胚における硬節物質の凝縮（condensation）を示し、一方、PS1-/-胚においては分節内凝縮（パネル2F中の矢印）は未だ生じていない。アステリスクは、脊髄を示す。 2H、2I：アステリスクで示されるDRGの癒合を示すE15.5 PS1-/-胚の傍矢状断面（2H）。矢印は、未分節軸骨格を示す。アステリスクで示されるDRGは、E15.5 PS1+/-胚においては分節している（2i）。2 Dおよび2Eの切面はマッソン三色染料で染色し、2F〜2Iにおける切面はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。棒線:2F、2G＝200mm;2H、2I=100mm。図3A〜3F。PS1-/-胚における体節の異常分節。3A、3B:PS1+/-（3A）およびPS1 -/-（3B）E9.5胚を固定し、無傷のまま写真撮影した。3C、3D:PS1+/-およびPS1- /-胚の拡大図。PS1+/-胚(3C)においては、体節の規則正しい配置が明らかであり、一方、PS1-/-胚（3D）におけるいくつかの体節は、圧迫され（矢じり）癒合（ *）しているようにみえる。体節の未分節凝縮（3Dにおいて大括弧で示されている）に注目されたい。3E、3F：野生型（示していない）またはPS1+/-（3E）胚における体節の分節は、正中線を挟んで対等であり、一方、PS1-/-胚（3F）においては、体節の非対称な分節が認められる。切面はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。棒線＝100mm。図4A〜4G。PS1-/-胚におけるNotch 1およびDll 1の発現の減少。4A〜4D：E8.5 （4A、4B）およびE9.5（4C、4D）胚のホールマウントin situハイブリダイゼーションによるNotch 1 mRNA の検出。体節形成前の中胚葉におけるPS1-/-胚におけるNotch 1シグナルの減少に注目されたい（大括弧で示されている）。4E、4F：E9.5胚のホールマウントin situハイブリダイゼーションによるDll 1 mRNAの検出。体節形成前の中胚葉におけるPS1-/-胚におけるDll 1シグナルの減少に注目されたい（大括弧で示されている）。4G：E9.5胚のホールマウントin situハイブリダイゼーションによるP S1 mRNAの検出。矢印は体節を示し、大括弧は体節形成前の中胚葉を示す。対照：(4A、4C、4E、4G)；PS1-/-：（4B、4D、4F）。図5A〜5F。PS1-/-胚における中枢神経系（CNS）出血および頭蓋底変形。5A：P S1+/-(右上［側面図］および右下［平面図］)の無傷のE15.5胚と比べて、PS1-/- （左上［側面図］および左下［平面図］）においては顕著な脳出血が明らかである。5B：出血は、脳室（アステリスクで示されている）、脳を覆う結合組織（原基軟膜；矢じり）および実質（矢印）内で生じる。5Cおよび5E：E15.5 PS1-/-胚の正中矢状断面（5C）は、PS1+/-同腹子（5E）においては認められないCNS出血および頭蓋変形を示す。後頭骨基底部の著しい屈曲ならびに後脳および脳幹の下向きの配置に注目されたい。5Dおよび5F：それぞれ5Cおよび 5Eにおいて枠で囲まれた領域の拡大図であり、mPS1+/-（5F）胚と比べて、PS1-/ -（5D）においては、後頭骨基底部（矢印）と環椎との間で形成された歪曲した角（矢じり）が示されている。食道口における後咽頭（posterior pharynex）をアステリスクで示して、位置が指定されている。5B〜5Fの切面は、マッソン三色染料で染色した。5B、5Dおよび5Fの棒線＝200mm；5Cおよび5E＝300mm。図6A〜6B。（6A）野生型および突然変異ヒトPS1(それぞれhPS1およびhPS1A246 E)トランスジーン構築物を示す図である。1.4kbのPS1およびPS1-1A246E cDNAを、ヒトThy-1プロモーターとSV40スプライシング／ポリアデニル化配列との間に挿入した。該地図の下に２対のPCRプライマーを示した。該SV40プライマー対は、トランスジーン遺伝子型決定のための300bpの断片を増幅する。A246E部位を含む該hPS1プライマー対は、トランスジェニックマウスにおける突然変異部位が確認されるように設計した。（6B）Thy-PS1系統（レーン1〜4）および４つのThy-P S1A246E系統（レーン5〜8）に由来するトランスジェニックマウス中の野生型および突然変異トランスジーンの、PCRタイピング（typing）。該突然変異部位を含む320bpのPCR 断片を、hPS1プライマー対を使用して尾DNAから増幅し、DdeIで消化した。185bp および135bpの２つの断片を野生型PS1トランスジェニックマウスから得た。A246 E突然変異は、その185bpの断片中に新たなDdeI部位を作る。レーン5〜8に示されるとおり、それはDdeI消化により２つの95bpの断片に変換された。図7A〜7B。7Aは、トランスジーンの発現のノーザン分析を示す。15mg/レーンの全脳RNAを変性ホルムアミドゲルにより分離し、ナイロンメンブレンに移し、トランスジーン特異的SV40プローブでハイブリダイズさせた。下側のパネルは、 APP負荷対照を示す。7Bは、PS1ループ抗体と反応させた脳（レーン1〜7）および胚（レーン8〜9）タンパク質ライセート（60mg）の免疫ブロットであり、トランスジェニックおよび救助系統におけるヒトPS1タンパク質の発現を示している。レーン１、２は、hPS1（上側のバンド）およびmPS1（下側のバンド）に関してほぼ等しいシグナル強度を示す２つのThy-PS1トランスジェニック系統である。レーン３は、hPS1のみを発現するThy-PS1救助系統である。レーン4〜6は、hPS1およびmPS1の両方を発現する３つのThy-PS1A246Eトランスジェニック系統である。レーン４および５で表されるトランスジェニック系統が、hPS1を天然mPS1より多量に発現したことに注目されたい。レーン７は、hPS1のみを発現するThy-PS1A246E救助系統である。レーン８および９は、それぞれヘテロ接合（+/-）およびホモ接合（-/- ）PS1ノックアウトマウスに由来する18.5日の胚のタンパク質抽出物である。最下部のパネルは、β-チューブリンを負荷した対照である。図８。トランスジーン特異的SV40オリゴプローブを使用する、発生および組織に特異的なヒトPS1トランスジーン発現のin situハイブリダイゼーション分析。種々の成体脳領域および胚組織(E13.5およびE18.5)における遍在的発現を、Thy- PS1A246Eトランスジェニック系統16-3からの切片上で検出した。該トランスジェニックmRNAは、成体脳の海馬および小脳に最も豊富に存在していた。E13.5胚の矢状断面上には、脊柱および脊髄(PS1ヌル胚中で最も影響を受けた組織)に沿って強力なハイブリダイゼーションシグナルが認められる。ヒトPS1 mRNAの組織分布は、E18.5胚においてはCNSに限局するようになった。各パネルにおいて、左側の図はハイブリダイゼーションイメージを表し、右側に示す図は、100倍コールドプローブの存在下での対照切片のハイブリダイゼーションを表す。図9A〜9C。アリザリンレッドおよびアルシアンブルーで染色された新生マウスの骨格標本。野生型(9A)およびPS1ヌル(9B)サンプルと比較して、Thy-PS1A246E で救助されたマウス（9D、系統16-3）は、尾部に認められる若干のよじれ以外の脊椎欠損のほぼ完全な修復を示した。（9A）に示すとおり、それは正常な数の７個の頚椎および13個の胸椎を有し、それに対して、ノックアウトマウスでは、様々な数、すなわち4〜6個の頚椎、９〜10個の胸椎が認められる。該骨化点は、野生型骨格の場合と同様に十分に発達し、適切に組織化されている。Thy-PS1で救助されたマウス(9C、系統10-8)は、該ノックアウトマウス(9B)に対して、頚および胸領域における著しい改善を示した。しかし、それは依然として肋骨を欠き、その腰−尾分節は組織化されておらず、脊椎の分裂および尾のねじれにつながる遅延した非対称な骨化を示した。発明の詳細な説明本発明は、天然PS1タンパク質を欠く（PS1ヌル）トランスジェニック非ヒト動物、および天然PS1の存在下または不存在下に発現される非天然PS1タンパク質を有する動物に関する。本発明のトランスジェニック動物は、PS1遺伝子およびタンパク質の発現および活性、PS1の発現および活性に対するFAD突然変異の効果、PS1遺伝子またはタンパク質の活性のモジュレーター、および中枢神経系にかかわる障害（例えば、アルツハイマー病）の諸態様の研究に使用することができる。 PS1欠損トランスジェニック非ヒト動物（マウスを含む）の作製は、PS1のインビボ機能を明らかにするのに役立つ。そのようなPS1ヌル動物は、ヒトPS1遺伝子を挿入するための系統として使用することができ、PS1の活性および発現を調節するための種々のアプローチの設計および評価において有用な動物モデルを提供する。また、そのような修飾されたトランスジェニック非ヒト動物は、細胞培養用の細胞の起源として使用することができる。これらの細胞は、PS1の発現、活性およびその調節の、対応するインビトロ研究に使用することができる。マウスPS1遺伝子は、約75kbのサイズを有し、10個のエキソンによりコードされている。ヒトPS1 cDNAは約1.4kbである。活性なPS1遺伝子を有さない動物は、動物の発生における及び中枢神経系におけるPS1の役割を評価するために使用することが可能であろう。しかしながら、そのような動物の作製が可能か否か、例えば、そのような動物が生存可能であるか否かは公知ではなかった。本発明においては、ヌル致死性表現型を示すPS1ノックアウトマウス、およびマウスノックアウトバックグラウンドにおいてヒト野生型またはFAD突然変異PS1を発現するトランスジェニックマウスの両方の作製を記載する。不活性化天然PS1 対立遺伝子に関してヘテロ接合であるマウスおよびヒトPS1遺伝子を保持するマウスを相互交配させて、発現される唯一のPS1がヒト由来のものであるPS1トランスジェニックマウスを作製した。ヒト遺伝子の野生型および代表的FAD突然変異形態の両方を使用する。これらの動物は、FADの諸態様を研究するための動物モデルとして有用である。本発明は、PS1遺伝子の一部または完全なコード配列をコードする核酸分子を使用する。改変されたPS1遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製する。該動物中に天然に存在するPS1遺伝子を、天然遺伝子と称することにする。また、それが突然変異体でない場合に、それを野生型と称することもある。天然遺伝子に対する改変には、修飾、欠失および置換が含まれる。修飾、欠失および置換は、該天然遺伝子を非機能的にして「ノックアウト」動物を与えることが可能であり、あるいは改変された発現または活性を有するPS1を与えることが可能である。これらのトランスジェニック動物は、薬物のアンタゴニストまたはアゴニストの研究、ヒトの疾患の動物モデル、およびPS1に関連した障害または疾患の治療の試験に有用である。天然PS1を欠くトランスジェニック動物は、PS1のインビボ機能の特徴づけにおいて有用である。天然PS1の不存在下に非天然PS1を保持するトランスジェニック動物は、PS1が関与する疾患に関する非ヒトモデルの確立、非天然PS1の研究、非天然遺伝子のモジュレーターの研究、およびインビボおよびインビトロ系における非天然PS1の活性の識別に有用である。驚くべきことに、本発明のヌル致死性ノックアウト動物は、ヒトPS1トランスジーンが存在する場合には、該非天然遺伝子が野生型であるか突然変異対立遺伝子であるかに無関係に、生存可能である。したがって、該ノックアウト動物を救助し、該トランスジェニック動物に固有のPS1遺伝子に由来するいずれかのバックグラウンド効果の不存在下における種々のPS1遺伝子または特定のPS1遺伝子の種々の修飾体の研究において使用することが可能である。本発明においては、「動物」なる語は、すべての哺乳動物を含むものとして使用されるが、トランスジェニック動物に言及する場合には、該用語は、ヒトを除外するものとして使用される。また、それは、胚および胎児段階を含むすべての発生段階の個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」は、マイクロインジェクションまたは組換えウイルス感染などによる細胞以下のレベルでの意図的な遺伝子操作により直接的または間接的に付与された遺伝情報を保持する１以上の細胞を含有する動物である。この導入されたDNA分子は、染色体内に組込まれることが可能であり、あるいはそれは、染色体外複製DNAであることが可能である。特に明示していたり動物の記載の文脈から理解される場合を除き、本発明で用いる「トランスジェニック動物」なる語は、該遺伝情報が生殖細胞系細胞中に導入されていることにより該情報が子に伝達されうるトランスジェニック動物を意味する。子が実際に該遺伝情報の一部または全部を有する場合には、それらもまた、トランスジェニック動物である。該遺伝情報は、典型的には、該トランスジェニック動物が保持するトランスジーンの形態で与えられる。該動物が受容する遺伝情報は、該受容動物が属する動物種にとって異種であることが可能であり、あるいはその特定の受容動物のみに異種であることが可能である。後者の場合には、該情報は改変されることが可能であり、あるいはそれは、該天然遺伝子とは異なって発現されることが可能である。あるいは、該改変または導入遺伝子は、該天然遺伝子を非機能的にして、「ノックアウト」動物を与えることが可能である。本発明で用いる「標的（targeted）遺伝子」または「ノックアウト」（KO）は、人間の介入（例えば、本明細書に記載の方法が含まれるが、これらに限定されるものではない）により非ヒト動物の生殖細胞系中に導入されたDNA配列である。本発明の標的遺伝子は、同類（cognate）内因性対立遺伝子を特異的に改変するように設計された核酸配列を含む。改変されたPS1遺伝子は、宿主動物に固有のものと同じPS1を完全にはコードしていないはすであり、その発現産物は、多少なりとも改変されているか、あるいは全く存在しないことが可能である。天然PS1遺伝子の不存在下でトランスジェニック動物中で非天然PS1遺伝子を発現させるのが有用な場合には、該改変PS1遺伝子が該動物中でヌル致死性ノックアウト表現型を誘導するのが好ましい。しかしながら、より控えめに修飾されたPS1遺伝子が有用な場合もあり、そのような遺伝子も本発明の範囲内に含まれる。トランスジーンの導入のための標的細胞の型は、胚幹細胞（ES）である。ES細胞は、インビトロで培養された移植前の胚から得ることができ、胚と融合することが可能である（M.J．Evansら，Nature 292:154-156(1981);Bradleyら，Nature 309:255-258(1984);Gosslerら．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:9065-9069(19 86)およびRobertsonら，Nature 322:445-448(1986)）。トランスジーンは、DNA トランスフェクション、マイクロインジェクションなどの種々の標準的な技術により、あるいはレトロウイルス媒介性導入により、ES細胞中に効率的に導入することができる。ついで、得られた形質転換ES細胞を、非ヒト動物由来の胚盤胞と合体させることができる。ついで該導入ES細胞は該胚をコロニー化（colonize）し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（R．Jaenisch，Science 240:1 468-1474(1988)）。 PS1の機能は複雑だと考えられているか、それは、種々の方法で検討することが可能である。個々の遺伝子およびそれらの発現産物の寄与の判定の問題に対する１つのアプローチは、単離された遺伝子を使用して、全能性ES細胞（例えば、本明細書に記載のもの）中で天然野生型遺伝子を選択的に不活性化し、ついでトランスジェニックマウスを作製することである。標的化相同組換えを用いて染色体対立遺伝子中に特異的変化を挿入することにより、任意の遺伝子領域を不活性化または改変して所望の任意の突然変異を得るための技術が利用可能である。遺伝子標的化トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ES細胞の使用は、1987年に記載されており(Thomasら，Cell 51:503-512，(1987))、種々の刊行物において概説されている（Frohmanら，Cell 56:145-147(1989);Capecchi，Trends in G enet．5:70-76(1989);Baribaultら，Mol．Biol．Med．6:481-492，(1989);Wagne r，EMBO J．9:3025-3032(1990);Bradleyら，Bio/Technology 10:534-539(1992) ）。標的化組換え事象および得られたノックアウトマウスを評価するための方法は、容易に利用可能であり、当技術分野において公知である。そのような方法には、DNA(サザン)ハイブリダイゼーション（標的対立遺伝子を検出するためのもの）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびウエスタンブロット法（DNA、RNAおよびタンパク質を検出するためのもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない。以下の実施例は例示として記載されており、また、他の種々の実施形態が当業者には明らかであるため、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。実施例１マウスプレセニリン１遺伝子ターゲッティングベクターの構築マウスPS1遺伝子のエキソン４を含有するゲノムクローンを、129Sv系統のマウス（Lambda FIX II library，Stratagene，La Jolla，CA）から単離した。制限部位および第４エキソンに関するマウスPS1遺伝子のゲノム構成の知見から、PS1 遺伝子を不活性化するための遺伝子ターゲッティングベクターを、標準的なクローニング技術（Sambookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，1989）により調製した。図1Aに関しては、該ターゲッティングベクター(pPS1KO(ATCC 98433、1997年５月14日付けで寄託)は、左から右に、PS1遺伝子座に5'相同性である6.0kb；PS1遺伝子とは逆配向で挿入されたPGKneo発現カセット;PS1遺伝子の3'部分に相同な1. 7kbの断片を含有する。ネガティブセレクション用に、MC1-TK遺伝子を該5'相同配列の上流にクローニングした(Mansourら，336，348-352，(1988) )。該ベクターと該野生型PS1遺伝子座との間の標的化組換えにより、エキソン４を含む該PS1遺伝子の1.9kbが欠失し、ついでそれはネオマイシン耐性遺伝子で置換される。実施例２マウスES細胞におけるPS1遺伝子の標的破壊 PS1遺伝子破壊実験においては、実施例１のpPS1KOターゲッティングベクターを使用した。該ベクターをユニークBamHI部位で線状化した後、AB2.1ES細胞中にエレクトロポレーション導入した。該AB2.1ES細胞をSNLフィーダー細胞（Robert son， Teratocarcinomas and embryonic stem cells，IRL Press，pp.71-112( 1987)）上で培養し、標的化PS1クローン（Zhengら，Cell 81:525-531(1995)）の選択を、当技術分野で公知の技術により行なった。野生型AB2.1細胞および該クローンからのES細胞DNA(8μg)を制限酵素HindIIIで消化し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動し、Gene Screen Plusナイロンメンブレン（NEN-Dupont）上に移した。サザンブロット分析に使用するハイブリダイゼーションプローブは、該3' 相同配列の下流の0.7kbのEcoRI-HindIII断片であった（図1A）。8.7kbの野生型対立遺伝子および2.6kbの標的対立遺伝子を与えるHindIII消化を用いて、該対立遺伝子を識別した。該野生型8.7kb断片に加えて、その2.6kbの診断的断片が、該標的クローン中のプローブにより検出される。分析した合計700個のクローンから、合計55個の標的クローンを同定した。６個のクローンを更なる実験に使用した。実施例３キメラマウスの作製別の実験において、通常の技術(Bradley，A．"Production and analysis of c himeric mice．In Teratocarcinomad and Embryonic Stem Cells:A Practical A pproach"，E.J．Robertson編．Oxford:IRL Press，(1987)，pp113-151)を用いて、６個のPS1標的ESクローンをC57BL/6Jレシピエント胚盤胞中に注入した。ES細胞系AB2.1は、アグーティ（A）毛色遺伝子に関してホモ接合であるため、注入された（黒毛色）C57B1/6胚盤胞中へのES細胞の浸透は、キメラ毛色マウスを与える。それらの６個のESクローンのなかで、クローン＃300は７匹の雄キメラおよび０匹の雌キメラを産生し、該キメリズムは90％〜100％であった。クローン#68 8は、３匹の雄キメラおよび１匹の雌キメラを産生し、キメリズムは50％〜100％であった。実施例４ヘテロ接合PS1ノックアウトマウスおよびホモ接合PS1ノックアウト胚の作製該キメラマウスを野生型C57BL/6雌マウスと交配した。アグーティ色の子の出現から明らかなとおり、クローン#300およびクローン#688の両方で、生殖系細胞の伝達が達成された。PS1遺伝子型を決定するために、各マウスから採取した約1 cmの尾からゲノムDNAを精製した。前記のサザンハイブリダイゼーション分析を用いて、破壊されたPS1対立遺伝子を含有する子を確認した。野生型AB2.1細胞およびクローン#300および#688からのES細胞DNAを、対照として使用した。これらのトランスジェニック子マウスは、PS1破壊に関してヘテロ接合であった。該改変マウスPS1対立遺伝子の１コピーをそれぞれが含有する雄および雌トランスジェニックマウス(ヘテロ接合マウスまたはPS1+/-)を相互に交配させて、該PS1遺伝子の両方のコピーが該標的改変PS1対立遺伝子をコードしているマウス（ホモ接合マウスまたはPS1-/-）を作製した。該マウスが生存可能である限り、該マウスの４分の１は該改変PS1 遺伝子に関してホモ接合であると予想された。60匹を超える一腹子からのマウスを、ホモ接合性に関して評価したが、いずれにおいても確認されなかった。このことは、PS1-/-マウスがヌル致死性表現型を有することを示している。マウス胚の60匹を超える一腹子を評価したところ、マウス胚のホモ接合体PS-/-が、E8.5 〜E18.5の妊娠の種々の段階において、予想されるメンデル頻度で存在することが確認された。実施例５ウエスタンブロット分析によるPS1の不活性化の確認胚日数18.5(E18.5)における野生型(+/+)、ヘテロ接合(+/-)およびホモ接合(-/ -)PS1ノックアウト胚の全タンパク質抽出物（100mg）の免疫ブロットを行なった（図1C）。使用した抗体は、N末端（AB14）および「ループ」領域（PS1ループ）中のエピトープに特異的なウサギポリクローナル抗血清である。スーパーオキシドジスムターゼ１(SOD1)を、内部標準として使用する。 PS1+/-マウスにおいては、対照同腹子のレベルの約50％にまでPS1誘導体が蓄積する。ホモ接合PS1ノックアウト（PS1-/-）胚は、PS1関連ポリペプチドの蓄積の証拠を何ら示さなかった。したがって、このことは、該ホモ接合胚中の遺伝子の完全な不活性化を証明している。実施例６ホモ接合PS1欠損マウスの特徴づけ調べた60匹を超える同腹子のなかには、生後１日以降に生存するホモ接合PS1- /-マウスはいなかった。しかしながら、PS1-/-胚は、E8.5〜E18.5の妊娠の種々の段階において、予想されるメンデル頻度で存在した（>60匹の同腹子を調べた）。現在のところ、本発明者らは、PS1の突然変異対立遺伝子に関してヘテロ接合であるマウスにおいては、いずれの発生欠陥も観察していない。 PS1-/-胚において認められる最も顕著な表現型は、軸骨格の発生における著しい乱れであった。PS1-/-突然変異胚(E10.5〜E18.5)は、対照より小さく、また、太くて短い尾を有する（図2A）。アリザリンレッドおよびアルシアンブルー染色を用いるPS1-/-E17.5胚の骨格の組織化学的分析は、脊柱（図2B、2C）および肋骨（示されていない）の分化における著しい欠損を示した。四肢は正常であるようであった。以下のとおりに、胚を調製し切片化した。胚を４％パラホルムアルデヒド中、27℃で２時間固定し、脱水し、パラフィン中に包埋し、10mmで切片化した。組織学的分析のために、切片をヘマトキシリン・エオシンまたはマッソン三色染料で染色した。E15.5PS1-/-胚からの正中矢状断面においては、対照と比べて、脊柱が劇的に短縮しており、適切な分節を受けていないことが認められる（図2D、2E）。また、変形および異常配向（脊柱に関して）を含む後頭骨基底部（頭蓋底）の異常が明らかであった（図2D）。これに対して、対照胚は、脊柱に対してほぼ垂直な位置に存在する正常な頭蓋底を示している（図2E）。PS 1-/-動物においては軸骨格の発生が著しく乱れているという知見は、硬節の分化における欠損を示すものであった。PS1-/- E11.5胚と対照との比較は、PS1-/-胚における硬節の凝縮が、該硬膜の腹側正中部が分化し凝縮し次いで前体節部から分離している対照同腹子と比べて（図2G）、著しく遅延していることを示した（図2F）。これらのデータは、遅延した硬膜凝縮が脊柱の発生における欠損を招くことを示している。興味深いことに、PS1-/-胚における背根神経節（DRG）が、脊柱の頭蓋−尾軸に沿って多数の分節にわたり癒合していた（図2H、2I）。総合すると、PS1-/-胚における硬膜の凝縮の遅延およびDRGの癒合は、これらの表現型が、より初期の体節生成の欠損の結果として生じた可能性があることを示した。PS1-/-胚において体節生成が影響を受けるか否かを確認するために、体節が生成されつつある時期にあたるE8.5〜E10.5の胚を調べた。無傷E9.5 PS1-/-胚からは、不規則な形状の体節が神経管の全長に沿って認められ、最尾側領域には体節はほとんど存在していなかった（図3Bおよび 3D）。さらに、E9.5 PS1-/-胚の組織学的検査は、体節が正中線を隔てて正確に合っている野生型胚と比べて、体節の整列不良（misalignment）を示した（図3F ）。 PS1-/-胚と機能的に不活性化されたNotch 1（Conlon，R.A．ら，Development ，121:1533-1545(1995)）またはDll 1（Hrabede Angelis，Mら，Nature，386:71 7-721(1997)）対立遺伝子を有する胚とにおける体節分節欠損の類似性を考慮して、本発明者らは、PS1-/-胚におけるNotch 1およびDll 1のmRNAの発現を検討した。E8.5およびE9.5胚において対照胚の体節形成前の中胚葉で認められたNotch 1 mRNAの豊富な発現（それぞれ図4Aおよび図4C）は、PS-/-胚においては、ほとんど損なわれている（それぞれ図4Bおよび図4D）。Dll 1 mRNAの発現の分析は、 E9.5対照胚の体節形成前の中胚葉においては高レベルの Dll 1 mRNAが認められ（図4E）、一方、PS1-/-胚においてはこのレベルが著しく減少することを示した（図4F）。さらに、PS1mRNAはまた、Notch 1およびDll 1 よりかなり低いレベルではあるものの、野生型胚における体節形成前の中胚葉および体節において発現されることが確認された（4G）。これらのデータは、PS1が軸傍中胚葉におけるNotch 1およびDll 1の時空間的発現を調節するように機能することを示している。体節形成前の中胚葉における Notch 1またはDll 1 mRNAの細胞自律的増幅に必要な外因性または内因性情報伝達経路にPS1が影響を及ぼす個々の機作は、依然として明らかではない。 PS1-/-胚の発生中の脳の細胞充実性および細胞構築は正常であるようにみえたが、E11.5以降のすべてのPS1-/-胚は、脳(図5A)および／または脊髄に限局した出血を示した。これらの病変は、PS1+/-またはPS1+/+同腹子においては認められなかった。出血の重症度は、個々の胚によって様々であった。出血の起源を確認するために、本発明者らは、E13.5におけるPS1-/-胚を組織学的に検査し、該出血が脳室内の原基硬膜および軟膜の下および神経実質に存在することを確認した（図5B）。実施例７ニューロン特異的ヒトThy-1プロモーターを使用することによるヒトPS1発現ベクターの構築 KpnI-BamHIで消化されPS1(またはPS1A246E)cDNA配列を含有する1.8kbの断片を、KpnI-BglIIで切断されたpHZ024ベクターに連結することにより、ニューロン特異的ヒトThy-1プロモーターの制御下にPS1対立遺伝子を有する発現ベクターThy- PS1（ATCC 209034、1997年５月15日付けで寄託）およびThy-PS1A264E（ATCC 209 035、1997年５月15日付けで寄託）を作製した。該挿入遺伝子の方向は、制限消化により確認した。また、該構築物を部分的に配列決定して、該突然変異を確認した。プラスミドpHZ024の詳細な構造は以下のとおりである。 a．pBSHT1は、pBSV（MRC，Mill Hill，London，UKのF．Grosveld博士から提供された；Rijsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5832-5835，1985）中にヒトThy -1遺伝子（hThy-1）の8kbのEcoRI断片を含有する。 b．hThy-1プロモーターとATG翻訳開始コドンとを含有するpBSHT1の3.7kbのEcoRI -BglII断片を、pTZ18uのEcoRIおよびBamHI部位中にクローニングした。得られたプラスミドをpH020 と称することにした。 c．ATG開始コドンを含有する1.6kbのBamHI-BglII断片を、pTZ18uのBamHI部位中にクローニングした（pHZ021a）。鋳型としてpHZ021を、プライマーとしてオリゴヌクレオチドT7（pTZ18uバックボーン中）およびoHZ002(ATG開始コドンの位置 )を使用してPCR増幅を行なって、1.3kbの産物を得た。該プライマーの配列を以下に示す。以下に図示するとおり、oHZ002はATGコドンを破壊し、該PCR産物中にポリリンカークローニング部位を導入した。 d．pHZ020上でNcoI部分消化を行なって該下流部位で切断し、ついでXbaIでの完全消化のみを行なって、ATGコドンを含有するNcoI-XbaI断片を遊離させた。1.3k bのPCR産物をNcoI-XbaI で消化し、NcoI-XbaIで消化されたpHZ020中に挿入した（pHZ022）。 e．pSV2neoのSV40スモールTイントロンの上流のSmaI部位にBglIIリンカーを挿入した（pHZ023）。（Southern，P.J.およびBerg，P.J．Mol Appl．Genet．1:327，1982.） BglIIリンカー：d(CAGATCTG) f．1.0kbのSV40スモールTイントロンおよびポリAを、pHZ023のBglIIおよびBamHI 消化により単離し、BglIIで消化されたpHZ022中に連結した。得られたプラスミドpHZ024は、以下の特徴を有する。 1．該ベクターは、２つの調節要素、すなわち、脳特異的発現のためのヒトT hy-1プロモーターと、該トランスジーンの適切な発現のためのSV40スモールTイントロンおよびポリA配列とを含有する。 2．hThy-1遺伝子のATG開始コドンが変異された。 3．トランスジェニックマウス中で発現させる遺伝子の挿入のために、ポリリンカークローニング部位をhThy-1プロモーターの下流に導入した。実施例８ヒトThy-1プロモーターにより調節されるヒトPS1タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作製ヒトThy-1プロモーター、PS1(またはPSA246E)cDNAおよびSV40配列を含有する5 .8kbのEcoRI-XbaI断片を、前記の発現プラスミドから切り出し、ゲル精製し、文献記載(Hogan，Bら．Manipulating the Mouse Embryo，a Laboratory Manual．C old Spring Harbor Laboratory，1986)のとおりにB6SJL/F1胚の前核中に注入した。PCRおよび／またはサザンハイブリダイゼーションにより同定したファウンダーをB6SJL/F1ハイブリッドマウスと交配させ、トランスジェニック子マウスを PCRにより同定した。トランスジーン特異的SV40プライマー対を、PCRタイピングにおいて使用した。号8）（Renekerら，Development 121:1669-1680(1995)）。ヒトPS1を発現するトランスジェニック系統を、脳ライセートに関するノーザンおよびウエスタンブロット分析により同定した。ホモ接合個体を、尾DNAについてサザン分析により選択した。野生型および突然変異トランスジェニック系統において、トランスジーンの種類をPCRタイピングにより同定した。該突然変異部位を含むhPS1PCRプライマー対は、マウス尾DNA由来の320bpの断片を増幅するように設計し、以下のプライマーを使用した。 Thy-PS1トランスジーンからのPCR産物を制限酵素DdeIにより切断して、185bp および135bpの２バンドのパターンを得ることが可能である。Thy-PS1A246Eトランスジーンからの同じPCR産物は、A246E突然変異のために該185bp配列中に追加的なDdeI部位を含有している。該突然変異は、DdeI消化を受けると該185bp断片を２つの95bp断片に変換し、135bpおよび95bpの２バンドのパターンを与える。トランスジェニックマウスに関するPCR遺伝子型決定は、該野生型および突然変異トランスジェニック系統のすべてが、正しいトランスジーンを保持することを証明した（図6B）。実施例９トランスジェニックマウスの分析 A．ノーザン分析によるヒトPS1 RNA発現種々の系統におけるトランスジーンの発現の初期評価のために、ノーザン分析を用いた。Stratagene RNA精製キットを使用して、全脳RNAを個々のトランスジェニック系統から単離した。15mgのRNA/系統を1.5％MOPS-ホルムアルデヒド遺伝子上で分離し、GeneScreen Plusメンブレンに移し、SV40スプライシング／ポリアデニル化プローブまたはヒトPS1 cDNAプローブを使用して標準的な方法によりハイブリダイズさせた。発現している系統におけるヒトPS1 mRNAの量は、内因性マウスPS1 mRNAのレベルの0.5倍〜3倍であった（図7A）。 B．ウエスタンブロットによるヒトPS1タンパク質の定量抗ループPS1抗体を使用する脳タンパク質ライセートについてのウエスタンブロット測定（Thinakaranら，Neuron 17:181-190(1996)）は、ヒトおよびマウスの両方のPS1のタンパク質分解切断された19kDaのC末端断片を検出した。ヒトPS1タンパク質を発現する３個のThy-PS1系統および６個のThy-PS1A246E系統を同定した。これらの系統のヒトPS1レベルは、内因性マウスPS1の約1/4〜2倍である（図7Bおよび表1）。該タンパク質発現レベルは、該mRNAレベルと良く相関している。 C．in situハイブリダイゼーションによるヒトPS1 mRNAの分布脳切片上でトランスジーン特異的SV40オリゴプローブを使用するin situハイブリダイゼーション（Sirinathsinghjiら，Molecular Imaging in Neuroscience ，Sharif編，pp43-70，Oxford University Press，New York，(1993)）は、該ヒトPS1 mRNAが脳全体で発現されるが海馬および小脳に最も豊富に存在することを示した（図8）。また、本発明者らは、E9.5、13.5および18.5のトランスジェニック胚に関して、胚形成中のトランスジーン発現パターンを調べた。ホールマウントE9.5胚において、対照バックグラウンドを超える弱く遍在的なトランスジーン発現が検出された（データは示していない）。該シグナルは、E13.5には、より強力になり、ヌル胚において最も影響を受けた領域である脊柱および脊髄に沿った領域で最も顕著となった（図8）。E18.5になると、トランスジーン発現はCNSに局在するようになった（図8）。実施例10ヒトPS1トランスジーンにより救助されるPS1ノックアウトマウスの作製ヒトPS1トランスジェニックマウスを、ヘテロ接合PS1ノックアウトマウスと交配させた。二重ヘテロ接合F1を、PCRタイピングにより選択し、相互交配させて、１または２コピーの該ヒトトランスジーンと共に該ノックアウト対立遺伝子に関してホモ接合である子マウスを得た。 Thy-1プロモーターは、ニューロンおよび胸腺組織において顕著に活性であり、他の末梢組織においては、それより実質的に低活性であり、出生前発生中にはいくぶんか弱くなると報告されている（Kollias，PNAS 84:1492-1496(1987)，Go rdonら，Cell 50:445-452(1987)）。一方、PS1ヌルマウスの欠損脊椎およびCNS 出血表現型は、PS1発現が、胚形成の初期段階から、体節形成組織、そしておそらくCNS脈管系において必須となることを示唆している。本発明者らのin situハイブリダイゼーションのデータ（図8）は、Thy-1プロモーターが、早くも胚日数 E9.5において活性化されうることを示した。この遍在的発現はE18.5ではCNSに局在するようになるが、その活性は、E13.5 においては非常に強力かつ広範である。明らかに、この動的Thy-1プロモーターは、正常な発生に必要な決定的に重要なPS1活性を付与する能力を有していた。該野生型および突然変異Thy-PS1トランスジーンは共に、該PS1ヌルマウスの胚の致死性を救助し、本発明者らは、ヒトPS1タンパク質だけを発現する救助系統を確立することができた。実施例11ヒト化PS1トランスジェニックマウスの表現型の特徴づけ A．野生型トランスジーンで救助されたマウス試験した２つのThy-PS1系統のうち、系統10-8は、ヌル致死性を部分的に救助した。このトランスジーンに関してヘテロ接合またはホモ接合である救助された子マウスは、生存可能であり、稔性であった。これらのマウスは依然として、それらの脊椎骨格の或る程度の変形を有し、それらは、野生型同腹子より成長が遅い傾向にあったため、この救助は部分的であった。それらは、体長が短く、著しくねじれているか又は留め金状の外観の非常に短い尾を有する。それらの救助された雌においては、低い稔性率が認められた。雄は完全に稔性であるが、正常マウスより成熟が遅い。図9Cは、救助された新生動物の、アルシアンブルーおよびアリザリンレッドで染色された骨格標本を示す。その救助された新生子は、該ヌル子マウスより大きく、ノックアウトマウスと比べて頚および胸領域における著しい改善を示した( 図9B、9C)。野生型の脊柱は、通常、７個の頚椎および13個の胸椎（これらは同じ数の肋骨を支持する）を有する。ヌル動物では、頚分節の数が4〜6個に減少しており、それと共に、環椎（C-1脊椎）が存在せず、隣接分節の頻繁な癒合が認められた。胸分節および肋骨の数は、9〜10個に減少しており、これらもまた、頻繁に癒合していた。救助効果の、頭蓋-高-尾-低の勾配が明らかである。最良の改善は頚領域で認められ、この領域では、７個の頚椎の完全な組が回復していた。該胸椎および肋骨は、野生型骨格と同様の程度の骨化を示し、もはや圧縮されていなかったが、それは、11個の分節しか有していなかった。該腰-尾椎は依然として乱れており、分裂した脊椎およびねじれた尾を与える遅延した非対称な骨化を示した。脊柱における、より遅い骨化は、それらのより遅い成長の一因となることは明らかである。ヘマトキシリン・エオシン（H&E）で染色されたE15.5胚切片上、ヌル胚の頚領域で認められる欠損は完全に修復され、出血は何ら検出されなかったが、後部脊椎の欠損は維持された。もう１つの野生型トランスジェニック系統17-2による救助の程度は不均一となるらしい。該子マウスの大多数は、系統10-8と比べて同様の程度にまで救助されたが、その他は、ほぼ完全な救助を示しているようにみえる。この不均一性は、それらのコピー数の相違によるものである可能性がある。 B．突然変異トランスジーンで救助されたマウス４つのThy-1A246E突然変異トランスジェニック系統を、それらがノックアウト動物のヌル致死性表現型を救助する能力について試験した。該系統のうちの２つ（系統16-3および16-4）は、野生型ヒトPS1対立遺伝子を有する系統と同様またはそれより良好な程度の救助をもたらした。この子マウスの大多数は若干のよじれ又はねじれを有するにすぎず、その他は、野生型マウス対照と区別できない。図9Dは、系統16-3からの突然変異トランスジーンに関してヘテロ接合である救助された新生子の骨染色を示す。マウス野生型骨格（図9A）と比較して、それは、正しい数の頚椎および胸椎を有し、正常レベルの骨化を示した。該構造は、尾の若干のよじれ以外はほとんど完全に正常に見える。ヘテロ接合系統16-3で救助されたマウスの少数は、依然として、E15.5胚切片上で認められる肋骨の欠落から後部分節の変形にわたる有意な脊柱欠損を示している。この場合もまた、救助されたこれらのマウスにおいては、出血は認められなかった。表現型に関して十分に救助されたマウスは完全に稔性である。系統16-3におけるトランスジーンの用量を二倍にすると、救助活性が増加した。なぜなら、ホモ接合マウスは、表現型において正常であり、それらのヘテロ接合同腹子に存在する尾部欠損を有さなかったたからである。残りの２つの突然変異系統（系統16-1および22-1、表1）は、該ノックアウト欠損の重症度を減少させるようではあったものの、胚致死性を救助しなかった。ほとんどのトランスジーン＋ヌル胚は、妊娠を完結させる能力を有し、生後になってはじめて死亡した。骨染色は、救助されていないヌル子マウスの場合と比べて、脊柱の若干優れた骨化およびより良好な整列を示した（データは示していない）。興味深いことに、該トランスジーンの遺伝は、これらの動物の軸骨格における改善がほとんどなかったにもかかわらず、これらの動物からCNS出血をなくした。これらの２つの系統は、次善的な胚トランスジーン発現を引き起こす可能性があり、PS1矮小体型対立遺伝子とみなすことが可能である。出血および骨格欠損の修復に差があることは、これらの動物が、出血ではなく脊椎変形で死亡することを示唆している。実施例12マウスの交配本発明のトランスジェニック動物は、家族性アルツハイマー病（FAD）突然変異を含有するヒトAPPを過剰発現するトランスジェニック動物との交雑に使用することができる(Games，Dら，Nature 373:523-527(1995)，Hsiao，Kら，Science 274:99-102(1996))。得られたマウスは、天然PS1ヌルバックグラウンド上のFAD 突然変異の存在下または不存在下にAPPおよびPS1の両方を発現することになる。 APPのプロセシングおよびβ-アミロイドペプチド（Aβ）の産生に対するPS1およびPS1FAD突然変異の効果を、インビボおよびインビトロの両方において研究することができる。特に、AD関連病理の発生および重症度は、免疫組織化学的方法により調べることができる。Aβレベルは、これらの動物からの脳ライセートを使用してアッセイすることができる。また、該トランスジェニック動物の脳組識または他の組織からの細胞をインビトロで培養することが可能であり、APPおよびPS1の可能な相互作用を培養細胞中で調べることが可能である。後記のアッセイにおいて、これらの動物および培養細胞を使用することができる。実施例13A βレベルの分析本発明の動物および培養細胞は、APPの発現およびプロセシングならびにAPPの発現およびプロセシングに対するPS1 FAD突然変異の効果の研究に使用することができる。脳Aβレベルを、マウスおよびヒトPS1対立遺伝子の種々の組合せを有するトランスジェニクマウスから測定した。その結果は、マウスPS1ヌルバックグラウンド上で突然変異PS1タンパク質を発現するマウスが、Aβ42(43)のレベルおよびAβ42(43)/40の比率における非常に有意な増加をもたらすことを示しており、このことは、該FAD突然変異タンパク質が、内因性野生型マウスPS1の発現を必要としないAβ42(43)産生に関して有害な作用を有することを示している。この結果は、本発明の救助されたマウスおよびそれに由来する細胞系が、アルツハイマー病の病因のこの態様を研究するためのモデル系として役立ちうることを示している。また、該マウスおよび細胞は、Aβ42(43)のレベルおよびAβ42(43)/40の比率における増加をもたらしうる化合物の検出および研究のためにインビボおよびインビトロアッセイ系において使用することができる。アッセイ系は、本明細書に記載のものであることが可能である。さらに、これらの動物および細胞は、当技術分野で公知のタイプのアッセイにおいて使用することができる。 Aβの測定該ヒトPS1トランスジーンによる、マウスにおけるPS1ヌル致死性の救助は、ヒトおよびマウスPS1対立遺伝子の種々の組合わせを有するトランスジェニックマウス（利用可能な唯一のPS1がヒト由来のものであるヒト化PS1マウスを含む）の脳内のAβレベルの分析を可能にする。マウスAβ40およびAβ42(43)のレベルを、内因性マウスPS1の０個（PS-/-）、１個(PS+/-)または２個(PS+/+)の対立遺伝子と組合されたThy-PS1（系統10-8）およびThy-PS1A246E(系統16-3)トランスジェニックマウス（3月齢）の脳ライセートにおいて、当技術分野で公知のBNT77/B A27およびBNT77/BC05定量サンドイッチELISA アッセイ(Gravinaら，1995 J．Biol．Chem．270:7013-7016；Duffら，1996)により測定した。トランスジェニックマウスからの脳の半分（hemibrain）を、70%ギ酸中でホモジナイズした。ホモジネートを100,000gで１時間遠心分離した。該上清を回収し、中和し、マウスAβ40およびAβ42(43)レベルを測定した。いくつかの有意な知見が、この分析から得られる(表2)：i）マウスPS1に関してヘテロ接合であるマウス（PS1+/-）は、野生型対照と比べて、Aβ40およびAβ 42(43)の両方の、より低い、より高くないレベルを与える。この知見は、Aβ42( 43)産生に対するPS1 FAD突然変異の効果が、PS1機能の喪失によるものではないことを示している；ii）公開されている結果（Duffら，1996;Borcheltら，1996 ，Citronら，1997）と一致して、Aβ42(43)の量は、突然変異PS1 FADタンパク質が発現される場合にのみ増加する（表2）。Aβ42(43)/40の比率における最も劇的な増加は、マウスPS-/-、Thy-PS1A246E遺伝子型で認められ、対照の値が0.163 であるのに対して、その値は0.394である。hPS1A246Eで救助された系統における Aβ42(43)/40の比率の増加は、Aβ42(43)の増加およびそれに伴うAβ40の減少の両方より生じる（表2）。この系統において産生される唯一のPS1タンパク質はヒト形態PS1A246Eであるため、Aβ42(43)の増加は、このFAD突然変異に伴っていると結論できる；およびiii）内因性マウス野生型PS1の除去は、Aβ4 0の定常状態レベルを減少させるらしい。なぜなら、それは、PS1+/-マウスにおいては及びヒトThy-PS1またはThy-PS1A246Eトランスジーンのいずれかで救助されたPS1-/-マウスにおいては、有意に、より低いからである。しかしながら、PS 1-/-マウスは生存可能でないため、この概念の直接的な証明を得ることはできない。ヒトPS1トランスジーンに関してヘテロ接合またはホモ接合であるマウスにおいては、Aβ40またはAβ42(43)レベルの有意な相違は検出されなかった。また、野生型系統10-8に匹敵する発現レベルを有するもう１つの突然変異系統16-4により救助されたヌルマウスは、より高い発現系統16-3の救助マウスと同様の脳Aβ4 2(43)の増加を示した。これらの結果は、トランスジーンの発現レベルの相違がA β42(43)のレベルまたはAβ42(43)/40の比率を有意に改変しないことを示す従来の報告（Duffら，1996;Borcheltら，1996;Citronら，1997）と一致する。したがって、該PS1タンパク質は、野生型Thy-PS1系統10-8においては、Thy-PS1A246E突然変異系統16-3より低いレベルで発現されるが、Aβ産生に対するこの相違の効果は有意であるとは考えられない。 PS1およびAβの産生 PS1 FAD突然変異の発現は、PS1 FAD患者の繊維芽細胞および血漿サンプルからの及び形質転換細胞系およびトランスジェニックマウスの脳からのAβ測定において認められるAβ42(43)のレベルまたはAβ42(43)/40の比率の増加につながると報告されている（Scheunerら，1996;Duffら，1996:Borcheltら，1996;Citron ら，1997）。これらの報告は、アルツハイマー病におけるPS1 FAD突然変異の病理メカニズムがAβ42(43)産生の増加を含む可能性があることを示唆している。しかしながら、Aβ42(43)過剰産生に対する及びAβ42(43)/40の比率の増加に対するPS1 FADの効果の報告されている結果はすべて、内因性野生型PS1対立遺伝子の存在下で得られた。したがって、Aβ42(43)産生に対する該突然変異体効果が、1）Aβ42(43)産生におけるPS1 FADタンパク質による活性の増加から生じるのか、2）Aβ42(43)産生の増加につながるPS1機能の部分的喪失から生じるのか、または3）PS1 FADタンパク質による野生型PS1のドミナントネガティブな不活性化から生じるのか（それは、本質的には、Aβ42(43)の過剰発現がPS1機能の喪失の結果であることを示している）を識別することは正確には可能ではなかった。本発明により行った、上述の研究は、マウス野生型PS1の存在下または不存在下で野生型ヒトPS1を発現しないが突然変異体を発現する全てのトランスジェニックマウス系統が、対照動物より高レベルのAβ42(43)を産生することを示している。その結果は、Aβ42(43)増強効果が、該突然変異タンパク質の固有の特性であることを示している。この結果は、i）発生中のCNSおよび他の組織においてはPS1A246Eは機能的である、ii）ヘテロ接合PS1ノックアウトマウスにおける野生型マウスPS1発現の50％の減少は、Aβ42(43)産生の増加につながらない、およびiii）PS1 FADの症例においては、ナンセンスまたはフレームシフト突然変異が全く確認されていない、という観察と共に、PS1 FADにおける突然変異がAβ42(4 3)産生における機能の増強を引き起こすことを強く示している。シー・エレガンス（C.elegans）におけるPS1突然変異体の活性の評価は、いくぶん異なる結果を与えた。報告されている１つの研究では、PS1A246Eを含むいくつかのPS1 FAD突然変異体は、sel-12欠損の補償において、野生型タンパク質より実質的に低活性であることが判明した（Levitanら，1996）。このように救助においてシー・エレガンス（ C.elegans）とマウスとで矛盾するのは、この欠損の性質の相違に起因する可能性がある。例えば、マウスPS1ヌル突然変異とは異なり、ノックアウト体であるシー・エレガンス（C.elegans）sel-12突然変異体は、十中八九、完全な機能喪失突然変異体ではない。さらに、マウスの体節形成およびシー・エレガンス（C.ele gans）の卵房（egg chamber）分化経路は、異なる態様でPS1タンパク質発現に応答する可能性がある。また、シー・エレガンス（C.elegans）の救助研究におけるエピソームトランスジーン発現におけるばらつきは、評価されなかった。本結果は、PS1+/-ヘテロ接合マウスにおいては、野生型対照と比べて、Aβ40 およびAβ42(43)の定常状態レベルの穏やかであるが有意な減少を示している(表 2、Aβ40:PS1+/+ 1298fmol/gに対してPS1+/- 933fmol/g、P<0.02；Aβ42(43):PS 1+/+ 211fmol/gに対してPS1+/- 144fmol/g、P<0.0001)。Aβ40の減少は、マウス PS1がヒトPS1で置換されているThy-PS1およびThy-PS1A246Eで救助された両方のマウスにおいても生じる。これらの２つの現象は関連している可能性があり、正常なPS1活性がAβ産生には必要であることを示唆している。実施例14アッセイ本発明のトランスジェニック動物は、細胞培養用の細胞の起源として使用することができる。動物および細胞の両方を、本発明のアッセイにおいて使用することができる。例えば、機能的な天然プレセニリン１遺伝子を欠く脳組識の細胞を、標準的な培養技術を用いて培養することができる。また、機能的な非天然PS1 遺伝子だけを有する細胞を培養することができる。該動物および培養細胞は、遺伝子またはタンパク質レベルでのPS1の発現、活性または調節の研究のためのインビボおよびインビトロ系として使用することができる。これら動物および培養細胞は、Notch、Notchリガンドおよび下流Notchシグナル伝達分子の発現、活性または調節の研究に使用することができる。また、該動物および培養細胞は、AP Pの発現およびプロセシングならびにAPPの発現およびプロセシングに対するPS1 FAD突然変異の効果の研究に使用することができる。非天然PS1の発現または活性の観察可能な態様における定量的または定性的な変化に関してスクリーニングするように、研究を計画することができる。例えば、機能的天然PS1遺伝子を欠き機能的非天然PS1遺伝子を発現する動物細胞を、非天然PS1の発現または活性を調節する化合物に関してスクリーニングするためのアッセイにおいて使用することができる。また、PS1活性の調節を介して本発明の動物および細胞におけるAβ産生に影響を及ぼす、好ましくは低下させる化合物に関してスクリーニングするように、研究を計画することができる。これらの化合物は、例えば、非天然PS1タンパク質のリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストであることにより、該タンパク質と相互作用しうる。これら化合物は、非天然遺伝子の転写または非天然RNAの翻訳のレベルを直接的または間接的に増加または減少させうる。また、これら化合物は、PS1の発現または活性を調節するように直接的に作用する介在タンパク質またはリガンドを介して作用しうる。スクリーニングの多数の変法が当業者に公知であり、本発明の範囲内で適用できる。例えば、本発明の動物または細胞におけるAβ産生に対する化合物の効果を判定するためにスクリーニングを行なうことが可能である。そのようなスクリーニングにおいては、該化合物を該動物に投与するか、またはこれらの動物に由来する細胞の培地に適用する。動物または細胞におけるAβ産生に対するこれら化合物の効果は、これら化合物で処理されていない同じ動物または細胞と比較することができる。さらに、アルツハイマー病関連マーカーに対するこれら化合物の効果は、神経病理学的および行動分析により動物において評価することができる。したがって、本発明は、アルツハイマー病の病因の態様、特に、APPのプロセシングに影響を及ぼす突然変異と共に認められるAβ産生の変化の研究に有用な、トランスジェニック動物よりなるモデル系、細胞およびアッセイを提供することが示される。また、該アッセイは、Aβ産生に対する効果を有する化合物に関するスクリーニングに及びそれに続く該化合物の研究に有用である。以上の実施例は、本発明の特定の態様および実施形態を例示目的として記載するものであり、後記の請求の範囲に挙げる本発明の範囲を限定するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者チエン，ホイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者チエン，スーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フアン・デル・プルーフ，レオナルドウス・ハー・テーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ウオン，フイリツプ・シーアメリカ合衆国、メリイランド・21205、ボルテイモア、ラトランド・アベニユー・ 720 (72)発明者サイソデイア，サングラム・エスアメリカ合衆国、メリイランド・21205、ボルテイモア、ラトランド・アベニユー・ 720 (72)発明者ジアン，ピンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．トランスジェニックマウス胚であって、その体細胞および生殖細胞が、PS1 タンパク質をコードする遺伝子を欠くことを特徴とするトランスジェニックマウス胚。２．請求項１に記載のトランスジェニックマウス胚に由来する細胞系。３． PS1をコードするマウス遺伝子を欠く体細胞および生殖細胞を有するマウスの生産方法であって、（a）マウス胚幹細胞のPS1対立遺伝子を標的とするように設計された改変形態のPS1をコードする遺伝子を準備し、（b）該改変遺伝子をマウス胚幹細胞中に導入し、（c）該改変遺伝子を含有する胚幹細胞を選択し、（d）該改変遺伝子を含有する胚幹細胞をマウス胚盤胞中に導入し、（e）該注入胚盤胞を偽妊娠マウス中に移植し、（f）該胚を分娩期まで発生させて、キメラファウンダートランスジェニックマウスを得ることを含んでなる生産方法。４．工程（d）の導入がマイクロインジェクションによるものである、請求項４に記載の生産方法。５．さらに、（g）キメラトランスジェニックマウスと野生型マウスとを交配させて、該改変PS1遺伝子に関してヘテロ接合であるF1マウスを得る工程を含む、請求項４に記載の生産方法。６．トランスジェニックマウスであって、その体細胞が、PS1タンパク質をコードする機能的マウス遺伝子および改変PS1遺伝子に関してヘテロ接合であることを特徴とするトランスジェニックマウス。７．請求項６に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。８．該マウスが、稔性であり、その子に該改変PS1遺伝子を伝達しうる、請求項６に記載のマウス。９．該改変PS1遺伝子が、マウス胚盤胞中への改変胚幹細胞のマイクロインジェクションまたは改変胚幹細胞と受精卵もしくは桑実胚とのコインキュベーションにより、胚段階のマウス中に導入されている、請求項８に記載のマウス。 10．生存可能なトランスジェニックマウスであって、その体細胞および生殖細胞が、マウスPS1タンパク質をコードする機能的遺伝子を欠き、非天然PS1タンパク質の遺伝子を含むトランスジーンを含有し発現することを特徴とするトランスジェニックマウス。 11．該非天然PS1遺伝子が、野生型PS1対立遺伝子およびPS1の突然変異対立遺伝子よりなる群から選ばれる、請求項10に記載のトランスジェニックマウス。 12．該非天然PS1がヒトPS1であり、該PS1突然変異対立遺伝子が家族性アルツハイマー病に関連している、請求項11に記載のトランスジェニックマウス。 13．該突然変異対立遺伝子がヒトA246E対立遺伝子を含む、請求項12に記載のトランスジェニックマウス。 14．該A246E対立遺伝子が、ニューロン特異的ヒトThy-1プロモーターに作動的に結合している、請求項13に記載のトランスジェニックマウス。 15．該トランスジーンに関してヘミ接合である、請求項10に記載のトランスジェニックマウス。 16．該マウスが、稔性であり、その子に該非天然PS1遺伝子を伝達しうる、請求項10に記載のマウス。 17．該ヒトPS1またはPS1A246Eが、該二倍体ゲノム中にヘミ接合またはホモ接合のいずれかで存在する、請求項13に記載のトランスジェニック動物。 18．請求項10に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。 19．ヒトPS1またはPS1A246Eよりなる群から選ばれる遺伝子を含んでなるトランスジーンであって、該遺伝子がヒトThy-1プロモーターに作動的に結合しており、それにより該プロモーターが該遺伝子の胚および生後発現を指令することを特徴とするトランスジーン。 20．動物におけるAβ産生に対する化合物の効果を判定するためのアッセイであって、（a）第１および第２トランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、マウスPS1タンパク質をコードする機能的遺伝子を欠き、非天然PS1タンパク質の遺伝子を含むトランスジーンを含有し発現する）を準備し、（b）該第１マウスにおけるAβ産生を測定し、（c）該第２マウスを化合物にさらし、（d）該第２マウスにおけるAβ産生を測定し、（e）工程（b）で得た測定結果および工程（d）で得た測定結果を該第２動物におけるAβ産生に対する該化合物の効果の指標として比較することを含んでなるアッセイ。 21．動物細胞におけるAβ産生に対する化合物の効果を判定するためのアッセイであって、（a）PS1タンパク質をコードする機能的遺伝子を欠き、非天然PS1タンパク質の遺伝子を含むトランスジーンを含有し発現する第１および第２細胞集団を準備し、（b）該第１細胞集団におけるAβ産生を測定し、（c）該第２細胞集団を化合物にさらし、（d）該第２細胞集団におけるAβ産生を測定し、（e）工程（b）で得た測定結果および工程（d）で得た測定結果をAβ産生に対する該化合物の効果の指標として比較することを含んでなるアッセイ。 22．非天然PS1遺伝子を含むトランスジーンを有するトランスジェニックマウスの生産方法であって、 a）トランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、機能的PS1タンパク質をコードするマウス遺伝子および改変マウスPS1遺伝子に関してヘテロ接合である）を準備し、 b）該非天然PS1遺伝子に関してヘミ接合であるトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、非天然PS1タンパク質の遺伝子を含むトランスジーンを含有し発現する）を準備し、 c）工程a）で準備したマウスと工程b）で準備したマウスとを交配させ、 d）改変マウスPS1遺伝子に関してヘテロ接合および該非天然PS1遺伝子に関してヘミ接合であるマウスを得ることを含んでなる生産方法。 23．さらに、e）工程d）からの雄および雌マウスを相互交配させて、該非天然 PS1に関してヘミ接合またはホモ接合、および該改変マウスPS1遺伝子に関してホモ接合であるマウスを得ることを含む、請求項22に記載の生産方法。 24．さらに、f）工程e）で得たマウスとヒトAPP遺伝子を発現するトランスジェニックマウスとを交配させて、ヒトAPP遺伝子に関してヘミ接合またはホモ接合、該非天然PS1遺伝子に関してヘミ接合またはホモ接合、および該改変マウスP S1遺伝子に関してホモ接合であるマウスを得ることを含む、請求項23に記載の生産方法。 25．ヒトAPP遺伝子に関してヘミ接合またはホモ接合、非天然PS1遺伝子に関してヘミ接合またはホモ接合、および改変マウスPS1遺伝子に関してホモ接合であるトランスジェニックマウス。