DE69935903T2

DE69935903T2 - Genmutierte tiere

Info

Publication number: DE69935903T2
Application number: DE69935903T
Authority: DE
Inventors: Masatoshi Takatsuki-shi TAKEDA; Junji Suita-shi TAKEDA
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-01-08
Filing date: 1999-01-07
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2019-01-08
Also published as: NO20003495L; DE69935903D1; US7022893B1; CA2317809A1; KR20010040330A; WO1999034670A1; JP4290329B2; KR100646816B1; EP1044605A4; CN1292638A; RU2266002C2; TW200529742A; EP1044605A1; NO20003495D0; TWI240752B; AU1784499A; HK1031983A1; EP1044605B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein transgenes nichthumanes Tier. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Präsenilin-transgenes nichthumanes Tier mit einem übertragenen mutierten Präsenilin-Gen, das die humane Alzheimer-Krankheit hervorruft.
Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimer-Krankheit zeigt die Symptome einer progressiven Demenz. Ihre Pathohistologie ist gekennzeichnet durch das Auftreten einer enormen Anzahl seniler Plaques im Gehirn und eine Häufung neurofibrillärer Degeneration in den Neuronen. Die Krankheit ist neurodegenerativ, wobei die Neuronen nach und nach vergehen. Die Alzheimer-Krankheit entwickelt sich im Allgemeinen im hohen Alter, und es ist bekannt, dass sie mit zunehmendem Alter vermehrt auftritt. Gegenwärtig ist eine entscheidende Behandlung der Alzheimer-Krankheit nicht möglich. Um sich auf den starken Anstieg des Anteils der Älteren in der Bevölkerung in der Zukunft vorzubereiten, ist demgemäß die rechtzeitige Entwicklung eines Verfahrens zur therapeutischen und vorbeugenden Behandlung der Alzheimer-Krankheit und eines wirksamen Medikaments zur vorbeugenden und therapeutischen Behandlung der Krankheit erwünscht.
Senile Plaques sind Ablagerungen außerhalb der Neuronen, die verschiedene Bestandteile enthalten und deren Hauptbestandteil ein Peptid ist, das aus 39–42 Aminosäure-Resten besteht und Amyloid β-Protein (Aβ) genannt wird. Das Amyloid-Vorläuferprotein (amyloid precursor Protein: APP) wird durch Proteasen gespalten, die vorläufig als β-Sekretase und γ-Sekretase bezeichnet werden, wobei Amyloid β gebildet wird. In der senilen Plaque lagert sich Amyloid β als starres Gebilde mit einer β-Faltblattstruktur ab. Die senile Plaque bildet sich zunächst in Form einer "fleckigen" Ablagerung, die als diffuse senile Plaque be zeichnet wird. In diesem Stadium tritt noch keine Neurodegeneration auf. Es wird angenommen, dass die Degeneration oder das Vergehen der Neurozyten eintritt, wenn die diffuse senile Plaque zu einer festeren Ablagerung wird, was zum Einsetzen der Symptome der Alzheimer-Krankheit wie z.B. Demenz führt. Als Haupt-Amyloide β gibt es Aβ40, das aus 40 Aminosäureresten besteht, und Aβ 42, das aus 42 Aminosäureresten besteht. Das meiste von Zellen erzeugte Amyloid β ist Aβ40, und es liegen nur geringe Mengen Aβ42 vor. Allerdings hat Aβ42 die Eigenschaften einer stärkeren Aggregation, und daher wird angenommen, dass
Aβ42 eine bedeutendere Rolle als Aβ40 bei der Bildung seniler Plaque spielt (Tamaoka, Naika (Internal Medicine), Bd. 77, 843, 1996).
Bei der Alzheimer-Krankheit wird das Auftreten in Familien beobachtet, das eine autosomal dominante Vererbung zeigt. Ein Gen, das 1991 erstmals als verursachendes Gen für das Auftreten der Alzheimer-Krankheit in Familien identifiziert wurde, ist eine Mutante von APP, ein Gen, das sich auf Chromosom 21 befindet, wobei der Aminosäurerest 717 von Valin zu Isoleucin mutiert ist (Goate A. et al., Nature, Bd. 349, 704, 1991).
Es wurden weitere Mutanten von APP als Ursachen der Alzheimer-Krankheit gefunden, etwa solche, wobei der Aminosäurerest in Position 717 zu Phenylalanin mutiert ist (Murrell J. et al., Science, Bd. 254, 97, 1991); wobei der Aminosäurerest in der gleichen Position zu Glycin mutiert ist (Chartier, Harlin et al., Nature, Bd. 353, 844, 1991); wobei zwei Aminosäurereste in den Positionen 670 und 671 von Lysin-Methionin zu Asparagin-Leucin mutiert sind (Mullan M. et al., Nature Genet., Bd. 1, 345, 1992); und wobei der Aminosäurerest in Position 692 von Alanin zu Glycin mutiert ist (Hendrisk L. et al., Nature Genet., Bd. 1, 218, 1992) und dergleichen.
Apolipoprotein E (ApoE) wurde 1993 als verursachender Faktor oder Risikofaktor familiärer Alzheimer-Krankheit berichtet. Bei Individuen mit Alzheimer- Krankheit zeigte sich, dass sie zu einem erheblich höheren Anteil als gesunde Individuen ApoE4, worin der Aminosäurerest in Position 112 Arginin ist und der Aminosäurerest in Position 158 Arginin ist, von den Isomeren von ApoE hatten, dessen Gene sich auf Chromosom 19 befinden (Corder E.H. et al., Science, Bd. 261, 921, 1993).
Dann wurden 1995 eine Mutante des Gens "Präsenilin-1" (PS-1, zunächst als S182 bezeichnet), das sich auf Chromosom 14 befindet (Sherrington R. et al., Nature, Bd. 375, 754, 1995), und eine Mutante des Gens "Präsenilin-2" (PS-2, zunächst als E5-1 oder STM-2 bezeichnet), das sich auf Chromosom 1 befindet (Sherrington R. et al., Nature, Bd. 375, 754, 1995), als neue verursachende Gene der Alzheimer-Krankheit gefunden (in der Beschreibung werden die Gene jeweils als "Präsenilin-1-Gen" bzw. "Präsenilin-2-Gen" bezeichnet, und die jeweiligen Genprodukte werden als "Präsenilin-1-Protein" bzw. "Präsenilin-2-Protein" oder "PS-1" bzw. "PS-2" bezeichnet).
Die Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2, die aus 467 bzw. 448 Aminosäureresten bestehen, haben eine siebenfache (oder achtfache) Transmembran-Primärstruktur und liegen demzufolge vermutlich als Membranproteine vor. Die Homologie der beiden Proteine auf der Aminosäure-Ebene ist hoch, d.h., 67% insgesamt und 84% in der Transmembrandomäne alleine. Was die Funktion des Präsenilin-1-Proteins anbetrifft, so wird angenommen, dass das Protein aufgrund seiner großen Homologie zu diesen Proteinen möglicherweise ähnliche Funktionen aufweist wie das Nematoden-Sel-12-Protein oder das SPE-4-Protein. Das SPE-4-Protein ist am Vorgang der Nematoden-Spermatogenese beteiligt, und man nimmt an, dass es an Transport und Speicherung von Proteinen beteiligt ist.
Es wird daher angenommen, dass das Präsenilin-1-Protein möglicherweise an der Reifung von Membranproteinen wie z.B. APP, am axoplasmatischen Transport und an der Fusion von Membranvesikeln mit den Membranen beteiligt ist.
Sel-12 erwies sich als Gen, das embryologische Anomalien behebt, die durch Mutation von Lin-12 hervorgerufen werden, das die Nematoden-Entwicklung steuert. Es gibt Überlegungen, dass Lin-12 an der interzellulären Signaltransduktion beteiligt ist, und demgemäß wird auch angenommen, dass das Präsenilin-1-Protein möglicherweise an einem bestimmten Schritt der interzellulären Signaltransduktion beteiligt ist.
Der erste Bericht über das Präsenilin-1-Protein beschreibt, dass die Mutationen, welche die familiäre Alzheimer-Krankheit hervorrufen, Substitutionen von Aminosäureresten in fünf Positionen sind. Nach diesem Bericht wurden an verschiedenen Stellen mutierte Gene in vielen Familien gefunden, die von der familiären Alzheimer-Krankheit betroffen waren, darunter OS-2 (Isoleucin in Position 213 ist zu Threonin mutiert) und OS-3 (Valin in Position 96 ist zu Phenylalanin mutiert), die beide von den hier tätigen Erfindern berichtet werden (Kamino K. et al., Neurosci. Lett., Bd. 208, 195, 1996), und bisher sind mehr als 40 Aminosäure-Substitutionen an mehr als 30 Stellen bekannt (Hardy, TINS, Bd. 20, 154, 1997).
Gegenwärtig wird angenommen, dass 70–80% der familiären Alzheimer-Krankheit mit der Mutation des Präsenilin-1-Proteins zu tun haben. Beim Präsenilin-2-Protein wurde über Mutationen an zwei Stellen berichtet. Wie bereits erklärt, hat die genetische Analyse bewiesen, dass Mutanten der Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2 in hohem Maße an der familiären Alzheimer-Krankheit beteiligt sind.
Vorangetrieben wurden auch Untersuchungen zum Mechanismus, wie die Mutanten der Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2 das Ausbrechen der Alzheimer-Krankheit hervorrufen. Es wurde berichtet, dass Aβ40 nahezu den gleichen Spiegel wie die normalen Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2 aufweist, während Aβ42 im Vergleich zu den normalen Proteinen Präsenilin-1 und Präsenilin-2 stark erhöht ist im Serum oder in einem Kulturmedium von Hautfibroblasten aus einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit mit den oben genannten Mutanten (Scheuner D. et al., Nature Med., Bd. 2, 864, 1996); in einem Kulturmedium einer Zelllinie, die durch Mutanten der Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2 transformiert ist (Xia W. et al., J. Biol. Chem. Bd. 272, 7977, 1997; Borchelt D.R. et al., Neuron Bd. 17, 1005, 1996; Citron, M. et al., Nature Med. Bd. 3, 67, 1997); und im Hirngewebe von Patienten mit familiärer Alzheimer-Krankheit mit dem mutierten Präsenilin-1-Protein (Lemere C.A. et al., Nature Med. Bd. 2, 1146, 1996).
Diese Berichte zeigen, dass die Mutanten der Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2, welche die familiäre Alzheimer-Krankheit hervorrufen, möglicherweise das Ausbrechen der Alzheimer-Krankheit durch die Zunahme von Aβ42 auslösen, von dem angenommen wird, dass es eine bedeutende Rolle bei der Bildung seniler Plaques spielt. Es wurde eine transgene Maus geschaffen, in die ein Gen transferiert worden war, das für das mutierte Präsenilin-1-Protein codiert (Duff K. et al., Nature Bd. 383, 710, 1996; Borchelt D.R. et al., Neuron Bd. 17, 1005, 1996; und Citron M. et al., Nature Med. Bd. 3, 67, 1997). Es wurde berichtet, dass Aβ42 im Gehirn der transgenen Maus selektiv erhöht war. Diese Ergebnisse untermauern sehr stark die Möglichkeit, dass Mutanten der Proteine Präsenilin-1 und Präsenilin-2, welche die familiäre Alzheimer-Krankheit verursachen, Aβ42 erhöhen, das möglicherweise eine bedeutende Rolle bei der Bildung seniler Plaques spielt und so zur Alzheimer-Krankheit führt. Allerdings ist keine Beschreibung zu histologischen Untersuchungen des Mäusegehirns in den obigen Berichten zu der transgenen Maus gegeben, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass keine bemerkenswerten histologischen Veränderungen im Gehirn der transgenen Maus beobachtet wurden.
Im Allgemeinen sind transgene Tiere nützlich als Hilfsmittel zum Analysieren der Funktionen eines Zielgens in vivo. Allerdings ist es technisch schwierig, die Expression eines transferierten Gens während der Entwicklung quantitativ, gewebespezifisch oder zeitspezifisch zu kontrollieren. Es besteht auch insofern ein Problem, als zwei verschiedene Genprodukte als Mischung in den transgenen Tieren vorliegen, da ein Gen, das von Natur aus im Tier vorhanden ist, immer noch auf die normale Expression hinarbeitet, und die Funktionen eines transferierten Gens nicht hinreichend analysiert werden können. Erfolgt zudem mit dem transferierten Gen eine besonders überschießende Expression, so können sich Funktionen in den transgenen Tieren zeigen, die von Natur aus in vivo nicht ausgeführt werden, was zu dem Fehler möglicher Verwechslungen bei der Analyse konstruierter genmutierter Tiere führt.
Neben transgenen Tieren können auch Knockout-Tiere als Hilfsmittel zum Analysieren der Funktionen eines Zielgens verwendet werden. Bei einem Knockout-Tier wird ein Zielgen, das von Natur aus in dem Tier vorhanden ist, künstlich zerstört, so dass es seine Funktion verliert. Eine detaillierte Analyse von Knockout-Tieren kann die Funktionen eines Zielgens in vivo aufzeigen. Allerdings treten bei Knockout-Tieren, die als Homozygoten geschaffen wurden, bestimmte Veränderungen bisweilen nicht auf, da die Funktionen der anderen Genprodukte im Knockout-Tier die der zerstörten Genprodukte ersetzen können. Weiterhin besteht auch insofern ein Problem, als ein Tier als Homozygote bisweilen dem Tod geweiht sein kann, da das zerstörte Genprodukt für die Entwicklung und das Wachstum des Tiers essentiell ist, während eine gründliche Analyse der Genfunktionen eines Tiers als lebensfähige Heterozygote praktisch unmöglich ist.
Offenbarung der Erfindung
Zur Schaffung eines pathologischen Maus-Modells der Alzheimer-Krankheit ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer Maus als pathologisches Modell, deren pathologischer Zustand näher an dem eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, an Stelle eines transgenen Tiers mit den oben genannten Fehlern. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Bereitstellung einer genmutierten Maus, die aufgrund der Übertragung einer Mutante eines Präsenilin-Gens gemäß der Technik der homologen Rekombination, von der angenommen wird, dass sie ein verursachendes Gen der Alzhei mer-Krankheit ist (ein mutiertes Präsenilin-Gen), ein mutiertes Präsenilin-Protein im Gehirn exprimieren kann. Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der genmutierten Maus sowie die Verwendung eines Plasmids, das bei dem oben genannten Herstellungsverfahren brauchbar ist.
Zur Aufklärung der Rolle des Präsenilin-1-Proteins und des Mechanismus des Ausbrechens der Alzheimer-Krankheit aufgrund der Mutation des Präsenilin-1-Gens schufen die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Knock-in-Maus, bei der das Präsenilin-1-Gen, das von Natur aus in der Maus vorhanden ist, durch das vorstehend erwähnte Präsenilin-1-Gen mit einer Mutation vom OS-2-Typ ersetzt ist. Im Ergebnis fanden die Erfinder, dass mit der genmutierten Maus die Fehler bei den transgenen Mäusen und Knockout-Mäusen erfolgreich vermieden werden, und dass das Tier für Untersuchungen der Ursache und Pathologie familiärer Alzheimer-Krankheit brauchbar ist, die durch das mutierte Präsenilin-1-Gen hervorgerufen wird. Die Erfinder setzten diese Forschungen weiter fort und kamen so zu der vorliegenden Erfindung, die im Folgenden erläutert wird.
Die vorliegende Erfindung macht somit eine genmutierte Maus mit einem aus einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1-Gen verfügbar, wobei die genmutierte Maus erhalten wird durch Transfer des mutierten Präsenilin-1-Gens mit Hilfe der Technik der homologen Rekombination und homozygot bezüglich des mutierten Präsenilin-1-Gens ist, wobei das mutierte Präsenilin-1-Gen eine DNA mit einer Sequenz umfasst, die für ein mutiertes Präsenilin-1-Potein codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, in der eine oder mehrere Aminosäuren in den Positionen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren Nr. 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426, und 436, durch andere Aminosäure(n) in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins ersetzt ist/sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das mutierte Präsenilin-1-Gen eine DNA mit einer Sequenz, die für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, das eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P und P436S in der Aminosäuresequenz eines Präsenilin-1-Proteins, vorzugsweise des Maus-Präsenilin-1-Proteins aufweist (jeder Buchstabe steht für eine Aminosäure als Einbuchstabensymbol, wobei jede Zahl, ausgehend vom N-Terminus des Präsenilin-1-Proteins, für eine Aminosäure-Nummer steht und die Beschreibung bedeutet, dass die links von der Zahl dargestellte Aminosäure des Wildtyps durch die rechts davon dargestellte Aminosäure ersetzt ist).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das mutierte Präsenilin-1-Gen eine DNA mit einer Sequenz, die für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem das Isoleucin in Position 213 des Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, wobei das mutierte Präsenilin-1-Gen vorzugsweise eine DNA mit einer Sequenz umfasst, die für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem das Isoleucin in Position 213 des Präsenilin-1-Proteins durch Threonin ersetzt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird folgendes bereitgestellt:
die oben genannte genmutierte Maus mit einem mutierten Präsenilin-1-Gen, in dem die DNA-Sequenz, die um die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins codiert, zu der folgenden Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' mutiert ist, worin N eine von T verschiedene Base bedeutet, M für T oder C steht, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure in Position 213 codieren; die oben genannte genmutierte Maus mit einem mutierten Präsenilin-1-Gen, in dem die DNA-Sequenz, die um die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins codiert, zu der folgenden Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' mutiert ist, worin N für C steht, M für T oder C steht, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure in Position 213 codieren; und
die oben genannte genmutierte Maus mit einem mutierten Präsenilin-1-Gen, in dem die DNA-Sequenz, die um die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins codiert, zu der folgenden Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3' mutiert ist, worin XYZ ein Codon in Form eines Basentripletts bedeutet, das für eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure codiert, M für T oder C steht, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure in Position 213 codieren.
In bevorzugten Ausführungsformen der oben genannten genmutierten Maus macht die vorliegende Erfindung folgendes verfügbar: die oben genannte genmutierte Maus, bei der die Überexpression des Amyloid β-Proteins durch das mutierte Präsenilin-1-Gen verursacht wird; die oben genannte genmutierte Maus, die das mutierte Präsenilin-Protein exprimieren kann und bei der die Expression dieses Proteins die Produktion des Amyloid β-Proteins in einer Menge induziert, die zur Ausbildung einer fortschreitenden neuralen Krankheit in einem peripheren Teil der Hirnrinde im Gehirn der Maus ausreicht; die oben genannte genmutierte Maus, wobei das oben genannte mutierte Präsenilin-1-Gen mittels homologer Rekombination übertragen wird; die oben genannte genmutierte Maus, wobei die Menge der durch das oben genannte Präsenilin-1-Gen induzierten Amyloidprotein-Expression im Hirngewebe ausreicht, um ein abweichendes Verhalten in einem Gedächtnis-Lern-Test im Vergleich zu einem normalen Tier herbeizuführen und eine anomale Neuropathie in einem peripheren Teil der Hirnrinde des Hippokampus des Gehirns des Tiers zu induzieren; und die genmutierte Maus mit einer DNA, die ein mutiertes Präsenilin-1-Gen umfasst, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem eine oder zwei oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch eine andere Aminosäure ersetzt ist/sind, zusammen mit einer DNA mit einer Nucleotidsequenz, die für ein Markerprotein codiert.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Plasmids vor, das eine DNA umfasst, die die Sequenz eines mutierten Präsenilin-1-Gens aufweist, wobei die DNA-Sequenz, die um die Aminosäure in Position 213 des Präsenilin-1-Proteins codiert, die folgende Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' ist, worin N für A, G oder C steht, M für T oder C steht, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure in Position 213 codieren, zur Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung; und die Verwendung eines Plasmids, das eine DNA umfasst, die die Sequenz eines mutierten Präsenilin-1-Gens aufweist, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, wobei die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist und die um die Aminosäure in Position 213 des Präsenilin-1-Proteins codierende DNA-Sequenz die folgende Sequenz ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3', worin M für T oder C steht, XYZ ein Codon in Form eines Basentripletts bezeichnet, das für eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure codiert, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure in Position 213 codieren. Zudem macht die vorliegende Erfindung auch eine chromosomale DNA verfügbar, die das Exon 8 eines mutierten Präsenilin-1-Gens enthält, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, zur Herstellung einer genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung.
Des Weiteren sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Plasmids zur Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung vor, das eine DNA umfasst, wobei eine Sau3Al-Stelle in eine Nucleotidsequenz eingeführt ist, die die gesamte oder den mutierten Teil der cDNA oder chromosomalen DNA eines mutierten Präsenilin-1-Gens umfasst, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem die Aminosäure in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist. Ebenfalls bereitgestellt werden das oben genannte Plasmid, wobei es sich bei der Substitution der Aminosäure um Isoleucin in Position 213 durch Threonin handelt; sowie ein Plasmid, das eine DNA umfasst, die durch die folgende Nucleotidsequenz 5'-TGTGGTCGGGATGAMCGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' dargestellt ist, worin M für T oder C steht.
Neben den obigen Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Gens zur Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung vor, das für ein mutiertes Maus-Präsenilin-1-Protein codiert, wobei Isoleucin in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Maus-Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, wobei es sich bei der Substitution vorzugsweise um Isoleucin durch Threonin handelt. Ebenfalls vorgesehen ist die Verwendung eines Plasmids zur Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung, umfassend (1) ein Gen, das für ein mutiertes Maus-Präsenilin-1-Protein codiert, in dem Isoleucin in Position 213 in der Aminosäuresequenz des Maus-Präsenilin-1-Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist; und (2) eine Neomycin-Expressionseinheit, die durch IoxPs flankiert ist; sowie die oben genannte Verwendung des Plasmids, wobei es sich bei der Substitution um die von Isoleucin durch Threonin handelt (IoxP ist offenbart in der japanischen Offenlegungsschrift (Kohyo) Nr. 4-501501 , S. 4).
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Maus-Embryos zur Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung vor, wobei in den Embryo ein Plasmid eingeführt ist, umfassend eine DNA, die durch die folgende Nucleotidsequenz 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' dargestellt ist, worin M für T oder C steht; vorzugs weise die Verwendung eines Embryos, der mittels homologer Rekombination unter Verwendung eines jeden der oben genannten Plasmide erhalten wurde. Die Erfindung stellt auch eine primäre Zellkultur oder subkultivierte Zellen bereit, erhalten durch Isolierung von Zellen aus der oben genannten genmutierten Maus und Kultivierung der Zellen in Gewebekultur; ein Verfahren zur Herstellung einer genmutierten Maus, umfassend den Schritt der Übertragung eines von einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1-Gens mittels homologer Rekombination in einen Embryo einer Maus, wobei das mutierte Präsenilin-1-Gen in der Lage ist, mutiertes Präsenilin-1 zu exprimieren und die Produktion von Amyloid β -Protein in einer Menge zu induzieren, die ausreicht, um eine fortschreitende neurale Krankheit in einem peripheren Teil der Hirnrinde des Gehirns auszubilden; und das oben genannte Herstellungsverfahren, wobei ein mutiertes Präsenilin-1-Protein exprimiert werden kann, in dem das Isoleucin in Position 213 durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist.
Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung kann bei einem Verfahren zur Evaluierung einer Substanz verwendet werden, die zur therapeutischen und/oder vorbeugenden Behandlung der Alzheimer-Krankheit brauchbar ist, umfassend den Schritt des Vergleichens der oben genannten genmutierten Maus, der eine Testsubstanz verabreicht wurde, mit einer genmutierten Maus, der keine Testsubstanz verabreicht wurde. Ein typisches Beispiel für das Verfahren zur Evaluierung umfasst ein Screening-Verfahren. Das oben genannte Verfahren zur Evaluierung kann durchgeführt werden unter Anwendung eines Gedächtnis-Lern-Tests; das oben genannte Verfahren zur Evaluierung kann durchgeführt werden unter Anwendung eines pathologischen Tests; das oben genannte Verfahren zur Evaluierung kann durchgeführt werden mit Hilfe eines pathologischen Tests auf der Grundlage einer Neuropathologie in einem peripheren Teil der Hirnrinde; das oben genannte Verfahren zur Evaluierung kann durchgeführt werden mit Hilfe eines pathologischen Tests auf der Grundlage einer Neuropathologie und ist ein Vergleich einer oder mehrerer Punkte, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus der Suppression der Abnahme der überwachsenen Gliose in einem peripheren Teil der Hirnrinde des Gehirns, der Suppression der Abnahme bei der Aufnahme von 2-Desoxyglucose in einem peripheren Teil der Hirnrinde des Gehirns, und der Suppression der Abnahme der Verfügbarkeit von 2-Desoxyglucose in der Hirnrinde des Gehirns; und das oben genannte Verfahren zur Evaluierung, wobei der Vergleich anhand eines oder mehrerer Punkte durchgeführt wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus der Überlebensdauer, dem Erkundungsverhalten und dem Migrationsverhalten.
Des Weiteren macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Evaluierung eines Medikaments zur therapeutischen und/oder vorbeugenden Behandlung der Alzheimer-Krankheit verfügbar, umfassend den Schritt des in vitro-Kultivierens einer primären Zellkultur oder subkultivierter Zellen in der Gegenwart einer Testverbindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte des Fragments Pα einer chromosomalen DNA, das das Exon 8 von Maus-Präsenilin-1 enthält und das durch Klonieren ausgehend von einer Maus-Genom-DNA-Bibliothek erhalten wurde.
2 zeigt ein Schema des Aufbauverfahrens von Plasmid pmX-1, das eine Teilregion von Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens enthält, die eine Region umfasst, in die eine OS-2-Mutation mit Hilfe der Technik der ortsgerichteten Mutation eingeführt ist.
3 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Targeting Vektors.
4 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Targeting Vektors.
5 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Targeting Vektors.
6 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Targeting Vektors.
7 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Targeting Vektors und die Struktur des Targeting Vektors pOS-2-neoloxP.
8 zeigt die Ergebnisse der auf 1% Agarosegel erfolgten Elektrophorese des PCR-Produkts, das erhalten wurde durch Paaren von Maus #2 (männlich), die das OS-2-mutierte Präsenilin-1-Gen aufweist, mit der F4- Maus von CAG-cre#13 (weiblich), Ausschneiden eines kleinen Stücks aus dem Schwanz der resultierenden Nachkommen, Gewinnen chromosomaler DNA aus der Probe, und Durchführen einer PCR gemäß dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren. Es zeigt sich, dass die Mäuse entsprechend den Bahnen 2 und 4 von rechts keine neo-Expressionseinheit auf ihrer chromosomalen DNA aufweisen. In der Figur zeigt die Bahn ganz links einen Molekulargewichtsmarker. [A] zeigt Banden, die einen neo-Mangel in der chromosomalen DNA zeigen, [B] zeigt Banden, die zeigen, dass die chromosomale DNA der Wildtyp ist, und [C] zeigt Banden, die das Vorliegen von neo in der chromosomalen DNA zeigen.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Das bei der Herstellung der genmutierten Maus der vorliegenden Erfindung verwendete mutierte Präsenilin-Gen ist ein Gen, das für ein mutiertes Präsenilin-Protein codiert, und wie hierin verwendet, bedeutet "mutiertes Präsenilin-Gen" ein "mutiertes Präsenilin-1-Gen" und "mutiertes Präsenilin-Protein" bedeutet ein mutiertes Präsenilin-1-Protein. Das mutierte Präsenilin-Gen hat die Eigenschaft, dass es die Produktion von Amyloid β-Protein erhöht. Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung ist eine Maus, der das oben genannte mutierte Präsenilin-Gen übertragen wurde, beispielsweise mittels homologer Rekombination. Die in dem mutierten Protein vorhandene Mutation ist vorzugsweise das Ergebnis der Substitution eines Aminosäurerests. Die Anzahl der Mutationen unterliegt keinen Beschränkungen und kann vorzugsweise 1 sein.
Die Gesamtsequenz eines von einem Säuger stammenden Präsenilin-1-Proteins ist zum Beispiel bei E. Levy-Lahad, et al., Science 269, S. 973–977, 1995, beschrieben. Die Gesamtsequenzen humaner und Maus-Präsenilin-1-Proteine und Beispiele für DNA-Sequenzen, welche für die Proteine codieren, sind in den Sequenzprotokollen als SEQ ID NO 1 bis 4 gezeigt. Zum Beispiel können die Mutationsorte in dem aus der Maus stammenden Präsenilin-1 vorzugsweise eine oder mehrere Stellen sein, die ausgewählt sind aus Nr. 79, Nr. 82, Nr. 96, Nr. 115, Nr. 120, Nr. 135, Nr. 139, Nr. 143, Nr. 146, Nr. 163, Nr. 209, Nr. 213, Nr. 231, Nr. 235, Nr. 246, Nr. 250, Nr. 260, Nr. 263, Nr. 264, Nr. 267, Nr. 269, Nr. 280, Nr. 285, Nr. 286, Nr. 290, Nr. 318, Nr. 384, Nr. 392, Nr. 410, Nr. 426 und Nr. 436.
Besonders bevorzugte Mutationen sind eine oder mehrere Mutationen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P und P436S in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins, besonders bevorzugt in der Aminosäuresequenz des aus der Maus stammenden Präsenilin-1-Proteins. Von diesen Mutationen ist die Mutation, bei der die Aminosäure in Position 213 durch eine andere Aminosäure substituiert ist (in der Beschreibung bisweilen als "OS-2-Mutation" bezeichnet), eine besonders bevorzugte Mutation. Ganz besonders bevorzugt ist zum Beispiel eine Mutation, bei der das Isoleucin in Position 213 durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, oder eine Mutation, bei der das Isoleucin in Position 213 durch Threonin ersetzt ist.
Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie das obige mutierte Präsenilin-1-Gen in ihrer chromosomalen DNA be sitzt. Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung kann erzeugt werden durch Konstruktion eines Plasmids unter Verwendung einer DNA mit einer Sequenz von etwa 10 kbp, die ein mutiertes Präsenilin-Gen umfasst, und anschließendes Übertragen des Plasmids in eine embryonale Stammzelle, wodurch die homologe Rekombination intrazellulär herbeigeführt wird.
Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure-Mutation aufgrund der Übertragung des oben genannten mutierten Präsenilin-1 durch homologe Rekombination zumeist nur in einer Position erfolgt. Bei einem so genannten "transgenen Tier" wird eine DNA-Sequenz, die einen mutierten Teil umfasst, statistisch in die chromosomale DNA inseriert, und es werden zig Kopien einer sich wiederholenden Sequenz an mehreren Stellen inseriert. Mit dem genmutierten Tier der vorliegenden Erfindung können diese Probleme vermieden werden, und es ist möglich, die Pathologie der Alzheimer-Krankheit auf genetischer Ebene genau zu analysieren. Wird eine DNA, die einen Marker oder dergleichen umfasst, in das genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung übertragen, so kann das Tier eine Stelle für den Marker und eine Sequenz zum Inserieren des Markers aufweisen. Zum Beispiel kann zum Inserieren an einer Stelle, die mit Sau3Al gespalten werden kann, ein Nucleotid substituiert werden, und eine solche Substitution kann durch Spaltung des PCR-Produkts mit Sau3Al und anschließende Elektrophorese der Fragmente oder dergleichen verifiziert werden.
Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung weist das charakteristische Merkmal auf, dass sie Amyloid β-Protein aufgrund der genetischen Mutation in größerer Menge produziert als ein normales Tier. Die erhöhte Menge an Amyloid β-Protein, die durch das genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung erreicht wird, unterliegt keinen speziellen Einschränkungen, und die Menge kann vorzugsweise ausreichend sein, um erhebliche Unterschiede bei der Bewertung des Grads von Gedächtnisstörungen, pathologische Beobachtungen und verschiedene neurale Störungen im Vergleich zu einem normalen Tier zu erkennen.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten DNAs, Plasmide, Zellkulturen und Embryonen von Säugerzellen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein mutiertes Präsenilin-1-Gen aufweisen. Zur Verwendung kommen beispielsweise eine cDNA oder eine chromosomale Gesamt-DNA eines mutierten Präsenilin-1-Gens, das für das mutierte Präsenilin-1-Protein, vorzugsweise ein OS-2-mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, oder eine DNA-Sequenz, die eine oder mehrere Mutationsstellen umfasst; ein Plasmid, das eine DNA umfasst, bei der es sich um die obige cDNA oder die chromosomale DNA mit voller Länge handelt, oder um die obige DNA, die eine oder mehrere Mutationsstellen umfasst und in die eine Sau3Al-Stelle eingeführt ist; eine chromosomale DNA, umfassend Exon 8 eines mutierten Präsenilin-1-Gens, das für ein OS-2-mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert. Des Weiteren kommt bei der vorliegenden Erfindung das obige Gen oder die DNA zur Anwendung, das/die weiterhin eine oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 20, besonders bevorzugt 1 bis mehrere Basen-Substitutionen aufweist.
Zu den Beispielen für die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten DNAs und Plasmide zählen zum Beispiel:

1) Eine DNA, die ein mutiertes Präsenilin-1-Gen umfasst, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem das Isoleucin in Position 213 des Präsenilin-1-Proteins durch Threonin ersetzt ist, oder ein Plasmid, das die DNA umfasst.
2) Eine DNA, die ein mutiertes Präsenilin-1-Gen umfasst, wobei eine DNA-Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuren um die Position 213 der Aminosäuresequenz eines mutierten Präsenilin-1-Proteins codiert, die folgende Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3' ist, worin N für ein anderes Nucleotid als T steht und M für T oder C steht, oder ein Plasmid, das die DNA umfasst.
3) Eine DNA, die ein mutiertes Präsenilin-1-Gen umfasst, wobei eine DNA-Nucleotidsequenz, welche die Aminosäuren um die Position 213 der Aminosäuresequenz eines OS-2-mutierten Präsenilin-1-Proteins codiert, die folgende Sequenz 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA XYZ CACTGGAAAGGCCC-3' ist, worin M für T oder C steht, XYZ ein Codon in Form eines Basentripletts darstellt, das für eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure codiert, oder ein Plasmid, das die DNA umfasst.
4) Alle DNAs oder Plasmide, welche die DNAs nach den obigen 1) bis 4) umfassen, in die eine Sau3Al-Restriktionsschnittstelle eingeführt ist.
5) Eine DNA oder ein Plasmid, das die DNA umfasst, wobei eine Sau3Al-Restriktionsschnittstelle in eine Sequenz, die die volle Länge einer cDNA oder einer chromosomalen DNA eines mutierten Präsenilin-1-Gens umfasst, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem das Isoleucin in Position 213 der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch Threonin ersetzt ist, oder in einen mutierten Teil dieser Sequenz eingeführt ist.
6) Eine DNA, umfassend das Exon 8 eines mutierten Maus-Präsenilin-1-Gens, das für ein OS-2-mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, und eine durch IoxP flankierte Neomycin-Expressionseinheit, oder ein Plasmid, das die DNA umfasst.
7) Eine DNA, umfassend das Exon 8 eines mutierten Präsenilin-1-Gens, das für ein mutiertes Präsenilin-1-Protein codiert, in dem das Isoleucin in Position 213 der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins durch Threonin ersetzt ist, und eine durch IoxP flankierte Neomycin-Expressionseinheit oder ein Plasmid, das die DNA umfasst. Der Umfang der Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt.

Zu den mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Embryonen oder Zellen gehören Embryonen oder Zellen, in die das obige Plasmid übertragen wurde, z.B. ein Plasmid, umfassend eine PRL-104- oder PRL-105-Nucleotidsequenz. Zu den bevorzugten Zellen der vorliegenden Erfindung zählen solche, in die ein Gen übertragen wurde, das für ein mutiertes Präsenilin-Protein codiert, das durch homologe Rekombination unter Verwendung des oben genannten Plasmids eine Mutation in Position 213 der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1-Proteins umfasst. Die Arten der Embryonen oder Zellen unterliegen keinen Einschränkungen, sofern sie von einem Säuger stammen, und es können solche verwendet werden, die von einem Nager und vorzugsweise von einer Maus stammen.
Erzeugung der genmutierten Maus
Nach Erhalt der DNA, die für eine Mutante von Maus-Präsenilin codiert, kann das Präsenilin-genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Es soll ein Beispiel erläutert werden, in dem eine Maus als Säuger verwendet wird. Des Weiteren ist dieses Verfahren ein Beispiel für das Verfahren zur Erzeugung des genmutierten Tiers der vorliegenden Erfindung, und das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist nicht auf das folgende Verfahren beschränkt. Unter Bezugnahme auf das nachstehend beschriebene allgemeine Verfahren und die in den Beispielen beschriebenen speziellen Verfahren sowie durch geeignetes Abwandeln oder Verändern dieser Verfahren je nach den Erfordernissen kann der Fachmann das genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung ohne Weiteres erzeugen.
Zur Herstellung einer Sonde zur Verwendung im PCR-Verfahren wird ein DNA-Fragment, das eine Stelle für die Mutation in Exon 8 eines Präsenilin-1-Gens umfasst, das von einem für die Herstellung zu verwendenden Tier stammt, aus einer Maus-Genom-DNA-Bibliothek erhalten. Es kann eine Maus-Genom-DNA-Bibliothek eines beliebigen Stammes verwendet werden, darunter eine Maus- Genombibliothek des Maus-129-Stammes, der in den Beispielen beschrieben ist. Wird eine Maus als Tier für die Einführung der Mutation eingesetzt, so wird das Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens verwendet.
Nachdem das mit Hilfe des obigen Verfahrens hergestellte DNA-Fragment durch statistische Primeranlagerung markiert ist (³²P), wird ein Screening der Genom-Bibliothek unter Verwendung der markierten Sonde durchgeführt, und ein Fragment der chromosomalen DNA, die das Exon 8 des Präsenilin-1-Gens umfasst, wird anschließend kloniert. Ein Teil für die Mutation in Exon 8 des klonierten Präsenilin-1-Gens wird weiter subkloniert, und anschließend wird die Mutation eingeführt.
Es wird ein Targeting Vektor konstruiert, der die chromosomale DNA umfasst, die das Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens umfasst, in das die Mutation eingeführt wurde. Als Selektionsmarker wird die neo-Expressionseinheit in den Targeting Vektor eingeführt, so dass die Zellen, in deren Chromosom kein Vektor eingeführt ist, durch Zugabe von 0418 (ein Antibiotikum) in das Medium leichter abgetötet werden. Nachdem der Targeting Vektor mittels Elektroporation oder mit Hilfe eines anderen Verfahrens zum Gentransfer in eine ES-Zelle eingeführt ist, werden die ES-Zellen in Gegenwart von G418 kultiviert, und die gebildeten Kolonien werden abgenommen. Die erhaltenen Kolonien werden jeweils in zwei Teile geteilt. Ein Teil wird durch Kultivieren, Subkultivieren oder Einfrieren konserviert. Der andere Teil wird zur Untersuchung der ES-Zellen verwendet, in die die gewünschte Mutation in Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens durch homologe Rekombination eingeführt ist. Der konservierte Teil der Kolonie der ES-Zellen mit der gewünschten Mutation wird für das nachstehende Verfahren herangezogen und eingesetzt.
Einer trächtigen Maus wird ein Embryo im 8-Zellen-Stadium entnommen. Der Embryo wird mit etwa 20 der oben genannten konservierten ES-Zellen bestreut und anschließend in die Gebärmutter einer scheinträchtigen weiblichen Maus eingebracht. Von den geworfenen Jungtieren werden die Mäuse mit chimärer Fellfarbe selektiert Die chimäre Maus wird mit einer Maus des C57BL/6-Stamms gepaart, und eine Maus mit der gewünschten Mutation kann erhalten werden durch Selektion aus denjenigen der geworfenen Jungtiere, die eine Agouti-Fellfarbe haben. Die erhaltene Maus ist heterozygot bezüglich des Präsenilin-1-Gens, das mit der Mutation eingeführt ist, während das Präsenilin-1-Gen auf dem anderen Chromosom ein Wildtyp ohne Mutation ist.
Als Ausgangsmaterialien zur Herstellung der Sonde zum Klonieren der chromosomalen DNA, die das Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens aus der Maus-Genom-DNA-Bibliothek umfasst, kann eine cDNA des Präsenilin-1-Gens verwendet werden, die von einem anderen Säuger als Maus oder Mensch stammt und deren Nucleotidsequenz bekannt ist, sowie diejenigen, die in den Beispielen ausdrücklich erwähnt sind. Als Verfahren zur Gewinnung des als Sonde verwendeten DNA-Fragments kann ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids in großem Maßstab verwendet werden, das eine chromosomale Maus-DNA umfasst, die eine Region umfasst, die dem Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens in der chromosomalen DNA entspricht, oder eine cDNA des Präsenilin-1-Gens, die von einem anderen Säuger als Maus oder Mensch oder dergleichen stammt und deren Nucleotidsequenz bekannt ist, und es kann auch die in den Beispielen beschriebene Amplifikation mittels PCR angewandt werden. Des Weiteren kann nach Spaltung des Plasmids mit Hilfe eines Restriktionsenzyms das gewünschte DNA-Fragment durch Abtrennen eines als DNA-Fragment verwendeten Teils mittels Agarosegel-Elektrophorese und dergleichen erhalten werden.
Als Verfahren zur Markierung des DNA-Fragments können Verfahren angewandt werden wie beispielsweise solche mittels PCR in Gegenwart von ³²P-dNTP sowie das in den Beispielen beschriebene Verfahren der statistischen Primeranlagerung. Des Weiteren kann die Markierung mittels PCR oder statistischer Primeranlagerung unter Verwendung eines vormarkierten Oligodesoxynucleotids als Primer eingeführt werden. Zur Markierung können auch Chemilumineszenz unter Verwendung von Biotin-Avidin oder alkalischer Phosphatase oder dergleichen sowie die in den Beispielen erläuterten Radioisotope verwendet werden. Als Sonde kann auch ein RNA-Fragment verwendet werden, das unter Verwendung von T3- oder T7-RNA-Polymerase markiert wurde. Außer den vorstehend erwähnten sind auch verschiedene andere Verfahren zur Herstellung einer Sonde bekannt, und die gewünschte Sonde kann mit Hilfe irgendeines Verfahrens erhalten werden.
Zur Einführung einer Mutation in eine DNA können Verfahren angewandt werden, die in den Beispielen ausführlich beschrieben sind. Ein Plasmid, das von einem Bakteriophagen wie etwa M13 stammt, oder ein Plasmid, das unter Verwendung von ung-Escherichia coli wird des Weiteren komplementär an ein Oligodesoxynucleotid gebunden, das zur Einführung einer Mutation an einer gewünschten Mutationsstelle synthetisiert wurde (die Basen der Stelle, in die die Mutation eingeführt werden soll, sind nicht komplementär), und der resultierende Komplex wird als Primer zur Herstellung eines Heteroduplex-DNA-Plasmids mit Hilfe einer DNA-Polymerase verwendet, und anschließend wird Escherichia coli (ung⁺) mit dem resultierenden Plasmid transformiert, um das Plasmid mit der gewünschten Mutation zu erhalten. Zur Gewinnung eines Plasmids mit einer gewünschten Mutation wird ein weiteres Verfahren (Kassetten-Verfahren) angewandt, umfassend die Schritte des Synthetisierens zweier Oligodesoxynucleotide, die modifizierte Basen zur Einführung der gewünschten Mutation aufweisen und zu einem gegenseitig komplementären Annealing befähigt und so ausgelegt sind, dass sie Enzym-Restriktionsschnittstellen an beiden Enden ergeben, und des Ligierens des Oligodesoxynucleotids an ein Plasmid zur Einführung einer Mutation unter Verwendung von DNA-Ligase. Durch geeignetes Abwandeln oder Verändern der obigen Verfahren je nach Zweck kann ein Problem bisweilen effektiver gelöst werden. Zudem sind verschiedene in der Fachwelt verfügbare Methoden als Verfahren zur Einführung einer Mutation bekannt, und demgemäß kann ein beliebiges Verfahren zum Erreichen der Zielvorgaben angewandt werden.
Der Targeting Vektor kann vorzugsweise eine Expressionseinheit für einen Selektionsmarker als essentielles Element umfassen, die ein Fragment einer chromosomalen Maus-DNA umfasst, in das eine Mutation eingeführt ist, ein DNA-Fragment, das für einen Selektionsmarker codiert, einen Promotor zur Steuerung der Transkription derselben sowie einen Terminator. Das Fragment der chromosomalen Maus-DNA, in das eine Mutation eingeführt ist, ist ein notwendiger Teil zur Herbeiführung der homologen Rekombination in der ES-Zelle, und erforderlich sind auch die Fragmente der chromosomalen Maus-DNA, die den Mutationsort an beiden Seiten flankieren. Der Targeting Vektor weist somit ein DNA-Fragment auf, in dem sich lediglich die mutierten Basen von der nativen chromosomalen Maus-DNA unterscheiden. Die Länge des Fragments kann vorzugsweise etwa 10 kbp sein, und im Allgemeinen ist eine Verlängerung oder Verkürzung zu einem gewissen Grad zulässig. Ist das Fragment jedoch zu kurz, so kann die Frequenz der homologen Rekombination bisweilen verringert sein.
Als Selektionsmarker sind positive Selektionsmarker wie z.B. das Neomycin-Resistenzgen und das Hygromycin-Resistenzgen und negative Selektionsmarker wie etwa das Thymidinkinase-Gen von Herpes simplex-Virus und das Fragment A von Diphtherietoxin bekannt. Bei ES-Zellen können alle Marker verwendet werden, die für Zellkulturen eingesetzt werden. Wird ein negativer Selektionsmarker verwendet, so muss der Marker außerhalb des chromosomalen Maus-DNA-Fragments des Targeting Vektors inseriert werden. Wird ein positiver Selektionsmarker verwendet, so muss die Expressionseinheit in ein Intron des chromosomalen Maus-DNA-Fragments des Targeting Vektors inseriert werden. Wird ein positiver Marker in ein Exon inseriert, so verliert das inserierte Gen im Allgemeinen seine Funktion, und es ist dann bisweilen nicht möglich, eine Maus zu erzeugen, die letztendlich zum Zweck der Untersuchung der Auswirkungen der Mutation erzeugt werden soll.
Als ES-Zelllinie werden häufig die vom Maus 129-Stamm abgeleiteten Zelllinien verwendet. Als ES-Zellen, die von dem obigen Mausstamm abgeleitet sind, kön nen ES-Zellen wie etwa D3, CCE, J1 und AB1 verwendet werden, wie auch die in den Beispielen beschriebenen R1. Neben denjenigen des 129-Stamms können zum Beispiel von der Maus stammende ES-Zellen wie etwa die vom C57BL/6-Mausstamm verwendet werden. Als Verfahren zur Einführung des Targeting Vektors in die ES-Zellen kann im Allgemeinen die wie in den Beispielen beschriebene Elektroporation angewandt werden. Es kann jedes Verfahren angewandt werden, solange das Verfahren für die Einführung eines Plasmids in eine kultivierte Zelle brauchbar ist, etwa die Ca-phosphat-Copräzipitation oder ein Liposom-Verfahren. Werden die ES-Zellen mit dem eingeführten Targeting Vektor in Gegenwart eines Selektionsmarkers kultiviert, so weisen die überlebenden und Kolonien bildenden ES-Zellen möglicherweise homologe Rekombination auf. Als Verfahren zur Bestimmung, ob in den Kolonien bildenden ES-Zellen homologe Rekombination vorliegt, wird typischerweise die PCR angewandt. Verwendet werden kann ein DNA-Fragment, ein RNA-Fragment, ein synthetisches Oligodesoxynucleotid, ein Antikörper oder dergleichen, die als Sonde eingesetzt werden können.
Nach Zumischen der ES-Zellen zu einem befruchteten Ei in einem frühen Stadium der Entwicklung und anschließende Fortsetzung der Entwicklung kann aus einem Spermium oder einer Eizelle, die von den ES-Zellen stammen, eine Maus erhalten werden. Zum Mischen der ES-Zellen, in denen homologe Rekombination vorliegt, mit dem befruchteten Ei im frühen Entwicklungsstadium kann ein Verfahren angewandt werden, das in den Beispielen erklärt ist. Daneben kann auch ein Verfahren angewandt werden, umfassend die Schritte: Entnehmen eines befruchteten Eis im Blastula-Stadium aus einer trächtigen Maus, Injizieren von 10 bis 20 ES-Zellen in das Ei mit einer Injektionspipette, Transplantieren des behandelten Eis in die Gebärmutter einer scheinträchtigen Maus und anschließendes Fortsetzen der Entwicklung, um die Jungtiere zu erhalten.
Bei den befruchteten Eiern im frühen Stadium der Entwicklung, die zum Mischen mit den ES-Zellen verwendet werden, kann es sich um Eier handeln, die aus ei nem beliebigen Mausstamm erhalten wurden. Zur leichteren Bestimmung, ob die ES-Zellen in die Nachkommenschaft aufgenommen wurden oder nicht, werden vorzugsweise befruchtete Eier von einem Mausstamm verwendet, der eine andere Fellfarbe hat als der Mausstamm, von dem die ES-Zellen herrühren. Zum Beispiel sind die in den Beispielen verwendeten ES-Zellen von dem Agoutifarbigen 129-Stamm, und die Maus, von der das befruchtete Ei stammt (C57BL/6), hat ein schwarzes Fell. Mit diesen Handhaben ist es möglich, die Jungtiere problemlos zu selektieren, die Zellen aufweisen, die von den ES-Zellen stammen, indem die Jungtiere mit der chimären Fellfarbe aus den geworfenen Jungtieren selektiert werden. In diesem Fall haben die Jungtiere mit hohem Anteil an Agouti-Färbung sehr wahrscheinlich Keimzellen, die von den ES-Zellen abgeleitet sind. Bei der scheinträchtigen Maus kann es sich um einen beliebigen Mausstamm handeln.
Die verwendete Maus zum Erhalt einer Maus mit der gewünschten eingeführten Mutation durch Paaren mit der resultierenden chimären Maus kann vorzugsweise eine Maus eines Stamms mit einer Fellfarbe sein, die sich von derjenigen der Maus des Stamms unterscheidet, von dem die ES-Zellen stammen. Normalerweise wird eine männliche chimäre Maus mit einer weiblichen Maus eines anderen Stamms gepaart, und wenn Agouti-farbige Jungtiere erhalten werden, so haben die resultierenden Mäuse die gewünschte Mutation in heterozygoter Form. Da die Maus mit dem OS-2-mutierten Präsenilin-1-Gen eine durch IoxP-Sequenzen flankierte neo-Expressionseinheit aufweist, ist es möglich, durch Paarung mit einer transgenen Maus mit einem transferierten cre-Gen eine Maus zu erhalten, in der die neo-Expressionseinheit entfernt ist.
Wie zum Stand der Technik der vorliegenden Beschreibung erläutert, wird angenommen, dass eine Mutation am Präsenilin-1-Protein und Präsenilin-2-Protein die Bildung seniler Plaques aufgrund der Zunahme von Aβ42 fördert und dadurch das Ausbrechen der Alzheimer-Krankheit auslöst. Bei den transgenen Mäusen mit dem eingeführten Gen, das für das mutierte APP codiert, das die familiäre Alzheimer-Krankheit hervorruft, wird von einigen Mäuse berichtet, dass sie eine Amyloid-Ablagerung im Gehirn produzieren (Games D. et al., Nature Bd. 373, S. 523, 1995; Hsiao K. et al., Science Bd. 274, S. 99, 1996; Sturchler-Pierrat C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd. 94, Nr. 24, S. 13287, 1997). Bei diesen transgenen Mäusen wird angenommen, dass die Amyloid-Ablagerung durch die Zunahme der Menge an produziertem Aβ im Gehirn induziert wird.
Ein Teil des Schwanzes der Nachkommen wird abgenommen, und die chromosomale DNA wird extrahiert. Mit der extrahierten chromosomalen DNA als Substrat wird eine PCR durchgeführt, wobei als Primer zwei Oligodesoxynucleotide verwendet werden, die jeweils eine Nucleotidsequenz aufweisen, die den Mutationsort eines Gens flankieren soll, das für das mutierte APP codiert, sowie zwei Oligodesoxynucleotide, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, die den Mutationsort des mutierten PS-1-Gens flankieren soll.
Es kann bestimmt werden, ob das Gen, das für die APP-Mutante codiert, und das mutierte PS-1-Gen der vorliegenden Erfindung in die extrahierte chromosomale DNA eingebaut wurden oder nicht, indem mit dem PCR-Produkt eine Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt und anschließend beispielsweise das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Banden und die Mobilität der Banden im Gel beobachtet und die Bande mit der Mutation durch Hybridisierung unter Verwendung eines Oligodesoxynucleotids untersucht wird, das eine die Mutation umfassende Nucleotidsequenz aufweist. Die PCR kann nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Die Nucleotidsequenzen der als PCR-Primer verwendeten Oligonucleotide können beliebige Sequenzen sein, solange sie das für die APP-Mutante codierende Gen oder das mutierte PS-1-Gen nachweisen können. Auf der Grundlage der Ergebnisse der PCR kann ein Tier, das beide Gene jeweils in heterozygoter Form aufweist, durch Selektion von Tieren erhalten werden, die das für die APP-Mutante codierende Gen und das mutierte PS-1-Gen der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Um Tiere zu erhalten, die das für die APP-Mutante codierende Gen sowie das mutierte PS-1-Gen jeweils in homozygoter Form aufweisen, wird ein einzelnes Tier, das beide Gene in homozygoter Form aufweist, aus den Jungtieren ausgewählt, die erhalten werden durch Paaren eines geeigneten Männchens und Weibchens, die aus den Tieren ausgewählt werden, die beide Gene in heterozygote Form aufweisen. Zur Bestätigung, dass das für die APP-Mutante codierende Gen in homozygoter Form vorliegt, wird ein Teil des Schwanzes der Nachkommenschaft entnommen, und die chromosomale DNA wird extrahiert, und nach Spaltung der extrahierten chromosomalen DNA mit Restriktionsenzym wird eine Elektrophorese auf Agarose-Gel oder Acrylamid-Gel durchgeführt. Die DNA wird dann auf ein Membranfilter aufgetüpfelt, und es wird ein Southern-Blot durchgeführt, wobei ein Oligodesoxynucleotid als Sonde verwendet wird, das eine Sequenz aufweist, die spezifische Bindung an das für die APP-Mutante codierende Gen ermöglicht, und anschließend wird die Dichte der resultierenden Banden gemessen.
Ähnlich dem obigen Verfahren kann das Vorliegen des erfindungsgemäßen mutierten Präsenilin-1-Gens in homozygoter Form verifiziert werden. Die als Sonden im Southern-Blot verwendeten Oligodesoxynucleotide können nach Markierung mit Hilfsmitteln verwendet werden, die üblicherweise beim Southern-Blotting zum Einsatz kommen, wie etwa radioaktive Isotope und fluoreszierende Farbstoffe. So kann eine Maus erzeugt werden, die sowohl das für die APP-Mutante codierende Gen als auch das mutierte Präsenilin-1-Gen der vorliegenden Erfindung aufweist. Eine mit Hilfe des obigen Verfahrens erzeugte hybride Maus ist gekennzeichnet durch eine höhere Produktivität an Amyloid β-Protein im Gehirn und eine gesteigerte Amyloid-Ablagerung.
Mit dem genmutierten Tier, den Zellen mit dem transferierten mutierten Präsenilin-Gen, dem Plasmid, das das mutierte Präsenilin-Gen umfasst, und dergleichen ist es möglich, ein Screening mit Substanzen durchzuführen, die bei der vorbeugenden und/oder therapeutischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit brauchbar sind und deren Nutzen abzuschätzen. Die Ansammlung von Amyloid β in einem gesunden Säuger geht sehr langsam vor sich, wohingegen das genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung das charakteristische Merkmal einer höheren Produktivität an Amyloid β aufweist. Durch Verabreichen vieler verschiedener Testsubstanzen an das genmutierte Tier der vorliegenden Erfindung und Vergleichen des Tiers mit Tieren ohne Verabreichung oder mit Tieren, denen eine Kontrollsubstanz verabreicht wurde, können Substanzen bewertet werden, die zur vorbeugenden und/oder therapeutischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit brauchbar sind. Ein typisches Beispiel für die Evaluierung umfasst das Screening von Testsubstanzen, und die Bedingungen, pathologischen Beobachtungen, pharmakologischen Tests und dergleichen können als Prüfungen herangezogen werden.
Bei Verwendung der Zellen der vorliegenden Erfindung werden Zellen aus dem Tier der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als primäre Zellkultur isoliert, und anschließend können die Zellen durch Immortalisierung der Zellen der primären Kultur durch Behandlung mit einem Virus oder dergleichen, Subkultivieren der Zellen durch Isolieren eines Teils der Kultur und weiteres Kultivieren in einem frischen Gewebekulturmedium stabilisiert und in eine subkultivierte Zelllinie überführt werden. Die Zellen der vorliegenden Erfindung umfassen die primäre Zellkultur, etwa Nervenzellen, die aus dem genmutierten Tier isoliert werden, sowie subkultivierte Zellen, d.h., so genannte Zelllinien, die durch Subkultivieren der primären Kultur erhalten werden. Wird eine Nervenzelle als Zelle der vorliegenden Erfindung verwendet, so exprimiert die Zelle eine große Menge Amyloid β-Protein aufgrund der Expression des mutierten Präsenilin-1-Proteins durch die Zelle. Substanzen, die den Nervenzelltod verhindern oder verzögern, der mit der Ansammlung von Amyloid β in Zusammenhang steht, können einem Screening unterzogen werde, und der Nutzen derselben kann auch abgeschätzt werden durch Zugabe einer Testsubstanz zu einem in vitro-Kultursystem dieser Nervenzellen und Vergleichen z.B. der Überlebensdauer der Zellen oder der Anzahl überlebender Zellen nach einer bestimmten Zeitspanne.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden. Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispielen beschränkt. In den folgenden Beispielen wird das Präsenilin-1-Gen gelegentlich als PS-1 bezeichnet.
Beispiel 1:
Klonierung chromosomaler DNA, die das Exon 8 des Maus-Präsenilin-1-Gens (PS-1) enthält
Zum Aufbau einer Sonde zur Isolierung einer chromosomalen DNA, die das Exon 8 des Maus-PS-1-Gens enthält, wurden die folgenden beiden Oligodesoxynucleotide synthetisiert:

PR-8-U: 5'-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3'(25mer)
PR-8-L: 5'-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTGA-3'(23mer)

Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der beiden Oligodesoxynucleotide als PCR-Primer und einer DNA aus der 129 SVJ-Maus-Genom-Bibliothek (Stratagene), um ein amplifiziertes DNA-Fragment von etwa 130 bp zu ergeben. Das Fragment wurde anschließend mit Hilfe eines Verfahrens der statistischen Primeranlagerung in Gegenwart von ³²P-dCTP markiert und anschließend als Sonde zum Screening der 129 SVJ-Maus-Genom-Bibliothek verwendet. Die resultierenden positiven Phagen-Klone wurden untersucht, und es wurde bestätigt, dass sie die gewünschte chromosomale DNA einschließlich Exon 8 des Maus-PS-1-Gens trugen. Die klonierte chromosomale DNA wurde als Pα bezeichnet und einer Restriktionskartierung unterzogen (1).
Beispiel 2:
Konstruktion des Plasmids zur Einführung der Mutation
Aus dem klonierten Phagen, der Pα trägt, wurde die DNA extrahiert und mit SalI gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 1,0% Agarose-Gel unterzogen, um Pα zu gewinnen. Nach Spaltung mit PstI und XbaI wurde das Produkt einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein DNA-Fragment mit etwa 600 bp zu gewinnen, das eine Nucleotidsequenz enthielt, die für Isoleucin in Position 213 des Maus-PS-1 codiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde als X-1 bezeichnet. X-1 wurde unter Verwendung von T4-Ligase an das Plasmid pBluescript II KS+ (Stratagene) ligiert, das vorher mit PstI und XbaI gespalten worden war, und anschließend zur Transformation von Escherichia coli verwendet, um das Plasmid pX-1 zu erhalten.
Beispiel 3:
Einführung der OS-2-Mutation
In das Plasmid pX-1 wurden eine OS-2-Mutation und ein Sau3Al-Restriktionsschnittstelle neu eingeführt, wobei die folgenden beiden Oligodesoxynucleotide PRL-104 und PRL-105 verwendet wurden. PRL-104 wie auch PRL-105 sind 36mere und zueinander komplementär.

PRL-104: 5'-TGTGGTCGGGA TGATC* GCCA C CCACTGGAAAGGCCC-3'
PRL-105: 5'-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGC* ATCATCCCGACCACA-3'

(Die unterstrichenen Basen werden von der Wildtyp-Base zur Einführung der OS-2-Mutation verändert, d.h., T bei PRL-104 und A bei PRL-105 in den Wildtypen. Die mit Stern versehenen Basen werden von der Wildtyp-Base zur Einführung der Sau3Al-Stelle verändert, d.h., T bei PRL-104 und A bei PRL-105 in den Wildtypen.)
Die Einführung der Mutation wurde durchgeführt unter Verwendung des QUICK CHANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT (Stratagene) gemäß den Vorschriften des Herstellers. Durch Sequenzierung des Produkts wurde bestätigt, dass die Mutation korrekt eingeführt worden war. Das X-1 mit der Mutation wurde als mX-1 bezeichnet, und das Plasmid mit mX-1 wurde als pmX-1 bezeichnet (2).
Beispiel 4:
Konstruktion einer chromosomalen DNA, umfassend die OS-2-Mutation
Das in Beispiel 1 erhaltene Pα, enthaltend das Exon 8 des Maus-PS-1, wurde mit NcoI gespalten und anschließend mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von vier Arten dNTPs behandelt, um glatte Enden zu bilden. Das resultierende Fragment wurde mit Asp718I weiter gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein etwa 5 kbp-DNA-Fragment mit Exon 8 zu gewinnen. Dieses Fragment unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an das Plasmid pBluescript II KS+ ligiert, das vorher mit SamI und Asp718I gespalten worden war, und anschließend in Escherichia coli transformiert, um das Plasmid pSB-0 zu ergeben. Das Plasmid pSB-0 wurde mit XbaI komplett gespalten und anschließend mit PstI teilweise verdaut. Das Plasmid pmX-1 wurde mit XbaI und PstI gespalten und einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um mX-1 zu gewinnen. Das mX-1 wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an das PstI-Fragment ligiert und anschließend zur Transformation von Escherichia coli verwendet. Die Kolonien der transformierten E. coli wurden einem Screening unterzogen, um eine Kolonie mit dem Plasmid zu selektieren, in dem der X-1-Teil im Plasmid pSB-0 durch mX-1 ersetzt war. Das gewonnene Plasmid wurde als pmSB-0 bezeichnet (3).
Daneben wurde Pα mit BamHI und SalI gespalten und einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein DNA-Fragment von etwa 7 kbp zu gewinnen, welches das Exon 8 enthielt. Dieses Fragment wurde unter Verwendung von T4-Ligase an das Plasmid pBluescript II KS+ ligiert, das vorher mit BamHI und SalI gespalten worden war, und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet, um das Plasmid pSB-1 zu erhalten. Das Plasmid pmSB-0 wurde mit NcoI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von vier Arten dNTPs behandelt, um glatte Enden zu bilden. Das resultierende Fragment wurde mit XbaI weiter gespalten und einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen. Es wurde ein DNA-Fragment XN mit etwa 2,2 kbp gewonnen, welches das Exon 8 enthielt, und anschließend wurden das Fragment und das Plasmid pSB-1 mit XbaI und PstI gespalten und die Produkte wurden dann einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen. Das gewonnene DNA-Fragment PX mit etwa 2,3 kbp, das kein Exon enthielt, wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das ligierte Fragment wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase des Weiteren an pBluescript II KS+ ligiert, das vorher mit XbaI gespalten worden war, mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von vier Arten dNTPs mit glatten Enden versehen, erneut mit T4-DNA-Ligase ligiert und mit SmaI und PstI gespalten. Das resultierende Plasmid wurde dann in E. coli transformiert. Die Kolonien der transformierten Zellen wurden einem Screening unterzogen, um das Plasmid pmSB-0' zu erhalten, das nur ein DNA-Fragment trägt, in dem die DNA-Fragmente XN und XP an die XbaI-Stelle ligiert sind (4).
Beispiel 5:
Konstruktion des Targeting Vektor-Gerüsts
Zur Einführung einer EagI-Stelle in die XbaI-Stelle im Plasmid pmSB-0' wurde ein Oligodesoxynucleotid mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
5'-CTAGACGGCCGT-3'(12mer)
Dieses Oligodesoxynucleotid ist über eine Nucleotidsequenz mit Komplementarität im Teil CGGCCG zu einem Annealing und nach Einführung einer mit XbaI gespaltenen Stelle zur Bildung der folgenden Sequenz befähigt.
Nach Spaltung des Plasmids pmSB-0' mit XbaI wurde das obige Desoxynucleotid dem Produkt zugegeben, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet, um das Plasmid pmSB-0'eag zu erhalten, in dem die EagI-Stelle in die XbaI-Stelle des Plasmids pmSB-0' inseriert war. Nach Spaltung von pmSB-0'eag mit NcoI und SalI wurden die resultierenden Fragmente einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein DNA-Fragment SN mit etwa 5,3 kbp mit dem Exon 8 zu ergeben. Daneben wurde das Plasmid pSB-1 mit BamHI und NcoI gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein DNA-Fragment NB von etwa 2 kbp zu gewinnen, welches kein Exon 8 enthielt. Die Fragmente SN und NB wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert und mit BamHI und SalI behandelt, um ein DNA-Fragment zu ergeben, in dem beide DNA-Fragmente an die NcoI-Stelle ligiert waren. Dieses DNA-Fragment wurde anschließend mit T4-DNA-Ligase an pBluescript II KS+ ligiert und dann zur Transformation von E. coli verwendet, um das Plasmid pA zu ergeben (5), wobei pBluescript II KS+ vorher mit NotI gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease mit glatten Enden versehen, mit T4-DNA-Ligase erneut ligiert wurde, um die NotI-Stelle und die mit dieser Stelle überlappende EagI-Stelle aufzubrechen, und mit BamHI und SalI gespalten wurde.
Beispiel 6:
Konstruktion des Targeting Vektors
Das Plasmid pPNT (Victor L.J. et al., Cell, Bd. 65, S. 1153, 1991) wurde mit XhoI und BamHI gespalten, anschließend mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu bilden, und einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen. Das gewonnene DNA-Fragment von etwa 1,7 kbp, das eine neo-Expres sionseinheit enthielt, wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an das Plasmid pBS246 (GIBCO BRL) ligiert, das vorher mit BamHI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war, um glatte Enden zu bilden, und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet, um das Plasmid pBS246neo zu ergeben. Das Plasmid wurde mit NotI gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um ein DNA-Fragment von etwa 2 kbp zu ergeben, das die durch IoxP-Sequenzen flankierte neo-Expressionseinheit enthielt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an das Plasmid pA ligiert, das vorher mit EagI gespalten worden war, und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet. Die Kolonien der transformierten Zellen wurden einem Screening unterzogen, um das Plasmid pB zu erhalten, in dem das neo-Gen und das PS-1-Gen gleichsinnig orientiert waren (6).
Nach Spaltung des Plasmids pB mit BamHI und SalI wurden die resultierenden Fragmente einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen, um das DNA-Fragment C zu gewinnen, das die OS-2-Mutation und die neo-Expressionseinheit flankiert durch IoxP-Sequenzen enthielt. In ähnlicher Weise wurde Pα mit SalI und BamHI gespalten, und das resultierende DNA-Fragment von etwa 6,5 kbp wurde in pBluescript II KS+ subkloniert, um das Plasmid pSB-2 zu konstruieren, das anschließend mit HindIII und BamHI gespalten und einer Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel unterzogen wurde, um ein DNA-Fragment D von etwa 4 kbp zu ergeben. Die DNA-Fragmente C und D wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, und anschließend wurde das Produkt mit HindIII und SalI gespalten, um ein DNA-Fragment zu ergeben, in dem C und D an die BamHI-Stelle ligiert waren. Das erhaltene DNA-Fragment wurde des Weiteren mit T4-DNA-Ligase an pBluescript II KS+ ligiert, das vorher mit HindIII und SalI gespalten worden war, und anschließend zur Transformation von E. coli verwendet, um den Targeting Vektor pOS-2neoloxP zu ergeben (7).
Beispiel 7:
Einführung des Targeting Vektors in ES-Zellen
In den nun folgenden Beispielen wurde die Kultivierung in einem Brutschrank bei 37°C unter 5% CO₂ durchgeführt. Der Targeting Vektor wurde mittels Elektroporation in die ES-Zellen (R1) eingeführt, die in DMEM-Medium, ergänzt mit 15% FBS und 10³ Einheiten/ml LIF (ESGRO), gehalten wurden (das DMEM-Medium wird im folgenden als ES-Medium abgekürzt). Einen Tag vor der Elektroporation wurde das Kulturmedium durch frisches ES-Medium ersetzt, und die R1-Zellen wurden abgenommen und mit Elektroporationspuffer gewaschen (20 mM HEPES, pH 7,05, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄, 6 mM Dextrose). Die R1-Zellen (10⁷ Zellen) wurden mit 25 μg des Targeting Vektors pOS-2neoloxP, der mit NotI linearisiert worden war, und 0,8 ml Elektroporationspuffer in einer Elektroporationsküvette gemischt. Nach 1 bis 2 Minuten wurden mit einem Bio-Rad GenePulser (Bio-Rad) Pulse unter Pulsbedingungen von 240 V und 500 μF auf die Zellen angewandt. Die ES-Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und in 30 ml ES-Medium suspendiert. Die ES-Zellen-Suspension (2 ml) wurde jeweils in 10 ml Kulturschalen verbracht, in der sich Feeder-Zellen in 8 ml ES-Medium befanden. Nach 12 bis 18 Stunden wurde G418 (Titer 150 μg/ml) der Kultur zugesetzt, und anschließend wurde eine Woche kultiviert. Als Feeder-Zellen wurde ein von den hier tätigen Erfindern erbrachter Fibroblast verwendet, der aus einem Embryo von 12 bis 13 Tagen isoliert wurde, welcher erhalten worden war durch Paaren einer männlichen HS1-Knockout-Maus (I. Taniuchi et al., EMBO J., Bd. 14, S. 3664, 1995) mit einer weiblichen ICR-Maus des Wildtyps.
Beispiel 8:
Isolierung von ES-Zellen mit homologer Rekombination
Es wurden Kolonien von ES-Zellen gewonnen, die in Beispiel 7 durch einwöchiges Kultivieren nach Zugabe von G418 gebildet worden waren. Jede Kolonie wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde weiter kultiviert. Zur Selektion der Klone, bei denen homologe Rekombination erfolgte, wurde der andere Teil mit PBS gewaschen, mit Proteinase K behandelt, und anschließend wurde die chromosomale DNA gewonnen und zur Selektion der Klone einer PCR unterzogen. Die Nucleotidsequenzen der für die PCR verwendeten synthetischen Primer waren wie folgt:

PrsnI-2: 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3' (Nucleotidsequenz außerhalb des konstruierten Targeting Vektors)
PKG-1: 5'-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3' (Nucleotidsequenz in der neo-Expressionseinheit)

Die PCR wurde in 35 Zyklen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 Sekunden bei 93°C, 1 Minute bei 60°C und 3 Minuten bei 68°C je Zyklus. Das PCR-Produkt wurde mittels Elektrophorese auf 1% Agarose-Gel analysiert, um einen positiven Klon zu identifizieren, der eine Bande an der erwarteten Position ergab. Mit dem als positiv bewerteten Klon wurde des Weiteren eine PCR unter Verwendung der Oligodesoxynucleotide PRL-101 und PRL-102 durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Sau3Al gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 2% Agarose-Gel unterzogen. Die Einführung der Mutation wurde durch aufgespaltene Banden verifiziert, und es wurden die ES-Zellen selektiert, bei denen die gewünschte homologe Rekombination auftrat. Die Nucleotidsequenzen von PRL-101 und PRL-102 waren wie folgt:

PRL-101: 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3'
PRL-102: 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3'

Beispiel 9:
Erzeugung einer Knock-in-Maus
Die ES-Zellen mit bestätigter homologer Rekombination wurden 4 Tage lang weiter kultiviert und anschließend mit Trypsin behandelt, um sich voneinander zu trennen. Ein Embryo aus acht Zellen wurde einer weiblichen BDF1-Maus entnommen, die mit einer männlichen BDF1-Maus gepaart worden war, und anschließend wurde dessen Zona pellucida entfernt. Die voneinander getrennten ES-Zellen wurden an den nackten Embryo angefügt (20 ES-Zellen pro 8-zelligem Embryo). Der behandelte Embryo wurde in die Gebärmutter einer scheinträchtigen weiblichen Maus überführt, und die embryonale Entwicklung wurde fortgesetzt, um chimäre Mäuse zu ergeben. Die resultierende chimäre männliche Maus wurde mit einer weiblichen C57BL/6-Maus gepaart. Aus der Nachkommenschaft wurden die Mäuse mit Agouti-Färbung ausgewählt. Ein Teil des Schwanzes wurde ausgeschnitten, und die chromosomale DNA wurde aus der jeweiligen Probe extrahiert. Es wurde eine PCR unter Verwendung von PRL-101 und PRL-102 durchgeführt, und das PCR-Produkt wurde mit Sau3Al gespalten und anschließend einer Elektrophorese auf 2% Agarose-Gel unterzogen. Es wurde auf die Gegenwart von Spaltungsbanden hin untersucht, um zu verifizieren, dass die ausgewählten Nachkommen die OS-2-Mutation besaßen. Aus den verifizierten Mäusen wurde eine männliche Maus ausgewählt und mit #2 bezeichnet.
Beispiel 10
Die in Beispiel 9 erhaltene Knock-in-Maus #2 hat die vom Targeting Vektor stammende, durch IoxPs flankierte neo-Expressionseinheit. Diese Maus #2 (männlich, etwa 4 Monate alt) wurde mit einer weiblichen transgenen CAG-cre#13 F4-Maus gepaart (2 Monate alt, wobei das transferierte cre-Gen in heterozygoter Form ist; K. Sakai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 318, 1997). Die PCR wurde unter Verwendung der Oligodesoxynucleotide PRL- 100, PRL-102 und PGK-1 unter den in Beispiel 8 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Als OS-2-mutierte Knock-in-Maus ohne die neo-Expressionseinheit wurde eine Maus ausgewählt, aus der die neo-Expressionseinheit entfernt worden war (8). Diese Maus war heterozygot bezüglich der OS-2-Mutation und hatte ein IoxP. Die für die PCR verwendeten Nucleotidsequenzen von PRL-100, PRL-102 und PGK-1 waren wie folgt:

PRL-100: 5'-GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TCT-3'
PRL-102: 5'-TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA PGC-3'
PKG-1: 5'-TAG TGA GAC GTG CTA CTT CCA TTT GTC ACG-3'

Industrielle Anwendbarkeit
Die genmutierte Maus der vorliegenden Erfindung hat ein mutiertes Präsenilin-1-Gen und aufgrund dieses Gens eine hohe Produktivität an Amyloid β im Vergleich zu einer normalen Maus ohne die Mutation, und daher zeigt das Tier die Symptome der Alzheimer-Krankheit durch frühen Zelltod oder das Vergehen von Neuronen im zerebralen Hippokampus. Bei Verwendung des genmutierten Tiers der vorliegenden Erfindung kann daher ein Screening von Substanzen, die zur vorbeugenden und/oder therapeutischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit brauchbar sind, sowie eine Evaluierung der Nützlichkeit derselben durchgeführt werden.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine genveränderte Maus mit einem aus einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1-Gen, wobei die genveränderte Maus erhalten wird durch Transfer des mutierten Präsenilin-1 Gens mittels der Technik der homologen Rekombination und wobei die Maus homozygot bezüglich des mutierten Präsenilin-1 Gens ist, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA umfasst mit einer Sequenz, die für ein mutiertes Präsenilin-1 Potein kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist wobei eine oder mehrere Aminosäurepositionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionen Nr. 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426, und 436 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch andere Aminosäure(n) ersetzt ist/sind.
Die genveränderte Maus gemäß Anspruch 1, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA mit einer Sequenz umfasst, die für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, das eine oder mehrere Mutationen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P und P436S in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins umfasst, wobei jeder Buchstabe eine Aminosäure als Einbuchstabensymbol ausdrückt, wobei jede Ziffer eine Aminosäureposition ausgehend vom N-Terminus des Präsenilin-1 Proteins repräsentiert, und die Beschreibung bedeutet, dass eine links der Ziffer dargestellte Aminosäure des Wildtyps durch die rechts davon dargestellte Aminosäure ersetzt ist.
Die genveränderte Maus gemäß Anspruch 1, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA mit einer Sequenz umfasst, die für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, wobei das Isoleucin der Position 213 des Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist.
Die genveränderte Maus gemäß Anspruch 1, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA mit einer Sequenz umfasst, die für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, wobei das Isoleucin der Position 213 des Präsenilin-1 Proteins durch Threonin ersetzt ist.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Maus ein mutiertes Präsenilin-1 Gen aufweist, wobei eine um die Aminosäureposition 213 kodierende DNA-Sequenz in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins in die folgende Sequenz verändert ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' wobei N eine von T verschiedene Base ist, M T oder C darstellt, und die unterstrichenen Basen die Aminosäureposition 213 kodieren.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Maus das mutierte Präsenilin-1 Gen besitzt, wobei eine um die Aminosäureposition 213 kodierende DNA-Sequenz in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins in die folgende Sequenz verändert ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' wobei N C darstellt, M T oder C darstellt, und die unterstrichenen Basen die Aminosäureposition 213 kodieren.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Tier das mutierte Präsenilin-1 Gen besitzt, wobei eine um die Aminosäureposition 213 kodierende DNA-Sequenz in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins in die folgende Sequenz verändert ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3' wobei XYZ ein Codon als Basentriplet darstellen, das eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure bedeutet, wobei M T oder C repräsentiert, und die unterstrichenen Basen die Aminosäureposition 213 kodieren.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Überexpression des Amyloid β Proteins durch das mutierte Präsenilin-1 Gen verursacht wird.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Maus das mutierte Präsenilin-Protein exprimieren kann und wobei die Expression des genannten Proteins die Produktion des Amyloid β Proteins in einer Menge anregen kann, die ausreicht um eine fortgeschrittene neurale Krankheit in einem peripheren Teil der Hirnrinde im Gehirn der Maus auszubilden.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das zuvor genannte mutierte Präsenilin-1 Gen mittels homologer Rekombination übertragen wurde.
Die genveränderte Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Menge der Amyloid-Protein-Expression in einem Hirngewebe, die durch das Präsenilin-1 Gen induziert wurde ausreicht, um ein abweichendes Verhalten in einem Gedächtnis-Lern-Test im Vergleich zu einer normalen Maus zu verursachen und ausreichend ist, um eine abweichende Neuropathie in einem peripheren Teil der Hirnrinde des Hippocampus im Gehirn der genveränderten Maus zu induzieren.
Eine genveränderte Maus mit einer DNA, die ein aus der Maus stammendes mutiertes Präsenilin-1-Gen umfasst, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, in dem eine oder zwei oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch eine andere Aminosäure ersetzt ist/sind, sowie eine DNA mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Markerprotein kodiert, wobei die genveränderte Maus erhalten wird durch Transfer des mutierten Präsenilin-1 Gens mittels der Technik der homologen Rekombination und wobei die Maus homozygot bezüglich des mutierten Präsenilin-1 Gens ist, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA umfasst mit einer Sequenz, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Potein kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist wobei eine oder mehrere Aminosäurepositionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionen 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 und 436 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch andere Aminosäure(n) ersetzt ist/sind.
Die Verwendung eines Plasmides umfassend eine DNA oder einen Teil davon zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die DNA eine Sequenz eines von einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1 Gens aufweist, wobei eine um die Aminosäureposition 213 kodierende DNA-Sequenz in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins die folgende Sequenz ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3' wobei N A, G oder C darstellt, M T oder C darstellt, und die unterstrichenen Basen eine Aminosäure der Position 213 kodieren.
Die Verwendung eines Plasmides umfassend eine DNA oder einen Teil davon zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die DNA eine Sequenz eines von einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1 Gens aufweist, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, wobei eine Aminosäure der Position 213 in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, und eine um die Aminosäureposition 213 kodierende DNA-Sequenz des Präsenilin-1 Proteins die folgende Sequenz ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3' wobei M T oder C darstellt, XYZ ein Codon als Basentriplet bezeichnen, das für eine von Isoleucin verschiede Aminosäure kodiert, und die unterstrichenen Basen für die Aminosäure der Position 213 kodieren.
Die Verwendung einer chromosomalen DNA enthaltend das Exon 8 eines von einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1 Gens, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, wobei eine Aminosäure der Position 213 in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist, zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß Anspruch 1 oder 3.
Die Verwendung eines Plasmides umfassend die DNA zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei eine Sau3Al-Schnittstelle in eine Nukleotidsequenz eingefügt ist, das die ganze oder einen mutierten Teil einer cDNA oder chromosomalen DNA eines aus der Maus stammenden mutierten Präsenilin-1 Gens enthält, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, in dem eine Aminosäure der Position 213 in einer Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Aminosäuresubstitution die der Aminosäure Isoleucin der Position 213 in Threonin ist.
Die Verwendung eines Plasmides umfassend eine DNA zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die DNA durch die folgende Nukleotidsequenz spezifiziert ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' wobei M T oder C darstellt.
Die Verwendung eines Gens, das für ein von einer Maus stammendes mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei Isoleucin der Position 213 in einer Aminosäuresequenz eines Maus-Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei die Substitution die der Aminosäure Isoleucin in Threonin ist.
Die Verwendung eines Plasmides zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Plasmid enthält: (1) ein Gen, das für ein aus der Maus stammendes mutiertes Präsenilin-1 Protein kodiert, wobei Isoleucin der Position 213 in einer Aminosäuresequenz eines Maus-Präsenilin-1 Proteins durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist; und (2) eine Neomycin-Expressions-Einheit, die durch IoxPs flankiert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei die Substitution die der Aminosäure Isoleucin in Threonin ist.
Die Verwendung eines Maus-Embryos zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei in den Embryo ein Plasmid eingeschleust ist umfassend eine DNA, die durch die folgende Nukleotidsequenz dargestellt ist: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3' wobei M T oder C darstellt.
Die Verwendung eines Maus-Embryos zur Herstellung einer genveränderten Maus gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Embryo durch die Technik der homologen Rekombination unter Verwendung eines Pasmides gemäß irgend einem der Ansprüche 14, 16, 17, 18, 21 oder 22 erhalten wird.
Eine primäre Zellkultur oder eine subkultivierte Zelle, die durch Isolierung einer Zelle aus dem genveränderten Tier gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 12 erhalten wurde, und Kultivierung der Zelle in Gewebekultur.
Ein Verfahren zur Herstellung einer genveränderten Maus, wobei das Verfahren einen Schritt des Transfers eines von einer Maus stammenden mutierten Präsenilin-1 Gens mittels der Technik der homologen Rekombination in einen Embryo der Maus umfasst, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen in der Lage ist ein mutiertes Präsenilin-1 Protein zu exprimieren und die Produktion des Amyloid β Proteins in einer Menge zu induzieren die ausreicht, um eine fortgeschrittene neurale Krankheit im Hippocampus oder eines peripheren Teils der Hirnrinde des Gehirns auszubilden, und wobei die genveränderte Maus homozygot bezüglich des mutierten Präsenilin-1 Gens ist, wobei das mutierte Präsenilin-1 Gen eine DNA umfasst mit einer Sequenz, das für ein mutiertes Präsenilin-1 Potein kodiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist wobei eine oder mehrere Aminosäurepositionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionen 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 und 436 in der Aminosäuresequenz des Präsenilin-1 Proteins durch andere Aminosäure(n) ersetzt ist/sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei ein von einer Maus stammendes Präsenilin-1 Protein exprimiert wird, wobei Isoleucin der Position 213 durch eine von Isoleucin verschiedene Aminosäure ersetzt ist.
Ein Verfahren zur Beurteilung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder vorbeugenden Behandlung der Alzheimer'schen Krankheit, umfassend den Schritt der in vitro Kultivierung der Primärzellkultur oder der subkultivierten Zelle gemäß Anspruch 25 in Anwesenheit einer Testsubstanz.