KR20010040330A - 유전자 변이동물 - Google Patents

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KR20010040330A
KR20010040330A KR1020007007576A KR20007007576A KR20010040330A KR 20010040330 A KR20010040330 A KR 20010040330A KR 1020007007576 A KR1020007007576 A KR 1020007007576A KR 20007007576 A KR20007007576 A KR 20007007576A KR 20010040330 A KR20010040330 A KR 20010040330A
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protein
presenilin
amino acid
gene
mutant
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다케다마사토시
다케다준지
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스즈키 다다시
다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤
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Abstract

프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질(예를 들면, 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질의 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산, 예를 들면 트레오닌으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질)을 코딩하는 DNA 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 마우스 등의 유전자 변이동물. 인간에 있어서의 알츠하이머병 환자의 병태에 더욱 근접한 모델동물로서 유용하다.

Description

유전자 변이동물{Gene Mutant Animals}
〈110〉 DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.
〈120〉 Gene Mutant Animals
〈130〉 FP0019/SIKs/JP
〈150〉 PCT/JP
〈151〉 1998-01-08
〈160〉 17
〈170〉 KOPATIN 1.5
〈210〉 1
〈211〉 467
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 1
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260 265 270
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275 280 285
Ser Ser Thr Met Val Trp Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp Pro Glu
290 295 300
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340 345 350
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tagtgagacg tgctacttcc atttgtcacg 30
알츠하이머병은 진행성 치매증상을 보이는 질환으로, 뇌속에서의 현저하게 많은 노인반점의 출현과 신경원선유변화의 신경세포내 축적을 병리조직학적 특징으로 하여, 서서히 신경세포가 장애를 받아 탈락하는 신경변성 질환이다. 알츠하이머병은 노령자에게 많이 발병하며, 나이가 듦에 따라 환자의 비율이 증대하는 것으로 알려져 있다. 현재, 알츠하이머병의 치료는 불가능하여, 장래의 노령자 인구의 급증에 대비하여 알츠하미어병에 대한 치료나 예방을 위한 방법 및 알츠하이머병에 대하여 유효한 예방·치료제의 조속한 개발이 절실히 필요하다.
노인반점은 여러가지 성분을 함유하는 신경세포 외의 침착물로, 아밀로이드β단백질(Aβ)이라 불리는 39~42개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 주성분으로 한다. 아밀로이드β는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein: APP)로부터 β세크레타제와 γ세크레타제라 가칭되는 프로테아제로 절단되어 생성된다. 노인반점에는 아밀로이드β가 β시트구조를 갖는 견고한 구조물로서 침착되어 있다. 노인반점은 미만성(널리 퍼짐) 노인반점이라 불리는 "기미(stain-like)" 형상의 침착에서 시작되는데, 이 단계에서는 신경변성은 생기지 않고 미만성 노인반점이 더욱 견고한 침착물이 됨과 동시에, 신경변성이나 신경세포의 탈락이 생김에 따라 치매 등의 알츠하이머병의 증상이 나타나는 것으로 여겨지고 있다. 아밀로이드β로는 주로 40아미노산 잔기로 이루어지는 Aβ40과 42아미노산 잔기로 이루어지는 Aβ42가 존재한다. 세포가 생성하는 아밀로이드β의 대부분은 Aβ40이며, Aβ42는 미량 존재하는데 불과하나, Aβ42 쪽이 응집성이 높아 Aβ40에 비하여 노인반점 형성에 기여하는 역할은 큰것으로 여겨진다(참조: 옥강: 내과 77권, 843 페이지, 1996년).
알츠하이머병에서는 상염색체 우성유전을 나타내는 가족성 발증이 인정된다. 이 가족성 알츠하이머병의 원인유전자로서 최초로 발견된 것은 1991년 제 717번째의 아미노산 잔기가 발린에서 이소류신으로 전이되는 APP의 돌연변이체로, 이 유전자는 21번 염색체상에 존재한다(참조: Goate A. 외: Nature 349권, 704 페이지, 1991년).
이 밖에도 알츠하이머병의 원인이 되는 APP의 돌연변이체로서, 동일하게 제 717번째의 아미노산 잔기가 페닐알라닌으로 변환된 것(참조: Murrell J. 외: Science 254권, 97 페이지, 1991년), 동일한 위치의 아미노산 잔기가 글리신으로 변이된 것(참조: Chartier, Harlin 외: Nature 353권, 844 페이지, 1991년), 제 670번째와 671번째의 2 아미노산 잔기가 리신·메티오닌에서 아스파라긴·류신으로 변이된 것(참조: Mullan M. 외: Nature Genet. 1권, 345 페이지, 1992년), 제 692번째의 아미노산 잔기가 알라닌에서 글리신으로 변이된 것(참조: Hendrisk L. 등: Nature Genet. 1권, 218 페이지, 1992년) 등이 발견되어 있다.
가족성 알츠하이머병의 원인인자 또는 위험인자로서 아포리포단백질 E(apo E)이 1993년에 보고되었다. 즉, 19번 염색체상에 유전자가 존재하는 apo E의 아이소머 중, 제 112번째의 아미노산 잔기가 알기닌이고, 제 158번째의 아미노산 잔기가 알기닌인 apoE4를 보유하는 사람의 비율이 알츠하이머병 환자에서는 건강한 사람에 비하여 현저하게 높음을 발견하였다(참조: Corder E. H. 외: Science 261권, 921 페이지, 1993년).
그 후, 1995년에 알츠하이머병의 새로운 원인유전자로서, 14번 염색체상에 존재하는 [프리세닐린-1](PS-1; 당초에는 S182라 불리워졌다)의 유전자(참조: Sherrington R. 외: Nature 375권, 754 페이지, 1995년)의 돌연변이체 및 1번 염색체상에 존재하는 [프리세닐린-2](PS-2; 당초에는 E5-1 또는 STM-2라 불리워졌다)의 유전자(참조: Rogaev E. I. 외: Nature 376권, 775 페이지, 1995년)의 돌연변이체가 발견되었다(본 명세서에 있어서, 각각의 유전자를 [프리세닐린-1 유전자] 및 [프리세닐린-2 유전자]라 칭한다. 또한, 그들 유전자산물을 각각 [프리세닐린-1 단백질] 및 [프리세닐린-2 단백질], 또는 [PS-1] 및 [PS-2]라 칭한다.).
프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질은 각각 467 아미노산 잔기 및 448 아미노산 잔기로 구성되는 7회(또는 8회) 막관통형의 1차구조를 가지며, 막 단백질로서 존재하는 것으로 추측되어진다. 양자의 아미노산 레벨에서의 상동성은 높아, 전체에서 67%, 막통과부만에서는 84%이다. 프리세닐린-1 단백질의 기능에 관해서는, 선충의 sel-12 단백질이나 SPE-4 단백질과의 높은 상동성으로 인하여, 이들 단백질과 기능이 유사할 가능성이 지적되고 있다. SPE-4 단백질은 선충의 정자 형성과정에 관여하는 단백질로, 단백질의 수송·저장에 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 프리세닐린-1 단백질은 APP와 같은 막 단백질의 프로세싱, 축책수송(axoplasmic transport), 막소포의 막과의 융합과정 등에 관여할 가능성이 고려되고 있다. 또한, sel-12는 선충의 발생과정을 제어하고 있는 lin-12의 돌연변이에 의한 발생이상을 구제하는 유전자로서 발견되었다. lin-12는 세포간 정보전달에 관여하고 있다고 여겨지며, 프리세닐린-1 단백질도 세포간 정보전달의 어느 부분에 관여하고 있을 가능성도 시사되고 있다.
프리세닐린-1 단백질에 관하여, 최초의 보고에는 가족성 알츠하이머병의 원인이 되는 돌연변이는 5군데에서의 아미노산 잔기의 치환임이 기재되어 있다. 이 보고 이후, 본 발명자들이 보고한 OS-2(제 213번째의 아미노산 잔기 이소류신이 트레오닌으로 변이) 및 OS-3(제 96번째의 아미노산 잔기 발린이 페닐알라닌으로 변이)(참조: Kamino K. 외: Neurosci. Lett. 208권, 195 페이지, 1996년)을 비롯하여 많은 가족성 알츠하이머병의 가계로부터 여러 곳에서의 돌연변이체가 발견되어, 현재는 30군데 이상에서 40종류 이상의 아미노산 잔기의 치환이 알려져 있다(참조: Hardy: TINS 20권, 154 페이지, 1997년).
현재 프리세닐린-1 단백질의 돌연변이는 가족성 알츠하이머병의 70~80%를 차지하는 것으로 여겨지고 있다. PS-2에 관해서는 2곳의 돌연변이가 보고되어 있다. 이상 서술하였듯이, PS-1및 PS-2의 돌연변이체가 가족성 알츠하이머병과 깊이 관련되어 있음이 유전학적 해석으로 증명되어 있다.
한편, 최근 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질의 돌연변이체가 어떠한 기작에서 알츠하이머병의 발병원인이 되는가에 관한 연구도 진행되고 있다. 이들 돌연변이체를 갖는 알츠하이머병 환자의 혈청속이나 피부의 섬유아 아세포의 배양액(참조: Scheuner D. 외: Nature Med. 2권, 864 페이지, 1996년), 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질의 돌연변이체로 형질변환한 배양세포주의 배양액중(참조: Xia W. 외: J. Biol. Chem. 272권, 7977 페이지, 1997년; Borchelt DR 외: Neuron 17권, 1005 페이지, 1996년; Citron M. 외: Nature Med. 3권, 67 페이지, 1997년), 및 프리세닐린-1 단백질의 돌연변이체를 갖는 가족성 알츠하이머병 환자의 뇌조직(참조: Lemere C. A. 외: Nature Med. 2권, 1146 페이지, 1996년)에 있어서, Aβ40은 정상형의 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질에 비하여 거의 변화가 없으나, Aβ42는 정상형의 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질에 비하여 크게 증가하는 것으로 보고되어 있다.
즉, 가족성 알츠하이머병을 초래하는 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질의 돌연변이는 노인반점의 형성에 큰 역할을 하는 것으로 여겨지는 Aβ42를 증가시킴으로써, 알츠하이머병을 발병시킬 가능성이 나타난다. 프리세닐린-1 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스도 작제되고 있다(참조: Duff K. 외: Nature 383권, 710 페이지, 1996년; Borchelt DR. 외: Neuron 17권, 1005 페이지, 1996년; Citron M. 외: Nature Med. 3권, 67 페이지, 1997년). 이들 트랜스제닉 마우스에 있어서 마우스 뇌속의 Aβ42가 특이적으로 증가하고 있음이 보고되어 있다. 이 결과는, 가족성 알츠하이머병을 초래하는 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질의 돌연변이체는 노인반점의 형성에 큰 역할을 하는 것으로 여겨지는 Aβ42를 증가시킴으로써 알츠하이머병을 발병시킬 가능성을 강하게 지지하는 것이다. 그러나, 이들 트랜스제닉 마우스의 보고에는 트랜스제닉 마우스의 뇌의 조직학적 검토에 관해서는 기재되어 있지 않다. 이는 트랜스제닉 마우스에서 현저한 뇌의 조직학적 변화가 관찰되지 않음을 시사한다.
일반적으로, 트랜스제닉 동물은 대상으로 하는 유전자의 생체내에서의 기능을 해석하는 수단으로서는 유용하다. 그러나, 도입한 유전자의 발견을 양적·발현조직적·발생상의 발현시기적으로 제어하는 것은 기법적으로 곤란하다. 또한, 동물자체가 갖고 있는 유전자가 정상적으로 발현하고 있으므로 트랜스제닉 동물의 체내에서는 양쪽 유전자산물이 혼재한 상태에 있어, 도입한 유전자의 기능분석을 충분히 할 수 없다는 문제도 있다. 게다가, 도입한 유전자가 특별히 과잉발현되는 경우, 본래 생체내에서 하고 있지 않는 기능이 트랜스제닉 동물에서 나타나 버리는 경우가 있어, 그 결과, 작제한 유전자 변이동물의 해석에 혼란을 초래할 우려가 있는 등의 난점도 있다.
트랜스제닉 동물과는 별도로, 대상으로 하는 유전자의 기능을 분석하는 수단으로서 넉아웃 동물을 이용할 수 있다. 넉아웃 동물은 동물자체가 갖고 있는 대상의 유전자를 인공적으로 파괴하여 기능을 할 수 없는 상태로 한 것이다. 넉아웃 동물을 상세히 분석함으로써, 대상으로 하는 유전자의 생체내에서의 기능을 명확히 할 수 있다. 그러나, 파괴한 유전자의 산물의 기능을 넉아웃 동물체내의 다른 유전자산물이 대체하기 때문에, 호모화하여도 넉아웃 동물자체에 특별한 변화는 나타나지 않을 수 있다. 또한, 파괴한 유전자의 산물이 동물의 발생상·성육상 필수적이므로 호모에서는 치사가 되어 버려, 성장가능한 헤테로에서는 유전자의 기능의 상세한 분석이 사실상 불가능한 경우가 있다는 문제점도 갖고 있다.
[발명의 개시]
본 발명의 과제는 알츠하이머병의 병태 모델동물의 작제에 있어, 전기와 같은 결점을 갖는 트랜스제닉 동물이 아닌, 인간에 있어서의 알츠하이머병 환자의 병태에 더욱 근접한 모델동물을 제공하는 것이다. 좀 더 구체적으로, 알츠하이머병의 원인 유전자로 여겨지는 프리세닐린 유전자에 변이를 가한 유전자(변이 프리세닐린 유전자)를 상동 재조합법으로 도입함으로써, 변이 프리세닐린 단백질을 뇌속에서 발현가능한 유전자 변이동물을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 또한, 본 발명의 또 다른 과제는 상기 유전자 변이동물의 작제방법, 이 작제방법에 유용한 플라스미드, 및 이 유전자 변이동물을 이용하여 알츠하이며병의 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 프리세닐린-1 단백질의 역할을 해명하기 위하여, 및 프리세닐린-1 유전자의 돌연변이가 어떠한 기작에서 알츠하이머병을 유발하는지 해석하기 위하여, 마우스 자체가 갖고 있는 프리세닐린-1 유전자를 상기 OS-2형의 변이를 갖는 프리세닐린-1 유전자로 교체한 넉아웃 마우스를 작제하였다. 그 결과, 이 유전자 변이동물에서는 트랜스제닉 마우스 및 넉아웃 마우스가 갖는 결점을 회피할 수 있으며, 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 가족성 알츠하이머병의 병인·병태해명에 유용함을 발견하였다. 본 발명자들을 연구를 더욱 지속하여, 하기 서술하는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 유전자 도입동물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 인간·알츠하이머병을 야기하는 프리세닐린(preseniline) 유전자의 변이를 도입한 프리세닐린 유전자 도입동물에 관한 것이다.
도 1은, 마우스·제노믹 DNA 라이브러리로부터 클로닝하여 얻은 마우스 프리세닐린-1의 엑손 8을 함유하는 염색체 DNA 절편 Pα의 제한효소 지도이다.
도 2는, 부위특이적 변이도입법에 의하여 OS-2형 변이가 도입된 부위를 포함하는 마우스 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8의 일부를 갖는 플라스미드 pmX-1의 작제방법을 공정으로 나타낸 그림이다.
도 3은, 타겟팅 벡터의 작제공정을 나타낸 그림이다.
도 4은, 타겟팅 벡터의 작제공정을 나타낸 그림이다.
도 5은, 타겟팅 벡터의 작제공정을 나타낸 그림이다.
도 6은, 타겟팅 벡터의 작제공정을 나타낸 그림이다.
도 7은, 타겟팅 벡터의 작제공정과 타겟팅 벡터 pOS-2neoloxP의 구조를 나타낸 그림이다.
도 8은, OS-2형 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 #2 마우스(수컷)와 CAG-cre #13 마우스의 F4(암컷)를 교배하여 얻은 새끼의 꼬리 일부를 절단한 시료에서 얻은 염색체 DNA를, 실시예 10에 기재한 방법으로 PCR을 수행한 산물의 1% 아가로스 전기영동의 결과를 나타낸 그림이다. 오른쪽에서 2번째와 4번째의 마우스는 염색체 DNA상에 neo발현 유닛을 갖고 있지 않음이 나타나 있다. 각 그림에서, 왼쪽 끝단의 레인은 분자량 마커이다. [A]는 염색체 DNA상의 neo가 결손되어 있음을 나타내는 밴드이며, [B]는 염색체가 야생형임을 나타내는 밴드이고, [C]는 염색체 DNA상에 neo가 존재하고 있음을 나타내는 밴드이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명의 유전자 변이동물의 작제에 이용되는 변이 프리세닐린 유전자(본 명세서에 있어서 [변이 프리세닐린 유전자]라고 하는 경우에는, 변이 프리세닐린-1 유전자 및 변이 프리세닐린-2 유전자 중 어느 한 쪽 또는 양자를 의미한다)는 변이 프리세닐린 단백질(본 명세서에 있어서, [변이 프리세닐린 단백질]이라고 하는 경우에는, 변이 프리세닐린-1 단백질 및 변이 프리세닐린-2 단백질중 어느 한 쪽 또는 양자를 의미한다)을 코딩하는 유전자이다. 이 변이 프리세닐린 유전자는 아밀로이드 β단백질의 생산량을 증가시키는 성질을 갖고 있다. 본 발명의 유전자 변이동물은 상기 변이 프리세닐린 유전자가, 예를 들면 상동 재조합법에 의하여 도입된 포유동물이다. 변이 프리세닐린 단백질에 존재하는 변이는 바람직하게는 아미노산 잔기의 치환에 의하여 생긴 것으로, 그 변이의 개수는 제한되지 않으나 바람직하게는 1개이다.
포유동물 유래의 프리세닐린-1 단백질의 전장은, 예를 들면 [E. Levy-Lahad et al., Science, 269, pp.973-977, 1995]에 기재되어 있다. 인간 및 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질의 전장 및 이 단백질을 코딩하는 DNA의 일례를 각각 서열표의 서열번호 1~4에 나타내었다. 예를 들면, 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질에 있어서는 변이부위는 제 79번, 제 82번, 제 96번, 제 115번, 제 120번, 제 135번, 제 139번, 제 143번, 제 146번, 제 163번, 제 209번, 제 213번, 제 231번, 제 235번, 제 246번, 제 250번, 제 260번, 제 263번, 제 264번, 제 267번, 제 269번, 제 280번, 제 285번, 제 286번, 제 290번, 제 318번, 제 384번, 제 392번, 제 410번, 제 426번 및 제 436번에서 선택되어지는 1 또는 2곳 이상인 것이 바람직하다.
더욱 바람직한 변이는 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열예, 더욱 바람직하게는 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열예에 있어서, A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P 및 P436S로 이루어지는 군에서 선택되어지는 1 또는 2 이상의 변이이다. 이들 변이중, 제 213번의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 변이(본 명세서에 있어서, [OS-2형 변이]라 칭하는 경우가 있음)는 특히 바람직한 변이이며, 예를 들면 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이, 또는 제 213번의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이가 특히 적합하다.
포유동물 유래의 프리세닐린-2 단백질의 전장은, 예를 들면 [Science, 269, pp.973-977, 1995]에 기재되어 있다. 변이부위로는, 제 141번 및/또는 436번이 바람직하며, 마우스 유래의 서열에 있어서는 N141I 및/또는 M239V가 더욱 바람직하다. 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린 단백질-2 중 어느 한 쪽, 또는 양자에 변이가 존재해도 된다.
본 발명의 유전자 변이동물은 그 염색체 DNA상에 상기 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자를 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 유전자 변이동물은 포유동물이면 되고, 그 종류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 설치류 동물을 적합하게 이용할 수 있다. 특히 바람직한 것은 마우스이다. 본 발명의 유전자 변이동물은 변이 프리세닐린 유전자를 포함하는 약 10kbp 정도의 서열을 갖는 DNA를 이용하여 플라스미드를 작제하고, 그 플라스미드를 배성간세포에 도입하여 세포내에서 상동조합을 일으키게 함으로써 작제 가능하다.
본 발명의 유전자 변이동물은 상기 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자가 상동 재조합에 의하여 도입된 결과, 아미노산 변이가 대부분의 경우 1군데서 일어난다는 특징이 있다. 소위 트랜스제닉 동물의 경우에는, 변이부분의 DNA 서열이 무작위로 염색체 DNA상에 삽입되어, 많은 경우, 반복서열의 수십 카피가 복수개소에 삽입되어 있다. 본 발명의 유전자 변이동물에서는 이와 같은 문제가 회피되어 있어, 알츠하이머병의 병태를 유전자 레벨에서 정확히 해석 할 수 있다. 단, 본 발명의 유전자 변이동물에 있어서 마커 등을 포함하는 DNA를 도입한 경우에는, 그 마커부분 및 마커를 삽입하기 위한 서열 등을 포함하는 경우도 있다. 예를 들면, Sau3AI로 절단가능한 부위를 삽입하기 위하여 1 염기를 치환할 수 있으며, PCR산물을 Sau3AI로 절단하여 전기영동 등으로 확인할 수 있다.
본 발명의 유전자 변이동물은 그 유전자 변이의 결과, 정상동물에 비하여 β아밀로이드 단백질을 더욱 다량으로 생산한다는 특징을 갖고 있다. 본 발명의 유전자 변이동물에 의하여 달성되는 아밀로이드 β단백질의 증가량은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 기억장애, 병리소견, 각종 신경장애의 정도를 평가한 경우에 정상동물과의 사이에서 실질적인 차이가 인정되는 정도인 것이 바람직하다.
본 발명에 의하여 제공되는 DNA, 플라스미드, 배양세포 및 포유동물 세포의 배도 동일하게 상기 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자를 가지는 것에 의하여 특징지워진다. 예를 들면, 변이 프리세닐린-1 단백질, 바람직하게는 OS-2형 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 cDNA 또는 염색체 DNA의 전장 또는 변이부분을 포함하는 DNA 서열; 상기 cDNA 또는 염색체 DNA의 전장 또는 변이부분을 포함하는 DNA 서열에 Sau3AI 부위를 도입한 DNA를 함유하는 플라스미드; OS-2형 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA는 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 이들 유전자 또는 DNA에 있어서 1 또는 2개 이상, 바람직하게는 1개 내지 20개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 수개의 염기가 치환된 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 DNA 또는 플라스미드의 예로는, 예를 들면,
1) 프리세닐린-1의 제 213번의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자로 이루어지는 DNA, 및 이 DNA를 함유하는 플라스미드;
2) 변이 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 부근의 아미노산을 코딩하는 DNA 염기서열이, 다음 서열:
5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3'
(단, N은 T 이외의 염기를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미한다.)인 변이 프리세닐린-1 유전자로 이루어지는 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드;
3) OS-2형 변이 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 부근의 아미노산을 코딩하는 DNA 염기서열이, 다음 서열:
5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
(단, M은 T 또는 C를 의미하며, XYZ는 이소류신 이외를 코딩하는 3 염기의 코돈을 의미한다.)인 변이 프리세닐린-1 유전자로 이루어지는 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드;
4) Sau3AI 제한효소부위가 도입된 전기 1)~4) 중 어느 항에 기재된 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드;
5) 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1의 유전자의 cDNA 또는 염색체 DNA의 전장 또는 변이부분을 포함한 서열에 Sau3AI 제한효소가 도입된 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드;
6) OS-2형 변이 마우스 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 마우스 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8과, loxP가 양옆에 위치한(flanking) 네오마이신(neomycin) 발현유닛을 포함하는 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드; 및,
7) 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열의 제 213의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8과, loxP로 끼워진 네오마이신 발현유닛을 포함하는 DNA, 또는 이 DNA를 함유하는 플라스미드
등을 들 수 있는데, 본 발명의 범위는 이들 구체예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하여 제공되는 배 또는 세포로는, 상기 플라스미드, 예를 들면 PRL-104 또는 PRL-105의 염기서열을 갖는 플라스미드를 삽입한 배 또는 세포를 들 수 있다. 또한, 전기 플라스미드를 이용한 상동 재조합에 의하여, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열예의 제 213번에 변이를 포함하는 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 세포는 본 발명의 바람직한 세포이다. 배 또는 세포는 포유동물 유래이면 그 종류는 특별히 한정되지 않으나, 설치류동물 유래, 바람직하게는 마우스 유래의 배 또는 세포를 이용할 수 있다.
[유전자 변이동물의 작제]
인간 변이 프리세닐린을 코딩하는 DNA를 입수한 후, 본 발명의 프리세닐린 유전자 변이동물을 하기 서술하는 공정에 따라 작제할 수 있다. 이하에서는, 포유동물로서 마우스를 이용하고, 인간 변이 프리세닐린 유전자로서 인간·변이 프리세닐린-1 유전자를 이용하는 예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 유전자 변이동물은 이들을 이용하여 작제되는 것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이 방법은 본 발명의 유전자 변이동물의 작제방법의 한 예에 불과하며, 이하의 방법에 본 발명의 유전자 변이동물의 작제방법이 한정되는 것은 아니다. 여기에 기재된 일반적인 방법 및 실시예에 기재된 구체적인 방법을 참조함으로써, 또한, 필요에 따라 이들 방법에 적합한 수식 내지 개변을 추가함으로써, 당업자는 본 발명의 유전자 변이동물을 용이하게 작제할 수 있다.
먼저, PCR법에서 이용하는 탐침을 작제하기 위하여, 마우스·제노믹 DNA 라이브러리로부터 작제하고자 하는 변이동물의 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8 중 변이시키는 부위를 포함하는 DNA 절편을 취득한다. 마우스·제노믹 DNA 라이브러리로는, 실시예에서 서술하는 129계통의 마우스제노믹 DNA 외에 어떤 계통의 마우스의 제노믹 DNA 라이브러리를 이용해도 된다. 변이를 도입하고자 하는 동물로서 마우스를 이용하는 경우에는, 마우스·프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 이용하는데, 다른 종류의 동물에 있어서는 적당한 부분을 선택할 필요가 있다.
다음으로, 상기 공정에서 작제한 DNA 절편을 무작위 프라이밍으로 라벨화(32P)한 후, 라벨화한 탐침을 이용하여 제노믹 라이브러리를 스크리닝하고, 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA 절편을 클로닝한다. 또한, 클로닝한 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8중 변이시키는 부분을 서브클로닝한 후, 변이를 도입한다.
변이를 도입한 마우스·프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 함유하는 염색체 DNA를 포함하는 타겟팅 벡터를 작제한다. 타겟팅 벡터에는 선택 마커로서 neo발현 유닛을 도입해 두고, G418(항생물질)을 배지에 첨가함으로써, 벡터가 염색체에 도입되지 않은 세포를 사멸시키도록 해둔다. 이 타겟팅 벡터를 일렉트로포레이션법이나 유전자를 세포내에 도입하는 다른 방법에 의하여 ES세포에 도입한 후, G418 존재하에서 ES세포를 배양하여, 출현하는 콜로니를 채취한다. 얻어진 콜로니를 둘로 나누어, 하나는 배양·계대 또는 동결에 의하여 보존하여 두고, 다른 하나를 사용하여 상동 재조합에 의하여 목적으로 하는 마우스·프리세닐린-1 유전자의 엑손 8의 변이가 도입된 ES세포를 조사한다. 목적으로 하는 변이가 도입된 ES세포의 콜로니가 보존되어 있는만큼을 취하여 이하의 공정에 이용한다.
별도로, 임신 마우스로부터 8 세포기배를 취하고, 상기 보존되어 있던 약 20개 정도의 ES세포를 묻힌 후, 가임신시킨 암컷 마우스의 자궁에 도입한다. 태어난 새끼 중에서 털색이 키메라인 마우스를 선택한다. 키메라 마우스를 C57BL/6 계통과 교배시켜, 태어난 새끼 중에서 털색이 아구티인 것을 선택함으로써, 목적으로 하는 변이가 들어간 마우스를 취득할 수 있다. 또한, 이 마우스는 변이가 들어간 프리세닐린-1 유전자에 관해서는 헤테로이며, 또 하나의 염색체에 있는 프리세닐린-1 유전자는 변이가 없는 야생형이다.
마우스·프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 함유하는 염색체 DNA를 마우스·제노믹 DNA 라이브러리로부터 클로닝하기 위한 탐침을 작제하기 위한 출발재료로서는, 실시예에 구체적으로 서술하는 방법 외에, 염기서열이 명확하게 되어 있는 마우스나 인간 등의 기타 포유동물 유래의 프리세닐린-1 유전자의 cDNA를 이용해도 된다. 탐침이 되는 DNA 절편을 얻는 방법으로는, 실시예에 서술하는 PCR법에 의한 증폭법 외에, 염색체 DNA의 마우스·프리세닐린-1 유전자의 엑손 8에 대응하는 부분을 포함하는 마우스 염색체 DNA, 또는 염기서열이 명확하게 되어 있는 마우스나 인간 등의 기타 포유동물 유래의 프리세닐린-1 유전자의 cDNA를 함유하는 플라스미드를 대량 조제하는 방법을 채용할 수 있다. 또한, 이 플라스미드를 제한효소로 절단한 후, 아가로스젤 전기영동 등의 수단을 이용하여 DNA 절편으로서 필요한 부분을 분취함으로써 목적의 DNA 절편을 얻을 수도 있다.
DNA 절편을 라벨화하는 방법으로는, 실시예에 서술하는 랜덤 프라이밍법 외에,32P-dNTP 존재하에 PCR을 수행하는 방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 사전에 라벨링한 올리고디옥시뉴클레오티드를 프라이머로서 사용함으로써 PCR법 또는 랜덤 프라이밍법으로 라벨화해도 된다. 라벨화에는 실시예에 나타내는 방사성 동위원소 외에, 바이오틴-아비딘(Biotin-Avidin) 계 또는 알칼라인포스파타제(alkalinephosphatase) 등을 이용하는 화학발광법도 이용할 수 있다. 또한, T3 또는 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 라벨링한 RNA 절편을 탐침으로 사용할 수 있다. 기타, 탐침을 작제하는 방법은 여러 가지 알려져 있으나, 어떠한 방법을 채용하여 목적하는 탐침을 취득해도 상관없다.
목적으로 하는 변이를 DNA에 도입하는 방법으로는, 실시예에 구체적으로 나타낸 방법 외에, M13 등의 파아지(phage) 유래의 플라스미드 또는 ung-대장균을 이용하여 복제한 플라스미드를 이용하여, 목적의 변이를 도입하고자 하는 부분에 변이를 도입하기 위하여 합성한 올리고디옥시뉴클레오티드를 상보적으로(변이도입부위의 염기만은 상보적이지 않다) 결합시켜, 이것을 프라이머로서 DNA 폴리머라제로 헤테로 이중쇄 DNA 플라스미드를 작제하고, 이 플라스미드로 대장균(ung+)을 형질전환함으로써 목적의 변이를 가진 플라스미드를 취득할 수 있다. 또한, 목적으로 하는 변이를 도입하기 위하여 염기를 변경하여, 상호 상보적으로 아닐링할 수 있어, 양단에 제한효소부위가 생기도록 설계된 두줄의 올리고디옥시뉴클레오티드를 합성하여, 변이를 도입해야 하는 플라스미드에 DNA 리가제를 이용하여 결합시키는 방법(카셋트법)을 채용하여, 목적의 변이를 가진 플라스미드를 취득할 수도 있다. 이들 방법을 목적에 따라 적절히 수식 내지 개량함으로써, 한층 효율적으로 목적을 달성할 수 있는 경우가 있다. 이 밖에, 변이를 도입하는 방법은 당업계에서 이용가능한 여러 종류의 변이도입법이 알려져 있으며, 어느 방법에 의해서도 목적을 달성할 수 있다.
타겟팅 벡터는 변이를 도입한 마우스 염색체 DNA 절편, 선택 마커를 코딩하는 DNA 절편, 이 전사를 제어하기 위한 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 선택 마커 발현 유닛을 필수요소로 포함하고 있는 것이 바람직하다. 변이를 도입한 마우스 염색체 DNA 절편은 ES 세포내에서 상동 재조합을 일으키기 위하여 필요한 부분이고, 변이를 도입한 곳의 양 옆에 있는(flanking) 마우스 염색체 DNA 절편이 필요하다. 즉, 타겟팅 벡터는 변이시킨 염기만이 본래의 마우스 염색체 DNA와는 상이한 DNA 절편을 갖고 있다. 그 절편의 길이는 10kbp 정도가 바람직하나, 일반적으로는 다소의 길이의 증폭은 허용된다. 단, 너무 짧은 경우에는 ES 세포내에서의 상동 재조합의 빈도가 저하되는 경우가 있다.
선택 마커로는, 네오마이신 내성유전자, 하이그로마이신 내성유전자 등의 양성 선택마커, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나제 유전자, 디프테리아 독소A 절편 등의 음성 선택마커 등이 알려져 있으며, 배양세포주의 선택마커로 사용되고 있는 선택마커는 ES 세포에 있어서 어떤 것을 사용해도 상관없다. 음성 선택마커를 사용하는 경우에는 타겟팅 벡터의 마우스 염색체 DNA 절편의 밖에 삽입할 필요가 있으며, 양성 선택마커를 사용하는 경우에는 그 발현 유닛을 타겟팅 벡터의 마우스 염색체 DNA 절편중의 인트론 속에 삽입할 필요가 있다. 양성 선택마커를 엑손 속에 삽입하면 삽입된 유전자는 통상 기능을 상실하여, 최종목적인 변이의 영향을 조사하기 위하여 작제하는 마우스를 얻지 못하는 경우가 있다.
ES 세포주로는 129 계통의 마우스 유래의 주가 많이 사용되고 있으나, 이 계통의 ES 세포로는, 실시예에서 서술하는 R1 이외에 D3, CCE, J1, AB1 등의 ES 세포를 이용해도 된다. 또한, 예를 들면 C57BL/6 계통의 마우스 등, 129 계통 이외의 마우스 유래의 ES 세포도 사용할 수 있다. ES 세포에 타겟팅 벡터를 도입하는 방법으로는, 실시예에서 서술하는 일렉트로포레이션법이 일반적이나 인산칼슘공침법이나 리포좀법 등, 배양세포주로의 플라스미드 도입에 이용가능한 방법이면 어떤 방법을 채용해도 된다. 타겟팅 벡터 도입후의 ES 세포를 선택마커 존재하에서 배양하면, 생존하여 콜로니를 형성하는 ES 세포는 상동 재조합을 일으키고 있을 가능성이 있다. 이들 콜로니를 형성한 ES 세포중에서 상동 재조합을 일으키고 있는 세포를 조사하는 방법으로서는 일반적으로는 PCR법이 이용되는데, 탐침으로서 사용가능한 DNA 절편, RNA 절편, 합성올리고뉴클레오티드, 또는 항체 등을 사용할 수도 있다.
ES 세포를 발생초기의 수정란에 혼입시킨 후, 발생을 지속시켜 정자 또는 난자가 ES 세포 유래의 마우스를 얻을 수 있다. 상동 재조합을 일으킨 ES 세포를 발생초기의 수정란에 혼입시키는 방법으로는, 실시예에 서술하는 방법 외에 포배기의 수정란을 임신 마우스에서 취하여 이것에 주입용 피펫으로 10~20개의 ES 세포를 주입한 후, 가임신시킨 암컷 마우스의 자궁에 이식함으로써 발생을 지속시켜 새끼를 얻는 방법 등을 사용할 수 있다.
ES 세포를 혼입시킬 때 사용하는 발생초기의 수정란은 어떤 계통의 마우스에서 채취한 것이라도 상관없으나, 혼입시킨 ES 세포가 태어난 새끼에 포함되어 있는지 알기 쉽도록, ES 세포의 근원이 되어 있는 계통의 마우스와는 털색이 다른 계통의 마우스의 수정란을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 실시예에서 사용한 ES 세포는 아구티색(agouti색, 담갈색)의 129계통이고, 수정란이 유래하는 마우스(C57BL/6 계통)는 검정색 계통이다. 이들을 이용하여 태어난 새끼중에서 키메라 털색을 띄고 있는 새끼를 선택함으로써, ES 세포 유래의 세포를 갖고 있는 새끼를 용이하게 선택할 수 있다. 이 경우, 아구티색의 비율이 많은 새끼일수록 생식세포가 ES 세포유래로 되어 있을 가능성이 높다. 또한, 가임신시키는 마우스는 어떤 계통의 마우스라도 상관없다.
얻어진 키메라 마우스를 교배시켜 목적으로 하는 변이도입 마우스를 취득하기 위하여 사용하는 마우스도 ES 세포의 근원이 되어 있는 계통의 마우스와는 털색이 다른 마우스를 사용하는 것이 바람직하다. 통상, 키메라 마우스 수컷과 타계통의 암컷을 교배시켜, 아구티색의 새끼를 얻으면 그것이 목적으로 하는 변이를 헤테로 상태로 갖고 있는 마우스이다. OS-2형 변이의 프리세닐린-1 유전자를 갖는 마우스는 loxP 배열이 양옆에 위치한(flanking) neo 발현유닛을 갖고 있으므로, cre 유전자도입 트랜스제닉 마우스와의 교배에 의하여 neo 발현유닛이 제거된 마우스를 얻을 수 있다.
본 명세서의 종래의 기술에서 서술하였듯이, 프리세닐린-1 단백질 및 프리세닐린-2 단백질의 돌연변이는 Aβ42의 증가에 의하여 노인반점의 형성을 촉진하여 알츠하이머병을 발병시키는 것으로 여겨진다. 한편, 가족성 알츠하이머병의 원인인 APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스에 있어서, 뇌속에 아밀로이드 침착을 일으키는 마우스가 보고되어 있다(참조: Games D. 외: Nature 373권, 523 페이지, 1995년; Hsiao K. 외: Science 274권, 99 페이지, 1996년; Sturchler-Pierrat C. 외: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94권, 24호, 13287 페이지, 1997년). 이들 트랜스제닉 마우스에서는, 뇌속에서의 Aβ의 생산량이 증가하고 있으므로 아밀로이드 침착이 일어나고 있는 것으로 여겨진다.
APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자가 도입되어, 뇌속에 아밀로이드 침착을 일으키는 트랜스제닉 동물(도입유전자에 관하여 호모이든 헤테로이든 상관없다)과 본 발명의 PS1 유전자 변이동물(변이유전자에 관하여 호모이든 헤테로이든 상관없다)을 교배함으로써, 하이브리드 동물을 작제할 수 있다. 동물로는 마우스가 바람직하다. 교배에 있어서 어느쪽 동물이 수컷이어도 된다.
얻어지는 새끼의 꼬리 일부를 채취하여, 염색체 DNA를 추출한다. 추출한 염색체 DNA를 기질로 하여, APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자의 돌연변이부위를 사이에 두도록 설계한 염기서열을 갖는 두줄의 올리고뉴클레오티드 및 변이 PS1 유전자의 변이부위를 사이에 두도록 설계한 염기서열을 갖는 두줄의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 행한다.
PCR 산물의 아가로스젤 전기영동을 행하고, 밴드의 유무, 밴드의 젤상에서의 역동도, 변이부위를 포함하는 염기서열을 갖는 올리고디옥시뉴클레오티드를 이용한 혼성화(hybridization)에 의한 변이를 포함하는 밴드의 확인 등에 의하여, 추출한 염색체 DNA에, APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자 및 본 발명의 변이 PS1 유전자가 포함되어 있는지를 조사할 수 있다. PCR은 실시예 8에 기재한 방법에 따라 행할 수 있다. PCR의 프라이머에 사용하는 올리고뉴클레오티드의 염기서열은 APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자 또는 변이 PS1 유전자를 검출할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 상관없다. PCR의 결과에 근거하여 APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 갖고, 또한, 본 발명의 변이 PS1 유전자를 갖는 동물을 선발함으로써, 양유전자를 각각 헤테로로 갖는 동물을 얻을 수 있다.
APP의 돌연변이체를 코당하는 유전자 및 본 발명의 변이 프리세닐린-1 유전자의 양유전자를 호모로 갖는 동물을 얻기 위해서는, 이 양유전자를 각각 헤테로로 갖는 동물중, 적당한 수컷 및 암컷을 선택하여 교배함으로써 얻어지는 새끼중에서 양유전자를 호모로 갖는 개체를 선택하면 된다. APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 호모로 가짐을 확인하기 위해서는, 새끼의 꼬리 일부를 채취하여 염색체 DNA를 추출하고, 추출한 염색체 DNA를 제한효소로 절단한 후, 아가로스젤 또는 아크릴아미드젤을 이용하여 전기영동을 행한다. 그 후, 멤브레인 필터에 DNA를 블롯팅한 후, APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합가능한 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 탐침으로 하여 서던블롯팅을 행하여, 얻어지는 밴드의 농도를 측정하면 된다.
이 방법에 준하여 본 발명의 변이 프리세닐린-1 유전자를 호모로 가짐을 확인할 수 있다. 서던블롯팅에 탐침으로 사용하는 올리고디옥시뉴클레오티드는 방사성 동위원소, 형광색소 등 서던블롯팅에 통상적으로 사용되는 수단에 의하여 표식하여 이용할 수 있다. 이렇게 하여 APP의 돌연변이체를 코딩하는 유전자 및 본 발명의 변이 프리세닐린-1 유전자의 양유전자를 갖는 마우스를 작제할 수 있다. 이러한 방법으로 작제한 하이브리드 마우스는 뇌속의 아밀로이드 β단백질의 생산이 더 많고, 또한, 아밀로이드의 침착이 촉진된다는 특징이 있다.
본 발명의 유전자 변이동물, 변이 프리세닐린 유전자를 도입한 세포, 변이 프리세닐린 유전자를 포함하는 플라스미드 등을 이용하여, 알츠하이머병의 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 스크리닝하여, 그 유용성을 평가할 수 있다. 건강한 포유동물에서는 아밀로이드 β의 축적은 극히 서서히 발생하나, 본 발명의 유전자 변이동물은 아밀로이드 β의 생산이 많다는 특징을 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 유전자 변이동물에 여러 종류의 피검물질을 투여하여 비투여군의 동물 또는 대조물질 투여동물과 비교함으로써, 알츠하이머병의 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 평가할 수 있다. 평가의 대표예로서 피검물질의 스크리닝을 들 수 있으며, 시험항목으로서는 증상, 병리소견, 약리시험 등을 채용할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포를 이용하는 경우에는, 본 발명의 동물에서 분리하여 초대배양세포로서 이용 가능한 이외에, 그 초대배양세포를 바이러스 등으로 불사화한 후, 계대배양하여 수일마다 해당 배양세포의 일부를 채출하여 다시 새로운 조직배양액에서 배양함으로써, 해당 세포를 안정시켜 계대배양세포로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포에는 유전자 변이동물에서 분리한 신경세포 등의 초대세포 이외에, 초대세포를 계대배양하여 소위 라인화된 계대배양세포도 포함된다. 본 발명의 세포로서 신경세포를 이용하는 경우에는 세포가 변이 프리세닐린-1 단백질을 발현하는 결과로서 아밀로이드 β단백질이 다량 발현된다. 이러한 신경세포의 인히드로의 배양계에 피검물질을 첨가한 후, 예를 들면 세포의 생존기간이나 일정기간 경과후의 생세포수 등을 비교함으로써, 아밀로이드 β단백질의 축적이 관여하는 신경세포사를 예방 또는 지연시키는 물질을 스크리닝하여, 그 유용성을 평가할 수 있다.
즉, 본 발명은 변이 프리세닐린 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물을 제공하는 것이며, 더욱 바람직하게는, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중의 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 유전자 변이동물을 제공하는 것이다.
또한, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열, 바람직하게는 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 다음 번호:
제 79번, 제 82번, 제 96번, 제 115번, 제 120번, 제 135번, 139번, 제 143번, 제 146번, 제 163번, 제 209번, 제 213번, 제 231번, 제 235번, 제 246번, 제 250번, 제 260번, 제 263번, 제 264번, 제 267번, 제 269번, 제 280번, 제 285번, 제 286번, 제 290번, 제 318번, 제 384번, 제 392번, 제 410번, 제 426번, 및 제 436번으로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 1 또는 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열예를 갖는 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 프리세닐린-1 변이 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물;
및, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열, 바람직하게는 마우스 유래의 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열에 있어서,
A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P, 및 P436S,
(각 알파벳은 일문자표기법에 의한 아미노산을 의미하며, 숫자는 프리세닐린-1 단백질의 N 말단으로부터의 아미노산 번호를 나타내고, 숫자 왼쪽에 표시된 야생형의 아미노산이 오른쪽의 아미노산으로 치환됨을 나타낸다. 이하, 본 명세서에 있어서, 변이 프리세닐린-1 단백질 및 변이 프리세닐린-2 단백질에 관하여 동일하게 표시한다.)
으로 구성되는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 변이를 갖는 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물이 제공된다.
또한, 프리세닐린-1 단백질의 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 프리세닐린-1 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물; 및, 프리세닐린-1 단백질의 제 213번의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하는 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물이 제공된다.
이들 발명의 바람직한 태양에 따라,
프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이, 다음 서열:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
(단, N은 T 이외의 염기를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)으로 변이된 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 상기 유전자 변이동물;
프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이, 다음 서열
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
(단, N은 C를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)으로 변이된 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 상기 유전자 변이동물;
프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이, 다음 서열
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
(단, XYZ는 이소류신 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈을 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제 213번 아미노산을 코딩하는 염기이다.)으로 변이된 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는 상기 유전자 변이동물이 제공된다.
다른 관점으로는, 본 발명에 의하여 프리세닐린-2 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 제 141번 및/또는 436번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-2 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물이 제공되고, 그 바람직한 태양으로서, 프리세닐린-2 단백질의 아미노산 서열에 있어서, N141I 및/또는 M239V의 변이를 갖는 변이 프리세닐린-2 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-2 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물이 제공된다.
이들 유전자 변이동물의 바람직한 태양으로서, 아밀로이드 β단백질의 과잉발현이 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자에 기인하는 상기 유전자 변이동물; 변이 프리세닐린 단백질을 발현할 수 있으며, 이 단백질의 발현이 포유류 동물의 뇌의 대뇌피질 주변부에 있어서 진행성 신경질환을 형성시키는데 충분한 양의 아밀로이드 β단백질을 생산하는 상기 유전자 변이동물; 포유류 동물의 설치류, 바람직하게는 마우스인 상기 유전자 변이동물; 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자가 상동 재조합에 의하여 도입된 상기 유전자 변이동물; 변이 프리세닐린-1 유전자에 의하여 발생된 뇌조직에서의 아밀로이드 단백질의 발현량이, 정상동물에 비하여 기억학습 시험에 있어 장애를 받은 행동을 일으키며, 해당동물 뇌의 해마의 대뇌피질 주변부에 있어서 이상 신경병리를 유발하기에 충분한 것임을 특징으로 하는 상기 유전자 변이동물; 및 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 1 또는 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프레세닐린-1 유전자와 마커 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물이 제공된다.
또 다른 관점으로는, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중의 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이, 다음 서열: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'(단, N은 A, G 또는 C를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기는 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)인 변이 프리세닐린-1 유전자를 함유하는 플라스미드; 및
프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자이고, 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이, 다음 서열: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'(단, M은 T 또는 C를 의미하며, XYZ는 이소류신 이외를 코딩하는 3염기의 코돈을 의미하고, 밑줄친 염기는 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)인 유전자를 함유하는 플라스미드가 제공된다. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번의 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 함유하는 염색체 DNA도 제공된다.
또한, 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 cDNA 또는 염색체 DNA의 전장 또는 변이부분을 함유하는 염기서열에 대하여 Sau3AI 부위가 도입된 DNA를 함유하는 플라스미드가 제공되고, 아미노산의 치환이 213번의 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인 상기 플라스미드; 하기 염기서열: 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3'(여기서, M은 T 또는 C를 의미한다.)로 특정지워지는 DNA를 함유하는 플라스미드가 제공된다.
이들에 더하여, 마우스·프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 마우스 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 유전자; 아미노산의 치환이 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인 상기 유전자가 제공된다. 또한, (1) 마우스·프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 마우스 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 유전자, 및 (2) loxP가 양옆에 위치한(flanking) 네오마이신 발현 유닛을 포함하는 플라스미드; 아미노산의 치환이 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인 상기 플라스미드도 제공된다(loxP에 관해서는, 이미 특표(평) 4-501501호 공보의 제 4페이지에 개시되어 있다).
또 다른 관점으로는, 하기 염기서열:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3'(여기서, M은 T 또는 C를 의미한다.)로 특정지워지는 DNA를 함유하는 플라스미드가 도입된 것을 특징으로 하는 배; 상기 각 플라스미드를 이용한 상동 재조합으로 얻어진 배; 및, 포유류 동물의 설치류 유래, 바람직하게는 마우스 유래의 상기 배가 제공된다. 또한, 상기 유전자 변이동물의 세포를 분리하고, 조직배양에 의하여 배양함으로써 얻어지는 초대배양세포 또는 계대배양세포; 및, 변이 프리세닐린-1 단백질을 발현할 수 있으며, 또한, 이 단백질의 발현이 뇌의 대뇌피질 주변부에 있어서 진행성 신경질환을 형성시키기에 충분한 양의 아밀로이드 β단백질을 생산시킬 수 있는 변이 프리세닐린-1 유전자를 상동 재조합법에 의하여 동물의 배에 도입하는 공정을 포함하는, 인간 이외의 유전자 변이동물의 작제방법; 및 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 변이 단백질을 발현할 수 있는 상기 방법이 제공된다.
또한, 피검화합물을 투여한 상기 유전자 변이동물과 무투여 동물을 비교하는 공정을 포함하는 알츠하이머병의 치료법 및/또는 예방에 유용한 물질의 평가방법이 제공된다. 이 평가방법의 대표예로서 스크리닝 방법을 들 수 있다. 이 발명의 바람직한 태양에 의하면, 기억학습시험에 의하여 비교하는 상기 평가방법; 병리시험에 의하여 비교하는 상기 평가방법; 대뇌피질 주변부에서의 신경병리에 근거한 병리시험에 의하여 비교하는 상기 평가방법; 신경병리에 근거한 병리시험에 의한 비교가 해당뇌의 대뇌피질 주변부에서의 비대한 신경교종(glyosis) 감소의 억제, 해당뇌의 대뇌피질 주변부에서의 2-디옥시글루코스 획득감소의 억제, 및 해당뇌의 대뇌피질에서의 2-디옥시글루코스 이용감소의 억제로 구성되는 군에서 선택되어지는 1 또는 2 이상의 항목의 비교인 상기 평가방법; 및 해당동물의 생존기간, 탐색행동, 및 이동행동으로 구성된 군에서 선택되어지는 1 또는 2 이상의 항목에 대하여 비교하는 상기 평가방법이 제공된다.
아울러, 상기 초대배양세포 또는 계대배양세포를 피검화합물의 존재하에 시험관내(in vitro) 세포배양하는 공정을 포함하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방제의 평가방법; OS-2형 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프레세닐린-1 유전자의 부분염기서열을 이용하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 또는 알츠하이머병의 발병 가능성의 진단방법; 상기 각 평가방법에 의하여 선택되어진 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방에 유용한 물질; 및 상기 물질을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방제가 제공된다.
또한, 상기 유전자 변이동물과 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며, 아밀로이드 β단백질의 생산량이 많은 동물을 교배시켜 작제한 하이브리드 동물 및 그 자손으로, 바람직하게는, 교배에 의하여 작제한, 또는 교배에 의하여 태어난 하이브리드 마우스 및 그 자손으로, 변이 프리세닐린 유전자와 아밀로이드 전구체 단백질의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 유전자 변이동물이 제공된다. 이 발명의 바람직한 양태로는, APP의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며 아밀로이드 β의 생산량이 많은 동물이 PS1 변이 마우스인 상기 유전자 변이동물이 제공된다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들 예에 반드시 한정되는 것은 아니다. 실시예 중, 프리세닐린-1 유전자를 PS-1이라 약칭하는 경우가 있다.
실시예 1 : 마우스·프리세닐린-1(PS1) 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA의 클로닝
마우스 PS1 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA 절편 취득용의 탐침 작제를 위하여, 먼저 하기와 같은 두가지 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
PR-8-U : 5'-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3'(25mer)
PR-8-L : 5'-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTGA-3'(23mer)
이 2줄의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 129SVJ 마우스 제노믹 라이브러리(Stratagene사)에서 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 약 130bp의 증폭된 DNA 절편을 취득하였다. 이 절편을32P-dCTP 존재하에, 랜덤 프라이머 라벨법에 의하여 라벨링한 것을 탐침으로 하여, 129SVJ 마우스 제노믹 라이브러리를 스크리닝하였다. 얻어진 양성 파아지 클론의 염기서열을 조사하여, 목적으로 하는 마우스 PS-1 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA를 가진 클론임을 확인하였다. 이 클로닝한 염색체 DNA를 Pα로 하여, 그 제한효소 지도를 작제하였다(참조: 도 1).
실시예 2 : 돌연변이 도입용 플라스미드의 작제
Pα를 갖는 클론화한 파아지로부터 DNA를 추출하고, SalⅠ로 절단한 후, 1.0% 아가로스젤 전기영동을 행하여 Pα를 회수하였다. Pα를 PstⅠ 및 XbaⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하고, 마우스 PS1의 제 213번째의 아미노산인 이소류신을 코딩하고 있는 염기를 포함하는 약 600bp의 DNA 절편을 회수하여 이것을 X-1로 하였다. X-1을 사전에 PstⅠ 및 XbaⅠ로 절단한 플라스미드 pBluescriptⅡ KS+(Stratagene사)와 T4리가제를 이용하여 결합시켜, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pX-1을 취득하였다.
실시예 3: OS-2형 돌연변이의 도입
플라스미드 pX-1에 하기 2줄의 올리고뉴클레오티드 PRL-104 및 PRL-105를 이용하여 OS-2형 돌연변이 및 제한효소 Sau3AⅠ 부위를 새로이 도입하였다. 또한, PRL-104 및 PRL-105 모두 36mer로, 서로 상보성을 이루고 있다.
PRL-104 : 5'-TGTGGTCGGGA TGATC*GCCA C CCACTGGAAAGGCCC-3'
PRL-105 : 5'-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG*ATCATCCCGACCACA-3'
(밑줄친 염기는 OS-2형 변이도입을 위하여 본래의 염기가 변이되어 있다: PRL-104에서는 본래는 T, PRL-105에서는 본래는 A이다. 또한, * 표를 붙인 염기는 Sau3AⅠ 부위 도입을 위하여 본래의 염기가 변이되어 있다: PRL-104에서는 본래는 T, PRL-105에서는 본래는 A이다).
변이의 도입은 QUICK CHANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT(Stratagene사)를 이용하여 동사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 염기서열을 조사하여 변이가 올바르게 도입되어 있음을 확인하고, 이 변이를 가진 X-1을 mX-1로 하고 mX-1을 가지는 플라스미드를 p mX-1로 하였다(참조: 도 2).
실시예 4 : OS-2형 변이를 가진 염색체 DNA의 작제
실시예 1에서 얻은 마우스 PS-1의 엑손 8을 포함하는 Pα를 NcoⅠ로 절단한 후, 4종류의 dNTPs 존재하에, T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화하였다. 이어서, Asp718Ⅰ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 엑손 8을 포함하는 약 5kbp의 DNA 절편을 회수하였다. 이 DNA 절편을 사전에 SmaⅠ 및 Asp718Ⅰ로 절단한 플라스미드 pBluescriptⅡ KS+와 T4 DNA 리가제로 결합시켜, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pSB-0을 취득하였다. pSB-0을 XbaⅠ로 완전히 절단한 후, PstⅠ로 부분절단를 행하였다. 한편, pmX-1을 XbaⅠ 및 PstⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 mX-1을 회수하였다. 상기 PstⅠ 절편에 mX-1을 T4 DNA 리가제로 결합시켜, 대장균을 형질전환하였다. 형질전환한 대장균의 콜로니를 조사하여, 플라스미드 pSB-0의 X-1 부분이 mX-1과 치환되어 있는 플라스미드를 갖는 콜로니를 선택하여, 회수한 플라스미드를 pmSB-0으로 하였다(참조: 도 3).
또한, Pα를 BamHⅠ 및 SalⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하고, 약 7kbp의 엑손 8을 포함하는 DNA 절편을 회수하였다. 사전에 BamHⅠ 및 SalⅠ로 절단한 pBluescriptⅡ KS+와 이 절편에 T4 DNA 리가제로 결합시켜, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pSB-1을 취득하였다. pmSB-0을 NcoⅠ로 절단한 후, 4종류의 dNTPs 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화하고, 다시 XbaⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하였다. 회수한 엑손 8을 포함하는 약 2.2kbp의 DNA 절편 XN과 pSB-1을 XbaⅠ 및 PstⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하였다. 회수한 엑손 8을 포함하지 않는 약 2.3kbp의 DNA 절편 PX를 T4 DNA 리가제로 결합시켰다. 이것을 사전에 XbaⅠ로 절단하고 나서 4종류의 dNTPs 존재하에 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화시킨 후 T4 DNA 리가제로 재결합시키고, 다시 SmaⅠ 및 PstⅠ로 절단한 플라스미드 pBluescriptⅡ KS+와 T4 DNA 리가제로 결합시켜 대장균을 형질전환하였다. 형질전환한 대장균의 콜로니를 조사하여, DNA 절편 NX와 XP가 XbaⅠ부위에서 결합한 DNA 절편을 1개만 포함하는 플라스미드 pmSB-0'을 취득하였다(참조: 도 4).
실시예 5: 타겟팅 벡터의 기본골격의 작제
플라스미드 pmSB-0'을 XbaⅠ부위에 EagⅠ부위를 도입하기 위한 다음의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
5'-CTAGACGGCCGT-3'(12 mer)
이 올리고 뉴클레오티드는 CGGCCG 부분의 상보성을 갖는 염기서열을 매개로 하여 아닐링할 수 있으며, XbaⅠ로 절단한 부위에 삽입하면 이하와 같이 된다.
5'-TCTAGACGGCCGTCTAGA-3'
3'-AGATCTGCCGGCAGATCT-5'
XbaⅠ EagⅠ XbaⅠ
플라스미드 pmSB-0'을 XbaⅠ으로 절단한 후, 이 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 T4 DNA 리가제로 결합시켜 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 pmSB-0'의 XbaⅠ부위에 EagⅠ부위가 삽입된 플라스미드 pmSB-0'eag를 취득하였다. 이 pmSB-0'eag를 NcoⅠ 및 SalⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 엑손 8을 포함하는 약 5.3kbp의 DNA 절편 SN을 회수하였다. 또한, pSB-1을 BamHⅠ 및 NcoⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 엑손 8을 포함하지 않는 약 2kbp의 DNA 절편 NB를 회수하였다. SN 및 NB를 T4 DNA 리가제로 결합시켜 BamHⅠ 및 SalⅠ로 처리함으로써, 양 DNA 절편이 NcoⅠ부위에서 결합한 DNA 절편을 얻었다. 이 DNA 절편을 사전에 NotⅠ로 절단한 후, 멍빈뉴클레아제(mung bean nuclease) 처리에 의하여 평활말단화하고, T4 DNA 리가제로 재결합시킴으로써 NotⅠ부위 및 그것에 겹쳐 있는 EagⅠ부위를 파괴하고, 다시 BamⅠ 및 SalⅠ로 절단한 플라스미드 pBluescriptⅡ KS+와 T4 DNA 리가제를 이용하여 결합시켜, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pA를 취득하였다(참조: 도 5).
실시예 6: 타겟팅 벡터의 작제
플라스미드 pPNT(참조: Victor L. J. 외: Cell 65권, 1153 페이지, 1991년)를 XhoⅠ 및 BamHⅠ로 절단한 후, T4 DNA 폴리머라제로 평활말단화하고 1% 아가로스젤 전기영동을 행하였다. 회수한 neo 발현유닛을 포함하는 약 1.7kbp의 DNA 절편을 사전에 BamHⅠ로 절단한 후, T4 DNA 리가제를 이용하여 평활말단화한 플라스미드 pBS246(GIBCO BRL사)에 대하여 T4 DNA 리가제를 이용하여 결합시켜, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pBS246neo를 취득하였다. 이 플라스미드를 NotⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 loxP 서열에 끼인 neo 발현유닛을 갖는 약 2kbp의 DNA 절편을 회수하였다. 이 DNA 절편을 사전에 EagⅠ로 절단한 pA와 T4 DNA 리가제를 이용하여 결합시켜 대장균을 형질전환하였다. 형질전환한 대장균의 콜로니를 조사하여, neo 유전자의 방향이 PS-1 유전자와 같은 방향으로 되어 있는 플라스미드 pB를 취득하였다(참조: 도 6).
플라스미드 pB를 BamHⅠ 및 SalⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여, OS-2형 변이를 가지며 또한, loxP 서열에 끼인 neo 발현유닛을 갖는 DNA 절편 C를 회수하였다. 또한, Pα를 SalⅠ 및 BamHⅠ로 절단하여 얻은 약 6.5kbp의 DNA 절편을 pBluescriptⅡ KS+로 서브클로닝하여 얻은 플라스미드 pSB-2를 Hind Ⅲ 및 BamHⅠ로 절단한 후, 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여 약 4kbp의 DNA 절편 D를 회수하였다. DNA 절편 C 및 D를 T4 DNA 리가제로 결합시킨 후, Hind Ⅲ 및 SalⅠ로 절단하여 DNA 절편 C와 D가 BamHⅠ부위에서 결합한 DNA 절편을 취득하였다. 이 DNA 절편을 사전에 Hind Ⅲ 및 SalⅠ로 절단한 pBluescriptⅡ KS+와 T4 DNA 리가제로 결합시켜 대장균을 형질전환하여, 타겟팅 벡터 pOS-2neolxP를 취득하였다(참조: 도 7).
실시예 7: ES세포로의 타겟팅 벡터의 도입
이하 실시예에서 기재하는 세포의 배양은 모두 37℃의 5% CO2인큐베이터속에서 실시하였다. 15% FBS 및 103units/ml의 LIF(ESGRO사)를 첨가한 DMEM 배지(이하, ES용 배지)에서 유지하고 있는 ES 세포 R1에 대하여, 일렉트로포레이션법에 의하여 타겟팅 벡터의 도입을 행하였다. 일렉트로포레이션을 실시하기 전날에 신선한 ES용 배지와 교환한 R1 세포를 모아, 일렉트로포레이션용 용액(20mM HEPES, pH 7.05, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4, 6mM dextrose)로 세척하였다. 107개의 R1 세포를 NotⅠ로 선상화한 25㎍의 타겟팅 벡터 pOS-2neoloxP와 0.8ml의 일렉트로포레이션용 용액을 이용하여, 일렉트로포레이션용 큐벳속에서 혼합하였다. 1~2분후, Bio-Rad GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여 펄스를 주었다(펄스조건: 240V, 500μF). 원심분리에 의하여 ES 세포를 회수하여 30ml의 ES용 배지에서 현탁하였다. 사전에 8ml의 ES용 배지중에 피더(feeder)세포를 뿌려 놓은 10ml 접시 1장당 이 ES 세포현탁액 2ml를 첨가하고, 12~18시간후에 역가 150㎍/ml의 G418을 첨가하여 1주일간 배양하였다. 또한, 피더세포로는 본 발명자가 HS 1 넉아웃마우스(참조: I. Taniuchi 외; EMBO J. 14권, 3664 페이지, 1995년)의 수컷과 야성형의 ICR 계통의 암컷을 교배하여, 12~13일된 배에서 분리하여 수립한 섬유아세포를 사용하였다.
실시예 8: 상동 재조합을 일으킨 ES 세포의 취득
실시예 7에 있어서, G418의 첨가후 1주간 배양하여 생겨난 ES 세포의 콜로니를 채취하였다. 각 콜로니를 이분하여, 하나는 배양을 계속하였다. 다른 하나는 상동 재조합을 일으키고 있는 클론을 선택하기 위하여 PBS로 세척하여 Proteinase K 처리를 한 후, 염색체 DNA를 회수하여 PCR에 의하여 클론을 선택하였다. PCR에서 이용한 합성 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Prsnl-2: 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3'
(구축한 타겟팅 벡터의 외측에 있는 염기서열)
PKG-1: 5'-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3'
(neo 발현유닛 중의 염기서열)
PCR의 실험조건은 93℃에서 30초, 60℃에서 1분, 68℃에서 3분을 1 사이클로 하여 35 사이클을 행하고, PCR 산물의 1% 아가로스젤 전기영동을 행하여, 예상되는 위치에 밴드를 생성한 클론을 양성으로 판단하였다. 여기서 양성으로 판단된 클론은 올리고뉴클레오티드 PRL-101 및 PRL-102를 이용한 PCR을 수행하고 PCR 산물을 Sau3AⅠ로 절단한 후, 2% 아가로스젤 전기영동을 행하여 밴드가 이분되어지는 것으로부터 변이가 도입되고 있음을 확인하여, 올바르게 상동 재조합을 일으킨 ES 세포를 선택하였다.
PRL-101 및 PRL-102의 염기서열은 다음과 같다.
PRL-101: 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3'
PRL-102: 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3'
실시예 9: 넉아웃마우스의 취득
상동 재조합을 일으키고 있음이 확인된 ES 세포의 배양을 4일간 계속한 후, 세포를 트립신 처리에 의하여 뿔뿔이 분산시켰다. 마우스 BDF1 계통의 수컷을 교배한 동계통의 암컷에서 8세포기배를 채출하여 투명대를 벗긴 후, 분산시킨 상기 ES 세포를 접착시켰다(20 ES 세포/8세포기배 1개). 이것을 가임신 처리한 암컷 마우스의 자궁에 옮겨, 태아의 발생을 지속시킴으로써 키메라 마우스를 취득하였다. 이 키메라 마우스의 수컷을 C57BL/6의 암컷과 교배하여, 태어난 새끼중 아구티색을 띤 것을 골라 그 꼬리 일부를 절단한 시료에서 염색체 DNA를 추출하였다. PRL-101 및 PRL-102를 이용하여 PCR을 수행한 후, Sau3AⅠ로 PCR 산물을 절단하고 2% 아가로스젤 전기영동을 행하여, 절단된 밴드의 존재를 조사함으로써 OS-2형 변이를 갖고 있음을 확인하였다. 확인된 마우스중 수컷을 한 마리 골라 #2로 하였다.
실시예 10
실시예 9에서 얻어진 넉아웃마우스 #2는 타겟팅 벡터 유래의 loxP가 양 옆에 위치한(flanking) neo 발현유닛을 헤테로 상태로 갖고 있다. 이 마우스 #2(웅성, 약 4개월)를 CAG-cre#13(참조: K. Sakai 외; Biochem. Biophys. Res. Commun. 217:318, 1997) 트랜스제닉 마우스의 F4 암컷(2개월: 도입한 cre 유전자는 헤테로 상태로 되어 있다.)과 교배하여, 실시예 8에서 서술한 조건에서 올리고뉴클레오티드 PRL-100, PRL-102 및 PGK-1을 이용하여 PCR을 수행하고, neo 발현유닛이 제외된 마우스를 선택함으로써 neo 발현유닛을 갖지 않는 OS-2형 변이의 넉아웃마우스를 취득하였다(참조: 도 8). 본 마우스는 OS-2형 변이에 관하여 헤테로이며, 또한, 하나의 loxP를 보유하고 있다. 아울러, PCR에 사용한 PRL-100, PRL-102 및 PGK-1의 염기서열은 이하와 같다.
PRL-100: 5'-GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TCT-3'
PRL-102: 5'-TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA TGC-3'
PKG-1: 5'-TAG TGA GAC GTG CTA CTT CCA TTT GTC ACG-3'
본 발명의 유전자 변이동물은 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖고 있으므로, 정상동물(그 변이를 갖지 않는 동물)에 비하여 아밀로이드β의 생산량이 많고, 대뇌 해마신경세포사나 탈락이 조기에 일어나 알츠하이머 증상을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 유전자 변이동물을 이용하여 알츠하이머병의 예방 및/또는 치료에 유용한 물질의 스크리닝 등을 행할 수 있으며, 유용성을 평가할 수 있다.

Claims (50)

  1. 변이 프리세닐린 유전자를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물.
  2. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산이 다른 아
    미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을
    포함하는 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  3. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열에 있어서,
    제 79번, 제 82번, 제 96번, 제 115번, 제 120번, 제 135번, 139번,
    제 143번, 제 146번, 제 163번, 제 209번, 제 213번, 제 231번, 제
    235번, 제 246번, 제 250번, 제 260번, 제 263번, 제 264번, 제 267
    번, 제 269번, 제 280번, 제 285번, 제 286번, 제 290번, 제 318번,
    제 384번, 제 392번, 제 410번, 제 426번, 및 제 436번으로 이루어지
    는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산이 다른 아미노 산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 변이 프리세닐린-1 단백질을 코 딩하는 DNA 서열을 포함하는 프리세닐린-1 변이 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  4. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열에 있어서,
    A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V,
    M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V,
    I213T, A231T, A231V, L235P, A246E, L250S, A260V, C263R, P264L,
    P267S, R269G, R269G, R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C,
    E318G, G384A, L392V, C410Y, A426P, 및 P436S,
    (각 알파벳은 일문자표기법에 의한 아미노산을 의미하며, 숫자는 프리
    세닐린-1 단백질의 N 말단으로부터의 아미노산 번호를 나타내고, 숫자
    왼쪽에 표시된 야생형의 아미노산이 오른쪽의 아미노산으로 치환됨을
    나타낸다.)
    으로 구성되는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 변이를 갖는 변
    이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변이 프리세
    닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  5. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-1의 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로
    치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 변
    이 프리세닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  6. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-1의 제 213번의 이소류신이 트레오닌으로 치환된 변이 프
    리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하는 변이 프리세
    닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을
    코딩하는 DNA 서열이,
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
    (단, N은 T 이외의 염기를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄
    친 염기가 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)으로 변이된 변
    이 프리세닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  8. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을
    코딩하는 DNA 서열이,
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
    (단, N은 C를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제
    213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)으로 변이된 변이
    프리세닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  9. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
    프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을
    코딩하는 DNA 서열이,
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
    (단, XYZ는 이소류신 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈을 의미하고, M
    은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제 213번 아미노산을 코딩하
    는 염기이다.)으로 변이된 변이 프리세닐린-1 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  10. 제 1항에 있어서,
    프리세닐린-2 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 제 141번 및/또는
    436번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코딩하는 DNA
    서열을 포함하는 변이 프리세닐린-2 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  11. 제 10항에 있어서,
    프리세닐린-2 단백질의 아미노산 서열에 있어서, N141I 및/또는
    M239V(각 알파벳은 일문자표기법에 의한 아미노산을 의미하며, 숫자는
    프리세닐린-2 단백질의 N 말단으로부터의 아미노산 번호를 나타내고,
    숫자 왼쪽에 표시된 야생형의 아미노산이 오른쪽의 아미노산으로 치환
    됨을 나타낸다.)의 변이를 갖는 변이 프리세닐린-2 단백질을 코딩하는
    DNA 서열을 포함하는 변이 프리세닐린-2 유전자를 갖는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  12. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    아밀로이드 β단백질의 과잉발현이 변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는
    변이 프리세닐린-2 유전자에 기인하는
    유전자 변이동물.
  13. 제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서,
    변이 프리세닐린 단백질을 발현할 수 있으며, 이 단백질의 발현
    이 포유동물의 뇌의 대뇌피질 주변부에 있어서 진행성 신경질환을
    형성시키기에 충분한 양의 아밀로이드 β단백질을 생산시키는 것인
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  14. 제 1항 내지 제 13항의 어느 한 항에 있어서,
    유전자 변이동물이 포유류 동물의 설치류인
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  15. 제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서,
    유전자 변이동물이 마우스인
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  16. 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서,
    변이 프리세닐린-1 유전자 및/또는 변이 프리세닐린-2 유전자가 상동
    재조합에 의하여 도입된
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  17. 제 1항 내지 제 16항의 어느 한 항에 있어서,
    변이 프리세닐린-1 유전자에 의하여 발생된 뇌조직에서의 아밀로이드
    단백질의 발현량이, 정상동물에 비하여 기억학습 시험에 있어 장애를
    받은 행동을 일으키고, 해당동물 뇌의 해마의 대뇌피질 주변부에
    있어서 이상 신경병리를 유발하기에 충분한 것을 특징으로 하는
    인간 이외의 유전자 변이동물.
  18. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 1 또는 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프레세닐린-1 유전자와 마커 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 DNA를 갖는 인간 이외의 유전자 변이동물.
  19. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산의 부근을 코딩 하는 DNA 서열이,
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3'
    (단, N은 A, G 또는 C를 의미하고, M은 T 또는 C를 의미하며, 밑줄친 염기가 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)인 변이 프리세닐린-1 유전자의 DNA 서열 또는 그 부분서열을 포함하는 플라스미드.
  20. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자이고, 제 213번 아미노산의 부근을 코딩하는 DNA 서열이,
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3'
    (단, M은 T 또는 C를 의미하며, XYZ는 이소류신 이외를 코딩하는 3염기의 코돈을 의미하고, 밑줄친 염기가 제 213번의 아미노산을 코딩하는 염기이다.)인 유전자의 DNA 서열 또는 그 부분서열을 포함하는 플라스미드.
  21. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번의 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 엑손 8을 포함하는 염색체 DNA.
  22. 프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 중 제 213번 아미노산이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프리세닐린-1 유전자의 cDNA 또는 염색체 DNA의 전장 또는 변이부분을 함유하는 염기서열에 대하여 Sau3AI 부위가 도입된 DNA를 함유하는 플라스미드.
  23. 제 22항에 있어서,
    아미노산의 치환이 213번의 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인
    플라스미드.
  24. 하기 염기서열:
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3'
    (여기서, M은 T 또는 C를 의미한다.)로 특정지워지는 DNA를 함유하는 플라스미드.
  25. 마우스·프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 마우스 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 유전자.
  26. 제 25항에 있어서,
    아미노산의 치환이 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인
    유전자.
  27. (1) 마우스·프리세닐린-1 단백질의 아미노산 서열의 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 마우스 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 유전자, 및 (2) loxP가 양옆에 위치한(flanking) 네오마이신 발현 유닛을 포함하는 플라스미드.
  28. 제 27항에 있어서,
    아미노산의 치환이 이소류신에서 트레오닌으로의 치환인
    플라스미드.
  29. 하기 염기서열:
    5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3'
    (여기서, M은 T 또는 C를 의미한다.)
    로 특정지워지는 DNA를 함유하는 플라스미드가 도입된 것을 특징으로 하는 배.
  30. 제 20항, 22항, 23항, 24항, 27항, 또는 28항의 플라스미드를 이용한 상동 재조합으로 얻어진 배.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서,
    배가 포유류 동물의 설치류 유래의 배인
    배.
  32. 제 29항 내지 제 31항의 어느 한 항에 있어서,
    마우스 유래의 배성간세포인
    배.
  33. 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 기재된 유전자 변이동물의 세포를 분리하고, 조직배양에 의하여 배양함으로써 얻어지는 초대배양세포 또는 계대배양세포.
  34. 변이 프리세닐린-1 단백질을 발현할 수 있으며, 이 단백질의 발현이 뇌의 해마 또는 대뇌피질 주변부에 있어서 진행성 신경질환을 형성시키기에 충분한 양의 아밀로이드 β단백질을 생산시킬 수 있는 변이 프리세닐린-1 유전자를 상동 재조합법에 의하여 동물의 배에 도입하는 공정을 포함하는, 인간 이외의 유전자 변이동물의 작제방법.
  35. 제 34항에 기재된 유전자 변이동물의 작제방법에 있어서, 제 213번의 이소류신이 이소류신 이외의 아미노산으로 치환된 변이 프리세닐린-1 변이 단백질을 발현하는 방법.
  36. 피검물질을 투여한 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항 기재의 유전자 변이동물과 무투여 또는 대조물질을 투여한 동물을 비교하는 공정을 포함하는 알츠하이머병의 치료법 및/또는 예방에 유용한 물질의 평가방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    기억학습시험에 의하여 비교하는
    평가방법.
  38. 제 36항에 있어서,
    병리시험에 의하여 비교하는
    평가방법.
  39. 제 36항에 있어서,
    대뇌피질 주변부에서의 신경병리에 근거한 병리시험에 의하여
    비교하는
    평가방법.
  40. 제 38항 또는 제 39항에 있어서,
    신경병리에 근거한 병리시험에 의한 비교가 해당뇌의 대뇌피질 주변부
    에서의 비대한 신경교종(glyosis) 감소의 억제, 해당뇌의 대뇌피질 주 변부에서의 2-디옥시글루코스 획득감소의 억제, 및 해당뇌의 대뇌피질 에서의 2-디옥시글루코스 이용감소의 억제로 구성되는 군에서 선택되 어지는 1 또는 2 이상의 항목의 비교인
    평가방법.
  41. 제 36항에 있어서,
    해당동물의 생존기간, 탐색행동, 및 이동행동으로 구성된 군에서 선택
    되는 1 또는 2 이상의 항목에 대하여 비교하는
    평가방법.
  42. 제 33항에 기재된 초대배양세포 또는 계대배양세포를 피검화합물의 존재하에 시험관내(in vitro) 세포배양하는 공정을 포함하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방제의 평가방법.
  43. OS-2형 변이 프리세닐린-1 단백질을 코딩하는 변이 프레세닐린-1 유전자의 부분염기서열을 이용하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 또는 알츠하이머병의 발병 가능성의 진단방법.
  44. 제 36항 내지 제 42항의 어느 한 항에 기재된 평가방법에 의하여 선택되어진 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방에 유용한 물질.
  45. 제 44항에 기재된 물질을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방제.
  46. 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 기재된 유전자 변이동물과 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며, 아밀로이드 β단백질의 생산량이 많은 동물을 교배시켜 작제한 하이브리드 동물 및 그 자손으로, 변이 프리세닐린 유전자와 아밀로이드 전구체 단백질의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 유전자 변이동물.
  47. 제 46항에 있어서,
    동물이 마우스인
    유전자 변이동물.
  48. 제 47항에 있어서,
    아밀로이드 전구체 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며, 아밀로이드
    β단백질의 생산량이 많은 마우스가 PS1 변이된 마우스인
    유전자 변이동물.
  49. 제 7항 내지 제 18항의 어느 한 항에 기재된 유전자 변이동물과 아밀로이드 전구체 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며, 아밀로이드 β단백질의 생산량이 많은 마우스를 교배하여 작제한 하이브리드 마우스 및 그 자손으로, 변이 프리세닐린 유전자와 아밀로이드 전구체 단백질의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 유전자 변이 마우스.
  50. 제 7항 내지 제 18항의 어느 한 항에 기재된 유전자 변이동물과 아밀로이드 전구체 단백질을 코딩하는 유전자를 가지며, 아밀로이드 β단백질의 생산량이 많은 마우스를 교배하여 태어난 하이브리드 마우스 및 그 자손으로, 변이 프리세닐린 유전자와 아밀로이드 전구체 단백질의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 유전자 변이 마우스.
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