MXPA06003685A - Animales trangenicos que presentan las alteraciones principales ligadas a la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a animales transgenicos no humanos con desordenes serios relacionados a la enfermedad de Alzheimer. Los animales pueden utilizarse para el descubrimiento de los compuestos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Description

ANIMALES TRANSG ÉNICOS QUE PRESENTAN LAS ALTERACIONES PRINCIPALES LIGADAS A LA EN FERMEDAD DE ALZHEI M ER La presente solicitud se refiere a los animales transgénicos modelos de la enfermedad de Alzheimer (AD). Además tiene por objeto la utilización de estos animales. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa progresiva qué afecta a una gran proporción de la población de edad avanzada. Esta enfermedad se caracteriza en el plano clínico por una pérdida de la memoria y un declive de las funciones cognitivas, y en el plano neuropatológico por una pérdida neuronal pronunciada y la presencia en el cerebro de depósitos neurofibrilares intracelulares y depósitos extracelulares del péptido ß-amiloide (?ß) que forma placas amiloides. Las placas amiloides están compuestas mayoritariamente de. los péptidos ?ß con 40 o 42 residuos que son generados en el proceso proteolítico del precursor del péptido ?ß (APP). Los depósitos extracelulares de ?ß son muy específicos de los trastornos asociados con la enfermedad de Alzheimer. Ellos representan la característica precoz e invariable de todas las formas de la enfermedad de Alzheimer, incluyendo las formas familiares (FAD). Las formas familiares aparecen de manera relativamente precoz (entre los 30 y 60 años) y son debidas a mutaciones en el gen del APP en el 5 % de los casos de FAD con ocho mutaciones antisentido simples o dobles identificadas, en el gen de la presenilina 1 (PS 1 ) en 50 a 70 % de los casos de FAD con más de 100 mutaciones diferentes identificadas hasta ahora, y en el gen de la presenilina 2 en los casos más raros de FAD con dos mutaciones antisentido descritas. Se ha demostrado que las mutaciones en estos tres genes inducen cambios en la proteolisis del APP, que llevan a una sobreproducción de ?ß, especialmente de la forma larga ?ß42, y a la aparición precoz de la patología y síntomas similares a los de las formas esporádicas de la enfermedad de Alzheimer. Los modelos animales destinados a representar ciertas características de la patología de la enfermedad de Alzheimer han sido ya descritos en la bibliografía. Se trata por una parte de ratones transgénicos que llevan mutaciones en el gen APP. Ellos desarrollan patologías similares a la enfermedad de Alzheimer a partir de un año. Así el ratón PDAPP, que sobreexpresa el APP humano y que lleva la mutación V717F, desarrolla con la edad depósitos de ?ß en el cerebro pero no presenta pérdida neurona! más allá del emplazamiento de las propias placas (Irizarry et al. , 1 997, J. Neurosc. 17(18): 7053-7059). Este fenómeno se denomina aquí "efecto placa". Igualmente, el ratón Tg(HuAPP695. K670N-M671 L)2576, que expresa la isoforma humana APP K670N-M671 L (APPSw para la mutación tipo Swedish), presenta depósitos de tipo amiloide pero no presenta pérdida neuronal (Irizarry et al. , 1997, J. Neuropathbl. Exp. Neurol 56: 695-973).

En un estudio de Calhoun et al. (1 998 , Nature 395: 755-756), se ha demostrado una pérdida neuronal en ciertas regiones cerebrales en la proximidad de las placas amiloides, en los ratones transgénicos APP23 de 14-18 meses de edad que expresan una isoforma mutada de APP humano. Esta observación es controvertida puesto que la pérdida es débil y se produce en los animales relativamente viejos y sobre todo en la proximidad de las placas, lo que podría corresponder al "efecto placa" observado precedentemente. Además, dicha observación no se menciona o se menciona apenas en un comentario reciente que señala que los modelos animales actuales no presentan una completa similitud con todas las características conocidas de las patologías de la enfermedad de Alzheimer, entre otras la pérdida neuronal (Trojanowski, 2002, Am. J . Pathol .1 60: 409-41 1 ). Por otra parte, se conocen ratones transgénicos que llevan mutaciones en el gen PS 1 . Estos no parecen desarrollar una patología tipo enfermedad de Alzheimer pero presentan una cantidad elevada de péptido ?ß42 (aumento de 2 veces en relación con las PS 1 naturales) q ue es reconocida como altamente patógena. Además , en los modelos animales transgénicos descritos que llevan mutaciones FAD P264L o M 146L en el gen PS 1 de ratón ("knock-??"), la proteína PS 1 mutada no se expresa de forma estable (Siman et al. , 2000, J . Neurosci. , 20: 8717-8726; Flood et al. , 2002, Neurobiol . Aging 23: 335-348; Rozmahel et al. , 2002, 23: 1 87-1 94). Estos ratones presentan también una cantidad elevada de péptido La solicitud WO 02/0008407 describe tales ratones transgénicos en los que el gen que codifica la presenilina 1 se ha mutado por introducción de una mutación P264L. Debido al papel de la proteína PS 1 en la formación de las formas ?ß42, se han fabricado tam bién ratones dobles transgénicos que llevan mutaciones en los genes APP y PS 1 . Como los simples transgénicos descritos antes, estos ratones presentan depósitos de ?ß pero no presentan pérdida neuronal (Takeuchi et al. , 2000, Am . J. Pathol. 1 57 : 331 -339) . Así los modelos animales de la enfermedad de Alzheimer que existen no son satisfactorios porque fallan en reproducir una pérdida neuronal que sin em bargo es una característica importante de las enfermedades neurodegenerativas, entre ellas la enfermedad de Alzheimer. La solicitud se refiere por tanto a la fabricación de animales que presentan las características importantes de la enfermedad de Alzheimer, entre ellas la pérdida neuronal. Se ha demostrado en la solicitud q ue es posible obtener tales animales introduciendo mutaciones específicas en el gen que codifica la proteína PS1 en el ratón y cruzando este ratón con ratones que sobreexpresan el gen humano del APP. Un primer aspecto de la invención se refiere por tanto a un animal no humano que presenta, de forma ventajosa en su genoma, al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la presenilina 1 que lleva al menos una de las dos mutaciones que corresponden a las mutaciones M233T y L235P sobre la proteína PS1 de ratón. De forma ventajosa un animal de este tipo lleva las dos mutaciones. De forma preferencial la proteína PS1 que lleva las mutaciones M233T y L235P es de origen murino. De manera particularmente preferida la proteína presenilina 1 mutada es endógena. Así un animal según la presente invención produce de forma ventajosa una proteína que comprende la secuencia SEQ ID N°2. Produce preferencialmente una proteína que presenta la secuencia SEQ ID N°3. Comprende de forma ventajosa en su genoma la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N°1 o la secuencia SEQ ID N°8. Las secuencias SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 y SEQ ID N°8 resultan respectivamente de las mutaciones introducidas en las secuencias naturales SEQ ID N°4, SEQ ID N°5 y SEQ ID N°9. La secuencia SEQ ID N°5 es la de los residuos 229 a 237 de la proteína presenilina 1 natural de ratón. La secuencia SEQ ID N°9 es la del exón 7 natural del gen del ratón que codifica la proteína presenilina 1, es decir, no mutada. De forma ventajosa un animal según la presente invención coexpresa el APP, preferencialmente el APP humano. Dicho gen puede comprender una o varias mutaciones FAD. Así, las mutaciones en el gen del APP pueden ser una de las diferentes mutaciones descritas hasta ahora en la bibliografía. Las m utaciones en el gen del APP se pueden elegir entre las mutaciones "Swedish" (S) , "London" (L) y "Dutch" (D) solas o en com binación. Estas m utaciones están bien descritas en la bibliografía y se caracterizan de una manera general por las modificaciones siguientes: Están igualmente comprendidos en la m utación London todas las sustituciones que no sean de isoleucina q ue están situadas en la posición 71 7 con referencia al APP770, tales como por ejemplo las mutaciones V 71 7 G y V 71 7 F. Se entiende que el APP utilizable en el marco de la invención, puede estar bajo diferentes isoformas y en particular en las formas 695, 751 y 770 o en una forma troncada tal como por ejem plo la isoforma APP99, excluyendo la mutación Swedish para esta última.

De manera ventajosa, dicho animal comprende además, ventajosamente en su genoma, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica todo o una parte del gen q ue codifica el APP751 . De manera ventajosa la proteína APP751 es de origen humano. Ella presenta preferencialmente las mutaciones K670N y M671 L (Swedich) y V71 7I (London). En el marco de la presente invención , el gen del APP está puesto de forma ventajosa bajo el control de secuencias que permiten su expresión fuerte en las neuronas y en particular de secuencias promotoras de la transcripción tal como un promotor exógeno. Como secuencias promotoras, se pueden citar muy particularmente el promotor H G (Gautier et al. (1989) , Nucleic Acids Res 17: 20, 8389.) , así como el promotor PDGF (Sasahara et al. (1 991 ), Cell 64, 21 7-27) , el promotor Thy-1 (Luthi et al. (1997), J Neurosci 17, 4688-99) y el promotor del gen del Prion (Scott er al. ( 1 992) , Protein Sci 1 , 986-97). Según una modalidad particularmente interesante de la invención, el modelo animal com prende el gen del APP que tiene las mutaciones S, D y/o L, puesto bajo el control del promotor Thyí. Así un animal según la presente invención produce preferencialmente una proteína q ue com prende la secuencia SEQ I D N°7. Él puede presentar la secuencia de ácidos nucleicos SEQ I D N°6. De forma preferencial , se trata de un ratón transgénico obtenido del cruce entre un ratón transgénico ThyAPP (TG53) que lleva una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína humana APP751 SL y un ratón transgénico que lleva una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína PS1 de ratón que tiene las mutaciones M233T y L235P. Los animales según la presente invención reproducen por primera vez una de las características más importantes de las enfermedades neurodegenerativas, que es la pérdida neuronal de forma precoz. Por otra parte, ellos presentan las otras características clásicamente descritas de estas patologías. Los animales presentan una deposición acelerada de las placas amiloides claramente visible desde los 2 meses de edad, y de forma marcada a los 6 meses. Ellos presentan también una relación de las formas ?ß42 sobre ?ß total, ?ß42/?ß superior a aproximadamente 0,9 y eso desde los 2,5 meses. Una relación de este tipo es muy elevada en relación con la descrita en la bibliografía para otros ratones transgénicos. La pérdida neuronal, ya visible en los ratones de 6 meses de edad, es claramente pronunciada a los 10 meses. La PKR (Proteína Quinasa dependiente de RNA de doble cadena-) es una quinasa activada por el estrés y que fosforila elF2, implicada en la apoptosis. La PKR se detecta en el hipocampo (la estructura en la que tiene lugar la pérdida neuronal) de ratones APPxPS1 K1 según la invención de 1 0 meses de vida. No se ha detectado en el hipocampo de ratones transgénicos APPxPS I M146L de 12 meses de vida en los que además no se ha observado ninguna pérdida neurona!. Las nuevas características de los animales según la presente invención hacen a los modelos de estudio más completos y representativos de las alteraciones observadas en los pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer, que los ya descritos. Estos animales están por tanto particularmente adaptados para la identificación de las propiedades neuroprotectoras de los compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, de forma preferencial la enfermedad de Alzheimer. De forma preferencial, los animales según la presente invención poseen los alelos mutantes de ps1 en el estado homocigoto y los de APP en el estado heterocigoto. Sin embargo, las mismas características de dicho animal pueden estar descritas en un animal que posee uno de los dos alelos ps1 mutado en el estado heterocigoto y los alelos de APP en el estado heterocigoto, pero con un fenotipo menos marcado o que aparece más tardíamente. Otra ventaja de los animales según la presente invención es que la tasa de proteína PS1 mutada expresada por este ratón transgénico es equivalente a la tasa de proteína PS1 endógena normalmente expresada por un ratón normal (no transgénico), que expresa una PS 1 no mutada. Esta característica hace al mismo un modelo de estudio ventajoso- sin sobreexpresión de la proteína PS1 -para la identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. Estos compuestos pueden ser, principalmente, compuestos que tienen una acción sobre la regulación del gen PS1 a nivel transcripcional, post-transcripcional, traduccional, post- traduccional, o sobre la propia proteína PS1 modificando o regulando una o varias de sus propiedades, o teniendo una acción semejante sobre los copartícipes de interacción o las dianas de la proteína PS1 , o también compuestos que tienen una acción sobre la regulación del APP y de forma más amplia todas las moléculas hacia abajo de las señales iniciadas por PS1 y APP a lo largo del proceso neurodegenerativo. En el marco de la presente invención, los animales son de forma ventajosa mamíferos tales como los roedores. En particular se puede tratar de ratones, ratas o conejos. Los ratones y las estructuras artificiales que permiten su obtención se obtienen por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden obtener según las técnicas clásicas de transgénesis. Como ejemplo que ilustra uno de los procedimientos de transgénesis, se puede citar el método de electroporación de una construcción génica que contiene los genes modificados en las células de los sacos embrionarios de ratón y, después de la selección, transferencia de las células portadoras del suceso genético deseado en un blastocito receptor, tal como se describe en los ejemplos. A este respecto, los animales PS 1 mutados según la invención se obtienen por electroporación de una cásete de expresión que comprende un ácido nucleico. De manera preferencial, este ácido nucleico es un ADN que puede ser un ADN genómico (ADNg) o un ADN complementario (ADNc) . La modificación del genoma puede resultar de una alteración o una modificación de uno o varios genes por "knock-in". Esta modificación puede ser debida a la acción de agentes alterantes o mutágenos clásicos o bien se puede efectuar por m utagénesis dirigida. En la presente invención, en lo que se refiere al gen ps 1 mutado, se trata prefe.rencialmente de una recombinación homologa con un vector de reconocimiento génico que lleva el transgén previamente mutado por mutagénesis dirig ida tal como se describe en los ejemplos que siguen. Los animales que expresan la proteína APP m utada se obtienen por micro-inyección de una construcción génica en el núcleo de un zigoto . Los animales doble-transgénicos se obtienen por cruce de los animales ps 1 m utados y de los animales APP m utados. Los animales según la presente invención pueden ser utilizados de forma ventajosa para la identificación de propiedades neuroprotectoras de los com puestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, y con preferencia la enfermedad de Alzheimer. Estos compuestos pueden ser moléculas q uímicas, moléculas peptídicas o proteicas, anticuerpos , moléculas quiméricas así como los ARNs antisentido o ios ribosomas. Los compuestos identificados se pueden utilizar como medicamentos , como tales o en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable con el fin de obtener una composición farmacéutica. Se puede tratar en particular de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc., o las mezclas de tales sales), estériles, ¡sotónicas, o composiciones secas, principalmente liofilizadas, que por adición según los casos de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la reconstitución de soluciones inyectables. Las inyecciones se pueden realizar por vía estereotáxica, tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular, transdérmica, etc Otro objetivo de la invención se refiere por tanto a un procedimiento de identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas que comprende al menos las etapas siguientes: administración del compuesto o de una mezcla de compuestos a ensayar a los animales según la presente invención, y observación de la evolución de uno o varios marcadores característicos que reproducen la neuropatología observada en el hombre. Otro objetivo de la invención se refiere a un procedimiento de identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas que comprende al menos las etapas siguientes: puesta en contacto de las células extraídas de los animales según la presente invención con un compuesto o una mezcla de compuestos, y medida del efecto o efectos de los compuestos a nivel de las células enteras, en los homogenatos de células o sobre una fracción subcelular. Otro objetivo de la invención se refiere a todo producto biológico salido de. uno de los dos animales de la invención, así como a sus utilizaciones para la identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, con preferencia la enfermedad de Alzheimer. Se entiende principalmente por "producto biológico", células, extractos proteicos, ADN , ARN, o incluso anticuerpos. Así, la presente invención tiene por objetivo las células o líneas celulares derivadas de un animal tal como se ha descrito antes, en particular las células de sacos embrionarios. La presente invención tiene también por objetivo una proteína PS 1 de ratón que lleva las mutaciones de los aminoácidos M en T, y L en P respectivamente en las posiciones 233 y 235. De manera ventajosa dicha proteína comprende la secuencia SEQ ID N°2. Preferencialmente presenta la secuencia SEQ I D N°3. Otro objetivo de la presente invención es un ácido nucleico que codifica la proteína PS1 de ratón que lleva las mutaciones de los aminoácidos M en T, y L en P respectivamente en las posiciones 233 y 235. De manera ventajosa un ácido nucleico de este tipo según la reivindicación, comprende la secuencia SEQ ID N°1 o la secuencia SEQ ID N°8. La presente invención tiene también por objetivo las secuencias complementarias de estos ácidos nucleicos y los vectores que comprenden estos ácidos nucleicos o sus secuencias complementarias. Otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de estas proteínas para la identificación de las propiedades neuroprotectoras de los compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. La presente invención se ilustra por los ejemplos que siguen, pero sin que se limite a estos únicos ejemplos. En estos ejemplos, los resultados descritos demuestran la ventaja de los ratones PS 1 I y apoyan claramente la utilización preferencial del modelo PS I KIxAPP en las estrategias terapéuticas ya que tiene la ventaja de representar las principales características de las enfermedades neurodegenerativas conocidas hasta ahora.

LEYEN DAS DE LAS FIGU RAS Figura 1 A: Representación esquemática de la estructura del gen ps1 murino y de los principales sitios de restricción alrededor del exón 7 natural (línea superior) y del vector de reconocimiento génico utilizado (línea del medio). Los cambios de bases nucleotídicas para generar las mutaciones de los codones M233T y L235P mutaciones en el exón 7 (*) están representados en el cuadro de puntos. El alelo mutado PS1 K1 que contiene la cásete de resistencia a neomicina (Neo) está representado sobre la línea inferior. La posición de la sonda de 230 bp utilizada para la identificación de los recién nacidos está indicada también. Figura 1 B: Transferencia Southern utilizando la sonda de 230 bp para distinguir los alelos naturales WT (banda a 9,2 kb), y PS1 KI heterocigotos (He, doble banda) y homocigotos (Ho, banda a 7,4 kb) en diferentes ratones. Figura 1 C: Inmunotransferencia del fragmento C-terminal de PS 1 que demuestra que los niveles de expresión de la proteína PS 1 no se alteran por la presencia de las mutaciones del alelo PS1 KI. Figuras 2A, 2B y 2C: Cuantificación, respectivamente, del Aptotal del ?ß42 y de la relación A total/Ap42, a los 2,5, 4, 6 y 10 meses de edad. Figura 3: Aceleración del proceso de deposición del péptido ?ß en los ratones APP751 SLxPSI Kl Ho. Plancha ilustrativa de la distribución regional de los depósitos extracelulares del péptido ?ß en el cerebro a los 6 meses. Las imágenes representan el inmunomarcaje ?ß?? 4G8) en 3 ratones APP751 SL (Fig 3A, 3B, 3C) y 3 ratones APP751 SLxPS 1 KI Ho (Fig 3D, 3E, 3F). El inmunomarcaje pone en evidencia la aparición a los 6 meses de los primeros depósitos todavía escasos en la corteza (Cx) y en el hipocampo (Hp) de los ratones APP751 SL. Comparativamente, en los ratones APP751 SLxPSI Kl Ho de la misma edad, el número de depósitos está ampliamente aumentado en estas regiones. Es de observar que, en estos ratones, los depósitos están ya en cantidad notable en el tálamo (T). Figura 4: Progresión con la edad del proceso de deposición del péptido ?ß Plancha ilustrativa de la distribución regional de los depósitos Ap en el cerebro a los 1 0 meses. Las imágenes corresponden a 2 ratones APP751 SL (Fig 4A, 4B) y 2 ratones APP751 SLxPSI Kl Ho (Fig . 4C, 4D). En los ratones APP751 SL, el inmunomarcaje pone en evidencia un aumento importante del número y del tamaño de los depósitos en la corteza (Cx) y el hipocampo (Hp) a los 1 0 meses en comparación con los 6 meses de edad y la aparición de los primeros depósitos en el tálamo (véase la Figura 3). La densidad y el tamaño de los depósitos son igualmente más importantes a los 1 0 meses en la corteza, en el hipocampo y en el tálamo de los ratones APP751 SLxPS I Kl Ho. Es de observar que, en estos ratones, se pueden detectar depósitos en pequeño número en el cuerpo estriado (St). Figura 5: Proceso de muerte neuronal en la región CA1 en los ratones APP751 SLxPSI Kl Ho. Plancha ilustrativa de la afectación de las neuronas piramidales en el hipocampo de ratones APP751 SLxPS 1 Kl Ho de 1 0 meses de edad. Las imágenes representan la coloración por violeta de cresilo, con débil aumento en el hipocampo, en 2 ratones PS1 KI Ho (Fig. 5A, 5B), 2 ratones APP751 SL (Fig. 5C, 5D) y 2 ratones APP751 SLxPSI Kl Ho (Fig. 5 E, 5F). La densidad y espesor de las capas de las células piramidales en el hipocampo son cualitativamente comparables en los ratones APP751 SL y los ratones PS 1 KI Ho de 10 meses de edad. En cambio, a la misma edad, están netamente disminuidos en los ratones APP751 SL x PS 1 KI Ho, en particular en la capa 1 del asta de Amón (CA1 ). Es de observar que el número de pequeñas células coloreadas de azul (células de tipo glial) aparece aumentado en el hipocampo de los ratones APP751 SL x PS1 KI Ho. Figura 6: Proceso de muerte neuronal en la región CA1 en los ratones APP751 SLxPSI l Ho. Plancha ilustrativa de la afectación neuronal en CA1 a los 10 meses por medio de la utilización de otros marcadores neuronales, el verde de metilo y el inmunomarcaje BIP. Las imágenes representan la coloración por verde de metilo, con fuerte aumento en CA1 , en un ratón no transgénico (Fig 6A), un ratón PKS 1 KI Ho (Fig 6B), un ratón APP751 SL (Fig 6C) y un ratón APP751 SLxPS 1 Kl Ho (Fig 6D). Ellas representan el inmunomarcaje BIP con fuerte aumento en CA1 , en un ratón PS1 KI Ho (Fig 6 E) y un ratón APP751 SLxPSI Kl Ho (Fig 6F). Comparativamente en los ratones no transgénicos, PS 1 Kl Ho y APP751 SL, el número de células neuronales coloreadas con verde metilo está netamente disminuido en la región CA1 del ratón APP751 SLxPS1 Kl Ho. Es de observar la detección de células tipo glial coloreadas en número importante en el parénquima del hipocampo de este ratón doble-transgénico. El inmunomarcaje BIP confirma igualmente la pérdida de neuronas piramidales importante en CA1 en el ratón APP751 SLxPS 1 KI Ho de 10 meses de edad. Figura 7: Muerte neuronal en CA1 y deposición intracelular dei péptido ?ß Plancha ilustrativa de los dos procesos patológicos, la afectación neuronal y la acumulación intracerebral anormal del péptido Apa los 10 meses. Las imágenes representan, con fuerte aumento en CA1 , el inmunomarcaje ?ß en 2 ratones APP751 (Fig. 7A, 7B) y 2 ratones APP751 SLxPS1 Kl Ho (Fig 7E, 7F). Ellas representan, con fuerte aumento en CA1 , la coloración violeta de cresilo en los ratones APP751 (Fig. 7C, 7D) , los ratones APP751 SLxPS 1 KI Ho (Fig. 7G„ 7H) y 2 ratones PS1 KI Ho (7I , 7J). A (os 10 meses de edad, tanto en los ratones simples APP751 SL como en los dobles APP751SL x PS 1 KI Ho, los depósitos extracelulares de ?ß también se observan mayontariamente de una y otra parte de la capa de neuronas en CA1 . En cambio, en CA1 (caracterizada por una afectación neuronal pronunciada a lo largo de la capa en los ratones APP751 SLxPS1 Kl Ho, Fig 7C 7D), el inmunomarcaje ?ß de aspecto granular (que corresponde a la acumulación intraneuronal anormal del péptido A véanse las flechas) aparece más intenso en los ratones APP751 SL x PS1 KI Ho. Esto es verdad también a los 6 meses de edad (véase la Figura 8). Figura 8: Introducción precoz del proceso de muerte neuronal en CA1 en los APP751 SLxPS Kl Ho. Plancha ilustrativa de la región CA1 del hipocampo a los 6 meses. Las imágenes representan, con fuerte aumento en CA1 , el inmunomarcaje ?ß en 3 ratones APP751 (8A, 8B, 8C) y 3 ratones APP751 SLxPS 1 Kl Ho (Fig. 8G, 8H, 81). Ellas representan la coloración por violeta de cresilo en los ratones APP751 (Fig. 8D, 8E, 8F) y los ratones APP751 SLxPSI Kl Ho (8J, 8K, 8L). A los 6 meses, la región CA1 del hipocampo, en un ratón APP751 SLxPS 1 KI Ho, se caracteriza por un número de depósitos extraceiulares de ?ß ya importante (Fig 81) , un mareaje granular intracelular de ?ß intenso (véanse las flechas) y una pérdida de neuronas coloreadas con violeta de cresilo asociada con un aumento del número de células tipo glial (Fig 8L) . Para los otros 2 ratones APP751 SLxPS I Kl Ho, la capa de neuronas CA1 coloreada con violeta de cresilo aparece poco (Fig 8J) o nada (Fig 8K) desorganizada. Es de observar que para estos dos ratones, el inmunomarcaje ?ß intracelular aparece menos intenso y más difuso (FiG 8G , 8H) que en el tercer ratón (Fig . 81) .

EJEM PLOS Ejemplo 1 : Construcción del vector de reconocimiento génico que lleva las mutaciones M233T y L235P. El objetivo ha sido introducir dos mutaciones en el exón 7 del gen PS1 del ratón que conducen a la alteración de los residuos 1V1233 en T y L235 en P. Los dos nuevos codones corresponden a las mutaciones identificadas en los pacientes de Alzheimer de comienzo precoz (FAD) . Se ha generado una línea de ratones PS 1 knock-in (PS 1 KI) utilizando una estrategia de mutagénesis en 2 etapas similar a la descrita en Kwok et al. (1 997 Neuroreport 8; 1 57-42) y Champion et al. (1 996, Neuroreport 7, 1 582-4) . La estrategia ha pretendido la construcción de un vector de reconocimiento génico portador de cambios de ácidos nucleicos en los codones 233 y 235 del gen murino ps1 (véase la Fig l A) .

Sucintamente, un fragmento genómico de 17 Kb del gen de ratón PS1 ha sido aislado por cribado de un banco de ADN genómico de ratón 129SvJ construido en un bacteriófago lambda (Stratagene, catálogo # 946313). El análisis por digestión con enzimas de restricción, la secuenciación y la comparación con las secuencias parciales del gen murino PS1 disponibles (Mitsuda et al. 1 997, JBC 272, 23489-97), han indicado que este fragmento contenía la región intrón 5 a exón 11 del gen de ratón PS1. Un sub-fragmento BamH\-Hind\ \\ de 9,8 Kb que contiene una parte del intrón 5, el exón 6, el intrón 6, el exón 7 y una parte del intrón 7, ha sido sub-clonado en el plásmido pGEM-1 1 Zf (+) (Promega, France) (Fig. A). La mutagénesis de los 2 codones se ha realizado utilizando el kit Gene Editor (Promega ) sobre el fragmento de ADN que contiene el exón 7 y ha sido confirmada por secuenciación nucleotídica. El brazo largo (5') del vector de recombinación homólogo se ha obtenido por clonación del fragmento BamH\-Xba\ de 7 Kb que contiene el exón 6. El brazo corto (3') del mismo ha sido generado por sub-clonación del fragmento Xba\-EcoR\ de 1 ,8 Kb que contiene el exón 7 mutagenizado. Se ha introducido una cásete de selección positiva (pMCI-Neo cásete) en el sitio Xba\ situado en el intrón 6 en la posición -470 bp en 5' del exón 7 (véase la Fig l A).

Ejemplo 2: Obtención de células ES que comprenden PS1 KI El vector de reconocimiento génico, descrito en el ejem plo 1 , se ha linealizado por digestión con Notl y electroporado en la línea de células del saco embrionario (ES) C 35 suministrada por el Dr. Charles Babinet, Instituí Pasteur París, France. Se han cultivado las células como se ha descrito precedentemente (W.Wurtz and A. Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Editor) . Oxford University Press; 2nd edition (February 15, 2000)). Se han seleccionado en presencia de G41 8, 430 clones celulares susceptibles de llevar la recombinación homologa. El ADN genómico de estos clones se ha analizado por transferencia Southern como se ha descrito precedentemente (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1 989) utilizando una sonda PS 1 situada fuera del dominio de recombinación (Fig l A) del brazo largo. ' Se han podido identificar así cuatro clones celulares portadores de las mutaciones deseadas en el gen PS1. Estos clones celulares han servido para establecer una línea de ratones transgénicos PS1 KI .

Ejemplo 3: Construcción de la l ínea de ratones PS 1 KI Se ha inyectado el clon 18C5 en los blastocitos de ratón C57BI/6. Los cinco ratones quiméricos obtenidos han mostrado una transmisión del alelo mutante ps1 a la línea germinal (y por tanto a su descendencia) . A partir de estos fundadores, se ha establecido la línea de ratones PS1 KI sobre fondo genético puro 129SV y sobre fondo mixto 129SV-C57BI/6. La presencia del alelo mutado PS1 KI en el estado heterocigoto (He) o de homocigoto (Ho) ha sido determinada por transferencias Southern con la sonda ps1 de 230 bp (Fig. l B) . Los ratones mutantes son viables y fértiles.

Ejemplo 4: Dosificación de PS1 en la línea PS1 KI Después de eutanasia, se ha separado y pesado el cerebro de los ratones. Se ha conservado un hemisferio para la inmunohistoquímica (post-fijación) y el otro ha sido congelado después de ser homogeneizado individualmente sobre hielo con ayuda de un Potter en 2 mi de una solución tampón: sacarosa 0,32 , Tris-HCI 4 mM, pH 7,4 que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas (Complete™, Roche Diagnostics). La concentración en proteínas ha sido determinada por el método BCA (Pierce). El homogenato se ha conservado a -80 °C. Para la detección de PS 1 , se han incubado 25 pg de extracto proteico de cerebro a 56 °C durante 20 min en el tampón de depósito Laemmli que contiene urea 8 M y ditiotreitol 50 mM. Se han fraccionado las proteínas por electroforesis sobre gel NuPAGE 4-12 % Bis-Tris poliacrilamida (SDS-PAGE) en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico). Después de la transferencia de las proteínas sobre filtro de nitrocelulosa (Amersham, France), se ha calentado el filtro en PBS durante 5 min a fin de aumentar la sensibilidad e inmediatamente se ha saturado con 5 % (p/v) de leche desnatada en polvo en un tampón PBST (PBS, Tween 20 al 0,05 % (v/v) ) durante 1 h y se ha incubado durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario en tampón PBST solo. Se ha detectado la unión del anticuerpo con un anticuerpo -anti IgG (anti-ratón) conjugado con la peroxidasa de Raifort (Amersham, France) a la dilución de 1 /10.000 en PBST seguido de un sistema de detección por quimioluminescencia (Amersham, France) según las instrucciones del fabricante. Para la detección de PS1 , se ha utilizado el anticuerpo primario MAB1563 (Chemicon, USA) a la dilución 1 /10000. Para el análisis semi-cuantitativo, las señales de luminescencia se han digitalizado con una cámara CCD GeneGnome 16 bits (Syngene, Cambridge, Angleterre) y se han analizado con el programa Genetools (Syngene). La linealidad de la señal se ha verificado gracias a curvas estándar establecidas con muestras de 2,5 a 10 pg de homogenato por pista. Este análisis por inmunotransferencia ha permitido determinar que los niveles de expresión del fragmento C-terminal de PS 1 mutada permanecen normales y no han disminuido en el ratón PS 1 KI233/235 (Fig l C).

Ejemplo 5: Obtención de la línea PSI KIxAPP por cruce de las líneas PS1 KI y APP Los ratones PS1 KI (descritos en los ejemplos 1 a 4) se han cruzado con una línea de ratones transgénicos que sobreexpresan la forma humana del cDNA APP75 que lleva las mutaciones FAD Swedish (mutación K670N ; M671 L) y London (V717I) bajo el control del promotor Thy- 1 . Los ratones que sobreexpresan la forma humana del cDNA APP751 que lleva las mutaciones han sido obtenidos como se describe en la solicitud de patente WO 01 /20977. En todas las experiencias siguientes , se han utilizado ratones del m ismo fondo genético para minimizar todo efecto debido a las variaciones de fondo genético.

Ejemplo 6: Dosificación del péptido amíloide AB total v ?ß42 por el método de inm unoelectroquimioluminiscencia Para la cuantificación de la mezcla g lobal de ?ß en el cerebro (formas solubles y formas agregadas o ¡nsolubles) , se han tratado alícuotas de homogenato de cerebro con 2 volúmenes de una solución 9 M de clorhidrato de guanidina (GH) en Tris 50 mM pH 7,4. Los homogenatos se han mezclado durante 1 h con 3 periodos de sonicación de 15 min seguidos de una centrifug ación a 50 000 g a 4 °C durante 2 h. Los extractos de g uanidina se han diluido 1 /20 en tampón de Tris-HCI 20 mM, pH 7, 6, NaCI 1 50 mM, BSA al 0, 5 % (p/v) y Tween 20 al 0, 05 % (p/v) . La concentración del péptido ?ß en las fracciones se ha determinado a continuación por inmunoelectroquimioluminiscencia (Yang et al. , 1 994, Biotechnology (NY) 1 2(2) , 1 93- 1 94) con ayuda de 2 anticuerpos monoclonales de ratón anti-péptido ?ß (4G8 y 6E1 0) y del lector Origen M8 Analyzer (I G EN Europe I nc. Oxford) siguiendo un protocolo modificado según Khorkova et al. (J. Neurosci. Meth.ods 82, 159-166 (1998)) .

El anticuerpo monoclonal 4G8 (Senetek PLC), que reconoce el epítopo de los residuos 17-24 del péptido ?ß, es marcado con rutenio gracias al éster TAG-NHS siguiendo el protocolo del proveedor (IGEN Europe ínc , Oxford). Ru-4G8 y el anticuerpo biotinilado 6E1 0, epítopo 1 -1 0 del péptido ?ß (Senetek PLC) se ponen en presencia de la fracción soluble de cerebro y los complejos tripartitos Ru-4G8/A /6E1 0-biot se cuantifican por el lector Origen. Para calibrar cada experiencia se utiliza una gama de péptido sintético ?ß (Bachem). La tasa de péptido ?ß se calcula en nanogramos por g de peso inicial de tejido cerebral. Para medir específicamente las formas de péptido ?? ß que se terminan en la posición 42 (?ß42), el anticuerpo 6E10 era reemplazado por el anticuerpo monoclonal 22F9 que se fija específicamente al extremo C-terminal ?ß42 (Wirths et al. , 2002, Brain Pathol. 12, 275-286). En conclusión, la presencia del gen ps1 knock-in (PS 1 -KI) conduce a: Una aceleración de la acumulación de ?ß (Fig2A) y ?ß42 (Fig2B) en el cerebro con un efecto todavía más pronunciado cuando el alelo PS 1 KI está presente en el estado homocigoto (efecto gen-dosis). El efecto de PS1 KI (Ho) es más acentuado que con el ratón transgénico que sobreexpresa PS 1 M 146L precedentemente descrito en la solicitud WO 01 /20977. Un aumento masivo de la proporción de péptido ?ß que presenta un extremo ß42, que representa la gran mayoría del ?ß cuando la mutación PS 1 KI está en el estado homocigoto, como muestra la Figura 2C (relación ?ß42/?ß total igual a 0,92, a los 2,5 meses de edad, frente a 0,25 en ausencia de PS 1 KI y un valor intermedio 0,70 en presencia de un solo alelo PS 1 I: efecto gen- dosis). Se reconoce en la bibliografía que las especies de péptido ?ß que se terminan en el extremo ß42 representan las formas más patológicas del péptido. La línea PS I IxAPP representa por tanto un modelo particularmente enriquecido en formas patológicas.

Ejemplo 7: Análisis de los depósitos del péptido ?ß por inmunohistoquímica Para las experiencias de inmunohistoquímica/histología, después de extracción y postfijación en paraformaidehído al 4 %, los hemicerebros se crioprotegen durante 1 noche a 4 °C, en tampón de fosfato de sodio 0,2 M (NaH2P04,2H20 / Na2HP04, 12HzO, pH 7,4) que. contiene sacarosa al 20 % (p/v). A continuación se congelan durante 1 min en isopentano mantenido a una temperatura de -30 °C en nieve carbónica. Finalmente se ponen en un tampón PBS 0, 02 M, cortes de 25 µ?t? de espesor, realizados en un criostato con termostato a -30 °C (LEICA C 3000) y después se conservan a 4 °C. Sobre estos cortes, se ha realizado la detección inmunoenzimática del péptido ?ß. gracias al sistema de revelación que implica la formación de complejos avidina-biotina-peroxidasa (ABC) en el cual es biotinilada la peroxidasa de Raifort acoplada a la avidina. Brevemente, después de una incubación de 30 min en el tampón de bloqueo (suero normal de cabra (Chemicon) al 10 % en PBS que contiene 0, 1 % de tritón (Sigma), los cortes de cerebros se ponen en presencia de una solución de H202 al 0,3 % a fin de eliminar les endoperoxidasas presentes en el tejido. Después se incuban estos cortes en la solución de anticuerpo primario que contiene 0,3 % de tritón y 2 % de suero normal (toda la noche a 4 °C). El anticuerpo primario anti-?ß (4G8, Senetek) (anticuerpo monoclonal dirigido contra el residuo 17-24 del péptido ?ß) utilizado es biotinilado. Después de lavados, los cortes se ponen entonces directamente en presencia del complejo ABC, durante 1 hora según las instrucciones del fabricante (Kit ABC Vectastin, Laboratoires Vector, Burlingame, CA). Se ha utilizado la 3-3'-diaminobencidina como cromógeno para la enzima peroxidasa. Así, la aceleración de la acumulación anormal del péptido ?ß en el cerebro de los ratones dobles-transgénicos APP751 SLxPS I l Ho, detectada precedentemente por ensayos bioquímicos sobre homogenatos de hemicerebros, ha sido confirmada por inmunohistoquímica. En efecto, el análisis microscópico del inmunomarcaje ?ß obtenido sobre cortes de hemicerebros ha demostrado la existencia de un proceso de deposición del péptido ?ß acelerado en el parénquima cerebral de estos ratones. En efecto, mientras que los primeros depósitos aparecen en la corteza y el hipocampo hacia los 6 meses de edad en los ratones APP751 SL (Fig. 3), ellos pueden ser detectados desde la edad de 2 meses en los dobles APP751 SLxPS 1 Kl en el estado homocigoto. Comparativamente con los simples transgénicos APP751 SL, en los dobles transgénicos (APP751 SLxPS1 Kl Ho) de 6 meses de edad, la densidad de los depósitos de ?ß es netamente más importante en el hipocampo y la corteza. Además, la distribución de los depósitos es más amplia; en particular los depósitos son ya detectados en el tálamo y también en la protuberancia (Fig.3). Con la edad, en particular a los 10 meses, la densidad e igualmente el tamaño de los depósitos aumentan en el cerebro de los ratones simples-transgénicos APP751 SL (Fig 4). La distribución de estos depósitos es igualmente más amplia puesto que ellos están presentes en él tálamo. En los dobles transgénicos APP751 SLxPS1 Kl Ho de 10 meses de edad, se observa una progresión similar del proceso de deposición del péptido ?ß en el hipocampo, la corteza, el tálamo y la protuberancia. Los primeros depósitos pueden ser detectados en número limitado en el cuerpo estriado (Fig. 4). En cambio, el cerebelo permanece protegido por el proceso de deposición de ?ß. Es de observar, que en el cerebro los ratones PS1 Kl Ho de' 10 meses de edad (n = 4), no se ha detectado ningún depósito del péptido ?ß.

Ejemplo 8: Análisis de la pérdida neuronal por histología e inmunohistoauímica La presencia de una proporción muy importante de péptido ?ß42 patológico, ha llevado a analizar si en la línea APP751 SLxPS I Kl Ho, además de la aceleración del proceso de deposición del péptido ?ß, se desarrolla con la edad una pérdida neuronal. Para esto, se han realizado 3 tipos de coloraciones que permiten visualizar la desaparición de células neuronales sobre cortes de tejido cerebral: a) la histología con violeta de cresilo que colorea los cuerpos de Nissl (los orgánulos citoplásmicos asociados a los ribosomas del retículo endoplásmico granuloso) y permite la puesta en evidencia sobre cortes de cerebro del conjunto de las células neuronales y gliales; b) la histología con verde metilo que colorea el ADN de todas las células; c) la inmunohistoquímica con BIP que revela la expresión en las células de una proteína chaperona residente del retículo endoplásmico. Para la coloración con violeta de cresilo, los cortes de tejido cerebral se montan sobre láminas gelatinadas y después se incuban durante 10 minutos en una solución de violeta de cresilo (C 1791 , Sigma) al 0,5 % en agua destilada. Después de un lavado en medio ácido, finalmente se deshidratan los cortes. Para la coloración con verde de metilo, los cortes se montan sobre láminas gelatinadas y después se incuban durante 10 minutos en una solución de verde de metilo (M5015 de sigma) al 1 % en agua destilada, se lavan y después se deshidratan. Para la inmunohistoquímica con BIP (anticuerpo policlonal, SPA-826, Stressgen), el protocolo es idéntico al aplicado para la inmunohistoquímica del péptido ?ß (véase anteriormente) excepto la incubación suplementaria (1 h, a temperatura ambiente) de los cortes en una solución de anticuerpo secundario biotinilado (anticuerpo anti-lgG de conejo hecho en la cabra, Vector) antes de su incubación en el complejo ABC. El análisis microscópico ha puesto en evidencia, mediante la utilización de diferentes marcadores histológicos/inmunohistoquímica, una disminución del espesor de la capa de las células piramidales del hipocampo, en particular de CA1 , en el cerebro de los ratones APP751 SLxPSI Kl Ho (n = 3/3) (Figuras 5 y 6). Esta disminución indica la existencia de un proceso de muerte neuronal ya bien instalado a la edad de 1 0 meses. A los 6 meses, la muerte neuronal se presenta en el cerebro de 1 /3 ratones lo que sugiere la introducción precoz de un proceso neurotóxico (Figura 8). El análisis en paralelo en el hipocampo, y en particular en CA1 , de los 2 procesos patológicos que son la acumulación anormal del péptido ?ß en el cerebro y la afectación neuronal, sugiere un papel más probable en el proceso neurotóxico de la acumulación intracelular de ?ß (fenómeno ya descrito en los ratones thy1 APP751 SLxPSI M146L) que su acumulación en depósitos extracelulares (Figura 7). En efecto, las neuronas todavía presentes en CA1 presentan una expresión anormalmente fuerte del péptido ?ß. Además, la afectación neuronal en CA1 está claramente presente en las regiones desprovistas de depósitos extracelulares. Es de observar la existencia de un probable efecto gen-dosis en el proceso de muerte neuronal en CA1 . Se ha encontrado en efecto una afectación neuronal en los ratones APP751 SLxPS I Kl muy viejos (>1 5 meses) que no tienen más que un alelo PS1 KI.

Claims (1)

1. REIVI N DICACIONES 1 . Un animal no humano que presenta una secuencia de ácidos nucleicos q ue codifica una proteína presenilína 1 que lleva al menos una de las mutaciones que corresponden a las mutaciones M233T y L235P sobre la proteína PS 1 de ratón. 2. Un animal según la reivindicación 1 , caracterizado porque la mutación o las mutaciones están en el estado homocigoto. 3. Un animal según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque lleva las dos mutaciones. 4. Un animal seg ún una de las reivindicaciones 1 a 3, que com prende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica todo o una parte del gen que codifica el APP. 5. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque expresa una cantidad de PS1 mutada comparable a la cantidad de la PS 1 endógena de un animal que expresa u na PS 1 no mutada. 6. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proteína presenilína 1 q ue lleva las mutaciones M233T y L235P es de origen m urino. 7. Un animal según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la proteína APP es la APP751 y es de origen humano. 8. U n animal según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque la proteína APP751 es de origen humano y presenta las mutaciones Swedish y London . 9. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un roedor. 10. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque es un ratón, una rata o un conejo. 1 1 . Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 1 0, caracterizado porque produce una proteína que comprende la secuencia SEQ I D N°2. 12. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado porque presenta en su genoma la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1 . 13. Un animal según una de las reivindicaciones 4 a 12, caracterizado porque la expresión del gen que codifica el APP está bajo el control de un promotor exógeno. 14. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque presenta una pérdida neuronal. 15. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque presenta una relación Abeta42/Abeta total superior a aproximadamente 0,9. 16. Un animal según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la proteína presenilina 1 mutada es endógena. 17. Una célula o línea celular derivada de un animal según una de las reivindicaciones 1 a 16. 1 8. Una célula o línea celular que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el gen murino de la presenilina 1 bajo una forma mutada en M233T y L235P. 19. Una célula del saco embrionario derivada de un animal según una de las reivindicaciones 1 a 1 6. 20. La proteína PS1 de ratón que lleva las mutaciones de los aminoácidos M en T, y L en P respectivamente en las posiciones 233 y 235. 21 . La proteína según la reivindicación 20, caracterizada porque comprende la secuencia SEQ ID N°2. 22. Un ácido nucleico que codifica la proteína PS1 de ratón que lleva las mutaciones de los aminoácidos M en T, y L en P respectivamente en las posiciones 233 y 235. 23. El ácido nucleico según la reivindicación 22, caracterizado porque comprende la secuencia SEQ ID N° 1 . 24. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 23. 25. La utilización de un animal según una de las reivindicaciones 1 a 16, para la identificación de compuestos destinados al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. 26. Un procedimiento de identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas que comprende las etapas siguientes: administración del compuesto o de una mezcla de compuestos a ensayar a un animal según una de las reivindicaciones 1 a 16, y observación de la evolución de uno o varios marcadores característicos que reproducen la neuropatología observada en el hombre. 27. Un procedimiento de identificación de compuestos destinados al tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas que comprende las etapas siguientes: - la puesta en contacto de las células extraídas de un animal según una de las reivindicaciones 1 a 16 con un compuesto o una mezcla de compuestos y la medida del efecto o efectos de los compuestos a nivel de las células enteras, en los homogenatos de células o sobre una fracción subcelular. 28. La utilización de una proteína según una de las reivindicaciones 20 y 21 , para la identificación de compuestos destinados al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.