KR101164691B1 - 알쯔하이머 질환과 관련된 중증의 장애를 가진 트랜스제닉동물 - Google Patents

알쯔하이머 질환과 관련된 중증의 장애를 가진 트랜스제닉동물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알쯔하이머 질환과 관련된 중증의 장애를 갖는 비-인간 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 상기 동물은 알쯔하이머 질환의 치료를 위한 화합물의 발견을 위해 사용될 수 있다.
비-인간 트렌스제닉 동물, 알쯔하이머 질환

Description

알쯔하이머 질환과 관련된 중증의 장애를 가진 트랜스제닉 동물 {Transgenic Animals With Serious Disorders Related To Alzheimer's Disease}
본 출원은 알쯔하이머 질환 (AD)의 모델인 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 또한, 이들 동물의 용도에 관한 것이다.
알쯔하이머 질환은 노년 인구의 대부분에게 영향을 미치는 진행성 신경퇴행성 질환이다. 이 질환은 임상적 측면에서 기억 상실 및 인지 능력의 감퇴를 특징으로 하고, 신경병리학적 측면에서 뉴런의 현저한 손실 및 뇌에서 세포내 신경원섬유 침착 및 아밀로이드 플라크를 형성하는 β-아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 세포외 침착의 존재를 특징으로 한다.
아밀로이드 플라크는 주로 40 또는 42개의 잔기를 함유하는 Aβ 펩티드로 구성되며, 상기 펩티드는 Aβ 펩티드 전구체 (APP)에 대한 단백질 분해 과정 동안에 생성된다. Aβ의 세포외 침착은 알쯔하이머 질환과 관련된 장애에 대해 매우 특이적이다. 이는 가족성 형태 (FAD)를 비롯한 모든 형태의 알쯔하이머 질환의 조기의 일정한 특징이다. 가족성 형태는 비교적 조기 (30세 내지 60세)에 나타나며, FAD 케이스의 5％는 APP 유전자에서 확인된 8가지의 단일 또는 이중 미스센스 돌연변이, FAD 케이스의 50 내지 70％는 프리세닐린 1 (PS1) 유전자에서 지금까지 확인된 100가지가 넘는 상이한 돌연변이, 더욱 드문 FAD 케이스는 프리세닐린 2 유전자에 서 기재된 두가지 미스센스 돌연변이로 인해 일어난다. 이들 세가지 유전자에서의 돌연변이가 APP의 단백질 분해에 변화를 유도하여, Aβ, 특히 장형 Aβ42의 과다생산을 야기하고, 알쯔하이머 질환의 산발적인 형태와 유사한 병리학적 증상 및 징후의 조기 출현을 야기하는 것으로 밝혀졌다.
알쯔하이머 질환의 특정한 병리학적 특징을 나타내도록 의도된 동물 모델은 이미 문헌을 통해 기재되었다.
먼저, APP 유전자에서의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스가 있다. 이들은 1세 때부터 알쯔하이머 질환과 유사한 병리학적 증상을 나타낸다. 따라서, 돌연변이 V717F를 갖는 인간 APP를 과발현하는 PDAPP 마우스는 나이가 들면서 뇌에서 Aβ 침착을 나타내지만, 플라크 자체의 위치를 벗어나서는 뉴런 손실을 보이지 않는다 (문헌 [Irizarry et al., 1997, J. Neurosc. 17(18): 7053-7059]). 이 현상은 "플라크 효과"라고 지칭될 것이다.
유사하게, 인간 이소형 APP K670N-M671L (스웨덴 돌연변이의 경우 APPSw)을 발현하는 Tg(HuAPP695. K670N-M671L)2576 마우스는 아밀로이드 유형의 침착을 나타내지만, 뉴런 손실은 보이지 않는다 (문헌 [Irizarry et al., 1997, J. Neuropathol. Exp. Neurol 56: 695-973]).
문헌 [Calhoun et al., 1998, Nature 395: 755-756]의 연구에서는, 인간 APP의 돌연변이된 이소형을 발현하는 생후 14 내지 18개월 APP23 트랜스제닉 마우스에서 아밀로이드 플라크의 근처의 특정한 뇌 영역에서 뉴런 손실을 보였다. 이러한 발견은, 뉴런 손실이 적고 비교적 고령의 동물에서 특히 상기 발견된 "플라크 효 과"에 상응할 수 있는 플라크 근처에서 일어나기 때문에 논쟁의 여지가 있다. 또한, 최근 강조되는 기록에서는, 현재의 동물 모델이 알쯔하이머 질환의 병리학적 증상으로서 알려진 모든 특징, 특히 뉴런 손실의 면에서 완벽한 유사성을 나타내지 않는다는 점이 언급되지 않거나 전혀 없었다 (문헌 [Trojanowski, 2002, Am. J. Pathol. 160: 409-411]).
또한, PS1 유전자에 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스도 공지되어 있다. 이들에서는 알쯔하이머 질환 유형의 병리 증상이 전혀 나타나지 않으나, 병원성이 높은 것으로 인식되는 다량의 Aβ42 펩티드 (야생형 PS1에 비해 2배량임)가 나타난다.
또한, 마우스 PS1 유전자에 FAD 돌연변이 P264L 또는 M146L을 갖는 트랜스제닉 동물 모델 ("녹-인 (knock-in)")에서는, 돌연변이된 PS1 단백질이 안정적으로 발현되지 않는다 (문헌 [Siman et al., 2000, J.Neurosci., 20: 8717-8726]; [Flood et al., 2002, Neurobiol. Aging 23: 335-348]; [Rozhmahel et al., 2002, 23: 187-194]). 이들 마우스에서도 다량의 Aβ42 펩티드가 나타난다.
출원 WO 02/0008407에는 프리세닐린을 코딩하는 유전자가 P264L 돌연변이 도입에 의해 돌연변이된 트랜스제닉 마우스가 기재되어 있다.
Aβ42형 형성에서의 PS1 단백질 역할에 기인하여, APP 및 PS1 유전자에서 돌연변이를 갖는 이중 트랜스제닉 마우스도 제조된 바 있다. 이들 마우스에서는 상기 기재된 단일 트랜스제닉 마우스와 같이, Aβ 침착물이 나타나지만 뉴런의 손실은 나타나지 않는다 (문헌 [Takeuchi et al., 2000, Am.J.Pathol. 157: 331-339]).
따라서, 기존의 알쯔하이머 질환 동물 모델은 알쯔하이머 질환을 비롯한 신경퇴행성 질환의 주요 특성인 뉴런 손실을 재현할 수 없기 때문에 만족스럽지 못하다.
그러므로, 본 출원인은 뉴런 손실을 비롯한 알쯔하이머 질환의 주요 특성을 나타내는 동물을 제조하기 위해 노력해왔다.
이러한 동물들은 마우스에서 PS1 단백질을 코딩하는 유전자에 특정 돌연변이를 도입하고, 이를 인간 APP 유전자를 과발현하는 마우스와 교배시킴으로써 얻을 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 마우스 PS1 단백질 상의 돌연변이 M233T 및 L235P에 상응하는 두가지 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 프리세닐린 1을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 유리하게는 게놈 내에 나타내는 비-인간 동물에 관한 것이다.
이러한 동물이 두가지 돌연변이 모두를 갖는 것이 유리하다.
돌연변이 M233T 및 L235P를 갖는 PS1 단백질은 뮤린 기원의 것이 바람직하다.
돌연변이된 프리세닐린 1 단백질이 내인성인 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명에 따른 동물이 서열 2를 포함하는 단백질을 생성하는 것이 유리하다. 본 발명에 따른 동물이 서열 3을 갖는 단백질을 생성하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 동물이 게놈 내에 핵산 서열 1 또는 서열 8을 포함하는 것이 유리하다.
서열 1, 서열 2 및 서열 8은 각각 야생형 서열 4, 서열 5 및 서열 9로 도입된 돌연변이들로부터 생성된다. 서열 5는 마우스 야생형 프리세닐린 1 단백질의 잔기 229 내지 237의 서열이다. 서열 9는 프리세닐린 1 단백질을 코딩하는 마우스 유전자의 야생형 엑손 7의 서열 (즉, 돌연변이되지 않음)이다.
본 발명에 따른 동물은 APP, 바람직하게는 인간 APP를 동시발현하는 것이 유리하다. 이러한 유전자는 하나 이상의 FAD 돌연변이를 포함할 수 있다. 따라서, APP 유전자에서의 돌연변이는 현재까지 문헌에 기재된 다양한 돌연변이들 중 하나일 수 있다. APP 유전자에서의 돌연변이는 "스웨덴" (S), "런던" (L) 및 "네덜란드" (D) 돌연변이로부터 단독으로 또는 조합하여 선택될 수 있다.
이들 돌연변이는 문헌에 잘 기재되어 있으며, 일반적으로 하기 변형을 특징으로 한다.
유형 및 위치 스웨덴 돌연변이 네덜란드 돌연변이 런던 돌연변이
APP770에 대해 K670N 및 M671L E693Q 및(또는) A692G V717I
APP751에 대해 K651N 및 M652L E674Q 및(또는) A673G V698I
APP695에 대해 K595N 및 M596L E618Q 및(또는) A617G V642I
Aβ 펩티드 (A42)
에 대해		 E22Q 및(또는) A21G V46I
런던 돌연변이에는 APP770에 대해 위치 717에서 이소류신 이외의 것을 갖는 모든 치환체, 예를 들어 돌연변이 V717G 및 V717F도 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 APP는 다양한 이소형, 특히 695, 751 및 770형 또는 말단 절단형, 예를 들어 후자에 대한 스웨덴 돌연변이가 없는 이소형 APP99일 수 있는 것으로 이해된다.
상기 동물이 APP751를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부분을 코딩하는 핵산 서열도 유리하게는 게놈 내에 포함하는 것이 유리하다. APP751 단백질은 인간 기원의 것이 유리하다. 이 단백질이 돌연변이 K670N 및 M671L (스웨덴) 및 V717I (런던)를 나타내는 것이 바람직하다.
본 발명에서, APP 유전자는 뉴런에서 그의 강력한 발현을 가능하게 하는 서열, 특히 전사-촉진 서열, 예를 들어 외인성 프로모터의 제어하에 있는 것이 유리하다. 프로모터 서열로는 가장 특히 HMG 프로모터 (문헌 [Gautier et al. (1989), Nucleic Acids Res 17: 20, 8389]), 및 또한 PDGF 프로모터 (문헌 [Sasahara et al. (1991), Cell 64, 217-27]), Thy-1 프로모터 (문헌 [Luthi et al. (1997), J Neurosci 17, 4688-99]) 및 프리온 유전자 프로모터 (문헌 [Scott et al. (1992), Protein Sci 1, 986-97])가 언급될 수 있다.
본 발명의 특히 유리한 실시양태에 따르면, 동물 모델은 Thy1 프로모터의 제어하에 있는, S, D 및(또는) L 돌연변이를 갖는 APP 유전자를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 동물이 서열 7을 포함하는 단백질을 생성하는 것이 바람직하다. 이것은 핵산 서열 6을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 동물로는 인간 단백질 APP751SL을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 트랜스제닉 마우스 ThyAPP (TG53)와, 돌연변이 M233T 및 L235P를 갖는 마우스 PS1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 트랜스제닉 마우스간의 교배로부터 유래된 트랜스제닉 마우스가 바람직하다.
본 발명에 따른 동물은 신경퇴행성 질환의 가장 중요한 특성들 중 하나인 조기 뉴런 손실을 최초로 재현한다.
또한, 본 발명에 따른 동물은 이러한 병리 증상에 대해 통상적으로 기재된 다른 특성들을 나타낸다. 이들 동물에서는, 가속화된 아밀로이드 플라크 침착이 생후 2개월부터는 뚜렷하게 보여지고, 생후 6개월부터는 주목할 만하게 보여진다.
또한, 이들에서는 생후 2½개월부터 Aβ42형 대 전체 Aβ의 비율 (Aβ42/Aβ)이 약 0.9 초과로 나타난다. 이러한 비율은 문헌에 기재된 다른 트랜스제닉 마우스에 비해 매우 높다.
생후 6개월 마우스에서 이미 보여진 뉴런 손실은 10개월째에는 뚜렷하게 현저하다.
PKR (이중 가닥 RNA-의존성 단백질 키나제)은 아팝토시스에 관여된, eIF2를 포스포릴화시키는 스트레스-활성화 키나제이다.
PKR은 본 발명에 따른 생후 10개월 APPxPS1KI 마우스의 해마 (뉴런 손실이 발생하는 구조)에서 검출된다. 또한, 뉴런 손실이 관찰되지 않는 생후 12개월 APPxPS1M146L 트랜스제닉 마우스의 해마에서는 PKR이 검출되지 않는다.
본 발명에 따른 동물은 이들의 신규한 특성으로 인해 알쯔하이머 질환 환자에서 관찰되는 장애를 앞서 기재된 것들보다 더 완전하게 나타내는 연구 모델이다. 따라서, 상기 동물은 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알쯔하이머 질환의 치료를 위한 화합물의 신경보호 특성을 입증하는 데 특히 적합하다.
본 발명에 따른 동물은 동형접합체 상태로 PS1의 돌연변이 대립유전자 및 이형접합체 상태로 APP의 돌연변이 대립유전자를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 이형접합체 상태의 돌연변이된 PS1 대립유전자와 이형접합체 상태의 APP의 돌연변이 대립유전자 둘 중 하나를 가지나, 표현형이 덜 현저하거나 나중에 나타나는 동물이 상기 동물의 특성과 동일한 특성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 동물의 또다른 이점은 이러한 트랜스제닉 마우스에 의해 발현된 돌연변이된 PS1 단백질의 양이 비-돌연변이된 PS1를 발현하는 정상 (비트랜스제닉) 마우스에 의해 정상적으로 발현된 내인성 PS1 단백질의 양과 동일하다는 점이다. 상기 특성으로 인해 본 발명에 따른 동물은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하기 위한 (PS1 단백질의 과발현이 없는) 유리한 연구 모델이 된다.
이러한 화합물은 특히, 전사, 전사후, 번역 또는 번역후 수준으로 PS1 유전자를 조절하는 작용을 하거나, 그의 특성들 중 하나 이상을 변형 또는 조절함으로써 PS1 단백질 자체에 작용하는 화합물, 또는 상호작용 파트너 또는 PS1 단백질의 표적에 유사 작용을 하는 화합물, 또는 APP, 보다 넓게는 신경퇴행 과정 동안 PS1 및 APP에 의해 개시된 신호의 임의의 하류 분자를 조절하는 작용을 하는 화합물일 수 있다.
본 발명에서, 동물로는 설치류와 같은 포유동물이 유리하다. 특히, 이들은 마우스, 래트 또는 토끼이다.
이들을 얻기 위한 마우스 및 구조물은 당업자에게 공지된 방법으로 얻어진다.
이들은 통상의 트랜스제네시스(transgenesis) 기술에 따라 얻을 수 있다. 트랜스제네시스 방법의 하나를 예시하는 예로서, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, 마우스 배아 줄기 세포를 전기천공하여 변형된 유전자를 함유하는 유전자 구조 물을 도입하고, 선별 후, 목적하는 유전자 반응을 보유하는 세포를 수용자 배반포로 전달하는 방법을 들 수 있다. 이에 대해, 핵산을 포함하는 발현 카세트의 전기천공에 의해 도입하여 본 발명에 따른 돌연변이된 PS1 동물을 얻는다. 바람직하게는, 이 핵산은 DNA이며, 게놈 DNA (gDNA) 또는 상보적 DNA (cDNA)일 수 있다.
게놈의 변형은 하나 이상의 유전자가 "녹-인"에 의해 변화 또는 변형된 결과일 수 있다. 이러한 변형은 통상의 변화성 또는 돌연변이유발성 물질의 작용으로 인한 것일 수 있거나 또는 아마도 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에서, 돌연변이된 ps1 유전자에 대해, 이 유전자는 바람직하게는 하기 실시예에 기재된 바와 같은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 미리 돌연변이된 트랜스진을 갖는 표적화 벡터와의 상동성 재조합체를 포함한다.
돌연변이된 APP 단백질을 발현하는 동물은 유전자 구조물을 접합체의 핵으로 미세주입함으로써 얻는다.
이중 트랜스제닉 동물은 돌연변이된 ps1 동물과 돌연변이된 APP 동물을 교배하여 얻는다.
본 발명에 따른 동물은 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알쯔하이머 질환의 치료를 위한 화합물의 신경보호 특성을 입증하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 화학적 분자, 펩티드 또는 단백질 분자, 항체, 키메라 분자 및 안티센스 RNA 또는 리보자임일 수 있다. 입증된 화합물들은 그 자체로서 또는 제약상 허용가능한 비히클과 조합하여 얻은 제약 조성물로서 의약품으로 사용될 수 있다. 상기 화합물들은 특히 등장성, 무균 염수 용액 (제1인산나트륨 또는 제2인산나트 륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이들 염의 혼합물)으로 사용되거나, 또는 경우에 따라서는 멸균수 또는 생리학적 염수를 가하여 주사가능한 용질을 녹일 수 있는 건조된, 특히 동결건조된 조성물로 사용될 수 있다. 주사는 정위(stereotactical), 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등으로 제공될 있다.
따라서, 본 발명의 다른 주제는
- 본 발명에 따른 동물에게 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합물을 투여하는 단계, 및
- 인간에서 관찰되는 신경병증을 재현하는 하나 이상의 특징적인 마커의 발생을 관찰하는 단계를 적어도 포함하는, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 주제는
- 본 발명에 따른 동물로부터 추출된 세포를 화합물 또는 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계, 및
- 전세포에 대한 상기 화합물의 효과를 세포 균질화액 중에서 또는 세포내 분획에 대해 측정하는 단계를 적어도 포함하는, 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 주제는 본 발명의 두 가지 동물들 중 하나로부터 유래된 임의의 생물학적 생성물, 및 신경퇴행성 질환, 바람직하게는 알쯔하이머 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는데 있어서 상기 생성물의 용도에 관한 것이다. "생물 학적 생성물"이라는 용어는 특히 세포, 단백질 추출물, DNA, RNA 또는 항체를 의미한다.
따라서, 본 발명의 주제는 상기 기술된 동물로부터 유래된 세포 또는 세포주, 특히 배아 줄기 세포이다.
또한, 본 발명의 주제는 위치 233에서 아미노산 M에서 T로의 돌연변이, 및 위치 235에서 아미노산 L에서 P로의 돌연변이를 갖는 마우스 PS1 단백질이다. 유리하게는, 이러한 단백질은 서열 2의 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 서열 3의 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 주제는 위치 233에서 아미노산 M에서 T로의 돌연변이, 및 위치 235에서 아미노산 L에서 P로의 돌연변이를 갖는 마우스 PS1 단백질을 코딩하는 핵산이다.
유리하게는, 청구항에 따른 이러한 핵산은 서열 1 또는 서열 8의 서열을 포함한다.
본 발명의 주제는 또한 이들 핵산에 상보적인 서열, 및 이들 핵산 또는 이들 핵산에 상보적인 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물의 신경보호 특성을 입증하는데 있어서 상기 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되지만, 본 발명이 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서, 기술된 결과는 PS1KI 마우스의 이점을 입증하며, PS1KIxAPP 마우스 모델이 현재까지 알려진 신경퇴행성 질환의 주요 특성을 나타내는 이점이 있기 때문에 치료 전략에서 상기 모델이 바람직하게 사용됨을 분명하게 지지한다.
도면의 설명
도 1A는 뮤린 ps1 유전자의 구조의 개요도 및 야생형 엑손 7 (상부 라인)과 사용된 표적화 벡터 (중간 라인) 주변의 주요 제한 부위의 개요도를 나타낸다. 엑손 7 (*)에서의 돌연변이인 코돈 돌연변이 M233T 및 L235P를 발생시키는 뉴클레오티드 염기 변화는 점선으로 표시한 프레임내에 나타나 있다. 네오마이신 (Neo) 내성 카세트를 함유하는 돌연변이된 대립유전자 PS1KI는 하부 라인 상에 나타나 있다. 신생물(newborn)을 확인하는데 사용된 230　bp 프로브의 위치가 또한 표시되어 있다.
도 1B는 230　bp 프로브를 사용하여 다양한 마우스에서 야생형 WT 대립유전자 (9.2　kb에서의 밴드)와 이종접합성 PS1KI (He, 이중 밴드) 및 동종접합성 PS1KI (7.4　kb에서의 Ho 밴드) 대립유전자를 구별하는 써던 블럿을 나타낸다.
도 1C는 PS1 단백질의 발현 수준이 PS1KI 대립유전자의 돌연변이의 존재에 의해 변화되지 않음을 나타내는 PS1의 C-말단 단편의 이뮤노블럿을 나타낸다.
도 2A, 2B 및 2C는 생후 2.5, 4, 6 및 10개월에서 각각 총 Aβ, Aβ42 및 총 Aβ/Aβ42 비율의 정량화를 나타낸다.
도 3은 APP751SLxPS1KI Ho 마우스에서 Aβ펩티드의 침착 과정의 가속화를 나 타낸다. 플레이트는 생후 6개월의 뇌에서 Aβ펩티드의 세포외 침착물의 영역 분포를 예시한다. 이 영상은 3 APP751SL 마우스 (도 3A, 3B 및 3C) 및 3 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 3D, 3E 및 3F)에서의 Aβ 면역표지화 (Aβ 4G8)를 나타낸다. 면역표지화는 생후 6개월의 APP751SL 마우스의 피질 (Cx) 및 해마 (Hp)에서 제1 침착물이 훨씬 드물게 생성됨을 입증한다. 비교로서, 동일 연령의 APP751SLxPS1KI Ho 마우스에서, 침착물의 수는 이들 영역에서 크게 증가한다. 상기 마우스에서 침착물은 주목할 만한 양으로 시상 (T)내에 이미 존재한다는 것을 유의해야 한다.
도 4는 연령에 따른 Aβ펩티드의 침착 과정의 진행을 나타낸다. 플레이트는 생후 10개월의 뇌에서 Aβ침착물의 영역 분포를 예시한다. 이 영상은 2 APP751SL 마우스 (도 4A 및 4B) 및 2 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 4C 및 4D)에 대응한다. APP751SL 마우스에서, 면역표지화는 생후 10개월의 피질 (Cx) 및 해마 (Hp)에서의 침착물의 수 및 크기가 생후 6개월의 시상에서의 제1 침착물의 생성 (도 3 참조)에 비해 상당히 증가했음을 입증한다. 또한, 침착물의 밀도 및 크기는 생후 10개월의 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 피질, 해마 및 시상에서 훨씬 더 크다. 이러한 마우스에서, 선조체 (St)에서 소량의 침착물이 검출될 수 있음을 유의해야 한다.
도 5는 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 CA1에서의 뉴런 사멸 과정을 나타낸다. 플레이트는 생후 10개월의 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 해마에서 영향을 받은 추체(pyramidal) 뉴런을 예시한다. 이 영상은 2 PS1KI Ho 마우스 (도 5A 및 5B), 2 APP751SL 마우스 (도 5C 및 5D) 및 2 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 5　E 및 5F)의 해마에서 크레실 바이올렛(Cresyl violet) 염색을 저배율로 나타낸다. 해마에서 추체 세포층의 밀도 및 두께는 정량적으로 생후 10개월의 APP751SL 마우스 및 PS1KI Ho 마우스에 필적한다. 한편, 동일한 연령에서, 상기 밀도 및 두께는 APP751SLxPS1KI Ho 마우스, 특히 암몬각(Ammon's horn; CA1)의 1번 층에서 분명하게 감소한다. 블루(blue)로 염색된 소세포 (아교세포 유형의 세포)의 수는 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 해마에서 증가하는 것처럼 보인다는 것을 유의해야 한다.
도 6은 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 CA1에서의 뉴런 사멸 과정을 나타낸다. 플레이트는 다른 뉴런 마커, 메틸 그린 및 BIP 면역표지화의 사용에 의해 생후 10개월에서 CA1에서의 영향을 받은 뉴런을 예시한다. 이 영상은 비-트랜스제닉 마우스 (도 6A), PKS1KI Ho 마우스 (도 6B), APP751SL 마우스 (도 6C) 및 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 6D)의 CA1에서 메틸 그린 염색을 고배율로 나타낸다. 상기 영상은 PS1KI Ho 마우스 (도 6E) 및 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 6F)의 CA1에서 BIP 면역표지화를 고배율로 나타낸다. 비-트랜스제닉 PS1KI Ho 및 APP751SL 마우스에 비해, 메틸 그린으로 염색된 뉴런 세포의 수는 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 CA1 영역에서 분명하게 감소되었다. 염색된 아교세포 유형의 세포가 이러한 이중 트랜스제닉 마우스의 해마 실질에서 상당수 검출되었음을 유의해야 한다. 또한, BIP 면역표지화에 의해, 생후 10개월의 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 CA1에서 추체 뉴런의 상당한 손실이 확인된다.
도 7은 CA1에서의 뉴런 사멸 및 Aβ 펩티드의 세포내 침착을 나타낸다. 플 레이트는 두 가지 병리학적 과정, 즉 생후 10개월에서 영향을 받은 뉴런 및 Aβ 펩티드의 비정상적 뇌내 축적을 예시한다. 이 영상은 2 APP751 마우스 (도 7A 및 7B) 및 2 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 7E 및 7F)의 CA1에서 Aβ 면역표지화를 고배율로 나타낸다. 상기 영상은 APP751 마우스 (도 7C 및 7D), APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 7G 및 7H) 및 2 PS1KI Ho 마우스 (7I 및 7J)의 CA1에서 크레실 바이올렛 염색을 고배율로 나타낸다. 생후 10개월에서, 단일 APP751SL 마우스 및 이중 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 둘 다에서, Aβ의 세포외 침착물은 주로 CA1에서 뉴런 층의 각 측면에서 관찰된다. 한편, CA1 (APP751SLxPS1KI Ho 마우스에서 층을 따라 존재하는 모든 뉴런에 대한 현저한 효과를 특징으로 함, 도 7C 및 7D)에서, 과립 모양을 갖는 Aβ 면역표지화 (Aβ펩티드의 비정상적 뉴런 내 축적에 상응함, 화살표 참조)는 APP751SLxPS1KI Ho 마우스에서 더 강한 것으로 보인다. 이는 또한 생후 6 개월에서도 사실이다 (도　8 참조).
도 8은 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 CA1에서 뉴런 사멸 과정의 초기 개시를 나타낸다. 플레이트는 생후 6개월에서 해마의 CA1 영역을 예시한다. 이 영상은 3 APP751 마우스 (8A, 8B 및 8C) 및 3 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (도 8G, 8H 및 8I)의 CA1에서 Aβ 면역표지화를 고배율로 나타낸다. 상기 영상은 APP751 마우스 (도 8D, 8E 및 8F) 및 APP751SLxPS1KI Ho 마우스 (8J, 8K 및 8L)에서 크레실 바이올렛 염색을 나타낸다. 생후 6개월에서, APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 해마의 CA1 영역은 이미 상당한 수의 세포외 Aβ 침착물 (도 8I), Aβ 의 강한 세포내 과립 표지화 (화살표 참조), 및 아교세포 유형 세포수 증가와 관련하여 크레실 바이올렛으로 염 색된 뉴런의 손실 (도 8L)을 특징으로 한다. 다른 두 APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 경우, 크레실 바이올렛으로 염색된 CA1 뉴런 층은 거의 붕괴되지 않거나 (도 8J) 또는 전혀 붕괴되지 않은 것으로 보인다 (도 8K). 이들 두 마우스의 경우, 세포내 Aβ면역표지화는 제3 마우스 (도 8I)에서보다 덜 강하고 더 확산되는 것처럼 보인다 (도 8G 및 8H)는 것을 유의해야 한다.
실시예 　1: 돌연변이 M233T 및 L235P 를 갖는 표적화 벡터의 구축
본 실시예의 목적은 잔기 233의 M을 T로 변화시키고, 잔기 235의 L을 P로 변화시키는 두 가지 돌연변이를 마우스 PS1 유전자의 엑손 7에 도입하는 것이다. 이들 새로운 두 코돈은 발병 초기의 알쯔하이머 환자 (FAD)에서 확인된 돌연변이에 대응한다.
크보크 (Kwok) 등의 문헌 [1997 Neuroreport 8; 157-42] 및 챔피온 (Champion) 등의 문헌 [1996, Neuroreport 7, 1582-4]에 기재된 것과 유사한 2-단계 돌연변이유발 전략을 이용해서, PS1 녹-인 (PS1KI) 마우스 라인을 생성시켰다.
이 전략은 뮤린 ps1 유전자 (도 1A 참조)의 코돈 233 및 235에서의 핵산 변화를 갖는 표적화 벡터를 구축하는 것을 목표로 한다.
요약하면, 람다 박테리오파지 (스트라타진(Stratagene), 카탈로그 번호 946313)에서 구축된 129SvJ 마우스 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 마우스 PS1 유전자의 17　kb 게놈 단편을 단리하였다. 제한 효소를 사용한 절단, 서열분석, 및 뮤린 PS1 유전자의 이용가능한 부분 서열과의 비교에 의한 분석 (문헌 [Mitsuda et al. 1997, JBC 272, 23489-97])에서는 상기 단편이 마우스 PS1 유전자의 인트론 5 내지 엑손 11의 영역을 함유한 것으로 나타났다. 인트론 5의 일부, 엑손 6, 인트론 6, 엑손 7, 및 인트론 7의 일부를 함유하는 9.8　Kb 크기의 BamHI-HindIII 소 단편을 플라스미드 pGEM-11Zf(+)(프로메가(Promega), France) (도 1A)내에 서브클로닝하였다. 엑손 7을 함유하는 DNA 단편 상에서 유전자 에디터(Gene Editor) 키트 (프로메가)를 사용해서 상기 두 2 코돈의 돌연변이유발을 수행하고, 뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인하였다.
엑손 6을 함유하는 7　Kb BamHI-XbaI 단편을 클로닝함으로써 상동성 재조합 벡터의 긴 (5') 아암(arm)을 얻었다. 짧은 (3') 아암은 돌연변이유발 처리된 엑손 7을 함유하는 1.8　Kb XbaI-EcoRI 단편을 서브클로닝함으로써 그 자체로 생성하였다. 엑손 7의 5'에 위치하는, -470 bp 위치의 인트론 6에 존재하는 XbaI 부위에 양성 선별 카세트 (pMCI-Neo 카세트)를 도입하였다 (도　1A 참조).
실시예 　2: PS1KI 를 포함하는 ES 세포의 제조
실시예 1에 기재된 표적화 벡터를 NotI을 이용한 소화에 의해 선형화하고, 프랑스 파리 파스퇴르 인스티튜트(Pasteur Institute)의 찰스 바비넷(Charles Babinet) 박사에 의해 제공된 배아 줄기 (ES) 세포주 CK35에 전기천공에 의해 도입하였다.
세포를 상기 기재된 바와 같이 배양하였다 (문헌 [W.　Wurtz and A.　Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Editor). Oxford University Press; 2nd edition (February　15, 2000)]).
동종 재조합이 일어나기 쉬운 430 개의 세포 클론을 G418의 존재하에 선택하였다. 이러한 클론의 게놈 DNA를 긴 아암 재조합 도메인 바깥에 위치한 PS1 프로브를 이용하여 상기 기재된 바와 같은 써던 블럿팅에 의해 분석하였다 (문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1989]) (도 1A). 이렇게 하여, PS1 유전자에 목적하는 돌연변이를 갖는 4 개의 세포 클론을 확인할 수 있었다. 이러한 세포 클론을 사용하여 PS1KI 트랜스제닉 마우스 라인을 확립하였다.
실시예 　3: PS1KI 마우스 라인의 구축
클론 18C5를 C57Bl/6 마우스의 배반포에 주입하였다. 수득된 5 마리의 키메라 마우스는 ps1 돌연변이 대립유전자를 종자주로 (따라서 그의 자손에게로) 전달하는 것으로 나타냈다. 이들 시조로부터, PS1KI 마우스 라인은 순수한 129SV 유전적 백그라운드 및 혼합된 129SV-C57Bl/6 백그라운드에 대해 확립되었다. 이형접합체 (He) 또는 동형접합체 (Ho) 상태에서 돌연변이된 PS1KI 대립유전자의 존재는 230 bp ps1 프로브를 이용한 써던 블럿팅에 의해 측정되었다 (도 1b). 돌연변이 마우스는 생존하였으며, 임신가능하였다.
실시예 　4: PS1KI 라인에서 PS1 의 검정
안락사 후에, 마우스의 뇌를 제거하고 칭량하였다. 한쪽 반구를 면역조직화학을 위해 보존하고 (후고정), 다른 쪽을 냉동시킨 후, 프로테아제 억제제 (컴플리트(Complete; 상표명), 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) 제품)의 칵테일을 함유하는 완충 용액 (0.32　M 수크로스, 4　mM 트리스-HCl, pH 7.4) 2 ml 중에서 포터 균질화기를 사용하여 얼음 상에서 각각 균질화시켰다. 단백질 농도를 BCA 법 (피어스(Pierce))에 의해 측정하였다. 균질화액을 -80℃에서 보존하였다.
PS1의 검출을 위하여, 뇌의 단백질 추출물 25 ㎍을 8 M 우레아 및 50 mM 디티오트레이톨을 함유하는 라엠리(Laemmli) 로딩 완충제 중에서 20분 동안 56℃에서 인큐베이션하였다. 단백질을 MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 완충제 중에서 NuPAGE 4 내지 12％ 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분획화하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 여과기 (프랑스 아머샴 제품)로 옮긴 후, 여과기를 PBS에서 5분 동안 가열하여 민감성을 증가시키고, 즉시 PBST (0.05％ PBS (V/V), 트윈 20) 완충제 중 5％ (w/v)의 분말 탈지유로 1시간 동안 포화시키고, PBST 완충제 단독 중 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 항체의 결합은 PBST 중에서 1/10,000의 희석률에서 양고추냉이 퍼옥시다제 (프랑스 아머샴 제품)에 접합된 항-IgG (항-마우스)를 이용하여 검출한 후, 제조사의 설명서에 따라 화학발광 (프랑스 아머샴 제품)에 의한 검출 시스템에 의해 검출하였다. PS1의 검출을 위하여, 1차 항체 MAB1563 (미국 케미콘 제품)을 1/10,000 희석률로 사용하였다. 반-정량적 분석을 위하여, 발광 신호를 진그놈(GeneGnome) 16 비트 CCD 카메라 (잉글랜드 캠브릿지 소재 신젠 제품)를 이용하여 디지털화하고, 진툴 소프트웨어 (신젠 제품)를 이용하여 분석하였다. 신호의 선형성은 레인 당 균질화액 2.5 내지 10 ㎍의 샘플로 수립된 표준 곡선을 이용하여 증명하였다.
면역블럿팅에 의한 이러한 분석은 PS1KI233/235 마우스에서 돌연변이된 PS1 의 C-말단 단편의 발현 수준이 여전히 정상이고 감소되지 않았다는 것을 측정할 수 있게 하였다 (도 1C).
실시예 5: PS1KI 라인 및 APP 라인의 교배에 의한 PS1KIxAPP 라인의 제조
PS1KI 마우스 (실시예 1 내지 4에 기재된 것)를 Thy-1 프로모터의 제어하에, 스웨덴 (돌연변이 K670N; M671L) 및 런던 (V717I) FDA 돌연변이를 갖는 APP751 cDNA의 인간 형태를 과발현하는 트랜스제닉 마우스 라인과 교배시켰다. 돌연변이를 갖는 APP751 cDNA의 인간 형태를 과발현하는 마우스는 특허 출원 WO 01/20977호에 기재된 바와 같이 수득하였다.
다음의 모든 실험에서, 동일한 유전적 백그라운드를 갖는 마우스를 사용하여 유전적 백그라운드의 다양성으로 인한 임의의 효과를 최소화하였다.
실시예 6: 면역전기화학발광 방법에 의한 전체 Aβ 및 Aβ42 아밀로이드 펩티드의 검정
뇌에서 Aβ의 전체 풀을 정량화하기 위하여 (가용성 형태 및 응집된 또는 불용성 형태), 분취량의 뇌 균질화액을 50 mM 트리스, pH 7.4 중에서 구아니딘 히드로클로라이드 (GH)의 9 M 용액 2 부피로 처리하였다. 균질화액을 15분의 초음파처리를 3 주기로 하여 1시간 동안 혼합한 후, 4℃에서 2시간 동안 50,000 g에서 원심분리하였다. 구아니딘 추출물을 150　mM NaCl, 0.5％ BSA (w/v) 및 0.05％ 트윈 20 (w/v)을 함유하는 pH 7.6의 20 mM 트리스-Hcl 완충제 중에서 1/20으로 희석하였다. 그 후, 코르코바(Khorkova) 등에 따라 개질된 프로토콜에 따라 (문헌 [J. Neurosci. Methods 82, 159-166 (1998)]), 분획 중 Aβ 펩티드의 농도를 2개의 항-Aβ 펩티드 마우스 모노클로날 항체 (4G8 및 6E10) 및 오리겐 M8 분석기 판독기 (옥스포드 IGEN 유럽 인코포레이션(Europe Inc.) 제품)를 사용하여 면역전기화학발광 (문헌 [Yang et al., 1994, Biotechnology (NY) 12(2), 193-194])에 의해 측정하였다.
Aβ 펩티드의 잔기 17 내지 24 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 4G8 (세네텍(Senetek) PLC)을 공급자의 프로토콜에 따라 TAG-NHS 에스테르 (옥스포드 IGEN 유럽 인코포레이션 제품)를 이용하여 루테닐화하였다. Ru-4G8 및 바이오티닐화 항체 6E10, Aβ 펩테드의 에피토프 1 내지 10 (세네텍 PLC 제품)을 뇌의 가용성 분획과 접촉시키고, Ru-4G8/Aβ/6E10-비오틴의 3원 착체를 오리겐 판독기를 사용하여 정량하였다. 합성 펩티드 Aβ (바쳄) 류를 사용하여 각각의 실험을 보정하였다. 펩티드 Aβ의 양을 뇌 조직의 초기 중량 g 당 나노그램으로 계산하였다.
위치 42에서 종결되는 Aβ 펩티드 (Aβ42)의 형태를 구체적으로 측정하기 위하여, 항체 6E10을, Aβ42 C-말단에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 22F9와 대체하였다 (문헌 [Wirths et al., 2002, Brain Pathol. 12, 275-286]).
따라서, ps1 녹-인 (PS1-KI) 유전자의 존재는 다음과 같은 현상을 야기하였다:
- PS1KI 대립유전자가 동형접합체 상태로 존재할 때 훨씬 더 현저한 효과 (유전자량 효과)를 가지면서, 뇌에서 Aβ (도 2A) 및 Aβ42 (도 2B)의 축적의 가속화. PS1KI(Ho)의 효과는 이전에 출원 WO 01/20977호에 기재된 PS1M146L을 과발현 하는 트랜스제닉 마우스가 갖는 효과보다 더 두드러진 것이다.
- 도 2C에 도시된 바와 같이, PS1KI 돌연변이가 동형접합체 상태일 때, 대부분의 Aβ인 β42 말단을 나타내는 Aβ 펩티드의 비율의 대폭 증가 (Aβ42/전체 Aβ 비율이 생후 2½개월에 0.92인 반면, PS1KI가 없는 경우에는 0.25이고, 하나의 PS1KI 대립유전자만이 존재하는 경우에는 0.70임; 유전자량 효과). β42 말단으로 종결되는 Aβ 펩티드의 종이 펩티드의 대부분의 병리학적 형태라는 것은 문헌에서 인식되어 있다. 따라서, PS1KIxAPP 라인은 병리학적 형태가 특히 강화된 모델을 나타낸다.
실시예 7: 면역조직화학에 의한 Aβ 펩티드의 침착의 분석
면역조직화학/조직학 실험을 위하여, 반뇌를 제거하고, 4％ 파라포름알데히드에 후고정시킨 후, 20％ (P/V) 수크로스를 함유하는 0.2 M 나트륨 포스페이트 완충제 (NaH2PO4.2H2O/Na2HPO4.12H2O, pH 7.4) 중에서 밤새 4℃에서 동결보호시켰다. 그 후, 이것을 1분 동안 드라이 아이스 중에서 -30℃의 온도로 유지된 이소펜탄 중에서 냉동시켰다. -30℃로 자동 온도 조절되는 저온조 (LEICA CM3000)에서 절단된 25 μm 두께의 절편을 마지막으로 0.02 M PBS 완충제에 정치시킨 후, 4℃에서 보존하였다.
이들 절편에 대해, 아비딘에 커플링된 양고추냉이 퍼옥시다제가 바이오티닐화된 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 착체 (ABC)의 형성을 포함하는 레벨레이션 시스템 (revelation system)을 이용하여 Aβ 펩티드의 면역효소 검출을 수행하였다. 즉, 차단 완충제 (0.1％ 트리톤 (시그마 제품)을 함유하는 PBS 중 10％의 정상 염소 혈청) (케미콘 제품) 중에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 뇌 절편을 0.3％ H2O2 용액과 접촉시켜 조직에 존재하는 엔도퍼옥시다제를 제거하였다. 그 후, 이들 절편을 0.3％ 트리톤 및 2％ 정상 혈청을 함유하는 1차 항체 용액 중에서 (밤새도록 4℃에서) 인큐베이션하였다. 사용된 항-Aβ 1차 항체 (4G8, 세네텍 제품) (Aβ 펩티드의 잔기 17 내지 24에 대해 지정된 모노클로날 항체)는 바이오티닐화되었다. 따라서 절편을 세정 후, 제조사의 설명서 (벡타스틴 ABC 키트(Vectastin ABC Kit), 벡터 래버러터리즈(Vector Laboratories), 캐나다 버링검 소재)에 따라, ABC 착체와 1시간 동안 직접 접촉시켰다. 3,3'-디아미노벤지딘을 퍼옥시다제 효소에 대한 색소유전자로서 사용하였다.
따라서, 반뇌 균질화액에 대한 생화학적 검정에 의해 미리 검출된, APP751SLxPS1KI Ho 이중 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 Aβ 펩티드의 비정상적인 축적의 가속화를 면역조직화학에 의해 확인하였다. 구체적으로, 반뇌 절편에 대해 얻은 Aβ 면역표지의 현미경 분석은 이러한 마우스의 뇌 실질에서 Aβ 펩티드의 침착의 가속화된 과정이 존재함을 증명하였다. 실제로, 피질 및 해마에서의 첫번째 침착이 APP751SL 마우스에서는 생후 약 6개월쯤에 나타나지만 (도 3), 동형접합체 상태의 APP751SLxPS1KI 이중 트랜스제닉 마우스에서는 생후 2개월부터 검출될 수 있다. Aβ 침착물의 밀도는 APP751SL 단일 트랜스제닉 마우스에 비하여 생후 6개월 이중 트랜스제닉 마우스 (APP751SLxPS1KI Ho)의 해마 및 피질에서 확실히 크다. 또한, 침착물은 보다 광범위하게 분포되어 있으며, 특히 침착물은 시상 뿐만 아니라, 교뇌에서 이미 검출되었다 (도 3).
연령이 증가할수록, 특히 생후 10개월에 APP751SL 단일 트랜스제닉 마우스의 뇌에서 침착물의 밀도 및 크기가 증가하였다 (도 4). 또한 이러한 침착물은 시상에 존재하기 때문에, 그의 분포가 넓었다. 생후 10개월 APP751SLxPS1KI Ho 이중 트랜스제닉 마우스에서, 유사하게 진행되는 Aβ 펩티드의 침착 과정이 해마, 피질, 시상 및 교뇌에서 관찰되었다. 첫번째 침착은 선조체에서 제한된 개수로 검출될 수 있다 (도 4). 반면, 소뇌는 Aβ 침착의 진행에 의해 손상되지 않은 채 남아있었다. 생후 10개월 PS1KI Ho 마우스 (n = 4)의 뇌에서는, Aβ 펩티드의 침착이 없는 것으로 검출되었다는 것을 인지해야 한다.
실시예 8: 조직학 및 면역조직화학에 의한 뉴런 손실의 분석
매우 높은 비율의 병리학적 Aβ42 펩티드의 존재가, APP751SLxPS1KI Ho 라인에서 Aβ 펩티드의 침착 과정의 가속화 뿐만 아니라, 연령에 따른 뉴런 손실을 야기하는 지에 대해 분석하게 하였다. 이것을 위하여, 뇌 조직 절편 상에서 뉴런 세포의 손실을 가시화할 수 있게 하는 3가지 유형의 염색을 수행하였다: a) 니슬 소체 (조면 소포체의 리보솜과 관련된 세포질 소기관)를 염색하고, 뇌 절편 상에서 모든 뉴런 및 아교 세포를 표시할 수 있게 하는 크레실 바이올렛을 이용한 조직학; b) 모든 세포의 DNA를 염색하는 메틸 그린을 이용한 조직학; c) 소포체의 정주 샤프론 단백질의 세포에서의 발현을 지시하는 BIP를 이용한 면역조직화학.
크레실 바이올렛 염색을 위하여, 뇌 조직 절편을 젤라틴화된 슬라이드 상에 놓은 후, 증류수 중 0.5％의 크레실 바이올렛 (C1791, 시그마 제품)의 용액 중에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 산성 매질에서 세정한 후, 마지막으로 절편을 탈수시켰다.
메틸 그린 염색을 위하여, 절편을 젤라틴화된 슬라이드 상에 놓고, 증류수 중 1％의 메틸 그린 (M5015, 시그마 제품)의 용액 중에서 10분 동안 인큐베이션하고, 세정한 후, 탈수시켰다.
BIP 면역조직화학 (폴리클로날 항체, SPA-826, 스트레스젠 제품)을 위하여, 프로토콜은, 절편을 ABC 착체 중에서 인큐베이션하기 전에 바이오티닐화 2차 항체 (염소에서 만들어진 항-토끼 IgG 항체, 벡터 제품)의 용액 중에서 추가로 인큐베이션 (1시간, 주위 온도)한 것을 제외하고는, Aβ 펩티드 면역조직화학 (상기 참조)에 대해 적용된 것과 동일하였다.
현미경 분석으로 다양한 조직학/면역조직화학 마커의 사용을 통해, APP751SLxPS1KI Ho 마우스의 뇌 (n = 3/3)에서 해마, 특히 CA1의 피라미드 세포층의 두께가 감소되었음을 증명하였다 (도 5 및 6). 이러한 감소는 생후 10개월에 이미 잘 입증되었던 뉴런 사멸의 과정이 존재함을 지시하였다. 생후 6개월에, 뉴런 사멸이 1/3의 마우스의 뇌에 존재하였으며, 이는 신경독성 과정의 조기 개시를 암시하였다 (도 8). 두가지 병리학적 과정, 즉 뇌 및 감염된 뉴런에서 Aβ 펩티드의 비정상적인 축적을 해마, 특히 CA1에서 동시 분석한 결과, 세포외 침착에서의 축적보다 Aβ의 세포내 축적의 신경독성 과정 (Thy-1APP751SLxPS1 M146L 마우스에서 이미 기재된 현상)이 보다 유력한 역할을 한다는 것을 제시한다 (도 7). 실제 로, CA1에 여전히 존재하는 뉴런은 Aβ 펩티드를 비정상적으로 높게 발현하는 것으로 나타났다. 또한, CA1에서 뉴런에 대한 효과는 세포외 침착이 없는 영역에서 확실히 나타났다. CA1에서의 뉴런 사멸의 과정에 가능한 유전자량 효과가 존재한다는 것을 인지해야 한다. 뉴런에 대한 효과는 단지 하나의 PS1KI 대립유전자를 갖는 매우 늙은 (생후 15개월이 넘은) APP751SLxPS1KI 마우스에서도 발견되었다.
SEQUENCE LISTING <110> AVENTIS PHARMA S.A. <120> ANIMAUX TRANSGENIQUES EXPRIMANT DES MUTANTS DE PS1 ET APP PRESENTANT LES TROUBLES MAJEURS LIES A LA MALADIE D?LZHEIMER <130> PRJ03034 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atcagtgccc tcacggcacc ggtattt 27 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ile Ser Ala Leu Thr Ala Pro Val Phe 1 5 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Thr Glu Ile Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met 1 5 10 15 Ser Glu Asp Ser His Ser Ser Ser Ala Ile Arg Ser Gln Asn Asp Ser 20 25 30 Gln Glu Arg Gln Gln Gln His Asp Arg Gln Arg Leu Asp Asn Pro Glu 35 40 45 Pro Ile Ser Asn Gly Arg Pro Gln Ser Asn Ser Arg Gln Val Val Glu 50 55 60 Gln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys 65 70 75 80 His Val Ile Met Leu Phe Val Pro Val Thr Leu Cys Met Val Val Val 85 90 95 Val Ala Thr Ile Lys Ser Val Ser Phe Tyr Thr Arg Lys Asp Gly Gln 100 105 110 Leu Ile Tyr Thr Pro Phe Thr 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tacccactga tggtaatgct ggcctgctgg ctgaacccca gattgccatg 120 ttctgtggca gactgaacat gcacatgaat gtccagaatg ggaagtggga ttcagatcca 180 tcagggacca aaacctgcat tgataccaag gaaggcatcc tgcagtattg ccaagaagtc 240 taccctgaac tgcagatcac caatgtggta gaagccaacc aaccagtgac catccagaac 300 tggtgcaagc ggggccgcaa gcagtgcaag acccatcccc actttgtgat tccctaccgc 360 tgcttagttg gtgagtttgt aagtgatgcc cttctcgttc ctgacaagtg caaattctta 420 caccaggaga ggatggatgt ttgcgaaact catcttcact ggcacaccgt cgccaaagag 480 acatgcagtg agaagagtac caacttgcat gactacggca tgttgctgcc ctgcggaatt 540 gacaagttcc gaggggtaga gtttgtgtgt tgcccactgg ctgaagaaag tgacaatgtg 600 gattctgctg atgcggagga ggatgactcg gatgtctggt ggggcggagc agacacagac 660 tatgcagatg ggagtgaaga caaagtagta gaagtagcag aggaggaaga agtggctgag 720 gtggaagaag aagaagccga tgatgacgag gacgatgagg atggtgatga ggtagaggaa 780 gaggctgagg aaccctacga agaagccaca gagagaacca ccagcattgc caccaccacc 840 accaccacca cagagtctgt ggaagaggtg gttcgagagg tgtgctctga acaagccgag 900 acggggccgt gccgagcaat gatctcccgc tggtactttg atgtgactga agggaagtgt 960 gccccattct tttacggcgg atgtggcggc aaccggaaca actttgacac agaagagtac 1020 tgcatggccg tgtgtggcag cgccattcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt 1080 gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa 1140 gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag 1200 gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc 1260 caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag 1320 acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac 1380 tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag 1440 aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg 1500 cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt 1560 gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc 1620 gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac 1680 gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca 1740 tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg 1800 gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac 1860 gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt 1920 tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaatctgga tgcagaattc 1980 cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg 2040 ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg 2100 atcatcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg 2160 gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac 2220 ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaac 2265 <210> 7 <211> 751 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr 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Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Ile Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr 340 345 350 Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu 355 360 365 His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg 370 375 380 Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln 385 390 395 400 Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe 405 410 415 Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln 420 425 430 Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp 435 440 445 Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val 450 455 460 Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg 465 470 475 480 Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val 485 490 495 Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met 500 505 510 Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu 515 520 525 Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp 530 535 540 Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn 545 550 555 560 Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro 565 570 575 Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly 580 585 590 Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp 595 600 605 Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg 610 615 620 Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr 625 630 635 640 Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe 645 650 655 Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 660 665 670 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val 675 680 685 Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile Thr Leu Val Met Leu 690 695 700 Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp 705 710 715 720 Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn 725 730 735 Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 740 745 750 <210> 8 <211> 221 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg 60 gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca 120 ggcgtatctc attatgatca gtgccctcac ggcaccggta tttatcaagt acctccccga 180 atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 221 <210> 9 <211> 221 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg 60 gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca 120 ggcgtatctc attatgatca gtgccctcat ggccctggta tttatcaagt acctccccga 180 atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 221

Claims (28)

  1. 마우스 PS1 단백질 상의 돌연변이 M233T 및 L235P에 상응하는 돌연변이를 하나 이상 갖는 프리세닐린 1 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 발현하는 비-인간 동물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이가 동형접합체 상태에 있는 것을 특징으로 하는 동물.
  3. 제1항에 있어서, 두가지 돌연변이를 모두 갖는 것을 특징으로 하는 동물.
  4. 제1항에 있어서, APP를 코딩하는 유전자의 전부 또는 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물.
  5. 제1항에 있어서, 돌연변이된 PS1을, 비-돌연변이된 PS1을 발현하는 동물의 내인성 PS1의 양에 필적하는 양으로 발현하는 것을 특징으로 하는 동물.
  6. 제1항에 있어서, 돌연변이 M233T 및 L235P를 갖는 프리세닐린 1 단백질이 뮤린 기원인 것을 특징으로 하는 동물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 APP 단백질이 APP751이고, 인간 기원인 것을 특징으로 하는 동물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 APP751 단백질이 인간 기원이고, 돌연변이 K651N, M652L 및 V698I를 나타내는 것을 특징으로 하는 동물.
  9. 제1항에 있어서, 설치류인 것을 특징으로 하는 동물.
  10. 제9항에 있어서, 마우스, 래트 또는 토끼인 것을 특징으로 하는 동물.
  11. 제1항에 있어서, 서열 2를 포함하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 동물.
  12. 제1항에 있어서, 게놈 내에 핵산 서열 1을 나타내는 것을 특징으로 하는 동물.
  13. 제4항에 있어서, APP를 코딩하는 유전자의 발현이 외인성 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 동물.
  14. 제1항에 있어서, 뉴런 손실을 나타내는 것을 특징으로 하는 동물.
  15. 제1항에 있어서, Aβ42/전체 Aβ 비율이 0.9 초과인 것을 특징으로 하는 동물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이된 프리세닐린 1 단백질이 내인성인 것을 특징으로 하는 동물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 청구된 동물로부터 유래된 세포주.
  18. M233T- 및 L235P-돌연변이된 형태의 뮤린 프리세닐린 1 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포주.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 청구된 동물로부터 유래된 배아 줄기 세포.
  20. 위치 233에서 아미노산 M에서 T로의 돌연변이, 및 위치 235에서 아미노산 L에서 P로의 돌연변이를 갖는 마우스 PS1 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 서열 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  22. 위치 233에서 아미노산 M에서 T로의 돌연변이, 및 위치 235에서 아미노산 L에서 P로의 돌연변이를 갖는 마우스 PS1 단백질을 코딩하는 핵산.
  23. 제22항에 있어서, 서열 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  24. 제23항에서 청구된 핵산을 포함하는 벡터.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 청구된 동물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머 질환을 치료하기 위한 화합물을 입증하는 방법.
  26. - 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합물을 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 청구된 동물에게 투여하는 단계, 및
    - 인간에서 관찰되는 신경병증을 재현하는 하나 이상의 특징적인 마커의 발생을 관찰하는 단계를 포함하는,
    신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는 방법.
  27. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 청구된 동물로부터 추출된 세포를 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합물과 접촉시키는 단계, 및
    - 전세포에 대한 상기 화합물의 효과를 세포 균질화액 중에서 또는 세포내 분획에 대해 측정하는 단계를 포함하는,
    신경퇴행성 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는 방법.
  28. 제20항 또는 제21항에서 청구된 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는, 알쯔하이머 질환의 치료를 위한 화합물을 입증하는 방법.
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