PT1670309E - Animais transgénicos com distúrbios graves relacionados com a doença de alzheimer - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANIMAIS TRANSGÉNICOS COM DISTÚRBIOS GRAVES RELACIONADOS COM A DOENÇA DE ALZHEIMER" 0 presente pedido refere-se a animais transgénicos modelos da doença de Alzheimer (AD). Tem como outro objectivo a utilização destes animais. A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa progressiva que afecta uma grande proporção da população idosa. Esta doença é caracterizada no plano clínico por uma perda de memória e um declíneo das funções cognitivas e no plano neuropatológico por uma perda neuronal pronunciada e a presença no cérebro de depósitos neurofibrilares intracelulares e de depósitos extracelulares do péptido β-amilóide (Αβ) formando as placas amilóides.

As placas amilóides são maioritariamente compostas por péptidos Αβ de 40 ou 42 resíduos que são produzidos durante o processo proteolítico do precursor do péptido Αβ (APP). Os depósitos extracelulares de Αβ são muito específicos dos distúrbios associados à doença de Alzheimer. Representam a característica precoce e invariável de todas as formas da doença de Alzheimer, incluindo as formas familiares (FAD). As formas familiares aparecem de modo relativamente precoce (entre 30 e 60 anos) e são devidas a mutações no gene de APP em 5% dos casos de FAD com oito mutações sem sentido simples ou duplas identificadas, no gene da pré-senilina 1 (PS1) em 50 a 70% dos 1 casos de FAD com mais de 100 mutações diferentes identificadas até à data e no gene da pré-senilina 2 nos casos mais raros de FAD com duas mutações sem sentido descritas. Mostrou-se que as mutações nestes três genes induzem alterações na proteólise de APP, que conduzem a uma sobre-produção de Αβ, especialmente da forma longa Αβ42 e ao aparecimento precoce da patologia e dos sintomas semelhantes a estas duas formas esporádicas da doença de Alzheimer.

Os modelos animais destinados a representar certas características da patologia da doença de Alzheimer foram já descritos na literatura.

Trata-se de uma parte de murganhos transgénicos portadores de mutações no gene APP. Desenvolvem patologias semelhantes à doença de Alzheimer a partir de um ano. Deste modo, os murganhos PDAPP, sobre-expressam a APP humana portadora da mutação V717F, desenvolvem, com a idade, depósitos de Αβ no cérebro mas não apresentam perda neuronal para além da localização das próprias placas (Irizarry et ai., 1997, J. Neurose. 17(18): 7053-7059). Chama-se a este fenómeno «efeito placa».

Deste modo, os murganhos Tg(HuAPP695. K670N-M671L)2576, que expressam a isoforma humana APP K670N-M67IL (APPSw pela mutação do tipo Swedish), apresentam depósitos tipo amilóides mas não apresentam perda neuronal (Irizarry et ai., 1997, J. Neuropathol. Exp. Neurol 56 : 695-973).

Num estudo de Calhoun et ai. (1998, Nature 395: 755-756), foi demonstrada uma perda neuronal em certas regiões cerebrais na proximidade das placas amilóides, nos murganhos transgénicos APP23 de 14-18 meses de idade que expressam uma isoforma mutada 2 de APP humana. Esta observação é controversa uma vez que a perda é fraca e intervém nos animais relativamente idosos e, sobretudo, na proximidade das placas, o que poderia corresponder ao «efeito placa» observado anteriormente. Além disso, esta não é pouco ou sequer mencionada num comentário recente que sublinha que os modelos animais actuais não apresentam uma semelhança total com todas as caracteristicas conhecidas das patologias da doença de Alzheimer, entre outras, a perda neuronal (Trojanowski, 2002, Am. J. Pathol. 160: 409-411).

Por outro lado, conhecem-se murganhos transgénicos portadores de mutações no gene PS1. Estes não parecem desenvolver patologia do tipo doença de Alzheimer mas apresentam uma quantidade elevada de péptido Αβ42 (aumento de um factor de 2 em relação aos PS1 selvagens) que é reconhecido como altamente patogénico.

Além disso, nos modelos animais transgénicos descritos portadores de mutações FAD P264L ou M146L no gene PS1 de murganhos («activados»), a proteína PS1 mutada não é expressa de forma estável (Siman et ai., 2000, J. Neurosci., 20: 8717-8726; Flood et al., 2002, Neurobiol. Aging 23: 335-348; Rozmahel et al., 2002, 23:187-194). Estes murganhos apresentam, também, uma quantidade elevada de péptido Αβ42. O pedido WO 02/0008407 descreve murganhos transgénicos em que o gene que codifica a pré-senilina 1 foi mutado pela introdução de uma mutação P264L.

Huang et al. (Exp. Neurol., vol. 183, N° 2, Out 2003, pp 673-681) descreve murganhos transgénicos, aparentemente 3 heterozigóticos que expressam a proteína PS 1 humana com a mutação L235P.

Uma ligação possível entre as mutações respectivas M233T e L235P de PS1 1 e as formas precoces da doença de Alzheimer é evocada pela literatura (Kwok et al., Neuroreport 14 de Abril de 1997, vol 8, N° 6, pp 1537-1542 e Campion et al., Neuroreport 1996 RU, vol 7, N° 10, 1996, ppl582-1584).

Devido ao papel da proteína PS1 na formação das formas Αβ42, foram também produzidos murganhos duplos transgénicos portadores de mutações nos genes APP e PS1. Como os simples transgénicos descrito mais acima, estes murganhos apresentam depósitos de Αβ mas não apresentam perda neuronal (Takeuchi et al., 2000, Am. J.

Pathol. 157: 331-339).

Deste modo os modelos animais da doença de Alzheimer que existem não são satisfatórios uma vez que não reproduzem uma perda neuronal que é, contudo, uma característica principal das doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. A requerente direccionou-se deste modo para a produção de animais que apresentem características principais da doença de Alzheimer, como a perda neuronal.

Esta mostrou que era possível obter tais animais introduzindo mutações específicas no gene que codifica a proteína PS1 em murganhos e cruzando-os com murganhos que sobre-expressam o gene humano de APP.

Um primeiro aspecto da invenção refere-se assim a um animal não humano que apresenta, vantajosamente no seu genoma, através 4 de uma sequência de ácido nucleico que codifica para a pré-senilina 1 portadora das duas mutações correspondentes às mutações M233T e L235P na proteína PS1 de murganhos, no estado de homozigótico.

De um modo preferido, a proteína PS1 portadora das mutações M233T e L235P é de origem murina.

De um modo particularmente preferido, a proteína pré-senilina 1 mutada é endógena.

Deste modo, um animal de acordo com a presente invenção produz, vantajosamente, uma proteína que compreendem a sequência SEQ ID N° 2. Ele produz, de um modo preferido, uma proteína que apresenta a sequência SEQ ID N °3. Compreende, vantajosamente, no seu genoma a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1 ou a sequência SEQ ID N° 8.

As sequências SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 8 resultam respectivamente de mutações introduzidas nas sequências selvagens SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 9. A sequência SEQ ID N° 5 é a dos resíduos 229 a 237 da proteína pré-senilina 1 selvagem de murganhos. A sequência SEQ ID N° 9 é a do exão 7 selvagem do gene de murganhos que codifica a proteína pré-senilina 1, i. e., não mutada.

Vantajosamente, um animal de acordo com a presente invenção co-expressa a APP, de um modo preferido a APP humana. Um tal gene pode compreender uma ou várias mutações FAD. Deste modo, as mutações no gene de APP podem ser uma das diferentes mutações descritas até ao presente na literatura. As mutações no gene de 5 APP podem ser seleccionadas das mutações "Swedish" (S), "London" (L) e "Dutch" (D) sós ou em combinação.

Estas mutações são bem descritas na literatura e são caracterizadas de um modo geral pelas modificações seguintes:

Natureza e posição Mutação Swedish Mutação Dutch Mutação London em relação com a APP770 K 670 N e M 671 L E 693 Q e/ou A 692 G V 717 I em relação com a APP751 K 651 N e M 652 L E 674 Q e/ou A 673 G V 698 I em relação com a APP695 K 595 N e M596L E 618 Q e/ou A 617 G V 642 I em relação ao péptido Α-β (A42) E 22 Q e/ou A 21 G V 46 I São igualmente compreendidas por mutação London todas as substituições para além da isoleucina que estão situadas na posição 717 por referência a APP770, tais como, por exemplo, as mutações V 717 G e V 717 F.

Entende-se que a APP utilizável no quadro no âmbito da invenção, pode estar sobre diferentes isoformas e, em particular, nas formas 695, 751 e 770 ou numa forma truncada tal como, por exemplo, a isoforma APP99, que exclui a mutação Swedish para esta última.

De um modo vantajoso, o referido animal compreende, ainda, vantajosamente no seu genoma, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para a totalidade ou parte do gene que codifica para APP751. De um modo vantajoso, a proteína APP751 é de origem humana. Esta apresenta de um modo preferido as mutações K670N e M671L (Swedich) e V717I (London). 6

No âmbito da presente invenção, o gene de APP é vantajosamente colocado sob o controlo de sequências que permitem a sua expressão forte nos neurónios e, em particular, de sequências promotoras da transcrição, tal como um promotor exógeno. Como exemplo de sequências promotoras, pode citar-se muito em particular o promotor HMG (Gautier et al. (1989),

Nucleic Acids Res 17: 20, 8389.), assim como o promotor PDGF (Sasahara et al. (1991), Cell 64, 217-27), o promotor Thy-1 (Luthi e al (1997), J Neurosci 17, 4688-99) e o promotor do gene do Prion (Scott e al (1992), Protein Sei 1, 986-97).

De acordo com uma forma de realização particularmente interessante da invenção, o modelo animal compreende o gene de APP possuindo as mutações S, D e/ou L, colocadas sob o controlo do promotor Thyl.

Deste modo, um animal de acordo com a presente invenção produz, de um modo preferido, uma proteína que compreende a sequência SEQ ID N° 7. Pode apresentar a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N° 6.

De um modo preferido, trata-se de um murganho transgénico derivado do cruzamento entre um murganho transgénico ThyAPP (TG53) portador de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína humana APP751SL e um murganho transgénico portador de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína PS1 de murganhos portadores das mutações M233T e L235P.

Os animais de acordo com a presente invenção reproduzem pela primeira vez, uma das características mais importantes das doenças neurodegenerativas, que é a perda neuronal de forma precoce. 7

Apresentam, também, as outras características classicamente descritas destas patologias. Os animais apresentam uma deposição acelerada das placas amilóides claramente visível desde os 2 meses de idade e de forma marcada aos 6 meses.

Apresentam, também, uma relação das formas Αβ42 para Aptotal, Αβ42/Αβ superior a cerca de 0,9 e isto desde os 2,5 meses. Uma relação destas é muito elevada em relação à que é descrita na literatura para outros murganhos transgénicos. A perda neuronal, já visível nos murganhos com a idade de 6 meses, é nitidamente pronunciada aos 10 meses. A PKR (Cinase de Proteína dependente de ARN de cadeia Dupla) é uma cinase activada pelo stresse e que fosforila eIF2, implicada na apoptose. A PKR é detectada no hipocampo (a estrutura ou um local de perda neuronal) de murganhos APPxPSIKI de acordo com a invenção com a idade de 10 meses. Esta não é detectada no hipocampo de murganhos transgénicos APPxPSlM146L com a idade de 12 meses nos quais também não se observa nenhuma perda neuronal.

As novas características dos animais de acordo com a presente invenção tornam estes modelos de estudo mais completos e representativos dos problemas do que os anteriormente descritos. Estes animais são, deste modo, particularmente adaptados para colocar em evidência as propriedades neuroprotectoras dos compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas, de um modo preferido, da doença de Alzheimer.

De um modo preferido, os animais de acordo com a presente invenção possuem os alelos mutantes de psl no estado homozigótico e os de APP no estado heterozigótico. Contudo, as mesmas caracteristicas do referido animal podem ser descritas num animal possuindo um dos dois alelos da psl mutado no estado heterozigótico e os de APP no estado heterozigótico, contudo, com um fenótipo menos marcado ou aparecendo mais tardiamente.

Uma outra vantagem dos animais de acordo com a presente invenção é que a taxa de proteína PS1 mutada expressa por estes murganhos transgénicos é equivalente às taxas de proteína PS1 endógena normalmente expressa por um murganho normal (não transgénico) , que expressa uma PS1 não mutada. Esta característica torna um modelo de estudo vantajoso - sem sobre-expressão da proteína PS1 - para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas.

Estes compostos podem ser, nomeadamente, compostos possuindo uma acção sobre a regulação do gene PS1 ao nível transcricional, pós-transcrição, da tradução, pós-tradução ou sobre a própria proteína PS1 modificando ou regulando uma ou várias das suas propriedades, ou possuindo uma acção semelhante sobre os parceiros de interacção ou os alvos da proteína PS1 ou, ainda, compostos possuindo uma acção sobre a regulação de APP e de forma mais vasta de todas as moléculas a jusante dos sinais iniciados por PS1 e APP ao durante o processo neurodegenerativo.

No âmbito da presente invenção, os animais são vantajosamente mamíferos, tais como roedores. Em particular, pode tratar-se de um murganho, de um rato ou de um coelho. 9

Os murganhos e as construções que permitem a sua obtenção são obtidos através de métodos conhecidos do especialista da técnica.

Estes podem ser obtidos segundo as técnicas clássicas de transgénese. A titulo de exemplo, ilustrando um dos processos de transgénese, pode citar-se o método de electroporação de uma construção génica contendo os genes modificados nas células de estirpes embrionárias de murganhos e, após selecção, transferência das células portadoras do evento nos exemplos. A este respeito, os animais PS1 mutados de acordo com a invenção são obtidos por electroporação de uma cassete de expressão que compreende um ácido nucleico. De um modo preferido, este ácido nucleico é um ADN que pode ser um ADN genómico (ADNg) ou um ADN complementar (ADNc). A modificação do genoma pode resultar de uma alteração ou uma modificação de um ou vários genes por «activação». Esta modificação pode ser devida à acção de agentes alterantes ou mutagénicos clássicos ou pode, ainda, ser realizada por mutagénese dirigida. Na presente invenção, no que refere-se a ao gene psl mutado, trata-se, de um modo preferido, de uma recombinação homóloga com um vector dirigido, portador do transgene previamente mutado por mutagénese dirigida, tal como descrita nos exemplos que se seguem.

Os animais que expressam a proteína APP mutada são obtidos por micro-injecção de uma construção génica no núcleo de um zigoto. 10

Os animais duplamente transgénicos sao obtidos por cruzamento de animais psl mutados e de animais APP mutados.

Os animais de acordo com a presente invenção podem ser vantajosamente utilizados para colocar em evidência as propriedades neuroprotectoras dos compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas e, de um modo preferido a doença de Alzheimer. Estes compostos podem ser moléculas químicas, moléculas peptídicas ou proteicas, anticorpos, moléculas quiméricas assim como ARN anti-sentido ou ribozimas. Os compostos colocados em evidência podem ser utilizados como medicamentos, tais como ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável a fim de obter uma composição farmacêutica. Pode tratar-se, em particular, de soluções salinas (fosfato monossódico, dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, etc., ou misturas destes sais), estéreis, isotónicas ou de composições secas, nomeadamente liofilizadas, que por adição, segundo os casos, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de soluções injectáveis. As injecções podem ser realizadas por via estereotáxica, tópica, oral, parentérica, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-ocular, transdérmica, etc.

Um outro objectivo da invenção refere-se deste modo a um processo para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas que compreendem, pelo menos, as etapas que se seguem: - administração do composto ou de uma mistura de compostos a testar em animais de acordo com a presente invenção, e 11 - observação da evolução de um ou vários marcadores característicos que reproduzem a neuropatologia observada no homem.

Um outro objectivo da invenção refere-se a um processo para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas que compreendem, pelo menos, as etapas que se seguem: - colocar em contacto células extraídas de animais de acordo com a presente invenção com um composto ou uma mistura de compostos, e - medir o, ou os, efeitos dos compostos ao nível das células completas, nos homogenados de células ou sobre uma fracção subcelular.

Um outro objectivo da invenção refere-se a todo o produto biológico proveniente de um dos dois animais da invenção, assim como as suas utilizações para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas, de um modo preferido, a doença de Alzheimer. Nomeadamente, entende-se por «produto biológico», células, extractos proteicos, ADN, ARN, ou, ainda, anticorpos.

Deste modo, a presente invenção tem por objectivo células ou linhas celulares derivadas de um animal, tal como a descrita acima, em particular, estirpes de células embrionárias. A presente invenção tem como outro objectivo uma proteína PS1 de murganhos portadora das mutações dos aminoácidos M em T, e L em P respectivamente nas posições 233 e 235. De um modo 12 vantajoso, uma tal proteína compreende a sequência SEQ ID N° 2. De um modo preferido, esta apresenta a sequência SEQ ID N° 3.

Um outro objectivo da presente invenção é um ácido nucleico que codifica a proteína PS1 de murganhos portadora das mutações dos aminoácidos M em T, e L em P respectivamente, nas posições 233 e 235.

De um modo vantajoso, um tal ácido nucleico segundo a reivindicação compreende a sequência SEQ ID N° 1 ou a sequência SEQ ID N° 8. A presente invenção tem, além disso, por objectivo, as sequências complementares destes ácidos nucleicos e dos vectores que compreendem estes ácidos nucleicos ou suas sequências complementares.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização destas proteínas para colocar em evidência as propriedades neuroprotectoras dos compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas. A presente invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem, sem que, no entanto, seja limitada por estes únicos exemplos.

Nestes exemplos, os resultados descritos demonstram a vantagem dos murganhos PS1KI e apoiam, nitidamente, a utilização, de um modo preferido, do modelo PSIKIxAPP nas estratégias terapêuticas uma vez que apresentam a vantagem de representar as principais características das doenças neurodegenerativas conhecidas actualmente. 13

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1 A : Representação esquemática da estrutura do gene psl de murino e dos principais sítios de restrição à volta do exão 7 selvagem (linha superior) e do vector de direccionamento utilizado (linha do meio). As alterações de bases nucleotídicas para produzir as mutações de codões M233T e as mutações L235P no exão 7(*) são representadas no cartucho em ponteado. 0 alelo mutado PS1KI contendo a cassete de resistência a neomicina (Neo) é representada sobre a linha inferior. A posição da sonda de 230 pb utilizada para a identificação dos recém nascidos está também indicada.

Figura 1 B: Transferência de Southern utilizando a sonda de 230 pb para distinguir os alelos selvagens WT (banda a 9,2 kb) e PS1KI heterozigóticos (He, banda dupla) e homozigóticos (Ho, banda a 7,4 kb) nos diferentes murganhos.

Figura 1 C: Imunotransferência do fragmento C-terminal de PS1 mostrando que os níveis de expressão da proteína PS1 não são alterados pela presença das mutações do alelo PS1KI.

Figuras 2 A, 2B e 2C: Quantificação, respectivamente, de Aptotal de Αβ42 e da relação Aβtotal/Aβ42 aos 2,5, 4, 6 e 10 meses de idade. 14

Figura 3: Aceleração do processo de deposição do péptido Αβ nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho. 0 quadro ilustrativo da distribuição regional dos depósitos extracelulares do péptido Αβ no cérebro aos 6 meses. As imagens representam a imunomarcação Αβ(Ac 4G8) nos 3 murganhos APP751SL (Fig 3A, 3B, 3C) e 3 murganhos APP751SLxPSlKI Ho (Fig 3D, 3E, 3F). A imunomarcação coloca em evidência o aparecimento aos 6 meses dos primeiros depósitos ainda raros no córtex (Cx) e hipocampo (Hp) dos murganhos APP751SL. Comparativamente, nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho da mesma idade, o número de depósitos é largamente aumentado nestas regiões. De notar que, nestes murganhos, os depósitos estão já presentes em quantidade notável no tálamo (T).

Figura 4: Progressão com a idade do processo de deposição do péptido Αβ. 0 quadro ilustrativo da distribuição regional dos depósitos Αβ no cérebro aos 10 meses. As imagens correspondem a 2 murganhos APP751SL (Fig 4A, 4B) e 2 murganhos APP751SLxPSlKI Ho (Fig. 4C, 4D) . Nos murganhos APP751SL, a imunomarcação coloca em evidência um aumento importante do número e da dimensão dos depósitos no córtex (Cx) e hipocampo (Hp) aos 10 meses comparativamente aos 6 meses de idade e o aparecimento dos primeiros depósitos no tálamo (ver figura 3). A densidade e a dimensão dos depósitos são igualmente mais importantes aos 10 meses no córtex, hipocampo e no tálamo dos murganhos APP751SLxPSlKI Ho. Note-se que, nestes murganhos, os depósitos em pequeno número podem ser detectados no striatum (St).

Figura 5: Processo de morte neuronal em CAI nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho. Quadro ilustrativo da lesão dos neurónios piramidais no hipocampo de murganhos 15 APP751SLxPSlKI Ho com a idade de 10 meses. As imagens representam a coloração violeta de Cresilo, com baixa ampliação no hipocampo, nos 2 murganhos PS1KI Ho (Fig. 5A, 5B) , 2 murganhos APP751SL (Fig. 5C, 5D) e 2 murganhos APP751SLxPSlKI Ho (Fig. 5E, 5F) . A densidade e a espessura das camadas das células piramidais no hipocampo são qualitativamente comparáveis nos murganhos APP751SL e nos murganhos PS1KI Ho com a idade de 10 meses. Em contraste, na mesma idade, estas são globalmente diminuídas nos murganhos APP751SL x PS1KI Ho, em particular na camada 1 da Corno de Ammon (CAI). Note-se que o número de pequenas células coradas de azul (células de tipo glial) parecem aumentadas no hipocampo dos murganhos APP75 1 SL x PS1KI Ho.

Figura 6: Processo de morte neuronal em CAI nos murganhos APP751SLxPSIKI Ho. Quadro ilustrativo da lesão neuronal em CAI aos 10 meses através da utilização de outros marcadores neuronais, o verde de metilo e a imunomarcação BIP. As imagens representam a coloração de verde de metilo, com grande ampliação em CAI, num murganho não transgénico (Fig 6A) , um murganho PKS1KI Ho (Fig 6B) , um murganho APP751SL (Fig 6C) e um murganho APP751SLxPSlKI Ho (Fig 6D) . Estes representam a imunomarcação BIP com grande ampliação em CAI, em um murganho PS1KI Ho (Fig 6 E) e um murganho APP751SLxPSlKI Ho (Fig 6F) . Comparativamente com os murganhos não transgénicos, PS1 Kl Ho e APP751SL, o número de células neuronais coradas de verde de metilo está globalmente diminuída na região CAI de murganhos APP751SLxPSlKI Ho. Note-se a detecção de células tipo glial coradas em número importante no parênquima do hipocampo

deste murganho duplamente transgénico. A imunomarcação BIP 16 confirma, igualmente, a perda de neurónios piramidais importante em CAI nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho com idade de 10 meses.

Figura 7: Morte neuronal em CAI e deposição intracelular do péptido Αβ. Quadro ilustrativo dos dois processos patológicos, lesão neuronal e acumulação intracerebral anormal do péptido Αβ aos 10 meses. As imagens representam, com grande ampliação em CAI, a imunomarcação Αβ nos 2 murganhos APP751 (Fig. 7A, 7B) e 2 murganhos APP751SLxPSlKI Ho (Fig 7E, 7F). Estes representam, com grande ampliação em CAI, a coloração violeta de Cresilo nos murganhos APP751 (Fig. 7C, 7D), nos murganhos APP751SLXPS1KI Ho (Fig. 7G, 7H) e 2 murganhos PS1KI Ho (71, 7J) . Aos 10 meses de idade, tanto nos murganhos simples APP751SL como nos duplos APP751SL x PS1KI Ho, os depósitos extracelulares de Αβ são observados maioritariamente de ambos os lados da camada de neurónios em CAI. Por outro lado, em CAI (caracterizada por uma lesão neuronal pronunciada em toda a camada nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho, Fig. 7C, 7D) , a imunomarcação Αβ de aspecto granular (correspondente à acumulação intraneuronal anormal do péptido Αβ, ver setas) aparece mais intensa nos murganhos APP751SL x PS1KI Ho. Isto é também verdade aos 6 meses de idade (ver Figura 8).

Figura 8: Colocação no local precocemente ao processo de morte neuronal em CAI nos APP751SLxPSlKI Ho. Quadro ilustrativo da região CAI do hipocampo aos 6 meses. As imagens representam, com grande ampliação em CAI, a imunomarcação Αβ nos 3 murganhos APP751 (8A, 8B, 8C) e 3 murganhos APP751SLxPSlKI Ho (Fig. 8G, 8H, 81). Estes 17 representam a coloração violeta de Cresilo nos murganhos APP751 (Fig. 8D, 8E, 8F) e nos murganhos APP751SLxPSlKI Ho (8J, 8K, 8L). Aos 6 meses, a região CAI do hipocampo, em um murganho APP751SLxPSlKI Ho, é caracterizada por um número de depósitos extracelulares de Αβ já importante (Fig. 81), uma marcação granular intracelular de Αβ intensa (ver setas) e uma perda de neurónios corados com violeta de Cresilo associada a um aumento do número de células tipo glial (Fig 8L) . Para os 2 outros murganhos APP751SLxPSlKI Ho, a camada de neurónios CAI corada com violeta de Cresilo aparece pouco (Fig 8J) ou nada (Fig 8K) desorganizada. Note-se que para estes dois murganhos, a imunomarcação Αβ intracelular aparece menos intensa e mais difusa (FiG. 8G, 8H) do que no 3o murganho (Fig. 81).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção do vector de direccionamento portador das mutações M233T e L235P. A finalidade foi introduzir duas mutações no exão 7 do gene PS1 do murganho que conduziu à alteração dos residuos M233 em T e L235 em P. Os dois novos codões correspondem a mutações identificadas em doentes com Alzheimer com inicio precoce (FAD).

Uma linha de murganhos PS1 activada (PS1KI) foi produzida utilizando uma estratégia de mutagénese em 2 etapas semelhantes à descrita em Kwok et al. (1997 Neuroreport 8; 157-42) e

Champion et al. (1996, Neuroreport 7, 1582-4). 18 A estratégia visou a construção de um vector de direccionamento portador de alterações de ácidos nucleicos nos codões 233 e 235 do gene murino psl (ver Fig. IA).

Sucintamente, um fragmento genómico de 17-Kb do gene de murganho PS1 foi isolado por rastreio de um banco de ADN genómico de murganhos 129SvJ construído num bacteriófago lambda (Stratagene, catálogo N° 946313) . A análise por digestão com enzimas de restrição, a sequenciação e a comparação com as sequências parciais do gene murino PS1 disponíveis (Mitsuda et al. 1997, JBC 272, 23489-97), indicaram que este fragmento continha a região do intrão 5 ao exão 11 do gene de murganho PS1. Um sub-fragmento BamHI-HindlII de 9,8-Kb contendo uma parte do intrão 5, exão 6, o intrão 6, exão 7 e uma parte do intrão 7, foi subclonada no plasmídeo pGEM-llZf (+) (Promega, França) (Fig. IA) . A mutagénese dos 2 codões foi realizada utilizando o kit Gene Editor (Promega) no fragmento de ADN contendo o exão 7 e foi confirmado por sequenciação nucleotídica. 0 braço longo (5') do vector de recombinação homóloga foi obtido por clonagem do fragmento BamEI-Xbal de 7-Kb contendo exão 6. 0 braço curto (3') foi produzido por subclonagem do fragmento Xbal-EcoRI de 1,8-Kb contendo o exão 7 que sofreu mutagénese. Uma cassete de selecção positiva (pMCI-Neo cassete) foi introduzida no sítio Xba I situado no intrão 6 na posição -470 pb em 5' do exão 7 (ver Fig. IA).

Exemplo 2: Obtenção de células ES compreendendo PS1KI. O vector de direccionamento, descrito no exemplo 1, foi linearizado por digestão com NotI e sujeito a electroporação na 19 linha de células de estirpe embrionária (ES) CK35 fornecidas pelo Dr. Charles Babinet, Institut Pasteur Paris, França.

As células foram cultivadas como anteriormente descrito (W. Wurtz e A. Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Editor). Oxford University Press; 2a edição (15 de Fevereiro de 2000)).

Foram seleccionados 430 clones celulares susceptíveis de comportar a recombinação homóloga na presença de G418. O ADN genómico destes clones foi analisado por transferência de Southern como anteriormente descrito (Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1989) utilizando uma sonda PS1 situada fora do dominio de recombinação (Fig. IA) do braço longo. Quatro clones celulares portadores das mutações adequadas no gene PS1 puderam também ser identificadas. Estes clones celulares serviram para estabelecer uma linha de murganhos transgénicos PS1KI.

Exemplo 3: Construção da linha de murganhos PS1KI. O clone 18C5 foi injectado em blastócitos de murganhos C57B1/6 .

Cinco dos murganhos quiméricos obtidos demonstraram uma transmissão do alelo mutante psl para a linha germinal (e, deste modo, à sua descendência). 20 A partir destes fundadores, a linha de murganhos PS1KI foi estabelecida com base genética para 129SV e com base mista para 129SV-C57B1/6. A presença do alelo mutado PS1KI no estado heterozigótico (He) ou homozigótico (Ho)- foi determinada por transferências de Southern com a sonda psl de 230-bp (Fig. 1B) . Os murganhos mutantes são viáveis e férteis.

Exemplo 4: Dosagem de PS1 na linha PS1KI

Após eutanásia, o cérebro dos murganhos foi retirado e pesado. Um hemisfério foi conservado para imuno-histoquímica (pós-fixação) e o outro foi congelado e homogeneizado individualmente, em gelo, com o auxilio de um Potter em 2 mL de uma solução tampão: 0,32 M de sacarose, Tris-HCl a 4 mM, pH 7,4 contendo um cocktail de inibidores de proteases (Complete™, Roche Diagnostics). A concentração em proteína foi determinada pelo método BCA (Pierce). O homogenado foi conservado a -80 °C.

Para a detecção de PS1, 25 pg de extracto proteico de cérebro foram incubados a 56 °C, durante 20 min, no tampão de depósito de Laemmli contendo ureia a 8 M e ditiotreitol a 50 mM. As proteínas foram fraccionadas por electroforese em gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris poliacrilamida (SDS-PAGE) em tampão MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico) . Após transferência das proteínas para o filtro de nitrocelulose (Amersham, França), o filtro foi aquecido em PBS durante 5 min a fim de aumentar a sensibilidade e imediatamente saturado com 5% (p/V) de leite desnatado em pó num tampão PBST (PBS, 0,05% (V/V) Tween 20) durante lhe incubado durante a noite a 4 °C com os anticorpos 21 primários em apenas tampão PBST. A ligação dos anticorpos foi detectada com um anticorpo -anti IgG (anti-murganhos) conjugado com a peroxidase de Rábano (Amersham, França) à diluição de 1/10000 em PBST seguido de um sistema de detecção por quimioluminescência (Amersham, França) de acordo com as instruções do fabricante. Para a detecção de PS1, o anticorpo primário MAB1563 (Chemicon, USA) foi utilizado com a diluição 1/10000. Para a análise semi-quantitativa, os sinais de luminescência foram digitalizados com uma câmara CCD GeneGnome 16 bits (Syngene, Cambridge, Inglaterra) e analisados com o programa de computador Genetools (Syngene). A linearidade do sinal foi verificada graças às curvas padrão estabelecidas com amostras de 2,5 a 10 pg do homogenado por pista.

Esta análise por imunotransferência permitiu determinar que os níveis de expressão do fragmento C-term de PS1 mutado permanecem normais e não são diminuídos nos murganhos PS1KI233/235 (FiglC).

Exemplo 5: Obtenção da linha PSIKIxAPP por cruzamento das linhas PS1KI e APP

Os murganhos PS1KI (descritos nos exemplos 1 a 4) foram cruzados com uma linha de murganhos transgénicos que sobre-expressam a forma humana do ADNc APP751 portadora das mutações FAD Swedish (mutação K670N; M671L) e London (V717I) sob o controlo do promotor Thy-1. Os murganhos que sobre-expressam a forma humana do cDNA APP751 portadora das mutações foram obtidos como descrito no pedido de patente WO 01/20977. 22

Em todas as experiências seguintes, os murganhos com a mesma base genética foram utilizados para minimizar qualquer efeito devido às variações de base genética.

Exemplo 6: Dosagem do péptido amilóide Αβ-total e Αβ42 pelo método de imunoelectroguimioluminescência

Para a quantificação da mistura global de Αβ no cérebro (formas solúveis e formas agregadas ou insolúveis), fracções do homogenado de cérebro foram tratadas com 2 volumes de uma solução a 9 M de cloridrato de guanidina (GH) em 50 mM de Tris pH 7,4. Os homogenados foram misturados, durante 1 h, com 3 períodos de sonicação de 15-min seguidos de uma centrifugação a 50000 g, a 4 °C, durante 2h. Os extractos de guanidina foram diluídos ao 1/20 em tampão 20 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl, 0,5% de BSA (p/v) e 0,05% de Tween 20 (p/v). a concentração do péptido Αβ nas fracções foi a seguir determinada por imunoelectroquimioluminescência (Yang et al., 1994,

Biotechnology (NI) 12(2), 193-194) com o auxílio de 2 anticorpos monoclonais de murganhos anti-péptido Αβ (4G8 e 6E10) e do leitor Origen M8 Analyzer (IGEN Europe Inc. Oxford) seguindo um protocolo modificado de Khorkova et al. (J. Neurosci. Methods 82, 159-166 (1998) ) . O anticorpo monoclonal 4G8 (Senetek PLC), reconhecendo o epitopo nos resíduos 17-24 do péptido Αβ, é rutinilado graças ao éster TAG-NHS seguindo o protocolo do fornecedor (IGEN Europe Inc., Oxford). Ru-4G8 e o anticorpo biotinilado 6E10, epitopo 1-10 do péptido Αβ (Senetek PLC) são colocados na presença da fracção solúvel de cérebro e os complexos tripartidos ϊύα-ίΟδ/Αβ/δΕΙΟ^ίοί quantificados pelo leitor Origen. Uma grama 23 de péptido sintético A β (Bachem) é utilizada para calibrar cada experiência. A taxa de péptido Αβ é calculada em nanogramas por g de peso inicial de tecido cerebral.

Para medir especificamente as formas de péptido Αβ que terminam na posição 42 (Αβ42), o anticorpo 6E10 foi substituído pelo anticorpo monoclonal 22F9 que se fixa, especificamente, na extremidade C-terminal Αβ42 (Wirths et ai., 2002, Brain Pathol. 12, 275-286).

Em conclusão, a presença do gene psl activado (PS1-KI) conduz a: - Uma aceleração da acumulação de Αβ(Fig2A) e Αβ42 (Fig. 2B) no cérebro com um efeito ainda mais pronunciado uma vez que o alelo PS1KI está presente no estado homozigótico (efeito gene-dosagem). O efeito de PSlKI(Ho) é mais acentuado do que com os murganhos transgénicos que sobre-expressam PS1M146L anteriormente descritos no pedido WO 01/20977.

Um aumento massivo da proporção de péptido Αβ que apresenta uma extremidade β42, que representa a grande maioria de Αβ uma vez que a mutação PS1KI está no estado homozigótico, como o revela a figura 2C (proporção Αβ42/Αβ total igual a 0,92, aos 2,5 meses de idade, vs 0,25 na ausência de PS1KI e um valor intermédio 0,70 na presença de um só alelo PS1KI: efeito gene-dosagem). É reconhecido na literatura que as espécies de péptido Αβ que terminam na extremidade β42 representam as formas mais patológicas do péptido. A linha PSIKIxAPP representa 24 deste modo um modelo particularmente enriquecido em formas patológicas.

Exemplo 7: Análise dos depósitos do péptido Αβ por imuno-histoquímica

Para as experiências de imuno-histoquímica/histologia, após retirar e fixar em paraformaldeido a 4%, os hemicérebros são crioprotegidos durante 1 noite, a 4 °C, no tampão fosfato de sódio a 0,2M (NaH2P04,2H20/Na2HP04, 12H20, pH 7,4) contendo sacarose a 20% (P/V). Estes são a seguir congelados durante 1 min, em isopentano mantido a uma temperatura de -30 °C em gelo seco. Cortes de 25 pm de espessura, realizados num crióstato termoestatizado a -30 °C (LEICA CM3000) são finalmente colocados num tampão PBS a 0,02 M depois conservados a 4 °C.

Nestes cortes, a detecção imunoenzimática do péptido Αβ, foi realizada graças ao sistema de revelação que implicava formação de complexos avidina-biotina-peroxidase (ABC), nos quais a peroxidase de Rábano acoplada à avidina é biotinilada. Resumidamente, após uma incubação de 30 min no tampão de bloqueio (soro normal de cabra (Chemicon) a 10% em PBS contendo 0,1% de triton (Sigma), os cortes de cérebros são colocados na presença de uma solução de H202 a 0,3% a fim de eliminar as endoperoxidases presentes no tecido. Depois, estes cortes são incubados na solução de anticorpo primário contendo 0,3% de triton e 2% de soro normal (toda a noite a 4 °C) . O anticorpo primário anti-Αβ (4G8, Senetek) (anticorpo monoclonal dirigido contra o resíduo 17-24 do péptido Αβ) utilizado é biotinilado. Após lavagens, os cortes foram deste modo colocados directamente na presença do complexo ABC, durante 1 hora, segundo as 25 instruções do fabricante (Kit ABC Vectastin, Laboratoires Vector, Burlingame, CA). A 3-3'-diaminobenzidina foi utilizada como cromogénio para a enzima peroxidase.

Deste modo, a aceleração da acumulação anormal do péptido Αβ no cérebro de murganhos duplamente transgénicos APP751SLxPSlKI Ho, detectada anteriormente por testes bioquímicos em homogenados de hemicérebros, foi confirmada por imuno-histoquímica. Com efeito, a análise microscópica da imunomarcação de Αβ obtida no corte de hemicérebro demonstrou a existência de um processo de deposição do péptido Αβ acelerada no parênquima cerebral destes murganhos. Com efeito, desde que os primeiros depósitos aparecem no córtex e o hipocampo por volta dos 6 meses de idade nos murganhos APP751SL (Fig. 3), estes podem ser detectados desde a idade de 2 meses nos duplos APP751SLxPSlKI no estado homozigótico. Comparativamente aos simples transgénicos APP751SL, nos duplos transgénicos (APP751SLxPSlKI Ho) com a idade de 6 meses, a densidade dos depósitos de Αβ é globalmente mais importante no hipocampo e no córtex. Além disso, a distribuição dos depósitos é mais vasta; em particular, os depósitos são já detectados no tálamo e também no pons (Fig.3).

Com a idade, em particular aos 10 meses, a densidade e igualmente, a dimensão dos depósitos são aumentados no cérebro dos murganhos simples transgénicos APP751SL (Fig 4) . A distribuição destes depósitos é igualmente mais vasta uma vez que estes estão presentes no tálamo. Nos duplos transgénicos APP751SLxPSlKI Ho com a idade de 10 meses, é observada uma progressão semelhante do processo de deposição do péptido Αβ no hipocampo, no córtex, no tálamo e no pons. Os primeiros depósitos podem ser detectados em número limitado no striatum 26 (Fig. 4). Em contraste, o cerebelo permanece poupado ao processo de deposição de Av. Note-se que no cérebro dos murganhos PS1KI Ho com a idade de 10 meses (n = 4), nenhum depósito do péptido Αβ é detectado.

Exemplo 8: Análise da perda neuronal por histologia e imuno-histoquímica A presença de uma proporção muito importante de péptido Αβ42 patológico, conduziu à análise para determinar se, na linha APP751SLxPSlKI Ho, outra aceleração do processo de deposição do péptido Αβ, se desenvolve uma perda neuronal com a idade. Para isto, foram realizadas 3 tipos de coloração que permitem visualizar o desaparecimento de células neuronais nos cortes de tecido cerebral: a) a histologia com violeta de cresilo que cora os corpos de Nissl (os organitos citoplásmicos associados aos ribossomas do retículo endoplásmico granuloso) e permitem colocar em evidência nos cortes de cérebro o conjunto das células neuronais e da glia; b) a histologia com verde de metilo que cora o ADN de todas as células; c) a imuno-histoquímica BIP que revela a expressão nas células de uma proteína chaperone residente no retículo endoplasmático.

Para a coloração com violeta de cresilo, os cortes de tecido cerebral são montados sobre lâminas gelatinadas e, depois, incubadas 10 minutos numa solução de violeta de cresilo (C 1791, Sigma) a 0,5% em água destilada. Após uma lavagem em meio ácido, os cortes são, finalmente, desidratados.

Para a coloração com verde de metilo, os cortes são montados sobre lâminas gelatinosas, incubados durante 10 minutos numa 27 solução de verde de metilo (M5015 de sigma) a 1% em água destilada, lavadas e, depois, desidratadas.

Para a imuno-histoquimica BIP (anticorpo policlonal, SPA-826, Stressgen), o protocolo é idêntico ao aplicado para a imuno-histoquimica do péptido Αβ (ver acima) excepto a incubação suplementar (1 h, à temperatura ambiente) dos cortes numa solução de anticorpo secundário biotinilado (anticorpos anti-IgG de coelho de cabra, Vector) antes da sua incubação no complexo ABC. A análise microscópica colocou em evidência, através da utilização de diferentes marcadores histológico/imuno-histoquímico, uma diminuição da espessura da camada das células piramidais de hipocampo, em particular de CAI, no cérebro dos murganhos APP751SLxPSlKI Ho (n = 3/3) (Figuras 5 e 6). Esta diminuição indica a existência de um processo de morte neuronal já bem instalado com a idade de 10 meses. Aos 6 meses, a morte neuronal está presente no cérebro de 1/3 dos murganhos sugerindo o desencadear precoce de um processo neurotóxico (Figura 8). A análise em paralelo no hipocampo e, em particular, em CAI, os 2 processos patológicos que são a acumulação anormal do péptido Αβ no cérebro e a lesão neuronal, sugerem um papel mais provável no processo neurotóxico da acumulação intracelular de Αβ (fenómeno já descrito nos murganhos thylAPP751SLxPSl M146L) do que na sua acumulação em depósitos extracelulares (Figura 7) . Com efeito, os neurónios ainda presentes em CAI, apresentam uma expressão anormalmente forte do péptido Αβ. Além disso, a lesão neuronal em CAI está nitidamente presente nas regiões desprovidas de depósitos extracelulares. Note-se a existência de um provável efeito gene-dosagem no processo de morte neuronal em CAI. uma lesão neuronal foi com efeito encontrada nos murganhos 28 APP751SLxPSlKI com muita idade (> 15 meses) possuindo apenas um alelo PS1KI. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> AVENTIS PHARMA S.A.

E APP COM A

<120> ANIMAIS TRANSGÉNICOS QUE EXPRESSAM MUTANTES DE PS1 QUE APRESENTAM OS PROBLEMAS PRONCIPAIS RELACIONADOS DOENÇA DE ALZHEIMER <130> PRJ03034 < 16 0 > 9 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 1 atcagtgccc tcacggcacc ggtattt 27

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Ala Ala Vai Thr Pro Glu Glu Ara His Leu Ser Lys Met Gin Gin Asn 725 M 730 735

Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr lvs Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 740 745 750

<210> 8 <211> 221 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 8 ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca ggcgtatctc attatgatca gtgccctcac ggcaccggta tttatcaagt acctccccga atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 60 120 180 221

<210> 9 <211> 221 <212> ADN <213> Mus musculus 38 <4Ο0> 9 ggaagtattt aagacctaca atgtcgccgt ggactacgtt acagtagcac tcctaatctg 60 gaattttggt gtggtcggga tgattgccat ccactggaaa ggcccccttc gactgcagca 120 ggcgtatctc attatgatca gtgccctcac ggcaccggta tttatcaagt acctccccga 180 atggaccgca tggctcatct tggctgtgat ttcagtatat g 221

Lisboa, 21 de Setembro de 2010 39

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES Animal não humano que apresenta uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma proteína pré-senilina 1 portadora no estado homozigótico das mutações que correspondem às mutações M233T e L235P na proteína PS1 de murganhos. Animal de acordo com a reivindicação 1, compreendendo, ainda, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para todo ou parte do gene que codifica a APP. Animal de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por expressar uma quantidade de PS1 mutada comparável à quantidade de PS1 endógena de um animal que expressa uma PS1 não mutada. Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a proteína pré-senilina 1 portadora das mutações M233T e L235P ser de origem murina. Animal de acordo com uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada por a proteína APP ser a APP751 e ser de origem humana. Animal de acordo com uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada por a proteína APP751 ser de origem humana e apresentar as mutações Swedish e London. Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ser um roedor. 1
2. 8. Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser um murganho, um rato ou um coelho. 9 . Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por produzir uma proteína compreendendc > a sequência SEQ ID N‘ 3 2. O \—1 Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por apresentar no : seu genoma a sequência de ácidos nucleicos SEQ ID N° 1. 11. Animal de acordo com uma das reivindicações 2 a 10, caracterizado por a expressão do gene que codifica para a APP estar sob o controlo de um promotor exógeno. 12 . Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por apresentar uma perda neuronal. 13 . Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por apresentar uma relação Abeta42/Abeta total superior a cerca de 0,9 • 14 . Animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a proteína pré-senilina 1 mutada ser endógena.
3. 15. Célula ou linha celular derivada de um animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 14. 2
4. 16. Célula ou linha celular compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o gene murino da pré-senilina 1 sob uma forma mutada em M233T e L235P.
5. 17. Célula de estirpe embrionária derivada de um animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 14.
6. 18. Proteína PS1 de murganho portadora das mutações dos aminoácidos M em T, e L em P, respectivamente, nas posições 233 e 235.
7. 19. Proteína de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por compreender a sequência SEQ ID N° 2. 20. Ácido nucleico que codifica a proteína PS1 de murganho portadora das mutações dos aminoácidos M em T, e L em P, respectivamente, nas posições 233 e 235. 21. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender a sequência SEQ ID N° 1.
8. 22. Vector compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21.
9. 23. Utilização de um animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento da doença de Alzheimer.
10. 24. Processo para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas compreendendo as etapas seguintes: 3 administração do composto ou de uma mistura de compostos a testar num animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, e - observação da evolução de um ou vários marcadores característicos que reproduzem a neuropatologia observada no homem.
11. 25. Processo para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento das doenças neurodegenerativas compreendendo as etapas seguintes: - colocar em contacto células extraídas de um animal de acordo com uma das reivindicações 1 a 14 com um composto ou uma mistura de compostos e - medir o, ou os, efeitos dos compostos ao nível das células completas, em homogenados de células ou numa fracção subcelular.
12. 26. Utilização de uma proteína de acordo com uma das reivindicações 18 e 19 para colocar em evidência compostos destinados ao tratamento da doença de Alzheimer. Lisboa, 21 de Setembro de 2010 4