JP6583011B2 - 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 - Google Patents
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Description
[項1]
免疫染色法により、検体スライド上の組織切片に含まれる目的生体物質を蛍光ナノ粒子で標識する処理(蛍光標識処理)、
前記蛍光標識処理された組織切片を形態観察用染色液で染色する処理(染色処理)、および
染色処理された組織切片を酸性水溶液で洗浄する処理(洗浄処理)
を行う、染色スライドの洗浄方法。
[項2]
前記酸性水溶液のpHが2以上7未満である、項1に記載の染色スライドの洗浄方法。
[項3]
前記酸性水溶液のpHが3以上6.5以下である、項1に記載の染色スライドの洗浄方法。
[項4]
前記染色液がヘマトキシリンおよび/またはエオジンより選択される、項1〜3のいずれか1項に記載の染色スライドの洗浄方法。
[項5]
前記蛍光ナノ粒子が蛍光体集積ナノ粒子であり、その平均粒子径が20nm〜500nmである、項1〜4のいずれか1項に記載の染色スライドの洗浄方法。
本発明では、目的とする遺伝子またはタンパク質を蛍光標識するための物質として、蛍光ナノ粒子を使用する。蛍光ナノ粒子は、ナノサイズの(直径が1μm以下の)粒子状の蛍光体であり、1粒子で十分な輝度を有する蛍光を発することのできるものである。撮影される蛍光画像において所望の波長の蛍光(色)を発する蛍光ナノ粒子を選択すればよい。また、蛍光標識の対象とする生体目的物質が複数ある場合は、それぞれに対応した異なる波長の蛍光を発する、複数種類の蛍光ナノ粒子を組み合わせて用いればよい。このような蛍光ナノ粒子は、無機蛍光体ナノ粒子および蛍光体集積ナノ粒子に大別することができる。
本発明では無機蛍光体ナノ粒子として、量子ドットを用いることができる。これらの無機蛍光体ナノ粒子は、次に述べるような無機蛍光体集積ナノ粒子を調製しなくても単独で、観察可能な輝度を有する輝点の輝度を構成することができる。
蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光色素や無機蛍光体ナノ粒子のような蛍光体を複数個、母体となる物質に内包したり表面に付着させたりすることで集積化した、ナノサイズの(直径が1μm以下の)粒子状の蛍光体である。免疫染色においてこのような蛍光体集積ナノ粒子を用いることは、蛍光体を単独で(蛍光色素を一分子で、または無機蛍光体ナノ粒子を一粒子で)用いる場合と比較して、目的とする生体分子を標識した蛍光標識体1つあたりが発する蛍光の強度を増強し、細胞の自家蛍光等のノイズや他の色素との識別性を高めることができること、また励起光の照射による褪色を抑制することができることから好ましい。
本発明の方法で行われる蛍光標識処理は、染色工程において、免疫染色法に基づいて目的とするタンパク質を蛍光ナノ粒子で標識する処理である。
蛍光体と1次抗体を連結した蛍光標識1次抗体を用意し、その蛍光標識1次抗体で目的タンパク質を直接的に蛍光標識し染色する方法(1次抗体法);
1次抗体、および蛍光標識体と2次抗体を連結した蛍光標識2次抗体を用意し、目的タンパク質に1次抗体を反応させた後、その1次抗体に蛍光標識2次抗体を反応させることで、目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法(2次抗体法)
1次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾1次抗体、および蛍光体とアビジンないしストレプトアビジンを連結したアビジン修飾蛍光体を用意し、目的タンパク質にビオチン修飾1次抗体を反応させた後、さらにアビジン修飾蛍光体を反応させて、アビジン−ビオチン反応を利用して目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法(アビジン−ビオチン併用1次抗体法);
1次抗体、2次抗体とビオチンを連結したビオチン修飾2次抗体、および蛍光体とアビジンないしストレプトアビジンを連結したアビジン修飾蛍光体を用意し、目的タンパク質に1次抗体を反応させ、次いでビオチン修飾2次抗体を反応させた後、さらにアビジン修飾蛍光体を反応させて、アビジン−ビオチン反応を利用して目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する方法(アビジン−ビオチン併用2次抗体法)。
主に本発明の方法の染色工程において、標識物質として蛍光ナノ粒子で検体スライドを標識した後に、細胞ないし組織の形状や細胞の各部の位置情報を得るために検体スライドを形態観察用染色液で染色する形態観察用処理を行うことができる。
本発明の方法で行われる洗浄処理は、標本後処理工程において、溶媒置換処理の前に(溶媒置換処理の前に任意工程である脱水処理が行われる場合は脱水処理の前に)行われる処理であって、所定の酸性水溶液を用いて、染色された検体スライドを洗浄する処理である。
本発明の洗浄処理のために用いられる酸性水溶液は、酸と、水とを適切な割合で混合することによって調製することができる。酸性水溶液のpHの範囲は、輝度の低下およびばらつきを抑制する効果を考慮すると、2以上7未満が好ましく、pH3以上6.5以下がより好ましい。酸性水溶液のpHが2以上7未満、好ましくはpH3〜6.5であることにより、蛍光ナノ粒子の輝度のばらつきを抑制する効果が十分に保持され、輝度の低下を低減する効果を発揮できる。
"SulfoRhodamine101"(シグマアルドリッチ社製)20.3mgを水22mLに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤"エマルゲン"(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王株式会社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料"ニカラックMX−035"(日本カーバイド工業社製)を0.81g加えた。さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸(関東化学株式会社製)の10%水溶液を1000μL加え、70℃で50分間加熱撹拌した。その後、90℃に昇温して20分間加熱撹拌した。
蛍光標識処理に使用するビオチン修飾された2次抗体の調製を以下の(i)〜(vii)の手順で行った。(i)50mMTris溶液に抗ウサギIgG抗体50μgを溶解した。(ii)該溶液に、最終濃度3mMとなるようにDTT(dithiothretol)溶液を混合した。その後、該溶液を37℃で30分間反応させた。(iii)その後、脱塩カラムを用いてDTTで還元化した2次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち200μLを50mMTris溶液に溶解して抗体溶液を得た。(iv)その一方で、スペーサーの長さが30オングストロームであるリンカー試薬「Biotin−PEG6‐NH‐Mal」(PurePEG社製,製品番号2461006-250)を、DMSOを用いて0.4mMとなるように調製した。この溶液8.5μLを前記抗体溶液に添加し、混和して37℃で30分間反応させた。(v)この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」(サーモサイエンティフィック社製,Cat.#89882)に供して精製した。(vi)脱塩した反応溶液の波長300nmの吸収を分光光度計(日立製「F−7000」)により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。(vii)50mMTris溶液により反応溶液を250μg/mLに調製し、該溶液をビオチン修飾2次抗体溶液とした。
<I.免疫染色法に基づく染色スライドの作製>
免疫染色法は以下に示すように、脱パラフィン処理、賦活化処理(ここまで“標本前処理工程”)、1次抗体処理、2次抗体処理、蛍光標識処理および形態観察用染色処理(ここまで“染色工程”)、洗浄処理、脱水処理、溶媒置換処理および封入処理(ここまで“標本後処理工程”)をこの順で行うことで実施した。洗浄処理で用いる洗浄液のpHが1〜6のものが実施例に相当し、pHが7〜10のものが比較例に相当する。
(1−1)脱パラフィン処理
HER2陽性染色対照標本の検体スライドとして(コスモバイオ社 CB−A712のシリーズ)を、以下の(i)〜(iii)の手順で脱パラフィン処理を行った。(i)キシレンを入れた容器に検体スライドを30分間、常温で浸漬する。途中3回キシレンを交換した。(ii)エタノールを入れた容器に検体スライドを常温で、30分間浸漬する。途中3回エタノールを交換した。(iii)水を入れた容器に検体スライドを30分浸漬させた。途中3回水を交換した。
検体スライドを脱パラフィン処理した後、以下の(i)〜(v)の手順で賦活化処理を行った。(i)検体スライドを水に置換する洗浄を行った。(ii)10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に検体スライドを30分浸漬させた。(iii)121℃で10分、オートクレーブ処理を行った。(iv)PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の検体スライドを30分浸漬し、洗浄した。(v)1%BSA含有PBSを検体スライドに載せて、1時間、ブロッキング処理を行った。
(2−1)1次抗体処理
検体スライドを賦活化処理した後、1次抗体処理を行った。BSAを1%含有するPBSを用いて、ベンタナ社製「抗HER2ウサギモノクロナール抗体(4B5)」を0.05nMに調製し、該1次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した検体スライドに対して4℃で1晩反応させた。
1次抗体処理を行った検体スライドをPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈した、上記ビオチン修飾2次抗体溶液と室温で30分間反応させた。
2次抗体処理を行った検体スライドを以下の(i)〜(ii)の手順で、免疫染色法による蛍光標識処理を行った。(i)検体スライドに対して、1%BSA含有のPBSで0.02nMに希釈した実施例1で作製したストレプトアビジン修飾蛍光色素集積ナノ粒子を、中性のpH環境(pH6.9〜7.4)室温の条件下で3時間反応させた。(ii)該反応後の検体スライドをPBSで洗浄した。
蛍光標識処理を行った検体スライドを以下の(i)〜(ii)の手順で、形態観察染色処理(ヘマトキシリンーエオシン染色)を行った。(i)抗体により蛍光標識処理されたスライドをマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該スライドを45℃の流水で3分間洗浄した。(ii)次に、1%エオシン液で5分間染色してエオシン染色を行い、染色スライドを作製した。
(3−1)洗浄処理
染色スライドを以下の(i)〜(ii)の手順で、洗浄処理を行った。(i)pHが1,2,3,4,5,6,7,8,9または10の10種の洗浄液を調製した。pHが1〜6の洗浄液は、1Mの塩酸を希釈して調製した。pHが7の洗浄液としては、純水を用いた。pHが8〜10の洗浄液は、28%アンモニア水溶液を希釈して調製した。(ii)形態観察用染色処理が行われた染色スライドを常温で、各洗浄液に10分間浸漬して、洗浄処理を行った。
洗浄処理を行われた染色スライドに対して、脱水エタノールに5分間浸漬した。この操作を4回繰り返し、脱水処理を行った。
脱水処理が行われた染色スライドを、常温で2〜10秒、キシレンに浸漬することで、溶媒置換処理を行った。この操作を4回繰り返し、透徹処理を行った。
染色スライドを以下の(i)〜(ii)の手順で、封入処理を行った。(i)溶媒置換処理が行われた染色スライドを常温でエンテランニュー(メルク社)を滴下した後、カバーガラスを被せ、常温で10分間、風乾することで、封入処理を行った。(ii)その後、シグナルの計測まで、封入処理が行われた染色スライドを遮光して保存した。
封入処理を終えた染色スライドに対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の染色スライドを蛍光顕微鏡(オリンパス社製「BX−53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製「DP73」)により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで575〜600nmに設定した。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターを通すことで612〜692nmに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、580nmの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば4000μ秒に設定)して撮像した。HER2(3+)の組織の輝点数は、400倍で撮像した画像をもとにImageJ FindMaxims法により計測した1000細胞の平均値とした。また、撮像した画像から、1細胞当たりの蛍光ナノ粒子を算出し、ばらつきを表す指標として変動係数(CV)を算出した。
Claims (5)
- 免疫染色法により、検体スライド上の組織切片に含まれる目的生体物質を蛍光ナノ粒子で標識する処理(蛍光標識処理)、
前記蛍光標識処理された組織切片を形態観察用染色液で染色する処理(染色処理)、および
染色処理された組織切片を酸性水溶液で洗浄する処理(洗浄処理)
を行う、染色スライドの洗浄方法。 - 前記酸性水溶液のpHが2以上7未満である、請求項1に記載の染色スライドの洗浄方法。
- 前記酸性水溶液のpHが3以上6.5以下である、請求項1に記載の染色スライドの洗浄方法。
- 前記染色液がヘマトキシリンおよび/またはエオジンより選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の染色スライドの洗浄方法。
- 前記蛍光ナノ粒子が蛍光体集積ナノ粒子であり、その平均粒子径が20nm〜500nmである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の染色スライドの洗浄方法。
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