WO2017014196A1 - 目的生体物質の解析方法および解析システム - Google Patents

目的生体物質の解析方法および解析システム Download PDF

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target biological
filter set
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大輔 富岡
秀樹 郷田
佐藤　彰
雄一 尾崎
高橋　優
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コニカミノルタ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a target biological substance analysis method and analysis system.
  • an antigen to be observed is labeled on a tissue section by binding it to an antibody-modified phosphor (immunostaining agent) and observed with a fluorescence microscope.
  • an antibody-modified phosphor immunostaining agent
  • cancer-related pathological examination using immunostaining when multiple types of antigens exist on the same tissue section, the prognosis of anticancer drug treatment is poor by checking whether each antigen is positive or negative. Can be diagnosed.
  • the present applicant provides a method for detecting a biological substance and an immunostaining agent capable of analyzing the number of fluorescent bright spots and fluorescence intensity for each antigen and measuring the expression level (Patent Document 1, Examples). 3).
  • the main object of the present invention is to provide an analysis method and analysis system for a target biological material that can accurately analyze the number of fluorescent bright spots for each immunostaining agent even in multiple immunostaining using multiple types of immunostaining agents. There is to do.
  • a tissue specimen is stained with a plurality of types of immunostaining agents containing different fluorescent nanoparticles and analyzed using a fluorescence microscope. Calculating a luminance ratio of each of the immunostaining agents for each filter set; Measuring the number of fluorescent luminescent spots of the tissue specimen for each filter set, and calculating the number of fluorescent luminescent spots for each of the immunostaining agents based on the luminance ratio; A method for analyzing a target biological material is provided.
  • a fluorescence microscope for imaging the tissue specimen stained with the immunostaining agent;
  • a control device for controlling the fluorescence microscope, the storage unit storing a luminance ratio for each filter set of each of the immunostaining agents, and the fluorescence emission for each filter set of the tissue specimen from the imaging result of the fluorescence microscope
  • the control device having a calculation unit for measuring the number of points and calculating the number of fluorescent luminescent points for each immunostaining based on the luminance ratio;
  • a system for analyzing a target biological material is provided.
  • the target biological material analysis system 1 includes a fluorescence microscope 10, a control device 60, and a display device 70.
  • the fluorescence microscope 10 includes a stage 12, an objective lens 14, a lens barrel 16, an eyepiece lens 18, and an image sensor 20.
  • the stage 12 is provided with a tissue specimen 30 after immunostaining.
  • the lens barrel 16 incorporates a lamp 40 and a filter set 50.
  • the filter set 50 includes an excitation filter 52, a beam splitter 54, and a fluorescence filter 56.
  • the lamp 40 is a lamp that emits excitation light.
  • the excitation filter 52 is a filter that transmits only excitation light.
  • the beam splitter 54 is an optical component that reflects or transmits light having a predetermined wavelength as a boundary.
  • the beam splitter 54 reflects excitation light and transmits fluorescence.
  • the fluorescent filter 56 is a filter that blocks excitation light and transmits only fluorescence.
  • the excitation light passes through the excitation filter 52, is reflected by the beam splitter 54, passes through the objective lens 14, and is irradiated onto the tissue specimen 30.
  • fluorescence is emitted from the tissue specimen 30, and the fluorescence is collected by the objective lens 14 and passes through the beam splitter 54 and the fluorescence filter 56. Thereafter, the fluorescence is observed as a fluorescent image through the eyepiece 18 and is imaged on the image sensor 20.
  • a control device 60 for controlling these is connected to the fluorescence microscope 10.
  • the control device 60 includes a control unit 62 and a storage unit 64.
  • the control unit 62 is connected to the stage 12 and can control the focus position (height position) by controlling the elevation of the stage 12.
  • the control unit 62 is connected to the image sensor 20 and can control the image sensor 20 to capture a fluorescent image and receive the fluorescent image to generate a fluorescent image.
  • the control unit 62 is connected to the lamp 40 and can control lighting and extinguishing of the lamp 40.
  • the storage unit 64 stores a target biological substance analysis program for executing the fluorescent bright spot number calculation process of FIG.
  • a display device 70 is connected to the control device 60, and a calculation result by the control device 60 is displayed on the display device 70.
  • Target biological substance is a target of immunostaining using a fluorescent label for detection or quantification mainly from the viewpoint of pathological diagnosis, and is expressed in tissue sections.
  • Typical target biological materials include biological materials that are expressed in cell membranes of various cancer tissues and can be used as biomarkers.
  • Immunostaining As an immunostaining agent, in order to improve the efficiency of fluorescent labeling and suppress the time lapse leading to the deterioration of fluorescence as much as possible, primary antibodies and fluorescent nanoparticles are used indirectly, that is, other than covalent bonds using antigen-antibody reactions. It is preferable to use a complex linked by these bonds. In order to simplify the staining operation, a complex in which fluorescent nanoparticles are directly bound to a primary antibody or a secondary antibody can also be used as an immunostaining agent.
  • immunostaining agents include [primary antibody against target biological substance] ... [antibody against primary antibody (secondary antibody)] to [fluorescent nanoparticles (hereinafter also referred to as “fluorescent dye-encapsulating resin particles”)].
  • . “...” represents binding by an antigen-antibody reaction, and the mode of binding indicated by “ ⁇ ” is not particularly limited.
  • a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, a coordinate bond, an antigen-antibody bond examples include biotin avidin reaction, physical adsorption, chemical adsorption, and the like, and a linker molecule may be used as necessary.
  • a hapten molecule having a high binding ability is used [hapten-labeled primary Antibody] ... [Antibody against hapten (anti-hapten antibody)] to [Fluorescent nanoparticles] and [Biotin-labeled primary antibody] ... [Avidin] to [Fluorescent nanoparticles] having high binding ability.
  • haptens examples include haptens, anti-hapten antibodies (dinitrophenol, anti-dinitrophenol antibody, digoxigenin, anti-digoxigenin antibody, fluorescein, anti-fluorescein antibody, etc.), biotin, avidin and variants thereof (streptavidin, neutravidin, etc.) Examples of compounds involved in indirect reactions.
  • FISH is used in an embodiment in which a complex including a nucleic acid molecule (probe) to which a hapten is bound and a fluorescent dye-containing resin particle to which a hapten affinity molecule is bound is formed.
  • a polymer having functional groups at both ends is used, and these functional groups react with each of the functional groups of the resin and the functional groups of the affinity molecule.
  • the fluorescent dye-containing resin particles and the affinity molecule are bound via a spacer (linker) derived from the polymer.
  • the amount of the affinity molecule bound per unit area on the surface of the fluorescent dye-containing resin particle is likely to vary, the effectiveness of applying the present invention is high.
  • the fluorescent dye-containing resin particles can be covalently bonded (if necessary, with a spacer).
  • a functional group involved in the above-described reaction into each of the first affinity molecule, both ends of the spacer used as necessary, and the surface of the fluorescent dye-containing resin particle, and reacting under a predetermined condition can be linked by covalent bonds.
  • the first affinity molecule refers to an affinity molecule that is bound to the surface of the fluorescent dye-containing resin particle as described above.
  • hydrophilic polymers are preferable from the viewpoint of suppressing nonspecific adsorption
  • polyethylene glycol (PEG) is particularly preferable from the viewpoint of easily setting the chain length depending on the number of oxyethylene units.
  • PEG polyethylene glycol
  • the length of the spacer may be adjusted within an appropriate range according to the particle size of the fluorescent dye-containing resin particles to be bonded.
  • a spacer having a single length may be used, or spacers having two or more different lengths may be used in combination.
  • the length of the spacer is preferably 1 to 100 nm.
  • spacers having two or more types it is preferable that the length of at least one of the spacers is 1 to 100 nm and the length of the other spacers is 0.1 to 10 nm.
  • biocompatibility performance is an important factor that determines the quality of the immunostaining reaction.
  • This biocompatibility performance can be evaluated by the following method. That is, a specific amount of a solution containing a fluorescent dye-containing resin particle having a first affinity molecule (typically avidin) bound to the surface at a constant concentration can be combined with a molecule that can specifically bind to the affinity molecule (hereinafter referred to as “the affinity molecule”).
  • the affinity molecule is also referred to as a “second affinity molecule”, for example, but not limited to biotin for avidin, and is measured when reacted with a plate immobilized at a constant density.
  • It is a production / evaluation method of a fluorescent dye-containing resin particle solution including a step of selecting a signal value (S) that satisfies the following formula. 0.5 ⁇ A ⁇ B ⁇ (C / D) ⁇ S ⁇ 1.2 ⁇ A ⁇ B ⁇ (C / D) A: The same number of fluorescent dyes as those contained in all fluorescent dye-containing resin particles contained in a fixed amount of the fixed concentration solution bound with the first affinity molecule were reacted with the plate.
  • Signal value measured at the time B Divide the total number of first affinity molecules bound to the entire surface of all fluorescent dye-encapsulating resin particles contained in a fixed amount of the fixed solution by the number of fluorescent dye-encapsulating resin particles Further, the number of first affinity molecules bonded per fluorescent dye-containing resin particle C: emission intensity per one fluorescent dye-containing resin particle D: included in one fluorescent dye-containing resin particle Luminescence intensity of several fluorescent dyes
  • a fluorescent dye-containing resin particle solution with sufficient staining performance select a fluorescent dye-containing resin particle solution with sufficient staining performance, and adjust the concentration of the fluorescent dye-containing resin particles based on the signal value obtained by the specified method. By doing so, a fluorescent dye-containing resin particle solution having a certain dyeing performance can be obtained.
  • the second affinity molecule is biotin
  • a fluorescent dye-containing resin particle after surface modification modified with SA is used using a biotinylated plate
  • the signal value obtained from the plate and the particle are used. Since there is a high correlation with the intensity of luminance that was actually immunostained, it is possible to determine the staining performance of the particles without actually performing the staining.
  • the ratio value (S / T) of the signal value (S) measured when the fluorescent dye-containing resin particle solution is dispersed on the biotinylated plate with respect to the total surface area (T) of the fluorescent dye-containing resin particles is predetermined. It is possible to adjust the concentration of the fluorescent dye-containing resin particle solution so as to have the same dyeing performance by diluting the solution so as to have the above value. Therefore, even when pathological staining is performed using fluorescent dye-containing resin particle solutions of different lots, it is possible to obtain a staining result without variation.
  • the number of fluorescent dyes encapsulated in all fluorescent dye-encapsulating resin particles contained in a fixed amount of the solution having the first affinity molecule bound thereto ( a) can be calculated as follows. That is, a certain amount of fluorescent dye-containing resin particle solution (fluorescent dye-containing resin particle standard solution) having a constant concentration (for example, 0.01 nM, that is, 6.02 ⁇ 10 9 particles / mL), and the same constant concentration (for example, 0.8.
  • a fluorescent dye solution (fluorescent dye standard solution) of 01 nM, that is, 6.02 ⁇ 10 9 molecules / mL) is prepared, and the fluorescence intensity at the emission peak wavelength of each solution is measured.
  • the fluorescent dyes are accumulated at a high concentration in the fluorescent dye-containing resin particles, there is a possibility that the fluorescence emitted from the fluorescent dye-containing resin particles is weakened by a phenomenon called concentration quenching. Therefore, by multiplying "fluorescence intensity of fluorescent dye-containing resin particle standard solution" by "quantum yield of fluorescent dye alone / quantum yield of fluorescent dye-containing resin particles", the fluorescent dye corrected for the effect of concentration quenching The fluorescence intensity of the encapsulated resin particle standard solution can be calculated.
  • the “total number of first affinity molecules bound to the entire surface of all fluorescent dye-containing resin particles contained in a fixed amount of a fixed solution” (b1) included in the provision of B above is the total surface It can be calculated by dividing the total weight of the first affinity molecule bound to, by the molecular weight of the first affinity molecule.
  • the first affinity molecule typified by streptavidin is a protein
  • the matrix of the fluorescent dye-encapsulating resin particles is a resin. Therefore, based on a protein quantification method such as the BCA method, a certain amount of fluorescent dye-encapsulated substance is used.
  • the concentration of protein in the resin particle solution (all of which are bound to the surface of the fluorescent dye-containing resin particles) can be measured.
  • the total weight of the protein can be calculated by multiplying the measured concentration by the volume of “a certain amount of solution”, and the total weight can be divided by the molecular weight of the protein (for example, the molecular weight of streptavidin is 52000).
  • the total number of the proteins (the first affinity molecules) used for the definition of B can be calculated.
  • the “number of fluorescent dye-containing resin particles” (b2) contained in a fixed amount of the solution, which is also included in the above-mentioned provision of B is a particle counter (for example, “Liquid Particle Counter” manufactured by Lion Co., Ltd.) It is possible to measure with.
  • the number of first affinity molecules bound to one fluorescent dye-containing resin particle By dividing the total number of first affinity molecules in the previous section by the number of fluorescent dye-containing resin particles, it is possible to calculate the number of first affinity molecules bound to one fluorescent dye-containing resin particle. . If the values of b1 and b2 can be calculated, the number (average value) (B) of the first affinity molecules bound per fluorescent dye-containing resin particle can be obtained by b1 / b2.
  • the “emission intensity per particle of the fluorescent dye-containing resin particles” in C can be calculated as follows. That is, using a particle counter, a certain amount of fluorescent dye-containing resin particle solution (fluorescent dye-containing resin particle standard solution) having a constant concentration (for example, 0.01 nM, that is, 6.02 ⁇ 10 9 particles / mL) is prepared. The fluorescence intensity at the emission peak wavelength is measured. By dividing the fluorescence intensity of the fluorescent dye-containing resin particle standard solution by the number of fluorescent dye-containing resin particles contained in the standard solution, the emission intensity per fluorescent dye-containing resin particle can be obtained.
  • the “emission intensity of the number of fluorescent dyes contained in one fluorescent dye-containing resin particle” in D can be calculated as follows. That is, a certain amount of a fluorescent dye solution (fluorescent dye standard) of a constant concentration (for example, 0.01 nM, that is, 6.02 ⁇ 10 9 molecules / mL, and W ⁇ 10 ⁇ 14 g / mL if the fluorescent dye has a molecular weight of W). Solution) and the fluorescence intensity at the emission peak wavelength of the solution is measured.
  • the fluorescence intensity of the fluorescent dye standard solution is expressed as “the number of molecules of the fluorescent dye contained in one fluorescent dye-containing resin particle (or its weight) / the number of molecules of the fluorescent dye in the fluorescent dye standard solution (or its weight)”.
  • the method for measuring the emission intensity defined by C and D is not particularly limited, and the measurement may be performed under appropriate measurement conditions using a general fluorometer.
  • the fluorescent dye-containing resin particle solution whose signal value satisfies the above formula, in other words, the relative signal value: S / ⁇ A ⁇ B ⁇ (C / D) ⁇ is in the range of 0.5 to 1.2.
  • a certain fluorescent dye-containing resin particle solution is considered to have sufficient staining performance as a staining solution.
  • the evaluation of the SA-binding fluorescent labeling solution can be performed as follows.
  • a stock solution of an SA-binding fluorescent label is collected, the number of particles is measured with a particle counter “Liquid Particle Counter” (manufactured by Rion), and then the concentration is adjusted to 0.05 nM.
  • a commercially available biotinylated plate “Well-Coated Biotin, 96-well, Black” (manufactured by G-BIOSCIENCE) was washed 5 times with PBS. Add 100 ⁇ L each and react at 4 ° C. overnight. After the reaction, the plate is washed with PBS, and then the signal value (S) of the fluorescence intensity is measured using a microplate reader “Plate Chameleon V” (manufactured by Hidex).
  • the signal value (S) is combined per signal value (A) of the fluorescent dye alone ⁇ one fluorescent dye-containing resin particle.
  • Antibody molecule with high affinity for antigen
  • an antibody (IgG) that specifically recognizes and binds a protein as a target biological substance as an antigen can be used.
  • an anti-HER2 antibody can be used
  • HER3 is the target biological material
  • an anti-HER3 antibody can be used.
  • an antibody (IgG) that specifically recognizes and binds to the primary antibody as an antigen can be used.
  • Both the primary antibody and the secondary antibody may be polyclonal antibodies, but from the viewpoint of quantitative stability, monoclonal antibodies are preferred.
  • the type of animal that produces the antibody is not particularly limited, and may be selected from mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, sheep, and the like as in the past.
  • Fluorescent nanoparticles are nano-sized particles that emit fluorescence when irradiated with excitation light, and emit fluorescent light with sufficient intensity to represent the target biological substance as a bright spot one molecule at a time. Possible particles.
  • the fluorescent nanoparticles preferably, quantum dots (semiconductor nanoparticles) and fluorescent substance integrated nanoparticles are used.
  • the fluorescent nanoparticles nanoparticles having an emission wavelength within the sensitivity range of the imaging device 20 of the fluorescence microscope 10 are used. Specifically, nanoparticles having an emission wavelength of 400 to 700 nm are used.
  • Quantum Dots As the quantum dots, semiconductor nanoparticles containing a II-VI group compound, a III-V group compound, or a group IV element are used. Examples thereof include CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge.
  • Fluorescent substance integrated nanoparticles are based on organic or inorganic particles, and a plurality of fluorescent substances (for example, the above quantum dots and fluorescent dyes) are encapsulated therein. Nano-sized particles having a structure that is adsorbed and / or adsorbed on its surface. As the fluorescent substance-integrated nanoparticles, it is preferable that the matrix and the fluorescent substance have substituents or sites having opposite charges, and an electrostatic interaction works. As the fluorescent substance integrated nanoparticles, quantum dot integrated nanoparticles, fluorescent dye integrated nanoparticles, and the like are used.
  • Base material As organic substances, resins generally classified as thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, furan resin, etc. Resins generally classified as thermoplastic resins such as styrene resins, acrylic resins, acrylonitrile resins, AS resins (acrylonitrile-styrene copolymers), ASA resins (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymers); Examples of other resins such as lactic acid; polysaccharides. Of the matrix, examples of the inorganic substance include silica and glass.
  • Quantum dot integrated nanoparticle has a structure in which the quantum dot is included in the matrix and / or adsorbed on the surface thereof.
  • the quantum dots may be dispersed inside the matrix and may or may not be chemically bonded to the matrix itself.
  • the fluorescent dye integrated nanoparticle has a structure in which a fluorescent dye is included in the matrix and / or adsorbed on the surface thereof.
  • fluorescent dyes include rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic ring dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, and pyromesene dye molecules.
  • Alexa Fluor registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • BODIPY registered trademark, manufactured by Invitrogen
  • Cy registered trademark, manufactured by GE Healthcare
  • HiLite registered trademark, manufactured by Anaspec
  • DyLight registered trademark, manufactured by Thermo Scientific
  • ATTO registered trademark, manufactured by ATTO-TEC
  • MFP registered trademark, manufactured by Mobitec
  • Dye molecules CF (registered trademark, manufactured by Biotium) dye molecules
  • DY registered trademark, manufactured by DYOMICICS
  • CAL registered trademark, manufactured by BioSearch Technologies
  • Staining method of tissue section An example of a staining method will be described.
  • a method for preparing a tissue section to which this staining method can be applied (also simply referred to as “section”, including a section such as a pathological section) is not particularly limited, and a section prepared by a known procedure can be used.
  • Specimen preparation step (5.1) Specimen preparation step (5.1.1) Deparaffinization treatment
  • the section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
  • the section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, water may be exchanged during the immersion.
  • the activation process of the target biological material is performed according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer A liquid etc. can be used.
  • the pH condition is such that a signal is output from a pH range of 2.0 to 13.0 depending on the tissue slice used, and the roughness of the tissue is such that the signal can be evaluated.
  • the pH is 6.0 to 8.0, but for special tissue sections, for example, pH 3.0 is also used.
  • an autoclave As the heating device, an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the temperature can be 50 to 130 ° C. and the time can be 5 to 30 minutes.
  • the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
  • Immunostaining step in order to stain the target biological material, an immunostaining solution containing fluorescent nanoparticles having sites that can bind directly or indirectly to the target biological material, Place on section and react with target biological material.
  • the immunostaining agent solution used in the immunostaining step may be prepared in advance before this step.
  • the conditions for performing the immunostaining step should be adjusted as appropriate so that an appropriate signal can be obtained according to the conventional immunostaining method. Can do.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the reaction time is preferably 30 minutes or more and 24 hours or less.
  • a known blocking agent such as BSA-containing PBS or a surfactant such as Tween 20 dropwise.
  • tissue specimen after the immunostaining process is preferably subjected to treatment such as immobilization / dehydration, penetration, and encapsulation so as to be suitable for observation.
  • the immobilization / dehydration treatment may be performed by immersing the tissue specimen in a fixation treatment solution (crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol).
  • a fixation treatment solution crosslinking agent such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol.
  • the tissue specimen after the fixation / dehydration process may be immersed in a penetration liquid (xylene or the like).
  • the encapsulating process may be performed by immersing the tissue specimen that has undergone the penetration process in the encapsulating liquid.
  • the conditions for performing these treatments for example, the temperature and immersion time when the tissue specimen is immersed in a predetermined treatment solution, can be adjusted as appropriate in accordance with conventional immunostaining methods so as to obtain an appropriate signal. it can.
  • Morphological Observation Staining Step Apart from the immunostaining step, morphological observation staining may be performed so that the morphology of cells, tissues, organs, etc. can be observed in the bright field.
  • the morphological observation staining step can be performed according to a conventional method. For morphological observation of tissue specimens, staining using eosin, in which cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes are stained from red to dark red, is typically used.
  • hematoxylin in which cell nuclei, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus are stained blue-blue to light blue, is also used as standard (the method of performing these two stainings simultaneously is hematoxylin and eosin staining). (Known as HE staining)).
  • HE staining HE staining
  • the morphological observation staining step it may be performed after the immunostaining step or may be performed before the immunostaining step.
  • Such a method is a method in which a tissue specimen is stained with a plurality of types of immunostaining agents containing fluorescent nanoparticles different from each other and analyzed by the target biological material analysis system 1.
  • the analysis method of the target biological material mainly (S1) Step S1 for calculating the luminance ratio of each immunostaining agent for each filter set 50 (hereinafter also referred to as “luminance ratio calculation step S1”); (S2) Step S2 of measuring the number of fluorescent luminescent spots of the tissue specimen 30 for each filter set 50 and calculating the number of fluorescent luminescent spots for each immunostaining based on the luminance ratio (hereinafter referred to as “fluorescent luminescent spot number calculating step S2”) Say) It has.
  • Luminance ratio calculation step S1 In the luminance ratio calculation step S1, a plurality of types of immunostaining agent spray samples and filter sets 50 corresponding to the number of types of target biological substances for calculating the luminance ratio are prepared.
  • the “immuno-staining spray sample” is a sample in which an immuno-staining agent is applied on a glass substrate.
  • the “plural types of immunostaining agents” include fluorescent nanoparticles different from each other corresponding to the number of types of target biological materials in the tissue specimen sample, and the “multiple types of filter sets 50” also include the target biological materials in the tissue specimen sample.
  • Different excitation filters 52, beam splitters 54 and fluorescence filters 56 corresponding to the number of types are provided.
  • an immunostaining spray sample is placed on the stage 12.
  • the control unit 62 turns on the lamp 40, causes the imaging device 20 to capture the fluorescent image of the tissue specimen sample, and sets the number of fluorescent bright spots of the tissue specimen sample. Measure for each filter set 50.
  • the number of fluorescent luminescent spots for example, “ImageJ” (open source) is used, and by using such image processing software, the fluorescent luminescent spots of a predetermined wavelength (color) are extracted from the fluorescent image and the fluorescent luminescent spots are measured. This process can be performed semi-automatically and quickly.
  • the control unit 62 calculates the luminance ratio of each immunostaining agent for each filter set 50 based on the measurement result of the number of fluorescent bright spots for each filter set 50, and stores this in the storage unit 64.
  • three types of immunostaining agents A to C containing fluorescent nanoparticles emitting green, red, and near-infrared fluorescence are converted into three types of filters for green, red, and near-infrared, respectively.
  • the filter set 50 is switched while switching the set 50, the number of fluorescent bright spots in the fluorescence image of the tissue specimen sample is measured, and the luminance ratio of each immunostaining agent is calculated for each filter set 50.
  • the immunostaining agent A containing fluorescent nanoparticles emitting green light has a luminance ratio of 1: 0.08 when the number of fluorescent bright spots is measured with a filter set 50 for green, red, and near infrared. : Shows an example calculated as 0.01.
  • the luminance ratio is 0.12: 1: 0.08. It is calculated.
  • the immunostaining agent containing fluorescent nanoparticles that emit near-infrared is measured with the filter set 50 for green, red, and near-infrared, the luminance ratio is 0: 0.1: 1. It has been calculated.
  • the following two methods can be given as specific methods for calculating the luminance ratio.
  • the first method (first calculation method) is a method using the total luminance value of bright spots measured in the entire captured image, and the luminance ratio is derived as the ratio of the total luminance values. This method is a simple method that is derived by averaging the entire image, and can be effectively used particularly when each particle does not have a specific luminance ratio and there is no bias in its eigenvalue.
  • the first calculation method there is a method of calculating the luminance ratio R (1 to n, 1 to N) from the following general formula (1).
  • Luminance ratio R (m, k) FL (m, k) / FL (m, p)
  • FL (m, k) is the total luminance value of the bright spots observed in the entire image taken with the immunostaining agent (m) using the filter set (k).
  • FL (m, p) is the total luminance value of bright spots observed in the entire image obtained by photographing the immunostaining agent (m) using the filter set (p).
  • k is an integer in the range of 1 to N.
  • p is an integer in the range of 1 to N.
  • n, N, and m are each a positive integer, and 1 ⁇ m ⁇ n. ]
  • the combination of m, k, and p is the combination that satisfies FL (m, k) ⁇ FL (m, p), so that the upper limit of the luminance ratio R (m, k) Is 1, which is preferable in calculation.
  • the filter set (p) is preferably a filter set that maximizes the total luminance value of the bright spots observed in the entire image obtained by photographing the immunostaining agent (m) among the filter sets (1 to N). .
  • a luminance value per bright spot is measured for each filter set 50, and a luminance ratio is calculated based on the luminance value between the filter sets.
  • a luminance ratio is calculated based on the luminance value between the filter sets.
  • the luminance ratio R (1 to n, 1 to N) is measured, the luminance value of the same bright spot is measured for each filter set (1 to N), and the filter set (p ) Is used as an approximate straight line showing the relationship between the luminance value X obtained when using the filter set (k) and the luminance value Y obtained using the filter set (k), and the inclination a of the following general formula (2)
  • k is an integer in the range of 1 to N
  • p is an integer in the range of 1 to N
  • n, N and m are each a positive integer. Yes, 1 ⁇ m ⁇ n.
  • the filter set (p) has a maximum total luminance value of the bright spots observed in the entire image obtained by photographing the immunostaining agent (m) among the filter sets (1 to N).
  • the maximum value of a is 1 and is preferable in calculation.
  • This second method can approach the true luminance ratio even if each particle has an inherent luminance ratio and the eigenvalue is biased.
  • Fluorescent bright spot calculation step S2 In the fluorescence bright spot calculation step S2, the tissue specimen 30 is stained with a plurality of types of immunostaining agents similar to those described above, and the tissue specimen 30 after immunostaining is placed on the stage 12. Thereafter, each time the filter set 50 is switched while switching the filter set 50, the control unit 62 turns on the lamp 40, causes the imaging device 20 to capture the fluorescent image of the tissue specimen 30, and sets the number of fluorescent bright spots of the tissue specimen 30. Measure for each filter set 50.
  • control unit 62 reads out the luminance ratio calculated in the luminance ratio calculation step S1 and stored in the storage unit 64 from the storage unit 64, and calculates the number of fluorescent bright spots for each immunostaining agent based on the luminance ratio.
  • the luminance ratio for each filter set 50 (1 to N) of each of the immunostaining agents (1 to n) was measured for each R (1 to n, 1 to N) and each filter set 50 (1 to N).
  • TB (1) L (1) + R (1,2) ⁇ L (2) + R (1,3) ⁇ L (3) +.
  • TB (2) R (2,1) ⁇ L (1) + L (2) + R (2,3) ⁇ L (3) +.
  • TB (3) R (3,1) ⁇ L (1) + R (3,2) ⁇ L (2) + L (3) +. ......... «
  • n, N, and m are positive integers, and 1 ⁇ m ⁇ n.
  • the tissue specimen 30 contains three types of target biological substances, which are made up of three types of immunostaining agents A to C including fluorescent nanoparticles that emit green, red, and near-infrared fluorescence.
  • the number of fluorescent bright spots of the fluorescent image of the tissue specimen 30 is measured each time the filter set 50 is switched while switching the three types of filter sets 50 for green, red, and near infrared.
  • the following simultaneous equations should be made when the number of fluorescent bright spots is 572 for the green filter set 50, 680 for the red filter set 50, and 453 for the near infrared filter set 50. Can do.
  • the number of green fluorescent spots is 500, and the number of red fluorescent spots is 600.
  • the number of near-infrared fluorescent spots can be calculated as 400, and as a result, the number of fluorescent spots for each of the immunostaining agents A to C can be calculated.
  • a filter set should be used.
  • fluorescent nanoparticles of the immunostaining agent it is preferable to use nanoparticles having an emission wavelength overlap of 30% or less.
  • “overlapping emission wavelength” is an overlap of the fluorescence spectrum of the other fluorescent nanoparticle B with respect to the fluorescence spectrum of one fluorescent nanoparticle A, and a fluorescent filter corresponding to the fluorescent nanoparticle A
  • the integrated value of the intensity of the fluorescent nanoparticle B in the range of the wavelength width 56a (see the shaded area) with respect to the integrated value of the intensity of the fluorescent nanoparticle A in the wavelength width 56a of 56 see the gray part.
  • the luminance ratio of each immunostaining agent is calculated in advance for each filter set 50, and then the number of fluorescent bright spots (total number) of the tissue specimen 30 is measured for each filter set 50. Based on the calculated luminance ratio, the number of fluorescent bright spots for each immunostaining agent is calculated. In such a case, even when fluorescence from another immunostaining agent is reflected when performing fluorescence observation with one filter set 50, immunostaining at the time of fluorescence observation is based on the already calculated luminance ratio. The number of fluorescent bright spots of the agent can be calculated. Therefore, the number of fluorescent bright spots can be accurately analyzed for each immunostaining agent even in multiple immunostaining using a plurality of types of immunostaining agents.
  • Example 1 (1) Preparation of immunostaining agent (1.1) Synthesis of fluorescent dye-integrated nanoparticles 14.4 mg of Pyrromethene556 dye, which is a green luminescent dye, was added as a fluorescent dye and dissolved in 22 mL of water. Thereafter, 2 mL of a 5% aqueous solution of an emulsion (registered trademark) 430 (polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation) of an emulsifier for emulsion polymerization was added to this solution. This solution was heated to 70 ° C.
  • emulsion registered trademark
  • the mixture was centrifuged at 20000 G for 15 minutes in a centrifuge (Kubota Micro Cooling Centrifuge 3740), and after removing the supernatant, ultrapure water was added and ultrasonically irradiated to redisperse. Centrifugation, supernatant removal, and washing by redispersion in ultrapure water were repeated 5 times.
  • Green fluorescent dye integrated nanoparticles (excitation wavelength 490 nm, emission wavelength 520 nm) were prepared by the above treatment.
  • green fluorescent dye-integrated nanoparticles Sulforhodamine 101 (Texas Red) dye was used in place of the Pyrromethene556 dye, and red fluorescent dye-integrated nanoparticles (excitation wavelength 590 nm, emission wavelength 620 nm) were also prepared. Furthermore, in the preparation of such green fluorescent dye-integrated nanoparticles, Cy5 dye was used in place of Pyrromethene556 dye, and near-infrared fluorescent dye-integrated nanoparticles (excitation wavelength 643 nm, emission wavelength 647 nm) were also prepared.
  • Immunostaining sprays were prepared by applying immunostaining agents A to C to glass slides, respectively. In addition, it is good also as using the human breast tissue specimen sample which contains three types of antigens HER2, Ki67, and Cytokeratin 14, and the ratio of the expression of antigens is recognized in advance.
  • Step (4-1) The tissue specimen was immersed in a container containing xylene for 15 minutes. The xylene was changed twice during the process.
  • Step (4-2) The tissue specimen was immersed in a container containing ethanol for 10 minutes. The ethanol was changed twice during the process.
  • Step (4-3) The tissue specimen was immersed in a container containing water for 10 minutes.
  • Step (4-4) The tissue specimen was immersed in a 10 mM citrate buffer (pH 6.0).
  • Step (4-10) Immunostaining agent B bound with anti-Ki67 antibody diluted to 0.1 nM with PBS containing 1% BSA was placed on a tissue specimen and allowed to stand overnight.
  • Step (4-11) The stained tissue specimen was immersed in a container containing PBS for 15 minutes.
  • Step (4-12) Immunostaining agent C bound with anti-Cytokeratin 14 antibody diluted to 0.1 nM with PBS containing 1% BSA was placed on a tissue specimen and allowed to stand overnight.
  • steps (4-8) to (4-13) immunostaining agents A, B, and C adjusted to a final concentration of 0.1 nM with 1% BSA-containing PBS were placed on a tissue specimen and allowed to stand overnight. Thereafter, the stained tissue specimen may be immersed in a container containing PBS for 15 minutes.
  • Example 2 (1) Preparation of immunostaining agent (1.1) Synthesis of fluorescent dye-integrated nanoparticles In the same manner as in “(1.1) Synthesis of fluorescent dye-integrated nanoparticles” in Example 1, green fluorescent dye-integrated nanoparticles ( An excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 520 nm were prepared.
  • Sulforhodamine 101 (Texas® Red) dye was used in place of the Pyrromethene556 dye, and red fluorescent dye-integrated nanoparticles (excitation wavelength 590 nm, emission wavelength 620 nm) were also prepared.
  • Step (4-1) The tissue specimen was immersed in a container containing xylene for 15 minutes. The xylene was changed twice during the process.
  • Step (4-2) The tissue specimen was immersed in a container containing ethanol for 10 minutes. The ethanol was changed twice during the process.
  • Step (4-3) The tissue specimen was immersed in a container containing water for 10 minutes.
  • Step (4-4) The tissue specimen was immersed in a 10 mM citrate buffer (pH 6.0).
  • Step (4-6) The tissue specimen after autoclaving was immersed in a container containing PBS for 15 minutes. The PBS was changed three times during the process.
  • Step (4-7) PBS containing 1% BSA was placed on the tissue specimen and allowed to stand for 1 hour.
  • Step (4-8) The anti-PD-L1 antibody / anti-EGFR antibody mixed solution diluted to 3 ⁇ g / mL with PBS containing 1% BSA was placed on the tissue specimen and left overnight.
  • Step (4-8) Immunostaining agent D bound with anti-DIG antibody and anti-FITC antibody E bound with anti-FITC antibody diluted to 0.1 nM with PBS containing 1% BSA and put on tissue specimen Left overnight.
  • Example 3 an example in which a tissue specimen is extracted from an animal model and sampled
  • Bright spots derived from PD-L1 and EGFR were detected in the same manner as in Example 2, except that a tissue sample extracted from a PDX mouse (Patient-derived xenograft) was used as a tissue sample to be examined.
  • PDX is an abbreviation for Patient-derived tumor xenograft, in which tissue derived from a patient (human) is transplanted into a mouse or other laboratory animal and allowed to grow in the body of the mouse for a certain period of time.
  • the tissue specimen used in this example was prepared by the following procedure.
  • a part of the extracted cancer tissue was fixed with 10% formalin for 24 hours, and then stored in a block form with paraffin.
  • Example 2 The obtained paraffin block was cut out to a thickness of 4 ⁇ m and pasted on a glass slide, and immunostaining and analysis of the stained image were performed in the same manner as in Example 2.
  • “(1.2) Modification of fluorescent dye-integrated nanoparticles” in Example 2 was changed as follows. Maleimide was introduced into the end of the green fluorescent dye-integrated nanoparticles using NHS-PEG (polyethylene glycol) -maleimide reagent to obtain fluorescent substance-encapsulated melamine nanoparticles having a maleimide group at the end.
  • NHS-PEG polyethylene glycol
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • streptavidin solution was obtained.
  • the fluorescent substance-encapsulated melamine nanoparticles and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and reacted at room temperature for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction.
  • Example 2 “(1.3) Modification of secondary antibody” in Example 2 was changed to biotin modification as follows. (Production of biotin-modified anti-rabbit IgG antibody) In a 50 mM Tris solution, 50 ⁇ g of an anti-rabbit IgG antibody used as a secondary antibody was dissolved. To this solution, a DTT (dithiothreitol) solution was added to a final concentration of 3 mM, mixed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the reaction solution was passed through a desalting column “Zeba Desalt Spin Columns” (Thermo Scientific, Cat. # 89882) to purify the secondary antibody reduced with DTT.
  • DTT dithiothreitol
  • the linker reagent “Maleimide-PEG2-Biotin” (Thermo Scientific, product number 21901) was adjusted to 0.4 mM using DMSO. 8.5 ⁇ L of this linker reagent solution was added to the antibody solution, mixed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to bind biotin to the anti-rabbit IgG antibody via the PEG chain. The reaction solution was purified through a desalting column.
  • the absorbance at a wavelength of 300 nm was measured using a spectrophotometer (Hitachi “F-7000”) to calculate the concentration of the protein (biotin-modified secondary antibody) in the reaction solution.
  • a solution in which the concentration of the biotin-modified secondary antibody was adjusted to 250 ⁇ g / mL using a 50 mM Tris solution was used as a biotin-modified secondary antibody solution. Staining with “immunostaining agent D” was performed as follows.
  • a primary reaction treatment was performed at a concentration of 0.05 nM of an anti-PD-L1 rabbit monoclonal antibody (clone “SP142” Spring Bioscience (SBS)), and then the biotin-modified anti-rabbit IgG antibody prepared in a PBS solution of 6 ⁇ g / mL. Secondary reaction treatment was performed.
  • the present invention provides an analysis method and analysis system for a target biological material that can accurately analyze the number of fluorescent bright spots for each immunostaining agent even in multiple immunostaining using multiple types of immunostaining agents Suitable for doing.

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Abstract

本発明の課題は、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析する目的生体物質の解析システムを提供することである。当該目的生体物質の解析システム１は、組織標本３０を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡１０を用いて解析するシステムである。解析システム１では、前記免疫染色剤で染色された組織標本３０を撮像する蛍光顕微鏡１０と、蛍光顕微鏡１０を制御する制御装置６０とを備える。制御装置６０は、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセット５０ごとの輝度比率を記憶する記憶部６４と、蛍光顕微鏡１０の撮像結果から、組織標本３０のフィルターセット５０ごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する制御部６２とを有する。

Description

目的生体物質の解析方法および解析システム
　本発明は目的生体物質の解析方法および解析システムに関する。
　従来の免疫染色では、組織切片上で、観察対象となる抗原を、抗体修飾した蛍光体（免疫染色剤）に結合させることで標識し、蛍光顕微鏡で観察することが行われている。
　免疫染色を用いたがん関連の病理検査において、同一の組織切片上に複数種類の抗原が存在するような場合、抗原ごとに陽性か陰性かを見ることで、抗がん剤治療の予後不良などを診断することができる。
　本出願人はかかる病理検査において、抗原ごとに蛍光輝点数や蛍光強度を解析してその発現レベルを計測しうる生体物質の検出方法や免疫染色剤を提供している（特許文献１、実施例３参照）。
国際公開第２０１２／０２９３４２号
　ところで、蛍光顕微鏡による観察では、免疫染色剤の種類（蛍光体の励起波長および発光波長）に応じたフィルターセットが鏡筒の所定位置にセットされ観察が行われる。
　しかしながら、上記のとおり、複数種類の免疫染色剤を使用し蛍光顕微鏡で観察する場合、１つのフィルターセットで蛍光観察を行ったとき、他の免疫染色剤からの蛍光が映り込んでしまい、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数または蛍光輝点から算出される蛍光体粒子数を正確に解析（算出）しえないことがわかってきた。
　したがって本発明の主な目的は、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる目的生体物質の解析方法および解析システムを提供することにある。
　上記課題を解決するため、本発明の一態様によれば、
　組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析方法において、
　前記免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出する工程と、
　前記組織標本の蛍光輝点数を前記フィルターセットごとに計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程と、
　を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法が提供される。
　本発明の他の態様によれば、
　組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析システムにおいて、
　前記免疫染色剤で染色された前記組織標本を撮像する蛍光顕微鏡と、
　前記蛍光顕微鏡を制御する制御装置であって、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセットごとの輝度比率を記憶する記憶部と、前記蛍光顕微鏡の撮像結果から、前記組織標本の前記フィルターセットごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する算出部とを有する前記制御装置と、
　を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システムが提供される。
　本発明によれば免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる。
目的生体物質の解析システムの概略的な構成を示す図である。 目的生体物質の解析方法を経時的に示すフローチャートである。 輝度比率の算出工程の処理を概略的に説明する図である。 輝度比率の具体的な算出方法の一例を説明するグラフである。 蛍光輝点数の算出工程の処理を概略的に説明する図である。 フィルターセットの励起フィルターと蛍光フィルターとの関係を概略的に示す図である。 フィルターセットの蛍光フィルター同士の関係を概略的に示す図である。 蛍光ナノ粒子の発光波長のスペクトルの重複を概略的に説明する図である。
　以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。
　下記では、数値範囲を示す「～」の前後に記載される上限値および下限値はその数値範囲に含まれるものとする。
［目的生体物質の解析システム］
　図１に示すとおり、目的生体物質の解析システム１は蛍光顕微鏡１０、制御装置６０および表示装置７０を備えている。
　蛍光顕微鏡１０はステージ１２、対物レンズ１４、鏡筒１６、接眼レンズ１８および撮像素子２０を備えている。ステージ１２には免疫染色後の組織標本３０が設置される。鏡筒１６にはランプ４０およびフィルターセット５０が内蔵されている。フィルターセット５０は励起フィルター５２、ビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を備えている。
　ランプ４０は励起光を出射するランプである。励起フィルター５２は励起光だけを透過するフィルターである。ビームスプリッター５４は所定波長の光を境界として反射または透過する光学部品であって、ここでは励起光を反射し蛍光を透過するものである。蛍光フィルター５６は励起光を遮断し蛍光だけを透過するフィルターである。
　蛍光顕微鏡１０では、ランプ４０が点灯すると、励起光が励起フィルター５２を透過しビームスプリッター５４で反射され、対物レンズ１４を通過し組織標本３０に照射される。その結果組織標本３０で蛍光が発光され、蛍光は対物レンズ１４で集光されビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を透過する。その後、蛍光は蛍光像として接眼レンズ１８を介して観察されるとともに、撮像素子２０に撮像される。
　蛍光顕微鏡１０にはこれらを制御する制御装置６０が接続されている。
　制御装置６０は制御部６２および記憶部６４を備えている。
　制御部６２はステージ１２と接続され、ステージ１２の昇降を制御し焦点位置（高さ位置）を制御しうる。制御部６２は撮像素子２０と接続され、撮像素子２０を制御し蛍光像を撮像させ、その蛍光像を受け蛍光画像を生成しうる。制御部６２はランプ４０と接続され、ランプ４０の点灯および消灯を制御しうる。記憶部６４には図２の蛍光輝点数算出処理を実行するための目的生体物質の解析プログラムが記憶されている。
　制御装置６０には表示装置７０が接続され、表示装置７０には制御装置６０による算出結果などが表示される。
［組織標本］
　続いて、組織標本３０について説明する。
　組織標本３０は目的生体物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色され、染色後の組織標本３０が蛍光顕微鏡１０のステージ１２に設置される。
（１）目的生体物質
　目的生体物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいい、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）である。
　典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
（２）免疫染色剤（抗体－蛍光ナノ粒子の結合体）
　免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
　免疫染色剤の一例として、［目的生体物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］～［蛍光ナノ粒子（以下、「蛍光色素内包樹脂粒子」ともいう。）］が挙げられる。
　“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“～”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
　また、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応で連結される形態以外の、目的生体物質に対する免疫染色剤の形態としては、結合能力の高いハプテン分子を用いた［ハプテン標識一次抗体］…［ハプテンに対する抗体（抗ハプテン抗体）］～［蛍光ナノ粒子］が挙げられるし、同様に結合能力の高い［ビオチン標識一次抗体］…［アビジン］～［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。具体的には、ハプテン、抗ハプテン抗体(ジニトロフェノール、抗ジニトロフェノール抗体、ジゴキシゲニン、抗ジゴキシゲニン抗体、フルオレセイン、抗フルオレセイン抗体など)、ビオチン、アビジンおよびその改変体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）が、間接反応に関与する化合物として挙げられる。あるいは、ＦＩＳＨにおいては、ハプテンを結合させた核酸分子（プローブ）と、ハプテン親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む複合体を形成させる実施形態において用いられる。
　親和性分子を間接的に結合する場合の態様としては、両末端に官能基を有する高分子を用いて、それらの官能基を樹脂が有する官能基と親和性分子が有する官能基のそれぞれと反応させることにより、蛍光色素内包樹脂粒子と親和性分子とをその高分子由来のスペーサー（リンカー）を介して結合させる態様が挙げられる。特にこのような実施形態において、蛍光色素内包樹脂粒子表面の単位面積当たりに結合する親和性分子の量が変動しやすいため、本発明を適用することの有効性が高い。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を利用して、第１親和性分子と（必要に応じてスペーサーと）蛍光色素内包樹脂粒子とを共有結合させることができる。第１親和性分子、必要に応じて用いられるスペーサーの両端、蛍光色素内包樹脂粒子の表面のそれぞれに、上述した反応に関与する官能基を導入しておき、所定の条件下で反応させることで、共有結合によって連結することができる。なお、第１親和性分子とは、このように、蛍光色素内包樹脂粒子の表面に結合している親和性分子をいう。
　スペーサーのなかでは、非特異的吸着を抑制できることなどの観点から親水性高分子が好ましく、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい観点から好ましい。ＰＥＧを用いる場合は、例えばサーモサイエンティフィック社等の市販のものを購入したり、化学構造の繰り返しの単位の数を設定して、試薬メーカー等に製造を依頼したりすることで任意の長さのものを入手することができる。
　スペーサーの長さは、結合する蛍光色素内包樹脂粒子の粒径に応じて、適切な範囲で調整すればよい。単一の長さをもつスペーサーを用いてもよいし、それぞれ異なった２種類以上の長さをもつスペーサーを併用してもよい。単一のスペーサーを用いる場合、スペーサーの長さは１～１００ｎｍが好ましい。２種類以上の長さを有するスペーサーを用いる場合、そのうちの少なくとも１種類のスペーサーの長さが１～１００ｎｍであり、他のスペーサーの長さが０．１～１０ｎｍであることが好ましい。
　ここで、免疫染色反応の良しあしを決定する重要な要因として生体親和性の性能が挙げられる。この生体親和性の性能は、次のような方法により評価することができる。すなわち、表面に第１親和性分子(代表的にはアビジン)を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該親和性分子と特異的に結合可能な分子（以下、このような分子を「第２親和性分子」ともいい、例えばアビジンに対するビオチンが例として挙げられるがこれに限定されない。）を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産・評価方法である。
　０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）　≦　Ｓ　≦　１．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
　Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
　Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合される第１親和性分子の数
　Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
　Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
　このような粒子の生産・評価方法により、十分な染色性能を持った蛍光色素内包樹脂粒子溶液を選択し、さらに所定の方法で得られた信号値に基づいて蛍光色素内包樹脂粒子の濃度を調整することにより、一定の染色性能を持つ蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得ることができる。例えば第２親和性分子がビオチンであり、ビオチン化プレートを用いて、ＳＡで修飾された表面修飾後の蛍光色素内包樹脂粒子を用いた場合、プレートから得られた信号値とその粒子を用いて実際に免疫染色を行なった輝度の強さとの相関関係が高いことから、実際に染色をおこなわずとも粒子の染色性能を判断することがでる。さらに、蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、ビオチン化プレートに蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように溶液を希釈することによって、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を同等の染色性能を持つように調整することが可能となる。従って、異なったロットの蛍光色素内包樹脂粒子溶液を用いて病理染色を行なった場合でも、ばらつきのない染色結果を得ることが可能となる。上記Ａの規定に含まれている、蛍光色素の「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」（ａ）は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）と、それと同じ一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9分子／ｍＬ）の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、それぞれの溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。ここで、蛍光色素内包樹脂粒子内には蛍光色素同士が高濃度で集積しているので、濃度消光と呼ばれる現象により、蛍光色素内包樹脂粒子内が発する蛍光が弱められている可能性がある。そのため、「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」に「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、濃度消光の影響が補正された蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を算出することができる。この「補正後の蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」を「蛍光色素標準液の蛍光強度」で割れば、言い換えれば「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度／蛍光色素標準液の蛍光強度」×「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を算出することにより、「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」が求まる。なお、量子収率は公知の手段で、例えば「Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ－ＱＹ」（絶対ＰＬ量子収率測定装置、浜松ホトニクス株式会社）を用いて、計測することができる。
　上記ａの値が算出できれば、その数の蛍光色素を含有する溶液を調製し、第２親和性分子が固定化されたプレートに塗布するなどして反応させることにより、その結果発せられる蛍光強度（信号値）（Ａ）を計測することができる。
　上記Ｂの規定に含まれている「一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数」（ｂ１）は、その全表面に結合している第１親和性分子の総重量を、第１親和性分子の分子量で除することにより算出することができる。ストレプトアビジンに代表される第１親和性分子がタンパク質であるのに対し、蛍光色素内包樹脂粒子の母体は樹脂であるので、ＢＣＡ法等のタンパク質の定量方法に基づいて、一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液中のタンパク質（その全てが蛍光色素内包樹脂粒子の表面に結合しているものとする）の濃度を測定することができる。その測定された濃度に「一定量の溶液」の体積を掛ければ、前記タンパク質の総重量を算出することができ、その総重量を前記タンパク質の分子量（例えばストレプトアビジンの分子量は５２０００）で除すれば、Ｂの規定に用いられる前記タンパク質（前記第１親和性分子）の全数を算出することができる。
　また、同じく上記Ｂの規定に含まれている、前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる「蛍光色素内包樹脂粒子数」（ｂ２）は、粒子カウンター（例えばリオン社製「Liquid Particle Counter」）で計測することが可能である。前項にある第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子一つに結合している第１親和性分子の数を計算することが可能である。
　上記ｂ１およびｂ２の値が算出できれば、ｂ１／ｂ２により、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数（平均値）（Ｂ）が求まる。
　上記Ｃの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、粒子カウンターを利用して、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）を調製し、発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を、当該標準液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度が求まる。
　上記Ｄの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０9分子／ｍＬ、蛍光色素の分子量をＷとすればＷ×１０-14ｇ／ｍＬ）の一定量の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、その溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素標準液の蛍光強度に、「蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている蛍光色素の分子数（ないしその重量）／蛍光色素標準液中の蛍光色素の分子数（ないしその重量）」を乗じ、さらに、前述したような濃度消光の影響を補正するため、「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数（ないし同等の重量）あたりの蛍光色素単体の蛍光強度が求まる。
　なお、上記ＣおよびＤで規定する発光強度の測定方法は特に限定されるものではなく、一般的な蛍光光度計を用いて、適切な測定条件において測定すればよい。
　信号値が上記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液、換言すれば、相対値化された信号値：Ｓ／｛Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）｝が０．５～１．２の範囲にある蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、染色液として十分な染色性能があると考えられる。たとえば、ＳＡ結合蛍光標識液の評価は、次の通り実施できる。
　まず、ＳＡ結合蛍光標識体の保存液を採取し、パーティクルカウンター「Ｌｉｑｕｉｄ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｃｏｕｎｔｅｒ」（リオン社製）で粒子数を測定した後、濃度を０．０５ｎＭに調整する。市販のビオチン化プレート「Ｗｅｌｌ－Ｃｏａｔｅｄ　Ｂｉｏｔｉｎ，　９６－ｗｅｌｌ，　Ｂｌａｃｋ」（Ｇ－ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製）をＰＢＳで５回洗浄した後、当該プレート上に、上記の濃度を調整した溶液を、１ウェルにつき１００μＬずつ添加し、４℃で一昼夜反応させる。反応後のプレートをＰＢＳで洗浄した後、マイクロプレートリーダー「プレートカメレオンＶ」（Ｈｉｄｅｘ社製）を用いて、蛍光強度の信号値（Ｓ）を測定する。ここで、例えば、後述の実施例３で得られる「免疫染色剤Ｄ」について、信号値（Ｓ）を、蛍光色素単体での信号値（Ａ）×蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している親和性分子の数（Ｂ）×｛蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度（Ｃ）／（蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体での発光強度（Ｄ）｝で割ると、相対値化した値は０．８となるため、良好な染色性能が得られることがわかる。一方、後述の実施例１でニカラック（メラミン樹脂）を用いて作製した蛍光色素集積ナノ粒子に代えて、スチレン樹脂を用いて作製した蛍光色素集積ナノ粒子により染色した場合には良好な染色性能が得られず、その粒子の相対値は０．４である。総じて０．５以上出れば良好な染色性能が得られる。
　本発明によれば、良好な染色性能が得られない粒子を用いた多重染色においても、輝点数算出精度を向上させることが出来る。
（３）抗体（抗原に対して親和性の高い分子）
　一次抗体には、目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＨＥＲ２を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
　二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
　一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
（４）蛍光ナノ粒子
　蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
　蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。
　蛍光ナノ粒子として、好ましくは発光波長が蛍光顕微鏡１０の撮像素子２０の感度域内に存在するナノ粒子であって、詳しくは発光波長が４００～７００ｎｍのナノ粒子が使用される。
（４．１）量子ドット
　量子ドットとしては、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
（４．２）蛍光物質集積ナノ粒子
　蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
　蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
　蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
（４．２．１）母体
　母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
　母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
（４．２．２）量子ドット集積ナノ粒子
　量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
　量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（４．２．３）蛍光色素集積ナノ粒子
　蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
　蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
　蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
　なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
（５）組織切片の染色方法
　染色方法の一例について説明する。
　この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
（５．１）標本作製工程
（５．１．１）脱パラフィン処理
　キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
（５．１．２）賦活化処理
　公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
　ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０～１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０～８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
　加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０～１３０℃、時間は５～３０分で行うことができる。
　次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
（５．２）免疫染色工程
　免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
　免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
　温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
（５．３）標本後処理工程
　免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
　固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
　これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
（５．４）形態観察染色工程
　免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
　形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
　組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
　形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
［目的生体物質の解析方法］
　続いて、目的生体物質の解析方法について説明する。
　かかる方法は、組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを目的生体物質の解析システム１で解析する方法である。
　図２に示すとおり、目的生体物質の解析方法では主に、
（Ｓ１）免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出する工程Ｓ１（以下、「輝度比率算出工程Ｓ１」ともいう。）と、
（Ｓ２）組織標本３０の蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測し、前記輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程Ｓ２（以下、「蛍光輝点数算出工程Ｓ２」ともいう。）と、
　を備えている。
（１）輝度比率算出工程Ｓ１
　輝度比率算出工程Ｓ１では、輝度比率を算出するための目的生体物質の種類数に対応する複数種類の免疫染色剤散布サンプルおよびフィルターセット５０を、準備する。
　「免疫染色剤散布サンプル」とは、免疫染色剤をガラス基板上に塗布したものである。「複数種類の免疫染色剤」は、組織標本サンプルの目的生体物質の種類数に対応する、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含み、「複数種類のフィルターセット５０」も、組織標本サンプルの目的生体物質の種類数に対応する、互いに異なる励起フィルター５２、ビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を備える。
　その後、免疫染色剤散布サンプルをステージ１２に設置する。
　その後、フィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、制御部６２が、ランプ４０を点灯させ、組織標本サンプルの蛍光像を撮像素子２０に撮像させ、組織標本サンプルの蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測する。
　蛍光輝点数の計測では、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が使用され、かかる画像処理ソフトウエアを利用することにより、蛍光像から所定波長（色）の蛍光輝点を抽出し蛍光輝点を計測する処理を、半自動的に迅速に行いうる。
　その後、制御部６２が、フィルターセット５０ごとの蛍光輝点数の計測結果に基づき、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出し、これを記憶部６４に記憶させる。
　たとえば、図３に示すとおり、緑色、赤色、近赤外線の蛍光を発光する蛍光ナノ粒子を含む３種類の免疫染色剤Ａ～Ｃを、それぞれ緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、組織標本サンプルの蛍光像の蛍光輝点数を計測し、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出する。
　図３では、緑色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ａが、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が１：０．０８：０．０１と算出された例を示している。
　赤色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ｂが、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が０．１２：１：０．０８と算出されている。
　近赤外線を発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤が、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が０：０．１：１と算出されている。
　この輝度比率の具体的な算出方法としては、次の二つを挙げることが出来る。まず一つ目の方法（第１の算出方法）は、撮影画像全体で計測された輝点の合計輝度値を用いる方法であり、合計輝度値の比として輝度比率が導かれる。この方法は、画像全体を平均化して導かれる簡易な方法であり、特に、一つ一つの粒子が固有の輝度比率を持たず、その固有値に偏りがない場合に有効に使用できる。
　第１の算出方法の具体例としては、輝度比率Ｒ（１～ｎ，１～Ｎ）を、下記一般式（１）から算出する方法が挙げられる。
　一般式（１）：輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）＝ＦＬ（ｍ，ｋ）／ＦＬ（ｍ，ｐ）
　[上記一般式（１）において、ＦＬ（ｍ，ｋ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｋ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ＦＬ（ｍ，ｐ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｐ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ｋは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]
　なお、上記一般式（１）において、ｍ、ｋ、ｐの組み合わせは、ＦＬ（ｍ，ｋ）≦ＦＬ（ｍ，ｐ）を満たす組み合わせであることが、輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）の上限が１となり、計算上好ましい。すなわち、フィルターセット（ｐ）はフィルターセット（１～Ｎ）のうち、免疫染色剤（ｍ）を撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値が最大となるフィルターセットであることが好ましい。
　一方、二つ目の方法（第２の算出方法）としては、一輝点あたりの輝度値を、フィルターセット５０ごとに測定し、フィルターセット間での輝度値に基づいて、輝度比率を算出する方法が挙げられる。具体的には、例えば、緑色用、赤色用、近赤外用のフィルターセット５０ごとに輝度値を測定し、緑色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ａの輝度比率を求める場合、緑色用のフィルターセット５０で測定された輝度値を縦軸、赤色（もしくは近赤外用）のフィルターセット５０で測定された輝度値を横軸としたグラフを作成する(図４参照。)。そして、このグラフから得られる近似曲線y=ａxのａを緑色用のフィルターセット５０での測定値に対する赤色もしくは近赤外用のフィルターセット５０の輝度比率とする。
　すなわち、第２の算出方法とは、まず、輝度比率Ｒ（１～ｎ，１～Ｎ）を、同一輝点の輝度値を前記フィルターセット（１～Ｎ）ごとに測定し、フィルターセット（ｐ）を使用したときに得られる輝度値Ｘと、フィルターセット（ｋ）を使用したときに得られる輝度値Ｙとの関係を示す近似直線である下記一般式（２）の傾きａを輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）として算出する方法である。なお、この第２の算出方法において、ｋは、１～Ｎの範囲内の整数であり、ｐは、１～Ｎの範囲内の整数であり、ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。
　一般式（２）：Ｙ＝ａＸ
　なお、上記一般式（２）において、フィルターセット（ｐ）はフィルターセット（１～Ｎ）のうち、免疫染色剤（ｍ）を撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値が最大となるフィルターセットであることが、ａの最大値が１となり、計算上好ましい。
　この二つ目の方法は、一つ一つの粒子が固有の輝度比率を持っていて、その固有値に偏りがある場合であっても、真の輝度比率へ近づけることができる。
（２）蛍光輝点数算出工程Ｓ２
　蛍光輝点数算出工程Ｓ２では、組織標本３０を、上記と同様の複数種類の免疫染色剤で染色し、免疫染色後の組織標本３０をステージ１２に設置する。
　その後、フィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、制御部６２が、ランプ４０を点灯させ、組織標本３０の蛍光像を撮像素子２０に撮像させ、組織標本３０の蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測する。
　その後、制御部６２が、輝度比率算出工程Ｓ１で算出し記憶部６４に記憶させた輝度比率を記憶部６４から読み出し、その輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する。
　かかる場合、免疫染色剤（１～ｎ）それぞれのフィルターセット５０（１～Ｎ）ごとの輝度比率をＲ（１～ｎ，１～Ｎ）と、フィルターセット５０（１～Ｎ）ごとに計測した組織標本３０の蛍光輝点数をＴＢ（１～Ｎ）と、免疫染色剤（１～ｎ）ごとの蛍光輝点数をＬ（１～ｎ）として下記の連立方程式を作り、その連立方程式の解から、免疫染色剤（ｍ）の蛍光輝点数Ｌ（ｍ）を算出する。
　　　ＴＢ（１）＝Ｌ（１）＋Ｒ（１，２）×Ｌ（２）＋Ｒ（１，３）×Ｌ（３）＋…
　　　ＴＢ（２）＝Ｒ（２，１）×Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋Ｒ（２，３）×Ｌ（３）＋…
　　　ＴＢ（３）＝Ｒ（３，１）×Ｌ（１）＋Ｒ（３，２）×Ｌ（２）＋Ｌ（３）＋…
　　　……………
　ただし、ｎ、Ｎ、ｍは正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。
　たとえば、図５に示すとおり、組織標本３０に３種類の目的生体物質が含まれ、これを緑色、赤色、近赤外線の蛍光を発光する蛍光ナノ粒子を含む３種類の免疫染色剤Ａ～Ｃで染色した場合、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、組織標本３０の蛍光像の蛍光輝点数を計測する。
　かかる場合、緑色用のフィルターセット５０で５７２個、赤色用のフィルターセット５０で６８０個、近赤外線用のフィルターセット５０で４５３個の蛍光輝点数を計測したときは、下記の連立方程式を作ることができる。
　　　５７２＝Ｌ（１）＋０．１２Ｌ（２）＋０Ｌ（３）
　　　６８０＝０．０８Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋０．１Ｌ（３）
　　　４５３＝０．０１Ｌ（１）＋０．０８Ｌ（２）＋Ｌ（３）
　かかる連立方程式を解くと、Ｌ（１）＝５００、Ｌ（２）＝６００、Ｌ（３）＝４００という解が得られ、緑色の蛍光輝点数を５００と、赤色の蛍光輝点数を６００と、近赤外線の蛍光輝点数を４００と算出することができ、結果的に免疫染色剤Ａ～Ｃごとの蛍光輝点数を算出することができる。
　輝度比率算出工程Ｓ１、蛍光輝点数算出工程Ｓ２では、フィルターセット５０として、図６に示すとおり、励起フィルター５２の波長幅５２ａが２０～３０ｎｍで、蛍光フィルター５６の波長幅５６ａが３０～５０ｎｍのフィルターセットを使用するのがよい。
　かかる場合、図７に示すとおり、蛍光フィルター５６同士の波長重複幅５６ｂが１０ｎｍ以下のフィルターセット５０を使用するのがよい。
　免疫染色剤の蛍光ナノ粒子としても、発光波長の重複が３０％以下のナノ粒子を使用するのがよい。
　「発光波長の重複」とは、図８に示すとおり、一方の蛍光ナノ粒子Ａの蛍光スペクトルに対する、他方の蛍光ナノ粒子Ｂの蛍光スペクトルの重複であって、蛍光ナノ粒子Ａに対応する蛍光フィルター５６の波長幅５６ａでの蛍光ナノ粒子Ａの強度の積分値（グレー部参照）に対する、波長幅５６ａの範囲での蛍光ナノ粒子Ｂの強度の積分値（斜線部参照）である。図８の例では、グレー部の面積に対する、斜線部の面積が３０％以下である蛍光ナノ粒子Ｂを使用するのがよい。
　以上の本実施形態によれば、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに事前に算出しておき、その後に組織標本３０の蛍光輝点数（総数）をフィルターセット５０ごとに計測し、算出済みの輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出している。
　かかる場合、１つのフィルターセット５０で蛍光観察を行っているときに、他の免疫染色剤からの蛍光が映り込んでしまっても、すでに算出済みの輝度比率に基づき、その蛍光観察時の免疫染色剤の蛍光輝点数が算出されうる。そのため、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる。
　〔実施例１〕
（１）免疫染色剤の作製
（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成
　蛍光色素として緑色発光色素であるPyrromethene556色素１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
　さらに、この溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。
　得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素などの不純物を除くため、純水による洗浄を行った。具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。
　以上の処理により、緑色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長490nm、発光波長520nm）を作製した。
　かかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてSulforhodamine101（Texas Red）色素を使用し、赤色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長590nm、発光波長620nm）も作製した。
　さらにかかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてCy5色素を使用し、近赤外線蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長643nm、発光波長647nm）も作製した。
（１．２）蛍光色素集積ナノ粒子の修飾
　緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ－ＰＥＧ（polyethylene glycol）－マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＨＥＲ２抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ａ」とした。
　これと同様に、赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｋｉ６７抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ｂ」とした。
　近赤外線蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ｃ」とした。
（２）免疫染色剤散布サンプルの作製および輝度比率の測定
（２．１）免疫染色剤Ａ～Ｃをそれぞれガラススライドに塗布することで、免疫染色剤散布スライドを作製した。なお、ヒト乳房組織標本サンプルとして、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４の３種類の抗原を含み、かつ、抗原同士の発現の割合があらかじめ認識されているものを使用することとしてもよい。
（２．２）蛍光顕微鏡観察
　蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤Ａ～Ｃ（緑色用、赤色用、近赤外線用）に対応する下記３種類のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）蛍光顕微鏡観察
免疫染色剤散布サンプルをステージに設置し、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、免疫染色剤散布サンプルの蛍光像の画面全体の蛍光輝点から算出された合計輝度値の輝度比率(第１の算出方法)又は、一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ａ～Ｃそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに輝度比率を算出した(第２の算出方法)。第１の算出方法及び第２の算出方法どちらを用いた場合も、同じ輝度比率が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（４）組織標本の免疫染色
　ヒト乳房組織標本の免疫染色を行った。
　下記工程（４－１）～（４－１５）の方法により、免疫染色剤Ａ～Ｃを用いてヒト乳房組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
　工程（４－１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
　工程（４－２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
　工程（４－３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
　工程（４－４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
　工程（４－５）：１２１度で５分オートクレーブ処理を行った。
　工程（４－６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
　工程（４－７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
　工程（４－８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体が結合された免疫染色剤Ａを、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させた。
　工程（４－１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された免疫染色剤Ｂを、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－１１）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させた。
　工程（４－１２）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４抗体が結合された免疫染色剤Ｃを、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－１３）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を３０分浸漬させた。
　なお、工程（４－８）～工程（４－１３）では、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで最終濃度を０．１ｎＭに調整した免疫染色剤Ａ、Ｂ、Ｃを、組織標本に載せて一晩放置し、その後に、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させてもよい。
　工程（４－１４）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
　工程（４－１５）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（５）顕微鏡観察
　免疫染色後の組織標本をステージに設置し、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本の蛍光像の蛍光輝点数を計測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　蛍光輝点数の計測結果から、下記の連立方程式が作られた。
　　　１６５６＝Ｌ（１）＋０．１２Ｌ（２）＋０Ｌ（３）
　　　１５４５＝０．０８Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋０．１Ｌ（３）
　　　１３６９＝０．０１Ｌ（１）＋０．０８Ｌ（２）＋Ｌ（３）
　かかる連立方程式を解くと、Ｌ（１）＝１５００、Ｌ（２）＝１３００、Ｌ（３）＝１２５０という解が得られ、緑色の蛍光輝点数を１５００と、赤色の蛍光輝点数を１３００と、近赤外線の蛍光輝点数を１２５０と算出され、結果的に免疫染色剤Ａ～Ｃごとの蛍光輝点数を算出することができた。
　すなわち、以上の結果から、検査対象の組織標本では、ＨＥＲ２：Ｋｉ６７：Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４＝１５００：１３００：１２５０の割合で発現していることが確認された。
　〔実施例２〕
　（１）免疫染色剤の作製
（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成
　実施例１の「（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成」と同様にして、緑色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長490nm、発光波長520nm）を作製した。
　かかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてSulforhodamine101（Texas Red）色素を使用し、赤色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長590nm、発光波長620nm）も作製した。
(１．２)蛍光色素集積ナノ粒子の修飾
　緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ－ＰＥＧ（polyethylene glycol）－マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）抗体を結合させ、これを「免疫染色剤D」とした。
　これと同様に、赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）抗体を結合させ、これを「免疫染色剤E」とした。
（１．３）二次抗体の修飾
　ラット由来抗マウス抗体ＳＢ７７ｅのアミノ基にＮＨＳ―ＤＩＧを結合させ、これを「二次抗体Ａ」とした。
　これと同様に、ラット由来抗ラビット抗体ＬＯＲＧ１にＮＨＳ－ＦＩＴＣを結合させ、これを「二次抗体Ｂ」とした。
（２）免疫染色剤散布サンプルの作製および輝度比率の測定
　免疫染色剤Ｄ，Ｅをそれぞれガラススライドに塗布することで、免疫染色剤散布スライドを作製した。
（３）蛍光顕微鏡観察
　免疫染色剤散布サンプルをステージに設置し、緑色用、赤色用の２種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本サンプルの蛍光像の画面全体の蛍光輝点から算出された合計輝度値もしくは一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ｄ，Ｅそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出した。
（４）組織標本の免疫染色
　下記工程（４－１）～（４－１５）の方法により、免疫染色剤Ｄ,Ｅを用いてヒト肺組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
　工程（４－１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
　工程（４－２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
　工程（４－３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
　工程（４－４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
　工程（４－５）：１２１度で５分オートクレーブ処理を行った。
　工程（４－６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
　工程（４－７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
　工程（４－８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３μｇ／ｍＬに希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体・抗ＥＧＦＲ抗体混合溶液を、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したＤＩＧが結合した二次抗体ＡおよびＦＩＴCが結合した二次抗体Ｂの混合溶液を、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗ＤＩＧ抗体が結合された免疫染色剤Ｄおよび抗ＦＩＴＣ抗体が結合された免疫染色剤Ｅを、組織標本に載せて一晩放置した。
　工程（４－１３）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を３０分浸漬させた。
　工程（４－１４）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
　工程（４－１５）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。
（５）蛍光顕微鏡観察
　蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤Ｄ、Ｅ（緑色用、赤色用）に対応する２種類のものを使用した。顕微鏡観察及び蛍光輝点数解析は、実施例１の「（５）顕微鏡観察」と同様にして行った。
　次に、画面全体の蛍光輝点から算出した合計輝度値から輝度比率(第１の算出方法)を求めた。また、一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ａ～Ｃそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出した(第２の算出方法)。第１の算出方法又は第２の算出方法どちらを用いた場合も、同じ輝度比率（表４）であり、また、ＰＤ－Ｌ１：ＥＧＦＲ＝２００：１４００の割合で発現していることが確認された（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　〔実施例３（組織標本が動物モデルから搾取され、標本化されたものである例）〕
　検査対象の組織標本としてPDXマウス(Patient-derived xenograft)から搾取された組織の標本を用いたこと以外は、実施例２と同様にしてＰＤ－Ｌ１およびＥＧＦＲに由来する輝点を検出した。
　ＰＤＸとは、Patient-derived tumor xenograft（患者由来腫瘍異種移植）の略称であり、患者（ヒト）由来の組織をマウスまたはその他の実験動物に移植し、一定期間、マウス等の体内で成長させることをいう。たとえば、ヒト癌の組織が移植されたマウスを1か月近く飼育するとヒト癌組織が増大し、これを患者検体の代替えとして利用する有用性が、近年論じられている。さらに、増大した癌組織を別のマウスに移植することを「継代」と呼んでおり、患者検体を継代によってずっと増やしていくことも可能となっている。
　本実施例で使用する組織標本は、次の手順で準備した。
　（１）検体入手： 移植する大きさ１ｃｍ３の肺がん患者検体は、臨床検体供給元企業であるソフィアバイオ社(Sofia Bio LLC)から購入した。
　（２）ＰＤＸマウスの作製: 入手した癌組織検体を、３匹のNOD-SCIDマウスの皮下へそれぞれ３ｍｍ３角移植した。無菌施設内でマウスを約１か月間飼育し、癌組織が１ｃｍ３まで増大したらそれを搾取する。搾取した癌組織の一部は１０％ホルマリンで２４時間固定した後、パラフィンでブロック形態として保管した。
　（３）パラフィン切片スライドの染色
　得られたパラフィンブロックを４μｍの厚さに切り出して、ガラススライド上に張り付け、実施例２と同様に免疫染色および染色画像の解析を実施した。その際、実施例２における「(１．２)蛍光色素集積ナノ粒子の修飾」については下記のように変更した。
　緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ－ＰＥＧ（polyethylene glycol）－マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、末端にマレイミド基が付いた蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をN-succinimidyl S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光物質内包メラミンナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。上記の蛍光物質内包メラミンナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子を作製し、これを「免疫染色剤D」とした。
　一方、同様に赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入した粒子に対しては、これにチオール化した抗ＥＧＦＲ抗体を結合させ、これを「免疫染色剤E」とした。
　さらに、実施例２における「（１．３）二次抗体の修飾」については、次の通り、ビオチン修飾することに変更した。
　（ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の作製）
　５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社、Cat.#89882）に通して、ＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Maleimide-PEG2-Biotin」（サーモサイエンティフィック社、製品番号21901）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾２次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾２次抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した溶液を、ビオチン修飾２次抗体の溶液とした。「免疫染色剤D」による染色は次のように実施した。すなわち、抗ＰＤ－Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ「ＳＰ１４２」Spring Bioscience（SBS）社）０．０５ｎＭの濃度で１次反応処理し、次に作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体のPBS溶液６μｇ／ｍＬで２次反応処理した。
　その結果、第１の方法で導かれた蛍光輝点数はＰＤ－Ｌ１：ＥＧＦＲ＝２００：１４００であり、第２の方法で導かれた蛍光輝点数はＰＤ－Ｌ１：ＥＧＦＲ＝１００：１４００であった。このような差が生じる要因について不明であるが、ここで用意した患者由来マウス検体スライドの状態に、オリジナル患者検体スライドの状態に比較して何らかの変化が生じている可能性が示唆される。今後、マウス検体スライドの状態をチェックするために、本手法が有効な手段になりえると考察された。
　以上のように、本発明は、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる目的生体物質の解析方法および解析システムを提供することに適している。
　１　目的生体物質の解析システム
　１０　蛍光顕微鏡
　１２　ステージ
　１４　対物レンズ
　１６　鏡筒
　１８　接眼レンズ
　２０　撮像素子
　３０　組織標本
　４０　ランプ
　５０　フィルターセット
　５２　励起フィルター
　５２ａ　波長幅
　５４　ビームスプリッター
　５６　蛍光フィルター
　５６ａ　波長幅
　５６ｂ　波長重複幅
　６０　制御装置
　６２　制御部
　６４　記憶部
　７０　表示装置 

Claims (11)

  1. 　組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析方法において、
    　前記免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出する工程と、
    　前記組織標本の蛍光輝点数を前記フィルターセットごとに計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程と、
    　を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  2. 　請求項１に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程では、
    　免疫染色剤（１～ｎ）それぞれのフィルターセット（１～Ｎ）ごとの輝度比率をＲ（１～ｎ，１～Ｎ）と、フィルターセット（１～Ｎ）ごとに計測した組織標本の蛍光輝点数をＴＢ（１～Ｎ）と、免疫染色剤（１～ｎ）ごとの蛍光輝点数をＬ（１～ｎ）として下記の連立方程式を作り、その連立方程式の解から、免疫染色剤（ｍ）の蛍光輝点数Ｌ（ｍ）を算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
    　　　ＴＢ（１）＝Ｌ（１）＋Ｒ（１，２）×Ｌ（２）＋Ｒ（１，３）×Ｌ（３）＋…
    　　　ＴＢ（２）＝Ｒ（２，１）×Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋Ｒ（２，３）×Ｌ（３）＋…
    　　　ＴＢ（３）＝Ｒ（３，１）×Ｌ（１）＋Ｒ（３，２）×Ｌ（２）＋Ｌ（３）＋…
    　　　……………
    （ただし、ｎ、Ｎ、ｍは正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。）
  3. 　請求項２に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記輝度比率Ｒ（１～ｎ，１～Ｎ）を、下記一般式（１）から算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
    　一般式（１）：輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）＝ＦＬ（ｍ，ｋ）／ＦＬ（ｍ，ｐ）
    　[上記一般式（１）において、ＦＬ（ｍ，ｋ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｋ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ＦＬ（ｍ，ｐ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｐ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ｋは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]
  4. 　請求項２に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記輝度比率Ｒ（１～ｎ，１～Ｎ）を、
    　同一輝点の輝度値を前記フィルターセット（１～Ｎ）ごとに測定し、フィルターセット（ｐ）を使用したときに得られる輝度値Ｘと、フィルターセット（ｋ）を使用したときに得られる輝度値Ｙとの関係を示す近似直線である下記一般式（２）の傾きａを輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）として算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
    　一般式（２）：Ｙ＝ａＸ
    　[ただし、ｋは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１～Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]
  5. 　請求項１～４に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記フィルターセットとして、励起フィルターの波長幅が２０～３０ｎｍで、蛍光フィルターの波長幅が３０～５０ｎｍのフィルターセットを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  6. 　請求項５に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記フィルターセットとして、蛍光フィルター同士の波長重複幅が１０ｎｍ以下のフィルターセットを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記蛍光ナノ粒子として半導体ナノ粒子または蛍光物質集積ナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  8. 　請求項７に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記蛍光ナノ粒子として発光波長が４００～７００ｎｍのナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  9. 　請求項８に記載の目的生体物質の解析方法において、
    　前記蛍光ナノ粒子として、発光波長の重複が３０％以下のナノ粒子であって、一方の蛍光ナノ粒子に対応する前記フィルターセットの蛍光フィルターの波長幅での当該一方の蛍光ナノ粒子の強度の積分値に対し、その波長幅での他方の蛍光ナノ粒子の強度の積分値が３０％以下であるナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  10. 　請求項１～９に記載の目的生体物質の解析方法において、組織標本が動物モデルから搾取され、標本化されたものを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
  11. 　組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析システムにおいて、
    　前記免疫染色剤で染色された前記組織標本を撮像する蛍光顕微鏡と、
    　前記蛍光顕微鏡を制御する制御装置であって、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセットごとの輝度比率を記憶する記憶部と、前記蛍光顕微鏡の撮像結果から、前記組織標本の前記フィルターセットごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する算出部とを有する前記制御装置と、
    　を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システム。
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